La edición génica espacialmente confinada permite la terapia inmune combinada localizada

La activación magnética restaura la transducción baculoviral en condiciones de restricción mediada por el complemento

Inicialmente, examinamos si la activación magnética podría superar la restricción mediada por el complemento de la transducción baculoviral en células de adenocarcinoma de colon murino MC38, la línea celular utilizada para establecer el modelo tumoral sinérgico. MBV se generó mediante conjugación electrostática de MNPs a la superficie de vectores baculovirales (BV). Los MNPs funcionalizados con péptidos TAT se sintetizaron utilizando un procedimiento de dos pasos que permitió controlar el tamaño de partícula, la dispersidad y la densidad de péptidos (Fig. 2a, Fig. S1 suplementaria) ^[27]. Los péptidos TAT catiónicos facilitaron la unión al antígeno baculoviral de carga negativa. Los vectores BV que codifican SpCas9, genes reporteros y ARN guía (gRNA) se construyeron dentro de un único genoma viral, aprovechando la gran capacidad de carga de BV para mejorar la eficiencia de edición y reducir la complejidad de la producción (Fig. S2 suplementaria). Los complejos MBV se ensamblaron mezclando MNPs con BV en una proporción de ~3 μg de Fe por 107 unidades formadoras de placa (UFP) durante 10 minutos en PBS (Fig. 2a).

La eficiencia de transducción de BV se evaluó inicialmente en células MC38 utilizando BV-eGFP. Más del 50% de las células expresaron eGFP a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 (Fig. 2b). La expresión de eGFP alcanzó su punto máximo a las 24 horas y disminuyó a niveles indetectables al día 7 (Fig. 2c), lo que es consistente con la expresión transitoria del transgen mediada por BV. Para evaluar la inhibición del complemento y la activación magnética como interruptores funcionales de desactivación y activación en células MC38, la transducción de BV se evaluó en presencia de 50% de suero de ratón adulto (AMS), que contiene un sistema del complemento completamente desarrollado (Fig. 2d, Fig. S3 suplementaria). AMS redujo significativamente tanto la fracción de células eGFP-positivas como la intensidad de la expresión (Fig. 2e). En contraste, la activación magnética de MBV restauró una transducción robusta bajo presión del complemento, lo que resultó en niveles de expresión más altos que BV en condiciones sin AMS. La citometría de flujo mostró aproximadamente un 80% de inhibición de la transducción de BV por AMS, mientras que MBV activado magnéticamente rescató completamente la expresión del transgen (Fig. 2f, g). Estos resultados confirman que la sensibilidad al complemento suprime la actividad de BV, mientras que la activación magnética restaura la administración de genes mediada por BV.

El locus murino Pdl1 comprende cinco exones en el cromosoma 19. Se diseñaron y examinaron seis ARN guía candidatos que se dirigen a exones tempranos o regiones estructurales clave en células MC38 (Tabla S1 suplementaria) ^[28]. Basándose en el análisis de escisión T7E1 y secuenciación de nueva generación (NGS), se seleccionó un ARN guía que se dirige al exón 3 (Fig. S4 suplementaria). NGS reveló que aproximadamente el 87% de las inserciones y deleciones inducidas por Cas9 fueron mutaciones de cambio de marco de lectura, lo que indica una interrupción funcional eficiente.

Coherente con las observaciones en virus oncolíticos, la transducción de BV-eGFP aumentó la expresión de PD-L1 en células MC38 de manera dependiente de la transducción, lo que refleja la inducción de puntos de control mediada por interferón (Fig. 2h, i) ^[20]. En contraste, BV-Pdl1-eGFP redujo la expresión de PD-L1 a MOI coincidentes sin inducir una citotoxicidad sustancial (Fig. 2j, Fig. S5 suplementaria). MBV-Pdl1 logró una mayor eficiencia de interrupción que BV-Pdl1 (Fig. S6 suplementaria). AMS suprimió tanto la expresión de eGFP como la interrupción de Pdl1 por BV-Pdl1-eGFP, mientras que la activación magnética de MBV-Pdl1-eGFP restauró parcialmente la actividad de edición bajo presión del complemento (Fig. 2k, l). En conjunto, estos hallazgos establecen la inactivación del complemento y la activación magnética como restricciones biológicas y físicas ortogonales que regulan la actividad del vector in vivo.

La transducción de BV induce señalización asociada al sistema inmunitario in vitro

Para aislar los efectos inmunitarios atribuibles a la transducción de BV independientemente de la interrupción de Pdl1, se generó un vector de control que codifica Cas9 sin un ARN guía de orientación (BV-Cas9). Similar a BV-eGFP, BV-Cas9 aumentó la expresión de PD-L1 en relación con las células no tratadas (Fig. S7 suplementaria).

Se realizó un perfilaje transcriptómico de células MC38 tratadas con BV-Pdl1, MBV-Cas9 y MBV-Pdl1 utilizando el panel nCounter® Tumor Signaling 360. Tanto BV-Pdl1 como MBV-Pdl1 redujeron el nivel de transcripción de Pdl1 (Fig. 3a). En contraste, los cambios transcripcionales globales se compartieron en gran medida entre todos los grupos tratados y fueron distintos de los controles no tratados, lo que indica que la transducción de BV fue el principal impulsor de la expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario (Fig. 3b-d). Las células tratadas con BV exhibieron una marcada regulación al alza de quimiocinas asociadas con el reclutamiento de linfocitos, incluidas Ccl2, Cxcl11, Cxcl10 y Ccl5 (Fig. 3e, Fig. S8a, c suplementaria). El análisis de conjuntos de genes reveló la activación de vías de señalización de quimiocinas, presentación de antígenos y respuesta a interferones en MBV-Cas9 y MBV-Pdl1, pero en menor medida en el grupo BV-Pdl1 (Fig. 3f, Fig. S8b, d suplementaria), lo que es consistente con una respuesta antiviral coordinada mejorada magnéticamente. Todas las células tratadas con BV también exhibieron la activación de vías de costimulación de células T.

Para evaluar la activación inmunitaria posterior, las células MC38 transducidas con BV se cocultivaron con células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC). El cocultivo indujo la regulación al alza de marcadores de maduración canónicos (Cd86, Cd40, Il-12, Tnf-α, Ifn-α1 y Ifn-β1), lo que indica la activación de las células dendríticas (Fig. 3g). Cuando se cocultivaron con esplenocitos, los esplenocitos expuestos a células tratadas con BV-Pdl1 exhibieron una mayor expresión de genes efectores citotóxicos, incluidos Gzmb, Ifn-γ, en relación con BV-Cas9 (Fig. 3h). Además, los esplenocitos exhibieron una toxicidad significativa hacia las células MC38 tratadas con BV-Pdl1, pero no hacia las células tratadas con BV-Cas9 (Fig. 3i). Estos hallazgos indican que la interrupción de Pdl1 mitiga la regulación al alza compensatoria de PD-L1 inducida por el antiviral, lo que acopla el reclutamiento inmunitario con la inhibición del punto de control para mantener la actividad efectora citotóxica.

La compuerta magnética permite la restricción funcional de la edición del genoma in vivo

Para evaluar si la interrupción localizada de Pdl1 podría modular la inmunidad tumoral in vivo, se trató a ratones C57BL/6 con tumores MC38 establecidos (~50 mm3) mediante la infusión intratumoral de MBV-Pdl1 seguida de la activación magnética. Este diseño experimental permitió la edición del genoma espacialmente confinada dentro de tumores establecidos en condiciones que modelan la intervención en lesiones clínicamente accesibles.

La fuerza magnética sobre MBV está gobernada por los gradientes de campo más que por la intensidad del campo por sí sola (ver Métodos). Estudios previos han demostrado que se pueden generar altos gradientes de campo a una profundidad considerable dentro del cuerpo del ratón ^[29], ^[30]. Para lograr una activación magnética reproducible al tiempo que se limita intencionalmente la exposición a la fuerza en los órganos principales, diseñamos una matriz de imanes compuesta por cuatro imanes cilíndricos de NdFeB dispuestos en polaridad alterna y centrados alrededor del tumor (Fig. 4a). La matriz de imanes se integró en una cama para animales impresa en 3D para garantizar un posicionamiento consistente del tumor (Fig. S9 suplementaria). Después de la infusión del vector, los ratones se mantuvieron bajo anestesia con los tumores alineados dentro del campo magnético durante 1 hora. Los perfiles de densidad de flujo magnético y fuerza simulados en la superficie del tumor fueron comparables a los utilizados para la activación in vitro (Fig. 4b, c, Fig. S10 suplementaria), lo que confirmó que la configuración in vivo proporcionó una compuerta magnética suficiente para activar MBV. Las fuerzas estimadas sobre los MNPs en el hígado y el bazo fueron aproximadamente dos órdenes de magnitud menores que las del sitio tumoral. Este perfil magnético confinado refleja el diseño intencional de la matriz para localizar la activación, en lugar de una limitación en la penetración del campo.

Las nanopartículas magnéticas permitieron el seguimiento no invasivo de la distribución de MBV mediante resonancia magnética ponderada en T in vivo (Fig. S11 suplementaria). El análisis de resonancia magnética y los análisis histológicos revelaron una acumulación localizada de MBV principalmente alrededor de la vía de inyección (Fig. 4d, e), similar a otras nanopartículas grandes administradas localmente ^[31]. Para cuantificar la transducción intratumoral, los tumores tratados con MBV-Pdl1-eGFP se dividieron en cuatro fragmentos y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células eGFP+ oscilaron entre el 0,6% y el 2,7% en los fragmentos tumorales, lo que refleja la distribución intratumoral heterogénea típica de los vectores administrados localmente dentro de los tumores sólidos (Fig. 4f). La mayoría de las células eGFP+ fueron células tumorales CD44 con niveles más bajos detectados en fibroblastos ER-TR7 y células inmunitarias CD45 (Fig. 4g). No se detectó expresión de eGFP en los órganos principales, y la imagen de fluorescencia ex vivo confirmó además la localización en los tumores tratados (Fig. 4h, Fig. S12 suplementaria). La secuenciación de nueva generación confirmó las inserciones y deleciones de Pdl1 en los tumores, pero no en los órganos distales, después del tratamiento con MBV-Pdl1 (Fig. 4i, j). Es importante destacar que el hígado, que normalmente exhibe una alta acumulación fuera del objetivo durante el tratamiento con vectores convencionales, no mostró ninguna actividad de edición del genoma detectable, a pesar de la alta eficiencia de transducción de BV en los hepatocitos ^[4], ^[32].

Coherente con la restricción funcional de la edición del genoma, la distribución del vector se concentró cerca de la vía de inyección, lo que sugiere que la edición ocurrió dentro de regiones espacialmente restringidas del tumor. Debido a que los tumores se disociaron sin preservar la orientación espacial en relación con la vía de inyección, tanto las estimaciones de transducción citométricas de flujo como las mediciones de NGS a granel probablemente diluyeron las regiones editadas localmente con la fracción tumoral sustancialmente no transducida. A pesar de esta cobertura aparente limitada, el tratamiento con MBV-Pdl1 produjo robustos efectos terapéuticos, lo que indica que la interrupción localizada del punto de control dentro de un nicho tumoral restringido puede iniciar la remodelación inmunitaria en todo el tumor.

En particular, los volúmenes tumorales divergieron dentro de los tres días posteriores al tratamiento (Fig. 5o), lo que es consistente con los rápidos efectos citotóxicos mediados por el sistema inmunitario que pueden reducir la abundancia de las células inicialmente transducidas. In vitro, la expresión del transgen mediada por BV en células MC38 alcanzó su punto máximo a las 24 horas y disminuyó durante varios días, volviéndose indetectable al día 7 (Fig. 2c), mientras que estudios in vivo previos demostraron la eliminación de la expresión del transgen baculoviral dentro de las 48 horas en el tejido hepático ^[4]. Este contraste apoya la eliminación mediada por el sistema inmunitario de las células transducidas in vivo, lo que reduciría las fracciones de eGFP+ detectables en los tumores.

Aunque se detectó la señal de eGFP en las células CD45+ in vivo, la transducción baculoviral de las células de la línea hematopoyética es insignificante en condiciones in vitro ^[33]. La presencia de células CD45+ eGFP+ es, por lo tanto, más consistente con la fagocitosis de células tumorales transducidas o la transferencia de antígenos en lugar de la transducción viral productiva, lo que es consistente con el aumento del reclutamiento y la activación de las células presentadoras de antígenos en los tumores tratados. En conjunto, estas observaciones indican que la expresión de eGFP medida y las frecuencias de inserciones y deleciones subestiman la participación y la actividad de edición del vector máximas dentro de los tumores.

En conjunto, estos resultados demuestran que la compuerta magnética permite la edición localizada del genoma bajo la restricción mediada por el complemento, lo que resulta en la restricción funcional de la actividad de edición del genoma a los tumores al tiempo que limita la diseminación sistémica.

La interrupción de Pdl1 mediada por MBV previene la señalización del punto de control compensatorio, mejora la infiltración inmunitaria y suprime el crecimiento tumoral

Tras establecer la restricción funcional de la edición del genoma in vivo, examinamos a continuación cómo la alteración localizada de Pdl1 modula el microambiente inmunitario tumoral y la respuesta terapéutica. La eficacia terapéutica se evaluó comparando PBS, MNP solo, BV–Pdl1, MBV–Pdl1 y el anticuerpo anti-PD-L1 sistémico (aPD-L1) (Fig. 5a). La inmunohistoquímica confirmó la reducción de la expresión de PD-L1 en los tumores tratados con MBV–Pdl1, pero no en los tumores tratados con BV–Pdl1 (Fig. 5b). Aunque la transducción viral fue espacialmente heterogénea, la inmunohistoquímica reveló una reducción de la expresión de PD-L1 en gran parte del tumor tras el tratamiento con MBV–Pdl1. Esta observación es consistente con la propagación mediada por el sistema inmunitario de la modulación de los puntos de control iniciada por la edición localizada del genoma y la detección antiviral, lo que puede extenderse más allá de las células inicialmente transducidas y remodelar el microambiente tumoral ^[34], ^[35], ^[36]. Tanto los tratamientos con BV–Pdl1 como con MBV–Pdl1 aumentaron la infiltración de células dendríticas CD11c+CD86+ (Fig. 5c), mientras que el tratamiento con MBV–Pdl1 y aPD-L1 aumentó la infiltración de células T CD3+CD8+ (Fig. 5d).

Para caracterizar de forma exhaustiva el impacto de MBV–Pdl1 en el microambiente inmunitario tumoral, analizamos las células inmunitarias CD45 aisladas de los tumores tratados con PBS o MBV–Pdl1. El análisis por citometría de flujo reveló un aumento cercano al doble de las células inmunitarias CD45 en los tumores tratados con MBV–Pdl1 en relación con los controles de PBS (Fig. 5e). El secuenciamiento de ARN de una sola célula de las células inmunitarias infiltrantes del tumor demostró un cambio marcado en la composición inmunitaria tras el tratamiento con MBV–Pdl1 (Fig. 5f, g). Los tumores tratados con PBS estaban dominados por tres poblaciones principales: neutrófilos, células T CD4+ y células T CD8+. El tratamiento con MBV–Pdl1 aumentó la diversidad inmunitaria, con proporciones elevadas de macrófagos, células dendríticas, células B y células asesinas naturales (NK), acompañado de una reducción de las fracciones de neutrófilos y células T CD4+.

Las células presentadoras de antígenos, incluidos los macrófagos, las células dendríticas y las células B, se enriquecieron sustancialmente tras el tratamiento con MBV–Pdl1 (Fig. 5g). Las células dendríticas aumentaron más de cuatro veces entre las células CD45+ (Fig. 5h), y las células dendríticas convencionales de tipo 2 (cDC2) constituyeron el subconjunto dominante (Fig. 5i, Fig. S15a, b complementaria). El análisis de la expresión génica de las células dendríticas infiltrantes del tumor reveló un enriquecimiento de las vías asociadas con la defensa antiviral y la inmunidad antitumoral, incluida la presentación y el procesamiento de antígenos, la activación de las respuestas inmunitarias innatas, la regulación de la activación de las células T y la producción de interferón de tipo I (Fig. 5j).

Aunque la proporción general de células T disminuyó ligeramente, la relación CD8+/CD4+ de células T aumentó significativamente en los tumores tratados con MBV–Pdl1 (Fig. 5k, l). El subagrupamiento de las células T CD8 reveló además un cambio de los fenotipos efectores y exhaustos a los estados ingenuos y en ciclo (Fig. 5m, Fig. S15c, d complementaria). Los tumores tratados con PBS contenían proporciones más altas de células T CD8 efectoras y exhaustas, mientras que los tumores tratados con MBV–Pdl1 exhibieron un aumento marcado de las células T CD8 ingenuas y en ciclo. El análisis de la expresión diferencial reveló la regulación al alza de los genes asociados con la proliferación y el potencial citotóxico, incluidos Xcl1, Gzmc y Cd244a, junto con la reducción de la expresión de los receptores inhibitorios (Ctla4, Icos y Havcr2) (Fig. 5n). El análisis de las células T CD4+ reveló que el tratamiento con MBV–Pdl1 aumentó las fracciones de células T de memoria y reguladoras (Fig. S15e–g complementaria). Las células NK también se enriquecieron tras el tratamiento con MBV–Pdl1 (Fig. 5g). El análisis de los marcadores de agotamiento e inhibición (Ctla4, Cd274 y Satb1) junto con los genes asociados con la proliferación (Stmn1, Mcm3, Mcm5) y los genes asociados con la activación (Gzmc, Ifitm2, Apex1, C1qbp) reveló que las células NK en los tumores tratados con MBV–Pdl1 exhibieron firmas transcripcionales consistentes con la activación antiviral y los programas efectores citotóxicos (Fig. 5o).

MBV–Pdl1 se administró cada tres días para tener en cuenta la distribución intratumoral heterogénea y la expresión transitoria del transgen, lo que es consistente con la participación localizada del vector (Fig. 5a). MBV–Pdl1 produjo la supresión del crecimiento tumoral más fuerte entre todos los grupos, incluido aPD-L1, mientras que MNP o BV–Pdl1 solo indujeron un retraso modesto (Fig. 5p, q). MBV–Pdl1 prolongó significativamente la supervivencia, con una mediana de supervivencia de 18 días en comparación con 10 días para PBS y 12 días para aPD-L1 (Fig. 5r). No se observó una pérdida significativa del peso corporal (Fig. S16a complementaria).

La escalada de dosis de MBV–Pdl1 no mejoró aún más la supervivencia en relación con la dosis estándar, pero siguió siendo superior a MBV-eGFP (Fig. S16b, c complementaria), lo que indica que la activación inmunitaria antiviral por sí sola no explica la eficacia terapéutica. Los tumores derivados de células MC38 con eliminación de PD-L1 mostraron solo una reducción marginal del crecimiento en comparación con los tumores de tipo salvaje (Fig. S16d–f complementaria), lo que demuestra que la pérdida intrínseca de PD-L1 en el tumor por sí sola es insuficiente. En conjunto, estos hallazgos indican que la eficacia terapéutica surge de la integración coordinada de la activación inmunitaria antiviral y la alteración espacialmente confinada de Pdl1, en lugar de ninguno de los mecanismos de forma aislada.

La activación localizada de MBV–Pdl1 se sinergiza con el bloqueo sistémico de CTLA-4

Para evaluar la compatibilidad con el bloqueo sistémico de los puntos de control inmunitario, MBV–Pdl1 se combinó con el anticuerpo anti-CTLA-4 (aCTLA-4) en ratones con tumores MC38 (Fig. 6a). El bloqueo de CTLA-4 es un componente clínicamente relevante de las terapias dirigidas a PD-1/PD-L1 y complementa la alteración localizada de los puntos de control al reducir la inmunosupresión mediada por las células T reguladoras ^[37]. La combinación produjo una mayor supresión tumoral que cualquier monoterapia o combinaciones de anticuerpos (Fig. 6b–f). La mediana de supervivencia aumentó a 38 días en el grupo MBV–Pdl1 + aCTLA-4 en comparación con 10 días para PBS, 13,5 días para aCTLA-4 solo y 14 días para aCTLA-4 + aPD-L1 (Fig. 6g). Dos ratones en el grupo de combinación lograron una regresión tumoral completa. No se observó una pérdida significativa del peso corporal, lo que indica una tolerabilidad favorable (Fig. S17a complementaria). En un experimento de rechallenge piloto, los dos ratones supervivientes a largo plazo del grupo MBV–Pdl1 + anti-CTLA-4 fueron reimplantados con células MC38 y se controlaron durante 20 días. Ningún ratón desarrolló tumores detectables (Fig. S17b complementaria), lo que es consistente con una protección inmunitaria antitumoral duradera.

Discusión

La edición del genoma in vivo proporciona un enfoque programable para modular los genes asociados con enfermedades. En particular, la edición del genoma CRISPR se ha convertido en una herramienta fundamental para investigar los impulsores oncogénicos en la investigación del cáncer. Sin embargo, su traslación clínica se ha visto limitada por la falta de estrategias para controlar con precisión la actividad de la edición del genoma dentro de contextos espaciales definidos in vivo. La diseminación sistémica de los vectores conlleva el riesgo de una edición no deseada fuera de la región objetivo. Estudios anteriores han desarrollado nucleasas Cas9 inducibles por luz o por productos químicos ^[38], ^[39]; sin embargo, las señales ópticas no pueden penetrar en los tejidos profundos debido a la dispersión y la absorción, y la activación química se ve limitada por la biodistribución tanto de las nucleasas Cas9 como de los agentes activadores. Estos enfoques no desacoplan la actividad de la edición del genoma de la distribución del vector y, por lo tanto, no pueden imponer un control espacial sobre la actividad de la edición.

Aquí, integramos la regulación externa magnética con la inactivación intrínseca del complemento para lograr un control espacialmente restringido de la actividad de la edición del genoma in vivo. Se ha demostrado que la administración viral local tiene lugar en diversos sitios anatómicos ^[40], y los estudios clínicos de la orientación de nanopartículas guiadas magnéticamente han demostrado la localización de los terapéuticos en los tejidos profundos, lo que respalda la viabilidad traslacional de la activación guiada magnéticamente. Aunque la infusión intratumoral en un solo sitio produjo una deposición localizada del vector, se podría aumentar la cobertura mediante la administración en múltiples sitios si fuera necesario. Este enfoque es clínicamente plausible porque la colocación espacialmente distribuida ya se utiliza en procedimientos como la braquiterapia. No obstante, el despliegue clínico requerirá la optimización de las estrategias de inyección y las geometrías del campo magnético.

Desarrollamos una plataforma de edición del genoma híbrida que desacopla la actividad de la edición del genoma de la biodistribución del vector mediante la integración de restricciones físicas y biológicas complementarias. El complemento del huésped impone una restricción sistémica, mientras que la activación magnética restaura la entrada viral localizada en el sitio objetivo, estableciendo un control biológico y físico ortogonal de la actividad de la edición del genoma. En conjunto, estas restricciones confinan la actividad de CRISPR a las regiones tumorales objetivo y limitan la diseminación y la exposición innecesaria a la nucleasa. Aunque la expresión del transgen baculoviral es transitoria, la edición mediada por CRISPR modifica irreversiblemente el locus objetivo, lo que permite una alteración sostenida de los puntos de control dentro de la región tumoral objetivo sin una persistencia prolongada del vector.

Los vectores virales, incluidos los virus oncolíticos, se han utilizado durante mucho tiempo en la inmunoterapia contra el cáncer debido a su capacidad para estimular la inmunidad innata y adaptativa. Sin embargo, la detección antiviral puede inducir una regulación al alza compensatoria de los puntos de control, lo que crea un bucle de retroalimentación reguladora que restringe la función efectora y, a menudo, requiere un bloqueo sistémico. Estas observaciones resaltan una limitación clave de los enfoques existentes, en los que la activación inmunitaria y la retroalimentación reguladora no están coordinadas espacialmente. Nuestra estrategia aborda esta limitación al incrustar la alteración programable de los puntos de control dentro de una plataforma viral no replicativa con control espacialmente restringido, lo que limita la actividad de la edición del genoma a las regiones tumorales definidas. A diferencia de los virus oncolíticos replicantes, MBV permite la edición localizada del genoma sin una persistencia sistémica sostenida del vector, lo que acopla la activación inmunitaria y la alteración de los puntos de control dentro de la misma región tumoral y evita las limitaciones de seguridad y regulación asociadas con los vectores de edición del genoma competentes para la replicación.

Dentro de los tumores, MBV preserva la activación inmunitaria innata al tiempo que restringe la actividad de la edición del genoma al campo activado. La transducción baculoviral promueve la presentación de antígenos y el reclutamiento de células inmunitarias, pero también induce la regulación al alza de los puntos de control. La alteración localizada de Pdl1 resuelve esta retroalimentación inhibitoria al tiempo que preserva el contexto inmunostimulante generado por la detección viral. La reducción de la expresión de PD-L1 en gran parte del tumor a pesar de la distribución viral heterogénea sugiere que la actividad de la edición del genoma localizada puede iniciar la remodelación inmunitaria más allá de las células inicialmente transducidas. Coherente con esta interpretación, la eficacia limitada de la eliminación intrínseca de PD-L1 en el tumor y la respuesta modesta al bloqueo sistémico de PD-L1 indican que el beneficio terapéutico surge de la integración coordinada de la activación inmunitaria antiviral y la alteración espacialmente restringida de la actividad de la edición del genoma, en lugar de la alteración de los puntos de control por sí sola.

Estos hallazgos sugieren que la edición uniforme del genoma en todo el tumor puede no ser necesaria para la eficacia terapéutica. En cambio, la alteración de los puntos de control dentro de una región tumoral restringida puede ser suficiente para iniciar una remodelación inmunitaria más amplia, lo que es consistente con un modelo en el que el control de la actividad de la edición del genoma, en lugar de la administración uniforme, gobierna el resultado terapéutico.

A nivel tisular, MBV–Pdl1 aumenta la densidad y diversificación de las células inmunitarias, particularmente entre las poblaciones presentadoras de antígenos. La expansión de las células dendríticas y el enriquecimiento de las vías de procesamiento de antígenos son consistentes con una mayor activación de las células T dentro de los tumores. El perfilaje transcripcional apoya el reclutamiento y la activación de poblaciones efectoras proliferativas y citotóxicas, en lugar de simplemente la reactivación de células exhaustas preexistentes, lo que sugiere una reprogramación inmunitaria duradera tras la edición genómica localizada. El confinamiento espacial se centra en la amplificación de la respuesta inmunitaria antiviral dentro de los tumores, al tiempo que limita la edición y la actividad del vector detectables en los órganos distales. La sinergia con el bloqueo sistémico de CTLA-4 ilustra aún más cómo la edición localizada de puntos de control puede integrarse con la inmunomodulación sistémica a través de diferentes escalas espaciales sin toxicidad evidente. Aunque está limitado por el tamaño de la muestra, el rechazo del retreto con MC38 en dos supervivientes a largo plazo del grupo MBV–Pdl1 más anti-CTLA-4 es consistente con el establecimiento de una inmunidad antitumoral protectora y justifica una mayor evaluación de la memoria inmunitaria duradera.

Basándose en el control magnético previo de la administración de virus, este estudio avanza ese marco al establecer un control funcional sobre la actividad de la edición genómica terapéutica in vivo. Si bien nuestro trabajo anterior estableció el confinamiento espacial de la edición, el presente estudio demuestra que la regulación física puede acoplarse arquitectónicamente a la señalización inmunitaria endógena para resolver la retroalimentación regulatoria intrínseca del tumor. Este enfoque sugiere además que los mecanismos de eliminación inmunitaria intrínsecos, como la inactivación del complemento, pueden aprovecharse como características de diseño para restringir activamente la actividad de la edición genómica in vivo, proporcionando una estrategia para diseñar vectores de nueva generación con contención biológica incorporada. La arquitectura modular del baculovirus permite la incorporación de ARN guía adicionales, lo que permite una edición genómica multiplexada y adaptable dentro de regiones tisulares espacialmente definidas.

En conjunto, estos hallazgos establecen MBV como un marco de edición genómica controlable que integra la regulación espacial con la activación inmunitaria endógena para permitir una inmunoterapia combinada localizada. Al priorizar el control de la actividad de la edición genómica sobre la biodistribución pasiva, esta estrategia permite la inmunomodulación restringida al tumor, al tiempo que permite que los eventos de edición genómica localizados inicien una remodelación inmunitaria más amplia dentro del microambiente tumoral. De manera más amplia, este estudio ilustra cómo las entradas físicas externas pueden integrarse con los circuitos reguladores biológicos intrínsecos para diseñar una actividad de edición genómica controlada espacialmente in vivo, estableciendo un marco generalizable para el acoplamiento de la regulación física y biológica en sistemas terapéuticos.

Métodos en línea

Materiales

Acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3, 99,9 %), ácido oleico (90 %), oleilamina (70 %), 1,2-tetradecanodiol (90 %), éter bencílico (99 %), cloroformo (99 %), tolueno (99,9 %), DMSO (99,9 %), ferrozina (97 %) se compraron a Sigma-Aldrich. 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-mPEG2000) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[maleimido(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000-maleimido) se compraron a Avanti Polar Lipids. Péptidos TAT terminados en cisteína (CGYGRKKRRQRRR) fueron sintetizados por Genscript.

El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac y Cellfectin II se compraron a Thermo Fisher Scientific. El kit de titulación qPCR BacPAK, el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS, el kit maestro PrimeScript RT y la mezcla maestra TB Green Premix Ex Taq se compraron a Takara Bio. Los plásmidos pX330 (número de catálogo 42230), pCMV-GFP (número de catálogo 11153) y pCMV-iRFP (número de catálogo 45457) se obtuvieron de Addgene. Todos los ARN guía (Tabla S1 suplementaria) y los cebadores de PCR (Tablas S2, S3 y S4 suplementarias) fueron sintetizados por Eurofins. Los cebadores xGen™ UDI para la preparación de bibliotecas NGS se compraron a Integrated DNA Technologies. El kit Quick-DNA™ MicroPrep y el kit Quick-RNA Miniprep se compraron a ZYMO Research. El reactivo de transfección jetOPTIMUS® se compró a Polyplus.

Las enzimas, los tampones y los kits utilizados para el clonaje molecular, incluido el Q5® Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix, el kit de limpieza de PCR y ADN, el kit de extracción de ADN en gel, Quick CIP, la quinasa de polinucleótidos T4, el tampón de reacción de ligasa de ADN T4, BbsI-HF, la endonuclease I T7 y el kit de ligación rápida, se compraron a New England Biolabs. Las células competentes de E. coli 10-beta también se obtuvieron de New England Biolabs.

Todos los anticuerpos se enumeran en la Tabla S5 suplementaria.### Producción de vectores de baculovirus recombinantes

Los vectores de baculovirus recombinantes se generaron utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac. Brevemente, los casetes de expresión de Cas9, ARN guía y genes reporteros se insertaron en el vector pFastBac y se transformaron en células competentes DH10Bac (Figura S2 suplementaria). Los bacmidos recombinantes que contienen el genoma del virus y los casetes de expresión se extrajeron utilizando el kit PureLink HiPure Plasmid Miniprep y se transfectaron en células Sf9 de insectos utilizando Cellfectin II según el protocolo del fabricante. El medio de cultivo de células de insectos que contiene los virus brotados se centrifugó y se filtró para eliminar los restos celulares utilizando filtros de tapa de botella (0,45 μm; Thermo Fisher Scientific). El vector de baculovirus recombinante recogido se amplificó en células Sf9 durante dos pasajes más. Los stocks de baculovirus en el pasaje 3 se utilizaron para todos los experimentos. Las partículas virales se concentraron y purificaron mediante filtración a través de un filtro de tapa de botella de 0,45 μm seguido de centrifugación a 6.000 g durante 3 h a 4 °C. Los pellets virales resultantes se resuspendieron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Los títulos de baculovirus se cuantificaron utilizando el kit de titulación qPCR BacPAK.### Síntesis de nanopartículas magnéticas

Las nanopartículas magnéticas (MNP) se sintetizaron utilizando un método de dos pasos adaptado de métodos previamente publicados ^[27]. Brevemente, los nanocristales de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante descomposición térmica del acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3) en éter bencílico en presencia de ácido oleico, oleilamina y 1,2-hexadecanodiol. Para hacer que los nanocristales sean dispersables en agua, se recubrieron con una mezcla de DSPE-mPEG2000 y DSPE-PEG2000-maleimido en una relación molar de 19:1 utilizando un método de intercambio de disolventes duales ^[41]. Para la conjugación de péptidos, las MNP recién recubiertas se incubaron con péptidos TAT terminados en cisteína en una relación molar de 1:200 en 0,25× PBS durante la noche a temperatura ambiente. Los péptidos no conjugados se eliminaron mediante ultracentrifugación a 80.000 g durante 35 min a 4 °C. Las nanopartículas se lavaron, se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

El tamaño y la distribución del tamaño de los nanocristales de las MNP recubiertas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS). La curva de magnetización de los nanocristales se midió a 300 K utilizando un dispositivo de interferencia cuántica superconductora (Quantum Design MPMS). Las concentraciones de partículas se cuantificaron utilizando un ensayo de ferrozina. La conjugación exitosa de los péptidos TAT se confirmó mediante un ensayo de cambio de banda en gel (Figura S1 suplementaria).### Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon murino MC38 se obtuvieron de Kerafast, y las células de insectos Sf9 se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. Todas las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con los protocolos recomendados por los fabricantes.### Transducción in vitro de BV

Para evaluar la eficiencia y la dinámica temporal de la transducción de BV, las células MC38 se sembraron a una densidad de 4 × 104 células por pocillo en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células se incubaron luego con DMEM/F12 que contenía BV–eGFP a diferentes multiplicidades de infección (MOI) durante 24 h, después de lo cual el medio se reemplazó con DMEM/F12 fresco. La expresión de eGFP en las células MC38 se cuantificó mediante citometría de flujo en los puntos de tiempo indicados.

Para evaluar la activación magnética y la inhibición mediada por el complemento de la transducción de BV, las células MC38 sembradas en placas de 24 pocillos se incubaron con BV–eGFP en DMEM/F12, BV–eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de suero de ratón adulto (AMS) o MBV–eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de AMS. Para las células tratadas con MBV–eGFP, las placas de cultivo se colocaron sobre una placa magnética diseñada a medida durante 30 min para permitir la activación magnética (Figura S3 suplementaria). Las células se lavaron posteriormente y se mantuvieron en DMEM/F12. La expresión de eGFP en las células MC38 se evaluó a las 24 h mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Para evaluar la activación magnética de la interrupción de Pdl1 bajo presión del complemento, las células se trataron con BV–Pdl1 o MBV–Pdl1 como se describió anteriormente. La expresión de eGFP y PD-L1 se cuantificó mediante citometría de flujo a las 24 y 48 h posteriores al tratamiento, respectivamente.### Diseño de ARN guía únicos (sgRNA) para la interrupción de Pdl1

Se diseñaron seis ARN guía únicos (sgRNA) candidatos que se dirigen a los exones iniciales o regiones estructurales clave de PD-L1 utilizando una canalización bioinformática que incorpora la puntuación de bioactividad CRISPR de Viena (Tabla S1 suplementaria) ^[28]. Se predijeron los posibles sitios diana y no diana utilizando la herramienta web CRISPRO (http://crispor.gi.ucsc.edu/crispor.py) ^[42], y los cuatro sitios diana no diana predichos principales para cada sgRNA se seleccionaron para el análisis de secuenciación de nueva generación (NGS) posterior.

Las células MC38 se transfectaron con el plásmido pX330-sgRNA utilizando el reactivo de transfección jetOPTIMUS. El ADN genómico se recolectó 48 h después de la transfección utilizando el kit Quick-DNA™ MicroPrep. Las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s; 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 68 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 2 min. Para los ensayos de endonuclease I T7 (T7E1), el ADN heterodúplex desajustado se generó desnaturalizando y reanhelando 1 μg del producto de PCR purificado, seguido de la digestión con endonuclease I T7 a 37 °C durante 1 h. Los productos de digestión se resolvieron en geles de agarosa al 2 %. La eficiencia de modificación génica se calculó utilizando la fórmula:

Para el análisis de indels NGS dirigidos, las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR. Los ampliconos de PCR se purificaron utilizando el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS y luego se indexaron utilizando placas de cebadores xGen™ UDI de 10 nt 1–4 (Integrated DNA Technologies) a través de un segundo paso de PCR (98 °C durante 30 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 64 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s; extensión final a 72 °C durante 2 min). Las bibliotecas indexadas se purificaron, se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se cuantificaron utilizando un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina MiSeq. Las frecuencias de indels y los perfiles de edición se analizaron utilizando CRISPResso2 (http://crispresso2.Pinellolab.org) ^[43].### Análisis transcriptómico in vitro de la transducción de BV

Las células MC38 se transducieron con BV–Pdl1, MBV–Cas9 o MBV–Pdl1 durante 48 h. El ARN total se aisló utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El perfilado de expresión génica se realizó utilizando el panel nCounter® Mouse Tumor Signaling 360™. La normalización de datos, el análisis de expresión génica diferencial y el enriquecimiento de vías se realizaron utilizando el software de análisis nSolver (v4.0). Los valores de p en el análisis de expresión génica diferencial se ajustaron utilizando el método de Benjamini y Yekutieli para la corrección de pruebas múltiples.### Caracterización in vitro de las respuestas inmunitarias inducidas por BV

Las respuestas inmunitarias inducidas por BV se evaluaron utilizando sistemas de cocultivo que consisten en células MC38 transducidas con BV con células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) o esplenocitos.

Para generar BMDC (células dendríticas derivadas de médula ósea), se recolectaron células de médula ósea de ratones C57BL/6 hembra y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1000 U/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 800 U/mL de interleucina-4 (IL-4) durante 3 días. Las células MC38 se transfectaron con BV–Pdl1 o BV–Cas9 durante 24 h, después de lo cual se sembraron a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Luego, se añadieron las BMDC a las células MC38 en una proporción de 2:1 (BMDC:MC38). Las BMDC tratadas con LPS (100 ng/mL) se utilizaron como control positivo. Después de 24 h adicionales de cocultivo, se extrajo el ARN total utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El ARN se transcribió inversamente a ADNc utilizando el kit PrimeScript RT Master. La expresión génica se cuantificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando TB Green Premix Ex Taq Master Mix en un sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt.

En experimentos paralelos, se aislaron esplenocitos de los bazo de ratones C57BL/6 hembra y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células MC38 se transfectaron con BV durante 24 h y, posteriormente, se sembraron a 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. Luego, se añadieron los esplenocitos en una proporción de 5:1 (esplenocitos:MC38). Los esplenocitos tratados con LPS se utilizaron como control positivo. Después de 24 h de cocultivo, se evaluó la citotoxicidad utilizando un ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8). La expresión génica se cuantificó mediante RT-qPCR como se describió anteriormente.

Diseño del campo magnético para la activación intratumoral de MBV

El aparato magnético utilizado para la activación intratumoral de MBV se diseñó basándose en la disponibilidad de imanes, las dimensiones del tumor y la distribución simulada de la fuerza magnética. La fuerza magnética ejercida sobre las nanopartículas magnéticas (MNP) se calculó utilizando la siguiente ecuación ^[44]:

donde denota la permeabilidad magnética del tejido circundante, es el momento magnético de las MNP y representa la densidad de flujo magnético del campo magnético aplicado.

Las distribuciones del campo magnético se calcularon definiendo la geometría del imán y calculando la densidad de flujo magnético espacial generada por la geometría del imán definida, seguida del cálculo de la fuerza magnética basada en los gradientes de campo y un modelo de Langevin de magnetización de nanopartículas. Específicamente, el flujo de trabajo computacional implicó: (i) definir la geometría y la disposición espacial de los imanes permanentes, (ii) calcular la distribución del campo magnético sobre un dominio espacial discretizado, (iii) estimar la magnetización de las nanopartículas bajo el campo aplicado utilizando una función de Langevin y (iv) calcular la fuerza magnética resultante a partir de los gradientes de campo. Se generaron mapas espaciales sobre un dominio discretizado que representa el tumor y los tejidos circundantes.

Basándose en la simulación numérica, se dispusieron cuatro imanes cilíndricos de NdFeB (grado N52; K&J Magnetics) en una configuración de polaridad alternante para maximizar el gradiente del campo magnético (Figura S9 suplementaria). Se utilizó un soporte para animales impreso en 3D para posicionar de forma reproducible los tumores en el centro de la matriz de imanes. La distribución resultante del campo y la fuerza magnéticos se simularon utilizando un programa MATLAB desarrollado internamente.

Disrupción de Pdl1 activada magnéticamente in vivo

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky. Se adquirieron ratones C57BL/6 hembra (de 4 a 5 semanas de edad) de Charles River Laboratories. Para establecer el modelo de tumor sinérgico en ratones, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 5×105 células MC38 suspendidas en 100 μL de PBS en el flanco derecho. El volumen del tumor y el peso corporal se controlaron cada 3 días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = (L × W2) / 2, donde L y W denotan la longitud y el ancho del tumor, respectivamente. Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50 mm3. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor superó los 1000 mm3, de acuerdo con las pautas de punto final humano.

En los estudios de monoterapia, los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos que recibieron PBS, MNP solo, BV–Pdl1 solo, MBV–Pdl1 o anticuerpo anti-PD-L1 sistémico (aPD-L1). MBV–Pdl1 se preparó mezclando 1,5×107 unidades formadoras de placa (UFP) de BV–Pdl1 con 5 μg de MNP-TAT en 20 μL de PBS. Los ratones recibieron una infusión intratumoral de MBV–Pdl1 cada 3 días, para un total de cuatro dosis. El inyectado se administró utilizando una técnica de abanico, en la que la aguja se retiraba parcialmente y se redirigía para facilitar la distribución intratumoral. El volumen de inyección se fijó en 0,3 × el volumen del tumor, manteniendo una concentración vectorial constante, y las soluciones se infundieron durante aproximadamente 5 minutos utilizando una bomba de jeringa. Para los ratones tratados con MNP solo o BV–Pdl1 solo, las dosis inyectadas se igualaron a los componentes correspondientes en la formulación de MBV–Pdl1. En los grupos de MNP solo o MBV–Pdl1, los ratones se colocaron lateralmente sobre un soporte para animales impreso en 3D inmediatamente después de la infusión, con los tumores alineados dentro del campo magnético y se mantuvieron bajo anestesia durante 1 h (Figura S9 suplementaria). El aPD-L1 sistémico se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 200 μg en 100 μL de PBS con el mismo programa de dosificación.

Para los estudios de terapia combinada, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos que recibieron PBS, aCTLA-4 sistémico, aCTLA-4 sistémico combinado con aPD-L1 o MBV–Pdl1 combinado con aCTLA-4 sistémico, administrado cada 3 días, para un total de cuatro dosis. En el grupo de aCTLA-4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μg (día 0) o 100 μg (día 3, 6 y 9) de aCTLA-4 en 100 μL de PBS ^[45]. En el grupo de aCTLA-4 más aPD-L1, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se indicó anteriormente y 100 μg de aPD-L1 en 100 μL de PBS por tratamiento. En el grupo de MBV–Pdl1 más aCTLA-4, MBV–Pdl1 se administró intratumoralmente como se describió anteriormente, seguido de una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se describió anteriormente.

Evaluación de la distribución in vivo de MBV

Para evaluar la distribución intratumoral de MBV después de la infusión, los ratones portadores de tumores recibieron una única inyección intratumoral de BV o MBV como se describió anteriormente. Se realizó una resonancia magnética (RM) in vivo utilizando un sistema de RM para animales pequeños de 7 T (PharmaScan, Bruker) equipado con una bobina de superficie de 38 mm. Los tumores se visualizaron utilizando una secuencia de eco de espín con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR) = 2000 ms; tiempo de eco (TE) incrementado de 12 ms a 144 ms en pasos de 12 ms; tamaño de matriz = 256 × 256; y campo de visión (FOV) = 30 mm. Los mapas de relajación T2 se generaron utilizando un script MATLAB personalizado.

Después de la RM, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores, se crioseccionaron y se tiñeron con azul de Prusia para visualizar la distribución intratumoral de MNP.

Para evaluar las actividades fuera del objetivo de MBV–Pdl1 en los tejidos normales, los ratones portadores de tumores recibieron tratamiento con PBS o MBV–Pdl1–eGFP. Para minimizar la subestimación de los eventos fuera del objetivo que resultan de la eliminación inmunitaria de las células editadas, MBV–Pdl1–eGFP se administró una vez a una dosis cuatro veces mayor. 24 h después del tratamiento, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores, así como los órganos principales (corazón, riñón, pulmón, bazo e hígado). Cada tumor se cortó en 4 fragmentos. Los fragmentos de tumor y los órganos se disociaron enzimáticamente utilizando un cóctel de enzimas (20 μg/mL de DNasa I, 2 mg/mL de colagenasa tipo IV y 0,5 mg/mL de hialuronidasa tipo 1-S). Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC, un anticuerpo anti-CD44 de rata/humano conjugado con PE/cianina, un anticuerpo anti-ER-TR7 de rata/ratón/humano conjugado con Alexa Fluor 647 y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para evaluar la eficacia de la disrupción de Pdl1 en todo el tumor, se recolectaron 4 tumores más 24 h después de una única inyección de MBV–Pdl1 y se picaron en 10 a 12 piezas. El ADN genómico se extrajo de los tejidos homogeneizados mecánicamente con un kit Quick-DNA MicroPrep y se sometió a secuenciación de amplicón NGS dirigida.

Tinción de inmunofluorescencia

Para evaluar la expresión de PD-L1 y la infiltración de células dendríticas y células T, los ratones se sacrificaron 3 días después de completar cuatro ciclos de tratamiento y se recolectaron los tumores, se fijaron en 4% de paraformaldehído sobre hielo durante 2 h y se crioseccionaron. Las secciones de tejido se trataron con 0,3% de H2O2 durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la tinción. Para la detección de PD-L1, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-PD-L1 de rata conjugado con PE. Para la visualización de las células T CD3+CD8+, las secciones se bloquearon con 5% de suero de cabra durante 1 h y se incubaron con un anticuerpo anti-CD8α de conejo durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de la incubación con un anticuerpo anti-CD3 de rata conjugado con Alexa Fluor 594 y un anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 durante 1 h adicional. Las secciones se contratiñeron con Hoechst 33342 durante 5 minutos a temperatura ambiente y se montaron utilizando VectaShield Antifade Mounting Media (Vector Laboratories). De manera similar, las secciones se tiñeron para las células dendríticas (CD11c+CD86+). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse Ti2.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Los cambios inmunológicos inducidos por MBV–Pdl1 se caracterizaron mediante la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de las células inmunitarias infiltrantes del tumor aisladas de 3 tumores tratados con PBS y 3 tumores tratados con MBV–Pdl1. Dos días después del cuarto tratamiento, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores para el aislamiento de las células CD45+ siguiendo el protocolo de preparación de células de 10x Genomics. Los tumores se picaron en fragmentos de 2 a 4 mm3 y se disociaron enzimáticamente utilizando un kit de disociación de tumores (Miltenyi Biotec) durante 20 minutos a 37 °C. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y se centrifugaron a 500 g durante 7 minutos a 4 °C y se sometieron a lisis de células sanguíneas. Después del lavado, las células se etiquetaron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC y se clasificaron utilizando un clasificador de células BD FACSymphony™ S6 (Figura S13 suplementaria). Para cada tumor, se cargaron hasta 10 000 células CD45+ en un controlador de cromo (10x Genomics) para la encapsulación de células individuales. Las bibliotecas se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq 2500.

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando una canalización basada en R. Las bibliotecas de expresión génica se alinearon con el genoma de referencia del ratón GRCm39 (referencia precompilada de 10x Genomics, GRCm39–2024-A) utilizando Cell Ranger (v8.0.1). Los análisis posteriores se realizaron con Seurat (v5.3.0) ^[46].

El flujo de trabajo computacional consistió en: (i) control de calidad y filtrado para eliminar células y genes de baja calidad, (ii) normalización y escalado de los datos de expresión génica, (iii) reducción de la dimensionalidad utilizando el análisis de componentes principales (PCA), (iv) corrección de lotes e integración entre muestras utilizando Harmony (v1.1.0) ^[47], (v) construcción de un gráfico de vecinos compartidos (SNN) y agrupación no supervisada utilizando el algoritmo de Louvain y (vi) visualización utilizando la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Los grupos de células se anotaron en función de la expresión de genes marcadores canónicos (Figura S14 suplementaria).

El control de calidad y el filtrado se implementaron de la siguiente manera: se excluyeron las células con ≤200 genes detectados y los genes expresados en menos de tres células; se eliminaron las células con recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) totales o números de genes detectados por debajo del percentil 1 o por encima del percentil 99; el filtrado adicional excluyó las células con ≤1000 UMI, ≤500 genes detectados o ≥5% de contenido de transcritos mitocondriales. Se identificaron y eliminaron los posibles dobletes utilizando scDblFinder (v1.17.0) ^[48]. Después del filtrado, se retuvieron un total de 30 006 células (6405 (media) para PBS y 3597 (media) para MBV–Pdl1) para el análisis.

Las principales líneas inmunitarias, incluidas las células T, los macrófagos y las células dendríticas, se subconjuntaron para un análisis de subagrupación independiente. Dentro de cada subconjunto, los datos se renormalizaron y se reagruparon utilizando el mismo flujo de trabajo basado en Harmony, y los subgrupos se anotaron en función de los marcadores específicos de línea y estado establecidos.

Se realizó un análisis de expresión génica diferencial entre grupos o clústeres utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando el paquete clusterProfiler (v4.16.0) ^[49]. Las diferencias en las proporciones de tipos celulares entre los grupos experimentales se evaluaron utilizando una prueba hipergeométrica. Las comparaciones de las abundancias de estados celulares en diferentes ratones se consideraron exploratorias debido al número limitado de réplicas biológicas y se respaldaron con ensayos de validación ortogonales.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Los datos se analizaron utilizando pruebas t no pareadas de dos colas (con la corrección de Welch cuando las varianzas eran desiguales), análisis de varianza (ANOVA) de una vía con la prueba post hoc de Dunnett o pruebas no paramétricas (prueba U de Mann-Whitney) según corresponda. Los volúmenes tumorales al día 9 después del tratamiento (el último punto temporal en el que todos los ratones permanecieron vivos antes de que los animales de control alcanzaran los criterios de eutanasia) se compararon utilizando la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Los datos de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de Log-rank (Mantel-Cox). Los valores p exactos o los umbrales de significación y los tamaños de muestra se informan en las leyendas de las figuras. Los umbrales de expresión diferencial se definieron como un cambio de pliegue logarítmico (|log FC|) > 0,58 para el secuenciamiento de ARN a granel y |log FC| > 1 para el secuenciamiento de ARN de una sola célula, para tener en cuenta las diferencias en la variabilidad de la señal y las características del ruido entre los conjuntos de datos.

Ilustraciones esquemáticas

Las ilustraciones esquemáticas se crearon con Biorender.com.

Contenido en línea

Cualquier método, referencias adicionales, datos fuente, información complementaria, agradecimientos, detalles de las contribuciones de los autores y conflictos de intereses; y declaraciones de disponibilidad de datos y código están disponibles en línea.

Métodos en línea

Materiales

Acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3, 99,9 %), ácido oleico (90 %), oleilamina (70 %), 1,2-tetradecanodiol (90 %), éter bencílico (99 %), cloroformo (99 %), tolueno (99,9 %), DMSO (99,9 %), ferrozina (97 %) se compraron a Sigma-Aldrich. 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-mPEG2000) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[maleimido(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000-maleimido) se compraron a Avanti Polar Lipids. Péptidos TAT terminados en cisteína (CGYGRKKRRQRRR) se sintetizaron por Genscript.

El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac y Cellfectin II se compraron a Thermo Fisher Scientific. El kit de titulación qPCR BacPAK, el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS, el kit maestro PrimeScript RT y la mezcla maestra TB Green Premix Ex Taq se compraron a Takara Bio. Los plásmidos pX330 (número de catálogo 42230), pCMV-GFP (número de catálogo 11153) y pCMV-iRFP (número de catálogo 45457) se obtuvieron de Addgene. Todos los ARNg (Tabla suplementaria S1) y los cebadores de PCR (Tabla suplementaria S2, S3 y S4) se sintetizaron por Eurofins. Los cebadores xGen™ UDI para la preparación de bibliotecas NGS se compraron a Integrated DNA Technologies. El kit Quick-DNA™ MicroPrep y el kit Quick-RNA Miniprep se compraron a ZYMO Research. El reactivo de transfección jetOPTIMUS® se compró a Polyplus.

Las enzimas, los tampones y los kits utilizados para el clonado molecular, incluido el Q5® Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix, el kit de limpieza de PCR y ADN, el kit de extracción de ADN en gel, Quick CIP, la kinasa de polinucleótidos T4, el tampón de reacción de la ligasa de ADN T4, BbsI-HF, la endonucleasa I T7 y el kit de ligación rápida, se compraron a New England Biolabs. Las células competentes de E. coli 10-beta también se obtuvieron de New England Biolabs.

Todos los anticuerpos se enumeran en la Tabla suplementaria S5.

Producción de vectores de baculovirus recombinantes

Los vectores de baculovirus recombinantes se generaron utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac. Brevemente, los casetes de expresión de Cas9, ARNg y genes reporteros se insertaron en el vector pFastBac y se transformaron en células competentes DH10Bac (Figura suplementaria S2). Los bacmidos recombinantes que contienen el genoma del virus y los casetes de expresión se extrajeron utilizando el kit PureLink HiPure Plasmid Miniprep y se transfectaron en células Sf9 de insectos utilizando Cellfectin II según el protocolo del fabricante. El medio de cultivo de células de insectos que contiene los virus brotados se centrifugó y se filtró para eliminar los restos celulares utilizando filtros de tapa de botella (0,45 μm; Thermo Fisher Scientific). El vector de baculovirus recombinante recogido se amplificó en células Sf9 durante dos pasajes más. Los stocks de baculovirus en el pasaje 3 se utilizaron para todos los experimentos. Las partículas virales se concentraron y purificaron mediante filtración a través de un filtro de tapa de botella de 0,45 μm seguida de centrifugación a 6000 g durante 3 h a 4 °C. Los gránulos virales resultantes se resuspendieron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Los títulos de baculovirus se cuantificaron utilizando el kit de titulación qPCR BacPAK.

Síntesis de nanopartículas magnéticas

Las nanopartículas magnéticas (MNP) se sintetizaron utilizando un método de dos pasos adaptado de métodos previamente publicados ^[27]. Brevemente, los nanocristales de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante descomposición térmica del acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3) en éter bencílico en presencia de ácido oleico, oleilamina y 1,2-hexadecanodiol. Para que los nanocristales sean dispersables en agua, se recubrieron con una mezcla de DSPE-mPEG2000 y DSPE-PEG2000-maleimido en una relación molar de 19:1 utilizando un método de intercambio de disolventes duales ^[41]. Para la conjugación de péptidos, las MNP recién recubiertas se incubaron con péptidos TAT terminados en cisteína en una relación molar de 1:200 en 0,25× PBS durante la noche a temperatura ambiente. Los péptidos no conjugados se eliminaron mediante ultracentrifugación a 80.000 g durante 35 min a 4 °C. Las nanopartículas se lavaron, se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

El tamaño y la distribución del tamaño de los nanocristales de las MNP recubiertas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS). La curva de magnetización de los nanocristales se midió a 300 K utilizando un dispositivo de interferencia cuántica superconductora (Quantum Design MPMS). Las concentraciones de partículas se cuantificaron utilizando un ensayo de ferrozina. Se confirmó la conjugación exitosa de los péptidos TAT mediante un ensayo de cambio de gel (Figura suplementaria S1).

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon murino MC38 se obtuvieron de Kerafast y las células de insectos Sf9 se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. Todas las líneas celulares se cultivaron según los protocolos recomendados por los fabricantes.

Transducción in vitro de BV

Para evaluar la eficiencia y la dinámica temporal de la transducción de BV, las células MC38 se sembraron a una densidad de 4 × 104 células por pocillo en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Luego, las células se incubaron con DMEM/F12 que contenía BV–eGFP a diferentes multiplicidades de infección (MOI) durante 24 h, después de lo cual el medio se reemplazó con DMEM/F12 fresco. La expresión de eGFP en las células MC38 se cuantificó mediante citometría de flujo en los puntos de tiempo indicados.

Para evaluar la activación magnética y la inhibición mediada por el complemento de la transducción de BV, las células MC38 sembradas en placas de 24 pocillos se incubaron con BV–eGFP en DMEM/F12, BV–eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de suero de ratón adulto (AMS) o MBV–eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de AMS. Para las células tratadas con MBV–eGFP, las placas de cultivo se colocaron sobre una placa magnética diseñada a medida durante 30 min para permitir la activación magnética (Figura suplementaria S3). Posteriormente, las células se lavaron y se mantuvieron en DMEM/F12. La expresión de eGFP en las células MC38 se evaluó a las 24 h mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Para evaluar la activación magnética de la interrupción de Pdl1 bajo presión del complemento, las células se trataron con BV–Pdl1 o MBV–Pdl1 como se describió anteriormente. La expresión de eGFP y PD-L1 se cuantificó mediante citometría de flujo a las 24 y 48 h posteriores al tratamiento, respectivamente.

Diseño de ARNg para la interrupción de Pdl1

Se diseñaron seis ARNg guía candidatos (sgARNg) que se dirigen a los exones iniciales o regiones estructurales clave de PD-L1 utilizando una canalización bioinformática que incorpora la puntuación de bioactividad de Viena CRISPR (Tabla suplementaria S1) ^[28]. Se predijeron los posibles sitios diana y no diana utilizando la herramienta web CRISPRO (http://crispor.gi.ucsc.edu/crispor.py) ^[42], y los cuatro sitios diana no diana predichos para cada sgARNg se seleccionaron para el análisis de secuenciación de última generación (NGS) posterior.

Las células MC38 se transfectaron con el plásmido pX330-sgARNg utilizando el reactivo de transfección jetOPTIMUS. El ADN genómico se recolectó 48 h después de la transfección utilizando el kit Quick-DNA™ MicroPrep. Las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s; 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 68 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 2 min. Para los ensayos de endonucleasa I T7 (T7E1), el ADN heterodúplex no coincidente se generó desnaturalizando y reanhelando 1 μg del producto de PCR purificado, seguido de la digestión con la endonucleasa I T7 a 37 °C durante 1 h. Los productos de digestión se resolvieron en geles de agarosa al 2 %. La eficiencia de modificación génica se calculó utilizando la fórmula:

Para el análisis de indels NGS dirigidos, las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR. Los ampliconos de PCR se purificaron utilizando el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS y luego se indexaron utilizando placas de cebadores xGen™ UDI de 10 nt 1–4 (Integrated DNA Technologies) a través de un segundo paso de PCR (98 °C durante 30 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 64 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s; extensión final a 72 °C durante 2 min). Las bibliotecas indexadas se purificaron, se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se cuantificaron utilizando un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina MiSeq. Las frecuencias de indels y los perfiles de edición se analizaron utilizando CRISPResso2 (http://crispresso2.Pinellolab.org) ^[43].

Análisis transcriptómico in vitro de la transducción de BV

Las células MC38 se transducieron con BV–Pdl1, MBV–Cas9 o MBV–Pdl1 durante 48 h. El ARN total se aisló utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El perfil de expresión génica se realizó utilizando el panel nCounter® Mouse Tumor Signaling 360™. La normalización de datos, el análisis de expresión génica diferencial y el enriquecimiento de vías se realizaron utilizando el software de análisis nSolver (v4.0). Los valores p en el análisis de expresión génica diferencial se ajustaron utilizando el método de Benjamini y Yekutieli para la corrección de pruebas múltiples.

Caracterización in vitro de las respuestas inmunitarias inducidas por BV

Las respuestas inmunitarias inducidas por BV se evaluaron utilizando sistemas de cocultivo que consisten en células MC38 transducidas con BV con células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) o esplenocitos.

Para generar BMDC, se recolectaron células de médula ósea de ratones C57BL/6 hembra y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1000 U/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 800 U/mL de interleucina-4 (IL-4) durante 3 días. Las células MC38 se transducieron con BV–Pdl1 o BV–Cas9 durante 24 h, después de lo cual se sembraron a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Luego, se agregaron BMDC a las células MC38 en una relación de 2:1 (BMDC:MC38). Las BMDC tratadas con LPS (100 ng/mL) se utilizaron como control positivo. Después de 24 h adicionales de cocultivo, el ARN total se extrajo utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El ARN se transcribió inversamente a ADNc utilizando el kit maestro PrimeScript RT. La expresión génica se cuantificó mediante RT-qPCR en tiempo real utilizando TB Green Premix Ex Taq Master Mix en un sistema de RT-qPCR Bio-Rad CFX96. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt.

En experimentos paralelos, se aislaron esplenocitos de los bazo de ratones hembra C57BL/6 y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células MC38 se transfectaron con BV durante 24 h y, posteriormente, se sembraron a una concentración de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. A continuación, se añadieron esplenocitos en una proporción de 5:1 (esplenocitos:MC38). Los esplenocitos tratados con LPS se utilizaron como control positivo. Después de 24 h de cocultivo, se evaluó la citotoxicidad utilizando un ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8). La expresión génica se cuantificó mediante RT-qPCR según se describe anteriormente.

Diseño del campo magnético para la activación intratumoral de MBV

El aparato magnético utilizado para la activación intratumoral de MBV se diseñó basándose en la disponibilidad de imanes, las dimensiones del tumor y la distribución simulada de la fuerza magnética. La fuerza magnética ejercida sobre las nanopartículas magnéticas (MNP) se calculó utilizando la siguiente ecuación ^[44]:

donde denota la permeabilidad magnética del tejido circundante, es el momento magnético de las MNP y representa la densidad de flujo magnético del campo magnético aplicado.

Las distribuciones del campo magnético se calcularon definiendo la geometría del imán y calculando la densidad de flujo magnético espacial generada por la geometría del imán definida, seguida del cálculo de la fuerza magnética en función de los gradientes de campo y un modelo de Langevin de magnetización de nanopartículas. Específicamente, el flujo de trabajo computacional implicó: (i) definir la geometría y la disposición espacial de los imanes permanentes, (ii) calcular la distribución del campo magnético sobre un dominio espacial discretizado, (iii) estimar la magnetización de las nanopartículas bajo el campo aplicado utilizando una función de Langevin y (iv) calcular la fuerza magnética resultante a partir de los gradientes de campo. Se generaron mapas espaciales sobre un dominio discretizado que representa el tumor y los tejidos circundantes.

Basándose en la simulación numérica, se dispusieron cuatro imanes cilíndricos de NdFeB (grado N52; K&J Magnetics) en una configuración de polaridad alterna para maximizar el gradiente del campo magnético (Figura S9 del material suplementario). Se utilizó un soporte para animales impreso en 3D para posicionar de forma reproducible los tumores en el centro de la matriz de imanes. La distribución resultante del campo magnético y la fuerza se simularon utilizando un programa MATLAB desarrollado internamente.

Disrupción de Pdl1 activada magnéticamente in vivo

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (de 4 a 5 semanas de edad) de Charles River Laboratories. Para establecer el modelo de tumor sinérgico en ratones, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 5 × 105 células MC38 suspendidas en 100 μL de PBS en el flanco derecho. El volumen del tumor y el peso corporal se controlaron cada 3 días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = (L × W2) / 2, donde L y W denotan la longitud y el ancho del tumor, respectivamente. Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50 mm3. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor superó los 1000 mm3, de acuerdo con las pautas de punto final humano.

En los estudios de monoterapia, los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos que recibieron PBS, MNP solo, BV–Pdl1 solo, MBV–Pdl1 o anticuerpo anti-PD-L1 sistémico (aPD-L1). MBV–Pdl1 se preparó mezclando 1,5 × 107 unidades formadoras de placa (UFP) de BV–Pdl1 con 5 μg de MNP-TAT en 20 μL de PBS. Los ratones recibieron una infusión intratumoral de MBV–Pdl1 cada 3 días, para un total de cuatro dosis. El inyectado se administró utilizando una técnica de abanico, en la que la aguja se retiró parcialmente y se redirigió para facilitar la distribución intratumoral. El volumen de inyección se fijó en 0,3 × el volumen del tumor, manteniendo una concentración vectorial constante, y las soluciones se infundieron durante aproximadamente 5 minutos utilizando una bomba de jeringa. Para los ratones tratados con MNP solo o BV–Pdl1 solo, las dosis inyectadas se igualaron a los componentes correspondientes en la formulación de MBV–Pdl1. En los grupos de MNP solo o MBV–Pdl1, los ratones se colocaron lateralmente sobre un soporte para animales impreso en 3D inmediatamente después de la infusión, con los tumores alineados dentro del campo magnético y se mantuvieron bajo anestesia durante 1 h (Figura S9 del material suplementario). El aPD-L1 sistémico se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 200 μg en 100 μL de PBS con el mismo calendario de dosificación.

Para los estudios de terapia combinada, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos que recibieron PBS, aCTLA-4 sistémico, aCTLA-4 sistémico combinado con aPD-L1 o MBV–Pdl1 combinado con aCTLA-4 sistémico, administrado cada 3 días, para un total de cuatro dosis. En el grupo de aCTLA-4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μg (día 0) o 100 μg (día 3, 6 y 9) de aCTLA-4 en 100 μL de PBS ^[45]. En el grupo de aCTLA-4 más aPD-L1, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se indica anteriormente y 100 μg de aPD-L1 en 100 μL de PBS por tratamiento. En el grupo de MBV–Pdl1 más aCTLA-4, MBV–Pdl1 se administró intratumoralmente como se describe anteriormente, seguido de una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se describe anteriormente.

Evaluación de la distribución in vivo de MBV

Para evaluar la distribución intratumoral de MBV después de la infusión, los ratones con tumor recibieron una única inyección intratumoral de BV o MBV como se describe anteriormente. Se realizó una resonancia magnética (RM) in vivo utilizando un sistema de RM para animales pequeños de 7 T (PharmaScan, Bruker) equipado con una bobina de superficie de 38 mm. Los tumores se visualizaron utilizando una secuencia de eco de espín con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR) = 2000 ms; tiempo de eco (TE) incrementado de 12 ms a 144 ms en pasos de 12 ms; tamaño de matriz = 256 × 256; y campo de visión (FOV) = 30 mm. Los mapas de relajación T2 se generaron utilizando un script MATLAB personalizado.

Después de la RM, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores, se cortaron en frío y se tiñeron con azul de Prusia para visualizar la distribución intratumoral de MNP.

Para evaluar las actividades fuera del objetivo de MBV–Pdl1 en los tejidos normales, los ratones con tumor recibieron tratamiento con PBS o MBV–Pdl1–eGFP. Para minimizar la subestimación de los eventos fuera del objetivo que resultan de la eliminación inmunitaria de las células editadas, MBV–Pdl1–eGFP se administró una vez a una dosis cuatro veces mayor. 24 h después del tratamiento, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores, así como los órganos principales (corazón, riñón, pulmón, bazo e hígado). Cada tumor se cortó en 4 fragmentos. Los fragmentos de tumor y los órganos se disociaron enzimáticamente utilizando un cóctel de enzimas (20 μg/mL de DNasa I, 2 mg/mL de colagenasa tipo IV y 0,5 mg/mL de hialuronidasa tipo 1-S). Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC, un anticuerpo anti-CD44 de rata/humano conjugado con PE/cianina, un anticuerpo anti-ER-TR7 de rata/ratón/humano conjugado con Alexa Fluor 647 y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para evaluar la eficacia de la disrupción de Pdl1 en todo el tumor, se recolectaron 4 tumores más 24 h después de una única inyección de MBV–Pdl1 y se picaron en 10 a 12 piezas. El ADN genómico se extrajo de tejido homogeneizado mecánicamente con un kit Quick-DNA MicroPrep y se sometió a secuenciación de amplicón NGS dirigida.

Tinción de inmunofluorescencia

Para evaluar la expresión de PD-L1 y la infiltración de células dendríticas y células T, los ratones se sacrificaron 3 días después de completar cuatro ciclos de tratamiento y se recolectaron los tumores, se fijaron en formaldehído al 4% sobre hielo durante 2 h y se cortaron en frío. Las secciones de tejido se trataron con 0,3% de H2O2 durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la tinción. Para la detección de PD-L1, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-PD-L1 de rata conjugado con PE. Para la visualización de las células CD3+CD8+ T, las secciones se bloquearon con suero de cabra al 5% durante 1 h y se incubaron con un anticuerpo anti-CD8α de conejo durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de la incubación con un anticuerpo anti-CD3 de rata conjugado con Alexa Fluor 594 y un anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 durante 1 h adicional. Las secciones se contratiñeron con Hoechst 33342 durante 5 minutos a temperatura ambiente y se montaron utilizando VectaShield Antifade Mounting Media (Vector Laboratories). De manera similar, las secciones se tiñeron para las células dendríticas (CD11c+CD86+). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse Ti2.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Los cambios inmunológicos inducidos por MBV–Pdl1 se caracterizaron mediante la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de las células inmunitarias infiltrantes del tumor aisladas de 3 tumores tratados con PBS y 3 tumores tratados con MBV–Pdl1. Dos días después del cuarto tratamiento, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los tumores para el aislamiento de las células CD45+ siguiendo el protocolo de preparación de células de 10x Genomics. Los tumores se picaron en fragmentos de 2 a 4 mm3 y se disociaron enzimáticamente utilizando un kit de disociación de tumores (Miltenyi Biotec) durante 20 minutos a 37 °C. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y se centrifugaron a 500 g durante 7 minutos a 4 °C y se sometieron a lisis de células sanguíneas. Después del lavado, las células se etiquetaron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC y se clasificaron utilizando un clasificador de células BD FACSymphony™ S6 (Figura S13 del material suplementario). Para cada tumor, se cargaron hasta 10 000 células CD45+ en un controlador de cromo (10x Genomics) para la encapsulación de células individuales. Las bibliotecas se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq 2500.

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando una canalización basada en R. Las bibliotecas de expresión génica se alinearon con el genoma de referencia del ratón GRCm39 (referencia precompilada de 10x Genomics, GRCm39–2024-A) utilizando Cell Ranger (v8.0.1). Los análisis posteriores se realizaron con Seurat (v5.3.0) ^[46].

El flujo de trabajo computacional consistió en: (i) control de calidad y filtrado para eliminar células y genes de baja calidad, (ii) normalización y escalado de los datos de expresión génica, (iii) reducción de dimensionalidad utilizando el análisis de componentes principales (PCA), (iv) corrección de lotes e integración entre muestras utilizando Harmony (v1.1.0) ^[47], (v) construcción de un gráfico de vecinos compartidos (SNN) y agrupación no supervisada utilizando el algoritmo de Louvain y (vi) visualización utilizando la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Los grupos de células se anotaron en función de la expresión de genes marcadores canónicos (Figura S14 del material suplementario).

El control de calidad y el filtrado se implementaron de la siguiente manera: se excluyeron las células con ≤200 genes detectados y los genes expresados en menos de tres células; se eliminaron las células con recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) totales o números de genes detectados por debajo del percentil 1 o por encima del percentil 99; el filtrado adicional excluyó las células con ≤1000 UMI, ≤500 genes detectados o ≥5% de contenido de transcritos mitocondriales. Se identificaron y eliminaron los posibles dobletes utilizando scDblFinder (v1.17.0) ^[48]. Después del filtrado, se retuvieron un total de 30 006 células (6405 (media) para PBS y 3597 (media) para MBV–Pdl1) para el análisis.

Las principales líneas inmunitarias, incluidas las células T, los macrófagos y las células dendríticas, se subconjuntaron para un análisis de subagrupación independiente. Dentro de cada subconjunto, los datos se renormalizaron y se reagruparon utilizando el mismo flujo de trabajo basado en Harmony, y los subgrupos se anotaron en función de los marcadores específicos de línea y estado establecidos.

El análisis de expresión génica diferencial entre grupos o grupos experimentales se realizó utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó utilizando el paquete clusterProfiler (v4.16.0) ^[49]. Las diferencias en las proporciones de tipos de células entre los grupos experimentales se evaluaron utilizando una prueba hipergeométrica. Las comparaciones de abundancias de estados celulares entre los ratones se consideraron exploratorias debido al número limitado de réplicas biológicas y se respaldaron con ensayos de validación ortogonales.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Los datos se analizaron utilizando pruebas t no pareadas de dos colas (con la corrección de Welch cuando las varianzas eran desiguales), análisis de varianza (ANOVA) de una vía con la prueba post hoc de Dunnett o pruebas no paramétricas (prueba U de Mann-Whitney) según corresponda. Los volúmenes tumorales en el día 9 después del tratamiento (el último punto temporal en el que todos los ratones permanecieron vivos antes de que los animales de control alcanzaran los criterios de eutanasia) se compararon utilizando la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Los datos de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de Log-rank (Mantel-Cox). Los valores p exactos o los umbrales de significación y los tamaños de muestra se informan en las leyendas de las figuras. Los umbrales de expresión diferencial se definieron como el cambio de logaritmo en la expresión (|log FC|) > 0,58 para el secuenciamiento de ARN a granel y |log FC| > 1 para el secuenciamiento de ARN de una sola célula, para tener en cuenta las diferencias en la variabilidad de la señal y las características del ruido entre los conjuntos de datos.

Ilustraciones esquemáticas

Las ilustraciones esquemáticas se crearon con Biorender.com.

Contenido en línea

Cualquier método, referencias adicionales, datos de origen, información complementaria, agradecimientos, detalles de las contribuciones de los autores y conflictos de intereses; y declaraciones de disponibilidad de datos y código están disponibles en línea.

Materiales

Acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3, 99,9 %), ácido oleico (90 %), oleilamina (70 %), 1,2-tetradecanodiol (90 %), éter bencílico (99 %), cloroformo (99 %), tolueno (99,9 %), DMSO (99,9 %), ferrozina (97 %) se compraron a Sigma-Aldrich. 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-mPEG2000) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[maleimido(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000-maleimido) se compraron a Avanti Polar Lipids. Péptidos TAT terminados en cisteína (CGYGRKKRRQRRR) se sintetizaron mediante Genscript.

El sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac y Cellfectin II se compraron a Thermo Fisher Scientific. El kit de titulación BacPAK qPCR, el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS, el kit maestro PrimeScript RT y la mezcla maestra TB Green Premix Ex Taq se compraron a Takara Bio. Los plásmidos pX330 (número de catálogo 42230), pCMV-GFP (número de catálogo 11153) y pCMV-iRFP (número de catálogo 45457) se obtuvieron de Addgene. Todos los ARNg (Tabla suplementaria S1) y los cebadores de PCR (Tabla suplementaria S2, S3 y S4) se sintetizaron mediante Eurofins. Los cebadores xGen™ UDI para la preparación de bibliotecas NGS se compraron a Integrated DNA Technologies. El kit Quick-DNA™ MicroPrep y el kit Quick-RNA Miniprep se compraron a ZYMO Research. El reactivo de transfección jetOPTIMUS® se compró a Polyplus.

Las enzimas, los tampones y los kits utilizados para el clonado molecular, incluido el Q5® Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix, el kit de limpieza de PCR y ADN, el kit de extracción de ADN en gel, Quick CIP, la quinasa de polinucleótidos T4, el tampón de reacción de la ligasa de ADN T4, BbsI-HF, la endonucleasa I T7 y el kit de ligación rápida, se compraron a New England Biolabs. Las células competentes de E. coli 10-beta también se obtuvieron de New England Biolabs.

Todos los anticuerpos se enumeran en la Tabla suplementaria S5.

Producción de vectores de baculovirus

Los vectores de baculovirus recombinantes se generaron utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac. Brevemente, los casetes de expresión de Cas9, ARNg y genes reporteros se insertaron en el vector pFastBac y se transformaron en células competentes DH10Bac (Figura suplementaria S2). Los bacmidos recombinantes que contienen el genoma del virus y los casetes de expresión se extrajeron utilizando el kit PureLink HiPure Plasmid Miniprep y se transfectaron en células Sf9 de insectos utilizando Cellfectin II según el protocolo del fabricante. El medio de cultivo de células de insectos que contiene los virus en brote se centrifugó y se filtró para eliminar los restos celulares utilizando filtros de tapa de botella (0,45 μm; Thermo Fisher Scientific). El vector de baculovirus recombinante recogido se amplificó en células Sf9 durante dos pasajes más. Los bancos de baculovirus en el pasaje 3 se utilizaron para todos los experimentos. Las partículas virales se concentraron y purificaron mediante filtración a través de un filtro de tapa de botella de 0,45 μm seguida de centrifugación a 6000 g durante 3 h a 4 °C. Los gránulos virales resultantes se resuspendieron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Los títulos de baculovirus se cuantificaron utilizando el kit de titulación BacPAK qPCR.

Síntesis de nanopartículas magnéticas

Las nanopartículas magnéticas (NPM) se sintetizaron utilizando un método de dos pasos adaptado de métodos informados previamente ^[27]. Brevemente, los nanocristales de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante descomposición térmica del acetilacetonato de hierro(III) (Fe(acac)3) en éter bencílico en presencia de ácido oleico, oleilamina y 1,2-hexadecanodiol. Para que los nanocristales sean dispersables en agua, se recubrieron con una mezcla de DSPE-mPEG2000 y DSPE-PEG2000-maleimido en una relación molar de 19:1 utilizando un método de intercambio de disolventes duales ^[41]. Para la conjugación de péptidos, las NPM recién recubiertas se incubaron con péptidos TAT terminados en cisteína en una relación molar de 1:200 en 0,25× PBS durante la noche a temperatura ambiente. Los péptidos no conjugados se eliminaron mediante ultracentrifugación a 80 000 g durante 35 min a 4 °C. Las nanopartículas se lavaron, se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

El tamaño y la distribución del tamaño de los nanocristales de las NPM recubiertas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) y dispersión dinámica de luz (DLS). La curva de magnetización de los nanocristales se midió a 300 K utilizando un dispositivo de interferencia cuántica superconductora (Quantum Design MPMS). Las concentraciones de partículas se cuantificaron utilizando un ensayo de ferrozina. Se confirmó la conjugación exitosa de los péptidos TAT mediante un ensayo de cambio de gel (Figura suplementaria S1).

Cultivo celular

Las células de adenocarcinoma de colon murino MC38 se obtuvieron de Kerafast y las células de insectos Sf9 se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. Todas las líneas celulares se cultivaron según los protocolos recomendados por los fabricantes.

Transducción in vitro de BV

Para evaluar la eficiencia y la dinámica temporal de la transducción de BV, las células MC38 se sembraron a una densidad de 4 × 104 células por pocillo en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las células se incubaron luego con DMEM/F12 que contenía BV-eGFP a diferentes multiplicidades de infección (MOI) durante 24 h, después de lo cual el medio se reemplazó con DMEM/F12 fresco. La expresión de eGFP en las células MC38 se cuantificó mediante citometría de flujo en los puntos de tiempo indicados.

Para evaluar la activación magnética y la inhibición mediada por el complemento de la transducción de BV, las células MC38 sembradas en placas de 24 pocillos se incubaron con BV-eGFP en DMEM/F12, BV-eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de suero de ratón adulto (AMS) o MBV-eGFP en DMEM/F12 suplementado con 50 % de AMS. Para las células tratadas con MBV-eGFP, las placas de cultivo se colocaron sobre una placa magnética diseñada a medida durante 30 min para permitir la activación magnética (Figura suplementaria S3). Las células se lavaron posteriormente y se mantuvieron en DMEM/F12. La expresión de eGFP en las células MC38 se evaluó a las 24 h mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Para evaluar la activación magnética de la interrupción de Pdl1 bajo presión del complemento, las células se trataron con BV-Pdl1 o MBV-Pdl1 como se describió anteriormente. La expresión de eGFP y PD-L1 se cuantificó mediante citometría de flujo a las 24 y 48 h posteriores al tratamiento, respectivamente.

Diseño de los ARNg para la interrupción de Pdl1

Se diseñaron seis ARNg guía únicos (ARNg) que se dirigen a los exones iniciales o a las regiones estructurales clave de PD-L1 utilizando una canalización bioinformática que incorpora la puntuación de bioactividad de Viena CRISPR (Tabla suplementaria S1) ^[28]. Se predijeron los posibles sitios diana y no diana utilizando la herramienta web CRISPRO (http://crispor.gi.ucsc.edu/crispor.py) ^[42], y los cuatro sitios diana no diana predichos para cada ARNg se seleccionaron para el análisis de secuenciación de última generación (NGS) posterior.

Las células MC38 se transfectaron con el plásmido pX330-sgRNA utilizando el reactivo de transfección jetOPTIMUS. El ADN genómico se recogió 48 h después de la transfección utilizando el kit Quick-DNA™ MicroPrep. Las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 30 s; 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 68 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de una extensión final a 72 °C durante 2 min. Para los ensayos de endonucleasa I T7 (T7E1), el ADN heterodúplex desajustado se generó desnaturalizando y reanhelando 1 μg del producto de PCR purificado, seguido de la digestión con la endonucleasa I T7 a 37 °C durante 1 h. Los productos de digestión se resolvieron en geles de agarosa al 2 %. La eficiencia de modificación génica se calculó utilizando la fórmula:

Para el análisis de indels NGS dirigidos, las regiones genómicas que abarcan los sitios de escisión CRISPR-Cas9 se amplificaron mediante PCR. Los ampliconos de PCR se purificaron utilizando el kit de limpieza y selección de tamaño NucleoMag® NGS y luego se indexaron utilizando placas de cebadores xGen™ UDI de 10 nt 1-4 (Integrated DNA Technologies) a través de un segundo paso de PCR (98 °C durante 30 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 64 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s; extensión final a 72 °C durante 2 min). Las bibliotecas indexadas se purificaron, se verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se cuantificaron utilizando un fluorómetro Qubit (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina MiSeq. Las frecuencias de indels y los perfiles de edición se analizaron utilizando CRISPResso2 (http://crispresso2.Pinellolab.org) ^[43].

Análisis transcripcional in vitro de la transducción de BV

Las células MC38 se transducieron con BV-Pdl1, MBV-Cas9 o MBV-Pdl1 durante 48 h. El ARN total se aisló utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El perfil de expresión génica se realizó utilizando el panel nCounter® Mouse Tumor Signaling 360™. La normalización de datos, el análisis de expresión génica diferencial y el enriquecimiento de vías se realizaron utilizando el software de análisis nSolver (v4.0). Los valores p en el análisis de expresión génica diferencial se ajustaron utilizando el método de Benjamini y Yekutieli para la corrección de pruebas múltiples.

Caracterización in vitro de las respuestas inmunitarias inducidas por BV

Las respuestas inmunitarias inducidas por BV se evaluaron utilizando sistemas de cocultivo que consisten en células MC38 transducidas con BV con células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) o esplenocitos.

Para generar BMDC, se recogieron células de la médula ósea de ratones C57BL/6 hembra y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1000 U/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y 800 U/mL de interleucina-4 (IL-4) durante 3 días. Las células MC38 se transducieron con BV-Pdl1 o BV-Cas9 durante 24 h, después de lo cual se sembraron a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Luego, se agregaron BMDC a las células MC38 en una relación de 2:1 (BMDC:MC38). Las BMDC tratadas con LPS (100 ng/mL) se utilizaron como control positivo. Después de 24 h adicionales de cocultivo, el ARN total se extrajo utilizando el kit Quick-RNA Miniprep. El ARN se transcribió inversamente a ADNc utilizando el kit maestro PrimeScript RT. La expresión génica se cuantificó mediante RT-qPCR en tiempo real utilizando TB Green Premix Ex Taq Master Mix en un sistema de RT-qPCR Bio-Rad CFX96. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2−ΔΔCt.

En experimentos paralelos, se aislaron esplenocitos de los bazo de ratones C57BL/6 hembra y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de SFB, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células MC38 se transducieron con BV durante 24 h y luego se sembraron a 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos durante la noche. Luego, se agregaron esplenocitos en una relación de 5:1 (esplenocitos:MC38). Los esplenocitos tratados con LPS se utilizaron como control positivo. Después de 24 h de cocultivo, la citotoxicidad se evaluó utilizando un ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8). La expresión génica se cuantificó mediante RT-qPCR como se describió anteriormente.

Diseño del campo magnético para la activación intratumoral de MBV

El dispositivo magnético utilizado para la activación intratumoral de MBV se diseñó basándose en la disponibilidad de imanes, las dimensiones del tumor y la distribución simulada de la fuerza magnética. La fuerza magnética ejercida sobre las nanopartículas magnéticas (MNP) se calculó utilizando la siguiente ecuación ^[44]:

donde denota la permeabilidad magnética del tejido circundante, es el momento magnético de las MNP y representa la densidad de flujo magnético del campo magnético aplicado.

Las distribuciones del campo magnético se calcularon definiendo la geometría del imán y calculando la densidad de flujo magnético espacial generada por la geometría del imán definida, seguida del cálculo de la fuerza magnética basándose en los gradientes de campo y un modelo de Langevin de la magnetización de las nanopartículas. Específicamente, el flujo de trabajo computacional incluyó: (i) definición de la geometría y la disposición espacial de los imanes permanentes, (ii) cálculo de la distribución del campo magnético sobre un dominio espacial discretizado, (iii) estimación de la magnetización de las nanopartículas bajo el campo aplicado utilizando una función de Langevin y (iv) cálculo de la fuerza magnética resultante a partir de los gradientes de campo. Se generaron mapas espaciales sobre un dominio discretizado que representa el tumor y los tejidos circundantes.

Basándose en la simulación numérica, se dispusieron cuatro imanes cilíndricos de NdFeB (grado N52; K&J Magnetics) en una configuración de polaridad alternante para maximizar el gradiente del campo magnético (Figura S9 del material suplementario). Se utilizó una cama para animales impresa en 3D a medida para posicionar de forma reproducible los tumores en el centro de la matriz de imanes. La distribución resultante del campo magnético y la fuerza se simularon utilizando un programa MATLAB desarrollado internamente.

Disrupción de Pdl1 activada magnéticamente in vivo

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (de 4 a 5 semanas de edad) de Charles River Laboratories. Para establecer el modelo de tumor sinérgico en ratones, los ratones recibieron una inyección subcutánea de 5 × 105 células MC38 suspendidas en 100 μL de PBS en el flanco derecho. El volumen del tumor y el peso corporal se controlaron cada 3 días. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula V = (L × W2) / 2, donde L y W denotan la longitud y el ancho del tumor, respectivamente. Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50 mm3. Los ratones fueron sacrificados cuando el volumen del tumor superó los 1000 mm3, de acuerdo con las pautas de criterios de finalización.

En los estudios de monoterapia, los ratones se asignaron aleatoriamente a cinco grupos que recibieron PBS, MNP solo, BV–Pdl1 solo, MBV–Pdl1 o anticuerpo anti-PD-L1 sistémico (aPD-L1). MBV–Pdl1 se preparó mezclando 1,5 × 107 unidades formadoras de placa (UFP) de BV–Pdl1 con 5 μg de MNP-TAT en 20 μL de PBS. Los ratones recibieron una infusión intratumoral de MBV–Pdl1 cada 3 días, para un total de cuatro dosis. El inyectado se administró utilizando una técnica de abanico, en la que la aguja se retiró parcialmente y se redirigió para facilitar la distribución intratumoral. El volumen de inyección se fijó en 0,3 × el volumen del tumor, manteniendo una concentración vectorial constante, y las soluciones se infundieron durante aproximadamente 5 minutos utilizando una bomba de jeringa. Para los ratones tratados con MNP solo o BV–Pdl1 solo, las dosis inyectadas se igualaron a los componentes correspondientes en la formulación de MBV–Pdl1. En los grupos de MNP solo o MBV–Pdl1, los ratones se colocaron lateralmente sobre una cama para animales impresa en 3D inmediatamente después de la infusión, con los tumores alineados dentro del campo magnético y se mantuvieron bajo anestesia durante 1 hora (Figura S9 del material suplementario). El aPD-L1 sistémico se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 200 μg en 100 μL de PBS con el mismo programa de dosificación.

Para los estudios de terapia combinada, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos que recibieron PBS, aCTLA-4 sistémico, aCTLA-4 sistémico combinado con aPD-L1 o MBV–Pdl1 combinado con aCTLA-4 sistémico, administrado cada 3 días, para un total de cuatro dosis. En el grupo de aCTLA-4, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μg (día 0) o 100 μg (día 3, 6 y 9) de aCTLA-4 en 100 μL de PBS ^[45]. En el grupo de aCTLA-4 más aPD-L1, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se indicó anteriormente y 100 μg de aPD-L1 en 100 μL de PBS por tratamiento. En el grupo de MBV–Pdl1 más aCTLA-4, MBV–Pdl1 se administró intratumoralmente como se describió anteriormente, seguido de una inyección intraperitoneal de aCTLA-4 como se describió anteriormente.

Evaluación de la distribución in vivo de MBV

Para evaluar la distribución intratumoral de MBV después de la infusión, los ratones con tumor recibieron una única inyección intratumoral de BV o MBV como se describió anteriormente. Se realizó una resonancia magnética (RM) in vivo utilizando un sistema de RM para animales pequeños de 7 T (PharmaScan, Bruker) equipado con una bobina de superficie de 38 mm. Los tumores se visualizaron utilizando una secuencia de eco de espín con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR) = 2000 ms; tiempo de eco (TE) incrementado de 12 ms a 144 ms en pasos de 12 ms; tamaño de matriz = 256 × 256; y campo de visión (FOV) = 30 mm. Los mapas de relajación T2 se generaron utilizando un script MATLAB personalizado.

Después de la RM, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los tumores, se cortaron en secciones criogénicas y se tiñeron con azul de Prusia para visualizar la distribución intratumoral de MNP.

Para evaluar las actividades fuera del objetivo de MBV–Pdl1 en los tejidos normales, los ratones con tumor fueron tratados con PBS o MBV–Pdl1–eGFP. Para minimizar la subestimación de los eventos fuera del objetivo que resultan de la eliminación inmunitaria de las células editadas, MBV–Pdl1–eGFP se administró una vez a una dosis cuatro veces mayor. 24 horas después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los tumores, así como los órganos principales (corazón, riñón, pulmón, bazo e hígado). Cada tumor se cortó en 4 fragmentos. Los fragmentos de tumor y los órganos se disociaron enzimáticamente utilizando una mezcla de enzimas (20 μg/mL de DNasa I, 2 mg/mL de colagenasa tipo IV y 0,5 mg/mL de hialuronidasa tipo 1-S). Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC, un anticuerpo anti-CD44 de rata/humano conjugado con PE/cianina, un anticuerpo anti-ER-TR7 de rata/humano/rata conjugado con Alexa Fluor 647 y se analizaron mediante citometría de flujo.

Para evaluar la eficiencia de la disrupción de Pdl1 en todo el tumor, se recolectaron 4 tumores más 24 horas después de una única inyección de MBV–Pdl1 y se picaron en 10 a 12 piezas. El ADN genómico se extrajo de tejido homogeneizado mecánicamente con un kit Quick-DNA MicroPrep y se sometió a secuenciación de amplicones NGS dirigida.

Tinción de inmunofluorescencia

Para evaluar la expresión de PD-L1 y la infiltración de células dendríticas y células T, los ratones fueron sacrificados 3 días después de completar cuatro ciclos de tratamiento, y se recolectaron los tumores, se fijaron en formaldehído al 4% sobre hielo durante 2 horas y se cortaron en secciones criogénicas. Las secciones de tejido se trataron con 0,3% de H2O2 durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la tinción. Para la detección de PD-L1, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-PD-L1 de rata conjugado con PE. Para la visualización de las células T CD3+CD8+, las secciones se bloquearon con suero de cabra al 5% durante 1 hora y se incubaron con un anticuerpo anti-CD8α de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de la incubación con un anticuerpo anti-CD3 de rata conjugado con Alexa Fluor 594 y un anticuerpo anti-IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 durante 1 hora adicional. Las secciones se contratiñeron con Hoechst 33342 durante 5 minutos a temperatura ambiente y se montaron utilizando un medio de montaje VectaShield Antifade (Vector Laboratories). De manera similar, las secciones se tiñeron para las células dendríticas (CD11c+CD86+). Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse Ti2.

Secuenciación de ARN de una sola célula

Los cambios inmunológicos inducidos por MBV–Pdl1 se caracterizaron mediante la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de las células inmunitarias infiltrantes del tumor aisladas de 3 tumores tratados con PBS y 3 tumores tratados con MBV–Pdl1. Dos días después del cuarto tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los tumores para el aislamiento de las células CD45+ siguiendo el protocolo de preparación de células de 10x Genomics. Los tumores se picaron en fragmentos de 2 a 4 mm3 y se disociaron enzimáticamente utilizando un kit de disociación de tumores (Miltenyi Biotec) durante 20 minutos a 37 °C. Las suspensiones celulares se filtraron a través de un tamiz celular de 40 μm y se centrifugaron a 500 g durante 7 minutos a 4 °C y se sometieron a lisis de células sanguíneas. Después del lavado, las células se etiquetaron con un anticuerpo anti-CD45 de rata conjugado con APC y se clasificaron utilizando un clasificador de células BD FACSymphony™ S6 (Figura S13 del material suplementario). Para cada tumor, se cargaron hasta 10 000 células CD45+ en un controlador de cromo (10x Genomics) para la encapsulación de una sola célula. Las bibliotecas se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq 2500.

Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron utilizando una canalización basada en R. Las bibliotecas de expresión génica se alinearon con el genoma de referencia del ratón GRCm39 (referencia precompilada de 10x Genomics, GRCm39–2024-A) utilizando Cell Ranger (v8.0.1). Los análisis posteriores se realizaron con Seurat (v5.3.0) ^[46].

El flujo de trabajo computacional consistió en: (i) filtrado de control de calidad para eliminar células y genes de baja calidad, (ii) normalización y escalado de los datos de expresión génica, (iii) reducción de dimensionalidad utilizando el análisis de componentes principales (PCA), (iv) corrección de lotes e integración entre muestras utilizando Harmony (v1.1.0) ^[47], (v) construcción de un gráfico de vecinos compartidos (SNN) y agrupación no supervisada utilizando el algoritmo de Louvain y (vi) visualización utilizando la aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP). Los grupos de células se anotaron en función de la expresión de genes marcadores canónicos (Figura S14 del material suplementario).

El filtrado de control de calidad se implementó de la siguiente manera: se excluyeron las células con ≤200 genes detectados y los genes expresados en menos de tres células; se eliminaron las células con recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) totales o números de genes detectados por debajo del percentil 1 o por encima del percentil 99; el filtrado adicional excluyó las células con ≤1000 UMI, ≤500 genes detectados o ≥5% de contenido de transcritos mitocondriales. Se identificaron y eliminaron los posibles dobletes utilizando scDblFinder (v1.17.0) ^[48]. Después del filtrado, se retuvieron un total de 30 006 células (6405 (media) para PBS y 3597 (media) para MBV–Pdl1) para el análisis.

Las principales líneas inmunitarias, incluidas las células T, los macrófagos y las células dendríticas, se subconjuntaron para un análisis de subagrupación independiente. Dentro de cada subconjunto, los datos se renormalizaron y se reagruparon utilizando el mismo flujo de trabajo basado en Harmony, y los subgrupos se anotaron en función de los marcadores específicos de línea y estado establecidos.

El análisis de expresión génica diferencial entre grupos o grupos experimentales se realizó utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó utilizando el paquete clusterProfiler (v4.16.0) ^[49]. Las diferencias en las proporciones de tipos de células entre los grupos experimentales se evaluaron utilizando una prueba hipergeométrica. Las comparaciones de abundancias de estados celulares entre los ratones se consideraron exploratorias debido a los limitados replicados biológicos y se respaldaron con ensayos de validación ortogonales.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Los datos se analizaron utilizando pruebas t no pareadas de dos colas (con corrección de Welch cuando las varianzas eran desiguales), análisis de varianza (ANOVA) de una vía con la prueba post hoc de Dunnett o pruebas no paramétricas (prueba de Mann-Whitney U) según corresponda. Los volúmenes tumorales en el día 9 después del tratamiento (el último punto de tiempo en el que todos los ratones permanecieron vivos antes de que los animales de control alcanzaran los criterios de finalización) se compararon utilizando la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Los datos de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Los valores p exactos o los umbrales de significación y los tamaños de muestra se informan en las leyendas de las figuras. Los umbrales de expresión diferencial se definieron como un cambio de registro (log FC) > 0,58 para la secuenciación de ARN a granel y |log FC| > 1 para la secuenciación de ARN de una sola célula para tener en cuenta las diferencias en la variabilidad de la señal y las características del ruido entre los conjuntos de datos.

Ilustraciones esquemáticas

Las ilustraciones esquemáticas se crearon con Biorender.com.

Contenido en línea

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