Landscape de mutaciones en KRAS, NRAS y BRAF en pacientes serbios con cáncer colorrectal de inicio temprano.

El cáncer colorrectal (CCR) representa un importante desafío para la salud a nivel mundial, ocupando el tercer lugar entre los cánceres más diagnosticados y siendo la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. Según los datos de GLOBOCAN, en 2022 se registraron aproximadamente 1,93 millones de nuevos casos y 904 000 muertes atribuibles al CCR, lo que representa el 9,6% de todos los diagnósticos de cáncer y el 9,3% de las muertes por cáncer a nivel mundial.^[1] Si bien tradicionalmente se ha considerado el CCR como una enfermedad de los adultos mayores, en las últimas décadas se ha observado un preocupante aumento en la incidencia de CCR de inicio temprano (CCIE) del 1,4% anual, a pesar de una disminución anual del 3,1% en la incidencia de CCR entre individuos mayores de 50 años.^[2]-^[4] En los Estados Unidos, aproximadamente el 10% de todos los casos de CCR se diagnostican en pacientes menores de 50 años.^[5] Considerando las tendencias recientes, se estima que para 2030, la incidencia de cáncer de colon y recto de inicio temprano aumentará en un 90% y un 124%, respectivamente, y se espera que aproximadamente el 11% de los cánceres de colon y el 23% de los cánceres de recto ocurran en individuos menores de 50 años. Estas proyecciones indican que el CCIE se está convirtiendo claramente en un problema crítico de salud pública a nivel mundial.^[6]

El CCR también representa un importante desafío para la salud pública en Serbia, y los datos recientes destacan su importante carga sobre el sistema nacional de salud. Según los datos de 2022 del Registro Nacional de Cáncer del Instituto de Salud Pública de Serbia “Dr. Milan Jovanović Batut”, se diagnosticaron 5199 nuevos casos de CCR (2053 mujeres y 3146 hombres), lo que representa el 12,5% de todos los casos de cáncer. El CCR se ubicó como el segundo cáncer más común y la segunda causa principal de morbilidad relacionada con el cáncer en el país.^[7] Serbia introdujo un programa nacional organizado de detección de CCR en diciembre de 2012, dirigido a individuos de entre 50 y 74 años con invitaciones bienales para la prueba de sangre oculta en heces, seguida de colonoscopia para los casos positivos.^[8] Sin embargo, este esquema excluye a los individuos menores de 50 años, dejando a la población más joven fuera de la detección temprana organizada. Cabe destacar que la proporción de casos de CCIE en Serbia (8,2%) es similar a la que se informa en los Estados Unidos (10%).^[7] Dada la creciente carga de CCIE en Serbia, es esencial realizar más investigaciones para dilucidar sus factores de riesgo subyacentes, informar sobre estrategias de prevención específicas, mejorar los esfuerzos de detección temprana y guiar los enfoques terapéuticos personalizados en las poblaciones más jóvenes.

El enfoque terapéutico actual del CCR avanzado depende en gran medida de las características del paciente y del tumor, específicamente la ubicación del tumor y el perfil molecular, en particular la presencia de mutaciones en los protooncogenes KRAS, NRAS y BRAF,^[9] lo que impacta directamente en la elección de las terapias dirigidas. Las mutaciones de KRAS se identifican en el 35-45% de los casos de CCR, más comúnmente en los codones 12 y 13 del exón 2, mientras que NRAS mutado está presente en el 7,5% de los casos en los codones 12, 13 o 61.^[10] Estas mutaciones dan como resultado la acumulación de la proteína RAS en su forma activa, lo que promueve la proliferación, diferenciación, apoptosis y supervivencia celular. KRAS mutado es un fuerte predictor independiente de la supervivencia en pacientes con CCR,^[11]-^[13] y también se asocia con el desarrollo de metástasis pulmonares^[11],^[14] y hepáticas,^[12] así como con un mal pronóstico.^[15],^[16] Por lo tanto, la evaluación precisa y sensible del estado de mutación de RAS se ha vuelto crucial para guiar las decisiones de tratamiento personalizadas. Además de KRAS y NRAS, las mutaciones en BRAF ocurren en aproximadamente el 11% de todos los CCR,^[17],^[18] y también desempeñan un papel clave en la progresión tumoral. Aunque existen alrededor de 30 mutaciones diferentes de BRAF, la mutación V600E en el exón 15 es la más común, y representa el 90% de todos los CCR con mutación de BRAF.^[19] Esta mutación se asocia con una menor supervivencia global y resistencia a la terapia anti-EGFR, lo que la convierte en un reconocido marcador de mal pronóstico y predicción.^[20]-^[22] Las guías recomiendan pruebas de rutina para el estado de BRAF en CCR metastásico (CCRM), especialmente en pacientes con KRAS salvaje, ya que las mutaciones de KRAS y BRAF son generalmente mutuamente excluyentes.^[23] En la práctica clínica habitual en Serbia, se realizan pruebas de mutación de KRAS y NRAS, pero no se publican los subtipos de mutación específicos, mientras que las pruebas de BRAF generalmente se dirigen a la variante V600E. Sin embargo, conocer la mutación exacta de KRAS es cada vez más importante, ya que recientemente se han desarrollado varios inhibidores de KRAS específicos para subtipos, y algunos ya han sido aprobados, principalmente para su uso en cáncer de pulmón de células no pequeñas y, más recientemente, con una aplicación extendida para CCRM.^[24]-^[27] Dada la creciente carga y la alta incidencia de CCIE en Serbia, este estudio tiene como objetivo caracterizar las tendencias epidemiológicas de la incidencia de CCIE y las pruebas de diagnóstico en Serbia, junto con proporcionar un perfil molecular detallado de las mutaciones de KRAS, NRAS y BRAF en pacientes con CCIE. Al integrar los datos de incidencia y los análisis de mutaciones, buscamos informar sobre políticas de detección oportunas y optimizar los enfoques de tratamiento personalizados para los pacientes con CCR más jóvenes en Serbia.

Material y Métodos

Diseño del Estudio

Este estudio comprendió dos componentes complementarios: a. un análisis temporal basado en la población de la incidencia de CCIE en Serbia a partir de los datos del registro nacional de cáncer (Población 1), y b. un análisis molecular retrospectivo de pacientes con CCIE, que incluye una gran cohorte clínicamente evaluada que utiliza ensayos de PCR cuantitativa registrados como IVD (Población 2) y una población secuenciada más pequeña (Población 3).

Análisis de la Incidencia de CCIE (Población 1)

Las tasas de incidencia de CCIE se obtuvieron mediante el análisis de los datos oficiales del registro nacional de cáncer del Instituto de Salud Pública de Serbia “Dr. Milan Jovanović Batut” para el período 2016-2022, utilizando datos anonimizados y datos disponibles públicamente (https://www.batut.org.rs/index.php content=2096). El CCIE se definió como CCR diagnosticado antes de los 50 años. El resultado primario para este análisis fue la tasa de incidencia específica por edad de CCIE. El año del diagnóstico se consideró como la variable de exposición. El conjunto de datos basado en el registro incluyó datos de incidencia agregados y no contenía variables clínicas o moleculares a nivel individual.

Cohorte Molecular Retrospectiva (Población 2)

Se identificaron un total de 681 pacientes de entre 18 y 50 años con CCIE confirmado histológicamente a partir de bases de datos institucionales y se incluyeron en esta cohorte retrospectiva. Los pacientes eran elegibles si tenían CCR primario o metastásico confirmado histológicamente. Se incluyeron tanto tumores de colon como de recto. Los criterios de exclusión fueron la edad >50 años en el momento del diagnóstico, la falta de confirmación histológica o la presencia de tejido tumoral insuficiente o inadecuado para el análisis molecular. Se incluyeron todos los pacientes consecutivos que cumplían con los criterios de inclusión y exclusión durante el período de estudio. Dado que este fue un estudio observacional retrospectivo, el tamaño de la muestra se determinó por la disponibilidad de datos en lugar de un cálculo de potencia predefinido.

Para 681 pacientes con CCRM, el estado de mutación de KRAS se había determinado previamente entre 2008 y 2024 en el Instituto de Oncología y Radiología de Serbia utilizando ensayos de PCR cuantitativa registrados como IVD^[9] en todos los pacientes, mientras que NRAS se determinó en 420 de esos 681, y BRAF en 67 de esos 681. Los resultados primarios para esta cohorte fueron el estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF. Las variables predictoras incluyeron la edad en el momento del diagnóstico, el sexo y la ubicación del tumor primario (colon frente a recto). Los posibles factores de confusión considerados en los análisis incluyeron la edad, el sexo, la ubicación del tumor y el estadio de la enfermedad. No se especificaron previamente los modificadores de efecto.

Subconjunto Secuenciado (Población 3)

Debido a la falta de datos de mutación a nivel de variante en la Población 2, se seleccionó un subconjunto de 54 pacientes que cumplieron con los mismos criterios de inclusión y exclusión y que tenían tejido tumoral disponible con una calidad de ADN adecuada para el secuenciamiento de KRAS exón 2 y BRAF V600E, lo que permitió una caracterización precisa del espectro de mutaciones a nivel de variante.

Estos pacientes se incluyeron consecutivamente en función de la disponibilidad de tejido tumoral representativo de formalina fijada e incrustada en parafina (FFPE) adecuado para el secuenciamiento. Las muestras de tumor se obtuvieron de la Primera Clínica de Cirugía del Centro Clínico Universitario de Serbia. Este subconjunto se utilizó para permitir una evaluación basada en el secuenciamiento directo de las mutaciones de KRAS exón 2 y BRAF V600E. No se puede excluir por completo un posible sesgo de selección relacionado con la disponibilidad de tejido.

Para garantizar la comparabilidad entre los grupos de pacientes, el estado de mutación de las pruebas basadas en PCR y el secuenciamiento se clasificó como binario (mutado frente a salvaje), y se aplicaron definiciones de mutación armonizadas en todos los análisis.

Sesgos y Consideraciones Éticas

Para minimizar el sesgo de selección, solo se incluyeron pacientes con CCIE confirmado histológicamente y con suficiente material tumoral. El sesgo de información se redujo mediante el uso de ensayos moleculares estandarizados y validados y procedimientos de prueba centralizados. Dado que este fue un estudio retrospectivo, no se puede excluir por completo el sesgo residual y la confusión. Todos los datos de los pacientes se anonimizaron antes del análisis.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (1975, revisada en 2024) y fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico Universitario de Serbia (Ref. No.: 175/1; Fecha: 27 de abril de 2021) y el Comité de Ética del Instituto de Oncología y Radiología de Serbia (Aprobación No.: 01-1/2023/701; Fecha: 30 de marzo de 2023). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la intervención quirúrgica.

Genotipado de KRAS y BRAF

Todas las muestras de tumor de formalina fijada e incrustada en parafina (FFPE) fueron revisadas por un patólogo para confirmar el diagnóstico y estimar la celularidad del tumor. Solo se consideraron adecuadas para el análisis molecular las muestras con un contenido tumoral estimado de ≥20%. Para aislar el ADN, se cortó aproximadamente 0,1 cm3 de bloque de tejido incrustado en parafina utilizando un bisturí estéril. El tejido se desparafinizó añadiendo 1 ml de xileno (Merck, Alemania), agitándolo durante 5 minutos y centrifugándolo a 13 000 rpm durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, se repitió el paso de desparafinización con 1 ml de xileno. Luego, el tejido desparafinado se lavó dos veces añadiendo 1 ml de etanol, agitándolo durante 1 minuto, centrifugándolo a 13 000 rpm durante 5 minutos y desechando el sobrenadante. Posteriormente, el pellet se lavó con 1 ml de etanol al 70% en las mismas condiciones y, después de retirar el sobrenadante, se dejó secar durante 1 hora a 37 °C. El ADN se aisló utilizando el kit QIAamp Fast DNA Tissue Kit según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Alemania). Se evaluó la concentración y la pureza del ADN antes del análisis. Las muestras que produjeron una cantidad insuficiente de ADN o una amplificación de mala calidad se extrajeron nuevamente o se excluyeron del análisis posterior.

Para la genotipificación de KRAS y BRAF, las secuencias de ADN de las regiones de interés (165 pares de bases (pb) y 224 pb, respectivamente) se amplificaron utilizando los siguientes cebadores: KRAS Fwd: AAG GCC TGC TGA AAA TGA CTG; KRAS Rev: GGT CCT GCA CCA GTA ATA TGC A; BRAF Fwd: TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA y BRAF Rev: GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 µL, que contenía aproximadamente 500 ng de ADN, 1 U de ADN polimerasa KAPA Taq (Kapa Biosystems, EE. UU.), 1X de tampón KAPA Taq A, 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP y 10 pmol de cada cebador. Las condiciones de ciclado consistieron en una desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, con una extensión final a 72 °C durante 10 min. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems; ThermoFisher Scientific, Inc., EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La electroforesis capilar se realizó en el analizador genético 3730 (Applied Biosystems). Los resultados se analizaron utilizando el software de análisis de secuencias 5.2 (Applied Biosystems). La secuenciación de Sanger se realizó utilizando un protocolo estandarizado y validado de forma rutinaria en nuestro laboratorio. Los productos de PCR se secuenciaron en ambas direcciones y los cromatogramas se revisaron de forma independiente para garantizar una lectura precisa de las bases. Cada ejecución de secuenciación incluyó los controles positivos y negativos adecuados. Las ejecuciones se consideraron exitosas cuando se obtuvieron electroferogramas claros y de alta calidad con una resolución de picos inequívoca. Las muestras que arrojaron cromatogramas de baja calidad o ambiguos se reamplificaron y se resecuenciaron. Este enfoque garantizó la reproducibilidad y la fiabilidad de la detección de mutaciones utilizando la metodología convencional de secuenciación de Sanger.

Análisis estadístico

Las variables cuantitativas se trataron de la siguiente manera: la edad al diagnóstico se analizó como una variable continua y se resumió utilizando estadísticas descriptivas. Las tasas de incidencia de CCRC en pacientes jóvenes se calcularon anualmente y se analizaron en los años del calendario, tratándolos como variables ordenadas. La ubicación del tumor se analizó como una variable categórica (colon frente a recto). El estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF se analizó como variables binarias (mutado frente a tipo salvaje). Las asociaciones entre el estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF y las variables clinicopatológicas se evaluaron utilizando la prueba ?2. Los análisis estadísticos descriptivos y comparativos se realizaron utilizando IBM SPSS Statistics (versión 20; IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.). Las tendencias lineales en las proporciones de incidencia de CCRC en pacientes jóvenes a lo largo de los años del calendario ordenados se evaluaron utilizando la prueba de tendencia de Cochran-Armitage implementada en R versión 4.3.1, probando un aumento o disminución monótona en el resultado binario. Las tendencias temporales en las pruebas moleculares de 2008 a 2025 se evaluaron utilizando la regresión de Poisson en R, con el número de pacientes analizados por año modelado como una función del año de diagnóstico. Las razones de tasas con intervalos de confianza del 95% se utilizaron para cuantificar el cambio anual en los recuentos de pruebas. Se analizaron los recuentos absolutos de pruebas, ya que no estaban disponibles los recuentos totales de pacientes por año, por lo que estos resultados describen las tendencias en los números de pruebas observados en lugar de la probabilidad de prueba. Se aplicó un nivel de significación bilateral de 0,05 en todo el estudio. La presentación de este estudio se ajusta a las directrices STROBE.^[28]

Diseño del estudio

Este estudio comprendió dos componentes complementarios: a. un análisis temporal basado en la población de la incidencia de CCRC en pacientes jóvenes en Serbia a partir de los datos del registro nacional de cáncer (Población 1), y b. un análisis molecular retrospectivo de pacientes con CCRC en pacientes jóvenes, que incluye una gran cohorte clínicamente probada que utiliza ensayos de PCR cuantitativa registrados como IVD (Población 2) y una población secuenciada más pequeña (Población 3).

Análisis de la incidencia de CCRC en pacientes jóvenes (Población 1)

Las tasas de incidencia de CCRC en pacientes jóvenes se obtuvieron analizando los datos oficiales del registro nacional de cáncer del Instituto de Salud Pública de Serbia "Dr. Milan Jovanović Batut" para el período 2016-2022 utilizando datos anonimizados y datos de dominio público (https://www.batut.org.rs/index.php content=2096). CCRC en pacientes jóvenes se definió como CCRC diagnosticado antes de los 50 años. El resultado primario para este análisis fue la tasa de incidencia específica por edad de CCRC en pacientes jóvenes. El año del calendario del diagnóstico se consideró la variable de exposición. El conjunto de datos basado en el registro incluyó datos de incidencia agregados y no contenía variables clínicas o moleculares a nivel individual.

Cohorte molecular retrospectiva (Población 2)

Se identificaron un total de 681 pacientes de entre 18 y 50 años con CCRC en pacientes jóvenes confirmado histológicamente a partir de bases de datos institucionales y se incluyeron en esta cohorte retrospectiva. Los pacientes eran elegibles si tenían CCRC primario o metastásico confirmado histológicamente. Se incluyeron tanto los tumores de colon como los de recto. Los criterios de exclusión fueron la edad > 50 años en el momento del diagnóstico, la falta de confirmación histológica o la insuficiencia o inadecuación del tejido tumoral para el análisis molecular. Se incluyeron todos los pacientes consecutivos que cumplían los criterios de inclusión y exclusión durante el período de estudio. Dado que este fue un estudio observacional retrospectivo, el tamaño de la muestra se determinó por la disponibilidad de datos en lugar de un cálculo de potencia predefinido.

Para 681 pacientes con CCRC metastásico, el estado de mutación de KRAS se había determinado previamente entre 2008 y 2024 en el Instituto de Oncología y Radiología de Serbia utilizando ensayos de PCR cuantitativa registrados como IVD^[9] en todos los pacientes, mientras que NRAS se determinó en 420 de esos 681, y BRAF en 67 de esos 681. Los resultados primarios para esta cohorte fueron el estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF. Las variables predictoras incluyeron la edad al diagnóstico, el sexo y la ubicación del tumor primario (colon frente a recto). Los posibles factores de confusión considerados en los análisis incluyeron la edad, el sexo, la ubicación del tumor y el estadio de la enfermedad. No se especificaron previamente los modificadores de efecto.

Subconjunto secuenciado (Población 3)

Debido a la falta de datos de mutación a nivel de variante en la Población 2, se seleccionó un subconjunto de 54 pacientes que cumplían los mismos criterios de inclusión y exclusión y que tenían tejido tumoral disponible con una calidad de ADN adecuada para la secuenciación de Sanger del exón 2 de KRAS y BRAF V600E, lo que permitió una caracterización precisa del espectro de mutaciones a nivel de variante.

Estos pacientes se incluyeron de forma consecutiva en función de la disponibilidad de tejido tumoral representativo de formalina fijada e incrustada en parafina (FFPE) adecuado para la secuenciación. Las muestras de tumor se obtuvieron de la Primera Clínica de Cirugía del Centro Clínico Universitario de Serbia. Este subconjunto se utilizó para permitir una evaluación directa basada en la secuenciación de las mutaciones del exón 2 de KRAS y BRAF V600E. No se puede excluir por completo el posible sesgo de selección relacionado con la disponibilidad de tejido.

Para garantizar la comparabilidad entre los grupos de pacientes, el estado de mutación tanto de las pruebas basadas en PCR como de la secuenciación se clasificó como binario (mutado frente a tipo salvaje) y se aplicaron definiciones de mutación armonizadas en todos los análisis.

Sesgos y consideraciones éticas

Para minimizar el sesgo de selección, solo se incluyeron pacientes con CCRC en pacientes jóvenes confirmado histológicamente y con suficiente material tumoral. El sesgo de información se redujo mediante el uso de ensayos moleculares estandarizados y validados y procedimientos de prueba centralizados. Dado que este fue un estudio retrospectivo, no se puede excluir por completo el sesgo residual y la confusión. Todos los datos de los pacientes se desidentificaron antes del análisis.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (1975, revisada en 2024) y fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico Universitario de Serbia (Ref. No.: 175/1; Fecha: 27 de abril de 2021) y el Comité de Ética del Instituto de Oncología y Radiología de Serbia (Aprobación No.: 01-1/2023/701; Fecha: 30 de marzo de 2023). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la intervención quirúrgica.

Genotipificación de KRAS y BRAF

Todas las muestras de tumor de formalina fijada e incrustada en parafina (FFPE) fueron revisadas por un patólogo para confirmar el diagnóstico y estimar la celularidad del tumor. Solo se consideraron adecuadas para el análisis molecular las muestras con un contenido tumoral estimado de ≥ 20 %. Para aislar el ADN, se cortó aproximadamente 0,1 cm3 de bloque de tejido incrustado en parafina utilizando un bisturí estéril. El tejido se desparafinizó añadiendo 1 ml de xileno (Merck, Alemania), agitándolo durante 5 minutos y centrifugándolo a 13 000 rpm durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, se repitió el paso de desparafinización con 1 ml de xileno. El tejido desparafinado se lavó luego dos veces añadiendo 1 ml de etanol, agitándolo durante 1 minuto, centrifugándolo a 13 000 rpm durante 5 minutos y desechando el sobrenadante. Posteriormente, la pastilla se lavó con 1 ml de etanol al 70 % en las mismas condiciones y, después de retirar el sobrenadante, se secó durante 1 hora a 37 °C. El ADN se aisló utilizando el kit de ADN rápido QIAamp para tejidos según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Alemania). Se evaluó la concentración y la pureza del ADN antes del análisis. Las muestras que arrojaron una cantidad de ADN insuficiente o una amplificación de baja calidad se reextrajeron o se excluyeron del análisis posterior.

Para la genotipificación de KRAS y BRAF, las secuencias de ADN de las regiones de interés (165 pares de bases (pb) y 224 pb, respectivamente) se amplificaron utilizando los siguientes cebadores: KRAS Fwd: AAG GCC TGC TGA AAA TGA CTG; KRAS Rev: GGT CCT GCA CCA GTA ATA TGC A; BRAF Fwd: TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA y BRAF Rev: GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 µL, que contenía aproximadamente 500 ng de ADN, 1 U de ADN polimerasa KAPA Taq (Kapa Biosystems, EE. UU.), 1X de tampón KAPA Taq A, 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP y 10 pmol de cada cebador. Las condiciones de ciclado consistieron en una desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, con una extensión final a 72 °C durante 10 min. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems; ThermoFisher Scientific, Inc., EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La electroforesis capilar se realizó en el analizador genético 3730 (Applied Biosystems). Los resultados se analizaron utilizando el software de análisis de secuencias 5.2 (Applied Biosystems). La secuenciación de Sanger se realizó utilizando un protocolo estandarizado y validado de forma rutinaria en nuestro laboratorio. Los productos de PCR se secuenciaron en ambas direcciones y los cromatogramas se revisaron de forma independiente para garantizar una lectura precisa de las bases. Cada ejecución de secuenciación incluyó los controles positivos y negativos adecuados. Las ejecuciones se consideraron exitosas cuando se obtuvieron electroferogramas claros y de alta calidad con una resolución de picos inequívoca. Las muestras que arrojaron cromatogramas de baja calidad o ambiguos se reamplificaron y se resecuenciaron. Este enfoque garantizó la reproducibilidad y la fiabilidad de la detección de mutaciones utilizando la metodología convencional de secuenciación de Sanger.

Análisis estadístico

Las variables cuantitativas se analizaron de la siguiente manera: la edad al diagnóstico se analizó como una variable continua y se resumió utilizando estadísticas descriptivas. Las tasas de incidencia de CCRC en edades tempranas (EOCRC) se calcularon anualmente y se analizaron a lo largo de los años del calendario, tratándolos como variables ordenadas. La localización del tumor se analizó como una variable categórica (colon frente a recto). El estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF se analizó como variables binarias (mutado frente a tipo salvaje). Las asociaciones entre el estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF y las variables clinicopatológicas se evaluaron utilizando la prueba de chi-cuadrado (χ²). Se realizaron análisis estadísticos descriptivos y comparativos utilizando IBM SPSS Statistics (versión 20; IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.). Las tendencias lineales en las proporciones de incidencia de CCRC en edades tempranas a lo largo de los años del calendario ordenados se evaluaron utilizando la prueba de tendencia de Cochran-Armitage implementada en R versión 4.3.1, probando un aumento o disminución monótona en el resultado binario. Las tendencias temporales en las pruebas moleculares desde 2008 hasta 2025 se evaluaron utilizando la regresión de Poisson en R, con el número de pacientes sometidos a pruebas por año modelado como una función del año de diagnóstico. Las razones de tasas con intervalos de confianza del 95% se utilizaron para cuantificar el cambio anual en el número de pruebas. Se analizaron los recuentos absolutos de pruebas, ya que no estaban disponibles los recuentos totales de pacientes por año, por lo que estos resultados describen las tendencias en los números de pruebas observados en lugar de la probabilidad de realizar las pruebas. Se aplicó un nivel de significación bilateral de 0,05 en todo el estudio. La presentación de este estudio se ajusta a las directrices STROBE.^[28]

Resultados

El diseño general del estudio, incluido las tres poblaciones de estudio, se resume en la Figura 1, que ilustra los tamaños de muestra, los análisis y el número de casos realizados para cada grupo.

Incidencia de CCRC en edades tempranas en Serbia

Se registraron un total de 2198 casos de CCRC en edades tempranas (Población 1) en Serbia desde 2016 hasta 2022 (Figura 2A–C). Los recuentos anuales de casos oscilaron entre un mínimo de 219 casos en 2017 y un máximo de 426 casos en 2022. El número de casos de CCRC en edades tempranas diagnosticados recientemente fue consistentemente mayor en hombres en comparación con mujeres, con proporciones hombre-mujer que variaron entre 1,02 (2016) y 1,28 (2018 y 2020) (Figura 2A). Cuando se expresa en relación con la carga total de CRC, el CCRC en edades tempranas representó del 4,92% (2017) al 8,19% (2022) de todos los casos de CRC (Figura 2C). La proporción de CCRC en edades tempranas demostró una tendencia ascendente estadísticamente significativa durante el período de estudio (Z = 4,63, P < 0,00001).

Para explorar más a fondo las tendencias específicas de la edad en la incidencia de CCRC en edades tempranas, nos centramos en la distribución de los casos diagnosticados recientemente en grupos de edad detallados menores de 50 años (Tabla 1). Entre 2016 y 2022, se informaron casos de CCRC en edades tempranas en todos los grupos de edad, con un aumento notable en los individuos de 45 a 49 años. Durante este período de 7 años, el número de casos en el grupo de edad de 45 a 49 años casi se duplicó, desde un mínimo de 120 en 2017 hasta 212 en 2022.

Perfil de mutación de KRAS, NRAS y BRAF en casos serbios de CCRC en edades tempranas

Para evaluar los cambios en las prácticas de diagnóstico a lo largo del tiempo, analizamos el número anual de pacientes con CCRC en edades tempranas sometidos a pruebas en IORS. Entre 2008 y 2025, el número de pacientes sometidos a pruebas aumentó con el tiempo, desde solo 10 individuos en 2008 hasta un máximo de 77 en 2024 (Figura 2D), lo que resultó en un total de 681 pacientes (Población 2). El número anual de pacientes sometidos a pruebas moleculares aumentó significativamente con el tiempo (razón de tasas por año 1,09, intervalo de confianza del 95% 1,07-1,11, P < 0,001), lo que corresponde a un aumento aproximado del 8,9% en el número de pruebas cada año.

Entre los 681 pacientes con CCRC en edades tempranas previamente genotipados (Población 2), se detectaron mutaciones de KRAS en 302/681 casos (44,3%), NRAS en 27/420 casos (6,4%) y BRAF en 6/67 casos (8,9%) (Tabla 2). El estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF no mostró asociaciones significativas con la edad, el sexo o la localización del tumor (P > 0,05) (Tabla 2). Además, se realizaron análisis comparativos de las frecuencias de mutación de KRAS en los grupos de edad estrechos definidos. Cuando los pacientes con CCRC en edades tempranas se estratificaron en dos grupos de edad ( 0,05) (Tabla 3). No se realizó análisis estadístico para BRAF debido al bajo número de mutaciones detectadas (N = 2).

Incidencia de CCRC en edades tempranas en Serbia

Se registraron un total de 2198 casos de CCRC en edades tempranas (Población 1) en Serbia desde 2016 hasta 2022 (Figura 2A–C). Los recuentos anuales de casos oscilaron entre un mínimo de 219 casos en 2017 y un máximo de 426 casos en 2022. El número de casos de CCRC en edades tempranas diagnosticados recientemente fue consistentemente mayor en hombres en comparación con mujeres, con proporciones hombre-mujer que variaron entre 1,02 (2016) y 1,28 (2018 y 2020) (Figura 2A). Cuando se expresa en relación con la carga total de CRC, el CCRC en edades tempranas representó del 4,92% (2017) al 8,19% (2022) de todos los casos de CRC (Figura 2C). La proporción de CCRC en edades tempranas demostró una tendencia ascendente estadísticamente significativa durante el período de estudio (Z = 4,63, P < 0,00001).

Para explorar más a fondo las tendencias específicas de la edad en la incidencia de CCRC en edades tempranas, nos centramos en la distribución de los casos diagnosticados recientemente en grupos de edad detallados menores de 50 años (Tabla 1). Entre 2016 y 2022, se informaron casos de CCRC en edades tempranas en todos los grupos de edad, con un aumento notable en los individuos de 45 a 49 años. Durante este período de 7 años, el número de casos en el grupo de edad de 45 a 49 años casi se duplicó, desde un mínimo de 120 en 2017 hasta 212 en 2022.

Perfil de mutación de KRAS, NRAS y BRAF en casos serbios de CCRC en edades tempranas

Para evaluar los cambios en las prácticas de diagnóstico a lo largo del tiempo, analizamos el número anual de pacientes con CCRC en edades tempranas sometidos a pruebas en IORS. Entre 2008 y 2025, el número de pacientes sometidos a pruebas aumentó con el tiempo, desde solo 10 individuos en 2008 hasta un máximo de 77 en 2024 (Figura 2D), lo que resultó en un total de 681 pacientes (Población 2). El número anual de pacientes sometidos a pruebas moleculares aumentó significativamente con el tiempo (razón de tasas por año 1,09, intervalo de confianza del 95% 1,07-1,11, P < 0,001), lo que corresponde a un aumento aproximado del 8,9% en el número de pruebas cada año.

Entre los 681 pacientes con CCRC en edades tempranas previamente genotipados (Población 2), se detectaron mutaciones de KRAS en 302/681 casos (44,3%), NRAS en 27/420 casos (6,4%) y BRAF en 6/67 casos (8,9%) (Tabla 2). El estado de mutación de KRAS, NRAS y BRAF no mostró asociaciones significativas con la edad, el sexo o la localización del tumor (P > 0,05) (Tabla 2). Además, se realizaron análisis comparativos de las frecuencias de mutación de KRAS en los grupos de edad estrechos definidos. Cuando los pacientes con CCRC en edades tempranas se estratificaron en dos grupos de edad ( 0,05) (Tabla 3). No se realizó análisis estadístico para BRAF debido al bajo número de mutaciones detectadas (N = 2).

Discusión

Dado el evidente aumento en la incidencia de CCRC en edades tempranas en Serbia, nuestro objetivo fue investigar cuándo se hizo evidente esta tendencia, en qué medida se ha implementado la prueba de KRAS, NRAS y BRAF a lo largo del tiempo y caracterizar sus perfiles de mutación en esta población. Por lo tanto, este estudio presenta un análisis exhaustivo de CCRC en edades tempranas en Serbia, integrando las tendencias de incidencia nacionales, los patrones de pruebas institucionales y la caracterización detallada de las mutaciones, lo cual es esencial para mejorar las estrategias de detección temprana, guiar el tratamiento personalizado e informar las políticas de salud nacionales adaptadas a esta creciente población de pacientes.

Dado que los datos a nivel nacional estuvieron disponibles en 2016, nuestro análisis de la incidencia de CCRC en edades tempranas se limitó al período 2016-2022 para garantizar una cobertura territorial completa. De los datos, se puede observar que tanto el número absoluto de casos de CCRC en edades tempranas como su proporción de todos los casos de CRC muestran aumentos paralelos desde 2016 hasta 2022, con casi el doble de casos en 2022. El aumento constante después de 2020 sugiere una contribución creciente de CCRC en edades tempranas a la carga general de CRC, lo que enfatiza la importancia de la concienciación sobre el problema, la vigilancia y la prevención dirigidas y las estrategias de detección temprana en poblaciones menores de 50 años. Nuestro análisis de la incidencia de CCRC en edades tempranas identificó un aumento marcado en los casos entre los individuos de 45 a 49 años, un aumento de más del 50% en solo siete años, lo que convierte a este grupo de edad en una zona de transición crítica justo por debajo del umbral de detección actual en Serbia. Varias directrices internacionales, incluidas las de la Sociedad Americana contra el Cáncer y el Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de los Estados Unidos, ya han modificado sus recomendaciones para que la detección de CRC comience a los 45 años en respuesta al aumento de la incidencia en edades tempranas.^[29] En Serbia, donde la detección aún comienza a los 50 años, estos hallazgos subrayan la urgencia de reconsiderar la edad de inicio de la detección de CRC. Varios factores pueden subyacer al aumento observado en la incidencia de CCRC en edades tempranas en Serbia. Esto puede deberse en parte a una mejor notificación del cáncer y a un mayor acceso al diagnóstico,^[30] pero la tendencia ascendente persistente durante varios años apunta a un cambio epidemiológico real. Aunque el programa oficial se dirige a personas mayores de 50 años, el aumento de la concienciación pública puede estar llevando a que personas más jóvenes busquen atención médica antes, especialmente cuando aparecen los síntomas. Esto podría conducir a colonoscopias o investigaciones de seguimiento más frecuentes, incluso fuera de los programas de detección organizados. Además, los factores de riesgo relacionados con el estilo de vida, como una mala dieta, la obesidad, el tabaquismo, el consumo de alcohol y el sedentarismo, también pueden estar contribuyendo a un aumento real de la incidencia. Los síndromes hereditarios, como el síndrome de Lynch, y la evidencia emergente sobre el papel del microbioma intestinal, también podrían influir en el riesgo de CCRC en edades tempranas.

Paralelamente a estas tendencias epidemiológicas, nuestros hallazgos también señalan la evolución de las prácticas clínicas, particularmente en el uso de pruebas moleculares para el CCRC de inicio temprano. Los datos del IORS muestran que el número de pacientes con CCRC de inicio temprano que se sometieron a pruebas de KRAS, NRAS y BRAF aumentó más de siete veces entre 2008 y 2024, alcanzando un máximo en 2024, lo que puede reflejar un mayor acceso a los diagnósticos moleculares, una mayor concienciación por parte de los clínicos y un reconocimiento más amplio de la relevancia clínica de la caracterización de las mutaciones en el manejo del CCRC de inicio temprano. A medida que el CCRC de inicio temprano continúa aumentando, garantizar un acceso equitativo a diagnósticos moleculares integrales será esencial para optimizar los resultados de los pacientes y fundamentar las estrategias de salud pública.

Si bien las mutaciones de KRAS, NRAS y BRAF se han estudiado en pacientes serbios con CCRC primario, localmente avanzado y metastásico ^[31]-^[35], su prevalencia y relevancia clínica en casos de inicio temprano aún no se han explorado. En nuestro estudio nacional previamente publicado sobre CCRC, que incluyó a 6369 pacientes con CCRC no seleccionados ^[9], el subgrupo de inicio temprano no se analizó por separado. En el presente análisis retrospectivo, identificamos 681 casos de CCRC de inicio temprano (10,3%) de esa cohorte, lo que permitió, por primera vez, un examen enfocado de su perfil mutacional. Encontramos que las mutaciones de KRAS estaban presentes en el 44,3% (302/681) de los casos de CCRC de inicio temprano, NRAS en el 6,4% (27/420) y las mutaciones de BRAF V600E en el 8,9% (6/67). Sin embargo, no se informaron variantes de mutación específicas. La diferencia en el número de pacientes sometidos a pruebas de KRAS, NRAS y BRAF se debe a la implementación gradual de pruebas moleculares ampliadas en Serbia, con la introducción de las pruebas de NRAS en la práctica clínica de rutina en 2017 y las pruebas de BRAF en 2018. Además, las pruebas de BRAF se realizaron de forma selectiva y dependieron de la derivación por parte del clínico, lo que contribuyó aún más al menor número de casos sometidos a pruebas. Además, si bien la cohorte retrospectiva más grande de CCRC de inicio temprano incluyó el estado de mutación para KRAS, NRAS y BRAF, el presente estudio se centró exclusivamente en la genotipificación de KRAS y BRAF. Esta decisión se basó en su mayor relevancia clínica, particularmente en el contexto de la resistencia anti-EGFR y la disponibilidad de terapias dirigidas. Además, proporcionamos la primera caracterización mutacional detallada de una cohorte de CCRC de inicio temprano genotipificada de Serbia (N = 54), que revela una frecuencia de mutación de KRAS del 20,4% y una frecuencia de mutación de BRAF del 3,7%. Estos hallazgos se encuentran dentro del rango informado en la mayoría de los estudios previos, lo que apoya aún más el perfil molecular distinto del CCRC de inicio temprano. Más específicamente, una revisión sistemática y un metaanálisis exhaustivos de Lawler et al. (2024), que abarcan 49 estudios sobre KRAS y BRAF en CCRC de inicio temprano, revelaron que las mutaciones de KRAS fueron ligeramente menos comunes, mientras que las mutaciones de BRAF estuvieron significativamente subrepresentadas en los casos de inicio temprano en comparación con el CCRC de inicio tardío. Estos hallazgos sugieren que el CCRC de inicio temprano sigue vías tumorigénicas distintas en comparación con su contraparte de inicio tardío ^[36]. En consonancia con estos hallazgos de metaanálisis, informes previos han demostrado una frecuencia más baja de la mutación BRAF V600E, con tasas que oscilan entre el 0 y el 8%. De manera similar, la mayoría de los estudios informan una prevalencia reducida de las mutaciones de KRAS en el CCRC de inicio temprano (que oscila entre el 4% y el 27%), siendo las excepciones notables los estudios de Cercek et al. y de Watson et al., que observaron una tasa de mutación de KRAS notablemente más alta del 42% y el 54%, respectivamente ^[37]-^[43], lo que refleja más de cerca los resultados de nuestra cohorte más grande.

En el grupo serbio de CCRC de inicio temprano, detectamos cinco mutaciones no sinónimas de KRAS que pueden ser objeto de terapia: G12D, G13D, G12 C, G12S y G12 V. Estas mutaciones se encuentran entre las alteraciones activadoras más frecuentes informadas en el CCRC. En particular, la distribución de las mutaciones de KRAS en nuestra cohorte G12D - 36,4%, G13D - 27,3%, G12 C - 18,1%, G12S y G12 V - 9,1% se alinea parcialmente con las tendencias globales. La predominancia de G12D es consistente con su función establecida como la alteración de KRAS más frecuente en el CCRC y el CCRC metastásico (27,9-36,0%) ^[44], ^[45], aunque nuestra frecuencia supera las informadas en conjuntos de datos específicos de CCRC de inicio temprano (13,2-13,3%) ^[46], ^[47] y se acerca más a un hallazgo más reciente (57,1%) ^[47]. Para otras mutaciones, observamos proporciones más altas de G13D y G12 C en comparación con las frecuencias típicas de CCRC (18,8-21,8% y 1-7%, respectivamente) ^[43], ^[44], y con los datos de CCRC de inicio temprano de Ponvilawan et al. (4,8% y 7,1%) ^[47] y el navegador UCSC Xena (5% y 3,3%) ^[46]. Por el contrario, G12 V, que suele ser la segunda mutación de KRAS más común a nivel mundial (21,8%) ^[43], ^[44], estuvo subrepresentada en nuestra cohorte (9,1%), aunque esto se alinea con los datos de CCRC de inicio temprano de Ponvilawan et al. (11,9%) ^[48] y UCSC Xena (8,3%) ^[47]. Estos hallazgos pueden reflejar características moleculares únicas del CCRC de inicio temprano o variaciones poblacionales específicas en los patrones de mutación de KRAS, pero deben verificarse en cohortes de pacientes más grandes.

Hasta la fecha, no hay datos publicados sobre variantes específicas de KRAS en pacientes con CCRC de inicio temprano en Serbia, probablemente debido a que las pruebas moleculares se limitan a la detección de la presencia de mutación en lugar de la identificación a nivel de variante. Las mutaciones de KRAS detectadas en la población serbia con CCRC no seleccionado en diferentes estudios incluyen G12D, G12 V, G13D, G12 A, G12 C, G12S y G12 R ^[32], ^[34], ^[35], y nuestra cohorte de CCRC de inicio temprano confirma la presencia de todas, excepto G12 A y G12 R. Nuestro análisis comparativo sugiere que el espectro de mutaciones de KRAS en el CCRC de inicio temprano se superpone en gran medida con el observado en los casos de CCRC no seleccionados en Serbia, particularmente para las variantes más comunes, como G12D, G12 V y G13D, aunque con una frecuencia relativamente mayor de las mutaciones G13D y G12 C y una menor prevalencia de G12 V.

Se han realizado importantes esfuerzos para el desarrollo de inhibidores específicos de KRAS, y varios agentes ya están avanzando en ensayos clínicos. Hasta ahora, dos inhibidores de KRAS, AMG510 (sotorasib) ^[24] y MRTX840 (adagrasib) ^[25], que se dirigen específicamente a la mutación G12 C, han recibido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) inicialmente para el cáncer de pulmón no microcítico. Animados por su éxito, estos inhibidores se han explorado desde entonces en otros tumores sólidos, incluido el CCRC. En 2024, la FDA otorgó la aprobación acelerada a adagrasib más cetuximab para el CCRC localmente avanzado o metastásico con mutación KRAS G12C, con una duración media de la respuesta superior a los 6 meses ^[26]. Más recientemente, en 2025, se amplió la indicación de sotorasib para incluir su uso con panitumumab para el CCRC metastásico con mutación KRAS G12C resistente a la quimioterapia ^[27]. Mientras tanto, los inhibidores selectivos de KRAS G12D, como MRTX1133 (Identificador de ClinicalTrials.gov: NCT05737706), RMC 9805 (NCT06040541) y QTX3034 (NCT06227377), se encuentran actualmente en evaluación clínica en fase temprana en CCRC y otros tumores sólidos, sin embargo, los resultados aún no se han publicado ^[44]. Además de las terapias dirigidas a KRAS, los inhibidores de BRAF, como encorafenib, han demostrado beneficios clínicos en pacientes con CCRC metastásico con mutaciones BRAF V600E, especialmente cuando se combinan con inhibidores de EGFR y quimioterapia ^[49]. Por el contrario, aún no se han desarrollado inhibidores específicos de NRAS. Si bien los inhibidores de KRAS y BRAF están aprobados actualmente principalmente para entornos metastásicos, su papel en el CCRC de inicio temprano y en etapas más tempranas de la enfermedad aún está bajo investigación. Aunque los inhibidores específicos de KRAS se encuentran actualmente en ensayos clínicos en fase temprana, como se mencionó anteriormente, las pruebas de rutina de las mutaciones de KRAS y BRAF en el CCRC de inicio temprano siguen siendo cruciales ^[50], ^[51], ya que no solo informan sobre las decisiones de tratamiento actuales, sino que también preparan a los pacientes para una posible inclusión en futuros ensayos de terapia dirigida, allanando en última instancia el camino para estrategias de tratamiento más personalizadas y eficaces a medida que estos nuevos agentes estén disponibles clínicamente. Es esencial que Serbia se mantenga alineada con los avances globales e implemente rápidamente nuevas terapias, lo que permitirá estrategias de tratamiento más personalizadas y garantizará que los pacientes con CCRC de inicio temprano no se vean excluidos de las posibles opciones terapéuticas dirigidas debido a una caracterización molecular insuficiente. Además, nuestros resultados implican una sólida justificación para ir más allá de la detección binaria de mutaciones e implementar pruebas de KRAS específicas de variantes como parte de los diagnósticos moleculares de rutina.

Los hallazgos de este estudio deben interpretarse a la luz de varias limitaciones. Primero, aunque los datos de las pruebas moleculares estaban disponibles para una gran cohorte de 681 pacientes (Población 2), el análisis detallado a nivel de variante se realizó en un subconjunto secuenciado más pequeño de 54 casos (Población 3), lo que puede limitar la generalizabilidad de los patrones de mutación específicos. En segundo lugar, las pruebas de NRAS y BRAF no se realizaron de manera uniforme en toda la Población 2, lo que refleja las diferencias históricas en la disponibilidad de las pruebas y la práctica clínica, y lo que resulta en una evaluación incompleta de la prevalencia de la mutación BRAF. En tercer lugar, no se dispuso de datos sobre el estado de inestabilidad de microsatélites y los síndromes de cáncer hereditario, lo que impidió la evaluación de su contribución al CCRC de inicio temprano en esta población. Por último, el diseño retrospectivo y el entorno de un solo país pueden limitar la generalizabilidad de los hallazgos a otras poblaciones. A pesar de estas limitaciones, el estudio proporciona información valiosa sobre las tendencias temporales y las características moleculares del CCRC de inicio temprano dentro de un contexto nacional.

Conclusión

En conclusión, este estudio revela un aumento significativo y continuo en la incidencia de CCRC de inicio temprano en Serbia, particularmente entre las personas de 45 a 49 años, lo que destaca la urgente necesidad de ajustes de políticas basados en la evidencia. Al mismo tiempo, presentamos la primera caracterización molecular integral de las mutaciones de KRAS, NRAS y BRAF en pacientes serbios con CCRC de inicio temprano, lo que demuestra un perfil de mutación en gran medida consistente con los datos globales de CCRC de inicio temprano, pero distinto de los casos de inicio tardío. En particular, la menor prevalencia de estas mutaciones en los pacientes más jóvenes apoya la hipótesis de vías oncogénicas distintas en el CCRC de inicio temprano. Con base en estos hallazgos, recomendamos las siguientes acciones para los responsables de la formulación de políticas de salud nacionales. Es esencial reducir la edad de inicio del programa nacional de detección de CCRC a los 45 años. Este cambio facilitará la detección y la intervención tempranas en el grupo de edad más afectado por la enfermedad. Las pruebas de rutina deben incluir la identificación de sustituciones de nucleótidos específicas en el gen KRAS, con un enfoque particular en la mutación KRAS G12 C. Es crucial que estas pruebas estén totalmente reembolsadas por el Fondo de Seguro de Salud de la República. Además, el Fondo debe garantizar la disponibilidad de inhibidores específicos de KRAS G12C, que han demostrado beneficios clínicos significativos en grandes ensayos internacionales y que representan un avance crucial en la terapia personalizada para el CCRC de inicio temprano. La integración de estas medidas en los protocolos nacionales de detección y tratamiento mejorará la detección temprana, permitirá enfoques de oncología de precisión y, en última instancia, mejorará los resultados de los pacientes con CCRC de inicio temprano en Serbia.