Detección de variantes KRAS G12D en cáncer colorrectal mediante secuenciación basada en próxima generación: Un estudio de cohorte retrospectivo.

El cáncer colorrectal (CCR) es un tipo de cáncer muy agresivo del sistema digestivo. Los pacientes que reciben un diagnóstico en una etapa avanzada tienen más probabilidades de tener un mal pronóstico [^[1]]. Los anticuerpos monoclonales que bloquean la cascada de señalización iniciada por la unión del factor de crecimiento epidérmico a su receptor (EGFR) se utilizan en ciertos tratamientos dirigidos para el CCR. Los cambios somáticos en genes como el gen RAS y el gen BRAF, que son homólogos del oncogén viral del sarcoma murino y que participan en la cascada de señalización del EGFR, determinan la eficacia de esta terapia. En ausencia de cambios en el gen RAS, la terapia con anticuerpos monoclonales anti-EGFR combinada con quimioterapia puede ser beneficiosa para los pacientes como tratamiento de primera línea. Gracias a las nuevas técnicas genómicas, se han identificado numerosos cambios cromosómicos relacionados con el CCR. Como transductor de señales de crecimiento aguas abajo del EGFR, el gen KRAS, un oncogén que es miembro de la superfamilia de GTPasas RAS, inicia procesos relacionados con la división y proliferación celular. Por lo tanto, KRAS desempeña un papel en la transformación neoplásica como un evento temprano en la carcinogénesis colorrectal cuando está sobreexpresado debido a una alteración genética. Las investigaciones han demostrado que la frecuencia de cambios en el gen RAS en pacientes con CCR varía según la comunidad [^[2],^[3],^[4]]. Si bien la frecuencia de los cambios en el gen NRAS, homólogo del oncogén viral del neuroblastoma RAS, oscila entre el 1% y el 7%, el rango de los cambios en el gen KRAS es del 27% al 56% [^[5]]. En varios estudios se han relacionado el estado de los cambios en el gen RAS, las características clinicopatológicas y la información demográfica. Por ejemplo, se ha relacionado los cambios en el gen KRAS con la edad, el sexo y la histología del tumor del paciente [^[6],^[7]]. Los cambios en el gen KRAS se asocian con metástasis, disminución de la supervivencia y mal pronóstico [^[8],^[9]]. Otro miembro de la familia RAS, el gen BRAF, homólogo del oncogén viral del sarcoma murino b-raf, es una proteína quinasa esencial en la vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos MAPK/ERK. La activación de BRAF se asocia con la proliferación, la angiogénesis, la migración y la diferenciación celular. Los productos del gen BRAF funcionan en la vía de señalización MAPK aguas abajo del gen KRAS. La vía MEK-ERK se activa de forma anormal cuando un aminoácido en el codón 600 (V600E) se sustituye de valina a ácido glutámico. El cambio más significativo es BRAF V600E, que representa el 90% de todos los cambios en el gen BRAF y es un signo de enfermedad grave [^[10]]. Además, los cambios en el gen BRAF se asocian con un mal pronóstico y una disminución de las tasas de supervivencia, especialmente en los cánceres que presentan inestabilidad de microsatélites [^[11],^[12]]. A pesar de ser un factor pronóstico desfavorable para el cáncer metastásico [^[13]], BRAF V600E es un objetivo prometedor para el tratamiento personalizado, y el CCR se trata de forma más eficaz cuando ciertos inhibidores de BRAF V600E se combinan con otros inhibidores de la vía MAPK/PI3K [^[14]].

La inestabilidad de microsatélites (MSI) está atrayendo cada vez más atención como biomarcador para pacientes con cáncer avanzado, con el fin de evaluar su idoneidad para los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICIs). Los microsatélites son secuencias cortas de ADN con repeticiones de nucleótidos y una alta tasa de error. Un método de prueba sería utilizar una prueba molecular, como la PCR multiplex, para analizar el CCR y verificar el estado de la MSI [^[15]]. La MSI está causada por una reparación deficiente del desajuste del ADN. Los ensayos clínicos han examinado la utilidad de la inmunoterapia y el tratamiento preoperatorio para pacientes con CCR con MSI alta [^[10]]. El Instituto Nacional del Cáncer recomienda utilizar un panel de cinco loci de microsatélites para evaluar el estado de la MSI [^[16]]. Un estado de MSI alta se asocia con un cambio en el gen KRAS o BRAF [^[17]]. Los cambios en el gen KRAS indican que los anticuerpos monoclonales anti-EGFR (mAb) cetuximab y panitumumab tienen una baja eficacia terapéutica debido a la resistencia, lo que sugiere una diversa dependencia de los cánceres con cambios en el gen KRAS en alelos específicos de los cambios en el gen KRAS [^[18]].

El gen TP53 es uno de los genes más frecuentemente alterados en el CCR, y desempeña un papel crucial en la síntesis y reparación del ADN, la estabilidad del genoma, la apoptosis o la senescencia y la detención del crecimiento [^[19]]. Junto con los genes KRAS y TP53, la amplificación en el protooncogén ERBB2 también se observa en el CCR, aunque es poco frecuente. El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), codificado por el gen ERBB2, es un receptor unido a la membrana, cuya amplificación genética se ha identificado en ciertos modelos de xenoinjerto de CCR resistentes al cetuximab, incluso en ausencia de cambios en los genes KRAS, NRAS o BRAF [^[20]]. Mediante NGS, MSI y pruebas de variación del número de copias (CNV), nuestro objetivo fue evaluar la frecuencia de los cambios en el gen KRAS en el CCR y su asociación con la respuesta a la terapia anti-EGFR. Dado que los cambios en el gen KRAS contribuyen a la resistencia a los fármacos y al mal pronóstico, determinar el estado de los cambios y las características clinicopatológicas asociadas es vital para optimizar el manejo del CCR y el seguimiento de los pacientes. En consecuencia, este estudio buscó determinar la prevalencia de los cambios en el gen KRAS y explorar su posible relación con las terapias dirigidas con inhibidores.

2. Materiales y Métodos

2.1. Pacientes

Se examinó un total de 73 pacientes con CCR. Los pacientes fueron seleccionados del Hospital Universitario y de Investigación de Umraniye desde enero de 2021 hasta agosto de 2024. Los siguientes fueron los criterios de inclusión del estudio: (1) edad superior a 18 años, (2) casos con adenocarcinoma colorrectal patogénico confirmado, (3) individuos sin tumores en un foco diferente al adenocarcinoma colorrectal. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para el análisis genético y el procesamiento de los datos de los pacientes de todos los participantes. El Comité de Ética del Hospital Universitario y de Investigación de Umraniye aprobó el proyecto. Se evaluaron las muestras de biopsia o quirúrgicas de adenocarcinoma colorrectal en estadio clínico III y IV de los pacientes.

2.2. Secuenciación de Nueva Generación

Inicialmente, se aisló el ADN de la muestra primaria para amplificar los genes, las secciones de los genes o las fusiones relacionadas con la enfermedad. La muestra de ADN extraída se sometió a un control de calidad. Se utilizó el kit basado en ADN "The Archer® VariantPlex® Solid Tumor Focus v2" para amplificar las regiones objetivo, y la plataforma Illumina NextSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) se utilizó para secuenciarlas utilizando la técnica de NGS. El software Archer Analysis (Versión: 7.5.1, Copyright 2014–2026, Integrated DNA Technologies, Inc.) se utilizó para realizar análisis secundarios (limpieza de datos, alineación e identificación de variantes/fusiones) en los datos brutos adquiridos (Fastq). La alineación se realizó utilizando el genoma de referencia humano, hg19 (GRCh37). Las lecturas desduplicadas se utilizan para un análisis preciso de variantes/fusiones y datos cuantitativos multiplex, mientras que las etiquetas de código de barras moleculares se utilizan para las falsas correlaciones en el programa Archer Analysis. El objetivo de la prueba de secuenciación de nueva generación (NGS), el kit Archer® VariantPlex® Solid Tumor Focus v2, es encontrar e identificar variantes puntuales, indels e inestabilidad de microsatélites en 20 genes que se mutan comúnmente en tumores sólidos. Utilizaron un panel de tumores sólidos y lo analizaron. AKT1, BRAF, EGFR, ERBB2, FOXL2, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MET, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RET, TERT y TP53 fueron algunos de esos genes. Incluso sin un conocimiento previo de los socios de fusión o los puntos de ruptura conocidos, el kit detecta las fusiones de todos los genes objetivo en una sola prueba de secuenciación utilizando el enriquecimiento basado en la PCR multiplex anclada (AMPTM) exclusiva de Archer. Para variantes conocidas y no descubiertas, la técnica utiliza cebadores específicos del gen (GSP) unidireccionales. Tanto los índices de los pacientes como las etiquetas de código de barras moleculares están presentes en las etiquetas. El gráfico "HeatMap" proporciona los niveles de expresión.

2.3. Inestabilidad de Microsatélites

Para cada uno de los 114 loci de microsatélites, el algoritmo MSI determina la diversidad de Shannon (puntuación de inestabilidad) de las longitudes de repetición en las distintas lecturas. La puntuación de inestabilidad de cada locus se compara con las puntuaciones de inestabilidad de una cohorte de referencia de muestras estables incluidas en la canalización para evaluar la estabilidad del locus. En cada locus de la muestra interrogada, las muestras de referencia se escalan para que coincidan con la profundidad de secuenciación. Dependiendo de las preferencias del usuario, el porcentaje de loci que se encuentran inestables influye en si las muestras se clasifican como inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H), inestabilidad de microsatélites intermedia o estables (MSS). Basándose en el porcentaje total de loci de microsatélites (MS) inestables, la canalización MSI determina la estabilidad de los microsatélites para cada muestra: MS-Estable: menos del 20% de los loci son inestables, MS-Intermedio: 20-30% y MS-Alto: más del 30%. Para garantizar que cada locus cumpla con un umbral mínimo de profundidad de lectura de 25, se realiza un control de calidad de la profundidad de lectura por locus de MS. Para garantizar que cada muestra tenga al menos 35.000 lecturas aceptables de MS, se realiza un segundo control de calidad. Las muestras se clasificarán como MSI-Desconocido si no superan alguno de estos controles de calidad.

2.4. Variación del Número de Copias

El ensayo de CNV compara el número de copias de las muestras normales y de la enfermedad utilizando una o más muestras de control, si las hay. Si no hay controles, cada muestra de la tarea se utiliza como línea de base. El software de análisis utiliza estos datos para generar una lectura y una visualización del número de copias, así como un valor p para indicar la confianza de la llamada. El número de copias de cada cebador con CNV habilitado en un panel se determina; estos cebadores se representan mediante puntos en la cuadrícula de CNV. Los resultados de estos análisis de cebador por cebador se compilan y se muestran para áreas genómicas más amplias.

2.5. Análisis de Datos

En primer lugar, se evaluó la calidad de los datos de los datos brutos que se transfirieron a la plataforma Archer Analysis. Tras la revisión de estas métricas, se añadieron las muestras adecuadas al flujo de análisis y se evaluaron en relación con la enfermedad designada. Teniendo en cuenta los datos clínicos del paciente, se realizó un filtrado en el flujo de análisis para examinar las alteraciones asociadas con el tipo de tumor designado. Tras el filtrado, las alteraciones de las listas se clasificaron en función de si se encontraban en bases de datos y directrices y contenían información sobre el diagnóstico, el pronóstico y la terapia. Se tuvieron en cuenta las recomendaciones de la Asociación para la Patología Molecular/Sociedad Americana de Oncología Clínica/Colegio de Patólogos Americanos (AMP/ASCO/CAP) [^[21]] y la evidencia sobre las alteraciones al clasificar.

2.6. Clasificación y Niveles de Evidencia

Nivel I: (A) Variantes en un tipo de tumor específico que son sensibles y resistentes a las terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y aprobadas por las directrices. (B) Variantes incluidas en investigaciones exhaustivas y bien documentadas por organizaciones profesionales. Nivel II: (C) Variantes en un tipo de tumor diferente que son sensibles y resistentes a las terapias aprobadas por la FDA y aprobadas por las directrices. (D) Las variantes se presentan en investigaciones preclínicas o informes de casos. Nivel III: Variantes con implicaciones clínicas poco claras. Nivel IV: Las variantes con frecuencias alélicas muy altas no se han asociado con una malignidad específica [^[21]].

2.7. Métricas de Calidad de NGS

Las métricas de calidad utilizadas en este estudio de NGS se seleccionaron para garantizar una alta precisión analítica, la fiabilidad de la detección de variantes y la relevancia clínica de los resultados obtenidos. Cada parámetro se describe en detalle a continuación: Se aplicó un umbral mínimo de profundidad de secuenciación y solo se incluyeron en el análisis las muestras que alcanzaron al menos 2,5 millones de lecturas totales por muestra. Este criterio aseguró una cobertura adecuada en todas las regiones objetivo y redujo el riesgo de detectar falsos negativos. Las observaciones alternativas (AO) representan el número total de lecturas de secuenciación que respaldan la presencia de un alelo alternativo. Se requirió un valor mínimo de AO de 5 para minimizar la posibilidad de que las variantes detectadas fueran el resultado de errores de secuenciación aleatorios o ruido de fondo. Las observaciones alternativas únicas (UAO) indican el número de lecturas de secuenciación independientes derivadas de fragmentos moleculares únicos que respaldan el alelo alternativo. Se aplicó un umbral de al menos 3 observaciones únicas para aumentar la confianza en las llamadas de variantes reales y reducir la influencia de artefactos de duplicación por PCR. Se realizó un filtrado de la frecuencia alélica poblacional utilizando la Base de datos de agregación de genomas (gnomAD). Se excluyeron las variantes con una frecuencia alélica de gnomAD de 0,05 o superior, ya que estas variantes se consideran polimorfismos comunes y es poco probable que sean clínicamente significativas en el contexto de este estudio. La fracción alélica de la variante (AF) refleja la proporción de lecturas de secuenciación que respaldan el alelo alternativo en relación con el número total de lecturas en una posición genómica determinada. Se aplicó un umbral de AF de al menos 0,027 para garantizar que las variantes detectadas estuvieran presentes a un nivel biológicamente significativo, particularmente en muestras con baja celularidad tumoral o ADN tumoral circulante. Finalmente, se aplicó una prueba estadística de valores atípicos de la fracción alélica. Se consideraron estadísticamente significativas las variantes con un valor p de valores atípicos de AF inferior a 0,01, lo que indica que la fracción alélica observada es poco probable que se deba a una variación aleatoria. Este criterio proporcionó un nivel adicional de confianza estadística en la detección de variantes. En conjunto, estos parámetros de control de calidad mejoraron la solidez del análisis NGS, optimizaron la precisión de la identificación de variantes y garantizaron la fiabilidad de las interpretaciones clínicas y de investigación posteriores.

2.8. Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 8.4.2 para analizar los datos. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir las características demográficas y clinicopatológicas basales. Las variables categóricas se compararon utilizando la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi-cuadrado, según corresponda. Todas las pruebas estadísticas fueron bicaudales, y se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

2.1. Pacientes

Se examinó un total de 73 pacientes con CRC. Desde enero de 2021 hasta agosto de 2024, los pacientes fueron seleccionados del Hospital Universitario y de Investigación de Umraniye. Los siguientes fueron los criterios de inclusión del estudio: (1) edad superior a 18 años, (2) casos con adenocarcinoma colorrectal patógeno confirmado, (3) individuos sin tumores en un foco diferente al adenocarcinoma colorrectal. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para el análisis genético y el procesamiento de los datos de los pacientes de todos los participantes. El Comité de Ética del Hospital Universitario y de Investigación de Umraniye aprobó el proyecto. Se evaluaron las muestras de biopsia o quirúrgicas de adenocarcinoma colorrectal en estadio clínico III y IV de los pacientes.

2.2. Secuenciación de nueva generación

Inicialmente, se aisló el ADN de la muestra primaria para amplificar los genes, las secciones de los genes o las fusiones relacionadas con la enfermedad. La muestra de ADN extraída se sometió a control de calidad. Se utilizó el kit basado en ADN "The Archer® VariantPlex® Solid Tumor Focus v2" para amplificar las áreas objetivo, y la plataforma Illumina NextSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) se utilizó para secuenciarlas utilizando la técnica NGS. El software Archer Analysis (Versión: 7.5.1, Copyright 2014–2026, Integrated DNA Technologies, Inc.) se utilizó para realizar análisis secundarios (limpieza de datos, alineación e identificación de variantes/fusiones) en los datos brutos adquiridos (Fastq). La alineación se realizó utilizando el genoma de referencia humano, hg19 (GRCh37). Las lecturas desduplicadas se utilizan para un análisis cuantitativo preciso de variantes/fusiones y datos multiplex, mientras que las etiquetas moleculares se utilizan para corregir falsas correlaciones en el programa Archer Analysis. El objetivo de la prueba de secuenciación de nueva generación NGS, el kit Archer® VariantPlex® Solid Tumor Focus v2, es encontrar e identificar variantes puntuales, indels e inestabilidad de microsatélites en 20 genes que se mutan comúnmente en tumores sólidos. Utilizaron un panel de enfoque de tumores sólidos y lo analizaron. AKT1, BRAF, EGFR, ERBB2, FOXL2, GNA11, GNAQ, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MET, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RET, TERT y TP53 fueron algunos de esos genes. Incluso sin un conocimiento previo de los socios de fusión o puntos de ruptura conocidos, el kit detecta las fusiones de todos los genes objetivo en una sola prueba de secuenciación utilizando el enriquecimiento basado en la PCR multiplex anclada (AMPTM) exclusiva de Archer. Para variantes conocidas y no descubiertas, la técnica utiliza cebadores específicos de genes (GSP) unidireccionales. Tanto los índices de los pacientes como las etiquetas moleculares están presentes en las etiquetas. El gráfico "HeatMap" proporciona los niveles de expresión.

2.3. Inestabilidad de microsatélites

Para cada uno de los 114 loci de microsatélites, el algoritmo MSI determina la diversidad de Shannon (puntuación de inestabilidad) de las longitudes de repetición en las lecturas distintas. La puntuación de inestabilidad de cada locus se compara con las puntuaciones de inestabilidad de una cohorte de referencia de muestras estables incluidas en la canalización para evaluar la estabilidad del locus. En cada locus de la muestra interrogada, las muestras de referencia se escalan para que coincidan con la profundidad de secuenciación. Dependiendo de las preferencias del usuario, el porcentaje de loci que se encuentran inestables influye en si las muestras se clasifican como inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H), inestabilidad de microsatélites intermedia o estables (MSS). Basándose en el porcentaje total de loci de microsatélites (MS) inestables, la canalización MSI determina la estabilidad de los microsatélites para cada muestra: MS-Estable: menos del 20% de los loci son inestables, MS-Intermedio: 20–30% y MS-Alto: más del 30%. Para garantizar que cada locus cumpla con un umbral mínimo de profundidad de lectura de 25, se realiza un control de calidad de la profundidad de lectura por locus de MS. Para garantizar que cada muestra tenga al menos 35 000 lecturas de MS aceptables, se realiza un segundo control de calidad. Las muestras se clasificarán como MSI-Desconocido si no superan alguno de estos controles de calidad.

2.4. Variación del número de copias

El ensayo de CNV compara el número de copias de las muestras normales y de enfermedad utilizando una o más muestras de control, si las hay. Si no hay controles, cada muestra de la tarea se utiliza como línea de base. El software de análisis utiliza estos datos para generar una lectura y una visualización del número de copias, así como un valor p para indicar la confianza de la llamada. El número de copias de cada cebador con CNV habilitado en un panel se determina; estos cebadores se representan mediante puntos en la cuadrícula de CNV. Los resultados de estos análisis cebador por cebador se compilan y se muestran para áreas genómicas más amplias.

2.5. Análisis de datos

Primero, se evaluó la calidad de los datos de los datos brutos que se transfirieron a la plataforma Archer Analysis. Tras la revisión de estas métricas, se añadieron las muestras adecuadas al flujo de trabajo analítico y se evaluaron en relación con la enfermedad designada. Teniendo en cuenta los datos clínicos del paciente, se realizó un filtrado en el flujo de trabajo analítico para examinar las alteraciones asociadas con el tipo de tumor designado. Tras el filtrado, los cambios en las listas se clasificaron en función de si se encontraban en bases de datos y directrices y contenían información sobre el diagnóstico, el pronóstico y la terapia. Se tuvieron en cuenta las recomendaciones de la Asociación para la Patología Molecular/Sociedad Americana de Oncología Clínica/Colegio de Patólogos Americanos (AMP/ASCO/CAP) [^[21]] y la evidencia sobre las alteraciones al clasificar.

2.6. Niveles de clasificación y evidencia

Nivel I: (A) Variantes en un tipo de tumor particular que son sensibles y resistentes a las terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y aprobadas por las directrices. (B) Variantes incluidas en investigaciones exhaustivas y bien documentadas por organizaciones profesionales. Nivel II: (C) Variantes en un tipo de tumor diferente que son sensibles y resistentes a las terapias aprobadas por la FDA y aprobadas por las directrices. (D) Las variantes se presentan en investigaciones preclínicas o informes de casos. Nivel III: Variantes con implicaciones clínicas poco claras. Nivel IV: Las variantes con frecuencias alélicas extremadamente altas no se han asociado con una malignidad particular [^[21]].

2.7. Métricas de calidad NGS

Las métricas de calidad utilizadas en este estudio de NGS se seleccionaron para garantizar una alta precisión analítica, la fiabilidad de la detección de variantes y la relevancia clínica de los resultados obtenidos. Cada parámetro se describe en detalle a continuación: Se aplicó un umbral mínimo de profundidad de secuenciación y solo se incluyeron en el análisis las muestras que alcanzaron al menos 2,5 millones de lecturas totales por muestra. Este criterio aseguró una cobertura adecuada en todas las regiones objetivo y redujo el riesgo de detectar falsos negativos. Las observaciones alternativas (AO) representan el número total de lecturas de secuenciación que respaldan la presencia de un alelo alternativo. Se requirió un valor mínimo de AO de 5 para minimizar la posibilidad de que las variantes detectadas fueran el resultado de errores de secuenciación aleatorios o ruido de fondo. Las observaciones alternativas únicas (UAO) indican el número de lecturas de secuenciación independientes derivadas de fragmentos moleculares únicos que respaldan el alelo alternativo. Se aplicó un umbral de al menos 3 observaciones únicas para aumentar la confianza en las llamadas de variantes reales y reducir la influencia de artefactos de duplicación por PCR. Se realizó un filtrado de la frecuencia alélica poblacional utilizando la Base de datos de agregación de genomas (gnomAD). Se excluyeron las variantes con una frecuencia alélica de gnomAD de 0,05 o superior, ya que estas variantes se consideran polimorfismos comunes y es poco probable que sean clínicamente significativas en el contexto de este estudio. La fracción alélica de la variante (AF) refleja la proporción de lecturas de secuenciación que respaldan el alelo alternativo en relación con el número total de lecturas en una posición genómica determinada. Se aplicó un umbral de AF de al menos 0,027 para garantizar que las variantes detectadas estuvieran presentes a un nivel biológicamente significativo, particularmente en muestras con baja celularidad tumoral o ADN tumoral circulante. Finalmente, se aplicó una prueba estadística de valores atípicos de la fracción alélica. Se consideraron estadísticamente significativas las variantes con un valor p de valores atípicos de AF inferior a 0,01, lo que indica que la fracción alélica observada es poco probable que se deba a una variación aleatoria. Este criterio proporcionó un nivel adicional de confianza estadística en la detección de variantes. En conjunto, estos parámetros de control de calidad mejoraron la solidez del análisis NGS, optimizaron la precisión de la identificación de variantes y garantizaron la fiabilidad de las interpretaciones clínicas y de investigación posteriores.

2.8. Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 8.4.2 para analizar los datos. Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir las características demográficas y clinicopatológicas basales. Las variables categóricas se compararon utilizando la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi-cuadrado, según corresponda. Todas las pruebas estadísticas fueron bicaudales, y se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

3. Resultados

3.1. Características clínicas de la cohorte de pacientes y frecuencias de las variantes RAS

Este es un estudio retrospectivo de pacientes con CRC. En el momento de la prueba, los 73 pacientes con CRC tenían entre 31 y 83 años, con una edad media de 58,77 ± 12,72. Había 38 (52%) mujeres y 35 (48%) hombres. Los hombres y las mujeres tenían edades medias casi idénticas (60,31 ± 12,32 frente a 57,34 ± 13,08). De los pacientes, 30 de 73 (41%) dieron positivo para variantes de KRAS. Comparamos el estado de las variantes de KRAS entre diferentes géneros y entre aquellos mayores y menores de 65 años. No se encontraron diferencias significativas entre ellos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Nuestra investigación reveló que el exón 2 incluía 21 (70%) variantes de KRAS, el exón 3 contenía 3 (10%) variantes de KRAS y el exón 4 contenía 6 (20%) variantes de KRAS. Las variantes de KRAS en el codón 12 fueron más comunes que las del codón 13 (43% frente a 27%, Tabla 2). Para nuestro grupo, c.35G > T p.Gly12Val (G12V 8/30, 26,6%) fue la variante más frecuente reportada en el exón 2, seguida de c.35G > A p.Gly12Asp (G12D 5/30, 16,6%). Según la Tabla 2, cada variante en el codón 13 del exón 2 era de la forma c.38G > A p.Gly13Asp (G13D 8/30, 26,6%) (Figura 1a).

Las variantes del exón 3 de KRAS en el codón 61 se detectaron en solo dos pacientes (Tabla 2). c.183A > C p.Gln61His (Q61H) y c.183A > T p.Gln61His (Q61H) fueron variantes en el codón 61. No se encontró que ningún individuo diera positivo para variantes de KRAS en el codón 59 del exón 3. Cada paciente que dio positivo para el exón 4 de KRAS tenía variantes en el codón 146, específicamente c.436G > A p.Ala146Thr (A146T). No se detectaron variantes de KRAS en el codón 117 del exón 4 en ninguno de los sujetos (Tabla 3). Cada variante de BRAF encontrada fue una variación de c.1799T > A p.Val600Glu (V600E) (Figura 1b). Se descubrieron un total de cuatro variantes de NRAS, y un paciente tenía covariantes tanto en NRAS como en KRAS. Una muestra tenía variantes de NRAS en el exón 2 (codón 13), tres muestras tenían el exón 3 (codón 61) y ninguna de las muestras tenía el exón 4 (codón 146 o 117) (Figura 1c). El análisis de la respuesta al tratamiento mostró que las 30 variantes de KRAS y las 4 variantes de NRAS eran resistentes a los medicamentos aprobados por la FDA, cetuximab, panitumumab y tutatinib + trastuzumab. En contraste, la terapia con cetuximab + encorafenib mostró una respuesta positiva en pacientes con variantes de BRAF.

Además, el 45,2% (33/73) de nuestra cohorte presentaba variantes de TP53 (Figura 2), ya sea solas o en asociación con otros genes como KRAS, BRAF, PIK3CA y NRAS. La amplificación de ERBB2 se identificó en el 1,4% (1/73) de los casos (Tabla 3).

3.2. Evaluación de la inestabilidad de microsatélites

Todos los pacientes, excepto dos, presentaban un estado de MSI estable según las pruebas de MSI. Se muestran a continuación imágenes representativas de la inestabilidad de microsatélites de los genes KRAS (Figura 3a), BRAF (Figura 3b) y NRAS (Figura 3c). Además, se encontraron variaciones de Nivel IA en 35 de 73 pacientes, clasificadas utilizando los estándares AMP/ASCO/CAP.

3.3. Evaluación de la variación del número de copias

Los resultados del análisis de CNV mostraron que no se detectaron variaciones en el número de copias en los pacientes con KRAS (Figura 4a), BRAF (Figura 4b) y NRAS (Figura 4c), pero se encontró amplificación de ERBB2 (Figura 5) en un caso.

4. Discusión

En esta investigación, encontramos que el 41% de nuestros pacientes con CRC tenían variantes de KRAS, lo que coincide con un estudio reciente [^[22]]. Entre estas variantes de KRAS, G12V fue la variante más frecuente reportada en el codón 12 del exón 2, seguida de G12D. Dado que G12D y G12V compiten por el primer puesto, estudios recientes han demostrado que la variante KRAS G12D es la más prevalente, representando el 10-12% de los casos de CRC [^[23]]. Los estudios han demostrado que los inhibidores de EGFR y los bloqueadores de KRAS G12D tienen efectos letales sintéticos porque la inhibición simultánea de KRAS G12D y EGFR puede mejorar significativamente la apoptosis in vitro y la reducción del tumor in vivo. La investigación del método combinado de restricción de KRAS G12D/EGFR para mejorar la respuesta al tratamiento y aumentar los beneficios para los pacientes con CRC con variantes de KRAS G12D. La activación de la mutación de KRAS es común en el CRC, el cáncer de pulmón no de células pequeñas y el cáncer de páncreas. La investigación genética ha demostrado que ciertos alelos variantes de KRAS están relacionados con dependencias genéticas específicas de tejidos, además de características de señalización únicas asociadas con cada forma mutante de KRAS [^[24]], lo que subraya la complejidad subyacente de los diferentes resultados clínicos de los inhibidores específicos de alelos de KRAS. Por ejemplo, sotorasib, el primer inhibidor aprobado para la variante KRAS G12C, produjo un beneficio terapéutico duradero para los pacientes con cáncer de pulmón con la variante KRAS G12C, excluyendo el cáncer de células pequeñas, mientras que aquellos con CRC que portaban la misma variante respondieron menos bien al mismo medicamento [^[25]]. Un enfoque terapéutico emergente para superar la resistencia adaptativa en pacientes con estas variantes específicas de KRAS es la combinación de inhibidores de EGFR con inhibidores de KRAS G12C o G12D. Debido a la sobreexpresión compensatoria de las vías de señalización de EGFR, la investigación ha demostrado que los inhibidores de KRAS G12C, como sotorasib o adagrasib, solos a menudo tienen una eficacia limitada en el CRC [^[18]]. Por lo tanto, se han observado mejores tasas de respuesta y control de la enfermedad en modelos preclínicos y ensayos clínicos de fase temprana cuando KRAS y EGFR se bloquean simultáneamente [^[26]].

Encontramos que el 45,2% (33/73) de nuestra cohorte presentaba variantes de TP53, ya sea solas o en combinación con otros genes oncogénicos como NRAS, BRAF, la subunidad catalítica alfa de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinasa (PIK3CA) y KRAS. Estudios recientes indican que se están desarrollando varios compuestos experimentales para corregir las variantes de TP53 o para restaurar la actividad funcional de la proteína p53. Estos incluyen enfoques que utilizan moléculas pequeñas que reactivan el p53 mutante y agentes que se dirigen a la interacción MDM2-p53 [^[27]]. Uno de estos compuestos, Eprenetapopt (APR-246), se ha investigado en cánceres que albergan variantes de TP53, pero aún no ha recibido la aprobación de la FDA como terapia dirigida [^[28]]. Además, el compuesto investigacional JAB-30300 ha recibido la aprobación de la FDA para un ensayo clínico de Fase 1/2a dirigido a tumores sólidos avanzados que albergan la variante p53 Y220C [^[29]]. Los estudios han demostrado que la tecnología NGS utilizada para detectar la amplificación del gen ERBB2 ofrece una sensibilidad y precisión significativamente mayores en comparación con los métodos tradicionales de inmunohistoquímica (IHC) e hibridación in situ fluorescente (FISH). En nuestro estudio, la amplificación de ERBB2 se detectó en el 1,4% (1/73) de los casos, lo que coincide con los hallazgos previos que informaron una frecuencia similar de alrededor del 2% [^[30]]. La CNV de ERBB2 se reconoce como un biomarcador predictivo de la respuesta al tratamiento y se puede identificar tanto en tejido tumoral como en muestras de plasma. En 2024, la FDA otorgó la aprobación acelerada para uso en tumores agnósticos a trastuzumab deruxtecan (Enhertu) para el tratamiento de tumores sólidos HER2-positivos [^[20]], lo que supone un avance significativo al permitir su uso en múltiples tipos de cáncer con amplificación de ERBB2/HER2 [^[31]].

En nuestro estudio, se obtuvieron biopsias o muestras quirúrgicas de pacientes con un diagnóstico patológico confirmado y una etapa clínica III-IV, lo que garantiza una alta precisión diagnóstica y fortalece la fiabilidad de nuestros hallazgos. Basándose en este marco patológico bien definido, los avances recientes en el aprendizaje profundo (DL) han demostrado un potencial sustancial para mejorar aún más el análisis de imágenes de histopatología para el diagnóstico y la clasificación del CRC. Un número creciente de investigaciones muestra que los algoritmos basados en DL, especialmente los modelos basados en transformadores y las redes neuronales convolucionales (CNN), pueden diferenciar de manera confiable entre tejidos benignos y malignos, logrando con frecuencia métricas de rendimiento que son comparables o mejores que las de los patólogos experimentados en conjuntos de datos multicéntricos de gran tamaño. Los modelos de IA entrenados en imágenes de histopatología de toda la lámina, por ejemplo, han demostrado una fuerte concordancia con los diagnósticos de los expertos y una excelente precisión diagnóstica, lo que indica herramientas de apoyo útiles para las operaciones clínicas de patología estándar [^[32]]. La amplia aplicabilidad de los enfoques de DL en la histopatología del CRC se demuestra aún más mediante revisiones sistemáticas y análisis de alcance, que muestran que no solo ayudan con la clasificación binaria del cáncer, sino que también permiten una categorización tumoral más granular y la extracción de características clínicamente relevantes de las imágenes de histología del CRC [^[33]]. La investigación en curso sugiere que los modelos de aprendizaje profundo podrían incorporarse en los flujos de trabajo de diagnóstico del CRC para aumentar la precisión, la eficiencia y la reproducibilidad con un mayor refinamiento y una validación clínica rigurosa, aunque todavía existen problemas con la validación externa y la generalización en diferentes entornos clínicos [^[34]].

En este sentido, al mejorar la estratificación del riesgo y la precisión diagnóstica, la incorporación de algoritmos basados en el aprendizaje profundo en los datos de cribado y el análisis histopatológico puede mejorar aún más la identificación temprana del CCRC [^[35]]. Se puede lograr un enfoque más individualizado, eficiente y con mayor valor pronóstico para la prevención y el tratamiento del CCRC mediante la combinación del uso de la inteligencia artificial, el asesoramiento genético y las pruebas moleculares con los métodos de cribado tradicionales. Además, los profesionales de la salud son nuestro grupo objetivo para la prevención del CCRC, ya que pueden reducir su riesgo personal de desarrollar la enfermedad y aumentar su capacidad para promover procedimientos de cribado basados en la evidencia. Las pruebas genéticas y el asesoramiento genético son esenciales para identificar a las personas con síndromes hereditarios de CCRC, como el síndrome de Lynch, y para orientar las decisiones de tratamiento, los niveles de vigilancia y las medidas preventivas, además de las pruebas basadas en heces y las colonoscopias que se recomiendan en las guías. La detección temprana de mutaciones perjudiciales permite tomar decisiones de tratamiento personalizadas, lo que también puede mejorar el pronóstico y los resultados clínicos [^[36]].

Dado que este fue un estudio retrospectivo realizado en un único centro de genética, hubo limitaciones en el seguimiento de los pacientes y en el acceso a datos clínicos completos. Además, el tamaño de la muestra fue relativamente limitado. Se planean futuros estudios multicéntricos que involucren cohortes de pacientes más grandes para abordar estas limitaciones y fortalecer la generalización de los hallazgos.

En conclusión, nuestro estudio confirma que los variantes de KRAS, especialmente G12C y G12D, son muy prevalentes en el CCRC y están asociados con un mal pronóstico y terapias limitadas. La combinación de inhibidores de EGFR con agentes dirigidos a KRAS G12C/G12D puede ayudar a superar la resistencia. Además, se observaron variantes patógenas de TP53 y amplificación de ERBB2, con terapias aprobadas por la FDA o en investigación disponibles, lo que ofrece orientación para las decisiones de tratamiento y el asesoramiento genético.