Optimización farmacocinética del predirigido terapéutico basado en radiocobre.

En las últimas tres décadas, los anticuerpos monoclonales marcados con radioisótopos (mAb) han surgido como herramientas potentes en oncología. De hecho, una amplia variedad de mAb marcados con radionúclidos que emiten rayos gamma (por ejemplo, 111In), positrones (por ejemplo, 89Zr, 124I), partículas beta (por ejemplo, 177Lu, 131I) o partículas alfa (por ejemplo, 225Ac) se han aplicado en la clínica para la obtención de imágenes nucleares y la terapia radiofarmacéutica del cáncer. Entre estos, 89Zr-girentuximab, 131I-omburtumab, 89Zr-pertuzumab, 177Lu-trastuzumab y 225Ac-Actimab-A ofrecen ejemplos recientes particularmente interesantes.[] []
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[] A pesar de esta promesa, los perfiles farmacocinéticos de varios días de duración de los anticuerpos de cadena completa pueden generar altas dosis de radiación en los tejidos sanos, un fenómeno que puede ser particularmente problemático e, en algunos casos, clínicamente contraindicado en el contexto de la radioinmunoterapia (RIT).[],[]

El preorientamiento in vivo es un método elegante diseñado para evitar las preocupaciones sobre la farmacocinética y la dosimetría de los anticuerpos marcados con radioisótopos.[] []
[] El preorientamiento se basa en una elección contraintuitiva: separar la radiactividad del anticuerpo. Primero, se inyecta el anticuerpo y se le da tiempo (generalmente varios días) para que se acumule en el tejido diana y se elimine de la sangre. Posteriormente, la radiactividad, típicamente como parte de una pequeña molécula radioligando, se administra; esta molécula viaja rápidamente por el cuerpo, combinándose con el inmunoconjugado unido al tumor o eliminándose rápidamente de la circulación. A lo largo de los años, los científicos han recurrido a varias tecnologías para facilitar la ligación in vivo entre el anticuerpo y el radioligando, incluyendo la biotina y la estreptavidina, los anticuerpos biespecíficos, los oligonucleótidos complementarios y la química huésped-invitado.[] Recientemente, nuestro equipo y otros hemos recurrido a la química de "clic" bioortogonal, específicamente la reacción de demanda electrónica inversa extraordinariamente rápida entre la tetrazina (Tz) y la trans-cicloocteno (TCO), para facilitar el preorientamiento.[] []
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[] Con este fin, se administra por vía intravenosa un inmunoconjugado que contiene TCO, seguido, días después, de un radioligando basado en Tz que se une al mAb-TCO en el tumor o se elimina del cuerpo (Figura). Este enfoque se ha validado en modelos preclínicos tanto para la obtención de imágenes como para la terapia, utilizando una variedad de anticuerpos y radionúclidos que van desde el 11C hasta el 225Ac.[] []
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Anteriormente, hemos utilizado anticuerpos que contienen TCO y un radioligando Tz que contiene sarcofagina (SarAr-Tz) para facilitar la obtención de imágenes PET preorientadas basadas en 64Cu en modelos murinos de cáncer colorrectal y de páncreas.[] Estos sistemas produjeron un excelente contraste entre el tumor y el fondo, y una combinación [64Cu]­Cu-SarAr-Tz y 5B1-TCO es el objeto de un ensayo clínico activo centrado en la obtención de imágenes PET preorientadas de cánceres que expresan CA19-9 en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (NCT05737615). A la luz de esta promesa, marcamos el ligando que contiene Tz con 67Cu, un radioisótopo emisor de partículas beta del cobre con una vida media de 2,6 días, y luego combinamos [67Cu]­Cu-SarAr-Tz con una variante que contiene TCO del mAb huA33 dirigido al antígeno A33 (es decir, huA33-TCO) para la radioinmunoterapia preorientada (PRIT) en un modelo murino de cáncer colorrectal.[] Si bien este sistema proporcionó resultados prometedores en términos de seguridad y eficacia, el rendimiento in vivo de los sistemas de preorientamiento depende en gran medida del perfil farmacocinético del radioligando. De hecho, nuestra investigación previa ha demostrado que incluso cambios menores en la estructura de los radioligandos pueden alterar drásticamente su captación en el tumor, el contraste entre el tumor y el fondo y los índices terapéuticos. Aquí, describimos nuestro trabajo para crear un radioligando de sarcofagina-tetrazina optimizado para la obtención de imágenes y la terapia preorientadas basadas en radiocobre.

Métodos y Materiales

General

Todos los reactivos se compraron a Fisher Scientific, a menos que se indique lo contrario. HuA33 se obtuvo de Genscript, Inc. (Piscataway, Nueva Jersey), y la línea celular SW1222 se compró a ATCC (Manassas, Virginia). TCO-NHS, Tz-NHS y Tz-PEG5-NHS se compraron a VectorLabs (Newark, California), y HOOC-PEG10-NH2 se obtuvo de BroadPharm (San Diego, California). El cobre-64 se compró a la Universidad de Washington, St. Louis, como [64Cu]­CuCl2 en 0,05 M HCl. El cobre-67 se compró al Idaho Accelerator Center (Idaho State University, Pocatello, Idaho, EE. UU.) como [67Cu]­CuCl2 en 0,01 M HCl. Todos los experimentos que involucran animales de laboratorio se realizaron utilizando protocolos aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de Weill Cornell Medical College y Hunter College (Protocolo #2015-0004).

Todos los instrumentos se calibraron y se mantuvieron de acuerdo con las prácticas y los procedimientos estándar de control de calidad. Toda la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó utilizando un sistema HPLC Shimadzu y una columna de fase inversa C18 Phenomenex Jupiter (5 μm, 10 × 250 mm) o una columna Superdex 200 Increase 10/300 GL. Las mediciones de UV-Vis se realizaron en un espectrofotómetro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One Microvolume (Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). La radiactividad se midió utilizando un calibrador de dosis CRC-15R (Capintec, Inc., Ramsey, NJ), y las muestras de biodistribución se contaron en un contador automático Wizard[] ?-calibrado (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). El marcado del radioligando se controló utilizando cromatografía en capa fina instantánea (iTLC) impregnada de sílice y fibra de vidrio y se analizó en un lector de placas de radio-TLC AR-2000 utilizando el software Winscan Radio-TLC (Bioscan, Inc., Washington, DC).

Síntesis de SarArTz (1)

En un pequeño frasco de vidrio, se disolvieron 10 mg de SarAr-NH2 en 400 μL de dimetilformamida extra seca. Posteriormente, se añadieron 1,5 eq. de Tz-NHS junto con 1,5 eq. de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (tR = 11,8 min). Masa exacta: 631,42; masa observada: [M + H]+= 632,42, [M+2H]2+= 316,87.

Síntesis de SarAr-PEG5-Tz (2)

En un pequeño frasco de vidrio, se disolvieron 10 mg de SarAr-NH2 en 400 μL de dimetilformamida extra seca. Posteriormente, se añadieron 1,5 eq. de Tz-PEG5-NHS junto con 1,5 eq. de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (t
R = 12,0 min). Masa exacta: 922,59; masa observada: [M + H]+= 923,64, [M+2H]2+= 461,82.

Síntesis de SarAr-PEG10-Tz (3)

En un pequeño frasco de vidrio, se disolvieron 10 mg de Tz-PEG10-COOH en 600 μL de dimetilformamida, y se añadieron 3 eq. de DIPEA. Después de 10 min, se añadieron 1,2 eq. de HATU, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, se mezclaron 1,3 eq. de SarAr-NH2 en el frasco, y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (t
R = 12,5 min). Masa exacta: 1142,72; masa observada: [M + H]+= 1143,64, [M+2H]2+= 571,82.

Cultivo celular

La línea celular de cáncer colorrectal humano SW1222 se obtuvo de ATCC y se mantuvo en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina y 100 unidades/mL de estreptomicina en un ambiente de 37 °C que contiene 5% de CO2. La línea celular se cosechó y se pasó cada 5 días utilizando 0,25% de tripsina/0,53 mM de EDTA en solución salina tamponada con Hank sin calcio ni magnesio. Todos los medios se compraron a la Unidad de Preparación de Medios del Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

Marcado con 64Cu y 67Cu

Se preparó una solución de 7 μg de SarAr-Tz, SarAr-PEG5-Tz o SarAr-PEG10-Tz en 200 μL de tampón NH4OAc (0,25 M, pH 5,5). Luego, se añadió [64Cu]­CuCl2 o [67Cu]­CuCl2 en 0,05 M HCl (185-370 MBq) a la mezcla de reacción, y se incubó en un termomixer a 600 rpm durante 15 min a 37 °C. Después de la incubación, se realizó una cromatografía en capa fina instantánea (iTLC) con un disolvente de 50 mM de EDTA (pH 5,5) para determinar el rendimiento radiroquímico de la reacción.

Coeficientes de partición

Se preparó una mezcla 1:1 de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y 1-octanol en viales de vidrio de 8 mL. Se añadieron 0,037 MBq de [64Cu]­Cu-SarAr-Tz, [64Cu]­Cu-SarAr-PEG5-Tz o [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz a la mezcla y se agitó vigorosamente durante 5 min. Luego, se transfirió 1 mL de cada capa a pequeños viales, y se contó la cantidad de radiactividad en un contador gamma calibrado para 64Cu. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular los coeficientes de partición:

Bioconjugación de huA33-TCO

Se colocó una solución de 1 mg de huA33 en 500 μL de PBS (pH 7,4) en un tubo de microcentrífuga LoBind Eppendorf, y luego se aumentó el pH a 9,5 mediante la adición de pequeñas alícuotas de 0,1 M de bicarbonato de sodio. Posteriormente, se añadieron 80 eq. de TCO-NHS en 500 μL de DMSO, y la solución resultante se dejó reaccionar en un termomixer durante 1 h a temperatura ambiente y 500 rpm. La mezcla se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Sephadex G-25 M, columna PD-10, GE Healthcare; volumen muerto: 2,5 mL, eluido con 2 mL de Chelex PBS, pH 7,4) y se concentró mediante filtración centrífuga con un punto de corte de peso molecular de 50.000 Da (Unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra de 2 mL, MilliporeSigma Corp., Burlington, MA). Se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para caracterizar el inmunoconjugado después de la modificación. Con este fin, se utilizó PBS pH 7,4 como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,75 mL/min en una columna Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva, Global Life Sciences Solutions USA LLC, Marlborough, MA, EE. UU.).

Grado de marcado

Se preparó una solución de 100 μg de huA33-TCO en 500 μL de PBS (pH 7,4) en un vial de microcentrífuga LoBind de 1,5 mL. Se añadió un exceso de 100 veces de tetrazina-Cy3 a la solución y se dejó reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente en un termomixer a 500 rpm. El producto modificado con fluoróforo se purificó mediante exclusión por tamaño utilizando una columna PD-10 y un eluyente de PBS y luego se concentró mediante centrifugación utilizando un filtro con un punto de corte de 50 kDa. Se realizaron mediciones de absorbancia a 280 y 532 nm para calcular el grado de marcado (DOL) utilizando la siguiente fórmula (A = absorbancia; MW = peso molecular; ? = absortividad molar):

Xenoinjertos subcutáneos

Se obtuvieron ratones hembra atímicos desnudos de seis a ocho semanas de edad de Jackson Laboratory y se les permitió aclimatarse durante aproximadamente 1 semana antes de la inoculación. Los animales se alojaron en jaulas ventiladas y se les proporcionó agua y alimento ad libitum. Se anestesiaron los ratones por inhalación de una mezcla de gas de 2% de isoflurano (Baxter Healthcare, Deerfield, IL)/oxígeno, y se les inyectaron xenoinjertos subcutáneos en el flanco derecho con 5 × 106 células SW1222 en una suspensión celular de 150 μL de una mezcla 1:1 de medio fresco: Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY). Los tumores SW1222 alcanzaron el tamaño ideal para los estudios de obtención de imágenes, biodistribución y terapia (100 mm3) después de aproximadamente dos a tres semanas.

Obtención de imágenes PET

Se realizó una imagen PET en un escáner PET/TC Inveon (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA). Primero, se inyectó a los ratones portadores de tumores con 100 µg (0,7 nmol) de huA33-TCO en 100 µL de solución salina estéril al 0,9% a través de la vena caudal lateral. Después de 96 h, se administró a los mismos ratones [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz o [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (de 11,1 a 12,95 MBq, 0,07 nmol) en 100 µL de solución salina estéril al 0,9% a través de la vena caudal lateral. Aproximadamente 5 minutos antes de la adquisición de los datos PET, se anestesiaron los ratones por inhalación de una mezcla de gas de isoflurano al 2%/oxígeno y se mantuvieron bajo anestesia durante toda la duración del escaneo. Se registraron escaneos estáticos a las 6, 12 y 24 h después de la administración intravenosa de radioligandos marcados con 64Cu. Se utilizó una ventana de energía de 350-650 keV y una ventana de coincidencia temporal de 3,432 ns. Los datos se clasificaron en histogramas bidimensionales mediante rebinado de Fourier y se reconstruyeron imágenes transversales mediante maximización de expectativas de subconjuntos ordenados (OSEM). Los datos de imagen se normalizaron para corregir la no uniformidad de la respuesta del detector, la desintegración física del radionúclido en el momento de la inyección, las pérdidas de conteo por tiempo muerto y la relación de ramificación de positrones, pero no se aplicó ninguna corrección de atenuación, dispersión o promediación de volumen parcial. Las tasas de conteo en las imágenes reconstruidas se convirtieron en concentraciones de actividad (porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido [%ID/g]) utilizando un factor de calibración del sistema derivado de la imagen de un fantasma de agua del tamaño de un ratón que contenía 64Cu. Las imágenes se analizaron con VivoQuant (Invicro).

Dosimetría

Brevemente, se utilizó el enfoque de dosimetría descrito por Carter y colaboradores.[] Con este fin, se obtuvieron datos de biodistribución a nivel de órgano para [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz a las 4, 12, 24, 48, 72 y 96 h posteriores a la administración (véase más abajo) y se utilizaron para proyectar las dosis de radiación absorbidas en un ratón representativo de 25 g. Para los fines de la estimación de la concentración de actividad en la médula ósea hematopoyéticamente activa (roja), las concentraciones de actividad en sangre se escalaron por un factor de 0,36.[] La eliminación de la actividad en la mayoría de los tejidos se describió generalmente mediante un modelo de decaimiento exponencial de una o dos fases, que se ajustó a los datos mediante regresión no lineal. El tejido tumoral exhibió una marcada captación durante el período de tiempo medido, por lo tanto, se utilizó un exponencial de dos fases con un período de captación seguido de un período de eliminación para el tumor. La actividad integrada en el tiempo se calculó entonces utilizando los parámetros optimizados por regresión de las funciones de ajuste con las expresiones analíticas de sus integrales (para completar la desintegración). Las dosis absorbidas en el tumor y en todos los órganos normales se estimaron utilizando simulaciones de transporte de radiación de Monte Carlo, que utilizan el fantasma de ratón MOBY y el software PHITS/PARaDIM.[] Se utilizaron la configuración predeterminada de PARaDIM para los modelos físicos del transporte de radiación y se simularon suficientes historias de partículas para lograr menos del 2% de error relativo estadístico en las estimaciones de la dosis absorbida para cada órgano del fantasma.

Estudio longitudinal de radioterapia

En los estudios de terapia longitudinal, se emplearon tres cohortes de control, tres cohortes de PRIT y una cohorte de RIT tradicional (n = 10). La primera cohorte de control recibió solo solución salina, la segunda recibió solo huA33-TCO (100 µg, 0,7 nmol, 6 TCO/mAb, en 100 µL de solución salina estéril) y la tercera recibió solo [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (55,5 MBq, 0,7 nmol, en 100 µL de solución salina estéril). A todos los animales de las cohortes de preorientación se les administró huA33-TCO (100 µg, 0,7 nmol, 6 TCO/mAb, en 100 µL de solución salina estéril) seguido, 96 h después, de la inyección de [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (18,5 MBq, 37 MBq, 55,5 MBq, en 100 µL de solución salina estéril). En la cohorte de RIT, se administró a los ratones [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz-TCO-huA33 (18,5 MBq, 100 µg, 0,7 nmol, en 100 µL de solución salina estéril; consulte la información complementaria para obtener detalles sobre la síntesis). Los volúmenes de los xenoinjertos se controlaron dos veces por semana utilizando calibradores. Se evaluó a todos los ratones cada dos semanas durante el estudio para detectar signos externos de toxicidad, incluyendo letargo, pérdida de apetito y disminución del peso corporal. Se definieron cuatro posibles puntos finales del estudio: (i) si la dimensión más larga del tumor alcanzó los 2 cm3; (ii) si el tumor comenzó a dificultar el movimiento del ratón; (iii) si el tumor se volvió necrótico; y (iv) si el ratón perdió más del 10% de su peso corporal.

Análisis de sangre

Los ratones del estudio de terapia longitudinal fueron anestesiados con una mezcla de gas de isoflurano al 2%/oxígeno antes de recoger 30 µL de sangre del seno retro-orbital utilizando un tubo capilar de microhematocrito. La sangre se recogió en un tubo de recolección Minivette POCT recubierto con EDTA K3 (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA, EE. UU.) y posteriormente se analizó con un HemaVet 950 (Drew Scientific, Inc., Miami Lakes, FL, EE. UU.).

Análisis estadístico

Las diferencias estadísticas se analizaron con el software GraphPad Prism (10.6.0v GraphPad Software Inc.; San Diego, CA, EE. UU.) mediante una prueba t de Student de dos colas no pareada con una corrección de Welch. *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 y ****P < 0,0001.

General

Todos los reactivos se compraron a Fisher Scientific, a menos que se indique lo contrario. HuA33 se obtuvo de Genscript, Inc. (Piscataway, Nueva Jersey), y la línea celular SW1222 se compró a ATCC (Manassas, Virginia). TCO-NHS, Tz-NHS y Tz-PEG5-NHS se compraron a VectorLabs (Newark, California), y HOOC-PEG10-NH2 se obtuvo de BroadPharm (San Diego, California). El cobre-64 se compró a la Universidad de Washington, St. Louis, como [64Cu]-CuCl2 en HCl 0,05 M. El cobre-67 se compró al Centro de Aceleradores de Idaho (Universidad Estatal de Idaho, Pocatello, Idaho, EE. UU.) como [67Cu]-CuCl2 en HCl 0,01 M. Todos los experimentos que involucraron animales de laboratorio se realizaron utilizando protocolos aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Weill Cornell y el Hunter College (Protocolo #2015-0004).

Todos los instrumentos se calibraron y se mantuvieron de acuerdo con las prácticas y los procedimientos estándar de control de calidad. Toda la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó utilizando un sistema HPLC Shimadzu y una columna de fase inversa C18 Phenomenex Jupiter (5 µm, 10 × 250 mm) o una columna Superdex 200 Increase 10/300 GL. Las mediciones de UV-Vis se realizaron en un espectrofotómetro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One Microvolume (Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). La radiactividad se midió utilizando un calibrador de dosis CRC-15R (Capintec, Inc., Ramsey, NJ), y las muestras de biodistribución se contaron en un contador automático Wizard calibrado (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). El marcado del radioligando se controló utilizando cromatografía en capa fina instantánea (iTLC) impregnada de fibra de vidrio y sílice con un eluyente de EDTA 50 mM (pH 5,5) y se analizó en un lector de placas de TLC radio-AR-2000 utilizando el software Winscan Radio-TLC (Bioscan, Inc., Washington, DC).

Síntesis de SarArTz (1)

En un pequeño vial de vidrio, se disolvieron 10 mg de SarAr-NH2 en 400 µL de dimetilformamida extra seca. Posteriormente, se añadieron 1,5 eq. de Tz-NHS junto con 1,5 eq. de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (tR = 11,8 min). Masa exacta: 631,42; masa observada: [M + H]+ = 632,42, [M+2H]2+ = 316,87.

Síntesis de SarAr-PEG5-Tz (2)

En un pequeño vial de vidrio, se disolvieron 10 mg de SarAr-NH2 en 400 µL de dimetilformamida extra seca. Posteriormente, se añadió 1,5 eq. de Tz-PEG5-NHS junto con 1,5 eq. de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente y el producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (tR = 12,0 min). Masa exacta: 922,59; masa observada: [M + H]+ = 923,64, [M+2H]2+ = 461,82.

Síntesis de SarAr-PEG10-Tz (3)

En un pequeño vial de vidrio, se disolvieron 10 mg de Tz-PEG10-COOH en 600 µL de dimetilformamida y se añadieron 3 eq. de DIPEA. Después de 10 min, se añadieron 1,2 eq. de HATU y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, se mezclaron 1,3 eq. de SarAr-NH2 en el vial y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto se purificó mediante HPLC semipreparativa C18 utilizando un gradiente de 5-95% de MeCN/Agua + 0,1% de TFA durante 30 min (tR = 12,5 min). Masa exacta: 1142,72; masa observada: [M + H]+ = 1143,64, [M+2H]2+ = 571,82.

Cultivo celular

La línea celular de carcinoma colorrectal humano SW1222 se obtuvo de ATCC y se mantuvo en medio Iscove modificado de Dulbecco (IMDM) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 100 unidades/mL de penicilina y 100 unidades/mL de estreptomicina en un ambiente de 37 °C que contiene 5% de CO2. La línea celular se cosechó y se pasó cada 5 días utilizando 0,25% de tripsina/0,53 mM de EDTA en solución salina tamponada con Hank sin calcio ni magnesio. Todos los medios se compraron a la Unidad de Preparación de Medios del Centro Oncológico Memorial Sloan Kettering.

Marcaje con 64Cu y 67Cu

Se preparó una solución de 7 µg de SarAr-Tz, SarAr-PEG5-Tz o SarAr-PEG10-Tz en 200 µL de tampón NH4OAc (0,25 M, pH 5,5). Luego, se añadió [64Cu]-CuCl2 o [67Cu]-CuCl2 en HCl 0,05 M (185-370 MBq) a la mezcla de reacción y se incubó en un termomixer a 600 rpm durante 15 min a 37 °C. Después de la incubación, se realizó una cromatografía en capa fina instantánea (iTLC) con un eluyente de EDTA 50 mM (pH 5,5) para determinar el rendimiento radiroquímico de la reacción.

Coeficientes de partición

Se preparó una mezcla 1:1 de solución de tampón fosfato (PBS, pH 7,4) y 1-octanol en viales de vidrio de 8 mL. Se añadieron 0,037 MBq de [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz o [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz a la mezcla y se agitó vigorosamente durante 5 min. Luego, se transfirió 1 mL de cada capa a pequeños viales y se contó la cantidad de radiactividad en un contador gamma calibrado para 64Cu. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular los coeficientes de partición:

Bioconjugación de huA33-TCO

Se colocó una solución de 1 mg de huA33 en 500 µL de PBS (pH 7,4) en un tubo de microcentrífuga LoBind Eppendorf y luego se aumentó el pH a 9,5 mediante la adición de pequeñas alícuotas de 0,1 M de bicarbonato de sodio. Posteriormente, se añadieron 80 eq. de TCO-NHS en 500 µL de DMSO y se permitió que la solución resultante reaccionara en un termomixer durante 1 h a temperatura ambiente y 500 rpm. La mezcla se purificó utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (Sephadex G-25 M, columna PD-10, GE Healthcare; volumen muerto: 2,5 mL, eluido con 2 mL de Chelex PBS, pH 7,4) y se concentró utilizando unidades de filtración centrífuga con un punto de corte de peso molecular de 50.000 Da (Unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra de 2 mL, MilliporeSigma Corp., Burlington, MA, EE. UU.). Se utilizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para caracterizar el inmunoconjugado después de la modificación. Con este fin, se utilizó PBS pH 7,4 como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,75 mL/min en una columna Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva, Global Life Sciences Solutions USA LLC, Marlborough, MA, EE. UU.).

Grado de marcaje

Se preparó una solución de 100 µg de huA33-TCO en 500 µL de PBS (pH 7,4) en un vial de microcentrífuga LoBind de 1,5 mL. Se añadió un exceso de 100 veces de tetrazina-Cy3 a la solución y se permitió que reaccionara durante 30 min a temperatura ambiente en un termomixer a 500 rpm. El producto modificado con fluoróforo se purificó mediante exclusión por tamaño utilizando una columna PD-10 y un eluyente de PBS y luego se concentró mediante centrifugación utilizando un filtro con un punto de corte de 50 kDa. Se realizaron mediciones de absorbancia a 280 y 532 nm para calcular el grado de marcaje (DOL) utilizando la siguiente fórmula (A = absorbancia; MW = peso molecular; ? = absortividad molar):

Xenoinjertos subcutáneos

Se obtuvieron ratones hembra atímicos y sin pelo de entre seis y ocho semanas de edad del Laboratorio Jackson y se les permitió aclimatarse durante aproximadamente 1 semana antes de la inoculación. Los animales se alojaron en jaulas ventiladas y se les proporcionó agua y comida ad libitum. Los ratones fueron anestesiados por inhalación de una mezcla de gas de isoflurano al 2% (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) y oxígeno, y se les injertó subcutáneamente en el flanco derecho con 5 × 106 células SW1222 en una suspensión celular de 150 µL, que era una mezcla 1:1 de medio fresco: Matrigel (Corning Life Sciences, Corning, NY). Los tumores SW1222 alcanzaron el tamaño ideal para estudios de imagen, biodistribución y terapia (100 mm3) después de aproximadamente dos a tres semanas.

Imagen PET

La imagen PET se realizó en un escáner PET/TC Inveon (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA). Primero, se inyectó a los ratones portadores de tumores con 100 µg (0,7 nmol) de huA33-TCO en 100 µL de solución salina estéril al 0,9% a través de la vena caudal lateral. Después de 96 horas, se administró a los mismos ratones [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz o [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (11,1 a 12,95 MBq, 0,07 nmol) en 100 µL de solución salina estéril al 0,9% a través de la vena caudal lateral. Aproximadamente 5 minutos antes de la adquisición de los datos PET, los ratones fueron anestesiados por inhalación de una mezcla de gas de isoflurano al 2%/oxígeno y se mantuvieron bajo anestesia durante toda la duración del escaneo. Se registraron escaneos estáticos a las 6, 12 y 24 horas después de la administración intravenosa de radioligandos marcados con 64Cu. Se utilizó una ventana de energía de 350–650 keV y una ventana de coincidencia de 3,432 ns. Los datos se ordenaron en histogramas bidimensionales mediante rebinado de Fourier y se reconstruyeron imágenes transversales mediante maximización de expectativas de subconjuntos ordenados (OSEM). Los datos de imagen se normalizaron para corregir la no uniformidad de la respuesta del detector, la desintegración física del radionúclido en el momento de la inyección, las pérdidas de conteo por tiempo muerto y la relación de ramificación de positrones, pero no se aplicó ninguna corrección de atenuación, dispersión o promediación de volumen parcial. Las tasas de conteo en las imágenes reconstruidas se convirtieron en concentraciones de actividad (porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido [%ID/g]) utilizando un factor de calibración del sistema derivado de la imagen de un fantasma de agua del tamaño de un ratón que contenía 64Cu. Las imágenes se analizaron con VivoQuant (Invicro).

Dosimetría

Brevemente, se utilizó el enfoque de dosimetría descrito por Carter et al.[] Para este fin, se obtuvieron datos de biodistribución a nivel de órgano para [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz a las 4, 12, 24, 48, 72 y 96 horas posteriores a la administración (véase más abajo) y se utilizaron para proyectar las dosis absorbidas de radiación en un ratón representativo de 25 g. Para los fines de estimar la concentración de actividad en la médula ósea hematopoyéticamente activa (roja), las concentraciones de actividad en la sangre se escalaron por un factor de 0,36.[] La eliminación de la actividad en la mayoría de los tejidos se describió generalmente mediante un modelo de decaimiento exponencial de una o dos fases, que se ajustó a los datos mediante regresión no lineal. El tejido tumoral exhibió una marcada captación durante el período de tiempo medido y, por lo tanto, se utilizó un exponencial de dos fases con un período de captación seguido de un período de eliminación para el tumor. La actividad integrada en el tiempo se calculó entonces utilizando los parámetros optimizados por regresión de las funciones de ajuste con las expresiones analíticas de sus integrales (para completar la desintegración). Las dosis absorbidas en el tumor y en todos los órganos normales se estimaron utilizando simulaciones de transporte de radiación de Monte Carlo, que utilizan el fantasma de ratón MOBY y el software PHITS/PARaDIM.[],[] Se utilizaron la configuración predeterminada de PARaDIM para los modelos físicos del transporte de radiación y se simularon suficientes historias de partículas para lograr menos del 2% de error relativo estadístico en las estimaciones de la dosis absorbida para cada órgano del fantasma.

Estudio de Radioterapia Longitudinal

En los estudios de terapia longitudinal, se emplearon tres cohortes de control, tres cohortes de PRIT y una cohorte de RIT tradicional (n = 10). La primera cohorte de control recibió solo solución salina, la segunda recibió solo huA33-TCO (100 µg, 0,7 nmol, 6 TCO/mAb, en 100 µL de solución salina estéril) y la tercera recibió solo [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (55,5 MBq, 0,7 nmol, en 100 µL de solución salina estéril). A todos los animales de las cohortes de preorientación se les administró huA33-TCO (100 µg, 0,7 nmol, 6 TCO/mAb, en 100 µL de solución salina estéril) seguido, 96 horas después, de la inyección de [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (18,5 MBq, 37 MBq, 55,5 MBq, en 100 µL de solución salina estéril). En la cohorte de RIT, se administró a los ratones [67Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz-TCO-huA33 (18,5 MBq, 100 µg, 0,7 nmol, en 100 µL de solución salina estéril; consulte la información complementaria para obtener detalles sobre la síntesis). Los volúmenes de los xenoinjertos se controlaron dos veces por semana utilizando calibradores. Se evaluó a todos los ratones cada dos semanas durante el estudio para detectar signos externos de toxicidad, incluidos letargo, pérdida de apetito y disminución del peso corporal. Se definieron cuatro posibles puntos finales del estudio: (i) si la dimensión más larga del tumor alcanzó los 2 cm3; (ii) si el tumor comenzó a obstaculizar el movimiento del ratón; (iii) si el tumor se necrosó; y (iv) si el ratón perdió más del 10% de su peso corporal.

Análisis de sangre

En el estudio de terapia longitudinal, se anestesiaron los ratones con una mezcla de gas de isoflurano al 2%/oxígeno antes de recoger 30 µL de sangre del seno retro-orbital utilizando un tubo capilar de microhematocrito. La sangre se recogió en un tubo de recolección Minivette POCT recubierto con K3 EDTA (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA, EE. UU.) y posteriormente se analizó con un HemaVet 950 (Drew Scientific, Inc., Miami Lakes, FL, EE. UU.).

Análisis estadístico

Las diferencias estadísticas se analizaron con el software GraphPad Prism (10.6.0v GraphPad Software Inc.; San Diego, CA, EE. UU.) mediante una prueba t de Student de dos colas y no pareada con una corrección de Welch. *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 y ****P < 0,0001.

Resultados y discusión

El primer paso de la investigación fue la síntesis y caracterización de los componentes moleculares del sistema. Nuestro enfoque para la preorientación in vivo combina un anticuerpo modificado con TCO con un radioligando que contiene Tz, principalmente debido a la mayor estabilidad in vivo de TCO en comparación con 1,2,4,5-tetrazina (es decir, la variante de Tz que utilizamos). Es importante tener en cuenta, sin embargo, que esto no necesariamente tiene que ser así: en los últimos años, el advenimiento de TCO más reactivos y Tz más estables ha dado lugar a varios informes en los que se invierte la "polaridad" del sistema de preorientación.[]. Para el estudio en cuestión, sintetizamos y caracterizamos un trío de ligandos en los que la sarcofagina y Tz están separados por cadenas de oligoetilenglicol de diferentes longitudes: SarAr-Tz, SarAr-PEG5-Tz y SarAr-PEG10-Tz (Figura). La elección de estos enlazadores se basó en varias observaciones previas de nuestro laboratorio, específicamente (i) la PEGilación es un enfoque eficaz para modular la farmacocinética de los radioligandos que contienen Tz; (ii) los radioligandos que contienen Tz PEGilados generalmente superan a los radioligandos que contienen Tz que llevan otros tipos de enlazadores; y (iii) la introducción de enlazadores que contienen PEG5 y PEG10 puede cambiar materialmente los perfiles farmacocinéticos de los radioligandos que contienen Tz.[],[] Para cada construcción, se sintetizó una variante que contiene amina de la sarcofagina SarAr-NH2 como se describió anteriormente.[]. Posteriormente, SarAr-NH2 se combinó con Tz-NHS en 500 µL de DMF; se elevó el pH de la solución con DIPEA; y se permitió que la solución se agitara a temperatura ambiente durante 1 hora, lo que finalmente produjo SarAr-Tz con un rendimiento del 35%. Se siguió un procedimiento casi idéntico con Tz-PEG5-NHS para obtener SarAr-PEG5-Tz con un rendimiento del 48%. La falta de un sintón Tz-PEG10 disponible comercialmente requirió una ruta diferente para SarAr-PEG10-Tz. Aquí, H2N-PEG10-COOH se incubó primero con Tz-NHS y DIPEA para producir Tz-PEG10-COOH. Este compuesto se activó luego con 1,2 eq. de HATU y se combinó con SarAr-NH2 para producir SarAr-PEG10-Tz con un rendimiento del 30%. Cada uno de los tres compuestos se purificó mediante HPLC C18 semipreparativa y se caracterizó mediante ESI-HPLC y RMN 1H (Figuras S1-S6).

El inmunoconjugado para este sistema se basa en el anticuerpo huA33, una IgG1 humanizada que se dirige al antígeno A33, una proteína de unión gap transmembrana expresada en la gran mayoría de los carcinomas colorrectales. HuA33 se modificó estocásticamente con TCO-NHS en condiciones básicas y posteriormente se purificó mediante cromatografía de filtración en gel, lo que finalmente produjo huA33-TCO con un rendimiento de aproximadamente el 80%. La cromatografía de exclusión por tamaño confirmó que el inmunoconjugado era >98% puro con respecto a la fragmentación, la agregación y la desmetalación. Posteriormente, se determinó el grado de etiquetado del inmunoconjugado 5,4 ± 0,8 TCO/mAb mediante la ligación por clic con una variante de Tz que contiene Cy3 seguida de espectrofotometría UV-Vis (Tabla S1).

En preparación para los experimentos in vivo, se desarrollaron protocolos de radiomarcaje para cada uno de los ligandos. Para este fin, SarAr-Tz, SarAr-PEG5-Tz y SarAr-PEG10-Tz (0,7 nmol) se incubaron con [64Cu]-CuCl2 (74-370 MBq) en 300 µL de tampón de acetato de amonio (200 mM, pH 5,5) a temperatura ambiente. Se emplearon radio-TLC y radio-HPLC para controlar la reacción, que se completó después de 20 minutos. Finalmente, [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz se aislaron sin purificación posterior en >99% de conversión radiroquímica, >99% de pureza y actividades específicas de 15-20 MBq/g (Figura S7). La hidrofilicidad (es decir, LogD7,4) de cada uno de los radioligandos se determinó mediante experimentos de partición. Se determinaron valores de -2,6 ± 0,1, -3,2 ± 0,1 y -3,3 ± 0,1 para [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz, respectivamente, lo que ilustra que la adición de las cadenas de PEG ejerce algo, pero no una gran influencia sobre la hidrofobicidad. Para verificar la reacción entre los socios de clic, se realizó una prueba de ligación entre cada uno de los radioligandos y huA33-TCO: en cada caso, la HPLC de exclusión por tamaño confirmó que la reacción de clic fue completa y cuantitativa después de solo 5 minutos a temperatura ambiente (ver Figura S8).

La evaluación in vivo de [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz, [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz comenzó con la determinación de las vidas medias séricas. Con este fin, se administraron 11,1-12,9 MBq de cada uno de los radioligandos a ratones atímicos sanos a través de la vena caudal lateral y, posteriormente, se recogieron alícuotas de sangre de la vena caudal contralateral después de 30 segundos, 1, 2, 5, 10, 30 y 60 minutos. La concentración de actividad de la sangre en cada punto de tiempo se determinó entonces mediante un contador gamma; los valores se trazaron en función del tiempo; y estos datos se ajustaron a curvas de decaimiento exponencial. Este análisis reveló una vida media sérica de 31,8 ± 7,9 minutos para [64Cu]-Cu-SarAr-Tz, 28,9 ± 6,4 minutos para [64Cu]-Cu-SarAr-PEG5-Tz y 23,5 ± 5,5 minutos para [64Cu]-Cu-SarAr-PEG10-Tz (Figura). Curiosamente, si bien la PEGilación del radioligando parece haber acelerado su eliminación de la sangre, el efecto no alcanzó el umbral de significación estadística (p > 0,05).

El siguiente paso en la investigación fue la evaluación del
rendimiento in vivo del trío de radioligandos como herramientas para el
pre-dirigido in vivo. Para este fin, se administraron por vía intravenosa a ratones desnudos atímicos que portaban xenoinjertos de cáncer colorrectal humano SW1222 (n = 4 por radioligando) huA33-TCO (100 µg; 0,7 nmol), seguido 96 h después de 11,1 a 12,95 MBq (0,7 nmol) de [64Cu]­Cu-SarAr-Tz, [64Cu]­Cu-SarAr-PEG5-Tz o
[64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz. Se adquirieron imágenes PET
6, 12 y 24 h después de la administración del radioligando, y se recogieron datos de biodistribución ex vivo inmediatamente después del último
punto temporal de imagen. Las imágenes PET ilustran claramente que el
pre-dirigido in vivo con los tres radioligandos delimita eficazmente el
tejido tumoral con un alto contraste tumor-fondo, incluso en los primeros
puntos temporales (Figura; Figura S9). Los datos de biodistribución
confirman esta observación: las concentraciones de actividad en los tumores
a las 24 h después de la inyección fueron 12,9 ± 2,6%ID/g ([64Cu]­Cu-SarAr-Tz),
10,2 ± 0,7%ID/g ([64Cu]­Cu-SarAr-PEG5-Tz) y
8,7 ± 1,4 ([64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz), y las relaciones de concentración de actividad tumor-músculo en el mismo
punto temporal fueron 27,8 ± 6,6, 23,9 ± 3,1 y 32,6 ±
6,2, respectivamente (Tablas S2-S9).
Si bien los tres radioligandos demostraron ser eficaces, las imágenes PET sugieren
que el pre-dirigido con [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz
produce una menor captación de fondo. Los datos de biodistribución también respaldan esta idea. Las diferencias más notables, como era de esperar, se observan entre el comportamiento de [64Cu]­Cu-SarAr-Tz
y [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz, y [64Cu]­Cu-SarAr-PEG5-Tz generalmente se sitúa en un punto intermedio.
Es importante destacar que, si bien [64Cu]­Cu-SarAr-Tz y [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz producen concentraciones de actividad comparables en el tejido tumoral,
el último produce concentraciones de actividad significativamente menores en la
sangre (1,9 ± 0,3%ID/g), los pulmones (1,6 ± 0,1%ID/g), el hígado (1,3
± 0,1%ID/g), el bazo (1,0 ± 0,1%ID/g), el páncreas (0,4 ±
0,1%ID/g), el estómago (0,2 ± 0,0%ID/g), el intestino delgado (0,3 ±
0,0%ID/g), el intestino grueso (0,3 ± 0,1%ID/g), los riñones (2,1 ±
0,2%ID/g), el músculo (0,3 ± 0,1%ID/g) y el hueso (0,5 ± 0,1%ID/g)
que el primero. Si bien las relaciones de concentración de actividad tumor-órgano sano para [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz no
fueron significativamente superiores a las de [64Cu]­Cu-SarAr-Tz, el
radioligando PEGilado sí produjo una mejor relación de concentración de actividad tumor-tejido para el estómago.

Si bien las diferencias en el rendimiento in vivo
de los radioligandos
no fueron particularmente drásticas, la menor acumulación de [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz en varios órganos, así como sus
relaciones de concentración de actividad tumor-fondo generalmente superiores,
nos llevaron a elegir este radioligando para los experimentos posteriores de PRIT.
Para este fin, primero optimizamos el marcado radioquímico de SarAr-PEG10-Tz
con [67Cu]­CuCl2, lo que finalmente produjo [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz en >99% de conversión radioquímica,
>99% de pureza y una actividad específica de ~15 MBq/g.
Posteriormente,
se inyectaron por vía intravenosa a ratones desnudos atímicos que portaban xenoinjertos de cáncer colorrectal humano SW1222 (n = 4 por grupo) huA33-TCO (100 µg; 0,7 nmol), seguido 96 h después de 11,1-12,9
MBq (0,7 nmol) de [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz, y se recogieron datos de biodistribución 4, 12, 24, 48, 72 y 96 h después de
la administración del radioligando. La concentración de actividad promedio en cada órgano se trazó luego como una función del tiempo y se ajustó a una
función biexponencial para obtener curvas tiempo-actividad que, a su vez,
se utilizaron para calcular la dosis absorbida para cada órgano, así como
su índice terapéutico (Figura). La médula ósea activa, con una dosis máxima tolerada (DMT) de 2-3 Gy[], es
el órgano limitante de la dosis para la mayoría de los estudios de terapia radiofarmacéutica;
nuestros datos de dosimetría sugirieron que la actividad máxima tolerada (AMT)
para nuestro estudio sería de ~63 MBq, dado el coeficiente de dosis absorbida para la médula de 3,2 cGy/MBq.

El estudio de terapia longitudinal empleó siete cohortes
de ratones desnudos atímicos que portaban xenoinjertos subcutáneos de cáncer colorrectal SW1222 (n = 10): una que no recibió ningún tratamiento;
una que recibió solo huA33-TCO (100 µg; 0,7 nmol); una que recibió [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz solo (55 MBq;
0,7 nmol); tres que recibieron huA33-TCO (100 µg; 0,7 nmol)
y luego, 96 h después, diferentes dosis de [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz (18,5, 37,0, 55,5 MBq; todas 0,7 nmol); y una que recibió
[67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-huA33 (18,5 MBq; 100 µg;
0,7 nmol). Es importante destacar que solo se utilizó una dosis de RIT de 18,5 MBq
porque la literatura sugiere que dosis más altas (es decir, 37,0
o 55,5 MBq) podrían causar toxicidad por radiación debido a las mayores tasas de dosis de radiación del anticuerpo marcado directamente. A lo largo del estudio,
se midieron los volúmenes tumorales y el peso corporal cada 3 días, y se recogió sangre cada 7 días a través del seno retro-orbital para análisis hematotoxicológicos.

El estudio reveló claramente que el pre-dirigido con
huA33-TCO y
[67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz exhibe un efecto terapéutico dependiente de la dosis (Figura). Si bien los tumores de los ratones de las cohortes de control experimentaron
un crecimiento descontrolado, los de las tres cohortes de huA33-TCO/[67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz demostraron un crecimiento inhibido, y el efecto
fue más evidente y dramático en la cohorte que recibió la dosis más alta del radioligando (es decir, 55 MBq). Esta tendencia se confirma en
los datos de supervivencia. Los valores de supervivencia general mediana para
las cohortes de control fueron de 19 días (solo solución salina), 19 días (solo huA33-TCO) y
24 días (55 MBq de radioligando), mientras que para las cohortes de pre-dirigido fueron de 24 días (18,5 MBq de radioligando), 31 días (37 MBq) y 38 días (55 MBq). Curiosamente, ninguna de las cohortes de pre-dirigido exhibió
una respuesta tan significativa como la cohorte que recibió 18,5 MBq
de [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-huA33 marcado directamente. Esto es algo sorprendente a la luz de nuestro trabajo anterior
sobre 67Cu-PRIT, en el que la supervivencia general mediana de la
cohorte de PRIT de dosis más alta (55 MBq) coincidió con la de la cohorte de RIT (18,5
MBq). Sin embargo, el estudio mencionado utilizó (i) un tiempo de intervalo más corto (es decir, 72 h frente a 96 h aquí) y (ii) un radioligando (es decir, [67Cu]­Cu-MeCoSar-Tz) sin cadena PEG y una estructura que
era similar pero fundamentalmente diferente en varios aspectos. Esto dificulta las comparaciones entre esta investigación y estos datos recopilados anteriormente; sin embargo, la diferencia anterior es probablemente
responsable de este fenómeno, ya que las 24 horas adicionales de intervalo de pre-dirigido pueden proporcionar más tiempo para que el TCO se isomerice a cis-cicloocteno no reactivo o para que el inmunoconjugado se vuelva inaccesible
para las ligaciones in vivo (es decir, mediante una penetración más profunda del xenoinjerto
o la salida del tejido tumoral). Finalmente, todos los regímenes terapéuticos probados parecieron ser seguros: no se observaron disminuciones significativas en el peso de los ratones, y todos los parámetros hematotoxicológicos se mantuvieron en o cerca de los niveles fisiológicos normales durante el experimento.
Se observaron caídas tempranas en los glóbulos blancos y las plaquetas, especialmente en
las cohortes de PRIT y RIT de dosis más alta, pero estos valores se recuperaron
a los niveles previos a la terapia al final del experimento.

Conclusiones

En esta investigación, sintetizamos, caracterizamos
y validamos con éxito un trío de ligandos marcados con radiocobre para radioterapeutica pre-dirigida: [64/67Cu]­Cu-SarAr-Tz, [64/67Cu]­Cu-SarAr-PEG5-Tz y [64/67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz. La adición de las cadenas de oligoetilenglicol alteró
tanto las propiedades fisicoquímicas como el comportamiento in vivo de los radioligandos, aunque no de manera drástica. En efecto, los experimentos de PET y biodistribución pre-dirigidos con huA33-TCO en un modelo murino de cáncer colorrectal
revelaron que [64Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz produjo
una captación tumoral comparable, pero mayores relaciones de concentración de actividad tumor-fondo para la mayoría de los tejidos en comparación con [64Cu]­Cu-SarAr-Tz.
Estos índices tumor-órgano sano superiores nos llevaron a investigar
la dosimetría, la seguridad y la eficacia de la radioinmunoterapia pre-dirigida
utilizando una variante marcada con 67Cu del radioligando que contiene PEG10. En última instancia, encontramos que el PRIT con [67Cu]­Cu-SarAr-PEG10-Tz exhibió un perfil de seguridad favorable y produjo un efecto terapéutico dependiente de la dosis.