Los extractos fenólicos pigmentados del sorgo regulan la expresión de los genes de las vías de desarrollo del cáncer en las células HT-29 y CCD 841 CoN inducidas por hipoxia.

El cáncer es una enfermedad heterogénea caracterizada por múltiples formas que pueden afectar al esófago, estómago, colon y otros órganos gastrointestinales, principalmente debido a hábitos alimenticios deficientes (Kerschbauma y Nüssler ^[2019]). El creciente conocimiento de los posibles beneficios para la salud del consumo de cereales integrales ha impulsado investigaciones sobre las propiedades preventivas del sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) contra el cáncer (Collins, Santhakumar, Francis, et al. ^[2024]; Tullio et al. ^[2020]; Xie et al. ^[2019]; Zhu y Sang ^[2017]). El sorgo integral es una fuente abundante y reconocida de compuestos fenólicos, como las antocianinas y las proantocianidinas, que se encuentran principalmente en las variedades pigmentadas (Brantsen et al. ^[2021]; Herrman et al. ^[2020]). Se ha informado que estos compuestos poseen bioactividad, son capaces de eliminar los radicales libres y han demostrado propiedades antiproliferativas y antioxidantes que contribuyen a la modulación de las vías de desarrollo del cáncer (Lee et al. ^[2020]; Chen et al. ^[2021]).

La mutación y la inestabilidad del genoma son una de las diez vías de desarrollo del cáncer que implican cambios en el genoma de una célula, afectando su crecimiento y progresión (Hanahan ^[2022]). A menudo, se asocia con la apoptosis (muerte celular programada), y varios cambios morfológicos pueden conducir a la malignidad de la enfermedad, incluyendo la reducción del tamaño de la célula, las alteraciones de la membrana celular y la fragmentación del ADN (Waarts et al. ^[2022]; Lachance et al. ^[2020]). La apoptosis puede desencadenarse a través de las vías extrínsecas (mediadas por receptores de muerte) o intrínsecas (mediadas por mitocondrias), y se ve significativamente influenciada por el gen supresor de tumores APC, que es crucial en la regulación de la vía de señalización WNT (Wingless/Integrated) (Zhou et al. ^[2022]; Stefanski y Prosperi ^[2020]). Las células cancerosas a menudo evitan la apoptosis suprimiendo el APC y reduciendo la expresión de proteínas proapoptóticas como KRAS y TTN, que están involucradas en las vías de señalización dentro de la célula (Wang et al. ^[2021]). Los estudios han informado sobre el potencial quimioprevención de los extractos fenólicos del sorgo (Stefoska Needham ^[2024]; Gilchrist et al. ^[2020]; Rao et al. ^[2019]); sin embargo, sus posibles efectos sobre el APC, KRAS, TTN y los mecanismos de acción no se han dilucidado.

La remodelación metabólica, también conocida como metabolismo celular desregulado, permite que las células cancerosas se dividan rápidamente al anular los controles metabólicos típicos de los tejidos normales (Schirrmacher ^[2020]). Crucial para esta adaptación es la regulación al alza de los transportadores de glucosa, en particular GLUT 1, lo que permite un mayor aporte de glucosa al citoplasma para satisfacer la mayor demanda metabólica (Schirrmacher ^[2020]). El cambio metabólico de la respiración aeróbica a la glucólisis anaeróbica está coordinado por los oncogenes HIF 1, HIF 1α y HIF 1β (Figura 1) (Raskov et al. ^[2023]). Estos genes pueden reprogramar el metabolismo de las células cancerosas para mejorar la supervivencia en entornos hipóxicos. Hasta donde sabemos, no existen estudios que investiguen el efecto de los extractos fenólicos del sorgo sobre HIF 1α, HIF 1β y GLUT 1, que están involucrados en estas vías. Por lo tanto, comprender la interacción entre la nutrición, la glucólisis y los posibles cambios en el metabolismo celular por los compuestos fenólicos del sorgo es fundamental.

Este estudio tiene como objetivo explorar los genes proapoptóticos y los mecanismos de los extractos fenólicos del sorgo integral pigmentado que inducen la muerte celular programada y regulan el metabolismo celular en las células de cáncer colorrectal y en las células normales del colon inducidas por la hipoxia. Además, este estudio tiene como objetivo determinar el impacto de los extractos fenólicos del sorgo procesado en las vías de desarrollo del cáncer mencionadas anteriormente. Estos hallazgos podrían contribuir a la comprensión en evolución del sorgo como un nutracéutico con posibles implicaciones para la reducción del riesgo de cáncer.

Materiales y Métodos

Recolección de muestras de sorgo

Se obtuvieron muestras de sorgo integral blanco (WhiteLi1 y WhiteLi2), rojo (RedBa1, RedBu1, RedBa2, RedBu2) y negro (BlackSb y BlackSs) como se describió previamente (Collins, Francis, Chinkwo, et al. ^[2024]). Brevemente, las muestras negras se obtuvieron de los ensayos de invernadero de 2021 realizados en Warwick, Queensland. Las muestras de sorgo rojo y blanco se adquirieron de los ensayos de campo de 2021 realizados en Bellata y Croppa Creek en Nueva Gales del Sur. Antes de la experimentación, las muestras de sorgo integral se almacenaron a 4 °C. Cada muestra se analizó por triplicado en cada experimento.

Procesamiento y preparación de extractos de sorgo

Utilizando un molino centrífugo Retsch Ultra ZM 200 (Haan, Renania del Norte-Westfalia, Alemania) con un tamiz de 0,5 mm, el sorgo integral se molió finamente para obtener la harina de sorgo resultante. Se añadió hexano a las muestras de harina (1:20 p/v) tres veces y luego se evaporó en una campana extractora durante 24 horas para obtener muestras de harina desgrasada. Antes del procesamiento, las muestras de harina de sorgo desgrasada se almacenaron a 4 °C. La cocción por fermentación de las muestras de harina de sorgo se realizó según Collins, Francis, Chinkwo, et al. (^[2024]). Brevemente, la harina de sorgo y el agua desionizada se mezclaron en una proporción de 1:2 y se dejaron fermentar a 25 °C hasta que se alcanzó un pH de 4 (aproximadamente 48 horas). Esta mezcla se añadió a 80 mL de agua hirviendo y se agitó durante 10 minutos y luego se transfirió a un baño de agua para detener el proceso de cocción. Las muestras de gachas de sorgo fermentadas y cocidas se congelaron a -80 °C y luego se liofilizaron (liofilizador Christ Alpha 2–4 LD Plus; Biotech International, Alemania) y se molió para obtener la harina fermentada y cocida (procesada). La preparación de las muestras se completó por triplicado.

El procedimiento de extracción fenólica se realizó según estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación (Rao et al. ^[2018]). El disolvente de extracción consistió en un 70% de acetona, un 29,5% de agua y un 0,5% de ácido acético (v/v/v). Esta mezcla se añadió a la harina cruda o procesada desgrasada en una proporción de 1:10 (p/v) y se dejó agitar a 25 °C durante 1 hora. Las mezclas se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos; la extracción se repitió dos veces más y los sobrenadantes se juntaron. Este paso se repitió tres veces para obtener un volumen total de 30 mL por gramo de muestra. Se utilizó un evaporador rotatorio al vacío (Rotavapor R 210 BUCHI Labortechnik, Flawil, Suiza) para eliminar la acetona a 50 °C. El líquido restante en las muestras se congeló luego a -80 °C y se liofilizó (liofilizador Christ Alpha 2–4 LD Plus; Biotech International, Alemania). Los extractos fenólicos resultantes se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis. Se utilizó una solución de 50% de metanol para reconstituir los extractos de sorgo antes del análisis y luego se almacenaron a -20 °C. Todas las muestras se extrajeron por triplicado.

Reactivos y productos químicos

Los materiales de cultivo celular incluyeron dimetilsulfóxido (DMSO), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio mínimo esencial de Eagle (EMEM), suero fetal bovino (SFB), penicilina-estreptomicina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), tripsina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y tinte rojo de resazurina, que se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MI, EE. UU.). Las células de cáncer colorrectal HT 29 y las células normales de colon CCD 841 CoN se obtuvieron del distribuidor ATCC, In Vitro Technologies Pty Ltd. (Victoria, Australia). Las placas de cultivo celular de 24 pocillos y 96 pocillos se compraron a Corning Incorporated (Corning, Nueva York, EE. UU.). Las placas de PCR de pocillos profundos de 96 pocillos (HSP9601) y la película adhesiva para placas (MSB1001) se compraron a Bio Rad (Bio Rad Laboratories, California, EE. UU.). El cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2•6H2O), el reactivo de Folin-Ciocalteu, el ácido fórmico, ABTS, el trolox, el ácido acético, la acetona y el metanol se adquirieron de Chem Supply Pty Ltd. (Port Adelaide, Australia del Sur, Australia) y Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los kits de ensayo utilizados para medir la expresión génica se compraron a Bio Rad (Bio Rad Laboratories, California, EE. UU.), incluyendo un kit de extracción de ARN total Aurum, un kit de síntesis de cDNA iScript y un kit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix. Los cebadores SYBR Green de PrimePCR de los genes humanos APC, KRAS, TTN, HIF 1α, HIF 1β (ARNT), GLUT 1 (SLC2A1) y el gen de referencia, β-actina, también se compraron a Bio Rad. Para medir la concentración de proteínas, se compraron los kits ELISA de APC y TTN humanos al distribuidor antibodies.com, Sapphire Biosciences (Beaconsfield, NSW, Australia).

Tratamiento de cultivos celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HT 29 se cultivaron y se mantuvieron como monocapa en un 89% (v/v) de DMEM, un 10% (v/v) de SFB y un 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina. La línea celular normal del colon CCD 841 CoN se cultivó en EMEM suplementado con SFB y penicilina-estreptomicina en la misma proporción de volumen. Para un crecimiento óptimo, las células normales del colon se utilizaron entre los pasajes 5 y 9, y los experimentos se realizaron con una confluencia del 70-80%. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C en una atmósfera de CO2 humidificada del 5%. Estas condiciones se mantuvieron cuando se utilizaron los ensayos, a menos que se indicara lo contrario.

Ensayo de citotoxicidad con tinte rojo de resazurina

Para probar la citotoxicidad de los extractos de sorgo, se realizó un ensayo de citotoxicidad de respuesta en el tiempo y la dosis según Rao et al. (^[2019]). Los extractos se diluyeron con medio de cultivo celular (DMEM suplementado con un 10% de SFB y un 1% de penicilina-estreptomicina) a concentraciones de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 y 2000 μg/mL antes de la prueba. Las células de cáncer de colon HT 29 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 5 × 103 células por pocillo. Las células se lavaron con PBS después de 24 horas de incubación y luego se incubaron con las diferentes preparaciones de extracto. Se preparó una placa separada (extractos sin células) para compensar el color del extracto y se utilizó para corregir los datos. También se incluyó un control positivo de 10 mM de peróxido de hidrógeno, un control negativo de medio fresco y un control de DMSO del 2% (la concentración máxima en los extractos reconstituidos). La citotoxicidad de los extractos de sorgo también se probó en las células normales del colon CCD 841 CoN. Después de los tratamientos de 4, 6, 12 y 24 horas, se retiraron los extractos, se lavaron los pocillos con PBS y se añadió 200 μL de tinte rojo de resazurina de 14 mg/L a cada pocillo para una incubación adicional de 4 horas. La absorbancia se midió a 570 y 600 nm y se calculó como porcentaje de viabilidad según Ataollahi et al. (^[2015]). Los experimentos y las condiciones de tratamiento se realizaron por triplicado.

Diseño experimental e inducción de hipoxia

Para determinar el impacto de los extractos de sorgo en los genes metabólicos, se determinó la expresión génica de HIF 1α, HIF 1β y GLUT 1 utilizando rtPCR. Brevemente, las condiciones hipóxicas se indujeron mediante cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2•6H2O) en las células normales del colon CCD 841 CoN, como se describió en Wu y Yotnda (^[2011]). Se preparó una solución de stock de 25 mM de CoCl2 para obtener una concentración final de 100 μM en el medio EMEM. También se preparó un control negativo de normoxia (células sin CoCl2) y un control positivo de hipoxia (células inducidas por hipoxia sin extractos). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 105 y se incubaron durante 24 horas a 37 °C y 5% de CO2. La solución de trabajo de CoCl2 se añadió a las células normales del colon durante 24 horas después de alcanzar una confluencia del 90% y luego se suplementó con extractos de sorgo a varios niveles de tratamiento, como se describe en la Sección 2.5. Después de la incubación, se retiraron los extractos, se lavaron las células con PBS y luego se lisaron para el posterior análisis de rtPCR.

Extracción de ARN y cDNA

Se extrajo el ARN total utilizando un kit de extracción de ARN total Bio Rad Aurum, según las instrucciones del fabricante. Se añadió un volumen de 2 µL de muestra de ARN a un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.) para evaluar la pureza del ARN. Se utilizó un kit de síntesis de cDNA iScript con un sistema CFX96 Real Time (Bio Rad, CA, EE. UU.) para sintetizar el cDNA, según las especificaciones del fabricante. La reacción se realizó en placas de PCR de 96 pocillos Hard Shell y consistió en 4 µL de mezcla de reacción 5× iScript, 1 µL de transcriptasa inversa iScript (RT), 10 µL de agua libre de nucleasas y 5 µL de plantilla de ARN (20 µL de volumen total por pocillo). El protocolo de reacción térmica consistió en una etapa de activación a 25 °C durante 5 min, RT a 46 °C durante 20 min, inactivación de RT a 95 °C durante 1 min y, a continuación, se mantuvo a 4 °C. La reacción se almacenó a -20 °C antes del análisis de rtPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rtPCR)

Se realizó la PCR en tiempo real utilizando un SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix en un sistema CFX96 Real Time. Los cebadores enumerados en la Sección 2.3 se diluyeron en 1:10 (v/v) en tampón Tris EDTA (TE). La reacción se realizó en placas de PCR de 96 pocillos Hard Shell e incluyó 10 µL de SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 2 µL de cebador, 2 µL de plantilla de cDNA (diluida en 1:20 v/v en tampón TE) y 6 µL de agua libre de nucleasas (20 µL de volumen total por pocillo). El protocolo de reacción térmica consistió en una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 3 min seguida de una etapa de amplificación a 95 °C durante 15 s y una etapa de hibridación a 60 °C durante 30 s durante 40 ciclos. Se realizó un análisis de curva de fusión desde 65 °C hasta 95 °C. Cada gen se normalizó con el gen de referencia, β-actina, para determinar su abundancia relativa. Los valores del umbral de ciclo/ciclo de cuantificación (Ct/Cq) obtenidos para cada gen objetivo se normalizaron al gen de referencia para obtener la expresión génica relativa media.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Para cuantificar la concentración de proteína intracelular, se utilizaron kits de ELISA para APC y TTN humanos (antibodies.com, Cambridge, Reino Unido) debido a sus niveles de expresión génica en rtPCR. Brevemente, se sembraron células de cáncer de colon HT 29 en placas de 24 pocillos y luego se trataron con sorgo BlackSs, BlackSb y RedBu2, tanto crudos como procesados, durante 12 y 24 h a las concentraciones de 500 y 2000 µg/mL debido a sus efectos citotóxicos, según lo determinado por el ensayo de citotoxicidad con resazurina en la Sección 2.5. Después del tratamiento, se retiraron los extractos, se lavaron las células con PBS y se lisaron con tampón de lisis. Los lisados celulares se añadieron a microplacas de 96 pocillos pre recubiertas con anticuerpos contra APC o TTN y, posteriormente, se incubaron a 37 °C durante 2 h según las instrucciones del fabricante. Después de añadir el anticuerpo de detección, la estreptavidina HRP y el tampón de lavado de placas PBS varias veces, se detuvo la reacción mediante la adición de una solución de parada y se utilizó un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nm. Se preparó una curva estándar añadiendo siete diluciones a cada placa de anticuerpos para determinar la concentración de proteína.

Análisis de datos

Los datos se representan como media ± DE. Todos los datos se analizaron con el software GraphPad Prism (versión 10) utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía ordinaria, seguido de una prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey y, a continuación, un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías y una prueba de Fisher LSD no corregida. Las diferencias en los valores se establecieron en p < 0,05 para la significación estadística.

Recolección de muestras de sorgo

Se obtuvieron muestras de sorgo de grano entero blanco (WhiteLi1 y WhiteLi2), rojo (RedBa1, RedBu1, RedBa2, RedBu2) y negro (BlackSb y BlackSs), como se describió anteriormente (Collins, Francis, Chinkwo, et al. ^[2024]). Brevemente, las muestras negras se obtuvieron de los ensayos de invernadero de 2021 realizados en Warwick, Queensland. Las muestras de sorgo rojo y blanco se obtuvieron de los ensayos de campo de 2021 realizados en Bellata y Croppa Creek en Nueva Gales del Sur. Antes de la experimentación, las muestras de grano entero se almacenaron a 4 °C. Cada muestra se analizó por triplicado en cada experimento.

Procesamiento y preparación de extractos de sorgo

Utilizando un molino centrífugo Retsch Ultra ZM 200 (Haan, Renania del Norte-Westfalia, Alemania) con un tamiz de 0,5 mm, se molió finamente el grano entero para obtener la harina de sorgo resultante. Se añadió hexano a las muestras de harina (1:20 p/v) tres veces y luego se evaporó en una campana extractora durante 24 h para obtener muestras de harina desgrasada. Antes del procesamiento, las muestras de harina de sorgo desgrasada se almacenaron a 4 °C. El cocinado por fermentación de las muestras de harina de sorgo se realizó según Collins, Francis, Chinkwo, et al. (^[2024]). Brevemente, se mezclaron harina de sorgo y agua desionizada en una proporción de 1:2 y se dejaron fermentar a 25 °C hasta que se alcanzó un pH de 4 (aproximadamente 48 h). Esta mezcla se añadió a 80 mL de agua hirviendo y se agitó durante 10 min y luego se transfirió a un baño de agua para detener el proceso de cocción. Las muestras de gachas de sorgo fermentadas y cocidas se congelaron a -80 °C y luego se liofilizaron (liofilizador Christ Alpha 2-4 LD Plus; Biotech International, Alemania) y se molió para obtener la harina fermentada y cocida (procesada). La preparación de las muestras se completó por triplicado.

El procedimiento de extracción de fenoles se realizó según estudios previos realizados por nuestro grupo de investigación (Rao et al. ^[2018]). El disolvente de extracción consistió en un 70 % de acetona, un 29,5 % de agua y un 0,5 % de ácido acético (v/v/v). Esta mezcla se añadió a la harina cruda o procesada desgrasada en una proporción de 1:10 (p/v) y se dejó agitar a 25 °C durante 1 h. Las mezclas se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min; la extracción se repitió dos veces más y los sobrenadantes se juntaron. Este paso se repitió tres veces para obtener un volumen total de 30 mL por gramo de muestra. Se utilizó un evaporador rotatorio al vacío (Rotavapor R 210 BUCHI Labortechnik, Flawil, Suiza) para eliminar la acetona a 50 °C. El líquido restante en las muestras se congeló a -80 °C y luego se liofilizó (liofilizador Christ Alpha 2-4 LD Plus; Biotech International, Alemania). Los extractos fenólicos resultantes se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis. Se utilizó una solución de 50 % de metanol para reconstituir los extractos de sorgo antes del análisis y luego se almacenaron a -20 °C. Todas las muestras se extrajeron por triplicado.

Reactivos y productos químicos

Los materiales de cultivo celular incluyeron dimetilsulfóxido (DMSO), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio mínimo esencial de Eagle (EMEM), suero fetal bovino (SFB), penicilina-estreptomicina, tampón fosfato salino (PBS), tripsina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y el colorante resazurina, que se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MI, EE. UU.). Las células de cáncer colorrectal HT 29 y las células normales de colon CCD 841 CoN se obtuvieron del distribuidor ATCC, In Vitro Technologies Pty Ltd. (Victoria, Australia). Las placas de cultivo celular de 24 y 96 pocillos se compraron a Corning Incorporated (Corning, Nueva York, EE. UU.). Las placas de PCR de 96 pocillos Hard Shell (HSP9601) y la película adhesiva para placas (MSB1001) se compraron a Bio Rad (Bio Rad Laboratories, California, EE. UU.). Se adquirieron cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2•6H2O), reactivo de Folin-Ciocalteu, ácido fórmico, ABTS, trolox, ácido acético, acetona y metanol de Chem Supply Pty Ltd. (Port Adelaide, Australia del Sur, Australia) y Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los kits de ensayo utilizados para medir la expresión génica se compraron a Bio Rad (Bio Rad Laboratories, California, EE. UU.), incluidos un kit de extracción de ARN total Aurum, un kit de síntesis de cDNA iScript y un kit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix. Los cebadores SYBR Green PrimePCR de APC, KRAS, TTN, HIF 1, HIF 1α (ARNT), GLUT 1 (SLC2A1) y el gen de referencia, β-actina, también se compraron a Bio Rad. Para medir la concentración de proteína, se compraron kits de ELISA para APC y TTN humanos al distribuidor Sapphire Biosciences (Beaconsfield, NSW, Australia) de antibodies.com.

Tratamiento de cultivos celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal HT 29 se cultivaron y se mantuvieron como monocapa en un 89 % (v/v) de DMEM, un 10 % (v/v) de SFB y un 1 % (v/v) de penicilina-estreptomicina. La línea celular normal de colon CCD 841 CoN se cultivó en EMEM suplementado con SFB y penicilina-estreptomicina en la misma proporción de volumen. Para un crecimiento óptimo, las células normales de colon se utilizaron entre los pasajes 5 y 9, y los experimentos se realizaron con una confluencia del 70-80 %. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C en una atmósfera humidificada con un nivel de CO2 del 5 %. Estas condiciones se mantuvieron cuando se utilizaron los ensayos, a menos que se indicara lo contrario.

Ensayo de citotoxicidad con resazurina

Para probar la citotoxicidad de los extractos de sorgo, se realizó un ensayo de citotoxicidad de respuesta de tiempo y dosis según Rao et al. (^[2019]). Los extractos se diluyeron con medio de cultivo celular (DMEM suplementado con un 10 % de SFB y un 1 % de penicilina-estreptomicina) a concentraciones de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 y 2000 µg/mL antes de la prueba. Se sembraron células de cáncer de colon HT 29 en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 5 × 103 células por pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se lavaron con PBS y luego se incubaron con los diferentes preparados de extracto. Se preparó una placa separada (extractos sin células) para compensar el color del extracto y se utilizó para corregir los datos. También se incluyó un control positivo de 10 mM de peróxido de hidrógeno, un control negativo de medio fresco y un control del 2 % de DMSO (la concentración máxima en los extractos reconstituidos). La citotoxicidad de los extractos de sorgo también se probó en las células normales de colon CCD 841 CoN. Después de los tratamientos de 4, 6, 12 y 24 h, se retiraron los extractos, se lavaron los pocillos con PBS y se añadió 200 µL de colorante resazurina al 14 mg/L a cada pocillo para una incubación adicional de 4 h. La absorbancia se midió a 570 y 600 nm y se calculó como porcentaje de viabilidad según Ataollahi et al. (^[2015]). Los experimentos y las condiciones de tratamiento se realizaron por triplicado.

Diseño experimental e inducción de hipoxia

Para determinar el impacto de los extractos de sorgo en los genes metabólicos, se determinó la expresión génica de HIF 1α, HIF 1β y GLUT 1 utilizando rtPCR. Brevemente, se indujeron condiciones hipóxicas mediante cloruro de cobalto (II) hexahidratado (CoCl2•6H2O) en las células normales de colon CCD 841 CoN, como se describió en Wu y Yotnda (^[2011]). Se preparó una solución de CoCl2 de 25 mM para obtener una concentración final de 100 µM en el medio EMEM. También se preparó un control negativo de normoxia (células sin CoCl2) y un control positivo de hipoxia (células inducidas a la hipoxia sin extractos). Se sembraron células en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 105 y se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO2. La solución de trabajo de CoCl2 se añadió a las células normales de colon durante 24 h después de alcanzar una confluencia del 90 % y luego se suplementó con extractos de sorgo a varios niveles de tratamiento, como se describe en la Sección 2.5. Después de la incubación, se retiraron los extractos, se lavaron las células con PBS y luego se lisaron para el posterior análisis de rtPCR.

Extracción de ARN y cDNA

Se extrajo el ARN total utilizando un kit de extracción de ARN total Bio Rad Aurum, según las instrucciones del fabricante. Se añadió un volumen de 2 µL de muestra de ARN a un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.) para evaluar la pureza del ARN. Se utilizó un kit de síntesis de cDNA iScript con un sistema CFX96 Real Time (Bio Rad, CA, EE. UU.) para sintetizar el cDNA, según las especificaciones del fabricante. La reacción se realizó en placas de PCR de 96 pocillos Hard Shell y consistió en 4 µL de mezcla de reacción 5× iScript, 1 µL de transcriptasa inversa iScript (RT), 10 µL de agua libre de nucleasas y 5 µL de plantilla de ARN (20 µL de volumen total por pocillo). El protocolo de reacción térmica consistió en una etapa de activación a 25 °C durante 5 min, RT a 46 °C durante 20 min, inactivación de RT a 95 °C durante 1 min y, a continuación, se mantuvo a 4 °C. La reacción se almacenó a -20 °C antes del análisis de rtPCR.

Ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rtPCR)

Se realizó una PCR en tiempo real utilizando un SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix en un sistema CFX96 Real Time. Los cebadores enumerados en la Sección 2.3 se diluyeron en un tampón Tris EDTA (TE) 1:10 (v/v). La reacción se llevó a cabo en placas de PCR de 96 pocillos Hard Shell e incluyó 10 µL de SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 2 µL de cebador, 2 µL de plantilla de ADNc (diluida en un tampón TE 1:20 v/v) y 6 µL de agua libre de nucleasas (volumen total de 20 µL por pocillo). El protocolo de reacción térmica consistió en una desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, seguida de una amplificación a 95 °C durante 15 segundos y un hibridamiento a 60 °C durante 30 segundos durante 40 ciclos. Se realizó un análisis de la curva de fusión desde 65 °C hasta 95 °C. Cada gen se normalizó con el gen de referencia, β-actina, para determinar su abundancia relativa. Los valores del umbral de ciclo/ciclo de cuantificación (Ct/Cq) obtenidos para cada gen objetivo se normalizaron al gen de referencia para obtener la expresión génica relativa media.

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Para cuantificar la concentración de proteína intracelular, se utilizaron kits de ELISA para APC y TTN humanos (antibodies.com, Cambridge, Reino Unido) debido a sus niveles de expresión génica en rtPCR. Brevemente, las células de cáncer de colon HT 29 se sembraron en placas de 24 pocillos y luego se trataron con sorgo BlackSs, BlackSb y RedBu2 crudos y procesados durante 12 y 24 horas a las concentraciones de 500 y 2000 µg/mL debido a sus efectos citotóxicos, según se determinó en el ensayo de citotoxicidad con resazurina roja en la Sección 2.5. Después del tratamiento, se retiraron los extractos, las células se lavaron con PBS y se lisaron con un tampón de lisis. Los lisados celulares se añadieron a microplacas de 96 pocillos pre-recubiertas con anticuerpos contra APC o TTN y, posteriormente, se incubaron a 37 °C durante 2 horas según las instrucciones del fabricante. Después de añadir el anticuerpo de detección, la estreptavidina-HRP y el lavado de la placa con PBS varias veces, la reacción se detuvo mediante la adición de una solución de parada y se utilizó un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nm. Se preparó una curva estándar añadiendo siete diluciones a cada placa de anticuerpos para determinar la concentración de proteína.

Análisis de datos

Los datos se representan como media ± DE. Todos los datos se analizaron con el software GraphPad Prism (versión 10) utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía ordinario, seguido de una prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey y un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías y una prueba LSD de Fisher no corregida. Las diferencias en los valores se establecieron en p < 0,05 para la significación estadística.

Resultados

Ensayo de citotoxicidad

El ensayo de resazurina roja se utilizó para determinar el impacto de ocho extractos de sorgo en las células de cáncer de colon HT 29. Las células se incubaron durante 4, 6, 12 y 24 horas con concentraciones de extractos fenólicos derivados del sorgo de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µg/mL. La disminución significativa (p < 0,05) en la viabilidad de las células cancerosas que comienza a 500 µg/mL después de 12 y 24 horas se muestra en la Figura 2A, B, D. Las variedades de sorgo blanco y rojo crudos no mostraron una disminución en la viabilidad de las células cancerosas. Sin embargo, la variedad de sorgo de pericarpio rojo RedBu2 exhibió una reducción significativa en la viabilidad celular a las 24 horas cuando la muestra se procesó mediante cocción por fermentación. Las variedades de sorgo negro BlackSs y BlackSb mostraron una regresión en el crecimiento celular inicialmente a 500 µg/mL para las muestras crudas, mientras que las muestras procesadas de las mismas variedades demostraron inhibición del crecimiento celular a 2000 µg/mL. Basándose en los efectos citotóxicos de los extractos de sorgo rojo y negro para reducir la viabilidad celular en un 50% (IC50), las condiciones de tratamiento de 500 y 2000 µg/mL a las 12 y 24 horas se seleccionaron para experimentos posteriores. No se observó citotoxicidad para la línea celular de colon normal CCD 841 CoN en las condiciones de tratamiento descritas (datos no mostrados).

Impacto de los extractos de sorgo crudos y procesados en la expresión de los genes de la vía de desarrollo del cáncer de mutación e inestabilidad del genoma

Se utilizó una PCR cuantitativa en tiempo real (rtPCR) para dilucidar el impacto de BlackSs y BlackSb crudos en la expresión génica de APC, KRAS y TTN en las células de cáncer de colon HT 29 (Figura 3). Los resultados mostraron un aumento significativo (p < 0,05) en la expresión génica con variaciones en la magnitud entre los grupos de tratamiento. El tratamiento con 500 µg/mL de BlackSs a las 12 horas resultó en una regulación al alza del 80% del gen APC (Figura 3A), con un aumento adicional de dos veces a las 24 horas, de 2,75 ± 0,74 a 6,07 ± 1,31 (p < 0,05, d de Cohen = 1,03, IC del 95% [1,17, 5,47]), lo que indica un gran tamaño del efecto. Se observó una regulación al alza significativa de ocho veces para el gen KRAS (Figura 3B) a la concentración más alta de 2000 µg/mL después de 24 horas, lo que sugiere que los extractos de sorgo negro afectan el crecimiento de las células cancerosas de forma dependiente del tiempo, mientras que las otras condiciones de tratamiento no dieron como resultado cambios significativos. Los niveles de expresión génica de TTN (Figura 3C) aumentaron significativamente (p < 0,05) después del tratamiento a 2000 µg/mL, de 1,40 ± 0,34 a 6,26 ± 0,76, con un ligero aumento a 6,77 ± 1,11, lo que indica que la regulación al alza puede ocurrir de forma dependiente de la dosis. La suplementación con 500 µg/mL de BlackSb también resultó en la regulación al alza del gen APC a las 12 horas en dos veces (Figura 3D); sin embargo, no hubo cambios significativos en la expresión génica a las 24 horas. Cabe destacar que BlackSb también reguló al alza los genes KRAS y TTN; sin embargo, estos se encontraron a un nivel de expresión más bajo cuando las células cancerosas se trataron con 2000 µg/mL durante 24 horas (Figura 3E) o 12 horas (Figura 3F).

Dado que los hallazgos del estudio también indicaron una reducción en la viabilidad de las células cancerosas después del tratamiento con extractos de BlackSs, BlackSb y RedBu2 crudos y procesados a las 24 horas, este estudio investigó más a fondo la expresión génica de APC, KRAS y TTN utilizando rtPCR (Figura 3). La suplementación con BlackSs procesado a 500 µg/mL reguló al alza significativamente (p < 0,05) la expresión del gen APC en dos veces (1,45 ± 0,81–3,53 ± 0,95) en comparación con el control (Figura 3A). Cabe destacar que el gen KRAS se reguló al alza significativamente a 500 µg/mL, de 1,07 ± 0,44 a 2,29 ± 0,84, estabilizándose a la concentración más alta sin cambios adicionales (2,33 ± 0,51). El tratamiento con BlackSs procesado no cambió la expresión de TTN a 500 o 2000 µg/mL. BlackSb reveló niveles de expresión génica similares para APC y TTN, aunque el gen KRAS mostró un aumento dependiente de la dosis en un 162% y luego un aumento adicional del 58% (Figura 3B). Curiosamente, el sorgo rojo procesado, RedBu2, fue la única muestra investigada que mostró un aumento en la expresión del gen TTN (Figura 3C). No se detectaron cambios en la expresión génica de APC o KRAS para esta muestra.

Efecto de los extractos de sorgo crudos y procesados en la expresión de los genes de la vía de desarrollo del cáncer de metabolismo celular inducido por hipoxia

Se indujo hipoxia en las células de colon normal CCD 841 CoN para determinar el efecto de los extractos de sorgo en los oncogenes HIF 1 y los genes de los transportadores de glucosa en comparación con la normoxia (Figura 4). El tratamiento de las células con BlackSs a 2000 µg/mL durante 12 horas resultó en una regulación a la baja significativa del gen HIF 1α de vuelta a los niveles de normoxia (p < 0,05, d de Cohen = 2,32, IC del 95% [0,37, 3,25]; Figura 4A), lo que indica un tamaño del efecto muy grande. Se observó el mismo nivel de expresión génica para HIF 1α a 500 µg/mL durante 24 horas con una disminución adicional de tres veces a la concentración más alta, lo que demuestra una actividad dependiente de la dosis y del tiempo. El tratamiento de las células de colon inducidas a la hipoxia con 2000 µg/mL de BlackSs mostró una disminución de tres veces en HIF 1α, pero no en ninguno de los otros tratamientos (Figura 4B). Curiosamente, GLUT 1 exhibió la mayor diferencia en los niveles de expresión, lo que demostró una disminución significativa en la expresión en comparación con los niveles de hipoxia en todas las condiciones de tratamiento (Figura 4C). Los niveles de expresión génica de HIF 1α en BlackSs fueron comparables a los observados en BlackSb, donde se produjo una disminución a la normoxia (Figura 4D). Se detectó una regulación al alza significativa para HIF 1α después de la suplementación con BlackSb a 500 µg/mL durante 12 horas, sin cambios significativos en las otras condiciones de tratamiento (Figura 4E). De manera similar a BlackSs, el gen GLUT 1 disminuyó en los niveles de expresión; sin embargo, esto solo se observó de manera dependiente de la dosis a 2000 µg/mL (Figura 4F). No se observaron cambios en los niveles de expresión génica de HIF 1, HIF 1 y GLUT 1 por las muestras de sorgo procesado RedBu2, BlackSs y BlackSb (datos no mostrados).

Efecto de los extractos de sorgo crudos y procesados en la expresión de proteínas de los genes de la vía de mutación e inestabilidad del genoma

Se utilizó ELISA para estudiar más a fondo el efecto de los extractos de BlackSs, BlackSb y RedBu2 crudos y procesados en la expresión de proteínas de los genes mutados de la vía de desarrollo del cáncer (Figura 4). Los resultados para la expresión de proteínas de APC y TTN se asemejaron estrechamente a los obtenidos en la expresión génica de rtPCR (Figuras 2 y 3). Se seleccionaron dos de los tres genes para el análisis posterior de la expresión de proteínas (APC y TTN) debido a sus niveles de expresión más altos a las 12 y 24 horas. A 500 µg/mL, BlackSs crudo aumentó significativamente el nivel de expresión de la proteína APC en dos veces de manera dependiente del tiempo a las 12 horas con un aumento adicional de dos veces a las 24 horas (p < 0,05). El análisis cuantitativo reveló que después del tratamiento de las células con 2000 µg/mL a las 12 y 24 horas, el nivel de proteína APC no mostró cambios estadísticamente significativos (p > 0,05). Por el contrario, la suplementación con 500 µg/mL de BlackSb crudo exhibió un aumento significativo de 4 veces en el nivel de expresión de la proteína APC (p < 0,05) solo a las 12 horas, lo que indica que su efecto sobre la expresión de proteínas es dependiente del tiempo y de la dosis. Los extractos de sorgo procesado de las muestras RedBu2, BlackSs y BlackSb no tuvieron un impacto significativo en los niveles de expresión de la proteína APC.

El tratamiento de las células HT 29 con 2000 µg/mL de BlackSs crudo aumentó significativamente el nivel de expresión de la proteína TTN en 4 veces a las 24 horas de manera dependiente del tiempo y de la dosis (p < 0,05) (Figura 5). Además, se exhibió un ligero pero significativo aumento en el nivel de expresión de la proteína TTN a las 12 y 24 horas cuando se trató con 500 µg/mL y a las 12 horas cuando se trató con 2000 µg/mL. El tratamiento de las células con 2000 µg/mL de BlackSb crudo mostró un aumento significativo de 2 veces en el nivel de expresión de la proteína TTN a las 24 horas; sin embargo, este aumento fue solo marginal en comparación con BlackSs. Las otras condiciones de tratamiento para BlackSb mostraron un ligero pero significativo aumento en el nivel de expresión de la proteína TTN. Inesperadamente, los niveles de expresión de TTN para el RedBu2 procesado fueron más altos que para BlackSs y BlackSb (Figura 5). A las 24 horas, esta muestra aumentó significativamente la expresión de TTN en 2 veces a 500 y 3 veces a 2000 µg/mL (p < 0,05). BlackSs procesado exhibió un ligero pero significativo aumento en la expresión de TTN a 500 µg/mL; sin embargo, el nivel de expresión se estabilizó a la concentración más alta. Se observaron resultados comparables para BlackSb; sin embargo, la meseta a 2000 µg/mL no fue significativa.

Ensayo de citotoxicidad

El ensayo de resazurina roja se utilizó para determinar el impacto de ocho extractos de sorgo en las células de cáncer de colon HT 29. Las células se incubaron durante 4, 6, 12 y 24 horas con concentraciones de extractos fenólicos derivados del sorgo de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µg/mL. La disminución significativa (p < 0,05) en la viabilidad de las células cancerosas que comienza a 500 µg/mL después de 12 y 24 horas se muestra en la Figura 2A, B, D. Las variedades de sorgo blanco y rojo crudos no mostraron una disminución en la viabilidad de las células cancerosas. Sin embargo, la variedad de sorgo de pericarpio rojo RedBu2 exhibió una reducción significativa en la viabilidad celular a las 24 horas cuando la muestra se procesó mediante cocción por fermentación. Las variedades de sorgo negro BlackSs y BlackSb mostraron una regresión en el crecimiento celular inicialmente a 500 µg/mL para las muestras crudas, mientras que las muestras procesadas de las mismas variedades demostraron inhibición del crecimiento celular a 2000 µg/mL. Basándose en los efectos citotóxicos de los extractos de sorgo rojo y negro para reducir la viabilidad celular en un 50% (IC50), las condiciones de tratamiento de 500 y 2000 µg/mL a las 12 y 24 horas se seleccionaron para experimentos posteriores. No se observó citotoxicidad para la línea celular de colon normal CCD 841 CoN en las condiciones de tratamiento descritas (datos no mostrados).

Impacto de los extractos de sorgo crudos y procesados en la expresión de los genes de la vía de desarrollo del cáncer relacionada con la mutación y la inestabilidad del genoma

Se utilizó una PCR cuantitativa en tiempo real (rtPCR) para dilucidar el impacto de BlackSs y BlackSb crudos en la expresión génica de APC, KRAS y TTN en células de cáncer de colon HT 29 (Figura 3). Los resultados mostraron un aumento significativo (p < 0,05) en la expresión génica, con variaciones en la magnitud entre los grupos de tratamiento. El tratamiento con 500 g/mL de BlackSs a las 12 h resultó en una sobreexpresión del 80% del gen APC (Figura 3A), con un aumento adicional de dos veces a las 24 h, de 2,75 ± 0,74 a 6,07 ± 1,31 (p < 0,05, d de Cohen = 1,03, IC del 95% [1,17, 5,47]), lo que indica un tamaño del efecto grande. Se observó una sobreexpresión significativa de ocho veces para el gen KRAS (Figura 3B) a la concentración más alta de 2000 g/mL después de 24 h, lo que sugiere que los extractos de sorgo negro afectan el crecimiento de las células cancerosas de manera dependiente del tiempo, mientras que las otras condiciones de tratamiento no resultaron en cambios significativos. Los niveles de expresión génica de TTN (Figura 3C) aumentaron significativamente (p < 0,05) después del tratamiento a 2000 g/mL, de 1,40 ± 0,34 a 6,26 ± 0,76, con un ligero aumento a 6,77 ± 1,11, lo que indica que la sobreexpresión puede ocurrir de manera dependiente de la dosis. La suplementación con 500 g/mL de BlackSb también resultó en la sobreexpresión del gen APC a las 12 h en dos veces (Figura 3D); sin embargo, no hubo cambios significativos en la expresión génica a las 24 h. Cabe destacar que BlackSb también sobreexpresó los genes KRAS y TTN; sin embargo, estos se encontraron a un nivel de expresión más bajo cuando las células cancerosas fueron tratadas con 2000 g/mL durante 24 h (Figura 3E) o 12 h (Figura 3F).

Dado que los hallazgos del estudio también indicaron una reducción en la viabilidad de las células cancerosas después del tratamiento con extractos de sorgo BlackSs, BlackSb y RedBu2 procesados a las 24 h, este estudio investigó más a fondo la expresión génica de APC, KRAS y TTN utilizando rtPCR (Figura 3). La suplementación con BlackSs procesados a 500 g/mL aumentó significativamente (p < 0,05) la expresión del gen APC en dos veces (1,45 ± 0,81–3,53 ± 0,95) en comparación con el control (Figura 3A). Cabe destacar que el gen KRAS se sobreexpresó significativamente a 500 g/mL, de 1,07 ± 0,44 a 2,29 ± 0,84, estabilizándose a la concentración más alta sin cambios adicionales (2,33 ± 0,51). El tratamiento con BlackSs procesados no cambió la expresión de TTN a 500 o 2000 g/mL. BlackSb reveló niveles de expresión génica similares para APC y TTN, aunque el gen KRAS mostró un aumento dependiente de la dosis del 162%, seguido de un aumento adicional del 58% (Figura 3B). Curiosamente, el sorgo rojo procesado, RedBu2, fue la única muestra investigada que mostró un aumento en la expresión del gen TTN (Figura 3C). No se detectaron cambios en la expresión génica para APC o KRAS para esta muestra.

Efecto de los extractos de sorgo negro crudos en la expresión de los genes de la vía de desarrollo del cáncer relacionados con el metabolismo celular inducido por hipoxia

Se indujo hipoxia en células normales de colon CCD 841 CoN para determinar el efecto de los extractos de sorgo en los oncogenes HIF 1 y los genes de los transportadores de glucosa en comparación con la normoxia (Figura 4). El tratamiento de las células con BlackSs a 2000 g/mL durante 12 h resultó en una regulación a la baja significativa del gen HIF 1α, volviendo a los niveles de normoxia (p < 0,05, d de Cohen = 2,32, IC del 95% [0,37, 3,25]; Figura 4A), lo que indica un tamaño del efecto muy grande. Se observó el mismo nivel de expresión génica para HIF 1α a 500 g/mL durante 24 h, con una disminución adicional de tres veces a la concentración más alta, lo que demuestra una actividad dependiente de la dosis y el tiempo. El tratamiento de células de colon inducidas a la hipoxia con 2000 g/mL de BlackSs mostró una disminución de tres veces en HIF 1α, pero no en ninguno de los otros tratamientos (Figura 4B). Curiosamente, GLUT 1 exhibió la mayor diferencia en los niveles de expresión, demostrando una disminución significativa en la expresión en comparación con los niveles de hipoxia en todas las condiciones de tratamiento (Figura 4C). Los niveles de expresión génica de HIF 1α en BlackSs fueron comparables a los observados en BlackSb, donde se produjo una disminución a los niveles de normoxia (Figura 4D). Se detectó una sobreexpresión significativa para HIF 1α después de la suplementación con BlackSb a 500 g/mL durante 12 h, sin cambios significativos en las otras condiciones de tratamiento (Figura 4E). De manera similar a BlackSs, el gen GLUT 1 disminuyó en los niveles de expresión; sin embargo, esto solo se observó de manera dependiente de la dosis a 2000 g/mL (Figura 4F). No se observaron cambios en los niveles de expresión de los genes HIF 1, HIF 1 y GLUT 1 por las muestras de sorgo procesado RedBu2, BlackSs y BlackSb (datos no mostrados).

Efecto de los extractos de sorgo crudos y procesados en la expresión de proteínas de los genes de la vía de mutación y inestabilidad del genoma

Se utilizó ELISA para estudiar más a fondo el efecto de los extractos crudos y procesados de BlackSs, BlackSb y RedBu2 en la expresión de proteínas de los genes mutados de la vía de desarrollo del cáncer (Figura 4). Los resultados para la expresión de proteínas de APC y TTN se asemejaron estrechamente a los obtenidos en la expresión génica de rtPCR (Figuras 2 y 3). Se seleccionaron dos de los tres genes para el análisis posterior de la expresión de proteínas (APC y TTN) debido a sus niveles de expresión más altos a las 12 y 24 h. A 500 g/mL, BlackSs crudos aumentaron significativamente el nivel de expresión de la proteína APC en dos veces de manera dependiente del tiempo a las 12 h, con un aumento adicional de dos veces a las 24 h (p < 0,05). El análisis cuantitativo reveló que después del tratamiento de las células con 2000 g/mL a las 12 y 24 h, el nivel de proteína APC no mostró cambios estadísticamente significativos (p > 0,05). Por el contrario, la suplementación con 500 g/mL de BlackSb crudo exhibió un aumento significativo de 4 veces en el nivel de expresión de la proteína APC (p < 0,05) solo a las 12 h, lo que indica que su efecto sobre la expresión de proteínas es dependiente del tiempo y la dosis. Los extractos de sorgo procesado de las muestras RedBu2, BlackSs y BlackSb no tuvieron un impacto significativo en los niveles de expresión de la proteína APC.

El tratamiento de las células HT 29 con 2000 g/mL de BlackSs crudos aumentó significativamente el nivel de expresión de la proteína TTN en 4 veces a las 24 h de manera dependiente del tiempo y la dosis (p < 0,05) (Figura 5). Además, se exhibió un ligero pero significativo aumento en el nivel de expresión de la proteína TTN a las 12 y 24 h cuando se trató con 500 g/mL y a las 12 h cuando se trató con 2000 g/mL. El tratamiento de las células con 2000 g/mL de BlackSb crudo mostró un aumento significativo de 2 veces en el nivel de expresión de la proteína TTN a las 24 h; sin embargo, este aumento fue solo marginal en comparación con BlackSs. Las otras condiciones de tratamiento para BlackSb mostraron un ligero pero significativo aumento en el nivel de expresión de la proteína TTN. Inesperadamente, los niveles de expresión de TTN para RedBu2 procesado fueron más altos que para BlackSs y BlackSb (Figura 5). A las 24 h, esta muestra aumentó significativamente la expresión de TTN en 2 veces a 500 y en 3 veces a 2000 g/mL (p < 0,05). BlackSs procesado exhibió un ligero pero significativo aumento en la expresión de TTN a 500 g/mL; sin embargo, el nivel de expresión se estabilizó a la concentración más alta. Se observaron resultados comparables para BlackSb; sin embargo, la estabilización a 2000 g/mL no fue significativa.

Discusión

En este estudio, se investigaron las propiedades anticancerígenas de los extractos de sorgo negro y rojo crudos y procesados (BlackSs, BlackSb y RedBu2) utilizando células de cáncer de colon HT 29 y células normales de colon CCD 841 CoN inducidas a la hipoxia. Se demostró que estos extractos de grano de sorgo pigmentado exhibían un aumento en la accesibilidad y detección de fenoles después de un proceso de cocción por fermentación en nuestras investigaciones anteriores debido a niveles elevados de fenoles totales y antioxidantes (Collins, Santhakumar, Latif, et al. ^[2024]). Además, se han informado varios polifenoles de sorgo bioaccesibles, capaces de llegar al colon para obtener beneficios para la salud atribuibles a través del proceso de biotransformación celular (Collins, Francis, Chinkwo, et al. ^[2024]). Los resultados de este estudio han demostrado, por primera vez, que BlackSs, BlackSb y RedBu2 exhibieron una reducción significativa en la viabilidad de las células de cáncer de colon a 500 o 2000 g/mL (Figura 1). Esto fue potencialmente debido a que los extractos de sorgo negro crudos y procesados aumentaron significativamente el nivel de expresión génica de los genes proapoptóticos (Figuras 3 y 6) y sus concentraciones de proteínas correspondientes (Figuras 5 y 7) de manera dependiente de la dosis y el tiempo. Además, los extractos de BlackSs y BlackSb también regularon a la baja los genes metabólicos sobreexpresados en las células normales de colon CCD 841 CoN inducidas a la hipoxia en diferentes niveles en varios tratamientos, exhibiendo así una actividad antitumoral (Figura 4).

La supervivencia de las células cancerosas depende de las modificaciones genómicas antiapoptóticas. Por ejemplo, la familia de genes BCL 2 se expresa comúnmente en exceso en las células cancerosas debido a una mutación génica en el "guardián del genoma", p53 (Feroz y Sheikh ^[2020]). También se ha informado que el gen supresor de tumores APC es un gen mutado con frecuencia con una frecuencia de mutación del 80% en las células de cáncer de colon (Hinoi ^[2021]). Este gen fue sobreexpresado por los extractos de sorgo negro crudos, particularmente BlackSs, tanto en los niveles de ARNm como de proteínas, lo que demuestra evidencia de su papel en la promoción de la apoptosis. El mecanismo de acción puede ser a través de la modulación de la vía de señalización Wnt/β-catenina: los polifenoles del sorgo pueden facilitar la unión de APC a Axin y promover la fosforilación de β-catenina (Raji et al. ^[2018]). Curiosamente, los extractos de sorgo negro procesados también demostraron un aumento significativo en la expresión del gen APC; sin embargo, la proteína no se detectó cuando se midió mediante ELISA. Esta discrepancia puede deberse a variaciones postranscripcionales o mecanismos intracelulares que inhiben la traducción y la estabilidad del producto proteico (Rani et al. ^[2020]). Un estudio informó que el gen APC fue sobreexpresado por los extractos de cloroformo de la planta en flor, Peucedanum chenur, en las células de cáncer de colon HCT 116 a una concentración de inhibición media (IC50) de 120 g/mL (Fadaei et al. ^[2022]). De manera similar a nuestro estudio, esto sugiere la inhibición de la vía de señalización Wnt/β-catenina de manera dependiente de la dosis. Además, se ha demostrado que los polifenoles del té negro, las teaflavinas y las tearubiginas, reducen la viabilidad de las células de leucemia U937 y K562 al inhibir las vías de señalización Akt y Wnt/β-catenina (Halder et al. ^[2012]).

Los genes KRAS y TTN, que participan principalmente en la señalización celular y la activación del crecimiento, han mostrado una frecuencia de mutación del 50% y el 40%, respectivamente (Wang et al. ^[2021]). Nuestros hallazgos indican que ambos genes aumentaron en la expresión génica, siendo BlackSs el que mostró una mayor regulación al alza que BlackSb a la concentración de suplementación de 2000 g/mL. BlackSs mostró un nivel de expresión génica KRAS más alto que BlackSb en las muestras crudas; sin embargo, las muestras procesadas mostraron la tendencia opuesta. Este hallazgo sugiere que BlackSs crudo y BlackSb procesado pueden activar las vías de señalización MAPK/ERK y PI3K/Akt (Sever y Brugge ^[2015]). BlackSb indujo un ligero, pero significativo, aumento en la expresión génica TTN en comparación con BlackSs, pero se estabilizó a la concentración más alta (Figuras 3F y 7B). Esta estabilización sugiere que las células CCD 841 CoN inducidas por hipoxia pueden haber alcanzado una capacidad máxima para la síntesis de proteínas TTN para BlackSb o que se pueden haber activado mecanismos de retroalimentación para regular aún más la expresión, reduciendo así la eficacia de la transcripción de TTN (Rani et al. ^[2020]). Hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primer informe sobre la bioactividad del sorgo procesado para el gen TTN. Cabe destacar que el RedBu2 procesado exhibió niveles de expresión génica superiores para TTN en comparación con BlackSs y BlackSb (Figuras 6C y 7B). Esta diferencia puede atribuirse a las diferencias en la composición fenólica o los factores reguladores posteriores al procesamiento que pueden influir en la expresión génica y los niveles de concentración. En nuestro estudio anterior, demostramos que RedBu2 aumentó en un 25% la actividad antioxidante después del procesamiento mediante cocción por fermentación (Collins, Santhakumar, Latif, et al. ^[2024]). Esta muestra contenía varios compuestos antioxidantes elevados, como el ácido 4-acetilbutírico, el ácido cafeico, el trans-piceid y el trans-resveratrolósido, que pueden haber contribuido a la regulación al alza de TTN en el presente estudio. Se ha demostrado que estos compuestos, entre otros, desempeñan un papel vital en las vías de señalización reguladoras posteriores asociadas con la estabilidad de las estructuras celulares, ejerciendo así sus efectos sobre la proteína TTN (Karadas et al. ^[2024]; Ulanova et al. ^[2019]).

La desregulación del metabolismo de la glucosa como vía de desarrollo del cáncer está impulsada por la preferencia por la glucólisis anaeróbica sobre la fosforilación oxidativa para proporcionar la alta demanda de energía de las células que se proliferan rápidamente (Isa ^[2022]). Este cambio metabólico está regulado principalmente por los oncogenes HIF 1, HIF 1α y HIF 1β, que se unen al elemento de respuesta a la hipoxia e inducen la transcripción del ADN canceroso (Nagao et al. ^[2019]). En el presente estudio, informamos que los extractos de sorgo BlackSs y BlackSb pueden restablecer potencialmente el metabolismo celular normal al inhibir el gen HIF 1α en las células normales del colon CCD 841 CoN inducidas por hipoxia (Figura 4). El mecanismo de acción probablemente se debió a la inactivación del HIF 1α nuclear translocado debido a las interacciones de la actividad estructural del anillo A y B fenólico. Un estudio similar de Ansó et al. (^[2010]) demostró que los flavonoides apigenina, luteolina y quercetina (todos presentes en nuestras muestras de sorgo) redujeron la expresión de HIF 1α al inhibir la fosforilación de Akt en la vía PI3K/Akt. Sin embargo, no se han realizado estudios recientes que exploren estos hallazgos. Se considera que la expresión de HIF 1β permanece relativamente constante en condiciones hipóxicas (Mandl y Depping ^[2014]). De manera similar, en nuestro estudio, este gen no mostró cambios significativos en los niveles de expresión después de la inducción de hipoxia en las células normales del colon. No obstante, BlackSs redujo HIF 1β a la concentración más alta, y no se observaron cambios significativos después de la suplementación con BlackSb, excepto a 500 g/mL, donde el gen se reguló al alza (Figura 4B, E).

GLUT 1, una proteína transportadora de la superficie celular, desempeña un papel vital en el "efecto de Warburg" al aumentar la captación de glucosa para satisfacer la demanda metabólica en las células cancerosas (Vaupel y Multhoff ^[2021]). Este estudio determinó que los extractos de sorgo negro disminuyen la sobreexpresión de GLUT 1 en las células CCD 841 CON inducidas por hipoxia. BlackSs alcanzó la normoxia a 500 g/mL en comparación con BlackSb, que alcanzó la glucólisis aeróbica a la concentración más alta (Figura 4C, F). El mecanismo de acción puede deberse a la unión de los fenoles del sorgo al sitio del receptor GLUT 1, bloqueando así el acceso de combustible a la célula (Darvin et al. ^[2015]). De manera similar, en las células cancerosas, los niveles de glucosa pueden disminuir debido a las interacciones del receptor fenólico, lo que resulta en la inanición de las células malignas y la inducción de la apoptosis (Hinoi ^[2021]). Prasad et al. (^[2015]) informaron que el sorgo contiene un índice glucémico (IG) significativamente más bajo en comparación con otros cereales. Se determinó que el sorgo procesado, incluidos la pasta, los copos y la gacha, tenía un IG significativamente más bajo que el trigo y el arroz. Según Miyazaki et al. (^[2024]), el consumo de gacha de sorgo en un estudio cruzado doble ciego redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre de los individuos. Estos estudios respaldan la hipótesis de que el sorgo con bajo IG reduce los niveles de glucosa en sangre posprandial al regular potencialmente a la baja GLUT 1, lo que resulta en una mejor salud metabólica y reduce el riesgo de enfermedades crónicas asociadas. Se requieren estudios adicionales, en particular ensayos de alimentación en humanos, para determinar la cantidad de sorgo consumido necesaria para administrar polifenoles bioactivos para neutralizar la sobreexpresión de GLUT 1. Además, son esenciales estudios que incorporen la validación in vivo para confirmar la relevancia fisiológica y los posibles efectos terapéuticos determinados por los ensayos in vitro utilizados.

Conclusión

El presente estudio ha demostrado que los extractos fenólicos de sorgo pigmentado pueden inducir la apoptosis al regular la expresión de los genes en las vías de desarrollo del cáncer de inestabilidad y mutación del genoma y desregulación del metabolismo celular. Los extractos fenólicos del sorgo negro, en particular BlackSs, mostraron una alta afinidad por la regulación al alza de APC, KRAS y TTN en comparación con BlackSb. El RedBu2 procesado demostró niveles superiores de expresión de ARNm y proteínas que ambas muestras de sorgo negro, lo que indica el aumento de la actividad anticancerígena de los polifenoles en esta muestra. Además, el factor inducible por hipoxia (HIF 1α y HIF 1β) fue inhibido por BlackSs, probablemente debido a la alta concentración de polifenoles antioxidantes en las muestras negras en comparación con las rojas. Además, GLUT 1 también fue modulado por BlackSs, lo que sugiere una reversión del estado metabólico alterado asociado con la tumorigénesis. Se requieren estudios que utilicen modelos in vivo para dilucidar los efectos de los extractos fenólicos del sorgo sobre estos genes en los tumores sólidos. Los hallazgos podrían indicar potencialmente que los extractos fenólicos del sorgo son una prometedora estrategia terapéutica para restaurar la expresión génica normal y el equilibrio metabólico en las células cancerosas.

Contribuciones de los autores

Aduba Collins: conceptualización, curación de datos, investigación, metodología, análisis formal, revisión y edición de la escritura, redacción del borrador original. Kenneth Chinkwo: conceptualización, visualización, revisión y edición de la escritura, supervisión. Nidhish Francis: conceptualización, revisión y edición de la escritura, visualización, supervisión. Abishek Bommannan Santhakumar: conceptualización, revisión y edición de la escritura, supervisión. Christopher Blanchard: conceptualización, revisión y edición de la escritura, visualización, supervisión.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.