El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. A pesar de los avances en las terapias dirigidas, la resistencia a los fármacos y la eficacia limitada en el CCR con mutación de KRAS siguen planteando desafíos clínicos. Antrodia cinnamomea, un hongo medicinal, demuestra propiedades antitumorales; sin embargo, los mecanismos de su compuesto triterpenoide, 4-acetilantrocamol LT3 (LT4), aún no están claros.
El presente estudio investigó los efectos de LT4 en las células HCT116 de CCR con mutación de KRAS mediante ensayos de viabilidad celular, formación de colonias y migración. También se utilizó Western blot para examinar las principales vías de señalización. El perfilado del transcriptoma mediante secuenciación de ARN se siguió de la búsqueda de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto/Ontología Génica y análisis de la red de interacción proteína-proteína utilizando STRING, CytoHubba y Detección de Complejos Moleculares (MCODE). Se realizó el acoplamiento molecular con PI3K? (PDB: 1E7U) para evaluar la posición de unión prevista y la energía de acoplamiento de LT4.
Los resultados indicaron que LT4 inhibió significativamente la proliferación y la migración de las células HCT116, indujo una transición mesenquimal a epitelial, suprimió las vías de señalización PI3K/AKT/mTOR y ERK, y activó los ejes GSK3/FOXO y p38/p21 fosforilados. LT4 también redujo los niveles de ciclooxigenasa 2 y las proteínas antiapoptóticas (Bcl-2 y Bcl-XL) y redujo la expresión de la subunidad IV de la proteína de la cadena respiratoria mitocondrial, citocromo c oxidasa. El análisis transcriptómico identificó la vía PI3K/AKT como la cascada de señalización más significativamente enriquecida. Los análisis de la topología de la red destacaron la familia de transportadores de solutos 3, miembro 2, la ciclina D1, la fosfoserina aminotransferasa 1 y la ChaC glutatión específica ?-glutamilciclotransferasa 1 como nodos centrales, que vinculan los efectos de LT4 con la señalización de nutrientes, la homeostasis redox y el metabolismo de la serina.
El acoplamiento molecular confirmó que LT4 ocupaba de forma estable el bolsillo de unión al ATP de PI3K? con una energía de unión comparable a la de la wortmannina y una conformación similar a la del antroquinol.
En conclusión, según nuestro conocimiento, el presente estudio es el primero en demostrar de forma exhaustiva los efectos anti-CCR multiobjetivo de LT4, lo que destaca su potencial como agente terapéutico, especialmente en el CCR con mutación de KRAS.
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado a nivel mundial y ocupa el segundo lugar como causa principal de muerte relacionada con el cáncer, lo que supone una importante carga para la salud mundial ([1]). La incidencia del CCR continúa aumentando, especialmente en los países que experimentan una rápida industrialización y cambios en el estilo de vida ([1]). A pesar de los avances en los programas de detección y las estrategias terapéuticas, la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con CCR avanzado o metastásico sigue siendo de aproximadamente el 16% ([2],[3]). Las modalidades de tratamiento actuales incluyen la resección quirúrgica, la quimioterapia (como los regímenes basados en 5-fluorouracilo), la radioterapia y las terapias dirigidas (como los agentes anti-factor de crecimiento endotelial vascular y anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico) ([4]). En los últimos años, las inmunoterapias, en particular los inhibidores de los puntos de control inmunitario que se dirigen a la proteína 1 de muerte celular programada y al ligando 1 de muerte programada, han surgido como una opción prometedora, especialmente para los pacientes con alta inestabilidad de microsatélites o tumores con deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento ([4],[5]). Sin embargo, estos enfoques no son universalmente eficaces; su eficacia a menudo se ve limitada por la resistencia adquirida, la heterogeneidad genética del tumor y los efectos secundarios adversos. Además, las mutaciones en los oncogenes y los genes supresores de tumores, como KRAS, TP53 y APC, así como la activación aberrante de las vías de señalización, incluidas las vías Wnt/β-catenina, PI3K/AKT/mTOR y MAPK, están frecuentemente implicadas en la progresión de la enfermedad y la resistencia al tratamiento ([6]-[8]). Estas complejidades subrayan la urgente necesidad de estrategias complementarias que se dirijan a mecanismos moleculares alternativos para mejorar la eficacia terapéutica y reducir la recurrencia del tumor.
En los últimos años, se ha prestado cada vez más atención al uso de productos naturales y hierbas medicinales en la terapia contra el cáncer. Debido a sus mecanismos de acción multifacéticos, sus perfiles de menor toxicidad y su uso histórico en los sistemas de medicina tradicional, los compuestos naturales ofrecen candidatos prometedores tanto para la quimioprevención como para la terapia adyuvante ([9],[10]). Entre ellos, Antrodia cinnamomea (comúnmente conocida como Niu-chang-chih), un hongo medicinal endémico de Taiwán, ha despertado un interés científico significativo debido a su amplio espectro de actividades farmacológicas, que incluyen efectos antiinflamatorios, antioxidantes, hepatoprotectores, inmunomoduladores y, notablemente, anticancerígenos ([11]). Hasta la fecha, la investigación sobre A. cinnamomea se ha centrado principalmente en sus extractos crudos, que han demostrado efectos inhibitorios contra varios tipos de cáncer a través de múltiples mecanismos, como la activación de la vía CHOP/tribbles pseudokinase 3 (TRB3)/AKT/mTOR, la supresión de NF-κB y la señalización de c-Myc, y la modulación de la transición epitelio-mesenquimal (TEM) y la capacidad de las células madre tumorales ([12]-[15]). A pesar de estos hallazgos, la investigación sobre la bioactividad de los compuestos purificados y estructuralmente definidos de A. cinnamomea sigue siendo limitada, especialmente en el contexto del CCR. Entre los componentes activos, los triterpenoides (en particular, las antcinas) han demostrado potencial anticancerígeno en múltiples neoplasias malignas, incluidos los modelos de cáncer oral, de mama, de páncreas, de próstata, de ovario, de cuello uterino y de osteosarcoma ([16]-[18]), y algunos estudios recientes han comenzado a examinar sus efectos en el CCR. Por ejemplo, se informó que la antrodina C induce la detención en la fase G1 y la apoptosis en las células HCT116 a través de la vía de las especies reactivas del oxígeno (ROS)/AKT/ERK/p38 y suprime el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto ([19]). Sin embargo, estos estudios siguen siendo en gran medida descriptivos, centrándose en los resultados fenotípicos, como la apoptosis o la detención del ciclo celular, sin dilucidar las redes de señalización más amplias o los objetivos moleculares directos implicados.
El presente estudio evaluó el potencial anticancerígeno del 4-acetilantrocamol LT3 (LT4), un derivado de triterpeno purificado aislado del micelio de A. cinnamomea. Utilizando células HCT116 de CCR humano como modelo, se realizaron ensayos funcionales en combinación con el perfilado transcriptómico, el análisis de la expresión de proteínas y el acoplamiento molecular para dilucidar los mecanismos subyacentes de la acción de LT4. Los hallazgos revelaron nuevas perspectivas sobre las redes de señalización afectadas por LT4 y sugieren que este compuesto puede servir como un candidato prometedor para un mayor desarrollo en la terapia del CCR.
Materiales y métodos
Preparación y purificación de los compuestos derivados de A. cinnamomea
En total, se aislaron 4 compuestos de A. cinnamomea, incluido el ácido dehidroeburico (DeEA) y el ácido deshidrosulfurénico (DSA) del cuerpo fructífero, y el 4-acetilantroquinol B (4AAQB) y el LT4 del micelio. Para DeEA y DSA, los extractos etanólicos del cuerpo fructífero se particionaron secuencialmente en capas de hexano, acetato de etilo, diclorometano y acuosa. Cada capa se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa utilizando un instrumento Hitachi L-7100 (Hitachi, Ltd.) equipado con un detector de matriz de fotodiodos (L-2400), una bomba (L-2130) y un autosampler (L-2200). La separación se realizó en una columna C18 (Lichro CART® RP-18e; 4,0 × 250 mm i.d.; 5 μm; Merck KGaA) con la temperatura de la columna mantenida a 25 °C. La fase móvil consistió en el disolvente A (0,1% de ácido fórmico en agua) y el disolvente B (acetonitrilo). El programa de elución fue el siguiente: 0-3 min (A:B, 70:30 a 60:40), 3-15 min (A:B, 60:40 a 42:58), 15-21 min (A:B, 42:58), 21-26 min (A:B, 42:58 a 35:65), 26-35 min (A:B, 35:65 a 0:100) y 35-50 min (0:100). La velocidad de flujo fue de 0,8 ml/min, el volumen de inyección (cantidad de muestra) fue de 10 μl y la detección se realizó a 254 nm. No se utilizó ningún estándar interno. Basándose en los tiempos de retención, se identificaron DSA y DeEA a los ~29 min y 45 min, respectivamente (Fig. S1A).
Para aislar 4AAQB y LT4, el extracto de micelio se sometió a HPLC en fase inversa utilizando una columna Lichro CART® RP-18e (4,0 × 250 mm, 5 μm; Merck KGaA) en un sistema Hitachi L-7100 equipado con un detector de UV (L-7455). La temperatura de la columna se mantuvo a 25 °C. La fase móvil fue un gradiente de agua-metanol: 40:60 durante 15 min, 20:80 durante 15 min y 0:100 durante 10 min. La velocidad de flujo fue de 1,0 ml/min, el volumen de inyección fue de 10 μl y la longitud de onda de detección fue de 254 nm. No se utilizó ningún estándar interno. Los tiempos de retención fueron de 14,92-15,35 min para 4AAQB, 17,93-17,97 min para antrocamol LT3 y 18,53-18,64 min para LT4, según lo confirmado por la comparación con los estándares auténticos (Fig. S1B-E).
Cultivo e identificación de células
Las líneas celulares de CCR humano, HCT116 (mutante de KRAS), HT-29 y Caco-2, se adquirieron de la Colección de Cultivos Celulares Americanos (ATCC; HCT116, CCL-247; HT-29, HTB-38; Caco-2, HTB-37). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) y un 1% de penicilina-estreptomicina y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2. Para los experimentos de rutina, las células se sembraron a una densidad de 3 × 105 a 6 × 105 células por placa de cultivo de 10 cm, a menos que se especifique lo contrario. Según Cellosaurus, la línea celular HT-29 (CVCL_0320) se derivó originalmente de un adenocarcinoma rectosigmoideo y, por lo tanto, debe clasificarse como una línea celular de CCR.
Las líneas celulares no se autenticaron de forma independiente en nuestro laboratorio, pero se obtuvieron directamente de ATCC y se utilizaron dentro de los 6 meses posteriores a la reactivación. La contaminación por micoplasma se controló de forma rutinaria mediante ensayos basados en PCR y se encontró que era negativa durante todo el estudio.
Ensayo de viabilidad celular
Las células HCT116, HT29 y Caco2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 103 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con diferentes concentraciones (0,1, 1, 3 o 10 μM) de DeEA, DSA, 4AAQB o LT4 durante 24, 48 y 72 h. La viabilidad celular se evaluó utilizando el kit de recuento de células-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Inc.). Después del tratamiento, se añadió la solución CCK-8 a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2 durante 30 min. La absorbancia se midió a 450/650 nm utilizando un lector de microplacas (SpectraMax 190; Molecular Devices, LLC). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Ensayo de formación de colonias
Las células HCT116 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 300 células/pocillo y se dejaron adherir durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2. Al día siguiente, las células se trataron con LT4 a concentraciones de 0, 0,1, 1, 3 o 10 μM y se cultivaron durante 10 días en las mismas condiciones (37 °C, 5% de CO2). Las colonias se fijaron con etanol al 95% durante 30 min a temperatura ambiente y se tiñeron con cristal violeta al 1% durante otros 30 min a temperatura ambiente. El exceso de tinte se eliminó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las placas se dejaron secar al aire durante 2-3 días. Las colonias se visualizaron y la cuantificación se realizó mediante el recuento manual. Se definió una colonia como un cúmulo que contenía ≥ 50 células.
Ensayo de curación de heridas
Las células HCT116 se sembraron a 3 × 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia. Se creó un arañazo uniforme utilizando la punta de una pipeta de 200 μl y las células se lavaron suavemente con PBS para eliminar los residuos. Se añadió LT4 a concentraciones finales de 0, 0,1, 1, 3 o 10 μM en medio fresco sin suero. Se capturaron imágenes utilizando un microscopio óptico invertido (contraste de fase) y se visualizaron los mismos campos microscópicos a las 0, 24, 48 y 72 h para controlar el cierre de la herida y la migración celular. El cierre de la herida se cuantificó utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud; v2.14.0/1.54f) midiendo el ancho de la herida a las 0 h y en cada punto de tiempo indicado. Para cada imagen, el ancho de la herida se midió en múltiples posiciones espaciadas uniformemente a lo largo del arañazo y se promedió para obtener un único valor por pocillo. La tasa de curación se calculó como (W0-Wt)/W0, donde W0 es el ancho de la herida a las 0 h y Wt es el ancho de la herida en el momento indicado.
Extracción de ARN
Las células HCT116 se cultivaron en seis placas de 10 cm hasta alcanzar la confluencia. Las células se dividieron en dos grupos: tres placas para el grupo de control y tres placas para el grupo tratado con LT4 (10 μM). El grupo de control recibió un volumen igual de DMSO [concentración final, 0,1% (v/v)] correspondiente al disolvente de LT4. Después de 24 h de tratamiento, las células se lavaron 1-2 veces con PBS para eliminar el medio residual y evitar interferencias con el reactivo NucleoZOL (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG). Posteriormente, se añadió al menos 1 ml de NucleoZOL a cada placa y las células se rasparon utilizando un raspador celular. Los lisados se transfirieron a tubos de centrífuga, se sellaron con parafilm para evitar fugas y se almacenaron a -20 °C o -80 °C.
Para la purificación del ARN, se añadieron 400 μl de agua tratada con DEPC (NZYtech) por cada 1 ml de lisado de NucleoZOL, seguida de una agitación vigorosa durante 15 segundos y una incubación a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 5-15 minutos. Las muestras se centrifugaron a 12 000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar el sobrenadante que contenía ARN del pellet de ADN/proteínas. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se añadieron 5 μl de 4-bromoanisol por cada 1 ml de sobrenadante para la separación de fases. Después de mezclar durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 35 minutos, las muestras se centrifugaron a 12 000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El pellet que contenía ARN se lavó dos veces con etanol al 75%, se centrifugó a 4000-8000 × g durante 1-3 minutos a 4 °C y se dejó secar al aire brevemente. Por último, el ARN se disolvió en agua tratada con DEPC para alcanzar una concentración de 1-2 μg/μl y se incubó a temperatura ambiente durante 2-5 minutos para garantizar una disolución completa.
Secuenciación de ARN (RNA-seq) y análisis bioinformático
Se realizó un análisis de ARN-seq por Genomics, BioSci & Tech Co., Ltd. (Nueva Taipéi, Taiwán). La preparación de las bibliotecas siguió el protocolo del kit TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, Inc.). Brevemente, se utilizaron 1 µg de ARN total para aislar el ARNm mediante cuentas magnéticas oligo(dT), seguido de la fragmentación y la síntesis de la cadena de ADN complementario de primera y segunda hebra. Después de la reparación de los extremos, la adenilación 3' y la ligación de los adaptadores, las bibliotecas se amplificaron por PCR y se purificaron utilizando las cuentas AMPure XP (Beckman Coulter, Inc.). La calidad de la biblioteca se evaluó utilizando el Agilent 2100 BioAnalyzer, y la cuantificación se realizó utilizando PCR cuantitativa. La secuenciación se llevó a cabo en la plataforma Illumina NovaSeq X Plus utilizando un kit de reactivos NovaSeq X Series 10B (300 ciclos; Illumina, Inc.) para generar lecturas apareadas de 150 pb. La biblioteca agrupada final se diluyó y se cargó a una concentración promedio de 110 pM de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los datos de ARN-seq se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus bajo el número de acceso GSE299648.
Los datos de secuenciación sin procesar se convirtieron al formato FASTQ utilizando bcl2fastq (v2.20.0; Illumina, Inc.). Las lecturas de secuenciación se procesaron utilizando fastp (v0.20.0) para eliminar las lecturas y los adaptadores de baja calidad ([20]). El filtrado de ARN ribosomal es un paso opcional y no se realizó en este estudio (es decir, no se realizó el filtrado de SortMeRNA). Las secuencias recortadas se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38 (ensamblaje RefSeq: GCF000001405.40; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF000001405.40/) utilizando HISAT2 (v2.1.0; Universidad Johns Hopkins; https://daehwankimlab.github.io/hisat2/). Los archivos SAM resultantes se convirtieron al formato BAM utilizando SAMtools (v1.9; proyecto SAMtools; https://www.htslib.org/). Los recuentos de lecturas a nivel de gen se calcularon utilizando featureCounts (Subread v2.0.1; paquete Subread; http://subread.sourceforge.net/) y se normalizaron a transcripciones por millón. Los genes expresados diferencialmente (DEG) se identificaron utilizando DESeq2 (v1.48.2) con umbrales establecidos en |log2 fold change| ≥ 1 y P ajustada
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