Características Basales del Tumor y Dinámicas Inmunológicas Sistémicas Subyacentes a la Eficacia en Cáncer Colorrectal Metastásico MSS Tratado con Regorafenib, Ipilimumab y Nivolumab.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial. La mayoría de los casos de CCR son microsatélites estables (MSS) y tienen una reparación del desajuste de bases eficiente. En particular, el CCR MSS ha demostrado una respuesta deficiente a los inhibidores de los puntos de control inmunitarios (ICIs), que han tenido éxito en el tratamiento de otros cánceres (^[1]–^[4]). Esta resistencia a los ICIs representa un importante desafío terapéutico, lo que subraya la necesidad de estrategias innovadoras para sensibilizar el CCR metastásico MSS (mCCR) a la inmunoterapia.

Las investigaciones emergentes destacan el potencial de la modulación del microambiente tumoral (MET) como una estrategia para superar la evasión inmune en el mCCR MSS. El regorafenib, un inhibidor multiquinasa con propiedades antiangiogénicas, ha demostrado la capacidad de normalizar la vasculatura tumoral aberrante, aliviar la hipoxia y reducir los elementos inmunosupresores dentro del MET (^[5]–^[8]). Estos efectos crean un entorno más permisivo para la infiltración y activación de las células inmunitarias. Cuando se combina con los ICIs, el regorafenib tiene el potencial de superar la resistencia a la inmunoterapia en el mCCR MSS.

Anteriormente, realizamos un ensayo de fase I que combinaba regorafenib con ipilimumab (anti-CTLA-4) y nivolumab (anti-PD-1), denominado colectivamente régimen RIN. Esta combinación produjo una tasa de respuesta general (ORR) del 27,6%, con una mediana de supervivencia libre de progresión (PFS) de 4 meses y una mediana de supervivencia global (OS) de 20 meses. En particular, los pacientes sin metástasis hepáticas experimentaron una ORR más alta del 36,4% y beneficios duraderos, incluido un índice de PFS a 3 años del 19,3% (^[9], ^[10]). Estos resultados sugieren que la terapia RIN puede activar la inmunidad antitumoral, lo que contribuye a respuestas duraderas en un subconjunto de pacientes con mCCR MSS. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a las diferentes respuestas clínicas siguen poco comprendidos, en particular los resultados deficientes observados en pacientes con metástasis hepáticas. Una mejor comprensión de estos mecanismos es fundamental para optimizar las estrategias de tratamiento e identificar biomarcadores predictivos.

Tanto el MET como la inmunidad sistémica desempeñan un papel fundamental en la configuración de la respuesta a la inmunoterapia. Las características intrínsecas del tumor, como la infiltración de células inmunitarias, la expresión de puntos de control y las citocinas supresoras, influyen en la eficacia terapéutica (^[11], ^[12]). En particular, las metástasis hepáticas imponen una barrera adicional debido al microambiente inmunotolerante del hígado, que promueve la disfunción de las células T y la evasión inmune (^[13]–^[15]). Además, los factores inmunitarios sistémicos, incluida la composición y el estado funcional de las células inmunitarias periféricas, también pueden alterar la respuesta al tratamiento (^[16], ^[17]).

En este estudio correlacional, investigamos los determinantes inmunológicos y moleculares de la respuesta a la terapia RIN en el mCCR MSS. Mediante el análisis de biopsias tumorales emparejadas y muestras de sangre periférica recogidas antes y durante el tratamiento, realizamos secuenciación de ARN, imagenología de inmunofluorescencia multiplexada, citometría de flujo de alto parámetro y perfilado de citocinas séricas. Nuestros objetivos fueron (^[1]) identificar las características tumorales y inmunitarias periféricas basales asociadas con la respuesta, (^[2]) caracterizar cómo la terapia RIN modula el MET y la inmunidad sistémica, y (^[3]) descubrir los mecanismos que contribuyen a los resultados deficientes en pacientes con metástasis hepáticas. A través del análisis integrado de datos clínicos, moleculares e inmunitarios, este estudio tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la resistencia a la inmunoterapia en el mCCR MSS y guiar el desarrollo de estrategias personalizadas para mejorar los resultados en esta población de difícil tratamiento.

Materiales y Métodos

Inclusión de pacientes y recogida de muestras

Un total de 29 pacientes con mCCR MSS fueron incluidos en este estudio en el marco del ensayo clínico de City of Hope IRB #19417 (NCT04362839). Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito antes de participar. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los estándares éticos descritos en el Informe Belmont y la Declaración de Helsinki. Los pacientes elegibles tenían un mCCR MSS confirmado histológicamente y eran candidatos adecuados para la terapia combinada con regorafenib, ipilimumab y nivolumab.

Las biopsias tumorales se recogieron al inicio y en la semana 4 después del inicio del tratamiento. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para la secuenciación de ARN o se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina (FFPE) para la imagenología de inmunofluorescencia multiplexada (mIF). La sangre periférica se recogió al inicio, en la semana 4 y en la semana 8. El plasma se almacenó a −80 °C y las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación de densidad con Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich, GE17-1440-02) y se crioconservaron en nitrógeno líquido para análisis posteriores.

Extracción y secuenciación de ARN

El ARN total se extrajo de las biopsias tumorales congeladas y de las células T CD4⁺ y CD8⁺ no naïvas clasificadas mediante citometría de flujo (FACS) utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, 74104) y el kit RNeasy Micro (Qiagen, 74004), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada muestra de secuenciación de ARN representa un réplica biológica independiente derivada de una biopsia de un paciente individual o de una población de células clasificadas.

Las bibliotecas y la secuenciación se realizaron en Novogene como un proyecto de servicio. Las bibliotecas de ARN de biopsias tumorales se generaron utilizando un flujo de trabajo de agotamiento del ARNr, mientras que el ARN del ARN derivado de células T clasificadas se preparó como bibliotecas de ARNm seleccionadas con poli(A). Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina NovaSeq 6000 (RRID:SCR_016387) para producir lecturas emparejadas de 150 pb, con una profundidad objetivo de >30 millones de pares de lecturas por muestra.

Los datos de secuenciación sin procesar se sometieron a un control de calidad estándar por parte del proveedor de secuenciación. Las lecturas que superaron una puntuación de calidad mínima de Q30 se conservaron para el análisis posterior. El recorte de adaptadores y la eliminación de bases de baja calidad se realizaron como parte del flujo de trabajo de preprocesamiento estándar del proveedor antes de la alineación.

Análisis bioinformático

Los datos de secuenciación de ARN sin procesar se procesaron utilizando la plataforma basada en la nube Partek Flow. Las lecturas se alinearon con el genoma de referencia humano GRCh38/hg38 utilizando STAR v2.7.8a. La cuantificación de la expresión génica se realizó utilizando HTSeq v2.0.3 y la expresión génica diferencial se analizó utilizando DESeq2 v1.30.1. Los genes con un valor p ajustado (corrección de Benjamini-Hochberg) inferior a 0,05 se consideraron significativos. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) se realizó utilizando el software GSEA v4.1.0 del Broad Institute (RRID:SCR003199) con los conjuntos de genes de la base de datos MSigDB hallmark y KEGG. La deconvolución de tipos de células a partir de la secuenciación de ARN a granel se realizó con xCell (RRID:SCR026446) (^[18]). Los subtipos moleculares de consenso (CMS) se asignaron utilizando el paquete R CMSclassifier (v1.0.0) (^[19]). El análisis del repertorio de receptores de células T (TCR) se realizó con TRUST4 v1.0.12 (RRID:SCR026162) (^[20]) y las métricas de diversidad de clonalidad se calcularon utilizando el paquete R Immunarch v0.9.1 (RRID:SCR023089).

Citometría de flujo

Las PBMC se tiñeron utilizando cuatro paneles de anticuerpos (Tabla suplementaria 4). Para la tinción de superficie, las células se incubaron con anticuerpos conjugados con fluorocromos. La tinción de citocinas intracelulares se realizó después de la estimulación con PMA (50 ng/mL, Sigma-Aldrich, P8139) e ionomicina (1 μg/mL, Sigma-Aldrich, I0634) en presencia de Brefeldin A (BioLegend, 420601) durante 4 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron utilizando el kit de tinción de Foxp3/factor de transcripción (Invitrogen, 00-5523-00) y se tiñeron para los marcadores intracelulares.

La tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) se realizó utilizando el kit de detección SPiDER-βGal (Dojindo, SG04) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se pretrataron con Bafilomicina A1 en un medio completo durante 1,5 horas a 37 °C, seguido de la incubación con la solución de trabajo SPiDER-βGal durante 30 minutos antes de la fijación y la tinción de anticuerpos de superficie.

Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo espectral Cytek Aurora (RRID:SCR019826) y se analizaron utilizando SpectroFlo v2.2 y FlowJo v10.9 (RRID:SCR008520). Se utilizó una puerta de entrada estandarizada para identificar los subconjuntos inmunitarios y los estados de activación (Figuras suplementarias 2-5).

Imagenología de inmunofluorescencia multiplexada

La inmunofluorescencia multiplexada (mIF) se realizó en secciones de tumores FFPE utilizando la plataforma de codetección por indexación (CODEX) Akoya PhenoCycler (RRID:SCR_023773) (^[21]). Se aplicó un panel personalizado de 50 anticuerpos dirigidos a marcadores inmunitarios y del estroma (Tabla suplementaria 5). La tinción se realizó según el protocolo del fabricante.

La imagen se realizó en el sistema PhenoCycler-Fusion (Akoya Biosciences), que integra un microscopio de fluorescencia de campo amplio, un escenario automatizado y un detector sCMOS, utilizando un objetivo de 20×. La adquisición de imágenes se realizó utilizando el software propietario del instrumento con ajustes de exposición estandarizados en todas las muestras. QuPath v0.5 (RRID:SCR_018257) (^[22]) se utilizó para la visualización de imágenes y la anotación manual de las regiones de interés.

Perfilado de citocinas

Los niveles de citocinas plasmáticas se cuantificaron utilizando un ensayo Luminex de 30 plex (MilliporeSigma, HCYTMAG-60K-PX30) en el Centro de City of Hope. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando la tecnología xMAP y se analizaron en un sistema Luminex 200 (RRID:SCR_018025).

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron en R v4.4.3 (RRID:SCR001905) y GraphPad Prism v10 (RRID:SCR002798). Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando las pruebas t de Student no pareadas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, según corresponda. Los umbrales de significación fueron: *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001.

Aprobación del estudio

Todos los bioespecímenes se obtuvieron de participantes que proporcionaron un consentimiento informado por escrito en el marco de un protocolo IRB aprobado en City of Hope (IRB #19417).

Inclusión de pacientes y recogida de muestras

Un total de 29 pacientes con mCCR MSS fueron incluidos en este estudio en el marco del ensayo clínico de City of Hope IRB #19417 (NCT04362839). Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito antes de participar. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los estándares éticos descritos en el Informe Belmont y la Declaración de Helsinki. Los pacientes elegibles tenían un mCCR MSS confirmado histológicamente y eran candidatos adecuados para la terapia combinada con regorafenib, ipilimumab y nivolumab.

Las biopsias tumorales se recogieron al inicio y en la semana 4 después del inicio del tratamiento. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para la secuenciación de ARN o se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina (FFPE) para la imagenología de inmunofluorescencia multiplexada (mIF). La sangre periférica se recogió al inicio, en la semana 4 y en la semana 8. El plasma se almacenó a −80 °C y las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante centrifugación de densidad con Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich, GE17-1440-02) y se crioconservaron en nitrógeno líquido para análisis posteriores.

Extracción y secuenciación de ARN

El ARN total se extrajo de las biopsias tumorales congeladas y de las células T CD4⁺ y CD8⁺ no naïvas clasificadas mediante citometría de flujo (FACS) utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, 74104) y el kit RNeasy Micro (Qiagen, 74004), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada muestra de secuenciación de ARN representa un réplica biológica independiente derivada de una biopsia de un paciente individual o de una población de células clasificadas.

Las bibliotecas y la secuenciación se realizaron en Novogene como un proyecto de servicio. Las bibliotecas de ARN de biopsias tumorales se generaron utilizando un flujo de trabajo de agotamiento del ARNr, mientras que el ARN del ARN derivado de células T clasificadas se preparó como bibliotecas de ARNm seleccionadas con poli(A). Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina NovaSeq 6000 (RRID:SCR_016387) para producir lecturas emparejadas de 150 pb, con una profundidad objetivo de >30 millones de pares de lecturas por muestra.

Los datos de secuenciación sin procesar se sometieron a un control de calidad estándar por parte del proveedor de secuenciación. Las lecturas que superaron una puntuación de calidad mínima de Q30 se conservaron para el análisis posterior. El recorte de adaptadores y la eliminación de bases de baja calidad se realizaron como parte del flujo de trabajo de preprocesamiento estándar del proveedor antes de la alineación.

Los datos brutos de RNA-seq se procesaron utilizando la plataforma en la nube Partek Flow. Las lecturas se alinearon al genoma de referencia humano GRCh38/hg38 utilizando STAR v2.7.8a. La cuantificación de la expresión génica se realizó utilizando HTSeq v2.0.3, y el análisis de la expresión génica diferencial se realizó utilizando DESeq2 v1.30.1. Los genes con un valor p ajustado (corrección de Benjamini-Hochberg) inferior a 0,05 se consideraron significativos. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando el software GSEA v4.1.0 del Broad Institute (RRID:SCR003199) con los conjuntos de genes hallmark y KEGG de MSigDB. La deconvolución de tipos celulares a partir de RNA-seq a granel se realizó con xCell (RRID:SCR026446) (^[18]). Los subtipos moleculares de consenso (CMS) se asignaron utilizando el paquete R CMSclassifier (v1.0.0) (^[19]). El análisis del repertorio de receptores de células T (TCR) se realizó con TRUST4 v1.0.12 (RRID:SCR026162) (^[20]), y las métricas de diversidad de clonalidad se calcularon utilizando el paquete R Immunarch v0.9.1 (RRID:SCR023089).

Citometría de flujo

Las PBMCs se tiñeron utilizando cuatro paneles de anticuerpos (Tabla suplementaria 4). Para la tinción de superficie, las células se incubaron con anticuerpos conjugados con fluorocromos. La tinción intracelular de citocinas se realizó después de la estimulación con PMA (50 ng/mL, Sigma-Aldrich, P8139) e ionomicina (1 μg/mL, Sigma-Aldrich, I0634) en presencia de Brefeldin A (BioLegend, 420601) durante 4 horas a 37 °C. Las células se fijaron, se permeabilizaron utilizando el kit de tinción de Foxp3/factor de transcripción (Invitrogen, 00-5523-00) y se tiñeron para los marcadores intracelulares.

La tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) se realizó utilizando el kit de detección SPiDER-βGal (Dojindo, SG04) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se pretrataron con Bafilomicina A1 en un medio completo durante 1,5 horas a 37 °C, seguido de la incubación con la solución de trabajo SPiDER-βGal durante 30 minutos antes de la fijación y la tinción de anticuerpos de superficie.

Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo espectral Cytek Aurora (RRID:SCR019826) y se analizaron utilizando SpectroFlo v2.2 y FlowJo v10.9 (RRID:SCR008520). Se utilizó una estandarización de la segmentación para identificar los subconjuntos y estados de activación inmunitarios (Figura suplementaria 2-5).

Imagen de inmunofluorescencia multiplexada

La inmunofluorescencia multiplexada (mIF) se realizó en secciones de tumores FFPE utilizando la plataforma Akoya PhenoCycler CO-Detection by indEXing (CODEX) (RRID:SCR_023773) (^[21]). Se aplicó un panel personalizado de 50 anticuerpos dirigidos a marcadores inmunitarios y del estroma (Tabla suplementaria 5). La tinción se realizó según el protocolo del fabricante.

La imagen se realizó en el sistema PhenoCycler-Fusion (Akoya Biosciences), que integra un microscopio de fluorescencia de campo amplio, un escenario automatizado y un detector sCMOS, utilizando un objetivo de 20×. La adquisición de imágenes se realizó utilizando el software propietario del instrumento con ajustes de exposición estandarizados en todas las muestras. QuPath v0.5 (RRID:SCR_018257) (^[22]) se utilizó para la visualización de imágenes y la anotación manual de las regiones de interés.

Perfilado de citocinas

Los niveles de citocinas plasmáticas se cuantificaron utilizando un ensayo Luminex de 30 plex (MilliporeSigma, HCYTMAG-60K-PX30) en el Centro de City of Hope. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando la tecnología xMAP y se analizaron en un sistema Luminex 200 (RRID:SCR_018025).

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron en R v4.4.3 (RRID:SCR001905) y GraphPad Prism v10 (RRID:SCR002798). Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando las pruebas t de Student no pareadas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, según corresponda. Los umbrales de significación fueron: *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001.

Aprobación del estudio

Todos los biospecímenes se obtuvieron de participantes que proporcionaron consentimiento informado por escrito bajo un protocolo aprobado por el IRB en City of Hope (IRB #19417).

Resultados

Los resultados del ensayo clínico revelan variabilidad en las respuestas de los pacientes al tratamiento RIN

La eficacia clínica del régimen RIN se evaluó en una cohorte de 29 pacientes con CRC metastásico MSS a la dosis recomendada en la fase II. Los detalles del tratamiento del estudio y los resultados clínicos se han informado previamente (^[9], ^[10]). Durante un período de seguimiento de tres años, observamos un beneficio clínico duradero en pacientes sin metástasis hepáticas, con una mediana de SLP de 5 meses y una mediana de SO de 27,5 meses. Estos pacientes generalmente tuvieron resultados más favorables, incluido un 36,4 % de respuesta parcial (RP) y un 31,8 % de enfermedad estable (EE), según los criterios RECIST 1.1 (Figura 1A). En contraste, no se observaron respuestas en pacientes con metástasis hepáticas, entre los cuales el 57,1 % experimentó progresión de la enfermedad (PD) y el 42,9 % logró EE, lo que destaca una importante asociación entre el sitio de metástasis y la eficacia terapéutica (Figura 1A).

Se realizaron análisis correlativos exhaustivos utilizando biopsias tumorales y muestras de sangre periférica recolectadas durante el tratamiento. Las biopsias tumorales de 8 pacientes se obtuvieron antes del tratamiento y/o en la semana 4, cuando estuvieron disponibles y fueron de calidad suficiente. Estas muestras se analizaron mediante secuenciación de ARN de toda la transcripción e imagen multiplexada (CODEX). Las muestras de sangre periférica de los 29 pacientes se recolectaron en el momento inicial, en la semana 4 y en la semana 8, y se utilizaron para la citometría de flujo y los ensayos de citocinas Luminex. Además, las células T periféricas clasificadas de pacientes seleccionados se sometieron a análisis transcripcional y perfilado de receptores de células T (TCR). En conjunto, estos análisis multimodales permitieron la caracterización tanto del TME como de la inmunidad sistémica asociada con los resultados clínicos (Figura 1B).

Para permitir un análisis correlativo interpretable, los pacientes se estratificaron en "buenos" y "malos" respondedores. Los pacientes que lograron una supervivencia libre de progresión (SLP) ≥ 6 meses o una RP confirmada se clasificaron como buenos respondedores, mientras que todos los demás se clasificaron como malos respondedores (Tabla suplementaria 1). Esta definición se eligió para reflejar un beneficio clínicamente relevante, que captura tanto el control duradero de la enfermedad como la regresión objetiva del tumor.

El microambiente tumoral basal predice la respuesta al tratamiento RIN

Para investigar cómo el TME influye en la respuesta al RIN, realizamos secuenciación de ARN en biopsias tumorales de ocho pacientes con diferentes resultados clínicos. El análisis de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos t (t-SNE) mostró un estrecho agrupamiento de las biopsias basales y de la semana 4 del mismo individuo, pero una clara separación entre los buenos y los malos respondedores, lo que sugiere heterogeneidad del TME entre pacientes incluso antes del tratamiento (Figura 2A).

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de las vías KEGG mostró que los tumores de los buenos respondedores se enriquecieron en vías relacionadas con la regulación del ciclo celular, la replicación y la reparación del ADN y la detección de ADN citosólico. Estos hallazgos se respaldaron con una mayor expresión de genes asociados con la proliferación, como MKI67, CDK1, CDC20 y CCNB1 (Figura 2B-E, Tabla suplementaria 2). También se elevaron varios genes inmunomoduladores en los buenos respondedores. Estos incluyeron CXCL11, una quimiocina inducida por IFN de tipo I/II involucrada en el reclutamiento de células T efectoras (^[23]); NOS2, que codifica la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y media la citotoxicidad inducida por IFN (^[24]); y DMBT1, una proteína similar a un receptor de eliminación que participa en la función de la barrera epitelial y la activación inmunitaria (^[25]) (Figura 2C). En línea con esto, dos pacientes con SLP prolongada tenían subtipos moleculares de consenso del cáncer colorrectal (CMS) con una inmunidad permisiva: Pt10 (CMS3, subtipo metabólico) y Pt7 (CMS2, subtipo canónico) (^[19]). En conjunto, estos datos sugieren que el estrés proliferativo y la señalización de la detección de ADN citosólico contribuyen a un TME más inmunogénico y sensible al tratamiento en los buenos respondedores.

En contraste, los malos respondedores, cuyas biopsias se tomaron todas de metástasis hepáticas, exhibieron un enriquecimiento significativo de las vías relacionadas con las cascadas de complemento y coagulación, el metabolismo de xenobióticos, el metabolismo de aminoácidos y el procesamiento de lípidos (Figura 2B; Figura suplementaria 1A). Los genes como C3, C4A/B, C5, SERPING1, SERPIND1, CYP2E1, FMO3 y ACSL1 se elevaron notablemente. Estas vías están relacionadas con la inflamación mediada por el complemento, la desintoxicación metabólica y la adaptación al entorno hepático rico en nutrientes, todo lo cual se ha relacionado con la promoción de la evasión inmunitaria y la resistencia al tratamiento (^[26], ^[27]).

El análisis de la imagen mIF proporcionó apoyo para los hallazgos transcriptómicos. Una biopsia tumoral basal de un buen respondedor representativo con la SLP más larga demostró una extensa tinción nuclear de Ki-67 colocalizada con pancitoqueratina, lo que indica una actividad proliferativa de las células tumorales (Figura 2F). Este tumor también exhibió una fuerte expresión de STING dentro de las células epiteliales tumorales, lo que sugiere la activación de la vía cGAS-STING. La proliferación elevada puede provocar estrés de replicación y acumulación de ADN citosólico a través de la ruptura del ADN o la formación de micronúcleos. La presencia de ADN citosólico puede activar la señalización cGAS-STING, lo que promueve la producción de interferón de tipo I, mejora la presentación de antígenos y facilita el reclutamiento de linfocitos citotóxicos (^[28]). En contraste, un mal respondedor representativo mostró una menor tinción de Ki-67 en las células tumorales y la expresión de STING restringida a las células inmunitarias CD45⁺. Coherente con estas observaciones, la deconvolución de subconjuntos inmunitarios y el GSEA de los datos transcriptómicos revelaron que los pacientes con SLP prolongada exhibieron una mayor infiltración linfoide y un enriquecimiento de las vías de activación de los linfocitos, mientras que los pacientes con progresión temprana mostraron perfiles inmunitarios con predominio de mieloides (Figura suplementaria 1B-E). En conjunto, estos hallazgos transcriptómicos e histológicos integrados sugieren que un TME altamente proliferativo, activado por el interferón, impulsado potencialmente por el estrés de replicación y la señalización de la detección de ADN citosólico, favorece las buenas respuestas al tratamiento RIN. En contraste, los tumores de los malos respondedores, particularmente aquellos en el hígado, exhibieron activación del complemento y regulación de las vías metabólicas asociadas con la evasión inmunitaria y la resistencia terapéutica.

Los biomarcadores inmunitarios periféricos predicen la respuesta al tratamiento RIN

Realizamos un perfil completo de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de pacientes sometidos a tratamiento RIN utilizando múltiples paneles de citometría de flujo de alta parametrización que cuantifican la composición y el fenotipo de los subconjuntos de células inmunitarias (Paneles 1 y 2), el potencial de producción de citocinas (Panel 3) y los marcadores de agotamiento y senescencia inmunitaria (Panel 4) (Figura 3A, Figura suplementaria 2-5, Tabla suplementaria 4). Este análisis reveló distintas firmas inmunitarias basales asociadas con los resultados clínicos.

Los buenos respondedores exhibieron una mayor proporción de células T CD4/CD8 y un aumento de las frecuencias de las células dendríticas de tipo 1 y tipo 2 (DC1 y DC2) (Figura 3B-C; Figura suplementaria 6A). En contraste, los pacientes con malos resultados tuvieron un mayor número total de células T CD8⁺ y mayores proporciones de subconjuntos de memoria efectora (TEM) en los compartimentos CD4⁺ y CD8⁺ (Figura 3D), incluidos mayores frecuencias de subconjuntos citotóxicos Tc2 y Tc17 (Figura 3B-C). Los subconjuntos de monocitos no difirieron significativamente entre los dos grupos.

Para evaluar la capacidad funcional, examinamos la expresión intracelular de citocinas tras la estimulación ex vivo. Las células T CD8⁺ de los pacientes con buena respuesta presentaban una mayor frecuencia de células IFN-γ⁺, mientras que las de los pacientes con mala respuesta mostraban proporciones aumentadas de células productoras de citocinas tipo 2 (IL-4, IL-13) y tipo 3 (IL-22) tanto en los compartimentos CD4⁺ como CD8⁺ (Figura 3E–F; Figura suplementaria 6B). Los pacientes con mala respuesta también presentaban una mayor expresión de receptores de puntos de control inmunitario (LAG-3, TIM-3) y el marcador de agotamiento asociado CD38, lo que sugiere un fenotipo de células T más disfuncional (Figura 3E, Figura suplementaria 6B). Esto se acompañó de un aumento del porcentaje de células Ki-67⁺ y la tinción de γH2AX en los linfocitos (Figura 3G–H), particularmente en los pacientes con enfermedad progresiva (Figura suplementaria 6B–D), lo que indica una mayor proliferación y daño previo del ADN antes del tratamiento. Los marcadores de activación mieloide no diferían significativamente entre los grupos (Figura suplementaria 7A). Sin embargo, el perfil de citocinas plasmáticas reveló niveles elevados de receptor soluble de IL-2 (sIL-2R) en los pacientes con mala respuesta, lo que refleja una mayor inflamación sistémica (Figuras suplementarias 8).

Para analizar más a fondo los fenotipos de las células T, realizamos un secuenciamiento masivo de ARN en células T CD4⁺ y CD8⁺ no naïvas clasificadas (Figura suplementaria 9). Las células T CD4⁺ de los pacientes con buena respuesta presentaban una mayor concentración de vías metabólicas lipídicas, lo que es consistente con un fenotipo similar al de la memoria (^[29]). En contraste, las células T de los pacientes con mala respuesta mostraban una mayor regulación de las vías de respuesta a patógenos (p. ej., bacterianas, virales y parasitarias) y programas relacionados con el estrés, como la ferroptosis y la necroptosis, lo que indica una inflamación crónica y una alteración de la homeostasis inmunitaria.

En conjunto, estos resultados indican que los pacientes que responden a la terapia con RIN presentan un perfil inmunitario periférico basal caracterizado por una mayor relación CD4/CD8 de células T, un aumento de las células dendríticas y una preservación de las respuestas de citocinas tipo 1. Por el contrario, los pacientes con mala respuesta presentan una diferenciación efectora sesgada, una polarización de citocinas tipo 2/3 y características de agotamiento de las células T y daño del ADN.

La terapia con RIN induce la activación inmunitaria en el microambiente tumoral (TME) de los pacientes con buena respuesta

Para evaluar cómo la terapia con RIN modula el TME, comparamos los perfiles transcripcionales de biopsias tumorales pareadas, pretratamiento y a las 4 semanas después del tratamiento (Tabla suplementaria 3). Los tumores pretratamiento presentaban una mayor expresión de genes implicados en procesos metabólicos, incluidos los marcadores del metabolismo de xenobióticos (AKR1C2), la glucólisis (ENO3) y la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP3). Los genes asociados con la progresión y la invasión tumoral, como MMP11, NCAM2, FN1 y NGFR, también se sobreexpresaban en la línea de base (Figura 4A–B).

En contraste, las biopsias postratamiento mostraron un enriquecimiento significativo de las vías relacionadas con la inmunidad, incluido el procesamiento y la presentación de antígenos, la señalización del receptor de células T, la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales y las interacciones citocina-receptor de citocinas (Figura 4A). La expresión de los marcadores de células T (CD3E, CD8A, TRAC), las moléculas de señalización (ZAP70, LCK, ITK) y las quimiocinas (CXCL9, CXCL13, CCL5) aumentó notablemente, junto con los genes efectores como GZMA, lo que indica una mayor activación y reclutamiento inmunitario (Figura 4B).

El análisis de muestras pareadas reveló que, aunque los perfiles inmunitarios de la línea de base no diferían sustancialmente entre los pacientes con buena y mala respuesta, los dos pacientes con respuesta parcial (Pt25 y Pt10) mostraron los mayores aumentos postratamiento en la expresión de genes relacionados con la inmunidad (Figura 4C–D). Estos cambios transcripcionales se acompañaron de un aumento de la infiltración de células T CD4⁺ y CD8⁺, así como de macrófagos CD68⁺ en los tumores postratamiento. En contraste, los tumores de los pacientes con mala respuesta mostraron cambios mínimos en la expresión de genes inmunitarios o la infiltración de células inmunitarias (Figura 4E).

Aunque está limitado por el tamaño de la muestra, estos hallazgos sugieren que la terapia con RIN puede mejorar el compromiso inmunitario dentro del TME de los pacientes con buena respuesta. Este cambio se caracterizó por un enriquecimiento transcripcional de las vías de procesamiento/presentación de antígenos y una mayor expresión de quimiocinas relacionadas con el reclutamiento de células inmunitarias, lo que podría contribuir al beneficio terapéutico.

La modulación dinámica de la inmunidad periférica se correlaciona con la respuesta terapéutica

Para dilucidar cómo la terapia con RIN modifica la inmunidad sistémica en los pacientes con CRC metastásico MSS, analizamos los cambios longitudinales en las células inmunitarias periféricas comparando las PBMC pretratamiento con las muestras recogidas después del primer (4 semanas) y el segundo (8 semanas) ciclo de tratamiento. Los pacientes con buena respuesta mantuvieron constantemente una mayor relación CD4/CD8 de células T, mientras que los pacientes con mala respuesta mostraron niveles persistentemente elevados de células T CD8⁺ en todos los puntos temporales (Figura 5A). Al comparar los cambios porcentuales con respecto a la línea de base, los pacientes con mala respuesta mostraron una expansión más pronunciada de los linfocitos, particularmente los subconjuntos de células T CD8⁺ y células T asesinas naturales (NKT), en la semana 4, mientras que los pacientes con buena respuesta mostraron cambios más moderados en la composición inmunitaria a lo largo del tiempo (Figura 5B–E, Figura suplementaria 10).

El análisis de los subconjuntos productores de citocinas y los marcadores de activación reveló respuestas divergentes (Figura 5F–H, Figuras suplementarias 11 y 12). Los pacientes con mala respuesta mostraron un perfil Th1 más fuerte, con frecuencias aumentadas de células T IFN-γ⁺ y TNF-α⁺ (Figura 5G). Por el contrario, los pacientes con buena respuesta mostraron una inducción Th1 más leve, pero mayores aumentos en las células T IL-4⁺ e IL-13⁺ (Figura 5H) y una menor reducción en los marcadores de agotamiento PD-1, CTLA-4 y TIM-3 (Figura 5I). Los marcadores de activación mieloide, incluidos CD83 y CD86, se regularon al alza desde la semana 4 hasta la semana 8 en los pacientes con buena respuesta (Figura suplementaria 13A–B). Estas dinámicas contrastantes probablemente reflejan un estado proinflamatorio preexistente en los pacientes con mala respuesta que favorece la activación rápida de los efectores, mientras que los pacientes con buena respuesta pueden iniciar una respuesta inmunitaria más atenuada.

A pesar de su temprana activación de linfocitos y la inducción de citocinas Th1, los pacientes con mala respuesta mostraron una expansión o reestructuración limitada del repertorio de TCR. En contraste, algunos pacientes con buena respuesta mostraron una mayor expresión de Ki-67 en las células T CD8⁺ naïvas, lo que sugiere un nuevo reclutamiento o proliferación de células T (Figura 5J). Coherente con este hallazgo, estos pacientes también mostraron una expansión significativa de los TCR de baja frecuencia previa dentro de las células T CD8⁺ no naïvas, pero no en las células T CD4⁺ (Figura 5K y Figuras suplementarias 14 y 15). En conjunto, estas observaciones sugieren una posible expansión selectiva de los clones de células T CD8⁺ en los pacientes con buena respuesta, lo que puede contribuir a una mayor inmunidad antitumoral.

El perfil transcripcional enfatizó aún más estas diferencias. Solo los pacientes con buena respuesta mostraron una mayor regulación de las vías de activación inmunitaria en las células T CD4⁺ y CD8⁺ durante el tratamiento, incluidas las vías implicadas en la defensa del huésped, la presentación de antígenos y la diferenciación de las células T (Figura suplementaria 16). Estas firmas estuvieron ausentes en los pacientes con mala respuesta, lo que subraya su compromiso inmunitario adaptativo limitado y su menor beneficio clínico.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que la terapia con RIN provoca distintas respuestas inmunitarias periféricas en los pacientes con buena y mala respuesta. Los pacientes con mala respuesta muestran una oleada temprana de linfocitos y la producción de citocinas Th1 sin una expansión sostenida de las células T o la activación transcripcional. En contraste, los pacientes con buena respuesta muestran una expansión selectiva de los clones de células T CD8⁺ y la activación de programas inmunitarios en los compartimentos CD4⁺ y CD8⁺, lo que puede sustentar la inmunidad antitumoral en los pacientes que se benefician de la terapia con RIN.

La senescencia inmunitaria en las metástasis hepáticas se correlaciona con una mala respuesta a la terapia con RIN

Investigamos más a fondo los mecanismos inmunológicos subyacentes a la mala respuesta asociada con las metástasis hepáticas a la terapia con RIN en los pacientes con CRC metastásico MSS comparando los perfiles inmunitarios periféricos de los pacientes con metástasis hepáticas con los de los pacientes con metástasis pulmonares. De manera similar a las diferencias observadas entre los pacientes con buena y mala respuesta, los pacientes con metástasis hepáticas mostraron una relación CD4/CD8 de células T más baja que se debió no a una pérdida de células T CD4⁺, sino más bien a una acumulación de células T CD8⁺, particularmente los subconjuntos de memoria efectora (TEM) y la memoria efectora terminal que reexpresan CD45RA (TEMRA) (Figura 6A–C). Este desequilibrio en las relaciones CD4/CD8 persistió durante el tratamiento con RIN, lo que sugiere que el entorno inmunitario senescente asociado con las metástasis hepáticas sigue siendo resistente a la modulación a corto plazo mediada por RIN (Figura 6A, Figura suplementaria 17A–B).

Se sabe que las células TEMRA presentan un fenotipo senescente (^[30]), lo que sugiere un vínculo entre la activación inmunitaria crónica y la carga tumoral hepática persistente en los pacientes con metástasis hepáticas. Un examen más detallado de los marcadores de senescencia reveló que las células T CD4⁺ en los pacientes con metástasis hepáticas exhibieron más características de senescencia en comparación con los pacientes con metástasis pulmonares (^[31]–^[33]). Estos incluyeron una expresión reducida de las moléculas coestimuladoras CD27 y CD28, niveles elevados de CD57 y β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) y una mayor granzima K. Además, estas células mostraron una mayor proporción de subconjuntos IFN-γ⁺ y una mayor regulación de los marcadores de agotamiento, como PD-1 y LAG-3, en todos los puntos temporales (Figura 6D–F, Figura suplementaria 17C, D). Las células T CD8⁺ mostraron menos características de senescencia asociadas con las metástasis hepáticas en general, pero sí expresaron una mayor granzima K y menos CD28 en comparación con los pacientes con metástasis pulmonares. En particular, los niveles de γH2AX, el marcador de daño del ADN, no difirieron significativamente entre los pacientes con metástasis hepáticas y pulmonares (Figura 6D), en contraste con los niveles elevados de γH2AX que se encontraron en los pacientes con mala respuesta (Figura 3E, Figura suplementaria 6B). Esto sugiere que, en el contexto de las metástasis hepáticas, la disfunción inmunitaria está impulsada más por mecanismos asociados con la senescencia que por mecanismos relacionados con el daño del ADN.

El perfil transcripcional respaldó esta noción. Antes del tratamiento, las células T CD4⁺ de los pacientes con metástasis hepáticas exhibieron una mayor expresión de genes relacionados con la apoptosis, la senescencia, la autofagia y la señalización de quimiocinas, lo que refleja un estado inmunitario hiperactivado pero disfuncional (Figura 6G–H). Las células T CD8⁺ mostraron un enriquecimiento de las vías metabólicas e inflamatorias, lo que es consistente con un fenotipo agotado pero metabólicamente activo (Figura 6H). Después del tratamiento con RIN, tanto las células T CD4⁺ como CD8⁺ de los pacientes con metástasis hepáticas mostraron una activación metabólica persistente y una mayor regulación de las vías biosintéticas (Figura suplementaria 18A).

En contraste, los pacientes sin metástasis hepáticas mostraron una remodelación inmunitaria más favorable después del tratamiento con RIN. Sus células T regularon al alza las vías asociadas con la regulación inmunitaria, incluido el TCR de señalización, la diferenciación de las células T y la señalización del punto de control PD-1/PD-L1 (Figura suplementaria 18B), lo que indica un cambio hacia un estado inmunitario más activado. En particular, la vía KEGG para la señalización del punto de control PD-1/PD-L1 se reguló al alza en la semana 4 incluso en los pacientes sin metástasis hepáticas que experimentaron malos resultados (Figura 6I–J), lo que destaca la capacidad única del hígado para atenuar la capacidad de respuesta de las células T periféricas.

En conjunto, estos hallazgos indican que la senescencia inmunitaria y el estrés metabólico persistente caracterizan el panorama de las células T en los pacientes con metástasis hepáticas, lo que contribuye a la resistencia terapéutica. En contraste, los pacientes sin compromiso hepático exhiben una mayor plasticidad y capacidad de respuesta inmunitaria. Estas observaciones subrayan la barrera inmunológica que plantean las metástasis hepáticas y respaldan la necesidad de estrategias que se dirijan a la disfunción inmunitaria en este subgrupo de pacientes.

Los resultados de los ensayos clínicos revelan la variabilidad en las respuestas de los pacientes a la terapia con RIN

La eficacia clínica del régimen RIN se evaluó en una cohorte de 29 pacientes con cRPM MSS a la dosis recomendada para la fase II. Los detalles del tratamiento del estudio y los resultados clínicos se han informado previamente (^[9], ^[10]). Durante un período de seguimiento de tres años, observamos un beneficio clínico duradero en pacientes sin metástasis hepáticas, con una mediana de SLP de 5 meses y una mediana de SO de 27,5 meses. Estos pacientes generalmente presentaron resultados más favorables, incluyendo una tasa de respuesta parcial (RP) del 36,4% y una tasa de enfermedad estable (EE) del 31,8%, según los criterios RECIST 1.1 (Figura 1A). En contraste, no se observaron respuestas en pacientes con metástasis hepáticas, entre los cuales el 57,1% experimentó enfermedad progresiva (EP) y el 42,9% logró EE, lo que destaca una importante asociación entre el sitio metastásico y la eficacia terapéutica (Figura 1A).

Se realizaron análisis correlativos exhaustivos utilizando biopsias tumorales y muestras de sangre periférica recolectadas a lo largo del tratamiento. Se obtuvieron biopsias tumorales de 8 pacientes al inicio del tratamiento y/o en la semana 4, cuando estuvo disponible y fue de calidad suficiente. Estas muestras se analizaron mediante secuenciación de ARN de todo el transcriptoma e imagenología multiplexada (CODEX). Se recolectaron muestras de sangre periférica de los 29 pacientes al inicio, en la semana 4 y en la semana 8, y se utilizaron para citometría de flujo y ensayos de citocinas Luminex. Además, las células T periféricas seleccionadas de pacientes seleccionados se sometieron a análisis transcripcional y perfilamiento del receptor de células T (TCR). En conjunto, estos análisis multimodales permitieron la caracterización tanto del microambiente tumoral (TME) como de la inmunidad sistémica asociada con los resultados clínicos (Figura 1B).

Para permitir un análisis correlativo interpretable, los pacientes se estratificaron en "buenos" y "malos" respondedores. Los pacientes que lograron una supervivencia libre de progresión (SLP) ≥ 6 meses o una RP confirmada se clasificaron como buenos respondedores, mientras que todos los demás se clasificaron como malos respondedores (Tabla suplementaria 1). Esta definición se eligió para reflejar un beneficio clínicamente relevante, capturando tanto el control duradero de la enfermedad como la regresión objetiva del tumor.

El microambiente tumoral basal predice la respuesta a la terapia RIN

Para investigar cómo el TME influye en la respuesta a RIN, realizamos secuenciación de ARN en biopsias tumorales de ocho pacientes con diferentes resultados clínicos. El análisis de incrustación estocástica de vecinos distribuidos en t (t-SNE) mostró un agrupamiento estrecho de las biopsias basales y de la semana 4 emparejadas del mismo individuo, pero una separación distinta entre buenos y malos respondedores, lo que sugiere heterogeneidad del TME entre pacientes incluso antes del tratamiento (Figura 2A).

El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de las vías KEGG mostró que los tumores de los buenos respondedores se enriquecieron en vías relacionadas con la regulación del ciclo celular, la replicación y reparación del ADN y la detección de ADN citosólico. Estos hallazgos fueron respaldados por una mayor expresión de genes asociados con la proliferación, como MKI67, CDK1, CDC20 y CCNB1 (Figura 2B–E, Tabla suplementaria 2). También se observó una mayor expresión de varios genes inmunomoduladores en los buenos respondedores. Estos incluyeron CXCL11, una quimiocina inducida por el IFN tipo I/II involucrada en el reclutamiento de células T efectoras (^[23]); NOS2, que codifica la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y media la citotoxicidad impulsada por el IFN (^[24]); y DMBT1, una proteína similar a un receptor de eliminación involucrada en la función de la barrera epitelial y la activación inmune (^[25]) (Figura 2C). En línea con esto, dos pacientes con SLP prolongada tenían subtipos moleculares consensuados de cáncer colorrectal (CMS) con una respuesta inmune permisiva: Pt10 (CMS3, subtipo metabólico) y Pt7 (CMS2, subtipo canónico) (^[19]). En conjunto, estos datos sugieren que el estrés proliferativo y la señalización de la detección de ADN citosólico contribuyen a un TME más inmunogénico y sensible al tratamiento en los buenos respondedores.

En contraste, los malos respondedores, cuyas biopsias se tomaron todas de metástasis hepáticas, exhibieron un enriquecimiento significativo de vías relacionadas con las cascadas de complemento y coagulación, el metabolismo de xenobióticos, el metabolismo de aminoácidos y el procesamiento de lípidos (Figura 2B; Figura suplementaria 1A). Los genes como C3, C4A/B, C5, SERPING1, SERPIND1, CYP2E1, FMO3 y ACSL1 se elevaron notablemente. Estas vías están relacionadas con la inflamación mediada por el complemento, la desintoxicación metabólica y la adaptación al entorno hepático rico en nutrientes, todo lo cual se ha relacionado con la promoción de la evasión inmune y la resistencia a la terapia (^[26], ^[27]).

El análisis de inmunofluorescencia tisular múltiple (mIF) proporcionó apoyo para los hallazgos del transcriptoma. Un tumor basal de un buen respondedor representativo con la SLP más larga demostró una extensa tinción nuclear de Ki-67 colocalizada con pancitoqueratina, lo que indica una proliferación activa de las células tumorales (Figura 2F). Este tumor también exhibió una fuerte expresión de STING dentro de las células epiteliales tumorales, lo que sugiere la activación de la vía cGAS-STING. La mayor proliferación puede resultar en estrés de replicación y acumulación de ADN citosólico a través de la ruptura del ADN o la formación de micronúcleos. La presencia de ADN citosólico puede activar la señalización cGAS-STING, lo que promueve la producción de interferón tipo I, mejora la presentación de antígenos y facilita el reclutamiento de linfocitos citotóxicos (^[28]). En contraste, un mal respondedor representativo mostró una menor tinción de Ki-67 en las células tumorales y la expresión de STING restringida a las células inmunes CD45⁺. Coherente con estas observaciones, la deconvolución de subconjuntos inmunes y el GSEA de los datos del transcriptoma revelaron que los pacientes con SLP prolongada exhibieron una mayor infiltración linfoide y un enriquecimiento de las vías de activación de los linfocitos, mientras que los pacientes con progresión temprana mostraron perfiles inmunes con predominio de mieloides (Figura suplementaria 1B–E). En conjunto, estos hallazgos transcriptómicos e histológicos integrados sugieren que un TME altamente proliferativo, activado por el interferón, impulsado potencialmente por el estrés de replicación y la señalización de la detección de ADN citosólico, favorece una buena respuesta a la terapia RIN. En contraste, los tumores de los malos respondedores, particularmente aquellos en el hígado, exhibieron activación del complemento y regulación al alza de las vías metabólicas asociadas con la evasión inmune y la resistencia terapéutica.

Los biomarcadores inmunes periféricos predicen la respuesta a la terapia RIN

Realizamos un perfil completo de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) pretratamiento de los pacientes que se sometieron a terapia RIN utilizando múltiples paneles de citometría de flujo de alta parametrización que cuantifican la composición y el fenotipo de los subconjuntos de células inmunes (Paneles 1 y 2), el potencial de producción de citocinas (Panel 3) y los marcadores de agotamiento y senescencia inmunes (Panel 4) (Figura 3A, Figura suplementaria 2–5, Tabla suplementaria 4). Este análisis reveló distintas firmas inmunes basales asociadas con los resultados clínicos.

Los buenos respondedores exhibieron una mayor relación CD4/CD8 de células T y un aumento de las frecuencias de las células dendríticas tipo 1 y tipo 2 (DC1 y DC2) (Figura 3B–C; Figura suplementaria 6A). En contraste, los pacientes con malos resultados tuvieron un mayor número total de células T CD8⁺ y mayores proporciones de subconjuntos de memoria efectora (TEM) en los compartimentos CD4⁺ y CD8⁺ (Figura 3D), incluyendo mayores frecuencias de subconjuntos citotóxicos Tc2 y Tc17 (Figura 3B–C). Los subconjuntos de monocitos no difirieron significativamente entre los dos grupos.

Para evaluar la capacidad funcional, examinamos la expresión de citocinas intracelulares después de la estimulación ex vivo. Las células T CD8⁺ de los buenos respondedores tuvieron una mayor frecuencia de células IFN-γ⁺, mientras que las de los malos respondedores mostraron mayores proporciones de células productoras de citocinas tipo 2 (IL-4, IL-13) y tipo 3 (IL-22) dentro de los compartimentos CD4⁺ y CD8⁺ (Figura 3E–F; Figura suplementaria 6B). Los malos respondedores también exhibieron una mayor expresión de los receptores de control inmunitario (LAG-3, TIM-3) y el marcador de agotamiento asociado CD38, lo que sugiere un fenotipo de células T más disfuncional (Figura 3E, Figura suplementaria 6B). Esto se acompañó de un aumento del porcentaje de células Ki-67⁺ y tinción γH2AX en los linfocitos (Figura 3G–H), particularmente entre los pacientes con enfermedad progresiva (Figura suplementaria 6B–D), lo que indica una mayor proliferación y daño previo del ADN antes del tratamiento. Los marcadores de activación de mieloides no difirieron significativamente entre los grupos (Figura suplementaria 7A). Sin embargo, el perfil de citocinas plasmáticas reveló niveles elevados de receptor soluble de IL-2 (sIL-2R) en los malos respondedores, lo que refleja una mayor inflamación sistémica (Figuras suplementarias 8).

Para diseccionar aún más los fenotipos de las células T, realizamos secuenciación de ARN a granel en células T CD4⁺ y CD8⁺ no naïvas clasificadas (Figura suplementaria 9). Las células T CD4⁺ de los buenos respondedores se enriquecieron en vías metabólicas de lípidos, lo que es consistente con un fenotipo similar a la memoria (^[29]). En contraste, las células T de los malos respondedores mostraron una regulación al alza de las vías de respuesta a patógenos (por ejemplo, bacterianas, virales y parasitarias) y programas relacionados con el estrés, como la ferroptosis y la necroptosis, lo que indica inflamación crónica y alteración de la homeostasis inmune.

En conjunto, estos resultados indican que los pacientes que responden a la terapia RIN tienen un perfil inmune periférico basal caracterizado por una mayor relación CD4/CD8 de células T, un aumento de las células dendríticas y una preservación de las respuestas de citocinas tipo 1. Por el contrario, los malos respondedores exhiben una diferenciación efectora sesgada, polarización de citocinas tipo 2/3 y características de agotamiento de las células T y daño del ADN.

La terapia RIN induce la activación inmune en el TME de los buenos respondedores

Para evaluar cómo la terapia RIN modula el TME, comparamos los perfiles transcripcionales de las biopsias tumorales emparejadas pretratamiento y postratamiento de la semana 4 (Tabla suplementaria 3). Los tumores pretratamiento exhibieron una mayor expresión de genes involucrados en procesos metabólicos, incluidos los marcadores del metabolismo de xenobióticos (AKR1C2), la glucólisis (ENO3) y la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP3). Los genes asociados con la progresión y la invasión tumoral, como MMP11, NCAM2, FN1 y NGFR, también se regularon al alza en la línea de base (Figura 4A–B).

En contraste, las biopsias postratamiento mostraron un enriquecimiento significativo de las vías relacionadas con la inmunidad, incluido el procesamiento y la presentación de antígenos, la señalización del receptor de células T, la citotoxicidad mediada por las células asesinas naturales y las interacciones citocina-receptor de citocinas (Figura 4A). La expresión de los marcadores de células T (CD3E, CD8A, TRAC), las moléculas de señalización (ZAP70, LCK, ITK) y las quimiocinas (CXCL9, CXCL13, CCL5) aumentó notablemente, junto con los genes efectores como GZMA, lo que indica una mayor activación y reclutamiento inmunitario (Figura 4B).

El análisis de muestras emparejadas reveló que, aunque los perfiles inmunes de la línea de base no difirieron sustancialmente entre los buenos y los malos respondedores, los dos pacientes con respuestas parciales (Pt25 y Pt10) exhibieron los mayores aumentos postratamiento en la expresión de genes relacionados con la inmunidad (Figura 4C–D). Estos cambios transcripcionales se acompañaron de un aumento de la infiltración de células T CD4⁺ y CD8⁺, así como de macrófagos CD68⁺ en los tumores postratamiento. En contraste, los tumores de los malos respondedores mostraron cambios mínimos en la expresión de genes inmunes o la infiltración de células inmunes (Figura 4E).

Aunque limitado por el tamaño de la muestra, estos hallazgos sugieren que la terapia RIN puede mejorar el compromiso inmunitario dentro del TME de los buenos respondedores. Este cambio se caracterizó por un enriquecimiento transcripcional de las vías de procesamiento/presentación de antígenos y una mayor expresión de quimiocinas relacionadas con el reclutamiento de células inmunes, lo que podría contribuir al beneficio terapéutico.

La modulación dinámica de la inmunidad periférica se correlaciona con la respuesta terapéutica

Para dilucidar cómo la terapia RIN modula la inmunidad sistémica en pacientes con mCRC MSS, analizamos los cambios longitudinales en las células inmunitarias periféricas, comparando las PBMC previas al tratamiento con las muestras recogidas después del primer (4 semanas) y segundo (8 semanas) ciclos de tratamiento. Los pacientes con buena respuesta mantuvieron consistentemente una mayor proporción de células T CD4/CD8, mientras que los pacientes con mala respuesta mostraron niveles persistentemente elevados de células T CD8⁺ en todos los puntos temporales (Figura 5A). Al comparar los cambios porcentuales con respecto a la línea de base, los pacientes con mala respuesta mostraron una expansión más pronunciada de los linfocitos, particularmente los subconjuntos de células T CD8⁺ y células T asesinas naturales (NKT), en la semana 4, mientras que los pacientes con buena respuesta mostraron cambios más moderados en la composición inmunitaria a lo largo del tiempo (Figura 5B–E, Figura Suplementaria 10).

El análisis de los subconjuntos productores de citocinas y los marcadores de activación reveló respuestas divergentes (Figura 5F–H, Figuras Suplementarias 11 y 12). Los pacientes con mala respuesta mostraron un perfil Th1 más fuerte, con frecuencias aumentadas de células T IFN-γ⁺ y TNF-α⁺ (Figura 5G). Por el contrario, los pacientes con buena respuesta mostraron una inducción Th1 más leve, pero mayores aumentos en las células T IL-4⁺ e IL-13⁺ (Figura 5H), y una menor reducción en los marcadores de agotamiento PD-1, CTLA-4 y TIM-3 (Figura 5I). Los marcadores de activación de células mieloides, incluidos CD83 y CD86, se regularon al alza desde la semana 4 hasta la semana 8 en los pacientes con buena respuesta (Figura Suplementaria 13A–B). Estas dinámicas contrastantes probablemente reflejan un estado proinflamatorio preexistente en los pacientes con mala respuesta que favorece la activación rápida de los efectores, mientras que los pacientes con buena respuesta pueden iniciar una respuesta inmunitaria más atenuada.

A pesar de su activación temprana de los linfocitos y la inducción de citocinas Th1, los pacientes con mala respuesta mostraron una expansión o reestructuración limitada del repertorio de TCR. En contraste, algunos pacientes con buena respuesta mostraron una mayor expresión de Ki-67 en las células T CD8⁺ naïvas, lo que sugiere un nuevo reclutamiento o proliferación de células T (Figura 5J). Coherente con este hallazgo, estos pacientes también mostraron una expansión significativa de los TCR previamente de baja frecuencia dentro de las células T CD8⁺ no naïvas, pero no en las células T CD4⁺ (Figura 5K y Figuras Suplementarias 14 y 15). En conjunto, estas observaciones sugieren una posible expansión selectiva de los clones de células T CD8⁺ en los pacientes con buena respuesta, lo que puede contribuir a una mayor inmunidad antitumoral.

El perfilaje transcriptómico enfatizó aún más estas diferencias. Solo los pacientes con buena respuesta mostraron una regulación al alza de las vías de activación inmunitaria tanto en las células T CD4⁺ como en las células T CD8⁺ durante el tratamiento, incluidas las vías involucradas en la defensa del huésped, la presentación de antígenos y la diferenciación de las células T (Figura Suplementaria 16). Estas firmas estuvieron ausentes en los pacientes con mala respuesta, lo que subraya su limitada participación de la inmunidad adaptativa y su menor beneficio clínico.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que la terapia RIN elicita respuestas inmunitarias periféricas distintas en los pacientes con buena y mala respuesta. Los pacientes con mala respuesta muestran un aumento temprano de los linfocitos y la producción de citocinas Th1 sin una expansión o activación transcripcional sostenida de las células T. En contraste, los pacientes con buena respuesta muestran una expansión selectiva de los clones de células T CD8⁺ y la activación de vías inmunitarias tanto en los compartimentos CD4⁺ como CD8⁺, lo que puede sustentar la inmunidad antitumoral en los pacientes que se benefician de la terapia RIN.

La senescencia inmunitaria en las metástasis hepáticas se correlaciona con una mala respuesta a la terapia RIN

Investigamos más a fondo los mecanismos inmunológicos subyacentes a la mala respuesta asociada con las metástasis hepáticas a la terapia RIN en pacientes con mCRC MSS, comparando los perfiles inmunitarios periféricos de los pacientes con metástasis hepáticas con los de los pacientes con metástasis pulmonares. De manera similar a las diferencias observadas entre los pacientes con buena y mala respuesta, los pacientes con metástasis hepáticas mostraron una menor proporción de células T CD4/CD8, que no se debió a una pérdida de células T CD4⁺, sino más bien a una acumulación de células T CD8⁺, particularmente los subconjuntos de memoria efectora (TEM) y memoria efectora terminal que reexpresan CD45RA (TEMRA) (Figura 6A–C). Este desequilibrio en las proporciones de CD4/CD8 persistió durante el tratamiento con RIN, lo que sugiere que el entorno inmunitario senescente asociado con las metástasis hepáticas sigue siendo refractario a la modulación a corto plazo mediada por RIN (Figura 6A, Figura Suplementaria 17A–B).

Se sabe que las células TEMRA demuestran un fenotipo senescente (^[30]), lo que sugiere una relación entre la activación inmunitaria crónica y la carga tumoral hepática persistente en los pacientes con metástasis hepáticas. Un examen más detallado de los marcadores de senescencia reveló que las células T CD4⁺ en los pacientes con metástasis hepáticas exhibieron más características de senescencia en comparación con los pacientes con metástasis pulmonares (^[31]–^[33]). Estos incluyeron una expresión reducida de las moléculas coestimuladoras CD27 y CD28, niveles aumentados de CD57 y β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) y granzima K elevada. Además, estas células mostraron una mayor proporción de subconjuntos IFN-γ⁺ y una regulación al alza de los marcadores de agotamiento, como PD-1, CTLA-4 y LAG-3, en todos los puntos temporales (Figura 6D–F, Figura Suplementaria 17C, D). Las células T CD8⁺ mostraron menos características de senescencia asociadas con las metástasis hepáticas en general, pero sí expresaron mayor granzima K y menos CD28 en comparación con los pacientes con metástasis pulmonares. Cabe destacar que los niveles de γH2AX, el marcador de daño del ADN, no difirieron significativamente entre los pacientes con metástasis hepáticas y pulmonares (Figura 6D), en contraste con los niveles elevados de γH2AX que se encontraron en los pacientes con mala respuesta (Figura 3E, Figura Suplementaria 6B). Esto sugiere que, en el contexto de las metástasis hepáticas, la disfunción inmunitaria está impulsada más por mecanismos asociados con la senescencia que por mecanismos relacionados con el daño del ADN.

El perfilaje transcriptómico respaldó esta noción. Antes del tratamiento, las células T CD4⁺ de los pacientes con metástasis hepáticas exhibieron una mayor expresión de genes relacionados con la apoptosis, la senescencia, la autofagia y la señalización de quimiocinas, lo que refleja un estado inmunitario hiperactivado pero disfuncional (Figura 6G–H). Las células T CD8⁺ mostraron un enriquecimiento de las vías metabólicas e inflamatorias, lo que es consistente con un fenotipo agotado pero metabólicamente activo (Figura 6H). Después del tratamiento con RIN, tanto las células T CD4⁺ como las células T CD8⁺ de los pacientes con metástasis hepáticas mostraron una activación metabólica persistente y una regulación al alza de las vías biosintéticas (Figura Suplementaria 18A).

En contraste, los pacientes sin metástasis hepáticas mostraron una remodelación inmunitaria más favorable después del tratamiento con RIN. Sus células T regularon al alza las vías asociadas con la regulación inmunitaria, incluida la señalización de TCR, la diferenciación de las células T y la señalización del punto de control PD-1/PD-L1 (Figura Suplementaria 18B), lo que indica un cambio hacia un estado inmunitario más activado. Cabe destacar que la vía KEGG para la señalización del punto de control PD-1/PD-L1 se reguló al alza en la semana 4 incluso en los pacientes sin metástasis hepáticas que experimentaron malos resultados (Figura 6I–J), lo que destaca la capacidad única del hígado para atenuar la capacidad de respuesta de las células T periféricas.

En conjunto, estos hallazgos indican que la senescencia inmunitaria y el estrés metabólico persistente caracterizan el paisaje de las células T en los pacientes con metástasis hepáticas, lo que contribuye a la resistencia terapéutica. En contraste, los pacientes sin afectación hepática exhiben una mayor plasticidad y capacidad de respuesta inmunitaria. Estas observaciones subrayan la barrera inmunológica que plantean las metástasis hepáticas y respaldan la necesidad de estrategias que se dirijan a la disfunción inmunitaria en este subgrupo de pacientes.

Discusión

Nuestro estudio proporciona evidencia de que la combinación de regorafenib, ipilimumab y nivolumab elicita actividad antitumoral en pacientes con mCRC MSS, particularmente en aquellos sin metástasis hepáticas. A través de análisis moleculares e inmunológicos integrados, demostramos que el régimen RIN involucra tanto el microambiente tumoral (TME) como la inmunidad sistémica, lo que contribuye a la activación inmunitaria en un subconjunto de pacientes con una enfermedad que de otro modo sería resistente a la inmunoterapia.

Al evaluar los biomarcadores predictivos de la respuesta, surgieron características distintas tanto en el TME como en la sangre periférica. Dentro del TME, las firmas transcripcionales relacionadas con el estrés proliferativo, la detección de ADN citosólico y la señalización de interferón se enriquecieron en los pacientes con buena respuesta, lo que sugiere que los tumores con activación inmunitaria intrínseca pueden ser más permisivos para las terapias basadas en el sistema inmunitario. En la sangre periférica, una mayor proporción de células T CD4/CD8, frecuencias más bajas de células T de memoria efectora y niveles reducidos de daño del ADN en los linfocitos se asociaron con resultados favorables. Estos hallazgos respaldan un modelo en el que tanto un TME preparado como un estado inmunitario sistémico más intacto y apto se asocian con el beneficio clínico y pueden servir juntos como biomarcadores predictivos.

En contraste, los pacientes con mala respuesta, particularmente aquellos con metástasis hepáticas, exhibieron características de disfunción inmunitaria tanto a nivel local como sistémico. Estas observaciones son consistentes con las características del agotamiento y la senescencia inmunitaria que pueden reflejar la activación inmunitaria crónica y el microambiente inmunorregulador hepático, lo que limita las respuestas antitumorales efectivas. Abordar esta resistencia es un área crítica para la investigación futura. Las estrategias terapéuticas, como los agonistas STING (por ejemplo, análogos de dinucleótidos cíclicos o formulaciones basadas en nanopartículas), pueden mejorar la señalización de interferón local y la presentación de antígenos (^[34], ^[35]). Mientras tanto, las estrategias de rejuvenecimiento sistémico, que incluyen los senolíticos (por ejemplo, dasatinib más quercetina; inhibidores de BCL-2) (^[36]) o la eliminación selectiva de poblaciones inmunitarias disfuncionales (por ejemplo, la depleción mediada por anticuerpos de las células madre hematopoyéticas de base mieloide) (^[37]), pueden ayudar a restaurar la competencia inmunitaria en los pacientes que no responden.

Si bien nuestro ensayo careció de un brazo comparador solo con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI), la activación inmunitaria observada sugiere que la adición de regorafenib puede haber mejorado la capacidad de respuesta al bloqueo de puntos de control. Se sabe que el regorafenib normaliza la vasculatura tumoral y reduce las poblaciones mieloides supresoras, lo que facilita la infiltración y la activación de las células T (^[6], ^[7], ^[38]). En nuestro estudio, los pacientes con buena respuesta mostraron una mayor infiltración de linfocitos, expresión de genes de activación inmunitaria y expansión clonal de las células T CD8⁺ después del tratamiento. Estos hallazgos sugieren que el regorafenib puede actuar de forma sinérgica con los ICI al remodelar el TME y mejorar la accesibilidad inmunitaria de los tumores.

Se deben reconocer varias limitaciones. El diseño no aleatorizado y el tamaño de muestra relativamente pequeño pueden limitar la generalizabilidad de nuestros hallazgos. Se necesitan estudios prospectivos más amplios con un perfilaje longitudinal para validar estos resultados y aclarar los mecanismos involucrados. Si bien definimos a los "pacientes con buena respuesta" como aquellos con una PFS ≥ 6 meses o una respuesta parcial confirmada para capturar un beneficio clínico significativo, esta clasificación binaria puede agrupar a pacientes con una biología subyacente distinta. La regresión tumoral temprana puede resultar de una actividad citotóxica aguda, pero no necesariamente se traduce en un beneficio duradero. De hecho, varios casos de una fuerte regresión temprana en este ensayo fueron seguidos por una rápida progresión debido a eventos adversos que requirieron la interrupción del tratamiento y la administración de esteroides. En consecuencia, la regresión temprana puede ir seguida de una progresión de la enfermedad impulsada por clones resistentes, respuestas mixtas (por ejemplo, reducción de la lesión diana con crecimiento de la lesión no diana) o inmunosupresión relacionada con el manejo de la toxicidad, mientras que una PFS prolongada puede reflejar en cambio una presión inmunitaria sostenida o un control eficaz de los subclones resistentes. Para tener en cuenta esto, se proporcionan análisis estratificados en las Figuras Suplementarias para delinear mejor la heterogeneidad clínica e inmunológica entre los pacientes.

En conclusión, nuestro estudio destaca el potencial terapéutico del régimen RIN en el mCRC MSS al demostrar su capacidad para involucrar la inmunidad antitumoral y modular tanto el TME como las respuestas inmunitarias sistémicas. Los resultados diferenciales asociados con los sitios metastásicos subrayan la necesidad de enfoques personalizados, particularmente en los pacientes con metástasis hepáticas. Los esfuerzos futuros dirigidos a revertir la disfunción inmunitaria y mejorar la aptitud de las células T serán fundamentales para mejorar los resultados en esta población que históricamente ha sido refractaria al tratamiento.