Exploración funcional de pacientes africanos con cáncer colorrectal mediante avatares de Drosophila personalizados

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte por cáncer a nivel mundial y el tercer cáncer más letal que afecta a hombres y mujeres ([Bray et al., 2024]; [Knapp et al., 2019]). Aproximadamente, se registraron 2 millones de nuevos casos de CCR y 904.000 muertes en 2022 ([Bray et al., 2024]). Los países de ingresos altos (PAI) han registrado importantes avances en el diagnóstico precoz, el pronóstico y la supervivencia general en comparación con las cohortes africanas. Sin embargo, en muchos países de ingresos bajos y medios (PIBM), especialmente en el África subsahariana, se observa un aumento alarmante en los casos y las muertes por CCR ([Arnold et al., 2017]). En Nigeria, por ejemplo, el CCR se consideraba anteriormente poco frecuente. Sin embargo, la incidencia de CCR en Nigeria ha aumentado recientemente, convirtiéndose en el cuarto tipo de cáncer más prevalente ([Alatise et al., 2022]). La alta tasa de mortalidad por CCR en la población africana está influenciada por varios factores, como el diagnóstico tardío y la disponibilidad limitada de tratamientos adaptados al contexto local.

Los avances en los estudios genómicos siguen revelando diferencias biológicas específicas de la población que subyacen a la forma en que el CCR se desarrolla y progresa en diferentes poblaciones. En un estudio de más de 46.000 casos de adenocarcinoma colorrectal, los pacientes africanos presentaban tumores agresivos caracterizados por tasas más altas de alteraciones oncogénicas en KRAS y PIK3CA, tasas más bajas en APC/WNT, especialmente en pacientes más jóvenes, y tasas más bajas de inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) en comparación con sus contrapartes europeas ([Alatise et al., 2021]; [Myer et al., 2022]). Esta evidencia implica que las estrategias de tratamiento eficaces para el CCR deben tener en cuenta las variaciones ancestrales y étnicas.

Los tratamientos actuales para el CCR incluyen cirugía, inmunoterapia, radioterapia y quimioterapia, y el tratamiento estándar a menudo se centra en el 5-fluorouracilo en combinación con los regímenes FOLFOX o FOLFIRI ([Fadlallah et al., 2024]; [Singh et al., 2024]). La integración clínica de agentes dirigidos, como los inhibidores de EGFR y VEGF, ha ampliado aún más las opciones de tratamiento para el CCR ([Heinemann et al., 2014]; [F. Li et al., 2023]). A pesar de la considerable mejora en los resultados del tratamiento, la eficacia varía debido al perfil genético subyacente del tumor, así como a su contexto local y general ([Kiran et al., 2024]). Por ejemplo, los inhibidores de EGFR son ineficaces en pacientes con CCR que presentan mutaciones en KRAS, mientras que la quimioterapia convencional tiene un efecto limitado en pacientes con tumores con mutaciones en BRAF ([Gong et al., 2016]). Tener en cuenta esta heterogeneidad del CCR probablemente requerirá la identificación de biomarcadores que tengan en cuenta las diferencias en la ascendencia, lo que, a su vez, afecta al panorama genético de los pacientes con CCR africano en toda la región.

Una herramienta para abordar esta complejidad sistémica es Drosophila. Las moscas proporcionan un sistema genético muy accesible, vías de señalización conservadas y un ciclo de vida corto, lo que las convierte en un modelo in vivo ideal para el cribado de alto rendimiento del CCR mediante la introducción de mutaciones específicas del paciente ([Bangi et al., 2016]; [Cagan et al., 2019]). Los trabajos recientes destacan su utilidad, en particular la disponibilidad y el desarrollo de avatares de moscas específicos del paciente para modelar genotipos humanos de cáncer y facilitar el cribado de fármacos de alto rendimiento ([Badmos & Cagan, 2025]; [Bangi et al., 2019]).

Anteriormente, publicamos informes de pacientes de un ensayo clínico "de la mosca a la cama" que utilizó "avatares de moscas personalizados" para detectar cócteles de fármacos a medida, incluido el de pacientes con CCR (NCT02363647) ([Bangi et al., 2019]). En este estudio, utilizamos datos genéticos de tumores de diez pacientes de África Occidental previamente caracterizados con CCR de microsatélites estables (MSS) ([Alatise et al., 2021]) para generar diez líneas transgénicas de "avatares de moscas personalizados", una para cada paciente modelado. Estos modelos permitieron el direccionamiento específico del intestino posterior de los principales genes impulsores del cáncer.

Para evaluar la respuesta al tratamiento, tratamos los avatares de moscas con regorafenib, un inhibidor multiquinasa clínicamente relevante aprobado para su uso en el CCR, o con el potente inhibidor de MEK, trametinib. El CCR de microsatélites estables (MSS) generalmente responde menos a la inmunoterapia, lo que convierte a los agentes dirigidos a las vías en una opción especialmente importante ([Gandini et al., 2023]). En particular, la vía MAPK/ERK, que es el objetivo de trametinib, desempeña un papel central en la progresión y la resistencia al tratamiento del CCR, y las vías de quinasa que son el objetivo de regorafenib también están implicadas en estos procesos ([Q. Li et al., 2024]).

Una propiedad clave del CCR es el desequilibrio redox, que está relacionado con la progresión del cáncer y la resistencia a la terapia. Aquí, utilizamos nuestras líneas de avatares de CCR nigerianos para evaluar los niveles de redox, incluidos los niveles de tioles, y cómo estas propiedades afectan a la respuesta a los fármacos. Al combinar el modelado genético con la puntuación fenotípica, la imagenología y los ensayos bioquímicos, mostramos cómo las líneas de avatares de Drosophila que portan perfiles de CCR derivados de pacientes africanos responden al tratamiento y cómo estas respuestas afectan a los aspectos de la progresión tumoral.

Resultados

Construcción y validación del modelo de avatares de Drosophila diseñados con mutaciones de CCR derivadas de Nigeria.

El CCR en pacientes nigerianos presenta tasas significativamente más altas de alteraciones de KRAS en comparación con las cohortes occidentales (76,1% frente a 59,6%) ([Alatise et al., 2021]), un tipo de tumor para el cual existen pocas opciones terapéuticas duraderas. Por lo tanto, nos centramos en construir avatares para modelar y explorar este grupo de pacientes con CCR impulsado por KRAS. Utilizando el análisis del panel de secuenciación MSK-IMPACT de 64 pacientes con CCR nigerianos ([Alatise et al., 2021]), según se informó en cBioPortal (cbioportal.org), seleccionamos 10 pacientes con CCR con mutaciones en KRAS para el modelado. KRAS se encuentra comúnmente con variantes en APC y TP53, y los diez tumores que seleccionamos también contenían mutaciones en APC (9/10) y TP53 (8/10; Tabla 1).

Además de KRAS, APC y TP53 (Drosophila Ras, Apc, p53, denominado aquí RAP), las muestras de los pacientes incluían un conjunto más amplio de mutaciones específicas del paciente en genes relacionados con el cáncer. Dirigimos estas mutaciones adicionales en función de si la mutación era un oncogén conocido o un supresor tumoral, si se predecía que la mutación era patógena o benigna, la penetrancia de las mutaciones, la frecuencia alélica de la mutación en otros pacientes con CCR y si el gen está bien conservado en Drosophila. Los oncogenes se modelaron mediante sobreexpresión, mientras que los supresores tumorales se modelaron utilizando la inhibición mediada por shRNA. Un resumen de las mutaciones seleccionadas se muestra en la Tabla 1 y los detalles de la construcción de las líneas transgénicas se encuentran en las Tablas Suplementarias 1, 2 y 3.

En resumen, para modelar los efectos de las mutaciones seleccionadas en Drosophila, utilizamos el sistema GAL4/UAS, que permite la expresión específica de tejidos de los transgenes dirigidos por UAS en tejidos específicos. Utilizando nuestro enfoque transgénico previamente informado para el direccionamiento multigenico ([Bangi et al., 2019]), utilizamos la sobreexpresión (oncogenes) y la inhibición mediada por ARN de interferencia (RNAi, supresores tumorales) para dirigir una gran cohorte de genes relacionados con el cáncer en un solo transgen. Por ejemplo, combinamos Drosophila RAS activado (Ras85DG12V), la inhibición basada en ARN de APC (ApcRNAi) y la inhibición de TP53 (p53RNAi) más objetivos génicos específicos del paciente adicionales para generar diez líneas transgénicas únicas. Nos referimos a estos modelos como RAP-N2 a RAP-N11 (Ras85D, Apc, p53 [RAP] o un subconjunto de estos [RA, RP]); los números de referencia de los pacientes específicos modelados también se encuentran en la Tabla 1. Nuestro objetivo era capturar y analizar en detalle cada paciente más allá de las mutaciones centrales, como Ras_.

La sobreexpresión/inhibición de grandes conjuntos de genes impulsores del cáncer en el intestino posterior de Drosophila conduce a la inducción de tumores y la letalidad del desarrollo ([Bangi et al., 2016]; [Datta et al., 2023]). Por lo tanto, utilizamos cruces genéticos estándar para combinar nuestras líneas específicas del paciente con el controlador específico del intestino posterior byn-GAL4 (abreviado byn>RAP-N*; Figura 1A), así como un alelo GAL80 sensible a la temperatura ([McGuire et al., 2003]) que reprime GAL4 a bajas temperaturas; el resultado es el control espacial y temporal de la expresión del transgen. También incluimos un reportero UAS-GFP para ayudar a visualizar el tejido transformado del intestino posterior.

Examinamos el impacto inicial de la progresión del tumor en los avatares a diferentes temperaturas (27 °C durante todo el desarrollo o la temperatura no permisiva de GAL4 de 18 °C durante 24, 48 y 72 horas antes de cambiar a 27 °C) para identificar la condición óptima para la expresión del transgen y la formación del tumor, según lo evaluado por la letalidad. Seis de diez avatares (byn>RAP-N3, N4, N8, N9, N11 y byn>RP-N10) exhibieron una reducción de la pupación y la eclosión (supervivencia a la edad adulta) a 27 °C durante todo el proceso en comparación con los embriones que se mantuvieron inicialmente a 18 °C durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente, y luego se cambiaron a 27 °C. Mientras que dos de diez (byn>RA-N6 y N7) mostraron una mayor letalidad a 18 °C durante 72 horas. byn>RAP-N2 mostró una mayor letalidad a 18 °C durante 48 horas, mientras que byn>RAP-N5 no mostró letalidad en ninguna de las condiciones (Figuras 1B–K).

Seleccionamos la condición más letal específica para cada línea de mosca como línea de base para estudios posteriores, ya que modela eficazmente la letalidad asociada con los perfiles de mutación del CCR específicos de Nigeria. Cabe destacar que nos centramos en las larvas debido a su comportamiento de alimentación agresivo y son más accesibles para la administración de fármacos ([Bangi et al., 2016], ^[2019]).

Los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCR exhibieron hiperplasia del intestino posterior.

Los intestinos de mamíferos y Drosophila comparten varias similitudes anatómicas y fisiológicas ([Jiang & Edgar, 2012]). El direccionamiento de genes relacionados con el cáncer al intestino posterior puede provocar hipertrofia intestinal, sobreproliferación, pérdida de marcadores específicos del intestino posterior y migración de células a otros sitios en la mosca ([Bangi et al., 2016], ^[2019]). Para comprender mejor cómo el direccionamiento de estos genes específicos del paciente puede alterar la biología intestinal, nos centramos en tres líneas: RAP-N3, RAP-N4 y RAP-N11, con perfiles genómicos distintos, que representan una alta complejidad genómica (RAP-N3, RAP-N4) y una menor complejidad genómica (RAP-N11) (Figura 1L).

En comparación con las moscas de control que expresan GFP solo (byn>w1118), observamos una expansión significativa de la zona de proliferación del intestino posterior (HPZ): byn>RAP-N3, byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 exhibieron una expansión del 123%, 152% y 208% en la HPZ, respectivamente (Figura 2B–E). Además, observamos una pérdida de la señal byn>GFP en la HPZ de los tres avatares, de forma significativa en los intestinos byn>RAP-N4 (Figura 2F), lo que es consistente con la pérdida de la identidad celular dependiente de byn_.

Concluimos que estas tres líneas de avatares nigerianos muestran aspectos importantes de la transformación, incluida la expansión de la HPZ y la pérdida de al menos un marcador de identidad celular.

Los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCR exhibieron respuestas diferenciales a la terapia dirigida.

Dado que las tres líneas de avatares nigerianos mostraron características claras de transformación, probamos a continuación su respuesta a las terapias dirigidas clínicamente relevantes para el CCR. Mezclamos el fármaco en el alimento de las larvas y evaluamos la respuesta a regorafenib (un inhibidor multiquinasa aprobado para el CCR) y trametinib (un inhibidor de MEK1/2). A los 5 días, los byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 no tratados mostraron una marcada reducción del tamaño de las larvas; sin embargo, el regorafenib a 0,01 y 0,10 μM mejoró el tamaño de las larvas para byn>RAP-N4 en comparación con el control no tratado. Mientras que los byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 alimentados con regorafenib y trametinib no mostraron cambios en el tamaño de las larvas en comparación con el control no tratado (Figuras 3A–F).

Como se muestra en la Figura 1, la expresión específica en el intestino posterior de los transgenes redujo la pupación y la eclosión en las tres líneas, lo que convierte a la supervivencia hasta la edad adulta en un indicador útil de la respuesta a los fármacos. Utilizando este ensayo, probamos regorafenib y trametinib como agentes únicos a 0,01, 0,10 y 1,00 μM. La administración de regorafenib a larvas byn>RAP-N3 provocó un aumento de la eclosión del 12% a 0,01 y 0,10 μM, mientras que trametinib aumentó la eclosión en un 7, 18 y 27% a 0,01, 0,10 y 1,00 μM, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (Figura 3G). En los animales byn>RAP-N4, trametinib causó una recuperación significativa, aumentando la pupación en un 31, 60 y 51% y la eclosión en un 25, 65 y 57% a 0,01, 0,10 y 1,00 μM, respectivamente (Figura 3H). En contraste, los animales byn>RAP-N11 no mostraron ninguna mejora en la supervivencia con ninguno de los dos fármacos a estas concentraciones (Figura 3I).

En conjunto, estos datos indican una sensibilidad dependiente del genotipo a regorafenib y trametinib en las líneas de avatar de CRC nigerianas. La resistencia de byn>RAP-N11 puede reflejar alteraciones en Pi3K92E (PIK3CA) y pan (TCF7L2), lo que podría promover la señalización PI3K-AKT y alterar la transcripción dependiente de Wnt/β-catenina, ambas de las cuales se han relacionado con una reducción de la sensibilidad a los fármacos en el CRC ([Voutsadakis, 2025]; [Wang et al., 2024]).### Regorafenib y trametinib mejoran selectivamente la arquitectura del intestino posterior en avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CRC.

Para evaluar si regorafenib y trametinib también mejoraban la arquitectura de los tejidos, examinamos sus efectos sobre el fenotipo agrandado de la HPZ. El tamaño relativo del intestino se calculó normalizando el área de la HPZ con el área de la larva para tener en cuenta las diferencias en el tamaño corporal general. Ambos fármacos, administrados a larvas byn>RAP-N4, redujeron selectivamente la expansión de la HPZ de forma significativa a 0,01 μM de regorafenib (p = 0,03) y trametinib (p = 0,04). En general, 0,01 y 1,00 μM de regorafenib, administrados a larvas byn>RAP-N4, redujeron la HPZ en un 49 y un 29%, respectivamente, mientras que las concentraciones de 0,01 y 1,00 μM de trametinib redujeron la HPZ en un 38 y un 47%, respectivamente, en relación con los controles no tratados. Además, los animales byn>RAP-N3 a los que se administraron 0,01 y 0,10 μM de regorafenib redujeron la expansión de la HPZ en un 15 y un 16%, mientras que trametinib redujo la expansión en un 26 y un 23% a 0,10 y 1,00 μM, respectivamente. Además, regorafenib a 0,10 μM redujo la HPZ de las larvas byn>RAP-N11 en un 10%, mientras que trametinib a 0,01, 0,10 y 1,00 μM causó una clara reducción en el tamaño de la HPZ en un 27, 26 y 34%, respectivamente, en byn>RAP-N11 en comparación con el control no tratado (Figura 4A–X).

A continuación, medimos la intensidad de byn>GFP como un indicador adicional de la transformación del intestino posterior. La intensidad de GFP se restauró en byn>RAP-N3 y byn>RAP-N4 después del tratamiento con regorafenib o trametinib, pero no en byn>RAP-N11 (Figura 4Y–Z). El análisis de correlación mostró además que un tamaño de HPZ más pequeño generalmente se asoció con una mayor eclosión y una mayor intensidad de GFP, aunque la fuerza de estas asociaciones varió según el genotipo y el tratamiento (Tablas suplementarias S4–S9). Específicamente, para el avatar byn>RAP-N3, el análisis de correlación reveló una fuerte relación inversa entre el tamaño relativo del intestino y las tasas de eclosión con ambos tratamientos, regorafenib (Tabla S4) y trametinib (Tabla S5), lo que indica que la reducción de la expansión de la HPZ es un fuerte predictor de una mejor supervivencia en adultos en este genotipo.

En conjunto, estos datos indican que regorafenib y trametinib revirtieron parcialmente la arquitectura anormal del intestino posterior de forma dependiente del genotipo, notablemente en byn>RAP-N4. Solo trametinib mostró una actividad clara en los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11.### Regorafenib y trametinib inhiben selectivamente la señalización de MAPK (dpERK) de Drosophila en avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CRC.

La quinasa regulada por señales extracelulares fosforilada (fosfo-ERK), una forma activada de ERK1/2, es una quinasa clave en la señalización de MAPK involucrada en la regulación de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración celular, procesos que a menudo están desregulados en el CRC ([White et al., 2026]).

Para comprender la expresión de dpERK, medimos la señal media de dpERK en el eje del intestino medio-intestino posterior de los avatares de CRC (Figura 5). Los animales byn>RAP-N3 no tratados mostraron activación de dpERK en comparación con el control, lo que indica una señalización ERK activa dentro de la HPZ. Sin embargo, los animales a los que se administró trametinib a todas las concentraciones y aquellos a los que se administró regorafenib (0,10 y 1,00 μM) mostraron una disminución de la intensidad de dpErk en comparación con los animales no tratados, mientras que 0,01 μM de regorafenib mostraron una señal de dpERK más alta (Figura 5A). El grupo byn>RAP-N4 no tratado no mostró una diferencia clara en la señal de dpERK en comparación con el control; sin embargo, trametinib a 0,10 y 1,00 μM causó una reducción en la intensidad de dpErk (Figura 5B). Se observó un aumento significativo en la señal de dpERK de los animales byn>RAP-N11 no tratados en comparación con el control (p = 0,01). El tratamiento de byn>RAP-N11 con regorafenib y trametinib condujo a una disminución significativa en todas las concentraciones en comparación con el control no tratado (Figura 5C).

Además, el análisis espacial del perfil de intensidad de dpERK reveló un aumento progresivo en la señal hacia el intestino posterior distal en los avatares de CRC (Figuras suplementarias S2–S4). En la Figura S2, la intensidad de dpERK muestra varios picos localizados a lo largo del eje del intestino posterior, con las señales más prominentes que aparecen más allá de ~60 μm de la HPZ en el control y ~80 μm en los animales byn>RAP-N3 no tratados. Se observó un patrón similar en el modelo byn>RAP-N4 tratado con regorafenib y trametinib (Figura suplementaria S3), donde los niveles de dpERK permanecen relativamente bajos cerca de la HPZ, pero aumentan más a lo largo del intestino posterior distal, con las muestras tratadas con trametinib que muestran picos pronunciados en la región distal, mientras que los grupos de control y no tratados mantienen un bajo perfil de dpERK. En el modelo byn>RAP-N11 (Figura suplementaria S4), la intensidad de dpERK exhibe múltiples picos distales a lo largo del eje del intestino posterior, particularmente en los tratamientos no tratados y de 0,01 μM de regorafenib.

En conjunto, estos perfiles espaciales indican que la señalización de ERK no se distribuye uniformemente a lo largo del intestino posterior, sino que muestra un enriquecimiento distal consistente en los modelos de avatar de CRC.### Las líneas de avatar de CRC nigerianas no tratadas exhiben un ligero desequilibrio redox.

El estrés oxidativo está fuertemente asociado con el cáncer colorrectal, donde el aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) puede dañar las biomoléculas y favorecer la iniciación y la progresión del tumor ([Bardelčíková et al., 2023]). A medida que los tumores se desarrollan, las células transformadas a menudo se adaptan fortaleciendo los sistemas antioxidantes, creando un estado redox que apoya la supervivencia y la resistencia al tratamiento. Para evaluar el estado redox basal en los avatares de CRC nigerianos, medimos los tioles totales, los tioles no proteicos, las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (RONS) y el óxido nítrico (medido como nivel de nitrito/nitrato) en las larvas del tercer estadio.

En la línea de base, el nivel total de tioles no difería significativamente del control en ninguna de las tres líneas (Figura 2G). Sin embargo, los niveles de tioles no proteicos variaron según el genotipo: byn>RAP-N4 mostró una reducción significativa en relación con el control (p = 0,04), mientras que byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 no lo hicieron (Figura 2H). Los resultados de óxido nítrico y RONS también difirieron entre las líneas. Los animales byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 mostraron aumentos marcados en RONS, mientras que se observó un aumento en el óxido nítrico en byn>RAP-N4 después de una reducción significativa en el óxido nítrico en las larvas byn>RAP-N11 en comparación con el control. En contraste, byn>RAP-N3 no mostró cambios en el nivel de RONS, mientras que hubo un aumento en los niveles de óxido nítrico en comparación con el control (Figuras 2I, J). En conjunto, estos datos indican que las líneas de avatar nigerianas no tratadas no comparten un único fenotipo redox, sino que muestran, como mucho, un ligero desequilibrio redox dependiente del genotipo.### Regorafenib y trametinib produjeron respuestas redox específicas del genotipo en las líneas de avatar de CRC nigerianas.

Para confirmar aún más esta observación, evaluamos la dinámica de los biomarcadores antioxidantes en los modelos de Drosophila en respuesta a regorafenib y trametinib. En los tioles totales y los tioles no proteicos, observamos patrones inconsistentes entre los avatares de Drosophila; regorafenib administrado a byn>RAP-N3 a 0,10 y 1,00 μM y byn>RAP-N4 a 0,10 μM mostró aumentos significativos en el nivel total de tioles en comparación con el control no tratado. Además, los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N4 tratados con trametinib no mostraron cambios observables en comparación con los controles no tratados. Además, byn>RAP-N11 mostró una ligera disminución en el tiol total para ambos fármacos en comparación con el control no tratado (Figuras 6A–B). Para los niveles de tioles no proteicos, byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 mostraron una ligera reducción en los niveles de tioles no proteicos para ambos fármacos en relación con el control no tratado, mientras que byn>RAP-N4 mostró un aumento significativo a 1,00 μM de regorafenib y trametinib (Figuras 6C–D).

Evaluamos los efectos de regorafenib y trametinib en el entorno redox de los tres avatares byn>RAP-N, revelando que los animales byn>RAP-N4 están particularmente predispuestos al estrés oxidativo inducido por los fármacos (Figura 7). Notablemente, ambos fármacos indujeron significativamente la producción de RONS específicamente en el fondo byn>RAP-N4 (Figuras 7A, B). Para byn>RAP-N4 tratado con regorafenib, se observó un aumento dependiente de la concentración en RONS, siendo las concentraciones más altas (0,10 μM, p = 0,02 y 1,00 μM) notables. Interesantemente, trametinib indujo un pico de RONS similar en su concentración más baja (0,01 μM, p = 0,02) en comparación con el control, seguido de una tendencia no lineal a medida que aumentaban las concentraciones. Mientras que los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 permanecieron en gran medida sin respuesta o exhibieron una disminución en los niveles de RONS en concentraciones más altas. Por ejemplo, 1,00 μM de regorafenib condujo a una reducción dramática en el nivel de RONS en byn>RAP-N3, mientras que 0,01 μM de trametinib redujo los niveles de RONS en byn>RAP-N11 en comparación con los animales no tratados.

El análisis paralelo del estrés nitrosativo mostró una diferencia sorprendente en la forma en que estos avatares manejaron el óxido nítrico bajo la intervención de los fármacos (Figura 7C–D). En los avatares byn>RAP-N3, regorafenib y trametinib indujeron significativamente un aumento dependiente de la concentración en los niveles de óxido nítrico en comparación con los animales no tratados (regorafenib: 0,01 μM, p = 0,02, 0,10 μM, p = 0,05 y trametinib: 1,00 μM, p = 0,01). Además, los animales byn>RAP-N4 no tratados mantuvieron niveles significativamente bajos de óxido nítrico en comparación con el control (p < 0,001). Regorafenib a 0,01 μM rescató los niveles de óxido nítrico suprimidos, mientras que las concentraciones más altas no mostraron un aumento observable.

Además, trametinib mostró una mejora marcada en los niveles de óxido nítrico en comparación con los animales byn>RAP-N4 no tratados. Los animales byn>RAP-N11 permanecieron sin respuesta a ambos fármacos con respecto a la restauración de los niveles de óxido nítrico. Además, byn>RAP-N4 mostró patrones de correlación distintos, revelando una correlación inversa significativa entre el tamaño relativo del intestino y el óxido nítrico (Tabla S6; r = −0,96, p = 0,04) para el tratamiento con regorafenib, así como una fuerte correlación observada entre el tamaño relativo del intestino y RONS en el tratamiento con trametinib (Tabla S7; r = 0,91, p = 0,09). Estas relaciones dependientes del genotipo reflejan cómo las diferencias genéticas específicas de la población remodelan el estado redox y el resultado terapéutico.### La tasa metabólica mitocondrial y la respuesta transcripcional de la tioredoxina-2 (Trx-2) también variaron significativamente según el genotipo y el tipo de fármaco.

Tras establecer la existencia de dinámicas variables de los marcadores bioquímicos de la respuesta redox en los modelos, evaluamos la tasa metabólica mitocondrial utilizando el ensayo MTT y la expresión de mRNA de la tioredoxina-2 (Trx-2) como biomarcador molecular de la progresión del CCRC ([Mollbrink et al., 2014]). La tasa metabólica mitocondrial y la expresión de mRNA de Trx-2 mostraron que los tres genotipos de CCRC-avatar respondieron de manera diferente a regorafenib y trametinib. El byn>RAP-N3 mostró un aumento de la tasa metabólica mitocondrial con ambos fármacos, mientras que byn>RAP-N4 mostró un aumento significativo a 0,1 μM de trametinib en comparación con el control no tratado. Sin embargo, byn>RAP-N11 a 0,1 μM de ambos fármacos indicó una disminución de la tasa metabólica mitocondrial en comparación con el subgrupo no tratado. Esto puede sugerir que los genotipos tumorales activan vías mitocondriales que aumentan la producción metabólica en lugar de sufrir daños inducidos por los fármacos (Figuras 8A–B).

El aumento de la tasa metabólica se acompaña de una mayor regulación de la expresión de mRNA de Trx-2, una proteína mitocondrial que ayuda a mantener el equilibrio redox y proteger las enzimas metabólicas, al tiempo que promueve la resistencia a los fármacos y la progresión del cáncer ([Jovanović et al., 2022]). Notablemente, regorafenib aumentó los niveles de mRNA de Trx-2 tanto en byn>RAP-N3 como en byn>RAP-N11 (Figura 8C). En contraste, trametinib redujo la expresión de mRNA de Trx-2 en byn>RAP-N4 (0,01 μM y 0,10 μM) pero la aumentó en byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 (0,01 μM y 1,0 μM) en comparación con sus controles no tratados (Figura 8D).

Construcción y validación de modelos de Drosophila con avatares diseñados con mutaciones del CCRC de origen nigeriano.

El CCRC en pacientes nigerianos presenta tasas significativamente más altas de alteraciones de KRAS en comparación con las cohortes occidentales (76,1% frente a 59,6%) ([Alatise et al., 2021]), un tipo de tumor para el cual existen pocas opciones terapéuticas duraderas. Por lo tanto, nos centramos en la construcción de avatares para modelar y explorar este grupo de pacientes con CCRC impulsado por KRAS. Utilizando el análisis del panel de secuenciación MSK-IMPACT de 64 pacientes con CCRC nigerianos ([Alatise et al., 2021]), según se informó en cBioPortal (cbioportal.org), seleccionamos 10 pacientes con CCRC mutante para KRAS para la modelización. KRAS se encuentra comúnmente con variantes en APC y TP53, y los diez tumores que seleccionamos también contenían mutaciones en APC (9/10) y TP53 (8/10; Tabla 1).

Además de KRAS, APC y TP53 (Drosophila Ras, Apc, p53, denominados aquí RAP), las muestras de los pacientes incluían un conjunto más amplio de mutaciones específicas del paciente en genes relacionados con el cáncer. Dirigimos estas mutaciones adicionales en función de si la mutación era un oncogén o un gen supresor tumoral conocido, si se predecía que la mutación era patógena o benigna, la penetrancia de las mutaciones, la frecuencia alélica de la mutación en otros pacientes con CCRC y si el gen está bien conservado en Drosophila. Los oncogenes se modelaron mediante sobreexpresión, mientras que los genes supresores tumorales se modelaron utilizando la inhibición mediada por shRNA. Un resumen de las mutaciones seleccionadas se muestra en la Tabla 1 y los detalles de la construcción de las líneas transgénicas se encuentran en las Tablas Suplementarias 1, 2 y 3.

En resumen, para modelar los efectos de las mutaciones seleccionadas en Drosophila, utilizamos el sistema GAL4/UAS, que permite la expresión específica de tejidos de los transgenes dirigidos por UAS en tejidos específicos. Utilizando nuestro enfoque de transgen previamente informado para la focalización multigénica ([Bangi et al., 2019]), utilizamos la sobreexpresión (oncogenes) y la inhibición mediada por ARN de interferencia (RNAi, genes supresores tumorales) para dirigir una gran cohorte de genes relacionados con el cáncer en un solo transgen. Por ejemplo, combinamos Drosophila RAS activado (Ras85DG12V), la inhibición basada en ARN de APC (ApcRNAi) y la inhibición de TP53 (p53RNAi) más objetivos génicos específicos del paciente adicionales para generar diez líneas transgénicas únicas. Nos referimos a estos modelos como RAP-N2 a RAP-N11 (Ras85D, Apc, p53 [RAP] o un subconjunto de estos [RA, RP]); los números de referencia de los pacientes específicos modelados también se encuentran en la Tabla 1. Nuestro objetivo era capturar y analizar en detalle los aspectos funcionales de cada paciente más allá de las mutaciones básicas como Ras.

La sobreexpresión/inhibición de grandes conjuntos de genes impulsores del cáncer en el intestino posterior de Drosophila conduce a la inducción de tumores y a la letalidad del desarrollo ([Bangi et al., 2016]; [Datta et al., 2023]). Por lo tanto, utilizamos cruces genéticos estándar para combinar nuestras líneas específicas del paciente con el activador específico del intestino posterior byn-GAL4 (abreviado byn>RAP-N*; Figura 1A) así como con un alelo GAL80 sensible a la temperatura ([McGuire et al., 2003]) que reprime GAL4 a bajas temperaturas; el resultado es el control espacial y temporal de la expresión del transgen. También incluimos un reportero UAS-GFP para ayudar a la visualización del tejido del intestino posterior transformado.

Examinamos el impacto basal de la progresión del tumor en los avatares a diferentes temperaturas (27 °C durante todo el desarrollo o la temperatura no permisiva de 18 °C durante 24, 48 y 72 horas antes de cambiar a 27 °C) para identificar la condición óptima para la expresión del transgen y la formación del tumor, según lo evaluado por la letalidad. Seis de diez avatares (byn>RAP-N3, N4, N8, N9, N11 y byn>RP-N10) exhibieron una reducción de la pupación y la eclosión (supervivencia a la edad adulta) a 27 °C durante todo el proceso en comparación con los embriones que se mantuvieron inicialmente a 18 °C durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente, y luego se cambiaron a 27 °C. Mientras que dos de diez (byn>RA-N6 y N7) mostraron una mayor letalidad a 18 °C durante 72 horas. byn>RAP-N2 mostró una mayor letalidad a 18 °C durante 48 horas, mientras que byn>RAP-N5 no mostró letalidad en ninguna de las condiciones (Figuras 1B–K).

Seleccionamos la condición más letal específica para cada línea de moscas como línea de base para estudios posteriores, ya que modela eficazmente la letalidad asociada con los perfiles de mutación del CCRC específicos de Nigeria. Cabe destacar que nos centramos en las larvas debido a su comportamiento de alimentación agresivo y porque son más accesibles para la administración de fármacos ([Bangi et al., 2016], ^[2019]).

Los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCRC exhibieron hiperplasia del intestino posterior.

Los intestinos de mamíferos y de Drosophila comparten varias similitudes anatómicas y fisiológicas ([Jiang & Edgar, 2012]). La focalización de genes relacionados con el cáncer en el intestino posterior puede conducir a la hipertrofia intestinal, la sobreproliferación, la pérdida de marcadores específicos del intestino posterior y la migración de células a otros sitios en la mosca ([Bangi et al., 2016], ^[2019]). Para comprender mejor cómo la focalización de estos genes específicos del paciente puede alterar la biología intestinal, nos centramos en tres líneas: RAP-N3, RAP-N4 y RAP-N11, con perfiles genómicos distintos, que representan una alta (RAP-N3, RAP-N4) y una menor (RAP-N11) complejidad genómica (Figura 1L).

En comparación con las moscas de control que expresan GFP solo (byn>w1118), observamos una expansión significativa de la Zona de Proliferación del Intestino Posterior (HPZ): byn>RAP-N3, byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 exhibieron una expansión del 123%, 152% y 208% en la HPZ, respectivamente (Figura 2B–E). Además, observamos la pérdida de la señal byn>GFP en la HPZ de los tres avatares, significativamente en los intestinos byn>RAP-N4 (Figura 2F), lo que es consistente con la pérdida de la identidad celular dependiente de byn_.

Concluimos que estas tres líneas de avatares nigerianos muestran aspectos importantes de la transformación, incluida la expansión de la HPZ y la pérdida de al menos un marcador de identidad celular.

Los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCRC exhibieron respuestas diferenciales a la terapia dirigida.

Dado que las tres líneas de avatares nigerianos mostraron características claras de transformación, a continuación, probamos su respuesta a terapias dirigidas contra el CCRC clínicamente relevantes. Mezclamos el fármaco en el alimento de las larvas y evaluamos la respuesta a regorafenib (un inhibidor multiquinasa aprobado para el CCRC) y trametinib (un inhibidor de MEK1/2). A los 5 días, las larvas no tratadas de byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 mostraron una marcada reducción del tamaño de las larvas; sin embargo, el regorafenib a 0,01 y 0,10 μM mejoró el tamaño de las larvas para byn>RAP-N4 en comparación con el control no tratado. Mientras que las larvas de byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 alimentadas con regorafenib y trametinib no mostraron cambios en el tamaño de las larvas en comparación con el control no tratado (Figuras 3A–F).

Como se muestra en la Figura 1, la expresión específica del tejido del transgen en el intestino posterior redujo la pupación y la eclosión en las tres líneas, lo que convierte a la supervivencia a la edad adulta en un indicador útil de la respuesta a los fármacos. Utilizando este ensayo, probamos regorafenib y trametinib como agentes únicos a 0,01, 0,10 y 1,00 μM. Alimentar a las larvas de byn>RAP-N3 con regorafenib condujo a un aumento de la eclosión del 12% a 0,01 y 0,10 μM, mientras que trametinib aumentó la eclosión del 7%, 18% y 27% a 0,01, 0,10 y 1,00 μM, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (Figura 3G). En los animales byn>RAP-N4, trametinib causó un rescate significativo, aumentando la pupación en un 31%, 60% y 51% y la eclosión en un 25%, 65% y 57% a 0,01, 0,10 y 1,00 μM, respectivamente (Figura 3H). En contraste, los animales byn>RAP-N11 no mostraron ninguna mejora en la supervivencia con ninguno de los fármacos a estas concentraciones (Figura 3I).

En conjunto, estos datos indican una sensibilidad dependiente del genotipo a regorafenib y trametinib en las líneas de avatares nigerianos del CCRC. La resistencia de byn>RAP-N11 puede reflejar alteraciones en Pi3K92E (PIK3CA) y pan (TCF7L2), lo que podría promover la señalización PI3K-AKT y alterar la transcripción dependiente de Wnt/β-catenina, ambas de las cuales se han relacionado con una menor sensibilidad a los fármacos en el CCRC ([Voutsadakis, 2025]; [Wang et al., 2024]).

El regorafenib y el trametinib mejoran selectivamente la arquitectura del intestino posterior en los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCRC.

Para evaluar si el regorafenib y el trametinib también mejoraron la arquitectura del tejido, examinamos sus efectos sobre el fenotipo de HPZ agrandado. El tamaño relativo del intestino se calculó normalizando el área de la HPZ con el área de la larva para tener en cuenta las diferencias en el tamaño corporal general. Ambos fármacos administrados a las larvas de byn>RAP-N4 redujeron selectivamente la expansión de la HPZ de forma significativa a 0,01 μM de regorafenib (p = 0,03) y trametinib (p = 0,04). En general, las larvas de byn>RAP-N4 alimentadas con 0,01 y 1,00 μM de regorafenib redujeron la HPZ en un 49% y un 29%, respectivamente, mientras que las concentraciones de 0,01 y 1,00 μM de trametinib redujeron la HPZ en un 38% y un 47%, respectivamente, en relación con los controles no tratados. Además, las larvas de byn>RAP-N3 alimentadas con 0,01 y 0,10 μM de regorafenib redujeron la expansión de la HPZ en un 15% y un 16%, mientras que trametinib redujo la expansión en un 26% y un 23% a 0,10 y 1,00 μM, respectivamente. Además, el regorafenib a 0,10 μM redujo la HPZ de las larvas de byn>RAP-N11 en un 10%, mientras que el trametinib a 0,01, 0,10 y 1,00 μM causó una clara reducción del tamaño de la HPZ en un 27%, 26% y 34%, respectivamente, en byn>RAP-N11 en comparación con el control no tratado (Figura 4A–X).

A continuación, medimos la intensidad de byn>GFP como un indicador adicional de la transformación del intestino posterior. La intensidad de GFP se restauró en byn>RAP-N3 y byn>RAP-N4 después del tratamiento con regorafenib o trametinib, pero no en byn>RAP-N11 (Figura 4Y–Z). El análisis de correlación mostró además que un tamaño de HPZ más pequeño generalmente se correlacionó con una mayor eclosión y una mayor intensidad de GFP, aunque la fuerza de estas asociaciones varió según el genotipo y el tratamiento (Tablas Suplementarias S4–S9). Específicamente, para el avatar byn>RAP-N3, el análisis de correlación reveló una fuerte relación inversa entre el tamaño relativo del intestino y las tasas de eclosión con el tratamiento con regorafenib (Tabla S4) y trametinib (Tabla S5), lo que indica que la reducción de la expansión de la HPZ es un fuerte predictor de una mejor supervivencia de los adultos en este genotipo.

En conjunto, estos datos indican que el regorafenib y el trametinib invirtieron parcialmente la arquitectura anormal del intestino posterior de forma dependiente del genotipo, notablemente en byn>RAP-N4. Solo el trametinib mostró una actividad clara en los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11.

El regorafenib y el trametinib inhiben selectivamente la señalización de MAPK (dpERK) en los avatares de Drosophila derivados de pacientes nigerianos con CCRC.

La proteína quinasa extracelular regulada fosforilada (fosfo-ERK), una forma activada de ERK1/2, es una quinasa clave en la señalización de MAPK que participa en la regulación de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración celular, procesos que a menudo están desregulados en el CCRC ([White et al., 2026]).

Para comprender la expresión de dpERK, medimos la señal media de dpERK en el eje medio-posterior del intestino de los avatares de CCRC (Figura 5). El grupo byn>RAP-N3 no tratado mostró activación de dpERK en comparación con el control, lo que indica una señalización ERK activa dentro de la ZHP. Sin embargo, los animales alimentados con trametinib a todas las concentraciones y aquellos alimentados con regorafenib (0,10 y 1,00 μM) mostraron una disminución de la intensidad de dpERK en comparación con los animales no tratados, mientras que 0,01 μM de regorafenib mostraron una señal de dpERK más alta (Figura 5A). El grupo byn>RAP-N4 no tratado no mostró una diferencia clara en la señal de dpERK en comparación con el control; sin embargo, el trametinib a 0,10 y 1,00 μM causó una reducción en la intensidad de dpERK (Figura 5B). Se observó un aumento significativo en la señal de dpERK de los animales byn>RAP-N11 no tratados en comparación con el control (p = 0,01). El tratamiento de byn>RAP-N11 con regorafenib y trametinib condujo a una disminución significativa en todas las concentraciones en comparación con el control no tratado (Figura 5C).

Además, el análisis espacial del perfil de intensidad de dpERK reveló un aumento progresivo de la señal hacia el intestino posterior distal en todas las líneas de avatares de CCRC (Figuras suplementarias S2–S4). En la Figura S2, la intensidad de dpERK muestra varios picos localizados a lo largo del eje del intestino posterior, con las señales más prominentes que aparecen más allá de ~60 μm de la ZHP en el control y ~80 μm en byn>RAP-N3 no tratado. Se observó un patrón similar en el modelo byn>RAP-N4 alimentado con regorafenib y trametinib (Figura suplementaria S3), donde los niveles de dpERK permanecen relativamente bajos cerca de la ZHP, pero aumentan más a lo largo del intestino posterior distal, con las muestras tratadas con trametinib que muestran picos pronunciados en la región distal, mientras que los grupos de control y no tratados mantienen un perfil de dpERK bajo. En el modelo byn>RAP-N11 (Figura suplementaria S4), la intensidad de dpERK exhibe múltiples picos distales a lo largo del eje del intestino posterior, particularmente en los tratamientos no tratados y con 0,01 μM de regorafenib.

En conjunto, estos perfiles espaciales indican que la señalización ERK no se distribuye uniformemente a lo largo del intestino posterior, sino que muestra un enriquecimiento distal consistente en todos los modelos de avatares de CCRC.

Las líneas de avatares de CCRC nigerianas no tratadas exhiben un leve desequilibrio redox

El estrés oxidativo está fuertemente asociado con el cáncer colorrectal, donde el aumento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) puede dañar las biomoléculas y favorecer la iniciación y la progresión del tumor ([Bardelčíková et al., 2023]). A medida que los tumores se desarrollan, las células transformadas a menudo se adaptan fortaleciendo los sistemas antioxidantes, creando un estado redox que apoya la supervivencia y la resistencia al tratamiento. Para evaluar el estado redox basal en los avatares de CCRC nigerianos, medimos los tioles totales, los tioles no proteicos, las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ERNO) y el óxido nítrico (medido como nivel de nitrito/nitrato) en las larvas de tercer estadio.

En la línea de base, el nivel total de tioles no difería significativamente del control en ninguna de las tres líneas (Figura 2G). Sin embargo, los niveles de tioles no proteicos variaron según el genotipo: byn>RAP-N4 mostró una reducción significativa en relación con el control (p = 0,04), mientras que byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 no lo hicieron (Figura 2H). Los resultados de óxido nítrico y ERNO también difirieron entre las líneas. byn>RAP-N4 y byn>RAP-N11 mostraron aumentos marcados en las ERNO, mientras que se observó un aumento en el óxido nítrico en byn>RAP-N4 después de una reducción significativa en el óxido nítrico en las larvas byn>RAP-N11 en comparación con el control. En contraste, byn>RAP-N3 no mostró cambios en el nivel de ERNO, mientras que hubo un aumento en los niveles de óxido nítrico en comparación con el control (Figuras 2I, J). En conjunto, estos datos indican que las líneas de avatares nigerianas no tratadas no comparten un único fenotipo redox, sino que muestran, como máximo, un leve desequilibrio redox dependiente del genotipo.

El regorafenib y el trametinib produjeron respuestas redox específicas del genotipo en las líneas de avatares de CCRC nigerianas

Para confirmar aún más esta observación, evaluamos la dinámica de los biomarcadores antioxidantes en los modelos de moscas en respuesta al regorafenib y al trametinib. En los tioles totales y los tioles no proteicos, observamos patrones inconsistentes entre los avatares de moscas; el regorafenib administrado a byn>RAP-N3 a 0,10 y 1,00 μM y a byn>RAP-N4 a 0,10 μM mostró aumentos significativos en el nivel de tioles totales en comparación con el control no tratado. Además, los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N4 tratados con trametinib no mostraron cambios observables en comparación con los controles no tratados. Además, byn>RAP-N11 mostró una ligera disminución en los tioles totales para ambos fármacos en comparación con el control no tratado (Figuras 6A–B). Para los niveles de tioles no proteicos, byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 mostraron una ligera reducción en los niveles de tioles no proteicos para ambos fármacos en relación con el control no tratado, mientras que byn>RAP-N4 mostró un aumento significativo a 1,00 μM de regorafenib y trametinib (Figuras 6C–D).

Evaluamos los efectos del regorafenib y el trametinib en el entorno redox de los tres avatares byn>RAP-N, revelando que los animales byn>RAP-N4 están particularmente predispuestos al estrés oxidativo inducido por los fármacos (Figura 7). Notablemente, ambos fármacos indujeron significativamente la producción de ERNO específicamente en el fondo byn>RAP-N4 (Figuras 7A, B). Para byn>RAP-N4 tratado con regorafenib, se observó un aumento dependiente de la concentración en las ERNO, con las concentraciones más altas (0,10 μM, p = 0,02 y 1,00 μM) que fueron notables. Curiosamente, el trametinib indujo un pico de ERNO similar en su concentración más baja (0,01 μM, p = 0,02) en comparación con el control, siguiendo una tendencia no lineal a medida que aumentaban las concentraciones. Mientras que los animales byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 permanecieron en gran medida sin respuesta o exhibieron una disminución en los niveles de ERNO en concentraciones más altas. Por ejemplo, 1,00 μM de regorafenib condujo a una reducción drástica en el nivel de ERNO en byn>RAP-N3, mientras que 0,01 μM de trametinib redujo los niveles de ERNO en byn>RAP-N11 en comparación con los animales no tratados.

El análisis paralelo del estrés nitrosativo mostró una diferencia sorprendente en la forma en que estos avatares manejaron el óxido nítrico bajo la intervención farmacológica (Figura 7C–D). En los avatares byn>RAP-N3, el regorafenib y el trametinib indujeron significativamente un aumento dependiente de la concentración en los niveles de óxido nítrico en comparación con los animales no tratados (regorafenib: 0,01 μM, p = 0,02, 0,10 μM, p = 0,05 y trametinib: 1,00 μM, p = 0,01). Además, los animales byn>RAP-N4 no tratados mantuvieron niveles de óxido nítrico significativamente bajos en comparación con el control (p < 0,001). El regorafenib a 0,01 μM rescató los niveles de óxido nítrico suprimidos, mientras que las concentraciones más altas no mostraron un aumento observable.

Además, el trametinib mostró una mejora marcada en el nivel de óxido nítrico en comparación con los animales byn>RAP-N4 no tratados. byn>RAP-N11 permaneció sin respuesta a ambos fármacos con respecto a la restauración de los niveles de óxido nítrico. Además, byn>RAP-N4 mostró patrones de correlación distintos, revelando una correlación inversa significativa entre el tamaño relativo del intestino y el óxido nítrico (Tabla S6; r = −0,96, p = 0,04) para el tratamiento con regorafenib, así como una fuerte correlación observada entre el tamaño relativo del intestino y las ERNO en el tratamiento con trametinib (Tabla S7; r = 0,91, p = 0,09). Estas relaciones dependientes del genotipo reflejan cómo las diferencias genéticas específicas de la población remodelan el estado redox y el resultado terapéutico.

La tasa metabólica mitocondrial y la respuesta transcripcional de la tioredoxina-2 (Trx-2) también variaron significativamente según el genotipo y el tipo de fármaco

Habiendo establecido una dinámica variable de los marcadores bioquímicos de la respuesta redox en los modelos, evaluamos la tasa metabólica mitocondrial utilizando el ensayo MTT y la expresión de mRNA de la tioredoxina-2 (Trx-2) como un biomarcador molecular del progreso del CCRC ([Mollbrink et al., 2014]). La tasa metabólica mitocondrial y la expresión de mRNA de Trx-2 mostraron que los tres genotipos de avatares de CCRC respondieron de manera diferente al regorafenib y al trametinib. byn>RAP-N3 mostró un aumento en la tasa metabólica mitocondrial de ambos fármacos, mientras que byn>RAP-N4 mostró un aumento significativo a 0,1 μM de trametinib en comparación con el control no tratado. Sin embargo, byn>RAP-N11 a 0,1 μM de ambos fármacos indicó una disminución en la tasa metabólica mitocondrial en comparación con el subconjunto no tratado. Esto puede sugerir que los genotipos tumorales activan vías mitocondriales que aumentan la producción metabólica en lugar de sufrir daños inducidos por los fármacos (Figuras 8A–B).

El aumento en la tasa metabólica se acompaña de una regulación al alza de la expresión de mRNA de Trx-2, una proteína mitocondrial que ayuda a mantener el equilibrio redox y proteger las enzimas metabólicas al tiempo que promueve la resistencia a los fármacos y la progresión del cáncer ([Jovanović et al., 2022]). Notablemente, el regorafenib aumentó los niveles de mRNA de Trx-2 tanto en byn>RAP-N3 como en byn>RAP-N11 (Figura 8C). En contraste, el trametinib redujo la expresión de mRNA de Trx-2 en byn>RAP-N4 (0,01 μM y 0,10 μM) pero la aumentó en byn>RAP-N3 y byn>RAP-N11 (0,01 μM y 1,0 μM) en comparación con sus controles no tratados (Figura 8D).

Discusión

Aquí, presentamos modelos Drosophila melanogaster específicos del paciente que reflejan las variaciones genéticas en los pacientes nigerianos seleccionados con CCRC ([Alatise et al., 2021]). Utilizamos una tecnología previamente desarrollada utilizada en un ensayo clínico de "de la mosca a la cama del paciente" (NCT02363647) ([Bangi et al., 2019]) para modelar pacientes individuales nigerianos con CCRC. Nuestros datos funcionales respaldan el uso de avatares Drosophila específicos del paciente para definir las respuestas a los fármacos dependientes del genotipo en el CCRC ([Bangi et al., 2019]). Las respuestas en los modelos tumorales de moscas a menudo se paralelizan con las que se observan en los pacientes, lo que respalda su uso como sistemas funcionales para probar terapias dirigidas en un entorno personalizado ([Bangi et al., 2019], ^[2021]).

En este estudio, el regorafenib y el trametinib mejoraron el tamaño de la larva y redujeron la expansión de la ZHP en el avatar byn>RAP-N4, lo que indica que este genotipo es sensible al tratamiento. Esto es notable porque byn>RAP-N4 no tratado tiene cambios en los genes reguladores del crecimiento, incluidos osa (ortólogo del ARID1A humano) y polo (PLK2), que están relacionados con la regulación de la cromatina, la mitosis y el crecimiento de los tejidos ([Chapagai et al., 2025]; [Hao et al., 2025]). La sensibilidad observada de las líneas a las inhibiciones de RAF y MEK refleja la biología fundamental conservada entre las especies; cabe señalar que las concentraciones de fármacos utilizadas en nuestro estudio no deben considerarse como una guía directa para la dosificación humana, dadas las principales diferencias interespecíficas en el manejo y el metabolismo de los xenobióticos ([Rand et al., 2023]). No obstante, los efectos dependientes de la concentración en el tamaño de la ZHP y la supervivencia proporcionan una lectura útil de la actividad y la toxicidad dentro de este modelo.

La actividad de ERK aumentada es una característica reconocida del CCRC, sobre todo en los tumores con KRAS, NRAS y BRAF oncogénicos ([White et al., 2026]). Como se esperaba, las tres líneas de avatares mostraron una actividad de ERK alterada en la ZHP, con el mayor aumento en byn>RAP-N11. Los datos también mostraron un aumento progresivo de la señal de dpERK hacia el intestino posterior distal fuera de la ZHP, lo que indica una heterogeneidad espacial en la actividad de la vía (Figuras suplementarias S2–S4). Tanto el regorafenib como el trametinib redujeron la activación de ERK, aunque el regorafenib produjo un patrón más desigual, lo que sugiere una supresión incompleta o una reactivación de la vía compensatoria. Esto se alinea con estudios previos donde la señalización de MAPK puede recuperarse después de la inhibición de la quinasa a través de mecanismos de retroalimentación ([Ponsioen et al., 2021]). Estos resultados muestran que la señalización de ERK en estos avatares es espacialmente dinámica y específica del genotipo, y esto probablemente contribuye a las diferencias en la respuesta al tratamiento.

Nuestros datos sobre el estrés oxidativo proporcionaron una segunda capa, sorprendente, a la respuesta de los avatares a los fármacos. El estrés oxidativo contribuye a la progresión del CRC, pero las células tumorales pueden adaptarse aumentando la capacidad antioxidante y remodelando el metabolismo ([Catalano et al., 2025]). Excepto para byn>RAP-N11, el tratamiento con regorafenib y trametinib redujo generalmente los marcadores de estrés oxidativo, restauró las medidas antioxidantes y mejoró el equilibrio metabólico mitocondrial, lo que concuerda con una mejor supervivencia de las moscas. Sin embargo, en byn>RAP-N3 y byn>RAP-N4, concentraciones más altas de fármacos aumentaron la tasa metabólica mitocondrial, lo que sugiere una actividad metabólica compensatoria bajo estrés inducido por el tratamiento. Junto con el aumento de la expresión de Trx-2 en entornos específicos, este aumento sugiere que la adaptación redox mitocondrial es un posible mecanismo de resistencia al tratamiento, en línea con informes previos en el CRC ([Jovanović et al., 2022]; [Qiu et al., 2025]).

En conjunto, estos datos demuestran que la respuesta terapéutica en los avatares de CRC derivados de pacientes nigerianos está fuertemente influenciada por el genotipo tumoral, lo que subraya las limitaciones de un enfoque terapéutico único para todos ([Sirugo et al., 2019]; [Vogelstein et al., 2013]). Además, plantea varias preguntas: qué tumores responden a los fármacos disminuyendo la tasa metabólica mitocondrial, cuáles aumentándola y cuáles son las consecuencias prácticas de cada tipo de tumor. En términos más amplios, este estudio refuerza la idea de utilizar modelos de Drosophila específicos del paciente para probar los efectos terapéuticos basados en el genotipo en el cáncer colorrectal, al tiempo que aborda una importante laguna en los modelos que representan la diversidad del CRC en África Occidental.

Materiales y Métodos

Construcción y validación de modelos de Drosophila

Se accedió a la secuencia genómica de 10 pacientes con cáncer colorrectal a partir de un conjunto de datos existente a través de cBioportal (https://www.cbioportal.org/) ([Alatise et al., 2021]). Se seleccionaron mutaciones impulsoras del cáncer (ver Tabla 1). Para modelar el efecto de las mutaciones de pérdida de función en los supresores tumorales, se crearon horquillas de shRNA para permitir la inhibición de los supresores tumorales. Se diseñó una única secuencia de siRNA de 21 nucleótidos por gen con DSIR, utilizando una puntuación de eficiencia ajustada al objetivo de aproximadamente el 85% ([Filhol et al., 2012]). Las secuencias objetivo de los siRNA se indican en la Tabla S1 suplementaria. Basándose en nuestro trabajo anterior, las secuencias de sentido y antisentido de los siRNA diseñados se unieron en un grupo de horquillas, utilizando secuencias de creación de bucles de horquilla y secuencias de flanqueo ([Bangi et al., 2019]).

Los grupos de shRNA se sintetizaron y se subclonaron en uno de los múltiples sitios de clonación (MCS) de un vector de expresión pWalium modificado previamente descrito que contiene tres MCS independientes aguas abajo de los elementos de respuesta UAS ([Bangi et al., 2019]). La síntesis de los grupos de shRNA y la subclonación se realizaron por GENEWIZ (Azenta Life Sciences). Los transgenes de cDNA que codifican Egfr, Pi3K92E y Myc de tipo salvaje se digirieron de los vectores de laboratorio Cagan existentes y se subclonaron en los otros MCS según se indica. Se muestra un ejemplo del mapa del plásmido en la Figura S1 suplementaria. Antes de la inyección, todo el plásmido se secuenció por Plasmidsaurus Inc (EE. UU.). Las secuencias de los plásmidos están disponibles bajo petición. La inserción transgénica mediada por PhiC31 en el sitio de aterrizaje del cromosoma 2 VK00018 se realizó por Bestgene. Las líneas transgénicas resultantes se cruzaron con w1118 durante dos generaciones para eliminar la integrasa cromosómica X.

La cepa RAP, con una inserción attP40 de un vector de expresión pWalium modificado que contiene horquillas de shRNA UAS-Ras85DG12V y UAS-4X Apc + 4X p53, se generó previamente ([Bangi et al., 2016]; [Cong et al., 2025]). Las cepas RA y RP (también insertadas en attP40), se generaron de manera similar a RAP, pero carecían de horquillas de orientación a p53 o Apc. Posteriormente, el transgen específico del paciente se recombinó con el transgen RAP para generar el modelo completo. La presencia de la inserción específica del paciente (VK00018) y RAP (attP40) en los recombinantes se confirmó mediante PCR.

Para una mayor validación, la expresión del transgen se dirigió en el intestino posterior de las larvas utilizando la línea conductora byn-Gal4, Gal80(ts), GFP/Tm6b ([Cong et al., 2025]). Las hembras vírgenes de la línea conductora se cruzaron con los machos de las líneas de avatar específicas del paciente en una proporción de 2:1 después de un preapareamiento de 48 horas a 25 °C, con la cepa w1118 como control. A continuación, se permitió que las moscas depositaran huevos durante 24 horas en dietas que contenían 0,1% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 18 °C y 27 °C. A 18 °C, los embriones se incubaron durante 24, 48 y 72 horas antes de transferirlos a 27 °C, donde el desarrollo continuó hasta la eclosión.

Puntuación y análisis de la supervivencia.

Los embriones de las moscas cruzadas se dejaron desarrollar hasta convertirse en pupas y adultos, durante los cuales se contaron para determinar la pupación y la eclosión, respectivamente. La puntuación de la eclosión duró un período de 7 días después de la eclosión, ya que byn>transgenes experimentó un retraso en la eclosión. Las tasas de pupación y eclosión se calcularon y se expresaron como porcentajes de byn>transgene (no tubby) frente a animales de control (Tb) mediante la fórmula que se indica a continuación.

Cálculos: [Abreviaturas: Pupas de control (CP), marcadas con Tb, pupas experimentales (EP), no tubby y adultos experimentales (EA)].

Caracterización del modelo y pruebas con fármacos

Los cruces se llevaron a cabo utilizando hembras vírgenes de byn-Gal4, Gal80(ts), GFP/Tm6b y líneas de transgenes macho en dietas normales para preaparearse durante 48 horas. Las moscas se distribuyeron en una proporción de 2:1 (hembra:macho) en dietas de tratamiento que contenían regorafenib o trametinib a concentraciones finales de 0,01, 0,10 y 1,00 μM, mientras que las larvas de control y tumor se alimentaron con una dieta que contenía 0,1% de DMSO. Las moscas permanecieron en las dietas durante 24 horas, después de lo cual se permitió que los embriones de las dietas se desarrollaran a 27 °C. Se recogieron larvas de tercer estadio con tumor de 5 días de edad para realizar experimentos como la imagenología y los ensayos bioquímicos.

Tinción con anticuerpos y microscopía de fluorescencia

Las larvas de tercer estadio se colocaron en toallitas previamente lavadas empapadas en un 4% de sacarosa a 27 °C durante 2 horas para permitir la limpieza del intestino y reducir la autofluorescencia de los alimentos ingeridos ([Pranoto y Kwon, 2024]). Los intestinos se disecaron en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS, pH 7,4) a 0 °C y se fijaron en un 4% de paraformaldehído durante 30 minutos. A continuación, los intestinos se lavaron 3 veces a intervalos de 5 minutos en PBS 1X y luego se incubaron en una solución de tinción de DAPI de 1 μg/mL (byn>RAP-N3 y N11) y 1 μg/mL de Hoechst en 0,2% de PBST (byn>RAP-N4) durante cinco minutos. A continuación, los intestinos se lavaron 3 veces en PBS 1X, después de lo cual se montaron y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR de 10X y se capturaron imágenes con una cámara digital CMOS de 5,0 MP de 1/2,5''.

Para la tinción con anticuerpos, el intestino se disecó y se fijó siguiendo el método indicado anteriormente. El intestino fijado se lavó con PBS más 0,1% de Triton X-100 (0,1% PBST) tres veces con intervalos de 15 minutos. A continuación, el intestino se bloqueó con PBST y albúmina sérica bovina (PBTB; PBS 1X, 0,1% de Triton X-100, 5% de BSA (p/v)) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, el intestino se incubó con el anticuerpo primario [anticuerpo monoclonal de conejo anti-diphospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (1:200) (n.º de catálogo: 9101S)] preparado en 5% de PBTB durante la noche a 4 °C. A continuación, el anticuerpo primario se lavó con 0,1% de PBST tres veces con intervalos de 15 minutos y se bloqueó con PBTB durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, el intestino se incubó con el anticuerpo secundario [Alexa Fluor 555 anti-IgG de conejo (H + L)] a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de la tinción con Hoechst durante 5 minutos y se lavó dos veces en 0,1% de PBST con intervalos de 5 minutos. Por último, los intestinos se montaron con 75% de glicerol y las imágenes se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR de 20X y se capturaron imágenes con una cámara digital CMOS de 5,0 MP de 1/2,5''. La intensidad de fluorescencia se obtuvo utilizando el software Fiji.

Análisis de imágenes para la intensidad de fluorescencia

Después de la imagen de los intestinos utilizando el software Image view vx64,3.7.6701, la intensidad de la señal de fluorescencia se cuantificó utilizando el software Fiji ([Schindelin et al., 2012]). Las imágenes del canal verde de la HPZ se separaron y se eliminó el fondo a 200 antes de la cuantificación. La región de interés para la medición de GFP se marcó manualmente utilizando la herramienta de selección de polígono que abarca la HPZ hasta el área luminal del intestino posterior y se midió la intensidad de GFP. De manera similar, la ROI para la intensidad de la señal de dpERK también se seleccionó con la herramienta oval, colocada alrededor de la unión posterior del intestino medio-posterior. El perfil de intensidad espacial de dpERK (Figuras S2–S4 suplementarias) se midió utilizando la línea de 140 μm dibujada manualmente desde la HPZ hasta la parte distal del intestino posterior. Los datos obtenidos de Fiji se analizaron utilizando GraphPad Prism, mientras que el perfil de intensidad de dpERK se visualizó utilizando Microsoft Power BI Desktop, versión 2.152.1057.0 de 64 bits (marzo de 2026).

Imagenología de larvas

Las larvas errantes se inmovilizaron en PBS durante 3-4 horas a 4 °C, seguido de la imagenología y la captura de imágenes utilizando una cámara digital CMOS de 5,0 MP de 1/2,5'' conectada a un microscopio de disección con un aumento de 0,7X.

Medición y análisis del tamaño relativo de las larvas y el intestino

Las áreas de la HPZ y las larvas se midieron utilizando Fiji (ImageJ v1.54p). Las imágenes del intestino se adquirieron con un aumento de 10X utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR de 10X, y las larvas se visualizaron con un aumento de 0,7X utilizando un microscopio estereoscópico StereoBlue Euromex. Se utilizó una cámara digital CMOS de 5,0 MP de 1/2,5'' para la captura de imágenes. Las imágenes se calibraron en milímetros en función de las dimensiones de los píxeles de la cámara (2592 × 1944 con un tamaño de píxel de ≈ 2,2 μm/píxel).

Para medir la longitud y el ancho de la larva, FiJi se escaló a 3,143 μm/píxel después de los ajustes para el aumento (μm/píxel = 2,2 / 0,7 = 3,143 μm/píxel). El tamaño relativo del intestino se cuantificó utilizando las dimensiones de la zona de proliferación del intestino posterior siguiendo un enfoque de calibración similar utilizado en las mediciones de las larvas con un ajuste para el aumento (μm/píxel = 2,2 / 10 = 0,22 μm/píxel). Se midió la longitud de la HPZ hasta el área luminal, mientras que su ancho se midió en tres regiones distintas a lo largo de su extensión. El tamaño relativo del intestino se determinó normalizando el área del intestino al tamaño total de la larva (área) utilizando la fórmula: Tamaño relativo del intestino = Área del intestino / Área del tamaño de la larva. La normalización tiene en cuenta la variación en el tamaño del cuerpo de la larva y permite una comparación precisa del intestino entre las muestras.

Preparación de larvas de D. melanogaster para ensayos bioquímicos

Para realizar ensayos bioquímicos, las larvas se pesaron utilizando una balanza ES 225SM-DR SWISS MADE y se homogeneizaron en un tampón de fosfato frío 0,1 M, pH 7,4 (10 μL por mg), sobre hielo. El homogeneizado se centrifugó utilizando una centrífuga Eppendorf 5804 R a 2300 rcf durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante obtenido se pipeteó suavemente en tubos de microcentrifugación estériles y se utilizó para el examen de los marcadores bioquímicos del estrés oxidativo y los antioxidantes.

Determinación de la concentración de proteínas

La concentración de proteínas se determinó utilizando el método de Lowry ([Kielkopf et al., 2020]). En resumen, la mezcla de reacción contenía 20 μL de la muestra diluida (1:10), 60 μL de agua destilada y 200 μL de la solución C (0,1 M de NaOH, 2% de Na2CO3, 2% de tartrato de Na-K y 1% de CuSO4). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después de lo cual se añadieron 20 μL de una dilución 1:5 del reactivo de Folin-Ciocalteu y se incubó durante otros 15 minutos. La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) a 650 nm frente a un blanco. El ensayo de determinación de proteínas se realizó para normalizar los contenidos totales de tioles y tioles no proteicos.

Estimación del nivel total de tioles

La concentración total de tioles se determinó utilizando el reactivo de Ellman ([Dhawan et al., 2021]). La mezcla de reacción consiste en 20 μL de la muestra diluida preparada, 10 μL de 5,5′-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) y 270 μL de tampón fosfato 0,1 M. La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 412 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). El nivel total de tioles se calculó utilizando una curva estándar de GSH y se expresó como μmol/mg de proteína.

Determinación del nivel de tioles no proteicos

El nivel de tioles no proteicos (NPSH) se estimó utilizando el reactivo de Ellman. El contenido de proteínas de la muestra se precipitó utilizando ácido tricloroacético (TCA) al 10% en una proporción de 1:1. Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante 1 hora y luego se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. La mezcla de reacción consistió en 200 μL de tampón fosfato 0,1 M, 50 μL de muestra y 50 μL de DTNB. La absorbancia se leyó a 412 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). La concentración de NPSH se estimó utilizando una curva estándar y se presentó como mmol/mg de proteína (Ginet et al., 2025).

Evaluación de la oxidación por ROS/RONS

La oxidación de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH) por el sobrenadante de la muestra sirve como un índice amplio del estrés oxidativo, como se describió previamente ([Pérez-Severiano et al., 2004]). La mezcla de reacción consistió en 450 μL de tampón de fosfato de potasio 0,1 μM (pH 7,4), 120 μL de agua destilada, 15 μL de 200 μM de DCFH-DA (concentración final: 5 μM) y 15 μL de muestra diluida. La emisión de fluorescencia de DCF producida por la oxidación de DCFH se registró durante 10 minutos (cada 30 segundos) a longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 525 nm, respectivamente, utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (Infitek SP-LF96S). El grado de formación de DCF se representó como un porcentaje del grupo de control experimental.

Estimación del nivel de nitrito/nitrato (óxido nítrico)

La concentración de nitrito/nitrato (óxido nítrico) se determinó según el método de Green ([Tsikas, 2007]). La mezcla de reacción contenía un volumen igual de reactivo de Griess recién preparado (0,1% de diclorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina; 1% de sulfanilamida en ácido fosfórico) y la muestra preparada (1:1), que se incubó y se midió la absorbancia a 550 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). El nivel de óxido nítrico se cuantificó utilizando la curva estándar de nitrato de sodio medida a 550 nm.

Estimación de la tasa metabólica mitocondrial

La tasa metabólica mitocondrial de las larvas tratadas se determinó utilizando el ensayo MTT ([Abe & Matsuki, 2000]). La mezcla de reacción contenía 20 μL de muestra diluida, 10 μL de 3-(4,5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) a una concentración final de 5 mg/mL y 170 μL de PBS, y se incubó a 37 °C durante 3 horas. El producto de formazán se leyó luego utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) a 570 nm y 650 nm después de la disolución en 100 μL de DMSO. La tasa metabólica mitocondrial se representó como un porcentaje del grupo de control.

Extracción y análisis de ARN

Se aisló ARN total de 10 a 15 intestinos de larvas de tercer estadio disecados de avatares de CRC utilizando el método fenol-cloroformo descrito previamente ([Green & Sambrook, 2020]). La pureza del ARN aislado se comprobó a A260/A280 y A260/A230 utilizando el espectrofotómetro de microvolumen Spectradrop en el lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.).

Diseño de primers y eficiencia

Los genes utilizados en este estudio se obtuvieron de (https://flybase.org/). Los primers se diseñaron utilizando Primer3 (https://primer3.ut.ee/) y la herramienta BLAST de primers del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Secuencia de primer para Trx-2: Primer directo (GTCTCCACATCTCCCATCCA) y Primer reverso (TTGACGCCGTTCTTGAGGAA). Para garantizar la especificidad y la amplificación precisa de los genes diana, el primer diseñado se sometió a validación según lo informado previamente ([Chen et al., 2023]).

Síntesis de ADNc y análisis de qRT-PCR

Se utilizó una alícuota del ARN total aislado (200 ng) para la síntesis de ADNc siguiendo el protocolo descrito por el fabricante para el kit LunaScript® RT SuperMix Kit (E3010) y se llevó a cabo en un termociclador PCR convencional BioRad T100. Se utilizó el kit Luna Universal qPCR master mix para la qRT-PCR. Para cada una de las réplicas, se utilizó un volumen total de reacción de 10 μL, que consistía en 1,5 μL de ADNc de cada muestra y 8,5 μL de mezcla de reacción de PCR (5 μL de master mix TaqMan, 3 μL de agua libre de nucleasas y 0,5 μL de mezcla de primer-sonda de ensayo de expresión génica). Se aplicaron parámetros de ciclismo térmico rápido estándar de 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 45 segundos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, utilizando el termociclador q-PCR QuantStudio-5. Las cantidades relativas se corrigieron para la eficiencia de la amplificación y se calculó el cambio en la expresión génica entre los grupos utilizando el método de cuantificación comparativa ([Pfaffl, 2001]).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como mediana o media ± SEM, o rango, según corresponda. Las comparaciones entre múltiples grupos o factores se realizaron utilizando ANOVA de una o dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se utilizó la prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones entre dos grupos independientes. Se verificaron los supuestos de la prueba paramétrica antes del análisis. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Los análisis se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0.0.

Construcción y validación de modelos de Drosophila

Se accedió a la secuencia genómica de 10 pacientes con cáncer colorrectal a partir de un conjunto de datos existente a través de cBioportal (https://www.cbioportal.org/) ([Alatise et al., 2021]). Se seleccionaron mutaciones impulsoras del cáncer (ver Tabla 1). Para modelar el efecto de las mutaciones de pérdida de función en los supresores tumorales, se crearon horquillas de ARN de interferencia (shRNA) para permitir la inhibición de los supresores tumorales. Se diseñó una única secuencia de siRNA de 21 nucleótidos por gen con DSIR, utilizando una puntuación de eficiencia ajustada al objetivo de ~85 ([Filhol et al., 2012]). Las secuencias diana de los siRNA se indican en la Tabla S1 suplementaria. Basándose en nuestro trabajo anterior, las secuencias de sentido y antisentido de los siRNA diseñados se unieron en un clúster de horquillas, utilizando secuencias de creación de bucles de horquillas y secuencias de flanqueo ([Bangi et al., 2019]).

Los clústeres de shRNA se sintetizaron y se subclonalizaron en uno de los múltiples sitios de clonación (MCS) de un vector de expresión modificado pWalium descrito previamente que contiene tres MCS independientes aguas abajo de los elementos de respuesta UAS ([Bangi et al., 2019]). La síntesis de los clústeres de shRNA y la subclonalización fueron realizadas por GENEWIZ (Azenta Life Sciences). Los transgénes de ADNc que codifican Egfr, Pi3K92E y Myc de tipo salvaje se digirieron de los vectores de laboratorio Cagan existentes y se subclonalizaron en los otros MCS, según se indica. Se muestra un ejemplo del mapa del plásmido en la Figura S1 suplementaria. Antes de la inyección, todo el plásmido se secuenció por Plasmidsaurus Inc (EE. UU.). Las secuencias de los plásmidos están disponibles bajo petición. La inserción mediada por PhiC31 en el sitio de inserción del cromosoma 2 VK00018 se realizó por Bestgene. Las líneas transgénicas resultantes se cruzaron con w1118 durante dos generaciones para eliminar el integrasa cromosómico X.

La cepa RAP, con una inserción attP40 de un vector de expresión modificado pWalium que contiene UAS-Ras85DG12V y horquillas de shRNA UAS-4X Apc + 4X p53, se generó previamente ([Bangi et al., 2016]; [Cong et al., 2025]). Las cepas RA y RP (también insertadas en attP40), se generaron de manera similar a RAP, pero carecían de horquillas de orientación a p53 o Apc. Posteriormente, el transgen específico del paciente se recombinó con el transgen RAP para generar el modelo completo. La presencia de la inserción específica del paciente (VK00018) y RAP (attP40) en los recombinantes se confirmó mediante PCR.

Para una mayor validación, la expresión del transgen se dirigió en el intestino de las larvas utilizando la línea conductora byn-Gal4, Gal80(ts), GFP/Tm6b ([Cong et al., 2025]). Las hembras vírgenes de la línea conductora se cruzaron con machos de las líneas de avatar específicas del paciente en una proporción de 2:1 después de un preapareamiento de 48 horas a 25 °C, con la cepa w1118 como control. Luego, se permitió que las moscas depositaran huevos durante 24 horas en dietas que contenían 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO) a 18 °C y 27 °C. A 18 °C, los embriones se incubaron durante 24, 48 y 72 horas antes de transferirlos a 27 °C, donde el desarrollo continuó hasta la eclosión.

Puntuación y análisis de la supervivencia.

Los embriones de las moscas cruzadas se dejaron desarrollar en pupas y adultos, durante los cuales se contaron para determinar la pupación y la eclosión, respectivamente. La puntuación de la eclosión duró un período de 7 días después de la eclosión, ya que byn>transgenes experimentó un retraso en la eclosión. Las tasas de pupación y eclosión se calcularon y se expresaron como porcentajes de byn>transgen (no tubby) frente a animales de control (Tb) mediante la fórmula que se muestra a continuación.

Cálculos: . [Abreviaturas: Pupa de control (CP), marcada por Tb, Pupa experimental (EP), no tubby y Adulto experimental (EA)].

Puntuación y análisis de la supervivencia.

Los embriones de las moscas cruzadas se dejaron desarrollar en pupas y adultos, durante los cuales se contaron para determinar la pupación y la eclosión, respectivamente. La puntuación de la eclosión duró un período de 7 días después de la eclosión, ya que byn>transgenes experimentó un retraso en la eclosión. Las tasas de pupación y eclosión se calcularon y se expresaron como porcentajes de byn>transgen (no tubby) frente a animales de control (Tb) mediante la fórmula que se muestra a continuación.

Cálculos: . [Abreviaturas: Pupa de control (CP), marcada por Tb, Pupa experimental (EP), no tubby y Adulto experimental (EA)].

Caracterización del modelo y pruebas con fármacos

Se realizaron cruces utilizando hembras vírgenes de byn-Gal4, Gal80(ts), GFP/Tm6b y líneas de transgenes macho en dietas normales para preaparearse durante 48 horas. Las moscas se distribuyeron en una proporción de 2:1 (hembra:macho) en dietas de tratamiento que contenían regorafenib o trametinib a concentraciones finales de 0,01, 0,10 y 1,00 μM, mientras que las larvas tumorales de control se alimentaron con una dieta que contenía 0,1% de DMSO. Las moscas permanecieron en las dietas durante 24 horas, después de lo cual se recogieron los embriones en las dietas para realizar experimentos como la imagenología y los ensayos bioquímicos en larvas tumorales de tercer estadio de 5 días de edad.

Tinción con anticuerpos y microscopía de fluorescencia

Las larvas de tercer estadio se colocaron en toallitas previamente lavadas empapadas en 4% de sacarosa a 27 °C durante 2 horas para permitir la limpieza del intestino y reducir la autofluorescencia de los alimentos ingeridos ([Pranoto & Kwon, 2024]). Los intestinos se disecaron en PBS (pH 7,4) 1X frío y se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 30 minutos. Posteriormente, los intestinos se lavaron 3 veces a intervalos de 5 minutos en PBS 1X y luego se incubaron en solución de tinción de DAPI de 1 μg/mL (byn>RAP-N3 y N11) y 1 μg/mL de Hoechst en 0,2% de PBST (byn>RAP-N4) durante cinco minutos. A continuación, los intestinos se lavaron 3 veces en PBS 1X, después de lo cual se montaron y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR 10X y se capturaron imágenes con una cámara digital CMOS de 5,0 MP de 1/2,5''.

Para la tinción con anticuerpos, el intestino se diseccionó y fijó siguiendo el método descrito anteriormente. El intestino fijado se lavó con PBS más 0,1 % de Triton X-100 (0,1 % PBST) tres veces, con intervalos de 15 minutos. A continuación, el intestino se bloqueó con PBST y albúmina sérica bovina (PBTB; 1x PBS, 0,1 % de Triton X-100, 5 % de ASB (p/v)) durante 1 hora a temperatura ambiente. El intestino se incubó con el anticuerpo primario [anticuerpo monoclonal de conejo anti-difosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) (1:200) (número de catálogo: 9101S)] preparado en 5 % de PBTB durante la noche a 4 °C. A continuación, el anticuerpo primario se lavó con 0,1 % de PBST tres veces, con intervalos de 15 minutos, y se bloqueó con PBTB durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, el intestino se incubó con el anticuerpo secundario [Alexa Fluor 555, anti-IgG de cabra contra conejo (H + L)] a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de la tinción con Hoechst durante 5 minutos y se lavó en 0,1 % de PBST dos veces, con intervalos de 5 minutos. Finalmente, los intestinos se montaron con 75 % de glicerol y las imágenes se visualizaron utilizando un microscopio fluorescente Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR 20X y se capturaron con una cámara digital CMOS APTINA de 5,0 MP y 1/2,5''. La intensidad de fluorescencia se obtuvo utilizando el software Fiji.

Análisis de imágenes para la intensidad de fluorescencia

Después de obtener imágenes de los intestinos utilizando el software Image View vx64,3.7.6701, la intensidad de la señal fluorescente se cuantificó utilizando el software Fiji ([Schindelin et al., 2012]). Las imágenes del canal verde de la HPZ se separaron y se restó el fondo a 200 antes de la cuantificación. La región de interés para la medición de GFP se marcó manualmente utilizando la herramienta de selección polígono, abarcando la HPZ hasta el área luminal del intestino posterior, y se midió la intensidad de GFP. De manera similar, la ROI para la intensidad de la señal dpERK también se seleccionó con la herramienta oval, colocada alrededor de la unión posterior del intestino medio y el intestino posterior. El perfil de intensidad espacial de dpERK (Figuras suplementarias S2–S4) se midió utilizando la línea de 140 μm dibujada manualmente desde la HPZ hasta la parte distal del intestino posterior. Los datos obtenidos de Fiji se analizaron utilizando GraphPad Prism, mientras que el perfil de intensidad de dpERK se visualizó utilizando Microsoft Power BI Desktop, versión 2.152.1057.0 de 64 bits (marzo de 2026).

Obtención de imágenes de larvas

Las larvas errantes se inmovilizaron en PBS durante 3 a 4 horas a 4 °C, seguido de la obtención de imágenes y captura utilizando una cámara digital CMOS APTINA de 5,0 MP y 1/2,5'' conectada a un microscopio de disección con un aumento de 0,7X.

Medición y análisis del tamaño relativo de las larvas y el intestino

Las áreas de la HPZ y las larvas se midieron utilizando Fiji (ImageJ v1.54p). Las imágenes del intestino se obtuvieron con un aumento de 10X utilizando un microscopio fluorescente Zeiss Axioskop con un objetivo PLAN-NEOFLUAR 10X, y las larvas se obtuvieron con un aumento de 0,7X utilizando un microscopio estereoscópico StereoBlue Euromex. Se utilizó una cámara digital CMOS Aptina de 5,0 MP y 1/2,5'' para la adquisición de imágenes. Las imágenes se calibraron a milímetros basándose en las dimensiones de los píxeles de la cámara (2592 × 1944 con un tamaño de píxel de ≈ 2,2 μm/píxel).

Para medir la longitud y el ancho de la larva, FiJi se escaló a 3,143 μm/píxel después de los ajustes para el aumento (μm/píxel = 2,2 / 0,7 = 3,143 μm/píxel). El tamaño relativo del intestino se cuantificó utilizando las dimensiones de la zona de proliferación del intestino posterior siguiendo un enfoque de calibración similar utilizado en las mediciones de las larvas con ajuste para el aumento (μm/píxel = 2,2 / 10 = 0,22 μm/píxel). Se midió la longitud de la HPZ hasta el área luminal, mientras que su ancho se midió en tres regiones distintas a lo largo de su extensión. El tamaño relativo del intestino se determinó normalizando el área del intestino al tamaño total de la larva (área) utilizando la fórmula: Tamaño relativo del intestino = Área del intestino / Área del tamaño de la larva. La normalización tiene en cuenta la variación en el tamaño del cuerpo de la larva y permite una comparación precisa del intestino entre las muestras.

Preparación de larvas de D. melanogaster para ensayos bioquímicos

Para realizar ensayos bioquímicos, las larvas se pesaron utilizando una balanza ES 225SM-DR SWISS MADE y se homogeneizaron en tampón de fosfato frío 0,1 M, pH 7,4 (10 μL por mg), sobre hielo. El homogeneizado se centrifugó utilizando una centrífuga Eppendorf 5804 R a 2300 rcf durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante obtenido se pipeteó suavemente en tubos de microcentrifugación estériles y se utilizó para el examen de los marcadores bioquímicos del estrés oxidativo y los antioxidantes.

Determinación de proteínas

La concentración de proteínas se determinó utilizando el método de Lowry ([Kielkopf et al., 2020]). En resumen, la mezcla de reacción contenía 20 μL de la muestra diluida (1:10), 60 μL de agua destilada y 200 μL de solución C (0,1 M de NaOH, 2 % de Na2CO3, 2 % de tartrato de Na-K y 1 % de CuSO4). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después de lo cual se añadieron 20 μL de 1:5 de diluciones del reactivo de Folin-Ciocalteu y se incubó durante otros 15 minutos. La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) a 650 nm frente a un blanco. El ensayo de determinación de proteínas se llevó a cabo para normalizar el contenido total de tioles y tioles no proteicos.

Estimación del nivel total de tioles

La concentración total de tioles se determinó utilizando el reactivo de Ellman ([Dhawan et al., 2021]). La mezcla de reacción consiste en 20 μL de la muestra diluida preparada, 10 μL de 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) y 270 μL de tampón de fosfato 0,1 M. La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 412 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). El nivel total de tioles se calculó utilizando la curva estándar de GSH y se expresó como μmol/mg de proteína.

Determinación del nivel de tioles no proteicos

El nivel de tioles no proteicos (NPSH) se estimó utilizando el reactivo de Ellman. El contenido de proteínas de la muestra se precipitó utilizando 10 % de ácido tricloroacético (TCA) en una proporción de 1:1. Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante 1 hora y luego se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. La mezcla de reacción consistió en 200 μL de tampón de fosfato 0,1 M, 50 μL de muestra y 50 μL de DTNB. La absorbancia se leyó a 412 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). La concentración de NPSH se estimó utilizando una curva estándar y se presentó como mmol/mg de proteína (Ginet et al., 2025).

Evaluación de la oxidación de ROS/RONS

La oxidación de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH) por el sobrenadante de la muestra sirve como un índice amplio del estrés oxidativo, como se describió anteriormente ([Pérez-Severiano et al., 2004]). La mezcla de reacción consistió en 450 μL de tampón de fosfato de potasio 0,1 μM (pH 7,4), 120 μL de agua destilada, 15 μL de 200 μM de DCFH-DA (concentración final: 5 μM) y 15 μL de muestra diluida. La emisión de fluorescencia de DCF producida por la oxidación de DCFH se registró durante 10 minutos (cada 30 segundos) a longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 525 nm, respectivamente, utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia (Infitek SP-LF96S). El grado de formación de DCF se representó como un porcentaje del grupo de control experimental.

Estimación del nivel de nitrito/nitrato (óxido nítrico)

La concentración de nitrito/nitrato (óxido nítrico) se determinó según el método de Green ([Tsikas, 2007]). La mezcla de reacción contenía volúmenes iguales de reactivo de Griess recién preparado (0,1 % de N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro; 1 % de sulfanilamida en ácido fosfórico) y la muestra preparada (1:1), que se incubó y se midió la absorbancia a 550 nm utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). El nivel de óxido nítrico se cuantificó utilizando la curva estándar de nitrato de sodio medida a 550 nm.

Estimación de la tasa metabólica mitocondrial

La tasa metabólica mitocondrial de las larvas tratadas se determinó utilizando el ensayo MTT ([Abe & Matsuki, 2000]). La mezcla de reacción contenía 20 μL de la muestra diluida, 10 μL de 3-(4,5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) a una concentración final de 5 mg/mL y 170 μL de PBS, que se incubó a 37 °C durante 3 horas. El producto de formazán se leyó luego utilizando un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.) a 570 nm y 650 nm después de la disolución en 100 μL de DMSO. La tasa metabólica mitocondrial se representó como un porcentaje del grupo de control.

Extracción y análisis de ARN

Se aisló ARN total de 10 a 15 intestinos de larvas de tercer estadio disecados de avatares de CRC utilizando el método fenol-cloroformo descrito anteriormente ([Green & Sambrook, 2020]). La pureza del ARN aislado se comprobó a A260/A280 y A260/A230 utilizando el espectrofotómetro de microvolumen Spectradrop en el lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.).

Diseño de cebadores y eficiencia

Los genes utilizados en este estudio se obtuvieron de (https://flybase.org/). Los cebadores se diseñaron utilizando Primer3 (https://primer3.ut.ee/) y la herramienta BLAST de cebadores de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Secuencia de cebador para Trx-2 Cebador directo (GTCTCCACATCTCCCATCCA) y Cebador reverso Trx-2 (TTGACGCCGTTCTTGAGGAA). Para garantizar la especificidad y la amplificación precisa de los genes diana, el cebador diseñado se sometió a validación según lo informado anteriormente ([Chen et al., 2023]).

Síntesis de ADNc y análisis de qRT-PCR

Se utilizó una alícuota del ARN total aislado (200 ng) para la síntesis de ADNc siguiendo el protocolo descrito por el fabricante para el kit LunaScript® RT SuperMix Kit (E3010) y se llevó a cabo en un termociclador PCR convencional BioRad T100. El kit Luna Universal qPCR master mix se utilizó para la qRT-PCR. Para cada una de las réplicas, se utilizó un volumen total de reacción de 10 μL, que consistía en 1,5 μL de ADNc de cada muestra y 8,5 μL de mezcla de reacción de PCR (5 μL de mezcla maestra TaqMan, 3 μL de agua libre de nucleasas y 0,5 μL de mezcla de cebadores-sonda de expresión génica). Se aplicaron parámetros de ciclismo térmico rápido estándar de 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 45 segundos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando el termociclador q-PCR QuantStudio-5. Las cantidades relativas se corrigieron para la eficiencia de la amplificación y se calculó el cambio en la expresión génica entre los grupos utilizando el método de cuantificación comparativa ([Pfaffl, 2001]).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como mediana o media ± SEM, o rango, según corresponda. Las comparaciones entre múltiples grupos o factores se realizaron utilizando ANOVA de una o dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se utilizó una prueba t de Student no pareada de dos colas para las comparaciones entre dos grupos independientes. Se verificaron los supuestos de la prueba paramétrica antes del análisis. Se consideró que un valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo. Los análisis se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.0.0.