Los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) desempeñan funciones esenciales en el microambiente tumoral (MET); sin embargo, sus características en condiciones hipóxicas aún no se comprenden completamente. El objetivo del presente estudio fue investigar las propiedades de los FAC hipóxicos e identificar sus factores reguladores en el cáncer colorrectal (CCR). Se analizaron FAC cultivados en condiciones normóxicas e hipóxicas mediante ensayos de proliferación, experimentos de cocultivo, proteómica de espectrometría de masas y secuenciación de ARN de células individuales. Se evaluaron muestras clínicas mediante inmunohistoquímica utilizando la clasificación de la reacción desmoplásica (RD).
Además, se validó la generalización de los hallazgos mediante análisis de correlación utilizando la base de datos The Cancer Genome Atlas. Los FAC hipóxicos mostraron una mayor capacidad proliferativa, y su medio de cultivo promovió la migración y la resistencia a la quimioterapia en las células de CCR. La proteómica de espectrometría de masas reveló un aumento significativo de la proteína de unión a la vitamina D en los medios de cultivo de los FAC hipóxicos, mientras que la secuenciación de ARN de células individuales mostró un enriquecimiento de genes relacionados con el metabolismo óseo y la vía de señalización de la fosfoinositida 3 quinasa AKT. El tratamiento de fibroblastos normales (FN) con proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) indujo fenotipos similares a los de los FAC, mientras que el tratamiento de los FAC con vitamina D condujo a cambios morfológicos hacia una apariencia similar a la de los FN.
En las muestras clínicas, el subtipo RD inmaduro, asociado con un mal pronóstico, exhibió una mayor expresión del marcador de hipoxia, el factor inducible por hipoxia 1, la periostina y la PTHrP, junto con una asociación significativa con las mutaciones del gen homólogo del oncogén del sarcoma de rata de Kirsten (KRAS).
Además, se observó una fuerte correlación positiva entre el número de copias de PTHrP y KRAS en múltiples tipos de cáncer, incluido el CCR.
Estos hallazgos sugieren que el eje PTHrP-vitamina D-oncogén del sarcoma de rata (RAS) funciona como un mecanismo regulador importante en los FAC hipóxicos. La PTHrP y la vitamina D pueden influir en la actividad del otro, y este eje puede contribuir a la progresión tumoral dentro del MET.
Por lo tanto, el eje PTHrP-vitamina D-RAS podría servir como un posible objetivo terapéutico.
Los fibroblastos asociados al cáncer (FAC) presentan una morfología similar a la de los fibroblastos y se sabe que ejercen efectos tanto promotores como supresores del tumor ([1]). Los FAC se localizan en el área peritumoral y constituyen uno de los componentes más cruciales del microambiente tumoral (MET) ([2]). Desempeñan funciones vitales en el crecimiento, la invasión y la metástasis del tumor ([3],[4]). Además del impacto significativo de los FAC en las células cancerosas, las células cancerosas también influyen en los FAC, lo que destaca la importancia de su interacción mutua para comprender la biología del tumor ([5]).
Se ha informado que la clasificación de la reacción desmoplásica (RD) es un índice de evaluación del estroma asociado con el pronóstico en muestras de cáncer colorrectal (CCR) resecado ([6]). La RD se refiere a la respuesta fibrótica generada por los fibroblastos que rodean el tumor, y se sabe que este componente del estroma expresa marcadores de FAC ([7]). En el CCR, la RD se clasifica en tres categorías: i) inmadura; ii) intermedia; y iii) madura; y sirve como predictor pronóstico ([8]).
Dado que los FAC forman el estroma del cáncer e interactúan estrechamente con las células cancerosas, la evaluación de la actividad de los FAC y el estado del estroma del cáncer a través de la clasificación de la RD parece crucial. Se sabe que la clasificación inmadura en la RD indica un mal pronóstico en el CCR ([9]). La periostina es un gen clave en la respuesta fibrogénica del estroma en el CCR, y se ha informado que la periostina está asociada positivamente con la clasificación inmadura en la RD ([10]). Se considera que la RD y la expresión de periostina desempeñan un papel importante en la evaluación de los FAC en muestras clínicas.
El entorno hipóxico dentro de los tumores afecta áreas clave de la biología del cáncer, incluida la invasión celular, la metástasis y la regulación de la muerte celular ([11]). La evidencia informada indicó que los patrones de expresión génica asociados con la hipoxia están relacionados con resultados desfavorables en las neoplasias humanas ([12]). Un estudio previo ([13]) realizado por los autores reveló que las metástasis hepáticas del CCR muestran una reducción progresiva en la densidad vascular y se vuelven cada vez más hipóxicas hacia el centro de las metástasis. Utilizando el análisis de microarrays de células de la región central de las metástasis, se identificó que varios genes novedosos inducidos por la hipoxia, incluida la adrenomedulina ([14]), la prolisina del colágeno, la 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 2 ([15]), la efrina-A1 ([16],[17]), el miembro 2A de la familia de secretoglobulinas ([18]) y la aldolasa A ([19]), están asociados con el pronóstico del CCR ([13]). En el cáncer de páncreas (CP), se ha informado que la hipoxia en el MET mejora el fenotipo inflamatorio de los FAC inducido por citocinas y promueve el crecimiento tumoral ([20]).
Si bien se sabe que la hipoxia mejora el comportamiento maligno del tumor, los roles específicos y las características funcionales de los FAC en condiciones hipóxicas en el CCR siguen siendo en gran medida poco claros. El objetivo del estudio actual es dilucidar los efectos de la hipoxia, una condición fundamental en los tumores sólidos, sobre los FAC e identificar los factores clave involucrados en los FAC hipóxicos. Los hallazgos contribuirán a una comprensión más profunda de la interacción entre los FAC y las células cancerosas.
Materiales y métodos
Criterios de selección de pacientes y recolección de muestras
Se consideró para su inclusión a los pacientes que se sometieron a procedimientos quirúrgicos en el Hospital Universitario de Osaka entre octubre de 2023 y mayo de 2024 y que fueron diagnosticados con CCR según las pautas de la Sociedad Japonesa para el Cáncer de Colon y Recto ([21]). Los criterios de exclusión incluyeron la enfermedad inflamatoria intestinal y la poliposis adenomatosa familiar. No se realizaron exclusiones basadas en la edad o el estadio de la enfermedad. Todos los casos que se sometieron a cirugía durante el período especificado y que fueron evaluados mediante la clasificación de la RD se incluyeron en el estudio. Se incluyeron un total de 59 muestras de tejido de CCR utilizando un muestreo de oportunidad basado en la disponibilidad de casos que cumplían con los criterios de inclusión; el tamaño de la muestra no se determinó mediante un cálculo formal de la potencia. La cohorte de estudio consistió en 26 hombres y 33 mujeres, con una edad media de 73 años (rango: 40-88 años). Todos los pacientes recibieron un diagnóstico definitivo de CCR. La clasificación clinicopatológica se determinó utilizando los criterios de la Sociedad Japonesa para el Cáncer de Colon y Recto. Después de la cirugía, los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos generalmente recibieron quimioterapia adyuvante. Las muestras recolectadas se sumergieron en formaldehído tamponado al 10% y se fijaron durante la noche a 4 °C, luego se deshidrataron a través de una serie de etanol graduado y se incluyeron en parafina.
Aprobación ética y consentimiento informado del paciente
El estudio actual fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka (aprobaciones nos. 15144 y 19020; Suita, Japón). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en el estudio. El protocolo del estudio se ajustó a las pautas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975.
Recolección de muestras clínicas y evaluación histológica
Entre octubre de 2023 y mayo de 2024, se recolectaron 59 muestras de tejido de CCR durante las cirugías realizadas en el Departamento de Cirugía Gastroenterológica, Universidad de Osaka. Las muestras se fijaron con formalina a 4 °C durante la noche, se procesaron a través de etanol graduado y se incluyeron en parafina. Un patólogo, que desconocía los resultados clínicos, clasificó 16 casos como que presentaban RD inmadura y 43 como madura, según los criterios histológicos establecidos.
Fibroblastos del colon
Los FAC y los fibroblastos normales (FN) se aislaron de los tejidos tumorales y normales adyacentes, respectivamente, inmediatamente después de la resección del CCR. Para evitar la contaminación cruzada, se utilizaron hojas de bisturí separadas para cada tipo de tejido. Los fragmentos de tejido se sometieron a digestión enzimática con colagenasa, y el pellet celular resultante se suspendió en medio de cultivo Dulbecco modificado (DMEM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; RRID: SCR001905) con antibióticos. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.; RRID: SCR008452) y se cultivaron a 37 °C con 5% de CO2.
Condiciones de cultivo celular
Los FAC y los FN se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de SFB en condiciones normóxicas (37 °C, 5% de CO2) e hipóxicas (37 °C, 1% de O2). Las líneas celulares de CCR humanas HT29 (RRID: CVCL0320), HCT116 (RRID: CVCL0291) y RKO (RRID: CVCL_0504) se obtuvieron del Banco de Cultivos de Células Americano y se autenticaron utilizando el perfilado de repeticiones cortas en tándem dentro de los 6 meses del uso experimental. Las líneas celulares se probaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando la reacción en cadena de la polimerasa y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de SFB en las mismas condiciones que los fibroblastos.
Tinción por inmunofluorescencia
Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 24 horas, se fijaron con formaldehído al 4% a temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos y se trataron con Triton X-100 y albúmina bovina al 5% (MilliporeSigma) a TA durante 10 minutos. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se aplicaron anticuerpos primarios, incluidos anti-actina alfa-muscular lisa (α-SMA; 1:400; cat. no. 19245; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2734735), anti-factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α; 1:500; cat. no. ab51608; Abcam; RRID: AB880418) y anti-molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM; 1:500; cat. no. 2929; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2098834). Las células se incubaron a TA durante 1 hora, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG de conejo Alexa Fluor 647 (1:500; cat. no. 4414; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB10694544) durante 30 minutos. Después de lavar con PBS, las células se contratiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (1 µg/ml) y se visualizaron utilizando un microscopio confocal.
Tinción inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente ([10],[11]). Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron anti-HIF-1α (1:200), anti-periostina (1:400; cat. no. 20302; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2798819), anti-proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP; 1:200; cat. no. 10817-1-AP; Proteintech Group, Inc.; RRID: AB2174535) y anti-receptor de vitamina D (VDR; 1:200, cat. no. BS-2987R; Bioss Antibodies; RRID: AB11058910). Se utilizó el kit VECTASTAIN® Elite® ABC Rabbit IgG Kit (Vector Laboratories, Inc.; RRID: AB2336817) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C. La intensidad de la tinción se evaluó mediante dos patólogos de forma independiente y se puntuó como +2 (equivalente al control positivo), +1 (más débil que el control positivo) o 0 (sin tinción) para el citoplasma y el estroma peritumoral. Una puntuación de +2 se consideró positiva.
Experimentos de cocultivo
Para los experimentos de cocultivo indirecto, se recolectaron sobrenadantes de FAC cultivados en condiciones hipóxicas y normóxicas. Luego, las células HT29 se cultivaron en un medio que contenía una proporción de 1:1 de DMEM suplementado con SFB y el sobrenadante de cocultivo de FAC respectivo.
Tratamiento con PTHrP y vitamina D
Los FN y los FAC se cultivaron en DMEM suplementado con PBS y PTHrP (1 µg/ml) a 37 °C y 5% de CO2. Para los experimentos de vitamina D, los FAC se cultivaron en DMEM suplementado con 1α,25-dihidroxivitamina D3 (10 µg/ml) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO; concentración final de DMSO ≤0,5%) a 37 °C y 5% de CO2.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,0 × 103 células/pocillo. La proliferación celular se evaluó a las 24, 48 y 72 horas después del tratamiento utilizando 10 µl del kit de conteo de células-8 (cat. no. CK04; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) a 37 °C durante 2 horas según el protocolo del fabricante. La asociación entre las mediciones de absorbancia y el conteo manual de células se verificó antes del experimento. La absorbancia se midió a 450 nm.
Ensayo de migración celular
Se utilizó el ensayo de curación de heridas para evaluar la migración celular. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 2,0 × 105 células/pocillo y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 60-80%. Se utilizó la punta de una pipeta de 200 µl para crear un rasguño lineal en el monocapa celular. El medio de cultivo se cambió a DMEM que contenía 1% de SFB para inhibir la proliferación celular. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio BZ-X710 (Keyence Corporation) a las 0, 24 y 48 horas posteriores al rasguño y se analizaron utilizando ImageJ (versión 1.54f; Institutos Nacionales de Salud) (RRID: SCR_003070). La migración celular se cuantificó midiendo el área media entre los bordes de la herida en tres ubicaciones seleccionadas al azar por un investigador que desconocía las condiciones experimentales.
Ensayo de sensibilidad a fármacos
Las células HT29 cocultivadas con sobrenadante de FAC cultivados en condiciones normóxicas o hipóxicas se sembraron en placas de 96 pocillos a 1,0 × 104 células/pocillo durante 24 horas. Luego, las células se expusieron a diferentes concentraciones de oxaliplatino. La viabilidad celular se evaluó utilizando el kit de conteo de células-8 según el protocolo del fabricante.
Secuenciación y análisis de ARN
La preparación de la muestra y la construcción de la biblioteca se realizaron utilizando el kit de preparación de muestras de ARNm TruSeq (Illumina, Inc.) siguiendo los protocolos del fabricante. Las líneas celulares HCT116, HT29 y RKO se cultivaron en condiciones normóxicas (37 °C, 5% de CO2) e hipóxicas (37 °C, 1% de O2). La secuenciación se realizó en un secuenciador DNBSEQ-G400 (MGI Tech Co., Ltd.) en modo de lectura única de 100 bases. Las secuencias de los adaptadores se eliminaron utilizando Trimmomatic (versión 0.38; RRID: SCR011848). Las lecturas limpias se alinearon con el genoma de referencia humano hg19 utilizando TopHat2 (versión 2.1.1; RRID: SCR013035). Se calcularon los fragmentos por kilobase de exones por millón de fragmentos mapeados utilizando Cufflinks (versión 2.2.1; RRID: SCR014597). Se realizó el análisis de variación del conjunto de genes utilizando R (versión 4.3.2; RRID: SCR001905). La calidad y la integridad del ARN se evaluaron utilizando el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis para medir el grado de degradación. La secuenciación se realizó utilizando el kit de reactivo NovaSeq 6000 S1 (200 ciclos; cat. no. 20028318; Illumina, Inc.). Las concentraciones finales de la biblioteca se cuantificaron utilizando el kit de cuantificación de bibliotecas KAPA (cat. no. KK4824/D; Roche Diagnostics) mediante PCR en tiempo real. Las bibliotecas se normalizaron a 2 nM antes de cargarlas en el secuenciador.
Análisis de proteómica
Se recolectaron sobrenadantes de CAF cultivados en condiciones hipóxicas y normóxicas. Se extrajo la proteína total utilizando el tampón de radioinmunoprecipitación que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las proteínas se procesaron utilizando cromatografía líquida nano y espectrometría de masas tándem, configurada con un sistema Ultimate 3000 Nano LC y Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los datos brutos se analizaron utilizando Scaffold 5 (Proteome Software Inc.; RRID:SCR_014345). El modo de ionización fue positivo (nano-ESI con voltaje capilar de 1,8 kV). La velocidad de flujo fue de 300 nl/min.
Secuenciación de ARN de célula única
Los CAF cultivados tanto en condiciones hipóxicas como normóxicas se prepararon para la secuenciación de ARN de célula única. Las bibliotecas se prepararon según los protocolos de los kits de reactivos Chromium Next GEM Single Cell 3′ (versión 3.1; 10X Genomics, Inc.). La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina HiSeq X. Se utilizó el programa Cell Ranger (versión 6.1.1; RRID:SCR017344) para generar la matriz de datos. Las lecturas de secuenciación brutas se mapearon al genoma de referencia humano (GRCh 38) utilizando el alineador STAR (RRID:SCR015899). La visualización y el análisis de los datos se realizaron utilizando Loupe Browser (versión 6.0.1; 10X Genomics, Inc.).
Análisis bioinformático
Para el análisis de Ontología Génica (GO), se analizaron los 100 genes expresados diferencialmente (DEG) principales, clasificados por valor P, utilizando la plataforma Metascape (https://metascape.org; RRID: SCR016620). Se realizaron gráficos de dispersión y análisis de correlación (coeficiente de correlación de Pearson) utilizando RStudio. Los datos de Variación del Número de Copias (CNV) se obtuvieron del conjunto de datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) a través de la plataforma cBioPortal (RRID:SCR014555). La información de los genes y las ubicaciones cromosómicas se obtuvieron de la base de datos NCBI Gene (RRID:SCR_002472).
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (Dotmatics; RRID: SCR_002798). Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para las comparaciones múltiples, se utilizó el análisis de varianza de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Los análisis de correlación se realizaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson y el coeficiente de correlación de rango de Spearman. Se consideró que un valor de P < 0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.
Disponibilidad de datos
Todos los datos de ARN y de secuenciación de ARN de célula única generados en el presente estudio se han depositado en el Gene Expression Omnibus. Los datos de CNV de TCGA se accedieron a través de la plataforma cBioPortal (https://www.cbioportal.org/). La información de los genes se obtuvo de la base de datos NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Criterios de selección de pacientes y recolección de muestras
Se consideraron para su inclusión los pacientes que se sometieron a procedimientos quirúrgicos en el Hospital Universitario de Osaka entre octubre de 2023 y mayo de 2024 y que fueron diagnosticados con CRC según las directrices de la Sociedad Japonesa para el Cáncer de Colon y Recto ([21]). Los criterios de exclusión incluyeron la enfermedad inflamatoria intestinal y la poliposis adenomatosa familiar. No se realizaron exclusiones basadas en la edad o el estadio de la enfermedad. Todos los casos que se sometieron a cirugía durante el período especificado y que fueron evaluados mediante la clasificación DR se incluyeron en el estudio. Se incluyeron un total de 59 muestras de tejido de CRC utilizando un muestreo de oportunidad basado en la disponibilidad de casos que cumplían los criterios de inclusión; el tamaño de la muestra no se determinó mediante un cálculo formal de la potencia. La cohorte de estudio consistió en 26 hombres y 33 mujeres, con una edad media de 73 años (rango: 40-88 años). Todos los pacientes recibieron un diagnóstico definitivo de CRC. La clasificación clinicopatológica se determinó utilizando los criterios de la Sociedad Japonesa para el Cáncer de Colon y Recto. Después de la cirugía, los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos generalmente recibieron quimioterapia adyuvante. Las muestras recolectadas se sumergieron en formaldehído tamponado al 10% y se fijaron durante la noche a 4 °C, luego se deshidrataron mediante una serie de etanol graduado y se incluyeron en parafina.
Aprobación ética y consentimiento informado del paciente
El presente estudio fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka (aprobaciones nos. 15144 y 19020; Suita, Japón). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en el estudio. El protocolo del estudio se ajustó a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975.
Recolección de muestras clínicas y evaluación histológica
Entre octubre de 2023 y mayo de 2024, se recolectaron 59 muestras de tejido de CRC durante las cirugías realizadas en el Departamento de Cirugía Gastroenterológica, Universidad de Osaka. Las muestras se fijaron en formalina a 4 °C durante la noche, se procesaron a través de etanol graduado y se incluyeron en parafina. Un patólogo, que desconocía los resultados clínicos, clasificó 16 casos como que presentaban DR inmaduro y 43 como maduro, basándose en criterios histológicos establecidos.
Fibroblastos del colon
Los CAF y los fibroblastos normales (FN) se aislaron de los tejidos tumorales y de los tejidos normales adyacentes, respectivamente, inmediatamente después de la resección del CRC. Para evitar la contaminación cruzada, se utilizaron hojas de bisturí separadas para cada tipo de tejido. Los fragmentos de tejido se sometieron a digestión enzimática con colagenasa, y el pellet celular resultante se suspendió en medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; RRID:SCR001905) con antibióticos. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.; RRID:SCR008452) y se cultivaron a 37 °C con 5% de CO2.
Condiciones de cultivo celular
Los CAF y los FN se cultivaron en DMEM suplementado con un 10% de SFB en condiciones normóxicas (37 °C, 5% de CO2) e hipóxicas (37 °C, 1% de O2). Las líneas celulares de CRC humanas HT29 (RRID: CVCL0320), HCT116 (RRID: CVCL0291) y RKO (RRID: CVCL_0504) se obtuvieron del American Type Culture Collection y se autenticaron utilizando el perfilado de repeticiones tándem cortas dentro de los 6 meses posteriores al uso experimental. Las líneas celulares se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando la reacción en cadena de la polimerasa y se mantuvieron en DMEM suplementado con un 10% de SFB en las mismas condiciones que los fibroblastos.
Tinción por inmunofluorescencia
Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 24 h, se fijaron con formaldehído al 4% a temperatura ambiente (TA) durante 15 min y se trataron con Triton X-100 y albúmina bovina al 5% (MilliporeSigma) a TA durante 10 min. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se aplicaron anticuerpos primarios, incluidos anti-actina de músculo liso alfa (α-SMA; 1:400; cat. no. 19245; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2734735), anti-factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α; 1:500; cat. no. ab51608; Abcam; RRID: AB880418) y anti-molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM; 1:500; cat. no. 2929; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2098834). Las células se incubaron a TA durante 1 h, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG de conejo Alexa Fluor 647 (1:500; cat. no. 4414; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB10694544) durante 30 min. Después de lavar con PBS, las células se contratiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (1 µg/ml) y se visualizaron utilizando un microscopio confocal.
Tinción inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente ([10],[11]). Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron anti-HIF-1α (1:200), anti-periostina (1:400; cat. no. 20302; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB2798819), anti-proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP; 1:200; cat. no. 10817-1-AP; Proteintech Group, Inc.; RRID: AB2174535) y anti-receptor de vitamina D (VDR; 1:200, cat. no. BS-2987R; Bioss Antibodies; RRID: AB11058910). Se utilizó el kit VECTASTAIN® Elite® ABC Rabbit IgG Kit (Vector Laboratories, Inc.; RRID: AB2336817) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C. La intensidad de la tinción se evaluó mediante dos patólogos de forma independiente y se puntuó como +2 (equivalente al control positivo), +1 (más débil que el control positivo) o 0 (sin tinción) para el citoplasma y el estroma peritumoral. Una puntuación de +2 se consideró positiva.
Experimentos de cocultivo
Para los experimentos de cocultivo indirecto, se recolectaron sobrenadantes de CAF cultivados en condiciones hipóxicas y normóxicas. Las células HT29 se cultivaron luego en un medio que contenía una proporción de 1:1 de DMEM suplementado con SFB y el sobrenadante de CAF correspondiente.
Tratamiento con PTHrP y vitamina D
Los FN y los CAF se cultivaron en DMEM suplementado con PBS y PTHrP (1 µg/ml) a 37 °C y 5% de CO2. Para los experimentos con vitamina D, los CAF se cultivaron en DMEM suplementado con 1α,25-dihidroxivitamina D3 (10 µg/ml) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO; concentración final de DMSO ≤ 0,5%) a 37 °C y 5% de CO2.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1,0 × 103 células/pocillo. La proliferación celular se evaluó a las 24, 48 y 72 h después del tratamiento utilizando 10 µl del kit de conteo de células Cell Counting Kit-8 (cat. no. CK04; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) a 37 °C durante 2 h según el protocolo del fabricante. Se verificó la asociación entre las mediciones de absorbancia y el conteo manual de células antes del experimento. La absorbancia se midió a 450 nm.
Ensayo de migración celular
Se utilizó el ensayo de curación de heridas para evaluar la migración celular. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 2,0 × 105 células/pocillo y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 60-80%. Se utilizó la punta de una pipeta de 200 µl para crear un rasguño lineal en el monocapa celular. El medio de cultivo se cambió a DMEM que contenía 1% de SFB para inhibir la proliferación celular. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio BZ-X710 (Keyence Corporation) a las 0, 24 y 48 h después del rasguño y se analizaron utilizando ImageJ (versión 1.54f; National Institutes of Health) (RRID:SCR_003070). La migración celular se cuantificó midiendo el área media entre los bordes de la herida en tres ubicaciones seleccionadas al azar por un investigador que desconocía las condiciones experimentales.
Ensayo de sensibilidad a fármacos
Las células HT29 cocultivadas con sobrenadante de CAF cultivados en condiciones normóxicas o hipóxicas se sembraron en placas de 96 pocillos a 1,0 × 104 células/pocillo durante 24 h. Las células se expusieron luego a diferentes concentraciones de oxaliplatino. La viabilidad celular se evaluó utilizando el kit de conteo de células Cell Counting Kit-8 según el protocolo del fabricante.
Secuenciación y análisis de ARN
La preparación de la muestra y la construcción de la biblioteca se realizaron utilizando el kit de preparación de muestras TruSeq stranded mRNA (Illumina, Inc.) siguiendo los protocolos del fabricante. Las líneas celulares HCT116, HT29 y RKO se cultivaron en condiciones normóxicas (37 °C, 5% de CO2) e hipóxicas (37 °C, 1% de O2). La secuenciación se realizó en un secuenciador DNBSEQ-G400 (MGI Tech Co., Ltd.) en modo de lectura única de 100 bases. Las secuencias de los adaptadores se eliminaron utilizando Trimmomatic (versión 0.38; RRID:SCR011848). Las lecturas limpias se alinearon al genoma de referencia humano hg19 utilizando TopHat2 (versión 2.1.1; RRID:SCR013035). Los fragmentos por kilobase de exones por millón de fragmentos mapeados se calcularon utilizando Cufflinks (versión 2.2.1; RRID:SCR014597). Se realizó el análisis de variación del conjunto de genes utilizando R (versión 4.3.2; RRID:SCR001905). La calidad e integridad del ARN se evaluaron utilizando el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis para medir el grado de degradación. La secuenciación se realizó utilizando el kit de reactivos NovaSeq 6000 S1 (200 ciclos; cat. no. 20028318; Illumina, Inc.). Las concentraciones finales de la biblioteca se cuantificaron utilizando el kit de cuantificación de bibliotecas KAPA (cat. no. KK4824/D; Roche Diagnostics) mediante PCR en tiempo real. Las bibliotecas se normalizaron a 2 nM antes de cargarlas en el secuenciador.
Análisis proteómico
Se recolectaron sobrenadantes de fibroblastos asociados al cáncer (CAFs) cultivados en condiciones hipóxicas y normóxicas. Se extrajo la proteína total utilizando un tampón de radioinmunoprecipitación que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Las proteínas se procesaron utilizando cromatografía líquida nano y espectrometría de masas en tándem, configurada con un sistema de cromatografía líquida nano Ultimate 3000 y un Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los datos brutos se analizaron utilizando Scaffold 5 (Proteome Software Inc.; RRID:SCR_014345). El modo de ionización fue positivo (nano-ESI con voltaje capilar de 1,8 kV). El caudal fue de 300 nl/min.
Secuenciación de ARN de una sola célula
Los CAFs cultivados tanto en condiciones hipóxicas como normóxicas se prepararon para la secuenciación de ARN de una sola célula. Las bibliotecas se prepararon según los protocolos de los kits de reactivos Chromium Next GEM Single Cell 3′ (versión 3.1; 10X Genomics, Inc.). La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina HiSeq X. Se utilizó el programa Cell Ranger (versión 6.1.1; RRID:SCR017344) para generar la matriz de datos. Las lecturas de secuenciación brutas se mapearon al genoma de referencia humano (GRCh 38) utilizando el alineador STAR (RRID:SCR015899). La visualización y el análisis de los datos se realizaron utilizando Loupe Browser (versión 6.0.1; 10X Genomics, Inc.).
Análisis bioinformático
Para el análisis de Ontología Génica (GO), se analizaron los 100 genes expresados diferencialmente (DEGs) principales, clasificados por valor P, utilizando la plataforma Metascape (https://metascape.org; RRID: SCR016620). Se realizaron gráficos de dispersión y análisis de correlación (coeficiente de correlación de Pearson) utilizando RStudio. Los datos de variación del número de copias (CNV) se obtuvieron del conjunto de datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) a través de la plataforma cBioPortal (RRID:SCR014555). La información de los genes y las ubicaciones cromosómicas se obtuvieron de la base de datos NCBI Gene (RRID:SCR_002472).
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (Dotmatics; RRID: SCR_002798). Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para las comparaciones múltiples, se utilizó un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Los análisis de correlación se realizaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson y el coeficiente de correlación de rango de Spearman. Se consideró que P
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