PVT1-104aa derivado del desierto génico 8q24 promueve la tumorogénesis del cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) presenta una alta tasa de incidencia y, con los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos, los resultados del tratamiento han mejorado significativamente. Sin embargo, los pacientes con cáncer colorrectal metastásico siguen teniendo un mal pronóstico, y menos del 20 % sobrevive más de 5 años.^[1] Esto sugiere que el desarrollo de nuevas dianas farmacológicas es crucial para mejorar la eficacia terapéutica en el CCR avanzado.

MYC (también denominado c-Myc) es un oncogén fundamental que impulsa la tumorigénesis y la resistencia terapéutica en el CCR.^[2], ^[3] El gen MYC se encuentra dentro de la región cromosómica 8q24.21, una región "desértica" caracterizada, dominada por elementos no codificantes, incluido PVT1.^[4], ^[5] Las ganancias del número de copias (CNG) de la región cromosómica 8q24 son una ocurrencia frecuente en múltiples tipos de cáncer y están fuertemente asociadas con el pronóstico tumoral.^[6], ^[7] Además, la coamplificación y la cooperación de MYC y PVT1 impulsan la transformación maligna del mesotelioma pleural y el CCR.^[8], ^[9]

Los ARN circulares (circARN) desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer.^[10], ^[11] Su función biológica principal implica actuar como esponjas de microARN para regular la expresión génica.^[12] Además, los circARN pueden funcionar como plantillas para la traducción de proteínas, y estas proteínas pueden ejercer funciones biológicas oncogénicas o supresoras de tumores en el cáncer.^[13], ^[14] CircPVT1 se genera a través del retro-splicing del segundo exón dentro del locus del gen PVT1. Como informaron Panda y colaboradores,^[15] circPVT1 funciona como un circARN asociado a la senescencia que se une al microARN let-7, inhibiendo así los genes diana de let-7 (incluidos IGF2BP1, KRAS y HMGA2) para modular la senescencia en fibroblastos humanos. Además, circPVT1 promueve la progresión de tumores malignos. Yi y colaboradores^[16] informaron que circPVT1 promueve la carcinogénesis de mama ER-positiva y la resistencia a la terapia endocrina a través de dos mecanismos: funciona como una esponja de microARN para secuestrar miR-181a-2-3p y aumentar la expresión de ESR1, al tiempo que sirve como un andamio de proteínas que se une a MAVS y altera la formación del complejo RIGI-MAVS. Según los hallazgos de Wang y sus colegas, circPVT1 facilita el avance del carcinoma de la vesícula biliar (CVB) al secuestrar miR-339-3p, lo que a su vez aumenta los niveles de la proteína leucemia mieloide-1 (MCL-1).^[17] Sin embargo, aún se desconoce si circPVT1 tiene potencial de codificación de proteínas y cómo sus posibles productos de traducción podrían influir en la biología tumoral.

Aquí, presentamos evidencia de que PVT1-104aa, codificado por circPVT1 (un circARN derivado del gen no codificante PVT1), está sobreexpresado en los tejidos de CCR. La sobreexpresión de PVT1-104aa está relacionada con un pronóstico deteriorado en individuos con CCR. El producto proteico PVT1-104aa, en lugar de su precursor circPVT1, impulsa las capacidades proliferativas y metastásicas en el CCR. Mecánicamente, PVT1-104aa estabiliza c-Myc al inhibir su degradación mediada por ubiquitina y, posteriormente, modula la expresión de PD-L1 a través de la regulación dependiente de c-Myc. Este hallazgo es consistente con informes anteriores de la literatura que demuestran "una estrecha relación funcional entre MYC y PVT1 en la promoción de la tumorigénesis". Los estudios in vivo demuestran que la terapia combinada dirigida a PVT1-104aa con anticuerpos anti-PD-L1 induce una potente eficacia antitumoral. Estos hallazgos sugieren que PVT1-104aa puede representar tanto una nueva diana terapéutica como una molécula inmunorreguladora en el CCR, estableciendo un marco teórico para el desarrollo de tratamientos más eficaces para la enfermedad en etapa avanzada.

RESULTADOS

Identificación de circPVT1 como un posible promotor tumoral en el CCR

Para identificar los circARN expresados diferencialmente en el CCR, se realizó una secuenciación de ARN en cuatro muestras clínicas de CCR junto con tejidos normales adyacentes correspondientes (Figura 1A). El perfilado transcripcional integral reveló 5970 ARN circulares, incluidos 144 candidatos expresados diferencialmente entre el carcinoma colorrectal y la mucosa normal correspondiente (tasa de descubrimiento falso (FDR) 7,0 y bandas claras de ARN ribosómico 18S/28S se utilizaron para aplicaciones posteriores.

Preparación de la biblioteca de cDNA

Tras la extracción, el ARN se sometió a la construcción de la biblioteca de cDNA. Dado el enfoque en el análisis de ARN circular (circRNA), la depleción de ARN ribosómico del ARN total se llevó a cabo con el kit Ribo-off rRNA Depletion Kit (Vazyme, núm. de catálogo N406). Para enriquecer aún más los circRNA, el ARN depleto de rRNA se trató con RNase R (Takara, núm. de catálogo 2396) a 37 °C durante 15 minutos para degradar los ARN lineales. La generación de la biblioteca se realizó luego utilizando el sistema TruSeq Stranded Total RNA Library Prep System (Illumina, núm. de catálogo 20020599). Brevemente, el ARN enriquecido se fragmentó utilizando cationes divalentes a temperaturas elevadas (94 °C). La síntesis de cDNA se inició con la SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, núm. de catálogo 18090010) y los hexámeros aleatorios en el primer paso, seguido de la generación de la segunda cadena utilizando la ADN polimerasa I y la RNasa H (NEBNext Second Strand Synthesis Module, NEB, núm. de catálogo E6111). Los fragmentos de cDNA se sometieron a reparación de extremos y adición de cola A (NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module, NEB, núm. de catálogo E7546), seguido de la ligación de adaptadores (TruSeq RNA UD Indexes, Illumina, núm. de catálogo 20022371). Finalmente, para preparar bibliotecas listas para la secuenciación, los productos se sometieron a selección de tamaño en geles de agarosa E-Gel™ EX (Thermo Fisher Scientific, G402002), seguido de la amplificación por PCR con KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, KK2602).

Flujo de trabajo de identificación y cuantificación de circRNA

El flujo de trabajo bioinformático primario implicó la evaluación de la calidad de las lecturas de secuenciación en bruto mediante FastQC (v0.11.9) y la posterior alineación del genoma a la referencia GRCh38 utilizando STAR (v2.7.10a). Las uniones de retro-empalme (BSJ) se identificaron utilizando tanto CIRCexplorer3 (v3.0.0) como CIRI2 (v2.0.6), y solo los circRNA detectados por ambas herramientas se retuvieron para el análisis posterior para garantizar llamadas de alta confianza. La cuantificación de circRNA se obtuvo mediante feature Counts (v2.0.3), y los circRNA expresados diferencialmente se identificaron posteriormente mediante edgeR (v3.40.0) utilizando umbrales de FDR < 0,05 y |log2FC| > 1.

Secuenciación

Todas las muestras se sometieron a una secuenciación profunda del transcriptoma en un sistema Illumina NovaSeq 6000 configurado para lecturas emparejadas de 150 pb, utilizando kits de reactivos NovaSeq 6000 S4 (núm. de catálogo 20027465) con una profundidad objetivo de 30 millones de lecturas por biblioteca para garantizar una cobertura completa.

Análisis bioinformático

El control de calidad inicial de los datos de secuenciación implicó una evaluación exhaustiva con FastQC, seguida de una mejora mediante Trimmomatic para la eliminación de la contaminación por adaptadores y el recorte de bases de baja calidad. El mapeo del genoma de las lecturas procesadas a la referencia humana GRCh38 se realizó con el alineador STAR. Utilizando feature Counts para la cuantificación de transcritos, identificamos genes estadísticamente significativos mediante el análisis DESeq2 en R, con criterios establecidos en FDR < 0,05 y un valor absoluto de cambio de pliegue logarítmico superior a 1. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG se realizó sistemáticamente utilizando los genes diana de los microARN expresados diferencialmente (arriba o abajo regulados en cada grupo de comparación) como conjuntos de genes de entrada. El paquete GOstats en R se empleó para realizar pruebas estadísticas para el enriquecimiento de genes en cada término GO funcional y vía KEGG. Se aplicó un umbral estricto de valor p < 0,01 para determinar el enriquecimiento significativo de la vía.

RT-qPCR de ARN

Sintetizamos ADN complementario con el HiScript III All-in-one RT SuperMix (Vazyme, #R333-01), un kit diseñado específicamente para aplicaciones de qPCR. El sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) se utilizó para todos los análisis de RT-qPCR utilizando AceQ qPCR Probe Master Mix (Vazyme, #Q112-02) como química de detección. Las condiciones experimentales específicas para la RT-qPCR son las siguientes: transcripción inversa: 50 °C durante 15 minutos, 85 °C durante 5 segundos; qPCR: etapa 1 (desnaturalización inicial) a 95 °C durante 5 minutos; etapa 2 (reacción de ciclismo): 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos, repetido durante 40 ciclos. Siguiendo los detalles del cebador enumerados en la Tabla S3, la normalización frente a la β-actina y el cálculo posterior de la expresión relativa tanto de los circRNA como de los ARNm se realizaron mediante el método 2−△△Ct. Cada experimento se repitió tres veces.

Tratamientos con RNase R

La validación de la conformación circular de circPVT1 implicó el tratamiento enzimático del ARN total utilizando RNase R (Lucigen) en condiciones estandarizadas (37 °C, 15 minutos de incubación), con la persistencia molecular evaluada mediante la cuantificación de la transcripción inversa-PCR.

Ensayo de actinomicina D

Se añadió dactinomicina (2 µg/mL, MedChemExpress) a cincuenta mil células 293T durante 0-24 horas. El ARN se recolectó en los puntos de tiempo indicados para la cuantificación de circ-PVT1/PVT1 lineal mediante qPCR, normalizado a los controles de 0 h.

Hibridación fluorescente in situ

Preparamos las células Lovo para la hibridación fluorescente in situ (FISH) colocándolas en portaobjetos recubiertos con poli-L-ornitina (Sigma-Aldrich) antes de la hibridación. El procedimiento se llevó a cabo siguiendo el protocolo de un kit de FISH de ARN (GenePharma). La adquisición de imágenes se realizó utilizando un microscopio ZEISS LSM 880 integrado con tecnología de superresolución Airyscan, utilizando sondas de hibridación fluorescente in situ como se especifica en la Tabla S2.

Ensayo de fraccionamiento del gradiente de sacarosa

Preparación del gradiente de sacarosa

Antes del aislamiento de polisomas, 1 × 107 células en suspensión recibieron un tratamiento con 100 µg/mL de cicloheximida (formulada en DMSO) durante 5 minutos de incubación a 37 °C. Lisamos las células en 500 µL de tampón de extracción de polisomas y centrifugamos los lisados a 12 000 × g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante clarificado se colocó cuidadosamente sobre un gradiente de sacarosa discontinuo (5-50% p/v) y se sometió a ultracentrifugación (20 000 × g, 2 h, 4 °C) utilizando un rotor oscilante Beckman SW41. La separación del gradiente se llevó a cabo utilizando el fraccionador de gradiente BioComp Piston (Modelo 152), con el monitoreo de la absorbancia UV en tiempo real a 254 nm. El ARN purificado de los procedimientos de fraccionamiento se evaluó utilizando la metodología de RT-qPCR para definir la asignación de transcritos en las fracciones de ribosomas.

Análisis de polisomas

El análisis de polisomas se realizó tratando 1 × 107 células con 100 µg/mL de cicloheximida (37 °C, 5 minutos), lisis en 500 µL de tampón de extracción y centrifugación (12 000 × g, 10 minutos). Colocamos el sobrenadante sobre un gradiente de sacarosa del 5 al 50% antes de la ultracentrifugación (20 000 × g, 2 h, 4 °C; rotor SW41). Se recolectaron las fracciones (fraccionador BioComp) con el monitoreo de UV254, seguido del análisis de RT-qPCR del ARN para la distribución de los polisomas.

Análisis de LC-MS

Para el análisis proteómico posterior, los extractos proteicos totales se separaron mediante SDS-PAGE, y la banda que migra aproximadamente a 17 kDa se procesó para la digestión enzimática. A continuación, se empleó un espectrómetro de masas QExactive para analizar los péptidos extraídos (Thermo Fisher Scientific). Se realizó la correspondencia espectral con la plataforma Mascot (Matrix Science) frente a la colección de proteínas no redundantes de NCBI.

Análisis proteómico

Para la generación de la biblioteca espectral, se procesó una muestra agrupada que contenía 5 µg de proteína de cada muestra para crear una biblioteca de péptidos, que posteriormente se analizó mediante LC-MS. Aplicamos la técnica SWATH-MS para lograr un perfilado cuantitativo de cada muestra biológica. Antes del análisis, los datos cuantitativos de SWATH se sometieron a normalización mediana y transformación Log2. Las proteínas que cumplían con el umbral de significación (p < 0,01 mediante la prueba t de Student) se clasificaron como proteínas con abundancia diferencial.

Inmunofluorescencia

Las células se sembraron en portaobjetos durante la noche hasta alcanzar una confluencia del 50%. Tras una serie inicial de lavados con PBS (3 × 5 min), la fijación celular se logró utilizando un 4% de paraformaldehído durante una incubación de 10 min, seguida de tres enjuagues sucesivos de 5 min con solución salina tamponada con fosfato. La permeabilización celular se realizó mediante incubación con 0,1% de Triton X-100 durante 10 min en condiciones ambientales, seguida de tres ciclos de lavado con PBS. Tras el bloqueo con un 1% de albúmina sérica bovina, las muestras celulares en los portaobjetos recibieron incubaciones con anticuerpo primario (dilución 1:1000) a 4 °C durante 16 h. Proteger de la luz para evitar el apagamiento del fluoróforo. Después de la incubación, lavar las células con PBS tres veces, 5 min cada vez, para eliminar los anticuerpos no unidos. Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor (Invitrogen). Se realizó la contratinción nuclear utilizando DAPI, y posteriormente se adquirieron imágenes mediante microscopía de fluorescencia.

Generación de líneas celulares estables

Las células SW480 y HCT116 se transfectaron con el vector vacío, circPVT1, delATG o plásmidos de PVT104aa linealizados utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante. Las líneas celulares estables se seleccionaron con puromicina durante siete días (2 µg/mL). Para el silenciamiento estable de circPVT1 en las células LoVo y SW620, las células HEK293T recibieron constructos lentivirales (shRNA/cDNA de Gene-Pharma, Shanghái) junto con plásmidos de empaquetamiento psPAX2/pMD2G (Addgene). Las células transducidas se sometieron posteriormente a selección con antibióticos utilizando higromicina (200 µg/mL) o puromicina (1 µg/mL) en función del marcador de resistencia del vector viral.

Plásmidos

Todos los plásmidos, incluido el constructo de sobreexpresión de Circ-PVT1, circPVT1 del ATG, circPVT1-3×Flag, PVT1-104aa linealizado y PVT1-104aa-3×Flag, se construyeron mediante síntesis química de genes basada en el andamio pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro y se adquirieron de Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. Los plásmidos pcDNA3-Flag-FBW7 y pcDNA3-Flag-GSK3β se clonaron en vectores de expresión mamífera pcDNA3-Flag. Los plásmidos pcDNA3-HA-c-Myc y las construcciones truncadas se clonaron en vectores de expresión mamífera pcDNA3-HA. Los plásmidos pCMV-His-Ub y pCMV-His-Ub-K48 se clonaron únicamente en vectores de expresión mamífera pCMV-GST. Los plásmidos de reportero de luciferasa fueron generados por Genomeditech. El elemento IRES de 67-203 pares de bases y su mutante de deleción se amplificaron por PCR y se clonaron en la región intercistrónica que separa los genes reporteros de Rluc y Fluc.

Sistema de reportero de luciferasa dual

Después de ser transfectadas con el reportero IRES durante 48 h, las células se lisaron y se lavaron. Las actividades de la luciferasa se midieron secuencialmente (luciferasa de luciérnaga seguida de Renilla) utilizando los reactivos Dual-Glo, y la actividad de IRES se calculó como la relación Fluc/Rluc. Se insertó un motivo de unión a c-Myc putativo (ACATGTGTGT) ubicado dentro de la región promotora de CD274 en el vector de reportero de luciferasa pGL3-basic (Promega) para generar el constructo de reportero. Las células Lovo se sembraron en placas de 24 pocillos, seguida de la transfección basada en Lipofectamine 3000 (Invitrogen) con 400 ng de constructo de reportero y 40 ng de vector de control de Renilla pRL-TK por pocillo. Después del período de incubación de 24 h, tanto las señales de luciferasa de luciérnaga como las de Renilla se cuantificaron con el sistema de ensayo de reportero de luciferasa dual (Promega) según las instrucciones del fabricante. Se realizó la normalización dividiendo las lecturas de luciferasa de luciérnaga por los valores correspondientes de Renilla, y los resultados se presentaron como unidades de luciferasa relativas.

Ensayo CCK8

Para la evaluación de la proliferación celular, las células se sembraron a una densidad de 2 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos, con cada pocillo conteniendo 100 µL de medio completo, seguido de una incubación durante la noche (37 °C, 5% de CO2). En días consecutivos (días 1 a 5), se administraron 10 µL de compuestos de prueba a cada pocillo, seguida de una incubación de 2 h en condiciones estándar de cultivo. La cuantificación se realizó midiendo la densidad óptica (DO) con un lector de microplacas, y todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayo de formación de colonias

Para el ensayo de formación de colonias, se sembraron 2000 células por pocillo en placas de seis pocillos y se cultivaron durante 14 días en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2), con el medio siendo renovado cada 72 h. Después del cultivo de 14 días, las colonias celulares se fijaron utilizando un 4% de metanol (15 min, temperatura ambiente) seguido de tres lavados con PBS de 5 min. Las colonias se tiñeron posteriormente utilizando una solución de cristal violeta al 0,1% durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la tinción, se adquirieron imágenes de las colonias y se cuantificaron para el análisis. Cada experimento se repitió por triplicado.

Ensayo de translocación de migración

Las células (3 × 104) en 200 µL de DMEM sin suero se colocaron en la cámara superior de translocación de una placa de 24 pocillos (Falcon #353097). Para crear un gradiente quimiotáctico, la cámara inferior contenía 800 µL de DMEM suplementado con un 10% de FBS. Después de la incubación de 24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2), las células que habían migrado al lado inferior de la membrana se fijaron en metanol al 100% durante 10 min a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS (5 min cada uno), se aplicó una solución de cristal violeta al 0,1% durante 20 min. Las células migratorias teñidas se visualizaron posteriormente utilizando un microscopio invertido a un aumento de 100× y se cuantificaron manualmente. Cada experimento se repitió por triplicado.

Ensayo de curación de heridas

Para el ensayo de curación de heridas, se sembraron 1 × 105 células/pocillo en placas de seis pocillos y se cultivaron durante la noche para formar monocapas de células en medio completo (DMEM+10% FBS). El medio se reemplazó con medio de bajo contenido de suero (2% FBS), y se creó un rasguño uniforme utilizando una punta de pipeta estéril de 200 µL, seguido de lavados con PBS para eliminar los residuos. El cierre de la herida se monitoreó capturando imágenes de contraste de fase en posiciones idénticas a los tiempos 0, 12 y 24 h (aumento de 100×). Las tasas de migración se cuantificaron midiendo los cambios en el ancho de la herida utilizando el software ImageJ, calculado como: ((ancho de 0 h — ancho de t h) / ancho de 0 h) × 100%, con tres pocillos por condición. Cada experimento se repitió por triplicado.

Purificación de proteínas marcadas con GST de bacterias

El constructo pGEX-4T1-GSK-3β se transformó en E. coli BL21 (DE3) para expresar la proteína de fusión GSK-3β-GST. Después de una dilución de 1:100 de los cultivos iniciadores en medio LB fresco, los cultivos se cultivaron a 37 °C hasta alcanzar una DO600 de 0,8. La producción de proteínas se indujo posteriormente añadiendo 0,1 mM de IPTG e incubando a 16 °C durante 16 h con agitación vigorosa. Después de la inducción, las proteínas recombinantes se aislaron de las células bacterianas cosechadas que se habían resuspendido en tampón EBC antes de la sonicación. La fracción soluble se obtuvo eliminando el material insoluble y los restos celulares, y luego se sometió a purificación por afinidad con glutatión mediante incubación con 50 µL de glutatión-Sepharose al 50% (Pierce) a 4 °C durante 3 h. Las cuentas lavadas (3 × PBS) produjeron proteínas que se almacenaron en PBS/10% de glicerol a 4 °C, o se eluyeron. La pureza se confirmó mediante tinción de Coomassie, con cuantificación basada en BSA.

Western blot

Se añadió el tampón RIPA a las células o tejidos procesados a 4 °C. Las muestras de proteínas se cargaron para electroforesis, después de lo cual, se retira cuidadosamente el gel y se excinde la banda diana guiada por el marcador de proteínas. Se sumerge la membrana de PVDF en metanol durante 1 min y luego se transfiere al tampón de transferencia. A continuación, se bloquea la membrana de PVDF con un 5% de leche (1 h, temperatura ambiente) seguida de la incubación con anticuerpo primario durante la noche (4 °C). Al día siguiente, se lava la membrana con TBST, 15 min, tres veces. A continuación, se incuba con anticuerpos secundarios durante 1 h. Se coloca la membrana de PVDF sobre el imagenador, se aplica uniformemente la solución de trabajo ECL, se eliminan las burbujas de aire y se inicia la exposición. Cada experimento se repitió por triplicado.

Anticuerpos

El anticuerpo personalizado PVT1-104aa se generó primero preparando el inmunógeno peptídico mediante GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Jiangsu, China), que se conjugó con la proteína portadora KLH y se controló la calidad mediante HPLC y MS para garantizar una pureza >85%. Posteriormente, se inmunizaron dos conejos utilizando el protocolo Polyexpress patentado de GenScript durante aproximadamente 4 semanas; el título del suero se comprobó después de la tercera inmunización para confirmar una fuerte respuesta inmune antes de la purificación. Finalmente, se recogió el antisuero de cada conejo, se agrupó y se purificó por afinidad utilizando el péptido diana, y se validó la calidad mediante ELISA indirecto (1:500 para IB).

Los anticuerpos contra c-Myc (#ab32072, 1:1000), MYC ser62 (#ab185656, 1:2000), MYC thr58 (#ab185655, 1:1000), GSK3β (#ab32391, 1:5000), FBXW7 (#ab192328, 1:1000) y myc tag (#ab32, 1:1000) fueron de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra β-tubulina (#2128, 1:1000), β-actina (#4967, 1:1000), GAPDH (#2118, 1:1000), Flag (#14793, 1:1000), HA (#3724, 1:1000), ubiquitina (#20326, 1:1000) y PD-L1 (#13684, 1:1000) fueron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.).

Co-inmunoprecipitación

Se cosecharon células de placas de 10 cm, se lavaron con tampón PBS helado, se añadió tampón de lisis IP suplementado con inhibidores de proteasas y se lisaron sobre hielo durante 30 min. Los lisados se centrifugaron, y el sobrenadante resultante se dividió en alícuotas para experimentos posteriores. La co-inmunoprecipitación se realizó utilizando el kit Pierce (Thermo), donde las cuentas se conjugaron con el anticuerpo primario para capturar los complejos de proteínas. Se lavaron las cuentas repetidamente con tampón de unión para eliminar las proteínas unidas de forma no específica. Los complejos unidos a las cuentas se desnaturalizaron calentando a 95 °C durante 5 min en tampón de carga SDS-PAGE, y posteriormente se resolvieron mediante SDS-PAGE para el análisis.

Estudios con animales

Los roedores experimentales, que comprendían las cepas C57BL/6J y BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad, con equilibrio de género; GemPharmatech), se alojaron en condiciones estandarizadas que mantenían una temperatura ambiente de 22 a 25 °C con un fotoperiodo de 12 h/12 h de luz/oscuridad. La asignación de animales a los diferentes grupos de estudio se realizó mediante protocolos de aleatorización computarizada. Los xenoinjertos se establecieron mediante inyección subcutánea dorsal de 5 × 105 células MC38/CT26 de control o con silenciamiento de circPVT1 en 100 µL de PBS helado. Las mediciones del tamaño del tumor y las evaluaciones del punto final se realizaron por investigadores que desconocían las asignaciones de los grupos. El volumen del tumor se monitoreó mediante mediciones con calibrador (L × W
2/2), y se realizó la eutanasia al alcanzar un diámetro de 15 mm, un estado de moribundez o al exceder la carga tumoral permitida. Los modelos de metástasis pulmonar se generaron mediante inyección en la vena de la cola de células MC38 (1 × 106 células suspendidas en 100 µL de PBS), y se recogieron los tejidos pulmonares fijados con formalina después de 8 semanas para la enumeración de nódulos metastásicos. Todas las cuantificaciones se realizaron de forma ciega. Los grupos de tratamiento recibieron dos inyecciones intraperitoneales semanales de anti-PD-L1 (100 µg/dosis; BioXcell #BP0101) o control de IgG (#BE0083).

Inmunohistoquímica

Todos los cortes de tejido (xenoinjertos y muestras clínicas) se sometieron a la recuperación estándar de antígenos con EDTA alcalino (pH 8.0) después de la desparafinación. El bloqueo de la peroxidasa se logró con un tratamiento con 3% de H2O2. Las muestras se bloquearon utilizando una solución de PBS con 5% de suero de cabra normal (Vector) y 0,1% de Triton X-100 durante 1 hora, seguida de lavados con PBS. Los anticuerpos primarios dirigidos contra c-Myc (1:200), PVT1-104aa (1:100), PD-L1 (1:500) y Ki67 (1:2000) se aplicaron a ciertas diluciones durante la noche. Se empleó el sistema de detección HRP-DAB para la localización del antígeno.

Citometría de flujo

Tras la eutanasia, los tumores de ratón se recolectaron inmediatamente, se picaron en pequeños fragmentos y se digirieron enzimáticamente en DMEM que contenía colagenasa IV (1,5 mg/mL, Sigma) y DNasa I (100 µg/mL, Sigma) a 37 °C durante 45 minutos con agitación suave (250 rpm). Tras la digestión, el tejido se filtró a través de una malla de 80 µm para obtener células individuales. Estas células se sometieron a centrifugación (300×g, 5 minutos), lavado con PBS y resuspensión final en un tampón de tinción que contenía 1% de BSA y 1 mM de EDTA en PBS. Para la inmunofenotipificación de subconjuntos de células inmunitarias y marcadores de agotamiento, las suspensiones de células individuales se etiquetaron con un panel de anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente dirigidos contra antígenos de superficie específicos, incluyendo CD11b-APC (MABF362, Sigma-Aldrich), Gr-1-PE (MABF472, Sigma-Aldrich), CD45-PerCP-Cy5.5 (MABF160A, Sigma-Aldrich), CD8-PE (SAB4700088, Sigma-Aldrich), CD4-PE (MABF573, Sigma-Aldrich), PD-1-APC (329907, Biolegend), Tim-3-FITC (11-5870-82, ThermoFisher), GZMB-PE (12-8988-82, ThermoFisher) y PRF1-PE (12-9392-82, ThermoFisher) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para cada panel de tinción, las células se incubaron con anticuerpos durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo BD FACSAria o equivalente después del lavado con el tampón de tinción. El análisis se realizó con el software FlowJo. Las MDSC se definieron como células CD45+CD11b+Gr-1+. La estrategia de clasificación definió las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ dentro de los linfocitos CD45+, con sus frecuencias expresadas en relación con el total de células viables. Se evaluó y cuantificó la expresión de marcadores de superficie e intracelulares (PD-1, Tim-3, GZMB, PRF1) en los linfocitos T CD8+ como MFI.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina con PCR

Siguiendo el protocolo comercial, realizamos la inmunoprecipitación de cromatina con el kit SimpleCHIP Enzymatic Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology). Tras la reticulación cruzada mediada por formaldehído y la lisis celular, la cromatina se fragmentó mediante un tratamiento limitado con micrococcal nuclease. La inmunoprecipitación de cromatina se llevó a cabo utilizando cuentas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para c-Myc o IgG de control isotípico. Tras la reversión de las uniones cruzadas inducidas por formaldehído, el ADN inmunoprecipitado se purificó mediante centrifugación con membrana de sílice y se realizó una evaluación cuantitativa de PCR centrada en las secuencias promotoras de CD274 (PD-L1).

Análisis estadístico

El procesamiento de datos se realizó con GraphPad Prism 8.0 y Microsoft Excel 16.74, y los resultados se expresaron como valores medios ± desviación estándar obtenidos de experimentos triplicados. Para las comparaciones paramétricas se utilizaron: (1) pruebas t pareadas para pares de tejidos tumorales y normales; (2) pruebas t no pareadas o ANOVA para otros grupos. El análisis de supervivencia se realizó utilizando la metodología de Kaplan-Meier. Los umbrales de significación se establecieron en p < 0,05, con anotación basada en asteriscos de la siguiente manera: *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001.

Tejidos humanos

Tras la obtención del consentimiento informado, se recolectaron quirúrgicamente muestras de carcinoma colorrectal y tejido adyacente histológicamente normal de pacientes tratados en el Fudan University Shanghai Cancer Center. La evaluación histopatológica de todas las muestras fue realizada por patólogos certificados.

Líneas celulares

Las células HEK293T y las líneas celulares de CRC, incluyendo HCT116, Lovo, RKO, SW480, SW620 y DLD1, se obtuvieron del repositorio ATCC en Manassas, Virginia. Las células epiteliales colónicas humanas normales NCM460 (núm. de catálogo IM-H445), las líneas de carcinoma de colon murino MC38 (núm. de catálogo IM-M006) y CT26 (núm. de catálogo IM-M007) se compraron a Immocell Biotechnology. La propagación celular se llevó a cabo utilizando DMEM (Gibco) como medio basal, suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco) y 1% de solución antibiótica de penicilina/estreptomicina, con parámetros de incubación establecidos en 37 °C/5% de CO2 en una cámara con control de humedad. Antes del uso experimental, se confirmó que todas las líneas estaban libres de micoplasma y se utilizaron dentro de los 10 pases posteriores a la descongelación.

Análisis de RNA-seq

Extracción de ARN y control de calidad

La extracción de ARN de las muestras se realizó con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en estricta adherencia a las especificaciones del fabricante. La calidad de la preparación de ARN se verificó mediante análisis electroforético en geles de agarosa libres de RNasa y evaluación cuantitativa utilizando un espectrofotómetro NanoDrop One. Las muestras de ARN con números de integridad de ARN >7,0 y bandas claras de ARN ribosómico 18S/28S se utilizaron para aplicaciones posteriores.

Preparación de la biblioteca de cDNA

Tras la extracción, el ARN se sometió a la construcción de la biblioteca de cDNA. Dado el enfoque en el análisis de ARN circular (circRNA), la depleción de ARN ribosómico del ARN total se llevó a cabo con el kit Ribo-off rRNA Depletion Kit (Vazyme, núm. de catálogo N406). Para enriquecer aún más los circRNA, el ARN depleto de rRNA se trató con RNasa R (Takara, núm. de catálogo 2396) a 37 °C durante 15 minutos para degradar los ARN lineales. La generación de la biblioteca se realizó utilizando el sistema TruSeq Stranded Total RNA Library Prep System (Illumina, núm. de catálogo 20020599). Brevemente, el ARN enriquecido se fragmentó utilizando cationes divalentes a alta temperatura (94 °C). La síntesis de cDNA se inició con la transcriptasa inversa SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific, núm. de catálogo 18090010) y hexámeros aleatorios en el primer paso, seguida de la generación de la segunda cadena utilizando la ADN polimerasa I y la RNasa H (NEBNext Second Strand Synthesis Module, NEB, núm. de catálogo E6111). Los fragmentos de cDNA se sometieron a reparación de extremos y adición de A (NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module, NEB, núm. de catálogo E7546), seguida de la ligación de adaptadores (TruSeq RNA UD Indexes, Illumina, núm. de catálogo 20022371). Finalmente, para preparar bibliotecas listas para la secuenciación, los productos se sometieron a selección de tamaño en geles de agarosa E-Gel™ EX (Thermo Fisher Scientific, G402002), seguida de la amplificación por PCR con KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, KK2602).

Flujo de trabajo de identificación y cuantificación de circRNA

El flujo de trabajo bioinformático primario implicó la evaluación de la calidad de las lecturas de secuenciación en bruto mediante FastQC (v0.11.9) y la posterior alineación del genoma a la referencia GRCh38 utilizando STAR (v2.7.10a). Las uniones de retro-empalme (BSJ) se identificaron utilizando tanto CIRCexplorer3 (v3.0.0) como CIRI2 (v2.0.6), y solo los circRNA detectados por ambas herramientas se retuvieron para el análisis posterior para garantizar llamadas de alta confianza. La cuantificación de circRNA se obtuvo mediante feature Counts (v2.0.3), y los circRNA expresados diferencialmente se identificaron posteriormente mediante edgeR (v3.40.0) utilizando umbrales de FDR < 0,05 y |log2FC| > 1.

Secuenciación

Todas las muestras se sometieron a una secuenciación profunda del transcriptoma en un sistema Illumina NovaSeq 6000 configurado para lecturas emparejadas de 150 pb, utilizando los kits de reactivos NovaSeq 6000 S4 (núm. de catálogo 20027465) con una profundidad objetivo de 30 millones de lecturas por biblioteca para garantizar una cobertura completa.

Análisis bioinformático

El control de calidad inicial de los datos de secuenciación implicó una evaluación exhaustiva con FastQC, seguida de una mejora mediante Trimmomatic para la eliminación de la contaminación por adaptadores y el recorte de bases de baja calidad. El mapeo del genoma de las lecturas procesadas a la referencia humana GRCh38 se realizó con el alineador STAR. Utilizando feature Counts para la cuantificación de transcritos, identificamos genes estadísticamente significativos mediante el análisis DESeq2 en R, con criterios establecidos en FDR < 0,05 y un valor absoluto de cambio de pliegue logarítmico superior a 1. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG se realizó sistemáticamente utilizando los genes diana de los microARN expresados diferencialmente (arriba o abajo regulados en cada grupo de comparación) como conjuntos de genes de entrada. El paquete GOstats en R se utilizó para realizar pruebas estadísticas para el enriquecimiento de genes en cada término GO funcional y vía KEGG. Se aplicó un umbral estricto de valor p < 0,01 para determinar el enriquecimiento significativo de la vía.

Extracción de ARN y control de calidad

La extracción de ARN de las muestras se realizó con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en estricta adherencia a las especificaciones del fabricante. La calidad de la preparación de ARN se verificó mediante análisis electroforético en geles de agarosa libres de RNasa y evaluación cuantitativa utilizando un espectrofotómetro NanoDrop One. Las muestras de ARN con números de integridad de ARN >7,0 y bandas claras de ARN ribosómico 18S/28S se utilizaron para aplicaciones posteriores.

Preparación de la biblioteca de cDNA

Tras la extracción, el ARN se sometió a la construcción de la biblioteca de cDNA. Dado el enfoque en el análisis de ARN circular (circRNA), la depleción de ARN ribosómico del ARN total se llevó a cabo con el kit Ribo-off rRNA Depletion Kit (Vazyme, núm. de catálogo N406). Para enriquecer aún más los circRNA, el ARN depleto de rRNA se trató con RNasa R (Takara, núm. de catálogo 2396) a 37 °C durante 15 minutos para degradar los ARN lineales. La generación de la biblioteca se realizó utilizando el sistema TruSeq Stranded Total RNA Library Prep System (Illumina, núm. de catálogo 20020599). Brevemente, el ARN enriquecido se fragmentó utilizando cationes divalentes a alta temperatura (94 °C). La síntesis de cDNA se inició con la transcriptasa inversa SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific, núm. de catálogo 18090010) y hexámeros aleatorios en el primer paso, seguida de la generación de la segunda cadena utilizando la ADN polimerasa I y la RNasa H (NEBNext Second Strand Synthesis Module, NEB, núm. de catálogo E6111). Los fragmentos de cDNA se sometieron a reparación de extremos y adición de A (NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module, NEB, núm. de catálogo E7546), seguida de la ligación de adaptadores (TruSeq RNA UD Indexes, Illumina, núm. de catálogo 20022371). Finalmente, para preparar bibliotecas listas para la secuenciación, los productos se sometieron a selección de tamaño en geles de agarosa E-Gel™ EX (Thermo Fisher Scientific, G402002), seguida de la amplificación por PCR con KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, KK2602).

Flujo de trabajo de identificación y cuantificación de circRNA

El flujo de trabajo bioinformático primario implicó la evaluación de la calidad de las lecturas de secuenciación en bruto mediante FastQC (v0.11.9) y la posterior alineación del genoma a la referencia GRCh38 utilizando STAR (v2.7.10a). Las uniones de retro-empalme (BSJ) se identificaron utilizando tanto CIRCexplorer3 (v3.0.0) como CIRI2 (v2.0.6), y solo los circRNA detectados por ambas herramientas se retuvieron para el análisis posterior para garantizar llamadas de alta confianza. La cuantificación de circRNA se obtuvo mediante feature Counts (v2.0.3), y los circRNA expresados diferencialmente se identificaron posteriormente mediante edgeR (v3.40.0) utilizando umbrales de FDR < 0,05 y |log2FC| > 1.

Secuenciación

Todas las muestras se sometieron a una secuenciación profunda del transcriptoma en un sistema Illumina NovaSeq 6000 configurado para lecturas emparejadas de 150 pb, utilizando los kits de reactivos NovaSeq 6000 S4 (núm. de catálogo 20027465) con una profundidad objetivo de 30 millones de lecturas por biblioteca para garantizar una cobertura completa.

Análisis bioinformático

El control de calidad inicial de los datos de secuenciación implicó una evaluación exhaustiva con FastQC, seguida de una optimización con Trimmomatic para eliminar la contaminación por adaptadores y recortar las bases de baja calidad. El mapeo del genoma de las lecturas procesadas al genoma de referencia humano GRCh38 se realizó con el alineador STAR. Utilizando Feature Counts para la cuantificación de transcritos, identificamos genes estadísticamente significativos mediante el análisis DESeq2 en R, con criterios establecidos en FDR < 0,05 y un valor absoluto del cambio logarítmico de 2 superior a 1. El análisis de enriquecimiento de vías KEGG se realizó sistemáticamente utilizando los genes diana de los microARN expresados diferencialmente (sobreexpresados o subexpresados en cada grupo de comparación) como conjuntos de genes de entrada. El paquete GOstats en R se empleó para realizar pruebas estadísticas de enriquecimiento de genes en cada término funcional GO y vía KEGG. Se aplicó un umbral estricto de valor p < 0,01 para determinar el enriquecimiento significativo de las vías.

qRT-PCR de ARN

Sintetizamos ADN complementario con el HiScript III All-in-one RT SuperMix (Vazyme, #R333-01), un kit diseñado específicamente para aplicaciones de qPCR. El sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) se utilizó para todos los análisis de RT-qPCR, utilizando AceQ qPCR Probe Master Mix (Vazyme, #Q112-02) como química de detección. Las condiciones experimentales específicas para la RT-qPCR son las siguientes: transcripción inversa: 50 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s; qPCR: etapa 1 (desnaturalización inicial) a 95 °C durante 5 min; etapa 2 (reacción de ciclado): 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, repetido durante 40 ciclos. Siguiendo los detalles de los cebadores enumerados en la Tabla S3, se realizó la normalización con respecto a β-actina y el cálculo posterior de la expresión relativa tanto de los circARN como de los ARNm mediante el método 2−△△Ct. Cada experimento se repitió por triplicado.

Tratamientos con RNase R

La validación de la conformación circular de circPVT1 implicó el tratamiento enzimático del ARN total con RNase R (Lucigen) en condiciones estandarizadas (37 °C, 15 min de incubación), y la persistencia molecular se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa.

Ensayo con actinomicina D

Se añadió dactinomicina (2 µg/mL, MedChemExpress) a cincuenta mil células 293T durante 0-24 h. El ARN se recolectó en los puntos de tiempo indicados para la cuantificación de circ-PVT1/PVT1 lineal mediante qPCR, normalizado a los controles de 0 h.

Hibridación in situ por fluorescencia

Preparamos células Lovo para la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) sembrándolas en portaobjetos recubiertos con poli-L-ornitina (Sigma-Aldrich) antes de la hibridación. El procedimiento se llevó a cabo siguiendo el protocolo de un kit de FISH de ARN (GenePharma). La adquisición de imágenes se realizó utilizando un microscopio ZEISS LSM 880 integrado con tecnología de superresolución Airyscan, empleando sondas de hibridación in situ por fluorescencia según lo especificado en la Tabla S2.

Ensayo de fraccionamiento por gradiente de sacarosa

Preparación del gradiente de sacarosa

Antes del aislamiento de polisomas, 1 × 107 células en suspensión recibieron un tratamiento con 100 µg/mL de cicloheximida (formulado en DMSO) durante 5 minutos de incubación a 37 °C, y se evaluó la persistencia molecular mediante RT-PCR cuantitativa. Lisamos las células en 500 µL de tampón de extracción de polisomas y centrifugamos los lisados a 12 000×g durante 10 min para eliminar los restos celulares. El lisado clarificado se depositó cuidadosamente sobre un gradiente de sacarosa discontinuo (5-50% p/v) y se sometió a ultracentrifugación (20 000×g, 2 h, 4 °C) utilizando un rotor oscilante Beckman SW41. La separación del gradiente se llevó a cabo utilizando el BioComp Piston Gradient Fractionator (Modelo 152), con monitorización de la absorbancia UV en tiempo real a 254 nm. El ARN purificado de los procedimientos de fraccionamiento se evaluó utilizando la metodología de RT-qPCR para definir la distribución de los transcritos en las fracciones ribosómicas.

Análisis de polisomas

El análisis de polisomas se realizó tratando 1 × 107 células con 100 µg/mL de cicloheximida (37 °C, 5 min), lisándolas en 500 µL de tampón de extracción y centrifugándolas (12 000×g, 10 min). Depositamos el sobrenadante sobre un gradiente de sacarosa del 5 al 50% antes de la ultracentrifugación (20 000×g, 2 h, 4 °C; rotor SW41). Se recolectaron las fracciones (BioComp Fractionator) con monitorización de UV254, seguida de la extracción de ARN y el análisis de RT-qPCR de la distribución de los polisomas.

Preparación del gradiente de sacarosa

Antes del aislamiento de polisomas, 1 × 107 células en suspensión recibieron un tratamiento con 100 µg/mL de cicloheximida (formulado en DMSO) durante 5 minutos de incubación a 37 °C. Lisamos las células en 500 µL de tampón de extracción de polisomas y centrifugamos los lisados a 12 000×g durante 10 min para eliminar los restos celulares. El lisado clarificado se depositó cuidadosamente sobre un gradiente de sacarosa discontinuo (5-50% p/v) y se sometió a ultracentrifugación (20 000×g, 2 h, 4 °C) utilizando un rotor oscilante Beckman SW41. La separación del gradiente se llevó a cabo utilizando el BioComp Piston Gradient Fractionator (Modelo 152), con monitorización de la absorbancia UV en tiempo real a 254 nm. El ARN purificado de los procedimientos de fraccionamiento se evaluó utilizando la metodología de RT-qPCR para definir la distribución de los transcritos en las fracciones ribosómicas.

Análisis de polisomas

El análisis de polisomas se realizó tratando 1 × 107 células con 100 µg/mL de cicloheximida (37 °C, 5 min), lisándolas en 500 µL de tampón de extracción y centrifugándolas (12 000×g, 10 min). Depositamos el sobrenadante sobre un gradiente de sacarosa del 5 al 50% antes de la ultracentrifugación (20 000×g, 2 h, 4 °C; rotor SW41). Se recolectaron las fracciones (BioComp Fractionator) con monitorización de UV254, seguida de la extracción de ARN y el análisis de RT-qPCR de la distribución de los polisomas.

Análisis LC-MS

Para el análisis proteómico posterior, los extractos proteicos totales se separaron mediante SDS-PAGE, y la banda que migra a aproximadamente 17 kDa se procesó para la digestión enzimática. A continuación, se empleó un espectrómetro de masas QExactive para analizar los péptidos extraídos (Thermo Fisher Scientific). El emparejamiento espectral se realizó con la plataforma Mascot (Matrix Science) contra la colección de proteínas no redundantes de NCBI.

Análisis proteómico

Para la generación de una biblioteca espectral, se procesó una muestra agrupada que contenía 5 µg de proteína de cada muestra en una biblioteca de péptidos, que se analizó posteriormente mediante LC-MS. Aplicamos la técnica SWATH-MS para lograr un perfilado cuantitativo de cada muestra biológica. Antes del análisis, los datos cuantitativos de SWATH se sometieron a normalización mediana y transformación Log2. Las proteínas que cumplían con el umbral de significación (p < 0,01 mediante la prueba t de Student) se clasificaron como diferencialmente abundantes.

Inmunofluorescencia

Se sembraron células en portaobjetos durante la noche hasta alcanzar una confluencia del 50%. Tras una serie inicial de lavados con PBS (3 × 5 min), la fijación celular se logró utilizando un 4% de paraformaldehído durante una incubación de 10 min, seguida de tres lavados sucesivos de 5 min con solución salina tamponada con fosfato. La permeabilización celular se realizó mediante la incubación con 0,1% de Triton X-100 durante 10 min en condiciones ambientales, seguida de tres ciclos de lavado con PBS. Tras el bloqueo con un 1% de albúmina sérica bovina, las muestras celulares en los portaobjetos recibieron incubaciones con anticuerpo primario (dilución 1:1000) a 4 °C durante 16 h. Proteger de la luz para evitar el apagado del fluoróforo. Después de la incubación, lavar las células con PBS tres veces, 5 min cada vez, para eliminar los anticuerpos no unidos. Anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor (Invitrogen). La contratinción nuclear se realizó utilizando DAPI, y la adquisición de imágenes se llevó a cabo posteriormente mediante microscopía de fluorescencia.

Generación de líneas celulares estables

Las células SW480 y HCT116 se transfectaron con el vector vacío, circPVT1, delATG o plásmidos linealizados PVT104aa utilizando Lipofectamina 3000 (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante. Las líneas celulares estables se seleccionaron mediante puromicina durante siete días (2 µg/mL). Para el silenciamiento estable de circPVT1 en las células LoVo y SW620, las células HEK293T recibieron constructos lentivirales (shRNA/cDNA de Gene-Pharma, Shanghái) junto con los plásmidos de empaquetamiento psPAX2/pMD2G (Addgene). Las células transducidas se sometieron posteriormente a selección con antibióticos utilizando higromicina (200 µg/mL) o puromicina (1 µg/mL) en función del marcador de resistencia del vector viral.

Plásmidos

Todos los plásmidos, incluido el constructo de sobreexpresión de Circ-PVT1, circPVT1 del ATG, circPVT1-3×Flag, PVT1-104aa linealizado y PVT1-104aa-3×Flag, se construyeron mediante síntesis química de genes basada en el andamio pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro y se adquirieron de Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. pcDNA3-Flag-FBW7 y pcDNA3-Flag-GSK3β se clonaron en vectores de expresión mamífera pcDNA3-Flag. pcDNA3-HA-c-Myc y las construcciones truncadas se clonaron en vectores de expresión mamífera pcDNA3-HA. pCMV-His-Ub y pCMV-His-Ub-K48 solo se clonaron en vectores de expresión mamífera pCMV-GST. Los plásmidos de reportero de luciferasa fueron generados por Genomeditech. El elemento IRES de 67-203 pb y su mutante de deleción se amplificaron por PCR y se clonaron en la región intercistrónica que separa los genes reporteros Rluc y Fluc.

Sistema de reportero de luciferasa dual

Después de ser transfectadas con el reportero IRES durante 48 h, las células se lisaron y lavaron. Las actividades de la luciferasa se midieron secuencialmente (luciferasa de luciérnaga seguida de luciferasa de renilla) utilizando reactivos Dual-Glo, y la actividad de IRES se calculó como la relación Fluc/Rluc. Se insertó un posible motivo de unión a c-Myc (ACATGTGTGT) ubicado dentro de la región promotora de CD274 en el vector de reportero de luciferasa pGL3-basic (Promega) para generar el constructo de reportero. Las células Lovo se sembraron en placas de 24 pocillos, seguidas de la transfección basada en Lipofectamina 3000 (Invitrogen) con 400 ng de constructo de reportero y 40 ng de vector de control de Renilla pRL-TK por pocillo. Después del período de incubación de 24 h, tanto las señales de luciferasa de luciérnaga como las de renilla se cuantificaron con el sistema de ensayo de reportero de luciferasa dual (Promega) según las instrucciones del fabricante. La normalización se realizó dividiendo las lecturas de luciferasa de luciérnaga por los valores correspondientes de renilla, y los resultados se presentaron como unidades de luciferasa relativas.

Ensayo CCK8

Para la evaluación de la proliferación celular, las células se sembraron a una densidad de 2 × 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos, con cada pocillo conteniendo 100 µL de medio completo, seguido de una incubación nocturna (37 °C, 5% de CO2). En días consecutivos (días 1-5), se administraron 10 µL de compuestos de prueba a cada pocillo, seguida de una incubación de 2 h en condiciones estándar de cultivo. La cuantificación se realizó midiendo la densidad óptica (OD) con un lector de microplacas, y todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayo de formación de colonias

Para el ensayo de formación de colonias, se sembraron 2000 células por pocillo en placas de seis pocillos y se cultivaron durante 14 días en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2), renovando el medio cada 72 h. Después del cultivo de 14 días, las colonias celulares se fijaron utilizando un 4% de metanol (15 min, temperatura ambiente) seguido de tres lavados de 5 min con PBS. Las colonias se tiñeron posteriormente con una solución de cristal violeta al 0,1% durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la tinción, se adquirieron imágenes de las colonias y se cuantificaron para el análisis. Cada experimento se repitió por triplicado.

Ensayo de translocación

Se colocaron células (3 × 104) en 200 µL de DMEM sin suero en la cámara superior de translocación de una placa de 24 pocillos (Falcon #353097). Para crear un gradiente quimiotáctico, la cámara inferior contenía 800 µL de DMEM suplementado con un 10% de FBS. Después de la incubación de 24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2), las células que habían migrado al lado de la membrana inferior se fijaron en metanol al 100% durante 10 min a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS (5 min cada uno), se aplicó una solución de cristal violeta al 0,1% durante 20 min. Las células migratorias teñidas se visualizaron posteriormente utilizando un microscopio invertido a un aumento de 100× y se cuantificaron manualmente. Cada experimento se repitió por triplicado.

Ensayo de curación de heridas

Para el ensayo de curación de heridas, se sembraron 1 × 10⁵ células por pocillo en placas de seis pocillos y se cultivaron durante la noche para formar monocapas concéntricas en un medio completo (DMEM + 10% FBS). El medio se reemplazó con un medio de baja concentración de suero (2% FBS) y se creó una hendidura uniforme utilizando la punta de una pipeta estéril de 200 µL, seguida de lavados con PBS para eliminar los residuos. El cierre de la herida se monitoreó capturando imágenes de contraste de fase en posiciones idénticas a los 0, 12 y 24 h (aumento de 100×). Las tasas de migración se cuantificaron midiendo los cambios en el ancho de la herida utilizando el software ImageJ, calculado como: ((ancho a 0 h — ancho a t h) / ancho a 0 h) × 100%, con pocillos triplicados por condición. Cada experimento se repitió en triplicado.

Purificación de proteínas marcadas con GST de bacterias

El constructo pGEX-4T1-GSK-3β se transformó en E. coli BL21 (DE3) para expresar la proteína de fusión GSK-3β-GST. Después de una dilución de 1:100 de los cultivos iniciadores en medio LB fresco, los cultivos se incubaron a 37 °C hasta alcanzar una OD600 de 0,8. Posteriormente, la producción de proteínas se indujo mediante la adición de 0,1 mM de IPTG e incubación a 16 °C durante 16 h con agitación vigorosa. Después de la inducción, las proteínas recombinantes se aislaron de las células bacterianas cosechadas que se habían resuspendido en el tampón EBC antes de la sonicación. La fracción soluble se obtuvo eliminando el material insoluble y los restos celulares, y luego se sometió a una purificación por afinidad con glutatión mediante incubación con 50 µL de glutatión-Sepharose al 50% (Pierce) a 4 °C durante 3 h. Las cuentas lavadas (3 × PBS) produjeron proteínas que se almacenaron ya sea en PBS/10% de glicerol a 4 °C, o se eluyeron. La pureza se confirmó mediante tinción de Coomassie, con cuantificación basada en BSA.

Western blot

Se añadió el tampón RIPA a las células o tejidos procesados a 4 °C. Las muestras de proteínas se cargaron para electroforesis, después de lo cual, se retiró cuidadosamente el gel y se extirpó la banda (o bandas) objetivo guiándose por el marcador de proteínas. Se sumergió la membrana de PVDF en metanol durante 1 minuto y luego se transfirió al tampón de transferencia. A continuación, se bloqueó la membrana de PVDF con leche al 5% (1 h, temperatura ambiente), seguida de la incubación con el anticuerpo primario durante la noche (4 °C). Al día siguiente, se lavó la membrana con TBST, durante 15 minutos, tres veces. Luego, se incubó con anticuerpos secundarios durante 1 h. Se colocó la membrana de PVDF sobre el lector de imágenes, se aplicó uniformemente la solución de trabajo ECL, se eliminaron las burbujas de aire y se inició la exposición. Cada experimento se repitió en triplicado.

Anticuerpos

El anticuerpo personalizado PVT1-104aa se generó primero preparando el inmunógeno peptídico a través de GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Jiangsu, China), que se conjugó con la proteína portadora KLH y se controló la calidad mediante HPLC y MS para garantizar una pureza >85%. Posteriormente, se inmunizaron dos conejos utilizando el protocolo propietario Polyexpress de GenScript durante aproximadamente 4 semanas; se comprobó el título sérico después de la tercera inmunización para confirmar una fuerte respuesta inmune antes de la purificación. Finalmente, se recogió el antisuero de cada conejo, se agrupó y se purificó por afinidad utilizando el péptido objetivo, con validación de la calidad mediante ELISA indirecto (1:500 para IB).

Los anticuerpos contra c-Myc (#ab32072, 1:1000), MYC ser62 (#ab185656, 1:2000), MYC thr58 (#ab185655, 1:1000), GSK3β (#ab32391, 1:5000), FBXW7 (#ab192328, 1:1000) y myc tag (#ab32, 1:1000) fueron de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra β-tubulina (#2128, 1:1000), β-actina (#4967, 1:1000), GAPDH (#2118, 1:1000), Flag (#14793, 1:1000), HA (#3724, 1:1000), ubiquitina (#20326, 1:1000) y PD-L1 (#13684, 1:1000) fueron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.).

Co-inmunoprecipitación

Se recogieron células de placas de 10 cm, se lavaron con tampón PBS helado, se añadió tampón de lisis IP suplementado con inhibidores de proteasas y luego se incubaron en hielo durante 30 minutos. Los lisados se centrifugaron y el sobrenadante resultante se dividió en alícuotas para experimentos posteriores. La co-inmunoprecipitación se realizó utilizando el kit Pierce (Thermo), donde las cuentas se conjugaron con el anticuerpo primario para capturar los complejos de proteínas. Se lavaron las cuentas repetidamente con tampón de unión para eliminar las proteínas unidas de forma no específica. Los complejos unidos a las cuentas se desnaturalizaron calentando a 95 °C durante 5 minutos en el tampón de carga SDS-PAGE y, posteriormente, se resolvieron mediante SDS-PAGE para su análisis.

Estudios con animales

Los roedores experimentales, que comprendían las cepas C57BL/6J y BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad, con un equilibrio de sexos; GemPharmatech), se alojaron en condiciones estandarizadas, manteniendo una temperatura ambiente de 22 a 25 °C con un fotoperiodo de 12 h/12 h. La asignación de animales a los diferentes grupos de estudio se realizó mediante protocolos de aleatorización informatizada. Se establecieron xenoinjertos mediante inyección subcutánea de 5 × 10⁵ células MC38/CT26 de control o con depleción de circPVT1 en 100 µL de PBS helado. Las mediciones del tamaño del tumor y las evaluaciones finales se realizaron por investigadores que desconocían la asignación de los grupos. El volumen tumoral se monitoreó mediante mediciones con calibre (L × W / 2), y se realizó la eutanasia cuando se alcanzó un diámetro de 15 mm, un estado de moribundez o se superó la carga tumoral permitida. Los modelos de metástasis pulmonar se generaron mediante inyección en la vena de la cola de células MC38 (1 × 10⁶ células suspendidas en 100 µL de PBS), y se recogieron los tejidos pulmonares fijados con formalina después de 8 semanas para la enumeración de nódulos metastásicos. Todas las cuantificaciones se realizaron de forma ciega. Los grupos de tratamiento recibieron inyecciones intraperitoneales dos veces por semana de anti-PD-L1 (100 µg/dosis; BioXcell #BP0101) o control de IgG (#BE0083).

Inmunohistoquímica

Todas las secciones de tejido (xenoinjertos y muestras clínicas) se sometieron a una recuperación de antígenos estándar con EDTA alcalino (pH 8,0) después de la desparafinación. El bloqueo de la peroxidasa se logró con un tratamiento al 3% de H2O2. Las muestras se bloquearon utilizando una solución de PBS con 5% de suero de cabra normal (Vector) y 0,1% de Triton X-100 durante 1 h después de los lavados con PBS. Los anticuerpos primarios dirigidos contra c-Myc (1:200), PVT1-104aa (1:100), PD-L1 (1:500) y Ki67 (1:2000) se aplicaron a ciertas diluciones durante la noche. Se empleó el sistema de detección HRP-DAB para la localización del antígeno.

Citometría de flujo

Tras la eutanasia, se recogieron inmediatamente los tumores de ratón, se picaron en pequeños fragmentos y se digirieron enzimáticamente en DMEM que contenía colagenasa IV (1,5 mg/mL, Sigma) y DNasa I (100 µg/mL, Sigma) a 37 °C durante 45 minutos con una agitación suave (250 rpm). Después de la digestión, el tejido se filtró a través de una malla de 80 µm para obtener células individuales. Estas células se centrifugaron (300 × g, 5 min), se lavaron con PBS y, finalmente, se resuspendieron en tampón de tinción que contenía 1% de BSA y 1 mM de EDTA en PBS. Para la inmunofenotipificación de los subconjuntos de células inmunitarias y los marcadores de agotamiento, las suspensiones de células individuales se etiquetaron con un panel de anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente dirigidos contra antígenos de superficie específicos, incluidos CD11b-APC (MABF362, Sigma-Aldrich), Gr-1-PE (MABF472, Sigma-Aldrich), CD45-PerCP-Cy5.5 (MABF160A, Sigma-Aldrich), CD8-PE (SAB4700088, Sigma-Aldrich), CD4-PE (MABF573, Sigma-Aldrich), PD-1-APC (329907, Biolegend), Tim-3-FITC (11-5870-82, ThermoFisher), GZMB-PE (12-8988-82, ThermoFisher) y PRF1-PE (12-9392-82, ThermoFisher), según las recomendaciones del fabricante. Para cada panel de tinción, las células se incubaron con los anticuerpos durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo BD FACSAria o equivalente después de lavarlas con tampón de tinción. El análisis se realizó con el software FlowJo. Las MDSC se definieron como células CD45+CD11b+Gr-1+. La estrategia de clasificación definió las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ dentro de los linfocitos CD45+, y sus frecuencias se expresaron en relación con el total de células viables. La expresión de marcadores de superficie e intracelulares (PD-1, Tim-3, GZMB, PRF1) en los linfocitos T CD8+ se evaluó y cuantificó como MFI.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina-PCR

Siguiendo el protocolo comercial, realizamos la inmunoprecipitación de cromatina con el kit SimpleCHIP Enzymatic Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology). Tras la reticulación cruzada mediada por formaldehído y la lisis celular, la cromatina se fragmentó mediante un tratamiento limitado con micrococcal nuclease. La inmunoprecipitación de cromatina se realizó utilizando cuentas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para c-Myc o IgG de control isotípico. Tras la reversión de las uniones cruzadas inducidas por formaldehído, el ADN inmunoprecipitado se purificó mediante centrifugación a través de una membrana de sílice y se realizó una evaluación cuantitativa de PCR centrada en las secuencias del promotor de CD274 (PD-L1).

Análisis estadístico

El procesamiento de datos se realizó con GraphPad Prism 8.0 y Microsoft Excel 16.74, y los resultados se expresaron como valores medios ± desviación estándar derivados de experimentos triplicados. Para las comparaciones paramétricas, se utilizaron: (1) pruebas t pareadas para pares de tejidos tumorales y normales; (2) pruebas t no pareadas o ANOVA para otros grupos. El análisis de supervivencia se realizó utilizando la metodología de Kaplan-Meier. Los umbrales de significación se establecieron en p < 0,05, con anotación basada en asteriscos de la siguiente manera: *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Yiwei Li y Qingguo Li concibieron el concepto del estudio, diseñaron los enfoques experimentales y supervisaron todas las actividades de investigación. Maoguang Ma, Mingdian Wang y Yufei Yang recogieron las muestras clínicas y realizaron los experimentos. Shaobo Mo y Sanjun Cai analizaron e interpretaron los datos. Maoguang Ma y Dakui Luo redactaron el manuscrito. Maoguang Ma, Yiwei Li y Weixing Dai realizaron el análisis estadístico.

INFORMACIÓN SOBRE LA FINANCIACIÓN

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82203289 para M.M.) y la Fundación de Ciencias para Jóvenes del Hospital Zhongshan de la Universidad Fudan (2024ZSQN36).

DECLARACIÓN DE ÉTICA Y CONSENTIMIENTO PARA PARTICIPAR

El estudio fue aprobado por los Comités de Revisión Institucional de Ética del Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái y cumplió con todas las normas éticas pertinentes con respecto a los participantes humanos (número de ética 050432-4-2108*, 8 de agosto de 2021). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái (número de ética FUSCC-IACUC-S2022-0095, 21 de febrero de 2022). Todos los procedimientos experimentales y con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y principios de la Declaración de Helsinki y el Consejo Internacional para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (ICLAS).

DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.