Ácidos grasos en el microambiente tumoral reprograman neutrófilos para inducir inmunosupresión a través de adenosina

El microambiente tumoral (MET) es propenso a frecuentes cambios metabólicos que reprograman la función de las células inmunitarias y afectan la inmunidad antitumoral (^[1]). Los neutrófilos son un tipo principal de célula inmunitaria en el MET que presenta una considerable heterogeneidad (^[2]). Con frecuencia se asocian con malos resultados en pacientes con cáncer, y un aumento de la infiltración tumoral se correlaciona con un peor pronóstico (^[3]-^[6]). Sin embargo, los neutrófilos también pueden ejercer efectos antitumorales, ya sea a través de citotoxicidad directa o mediante interacciones con otras células inmunitarias (^[7]-^[10]). Su función en el cáncer sigue siendo controvertida (^[11]); mientras que algunos estudios informan de una reducción de la carga tumoral tras la depleción de neutrófilos mediada por anti-Ly6G, otros demuestran efectos inhibidores del tumor de los neutrófilos (^[12]-^[15]). En tumores en etapa temprana, los pacientes que responden a la inmunoterapia presentan un subconjunto distinto de neutrófilos capaces de controlar el crecimiento tumoral (^[16],^[17]). Estos hallazgos resaltan la plasticidad de los neutrófilos, que pueden adoptar fenotipos pro- o antitumorales dependiendo de las señales del microambiente (^[18]).

Comprender cómo el metabolismo influye en la función de los neutrófilos en el MET es fundamental. Junto con los macrófagos, los neutrófilos se consideran células mieloides inmunosupresoras que contribuyen a las respuestas deficientes a la inhibición de puntos de control inmunitarios (ICB) (^[19]-^[26]). Si bien se sabe que las citocinas y las quimiocinas modulan el comportamiento de los neutrófilos, el impacto de la disponibilidad de nutrientes sigue estando poco definido. Tanto la proliferación de las células cancerosas como las respuestas inmunitarias eficaces dependen del acceso a los nutrientes dentro del MET (^[27],^[28]). La acumulación de lípidos es una característica de muchos tumores sólidos y promueve la progresión tumoral (^[29]-^[31]). Además, el metabolismo de los lípidos también desempeña un papel central en la supresión de la inmunidad antitumoral (^[32],^[33]). El fluido intersticial tumoral (FIT), que representa el medio extracelular del MET, en un modelo de tumor de melanoma B16 en ratones contiene muchos ácidos grasos (AG), cuya abundancia aumenta a medida que progresan los tumores (^[34]). Numerosos estudios se han centrado en los efectos de los ácidos grasos sobre las células T y se han centrado principalmente en demostrar los efectos tóxicos de los ácidos grasos en altas concentraciones mediante la inducción de varias vías (^[29],^[35],^[36]). Los estudios han demostrado que varias especies de lípidos pueden exhibir efectos de señalización sobre la diferenciación y polarización de los macrófagos asociados al tumor y desempeñan un papel importante en la inducción de efectos inmunosupresores que favorecen el crecimiento y la progresión del tumor (^[37]-^[41]).

A pesar de estos avances, aún no está claro cómo los lípidos moldean el panorama inmunitario, en particular la función de los neutrófilos. Aquí, mostramos que los neutrófilos en tumores avanzados adoptan un fenotipo altamente supresor en comparación con los de tumores en etapa temprana. Esta transición está impulsada, en parte, por las señales de nutrientes dentro del FIT. Los AG promueven la aparición de neutrófilos inmunosupresores que producen adenosina, un potente inhibidor de la proliferación y activación de las células T. Múltiples especies de AG fueron suficientes para inducir la liberación de adenosina mediada por neutrófilos. El bloqueo del receptor de adenosina en las células T con un antagonista selectivo revirtió los efectos supresores de los neutrófilos "educados" con AG y mejoró la supervivencia en un modelo de ratón inmunosupresor de cáncer colorrectal (CCR) cuando se combinó con inmunoterapia. Estos hallazgos identifican un eje ácido graso-neutrófilo-adenosina como una vía selectiva y susceptible de ser objetivo para restaurar la citotoxicidad de las células T y mejorar la inmunidad antitumoral en el MET.

Métodos

Ratones y tratamientos

Se utilizaron ratones C57BL/6 o BALB/C de tipo salvaje para experimentos sinérgicos. Los ratones TripleMut y PPARα KO se describieron previamente (^[42],^[43]). Los ratones OT-1 procedían de los laboratorios Jackson (número de cepa: 003831) y se utilizaron para ensayos de eliminación de células T in vitro o in vivo. Los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente en condiciones libres de patógenos específicos a una temperatura ambiente de 22 °C ± 2 °C, 45-65% de humedad relativa y un ciclo de luz/oscuridad (12 h de luz/12 h de oscuridad). Se proporcionó comida y agua de beber ad libitum con una dieta estándar. Se utilizaron ratones machos o hembras de seis a ocho semanas de edad para todos los experimentos. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de la Atención de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Universitario para el Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan y el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Cáncer bajo el Protocolo LM-016. Para el modelo sinérgico, se inyectaron por vía subcutánea 2 millones de células MC38 o Yumm5.2 y 1 millón de células CT26 en ambos flancos de ratones C57BL/6 o BALB/c, respectivamente. El tamaño del tumor se midió con calibradores digitales. A los 30 días (modelo MC38) o 20 días (modelo CT26 y Yumm5.2) después de que el crecimiento tumoral alcanzara la etapa avanzada, se sacrificaron los ratones y se aislaron los neutrófilos. Los ratones TripleMut se indujeron con tamoxifeno (Sigma-Aldrich) disuelto en aceite de maíz a 50 mg/kg o 100 mg/kg administrado por inyección intraperitoneal durante 3 días consecutivos. Para los estudios de supervivencia, los ratones recibieron anticuerpo anti-PD-1 (clon RMP1-14, Bio X Cell) a 5 mg/kg por vía intraperitoneal cada 3 días, comenzando 3 días después de la inducción con tamoxifeno. El anticuerpo anti-Ly6G (clon 1A8, Bio X Cell) se administró a 100 μg por ratón por vía intraperitoneal cada 3 días. El anticuerpo anti-CD8α (clon 2.43, Bio X Cell) se administró a 25 mg/kg por vía intraperitoneal cada 5 días. Los grupos de control recibieron anticuerpos de control con la misma isotipía (IgG2a para anti-PD-1, IgG2b para anti-Ly6G y anti-CD8α) a dosis y horarios equivalentes.

Cultivo de enteroides tumorales y crecimiento in vivo

La línea de enteroides 14481 derivada del paciente, que alberga mutaciones en APC, KRAS y TP53, se cultivó según se describió previamente (^[44],^[45]). Los enteroides se disociaron en células individuales, se resuspendieron en 200 μL de Matrigel (Corning) y se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos, que carecen de células T pero conservan poblaciones inmunitarias innatas funcionales.

Líneas celulares

Las líneas celulares de carcinoma de colon de ratón MC38, MC38-Ova y CT26 se mantuvieron en medio RPMI-1640, y la línea celular de melanoma de ratón Yumm5.2 se mantuvo en medio DMEM F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de antibiótico/antimicótico. Todas las líneas celulares se analizaron periódicamente para detectar una posible contaminación por micoplasma. Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio estaban libres de micoplasma.

Cultivos celulares primarios

Los neutrófilos derivados de la médula ósea se purificaron a partir de células de la médula ósea aisladas de los fémures y las tibias de ratones WT o ratones con tumor (C57Bl6/J) utilizando un método de gradiente de densidad de dos capas con 62,5% de Ficoll (GE Healthcare) como reactivo de separación en 1X HBSS-Prep (HBSS + 0,5% de FBS + 20 mM de Na-HEPES (pH 7,4) + Pen/Strep). Las células de la médula ósea se colocaron en una capa de 62,5% de Percoll y se centrifugaron durante 30 minutos a 1000 × g sin freno ni aceleración. Al final de la centrifugación del gradiente, una interfaz nítida en la parte superior del 62,5% de percoll (estas son células inmaduras y linajes no granulocíticos) se separó de un gránulo más turbio (los neutrófilos). El gránulo de neutrófilos se lavó en HBSS prep y las células se cultivaron durante 16 a 24 horas en RPMI con GlutaMax + 10% de FBS inactivada por calor + 20 mM de HEPES + y 1% de penicilina/estreptomicina suplementado con 10 ng/mL de GM-CSF (BioLegend). Los neutrófilos tumorales se aislaron de tumores cosechados de ratones del modelo sinérgico. Los tumores se lavaron, se disecaron en pequeños trozos y se digirieron con colagenasa V durante 45 minutos a 37 °C. Los trozos digeridos se recogieron y se obtuvo una suspensión de células individuales. Los neutrófilos se extrajeron de las suspensiones de células individuales de tumores utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos MojoSort™ para ratón (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Para los neutrófilos del colon, primero se enriquecieron y separaron las células inmunitarias de las células epiteliales, para lo cual se lavó el colon dos veces con PBS y se cortó en pequeños trozos, seguido de la digestión con 25 mM de EDTA dos veces en un incubador con agitación a 37 °C para eliminar las células epiteliales. Este paso fue seguido de la digestión con 0,5 mg/mL de colagenasa IV, después de lo cual las células se purificaron utilizando un gradiente de Percoll del 40% al 70%. El extracto de células inmunitarias se sometió a continuación al aislamiento de neutrófilos utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos MojoSort™ para ratón (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de proliferación o activación in vitro, las células T CD3+ o CD8+ se aislaron de los esplenocitos de ratones C57Bl6/J de 6 a 8 semanas de edad utilizando un kit de aislamiento de células T CD3+ o CD8+ para ratón MojoSort (BioLegend) según las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento de las células T CD3+ o CD8+, se sembraron 1 × 105 esplenocitos por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos recubiertas con CD3 (1,0 μg/ml, clon: 145-2C11, Thermo Fisher) y αCD28 (2 μg/ml, clon: 37.51, Thermo Fisher) en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio y 0,1% de β-mercaptoetanol y 5 ng/mL de IL2. Para los experimentos de cocultivo, los neutrófilos o macrófagos tratados con los reactivos indicados en las leyendas de las figuras o sin tratar se cocultivaron con células T CD3+ en una proporción de 1:2.

Tratamientos con receptor de adenosina e inhibidor de β-oxidación

AB928 (Arcus Biosciences) y AB680 (Arcus Biosciences) se disolvieron en DMSO para preparar soluciones madre de 10 mM y se almacenaron a -20 °C. Para los experimentos in vitro, las células T se pretrataron con 1 μM de AB928 o las células cancerosas se pretrataron con 100 nM de AB680 durante 30 minutos a 37 °C antes del cocultivo. Para los experimentos in vivo, AB928 se disolvió en 0,5% de metilcelulosa y se administró por gavage oral a 100 mg/kg dos veces al día. Etomoxir (Sigma-Aldrich) se disolvió en DMSO y se utilizó a concentraciones de 10 μM o 25 μM según se indica en las leyendas de las figuras con un pretratamiento de 16 horas antes de los ensayos funcionales.

Recolección de tejido humano

Se obtuvieron muestras frescas de tejido de adenoma y adenocarcinoma colorrectal humano de pacientes sometidos a resección quirúrgica en el Centro Médico de la Universidad de Michigan bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB, protocolo n.º HUM00064405). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la recolección de tejido.

Aislamiento de neutrófilos

Los tejidos tumorales se picaron en trozos de 2 a 3 mm y se digirieron con 1 mg/mL de colagenasa IV (Worthington Biochemical) y 0,1 mg/mL de DNasa I (Sigma-Aldrich) en HBSS durante 45 minutos a 37 °C con agitación suave. Las suspensiones de células individuales se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y se resuspendieron en PBS. Los neutrófilos humanos se aislaron utilizando un gradiente de densidad discontinuo con Histopaque-1077 e Histopaque-1119 (Sigma-Aldrich). Brevemente, se colocaron 3 mL de Histopaque-1119 debajo de 3 mL de Histopaque-1077 en un tubo cónico de 15 mL. La suspensión celular (hasta 6 mL) se colocó cuidadosamente sobre el Histopaque-1077 y se centrifugó a 700 × g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno. Los neutrófilos se recogieron de la interfaz entre el Histopaque-1119 y el gránulo celular, se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en medio RPMI completo. La pureza de los neutrófilos se confirmó en >90% mediante citometría de flujo utilizando los marcadores de superficie CD66b y CD15, y la viabilidad se evaluó mediante exclusión de azul de tripan para garantizar que fuera >95%.

Cuantificación de la proliferación y la apoptosis tumoral

Para el análisis de la proliferación, se inyectaron por vía intraperitoneal 100 mg/kg de BrdU (Sigma-Aldrich) 2 horas antes del sacrificio. Los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído al 4%, se incluyeron en parafina y se seccionaron con un grosor de 5 μm. La incorporación de BrdU se detectó utilizando el kit de detección in situ de BrdU (BD Pharmingen) según el protocolo del fabricante. La apoptosis se evaluó utilizando el kit de detección de muerte celular in situ (Roche) siguiendo los procedimientos estándar de tinción TUNEL. La proliferación se cuantificó como el porcentaje de células BrdU positivas, y la apoptosis se cuantificó como el porcentaje de células TUNEL positivas en al menos 5 campos aleatorios de alto aumento (40×) por sección de tumor utilizando el software ImageJ.

Ensayo de netosis

La NETosis se cuantificó utilizando un enfoque de imagen de fluorescencia en tiempo real, combinado con la segmentación y clasificación automatizada de células. Los neutrófilos derivados de la médula ósea se sembraron a una concentración de 2 × 10 células por pocillo en placas de cámara de vidrio de 8 pocillos (Cellvis, #C8-1.5H-N), pretratadas con 25 μg/ml de fibrinógeno y 10 μg/ml de fibronectina en DPBS. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO2, con ácido oleico (100 μM), ácido araquidónico (100 nM) o BSA (control vehículo) en RPMI-1640 suplementado con GlutaMAX, 10 % de FBS inactivado por calor, 20 mM de HEPES, 1 % de penicilina/estreptomicina y 10 ng/ml de GM-CSF.

Al día siguiente, el medio se reemplazó con RPMI que contenía 2 % de BSA. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 (1 μg/ml), CellMask Orange (1 μM) y SYTOX Green (500 nM), y se estimularon con 100 nM de 12-miristoato 13-acetato de forbol (PMA; Sigma-Aldrich) para inducir la NETosis. Se adquirieron imágenes cada minuto durante 2 horas utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Colibri con un aumento de 20×. El análisis de las imágenes se realizó utilizando CellProfiler, donde se segmentaron los núcleos y los límites celulares, y las células NETóticas se identificaron como aquellas con citoplasma positivo para SYTOX Green. La NETosis se cuantificó como el porcentaje de células NETóticas sobre el recuento total de células a los 90 minutos después del tratamiento con PMA.

Ensayos de proliferación y activación de células T

Las células T se tiñeron antes de la siembra con 2 μM de CFSE (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) durante 15 minutos a 37 °C, según las instrucciones del fabricante. El exceso de tinte se eliminó lavando tres veces con tampón de tinción CFSE (PBS+1 % de FBS). Las células T se cocultivaron con neutrófilos previamente tratados o no tratados con diferentes reactivos. Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos contra CD4, CD8, CD44 o CD25 (Invitrogen) para la selección de subconjuntos específicos y con 7AAD (BD Biosciences) para la exclusión de células muertas. Se tomaron suspensiones de células individuales para el análisis de citometría de flujo. Dado que el CFSE se diluye aproximadamente a la mitad con cada división celular, se seleccionaron las células vivas individuales (tinción negativa para 7AAD) y se calculó el porcentaje de proliferación mediante la selección de la población de CFSE tenue (izquierda). La intensidad media de fluorescencia de CD25 y el porcentaje de células CD44 positivas se utilizaron para evaluar el nivel de activación de las células T CD4+ y CD8+.

Ensayos de agotamiento de células T y de citocinas intracelulares

Las células T CD8+ se trataron con PMA, ionóforo y brefeldina A (Sigma) para la activación y con GolgiStop (BD Pharmingen) para detener la liberación extracelular 6 horas antes del ensayo. Primero, las células se tiñeron para los marcadores de superficie utilizando anticuerpos contra CD8, PD-1 y Tim-3 (eBioscience) y el marcador de exclusión de células vivas/muertas 7AAD (BD Biosciences), después de lo cual se lavaron dos veces con tampón FACS. Luego, las células se incubaron en tampón de fijación/perm (eBioscience #005123) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización (eBioscience #008333) y, a continuación, se determinó la expresión de citocinas de las células T CD8+ mediante la tinción intracelular con anticuerpos contra IFN-γ, TNF-α y granzima-b (Invitrogen) preparados en tampón de permeabilización durante 45 minutos sobre hielo. Las muestras se lavaron tres veces con tampón de permeabilización y todas las muestras de citometría de flujo se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un citómetro de flujo Cytek Aurora, capturando un mínimo de 50 000 eventos por muestra.

Ensayo de citotoxicidad in vitro e in vivo de células T CD8+

Las células MC38 o B16 que expresan ovalbúmina se suspendieron en medio completo RPMI 1640 (como se describe para el cultivo de células T). Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a 50 000 células por pocillo y se incubaron durante 24 horas para permitir su adherencia al sustrato. Las células T CD8+ se aislaron de los esplenocitos de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección negativa CD8+ MojoSort (BioLegend). Las células T CD8+ se activaron con 5 μg/ml de péptido de ovalbúmina (OVA257-264, InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) y se cultivaron durante 3 o 4 días en medio completo RPMI-células T con o sin medio acondicionado pretratado con neutrófilos. Luego, se añadieron sobre las células MC38 Ova. A continuación, se añadió 50 ng/ml de tinte SYTOX Green (Invitrogen) y se realizó la imagen de toda la placa mediante imagen de células vivas utilizando un lector de imágenes multimodales Cytation 5 para cuantificar las células fluorescentes verdes. Alternativamente, las células se tiñeron con 7AAD para la tinción de muerte celular y se analizaron en un citómetro de flujo (Cytek Aurora Spectral Analyzer). El porcentaje de muerte celular se calculó utilizando las células que presentaban tinción positiva para 7AAD. Para el ensayo in vivo, las células T CD8+ aisladas de 10 ratones OT-1 se cultivaron durante 4 días en medio acondicionado de neutrófilos inducidos con OA en presencia de AB928, después de lo cual se contaron y se transfirieron adoptivamente 1 millón de células a ratones individuales portadores de MC38-OVA. Se monitorizó la progresión del tumor a lo largo del estudio y se registraron los pesos terminales de los tumores para cada grupo. Se evaluó la proliferación y la apoptosis en las células tumorales.

Aislamiento de fluido intersticial tumoral (FIT) y suero

El fluido intersticial tumoral (FIT) de ratón se aisló de tumores MC38, CT26 o Yumm5.2 utilizando un protocolo modificado de un método de centrifugación descrito previamente (^[34], ^[46]-^[49]). Los ratones portadores de tumores se sacrificaron por dislocación cervical y los tumores se disecaron rápidamente de los animales en un plazo de 1 minuto. Se recogió sangre del mismo animal mediante punción cardíaca y se centrifugó a 800 × g durante 10 minutos a 4 °C para separar el plasma. El plasma se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis. Los tumores con un peso superior a 500 mg se enjuagaron rápidamente en PBS 1X y se añadió PBS adicional sobre papel de filtro. Luego, los tumores se colocaron sobre un tamiz celular de 15 μm, PluriStrainer (PluriSelect, CA, EE. UU.), se fijaron en la parte superior de tubos cónicos de 50 ml y se centrifugaron a 150 × g a 4 °C durante 10 minutos. A continuación, se recogieron los FIT, se transfirieron a un tubo de 1,5 ml, se congelaron y se almacenaron a −80 °C hasta su posterior análisis. Se aisló FIT (30–100 μL) de 1 tumor grande con un peso superior a 500 mg.

El FIT humano se aisló de tejidos frescos de adenoma y adenocarcinoma en un plazo de 15 minutos tras la resección quirúrgica. Durante el transporte, los tejidos se mantuvieron en hielo para preservar su integridad. Los tumores con un peso de entre 40 y 75 mg se colocaron sobre tamices Pluri de 15 μm (PluriSelect, CA, EE. UU.) colocados en la parte superior de tubos cónicos de 50 ml y se centrifugaron a 1000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El FIT resultante (3–5 μL por muestra) se recogió y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis.

Metabolómica

Para las muestras de neutrófilos, se sembraron 3 millones de células en medio completo RPMI en una placa de 6 pocillos y se trataron con ácidos grasos o se dejaron sin tratar para los neutrófilos en fase temprana o tardía del tumor durante 24 horas. Las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se recogieron en tubos separados y se colocaron inmediatamente sobre hielo seco. Se mezclaron 200 μl de sobrenadante de neutrófilos con 800 μl de metanol HPLC al 100 % frío. El pellet de neutrófilos se lavó una vez con PBS frío y luego se incubó en metanol al 80 % frío sobre hielo seco durante 10 minutos antes de la homogeneización. Las concentraciones de las muestras se normalizaron realizando un ensayo de proteínas BCA en un réplica técnica y se normalizó el volumen en todas las muestras para lograr concentraciones uniformes. Los extractos de metabolitos del sobrenadante o de la fracción de pellet se liofilizaron y luego se resuspendieron en una mezcla de metanol/agua (50:50) para el análisis de LC MS. Los datos se recogieron tanto en modos de iones negativos como positivos. Para el modo negativo, se utilizaron parámetros publicados anteriormente (^[50], ^[51]). Para el modo positivo, se utilizó un sistema LC/MS Agilent Technologies Triple Quad 6470 que consta de una bomba flexible Infinity II LC (bomba cuaternaria), un muestreador Infinity II Multi, un termostato multicolumna Infinity II con válvula de 6 puertos y un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple 6470. Se utilizó el software Agilent Mass Hunter Workstation LC/MS Data Acquisition for 6400 Series Triple Quadrupole MS con la versión B.08.02 para la calibración, la optimización de compuestos y la adquisición de datos de la muestra. Se utilizó una columna Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 mmVanGuard Pre-Column de 2.1 × 5 mm y una columna Waters UPLC BEH TSS C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 mm) con una fase móvil A que consistía en ácido fórmico al 0.1 % en agua y una fase móvil (B) que consistía en ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo. El gradiente del solvente B fue el siguiente: el solvente B se mantuvo al 0.1 % durante 3 minutos, se aumentó al 6 % a los 12 minutos, al 15 % a los 15 minutos, al 99 % a los 17 minutos y se mantuvo durante 2 minutos antes de volver a las condiciones iniciales y se mantuvo durante 5 minutos. La columna se mantuvo a 40 °C y se inyectaron 3 ml de muestra en el LCMS a un caudal de 0.2 ml/min. La calibración del instrumento QqQ MS 6470 se realizó mediante una mezcla de calibración Agilent ESI-Low Concentration Tuning. Los datos QQ para ambos modos de iones se preprocesaron con el software de análisis cuantitativo Agilent MassHunter Workstation (B0700). Los picos de cromatografía de metabolitos se inspeccionaron manualmente. La abundancia de cada metabolito se normalizó mediante la mediana en toda la población de muestras. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con un umbral de significación de 0.05. Para las muestras de FIT y suero, se mezclaron 100 μl de FIT de 3 tumores diferentes de ratones separados y 100 μl de suero con 400 μl de metanol al 100 %. Las muestras se secaron y se resuspendieron en 1:1 MeOH/H2O y se procesaron posteriormente como se describe para los neutrófilos.

Lipidómica

Las muestras se analizaron mediante un sistema UHPLC Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid™ utilizando una fuente de iones H-ESI™ (todo de Thermo Fisher Scientific) con una columna CSH C18 de Waters (Milford, MA) (1.0 × 150 mm, tamaño de partícula de 1.7 μm) en modos de detección de iones positivos y negativos. El solvente A fue ACN: H2O (60:40; v/v) que contenía 10 mM de formiato de amonio y 0.1 % de ácido fórmico, y el solvente B fue IPA: ACN (95:5; v/v) que contenía 10 mM de formiato de amonio y 0.1 % de ácido fórmico. El caudal de la fase móvil fue de 0.11 ml/min y la temperatura de la columna fue de 65 °C. El gradiente del solvente B fue el siguiente: el solvente B se mantuvo al 15 % durante 0 min, se aumentó al 30 % a los 1–3 min, al 48 % a los 3–3.5 min, al 82 % a los 3.5–12 min, al 99 % a los 12–12.2 min, al 99 % a los 12.2–17.00 min, al 15 % a los 17.00–17.50 min y al 15 % a los 17.00–20.00 min. Los voltajes de pulverización de la fuente de iones fueron de 4000 V y 3000 V en los modos positivo y negativo, respectivamente. La espectrometría de masas se realizó con un rango de escaneo de 200 a 1500 m/z para el escaneo de barrido completo y se utilizó en el modo AcquireX con una energía de colisión escalonada del 35 % y una dispersión del 15 % para el escaneo de fragmentación de MS/MS.

Secuenciación de ARN de célula única

Preparación y procesamiento de la biblioteca

Se aislaron aproximadamente 5-6 millones de neutrófilos derivados de la médula ósea de 5 ratones portadores de tumores MC38 en fase tardía. Las células de cada ratón se agruparon y se procesaron para la secuenciación de ARN de célula única utilizando un kit de expresión génica de célula única Chromium Flex según las instrucciones estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma NovaSeq6000 (Illumina). Se utilizó Cell Ranger v.3.1.0 (10x Genomics) para alinear las lecturas de secuenciación al genoma de referencia del ratón GRCm38 y generar tablas de conteo de identificadores moleculares únicos (UMI) para cada gen por célula.

Control de calidad y procesamiento de los datos de secuenciación de ARN de célula única

Se utilizó el paquete R Seurat v.4.1.1 para calcular las métricas de control de calidad. Se eliminaron las células del análisis si a) presentaban menos de 500 o más de 3000 genes únicos, b) presentaban más de 20.000 moléculas de ARN o c) más del 8% de las lecturas se asignaban a genes mitocondriales. Los datos se normalizaron para la profundidad de secuenciación, se escalaron a 10.000 UMI por célula y se transformaron logarítmicamente utilizando la función de normalización de datos de Seurat. Se utilizó la función FindVariableFeatures de Seurat para definir 2000 genes altamente variables que se utilizaron como entrada para el análisis de componentes principales. Los datos normalizados se escalaron y se generaron gráficos de codo para determinar cuántos componentes principales incluir en el análisis. Esto correspondió aproximadamente a los primeros 15 componentes principales. Se calcularon las incrustaciones de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) utilizando estos componentes principales como entrada, y las células se agruparon utilizando la función FindClusters. Además, se filtraron las células de los grupos con menos de 50 células y se repitieron los pasos de procesamiento anteriores para identificar nuestros grupos de interés.

Identificación y análisis de expresión de grupos mediante secuenciación de ARN de una sola célula

Los grupos se anotaron en función de las comparaciones con las poblaciones de neutrófilos identificadas en un estudio previo de neutrófilos murinos (^[52]). En resumen, las firmas genéticas de las poblaciones identificadas en Xie et al. se puntuaron en cada uno de los 5 grupos detectados en nuestro estudio utilizando la función AddModuleScore de Seurat. Los grupos maduros correspondieron a aquellos que obtuvieron una puntuación alta para G4-G5C, mientras que las poblaciones inmaduras obtuvieron una puntuación alta para G1. Los marcadores de cada población etiquetada se identificaron utilizando la función quickMarkers del paquete R SoupX y se filtraron para aquellos que se expresaban en al menos el 65% de las células (^[52]). Estos marcadores y otros marcadores específicos de neutrófilos se visualizaron utilizando las funciones DoHeatmap y FeaturePlot de Seurat.

Ensayo de cuantificación de adenosina

Los neutrófilos se trataron con ácidos grasos según lo indicado en las leyendas de las figuras durante 24 horas, después de lo cual las células se centrifugaron para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se analizó inmediatamente para la cuantificación dirigida de adenosina utilizando un kit de ensayo de adenosina (CELL BIOLABS, INC.) según las instrucciones del fabricante.

PCR cuantitativa en tiempo real

Para la expresión génica de neutrófilos, se extrajo un miligramo de ARN total de los neutrófilos utilizando un kit Quick RNA MicroPrep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante y se transcribió a ADNc utilizando el sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Se realizaron tres réplicas técnicas de PCR en tiempo real para cada muestra. Los cebadores específicos del gen de ADNc y la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems) se combinaron y luego se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). La expresión relativa de los genes se calculó utilizando el método ddCt con Actb o GAPDH como gen de referencia de ARNm.

Para la expresión génica tumoral, las células cancerosas MC38 se inyectaron subcutáneamente en los flancos de ratones C57BL/6. Los ratones se sacrificaron a los 14 días posteriores a la inyección (punto de tiempo temprano) o a los 28 días posteriores a la inyección (punto de tiempo tardío). Los tumores se disecaron rápidamente. Se transcribió 1 microgramo de ARN total a ADNc utilizando el sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Se realizaron tres réplicas técnicas de PCR en tiempo real para cada muestra. Los cebadores específicos del gen de ADNc y la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems) se combinaron y luego se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). La expresión relativa de los genes se calculó utilizando el método ddCt con Actb como gen de referencia de ARNm.

ELISA

Se cuantificaron los niveles de citocinas en sobrenadantes de células T después del cocultivo con neutrófilos de ratones con tumor o ratones inducidos con ácidos grasos. Se realizaron ensayos de TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-4, IL-10 y TGF-β de ratón utilizando kits ELISA de anticuerpos emparejados (R&D Systems, Minneapolis, MN) según el protocolo del fabricante.

Presentación de datos y análisis estadístico

Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. La significancia de las diferencias entre dos grupos se probó utilizando una prueba t no pareada de dos colas. Las diferencias significativas entre múltiples grupos se probaron utilizando ANOVA de 1 vía o de 2 vías seguida de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de P menor que 0,05 indicaba significancia estadística. La significancia estadística de las diferencias se describe en las leyendas de las figuras como *P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 y *** P90% mediante citometría de flujo utilizando los marcadores de superficie CD66b y CD15, y se evaluó la viabilidad mediante la exclusión de azul de tripan, que fue >95%.

Cuantificación de la proliferación y la apoptosis tumoral

Para el análisis de la proliferación, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 100 mg/kg de BrdU (Sigma-Aldrich) 2 horas antes del sacrificio. Los tejidos tumorales se fijaron en un 4% de paraformaldehído, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm de espesor. La incorporación de BrdU se detectó utilizando el kit de detección in situ de BrdU (BD Pharmingen) según el protocolo del fabricante. La apoptosis se evaluó utilizando el kit de detección de muerte celular in situ (Roche) siguiendo los procedimientos estándar de tinción TUNEL. La proliferación se cuantificó como el porcentaje de células BrdU-positivas, y la apoptosis se cuantificó como el porcentaje de células TUNEL-positivas en al menos 5 campos aleatorios de alto aumento (aumento de 40×) por sección tumoral utilizando el software ImageJ.

Ensayo de NETosis

La NETosis se cuantificó utilizando un enfoque de imagen de fluorescencia en tiempo real, combinado con la segmentación y clasificación automatizada de células. Los neutrófilos derivados de la médula ósea se sembraron a una concentración de 2 × 10 células por pocillo en placas de cámara de vidrio de 8 pocillos (Cellvis, #C8-1.5H-N), pretratadas con 25 μg/ml de fibrinógeno y 10 μg/ml de fibronectina en DPBS. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5% de CO2 con ácido oleico (100 μM), ácido araquidónico (100 nM) o BSA (control vehículo) en RPMI-1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de FBS inactivada por calor, 20 mM de HEPES, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 ng/ml de GM-CSF.

Al día siguiente, el medio se reemplazó con RPMI que contenía un 2% de BSA. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 (1 μg/ml), CellMask Orange (1 μM) y SYTOX Green (500 nM), y se estimularon con 100 nM de 12-O-tetradecanilforbol-13-acetato (PMA; Sigma-Aldrich) para inducir la NETosis. Se adquirieron imágenes cada minuto durante 2 horas utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Colibri a un aumento de 20×. El análisis de la imagen se realizó utilizando CellProfiler, donde se segmentaron los núcleos y los límites celulares, y las células NETóticas se identificaron como aquellas con citoplasma SYTOX Green-positivo. La NETosis se cuantificó como el porcentaje de células NETóticas sobre el recuento total de células a los 90 minutos después del tratamiento con PMA.

Ensayo de proliferación y activación de células T

Las células T se tiñeron antes de la siembra con 2 μM de CFSE (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) durante 15 minutos a 37 °C, según las instrucciones del fabricante. El exceso de tinte se eliminó lavando tres veces con tampón de tinción CFSE (PBS+1% de FBS). Las células T se cocultivaron con neutrófilos previamente tratados o no tratados con diferentes reactivos. Tres días después, las células se tiñeron con anticuerpos contra CD4, CD8, CD44 o CD25 (Invitrogen) para la clasificación de subconjuntos específicos y con 7AAD (BD Biosciences) para la exclusión de células muertas. Se tomaron suspensiones de células individuales para el análisis de citometría de flujo. Dado que el CFSE se diluye aproximadamente a la mitad con cada división celular, se seleccionaron las células vivas individuales (negativas para la tinción de 7AAD) y se calculó el porcentaje de proliferación mediante la selección de la población de CFSE tenue (izquierda). La intensidad media de fluorescencia de CD25 y el porcentaje de células CD44-positivas se utilizaron para evaluar el nivel de activación de las células T CD4+ y CD8+.

Ensayos de agotamiento de células T y de citocinas intracelulares

Las células T CD8+ se trataron con PMA, ionóforo y brefeldina A (Sigma) para la activación y GolgiStop (BD Pharmingen) para detener la liberación extracelular 6 horas antes del ensayo. Las células se tiñeron primero para los marcadores de superficie utilizando anticuerpos contra CD8, PD-1 y Tim-3 (eBioscience) y el marcador de exclusión de células vivas 7AAD (BD Biosciences), después de lo cual se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células se incubaron luego en tampón de fijación/perm (eBioscience #005123) durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización (eBioscience #008333) y luego se determinó la expresión de citocinas de las células T CD8+ mediante la tinción intracelular con anticuerpos contra IFN-γ, TNF-α y granzima-b (Invitrogen) preparados en tampón de permeabilización durante 45 minutos sobre hielo. Las muestras se lavaron tres veces con tampón de permeabilización y todas las muestras de flujo se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un citómetro de flujo Cytek Aurora, capturando un mínimo de 50 000 eventos por muestra.

Ensayo de citotoxicidad de células T CD8+ in vitro e in vivo

Las células MC38 o B16 que expresan ovalbúmina se suspendieron en medio RPMI 1640 completo (como se describe para el cultivo de células T). Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a 50 000 células por pocillo y se incubaron durante 24 horas para permitir su adherencia al sustrato. Las células T CD8+ se aislaron de los esplenocitos de ratones transgénicos OT-1 utilizando un kit de selección negativa CD8+ MojoSort (BioLegend). Las células T CD8+ se activaron con 5 μg/ml de péptido de ovalbúmina (OVA257-264, InvivoGen, San Diego, CA, EE. UU.) y se cultivaron durante 3 o 4 días en medio completo RPMI-T con o sin medio acondicionado pretratado con neutrófilos. Luego, se añadieron encima de las células MC38 Ova. Luego, se añadieron 50 ng/ml de tinte SYTOX Green (Invitrogen) y se realizó el análisis de imagen de toda la placa mediante imagen de células vivas utilizando un lector de imágenes multimodales Cytation 5 para cuantificar las células fluorescentes verdes. Alternativamente, las células se tiñeron con 7AAD para la tinción de muerte celular y se analizaron en un citómetro de flujo (Cytek Aurora Spectral Analyzer). El porcentaje de muerte celular se calculó utilizando células que daban positivo para la tinción de 7AAD. Para el ensayo in vivo, se aislaron células T CD8+ de 10 ratones OT-1 y se cultivaron durante 4 días en medio acondicionado de neutrófilos inducidos con OA en presencia de AB928, después de lo cual se contaron y se transfirieron adoptivamente 1 millón de células en ratones individuales que portaban MC38-OVA. Se monitorizó la progresión tumoral a lo largo del estudio y se registraron los pesos terminales de los tumores para cada grupo. Se evaluó la proliferación y la apoptosis en las células tumorales.

Aislamiento del líquido intersticial tumoral (LIT) y del suero

El líquido intersticial tumoral (LIT) de ratón se aisló de tumores MC38, CT26 o Yumm5.2 utilizando un protocolo modificado de un método de centrifugación descrito previamente (^[34],^[46]-^[49]). Los ratones portadores de tumores se sacrificaron por dislocación cervical y los tumores se disecaron rápidamente de los animales en un plazo de 1 minuto. Se recogió sangre del mismo animal mediante punción cardíaca y se centrifugó a 800 × g durante 10 minutos a 4 °C para separar el plasma. El plasma se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis. Los tumores que pesaban más de 500 mg se enjuagaron rápidamente en PBS 1X y se añadió PBS adicional sobre papel de filtro. Luego, los tumores se colocaron sobre un tamiz celular de 15 μm, PluriStrainer (PluriSelect, CA, EE. UU.), se fijaron en la parte superior de tubos cónicos de 50 mL y se centrifugaron a 150 × g a 4 °C durante 10 minutos. Los LIT se recogieron, se transfirieron a un tubo de 1,5 mL, se congelaron y se almacenaron a −80 °C hasta su posterior análisis. Se aisló LIT (30–100 μL) de 1 tumor grande que pesaba más de 500 mg.

El LIT humano se aisló de tejidos frescos de adenoma y adenocarcinoma en un plazo de 15 minutos tras la resección quirúrgica. Durante el transporte, los tejidos se mantuvieron en hielo para preservar su integridad. Los tumores que pesaban entre 40 y 75 mg se colocaron sobre tamices Pluri de 15 μm (PluriSelect, CA, EE. UU.) colocados en la parte superior de tubos cónicos de 50 mL y se centrifugaron a 1000 × g durante 10 minutos a 4 °C. El LIT resultante (3–5 μL por muestra) se recogió y se almacenó a −80 °C hasta su posterior análisis.

Metabolómica

Para las muestras de neutrófilos, se sembraron 3 millones de células en medio RPMI completo en una placa de 6 pocillos y se trataron con ácidos grasos o se dejaron sin tratar durante las etapas temprana o tardía de los neutrófilos tumorales durante 24 horas. Las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se recogieron en tubos separados y se colocaron inmediatamente sobre hielo seco. Se mezclaron 200 μL de sobrenadante de neutrófilos con 800 μL de metanol HPLC al 100% frío. El sedimento de neutrófilos se lavó una vez con PBS frío y luego se incubó en metanol al 80% frío sobre hielo seco durante 10 minutos antes de la homogeneización. Se normalizaron las concentraciones de las muestras realizando un ensayo de proteínas BCA en un réplica técnica y se normalizó el volumen en todas las muestras para lograr concentraciones uniformes. Los extractos de metabolitos del sobrenadante o de la fracción de sedimento se liofilizaron luego utilizando un concentrador SpeedVac a 4 °C y se resuspendieron en una mezcla de metanol/agua 50:50 para el análisis de LC MS. Los datos se recogieron tanto en modos de iones negativos como positivos. Para el modo negativo, se utilizaron parámetros publicados previamente (^[50],^[51]). Para el modo positivo, se utilizó un sistema LC/MS Triple Quad 6470 de Agilent Technologies que consistía en una bomba flexible Infinity II LC (bomba cuaternaria), un muestreador múltiple Infinity II, un termostato múltiple Infinity II con válvula de 6 puertos y un espectrómetro de masas de cuádruple triple 6470. Se utilizó el software Agilent Mass Hunter Workstation LC/MS Data Acquisition for 6400 Series Triple Quadrupole MS con la versión B.08.02 para la calibración, la optimización de compuestos y la adquisición de datos de la muestra. Se utilizó una columna Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 mm VanGuard Pre-Column de 2,1 × 5 mm y una columna Waters UPLC BEH TSS C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 mm) con una fase móvil A que consistía en ácido fórmico al 0,1% en agua y una fase móvil (B) que consistía en ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente del disolvente fue el siguiente: la fase móvil (B) se mantuvo al 0,1% durante 3 minutos, se aumentó al 6% a los 12 minutos, al 15% a los 15 minutos, al 99% a los 17 minutos y se mantuvo durante 2 minutos antes de volver a las condiciones iniciales y se mantuvo durante 5 minutos. La columna se mantuvo a 40 °C y se inyectaron 3 ml de muestra en el LCMS a un caudal de 0,2 ml/min. La calibración del instrumento QqQ MS 6470 se logró mediante una mezcla de calibración de bajo nivel Agilent ESI. Los datos QQ para ambos modos de iones se preprocesaron con el software de análisis cuantitativo Agilent MassHunter Workstation (B0700). Los picos de cromatografía de metabolitos se inspeccionaron manualmente. La abundancia de cada metabolito se normalizó mediante la mediana en toda la población de muestras. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con un umbral de significación de 0,05. Para las muestras de LIT y suero, se mezclaron 100 μL de LIT de 3 tumores diferentes de ratones separados y 100 μL de suero con 400 μL de metanol al 100%. Las muestras se secaron y se resuspendieron en 1:1 MeOH/H2O y se procesaron posteriormente como se describe para los neutrófilos.

Lipidómica

Las muestras se analizaron mediante un sistema UHPLC Vanquish acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid™ utilizando una fuente de iones H-ESI™ (todos de Thermo Fisher Scientific) con una columna CSH C18 de Waters (Milford, MA) (1.0 × 150 mm, tamaño de partícula de 1.7 μm) en modos de detección de iones positivos y negativos. El disolvente A fue ACN: H2O (60:40; v/v) que contenía 10 mM de formiato de amonio y 0.1% de ácido fórmico, y el disolvente B fue IPA: ACN (95:5; v/v) que contenía 10 mM de formiato de amonio y 0.1% de ácido fórmico. El caudal de la fase móvil fue de 0.11 mL/min, y la temperatura de la columna fue de 65°C. El gradiente del disolvente B fue de 0 min 15% (B), 1–3 min 30% (B), 3–3.5 min 48% (B), 3.5–12 min 82% (B), 12–12.2 min 99% (B), 12.2–17.00 min 99% (B), 17.00–17.50 min 15% (B) y 17.00–20.00 min 15% (B). Los voltajes de pulverización de la fuente de iones son de 4000 V y 3000 V en modo positivo y negativo, respectivamente. La espectrometría de masas se realizó con un rango de escaneo de 200 a 1500 m/z para el escaneo completo y se utilizó en el modo AcquireX con una energía de colisión escalonada del 35% y una dispersión del 15% para el escaneo de fragmentación MS/MS.

Secuenciación de ARN de célula única

Preparación y procesamiento de la biblioteca

Aproximadamente 5-6 millones de neutrófilos derivados de la médula ósea se aislaron de 5 ratones portadores de tumores MC38 en etapa tardía. Las células de cada ratón se agruparon y se procesaron para la secuenciación de ARN de célula única utilizando un kit de expresión génica de célula única Chromium Flex, según las instrucciones estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma NovaSeq6000 (Illumina). Se utilizó Cell Ranger v.3.1.0 (10x Genomics) para alinear las lecturas de secuenciación al genoma de referencia del ratón GRCm38 y generar tablas de conteo de identificadores moleculares únicos (UMI) para cada gen por célula.

Control de calidad y procesamiento de los datos de secuenciación de ARN de célula única

Se utilizó el paquete R Seurat v.4.1.1 para calcular las métricas de control de calidad. Las células se eliminaron del análisis si a) tenían menos de 500 o más de 3000 genes únicos, b) tenían más de 20 000 moléculas de ARN, o c) más del 8% de las lecturas se asignaron a genes mitocondriales. Los datos se normalizaron para la profundidad de secuenciación, se escalaron a 10 000 UMI por célula y se transformaron logarítmicamente utilizando la función de normalización de datos de Seurat. La función Seurat FindVariableFeatures se utilizó para definir 2000 genes altamente variables que se utilizaron como entrada para el análisis de componentes principales. Los datos normalizados se escalaron y se generaron gráficos de codo para determinar cuántos componentes principales incluir en el análisis. Esto correspondió aproximadamente a los primeros 15 componentes principales. Se calcularon las incrustaciones de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) utilizando estos componentes principales como entrada, y las células se agruparon utilizando la función FindClusters. Además, se filtraron las células de los grupos con menos de 50 células y se repitieron los pasos de procesamiento anteriores para identificar nuestros grupos de interés.

Identificación de grupos de secuenciación de ARN de célula única y análisis de expresión

Los grupos se anotaron en función de las comparaciones con las poblaciones de neutrófilos identificadas en un estudio previo de neutrófilos murinos (^[52]). Brevemente, las firmas génicas de las poblaciones identificadas en Xie et al. se puntuaron en cada uno de los 5 grupos detectados en nuestro estudio utilizando la función AddModuleScore de Seurat. Los grupos maduros correspondieron a aquellos que obtuvieron una puntuación alta para G4-G5C, mientras que las poblaciones inmaduras obtuvieron una puntuación alta para G1. Los marcadores para cada población etiquetada se identificaron utilizando la función quickMarkers del paquete R SoupX y se filtraron para aquellos que se expresaron en al menos el 65% de las células (^[52]). Estos marcadores y otros marcadores neutrofílicos específicos se visualizaron utilizando las funciones DoHeatmap y FeaturePlot de Seurat.

Preparación y procesamiento de la biblioteca

Aproximadamente 5-6 millones de neutrófilos derivados de la médula ósea se aislaron de 5 ratones portadores de tumores MC38 en etapa tardía. Las células de cada ratón se agruparon y se procesaron para la secuenciación de ARN de célula única utilizando un kit de expresión génica de célula única Chromium Flex, según las instrucciones estándar. Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma NovaSeq6000 (Illumina). Se utilizó Cell Ranger v.3.1.0 (10x Genomics) para alinear las lecturas de secuenciación al genoma de referencia del ratón GRCm38 y generar tablas de conteo de identificadores moleculares únicos (UMI) para cada gen por célula.

Control de calidad y procesamiento de los datos de secuenciación de ARN de célula única

Se utilizó el paquete R Seurat v.4.1.1 para calcular las métricas de control de calidad. Las células se eliminaron del análisis si a) tenían menos de 500 o más de 3000 genes únicos, b) tenían más de 20 000 moléculas de ARN, o c) más del 8% de las lecturas se asignaron a genes mitocondriales. Los datos se normalizaron para la profundidad de secuenciación, se escalaron a 10 000 UMI por célula y se transformaron logarítmicamente utilizando la función de normalización de datos de Seurat. La función Seurat FindVariableFeatures se utilizó para definir 2000 genes altamente variables que se utilizaron como entrada para el análisis de componentes principales. Los datos normalizados se escalaron y se generaron gráficos de codo para determinar cuántos componentes principales incluir en el análisis. Esto correspondió aproximadamente a los primeros 15 componentes principales. Se calcularon las incrustaciones de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) utilizando estos componentes principales como entrada, y las células se agruparon utilizando la función FindClusters. Además, se filtraron las células de los grupos con menos de 50 células y se repitieron los pasos de procesamiento anteriores para identificar nuestros grupos de interés.

Identificación de grupos de secuenciación de ARN de célula única y análisis de expresión

Los grupos se anotaron en función de las comparaciones con las poblaciones de neutrófilos identificadas en un estudio previo de neutrófilos murinos (^[52]). Brevemente, las firmas génicas de las poblaciones identificadas en Xie et al. se puntuaron en cada uno de los 5 grupos detectados en nuestro estudio utilizando la función AddModuleScore de Seurat. Los grupos maduros correspondieron a aquellos que obtuvieron una puntuación alta para G4-G5C, mientras que las poblaciones inmaduras obtuvieron una puntuación alta para G1. Los marcadores para cada población etiquetada se identificaron utilizando la función quickMarkers del paquete R SoupX y se filtraron para aquellos que se expresaron en al menos el 65% de las células (^[52]). Estos marcadores y otros marcadores neutrofílicos específicos se visualizaron utilizando las funciones DoHeatmap y FeaturePlot de Seurat.

Ensayo de cuantificación de adenosina

Los neutrófilos se trataron con ácidos grasos según lo indicado en las leyendas de las figuras durante 24 horas, después de lo cual las células se centrifugaron para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se analizó inmediatamente para la cuantificación dirigida de adenosina utilizando un kit de ensayo de adenosina (CELL BIOLABS, INC.) según las instrucciones del fabricante.

PCR cuantitativa en tiempo real

Para la expresión génica de neutrófilos, se extrajo un miligramo de ARN total de los neutrófilos utilizando un kit Quick RNA MicroPrep (Zymo Research) según las instrucciones del fabricante y se transcribió a ADNc utilizando el sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Se realizaron tres réplicas técnicas de PCR en tiempo real para cada muestra. Los cebadores de ADNc específicos del gen y la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems) se combinaron y luego se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). La expresión relativa de los genes se calculó utilizando el método ddCt con Actb o GAPDH como gen de referencia de la expresión de ARNm.

Para la expresión génica tumoral, las células cancerosas MC38 se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones C57BL/6. Los ratones se sacrificaron a los 14 días posteriores a la inyección (punto de tiempo temprano) o a los 28 días posteriores a la inyección (punto de tiempo tardío). Los tumores se disecaron rápidamente. Se transcribió un microgramo de ARN total a ADNc utilizando el sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen). Se realizaron tres réplicas técnicas de PCR en tiempo real para cada muestra. Los cebadores de ADNc específicos del gen y la mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems) se combinaron y luego se ejecutaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Applied Biosystems). La expresión relativa de los genes se calculó utilizando el método ddCt con Actb como gen de referencia de la expresión de ARNm.

ELISA

Los niveles de citocinas se cuantificaron en sobrenadantes de células T después del cocultivo con neutrófilos de ratones portadores de tumores o ratones inducidos con ácidos grasos. Se realizaron ensayos de TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-4, IL-10 y TGF-β de ratón utilizando kits ELISA de anticuerpos emparejados (R&D Systems, Minneapolis, MN) según el protocolo del fabricante.

Presentación de datos y análisis estadístico

Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. La significancia de las diferencias entre dos grupos se probó utilizando una prueba t no pareada de dos colas. Las diferencias significativas entre múltiples grupos se probaron utilizando ANOVA de 1 vía o 2 vías seguida de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de P menor que 0.05 indicaba significancia estadística. La significancia estadística de las diferencias se describe en las leyendas de las figuras como *P < 0.05, P < 0.01, *P < 0.001 y *** P