El PDGF-BB y el GDF-15 derivados de macrófagos promueven la resistencia a los fármacos en el cáncer colorrectal con mutación de KRAS

El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte por cáncer a nivel mundial [^[1]]. Aproximadamente el 45% de los pacientes presentan una mutación activadora de KRAS (CCR-K), comúnmente en el codón 12 o 13, que resulta en oncogénesis [^[2],^[3]]. Las opciones de terapia dirigida siguen siendo limitadas para la mayoría de los pacientes con CCR-K. Regorafenib es un inhibidor multiquinasa aprobado para el CCR metastásico previamente tratado. Actualmente, existen combinaciones dirigidas directamente a KRAS para tumores KRASG12C [^[4],^[5]]; esto representa solo una minoría de los pacientes con CCR-K y ha demostrado una durabilidad limitada y efectos secundarios significativos [^[6],^[7]].

Los intentos de dirigir KRAS y su vía de señalización descendente en el CCR hasta la fecha han producido un éxito clínico limitado, incluso con fármacos que han demostrado ser eficaces en otros tipos de tumores impulsados por KRAS [^[8]–^[10]]. Por ejemplo, el potente inhibidor de MEK, trametinib, no logró proporcionar beneficio clínico como agente único a pesar de los prometedores datos preclínicos [^[11]]. Esto plantea dos preguntas que el presente trabajo aborda: ¿qué factores promueven la resistencia a la terapia dirigida en el CCR mutado en KRAS y podemos superar esta resistencia mediante un enfoque racional de multitargeting [^[12]–^[17]]? Una consideración importante en la resistencia a los fármacos es el microambiente tumoral inmunitario (MTI): dirigir el MTI proporciona una oportunidad para manipular las señales locales que mejoran la progresión tumoral y mejoran la eficacia del tratamiento [^[18]–^[25]].

Los macrófagos son un tipo de célula especialmente abundante en el MTI del cáncer colorrectal [^[26]–^[29]]. Estas células mieloides desempeñan una amplia gama de funciones importantes: abarcando las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, la presentación de antígenos, la fagocitosis y funciones homeostáticas como el mantenimiento y la reparación de los tejidos [^[30],^[31]]. En el contexto del cáncer, los macrófagos asociados al tumor (MAT) se mueven dinámicamente entre funciones inflamatorias (tipo M1) e inmunosupresoras (tipo M2), y esta plasticidad puede afectar la respuesta a los fármacos [^[32]–^[39]]. Parte de esta resistencia puede reflejar la plasticidad del secretoma de los macrófagos; los MAT activan y promueven las vías asociadas al cáncer, impulsando la proliferación, la extravasación, la angiogénesis, la evasión de la immunosurveglancia, junto con otros cambios metabólicos [^[40]–^[45]].

En este trabajo, proporcionamos evidencia de que los macrófagos secretan factores, dos de los cuales son GDF-15 y PDGF-BB, que juntos impactan la eficacia de los fármacos en modelos preclínicos de CCR mutado en KRAS. GDF-15 es clínicamente relevante en el CCR: se ha demostrado que los altos niveles séricos se correlacionan con un mal pronóstico del paciente y la caquexia [^[46]–^[53]]. En el cerebro, GDF-15 señala a través de un complejo receptor que involucra a RET y GFRAL [^[54]]. Sin embargo, el papel y la identidad de los receptores de GDF-15 relevantes para el CCR son desconocidos. PDGF-BB impulsa la proliferación, la migración y la supervivencia del tumor al unirse a PDGFRαα, PDGFRββ y PDGFRαβ, activando las vías JAK/STAT, AKT, PI3K y RAS [^[55]–^[58]]. Las cascadas de señalización intracelular desencadenadas por estas proteínas transmembrana están vinculadas a través de las quinasas de la familia SRC (SFK), que a su vez pueden promover tanto la progresión tumoral como la resistencia a los fármacos a través de múltiples mecanismos [^[59]–^[62]].

Aquí identificamos un mecanismo impulsado por los macrófagos de resistencia a los fármacos, mediado por las citocinas GDF-15 y PDGF-BB. Juntos, estos factores impulsan la resistencia a trametinib a través de una red de quinasas coordinada. Utilizamos esta información para identificar una estrategia racional de combinación de fármacos: la inhibición de múltiples quinasas activadas, que contribuyen a esta red de resistencia emergente, reduce la resistencia a los fármacos mediada por los macrófagos y ralentiza la progresión tumoral.

Resultados

Los macrófagos impactan la respuesta a los fármacos en organoides AKP

Para explorar el impacto de las células inmunitarias en la respuesta tumoral a los fármacos, co-cultivamos (i) organoides de ratón Villin–CreERT2: Apcfl/fl
KrasG12D/+
Trp53fl/fl (AKP) con (ii) macrófagos murinos RAW 264.7 cultivados como una monocapa (2D). Los macrófagos, etiquetados con un rastreador de células vivas lisosomales de color rojo lejano (magenta), se integraron constantemente con los organoides AKP (GFP, verde). Los macrófagos típicamente migraron hacia el lumen del organoide, lo que sugiere una mayor auto-adhesión (Figura 1a).

A continuación, evaluamos la respuesta de AKP al inhibidor de la vía RAS, trametinib (Mekinist), un potente inhibidor de MEK que fracasó en los ensayos clínicos para el CCR mutado en KRAS [^[63]]. Los organoides AKP fueron sensibles al tratamiento con trametinib en un medio de cultivo de organoides (MCO) sin tratar (Figura 1b). Sin embargo, el co-cultivo de AKP con macrófagos RAW 264.7, diseñado para imitar un aspecto del MTI de un paciente, resultó en una fuerte reducción en la respuesta a trametinib (Figura 1b). Es decir, los macrófagos RAW 264.7 proporcionan una señal que promueve la resistencia a al menos un potente fármaco dirigido.

Para evaluar si esta resistencia emergente a los fármacos se debía a un factor secretado, probamos el medio acondicionado por macrófagos (mCM). El mCM solo fue suficiente para promover la resistencia a trametinib: la viabilidad celular aumentó un 260% en comparación con el MCO, aunque en menor medida que el aumento del 325% en la viabilidad observado en los co-cultivos AKP+RAW (Figura 1c). Para ampliar nuestro trabajo, evaluamos la respuesta a KRAS, el inhibidor RMC-6236, que se encuentra actualmente en ensayos clínicos de cáncer (NCT05379985). De manera similar a trametinib, las células AKP demostraron ser resistentes a RMC-6236 cuando se cultivaron en mCM en comparación con el MCO sin tratar (Figura 1d). Estos datos sugieren que los macrófagos locales proporcionan factores secretados que promueven la resistencia de AKP a al menos dos potentes fármacos dirigidos a la vía RAS. Los datos de fármacos adicionales probados se proporcionan a continuación.

Cabe destacar que nuestros estudios identificaron dos inhibidores de la vía RAS que redujeron la supervivencia de AKP incluso en presencia de mCM. Regorafenib, el único inhibidor multiquinasa aprobado por la FDA para el CCR mutado en KRAS, mostró (limitada) capacidad para matar las células AKP a 10 μM; esta actividad no se vio afectada por el mCM (Figura 1d). El tratamiento de las células AKP con dabrafenib, utilizado en terapias de combinación para tumores colorrectales mutados en BRAF [^[64]–^[66]], condujo a una mayor reducción en la viabilidad; sorprendentemente, dabrafenib mostró aún mayor potencia en mCM en comparación con el MCO sin tratar (Figura 1d).

Para explorar estos cambios asociados al mCM en la sensibilidad de AKP a los fármacos en respuesta a una variedad de inhibidores de la vía RAS, examinamos datos de inhibición in vitro publicados previamente para trametinib, regorafenib y dabrafenib para evaluar los efectos o patrones a nivel del kinoma. Regorafenib y dabrafenib mostraron amplios perfiles de inhibición de quinasas que contrastan con el perfil estrecho de trametinib (Figura 1e). A partir de esto, hipotetizamos que la resistencia a los fármacos inducida por mCM se inhibe mediante regorafenib y dabrafenib a través de mecanismos de multitargeting, una hipótesis comprobable.

Los macrófagos secretan PDGF-BB y GDF-15 que juntos promueven la resistencia a trametinib

Para identificar los factores secretores asociados a la resistencia derivados de los macrófagos presentes en el mCM, utilizamos una matriz de anticuerpos amplia para capturar la presencia o ausencia de citocinas/quimiocinas y ligandos de ratón. Esto identificó varias citocinas secretadas, incluyendo PDGF-BB y GDF-15, que activan cascadas de señalización intracelular que involucran quinasas inhibidas por regorafenib y dabrafenib (Figura 2a).

Para evaluar los papeles de los ligandos individuales, "añadimos" PDGF-BB o GDF-15 recombinantes al MCO sin tratar. La adición de GDF-15 recombinante solo disminuyó la viabilidad de AKP en un 20% en comparación con el MCO sin tratar, lo que indica una mayor sensibilidad a trametinib. En contraste, el PDGF-BB recombinante disminuyó ligeramente la respuesta de AKP a trametinib, aumentando la viabilidad media en un 121%, aunque un 26% menos que el aumento de viabilidad observado en los co-cultivos AKP+RAW (Figura 2b).

La adición de PDGF-BB y GDF-15 al MCO sin tratar recapitula los niveles de resistencia a trametinib impulsada por mCM. Mostramos que no hay una diferencia significativa entre la viabilidad de mCM y la viabilidad de MCO "añadido" + PDGF-BB + GDF-15: ambos aumentaron la resistencia a los fármacos en un 147% (Figura 2c). Concluimos que la resistencia a trametinib impulsada por mCM es multifactorial y probablemente mediada, al menos, por PDGF-BB más GDF-15.

Los macrófagos actúan a través de RET y PDGFR para promover la resistencia a trametinib

A continuación, utilizamos inhibidores dirigidos para examinar los papeles de los posibles receptores de GDF-15 y PDGF-BB comparando sus efectos sobre la actividad de trametinib en las células AKP cultivadas en mCM versus MCO.

El complejo receptor de GDF-15 en el colon no se ha caracterizado; en el cerebro, RET sirve como su receptor primario [^[54]]. La adición del inhibidor de RET GSK3179106 [^[68]] en el medio "añadido" con PDGF-BB + GDF-15 aumentó significativamente la sensibilidad de AKP a trametinib, según lo evaluado por la viabilidad celular (Figura 3a). Este resultado es consistente con la señalización de GDF-15 a través de RET para impactar la respuesta a los fármacos.

Después de esto, probamos la respuesta de AKP a la inhibición de RET en mCM utilizando GSK3179106 y el inhibidor multiquinasa de RET, selpercatinib [^[69]]. Ninguno de los dos eliminó la resistencia a los fármacos impulsada por mCM, solo o en combinación con trametinib (Figura 3b). Además, probamos la respuesta de AKP a mCM al inhibidor de PDGFR dirigido, CP673451 [^[70]]. La inhibición de la actividad de PDGFR con CP673451 no redujo la respuesta tratada con mCM para que coincidiera con la respuesta tratada con MCO, solo o en combinación con trametinib (Figura 3c). Concluimos que la inhibición de PDGFR o RET solo no es suficiente para eliminar el fenotipo completo de resistencia impulsado por mCM.

Para evaluar la capacidad de reducir la resistencia a los fármacos inducida por los macrófagos específicamente a través de la inhibición de PDGFR y RET, probamos ambos compuestos (CP673451 y GSK3179106, respectivamente) juntos con trametinib en una combinación triple. Vimos que la respuesta de AKP a esta combinación triple, inhibiendo PDGFR, RET y MEK, no varió entre el medio MCO "añadido" y el MCO (Figura 3d). Sin embargo, mCM aún pudo impulsar la resistencia a esta combinación, lo que indica que nuestra red de resistencia impulsada por mCM incluye nodos adicionales y es mecánicamente divergente de la resistencia a trametinib impulsada por el medio "añadido". (Figura 3e).

En conjunto, estos datos sugieren que los PDGF-BB y GDF-15 derivados de los macrófagos probablemente contribuyen a la resistencia a los fármacos a través de la señalización asociada a PDGFR y RET en AKP. Es probable que se requieran factores secretados por los macrófagos adicionales para explicar el fenotipo de resistencia completo observado en mCM.

Un papel de los miembros de la familia SRC en la mediación de la resistencia a los fármacos impulsada por mCM

Para identificar las vías descendentes que median la resistencia impulsada por mCM, utilizamos PAMGene para comparar las actividades de las vías de las células AKP tratadas con MCO vs. mCM. La tecnología PAMGene utiliza el perfilado de quinasas para informar sobre las actividades de una amplia gama de vías intracelulares.

Bajo el tratamiento con trametinib, mCM aumentó la actividad de la quinasa en varias redes de señalización (Figura 4a). Las quinasas vinculadas al control del ciclo celular y la señalización JAK/STAT se elevaron, y las quinasas tirosina mostraron algunos de los cambios más fuertes. En particular, la actividad asociada a PDGFR y la familia de quinasas Src se incrementó significativamente, mientras que la actividad asociada a RET se incrementó de manera más modesta (Figura 4a).

Anteriormente, encontramos que mCM no alteró funcionalmente la respuesta de las células AKP a regorafenib. Por lo tanto, utilizamos el perfilado PAMGene para comparar la actividad de la quinasa en las células AKP tratadas con regorafenib cultivadas en mCM versus MCO. En contraste con trametinib, el tratamiento con regorafenib se asoció con una reducción de la actividad de varias quinasas tirosina en mCM, incluidas las asociadas con la señalización de PDGFR, RET y SFK (Figura 4b).

Basándonos en estos hallazgos, preguntamos a continuación si la resistencia a los fármacos impulsada por mCM podría dirigirse a nivel de la red. Comparamos los perfiles de inhibición de fármacos publicados con las quinasas activadas por mCM de la Figura 4a, las quinasas inhibidas por dabrafenib o regorafenib y las quinasas que no están completamente cubiertas por selpercatinib (Figura 4c) [^[71]–^[78]]. Esto nos permitió seleccionar compuestos para combinar con trametinib para dirigir la red activada de manera más amplia.

Basándose en la mayor actividad de las quinasas del ciclo celular en las células AKP tratadas con mCM bajo trametinib, evaluamos si estas quinasas contribuyen al fenotipo de resistencia a los fármacos. El cotratamiento con trametinib y el inhibidor de CDK4/6 palbociclib no redujo la resistencia a los fármacos asociada a mCM: la viabilidad en mCM fue del 21% en comparación con el 4% en OCM (Figura 4d) [^[79],^[80]]. Esto sugiere que la resistencia observada en mCM no se explica simplemente por un aumento de la proliferación.

mCM también aumentó la actividad de los nodos de señalización aguas abajo de las quinasas receptoras de tirosina, incluyendo JAK/STAT y NF-κB. Para probar si estas vías contribuyen a la resistencia a trametinib, combinamos trametinib con el inhibidor de JAK tofacitinib o el inhibidor de NF-κB JSH-23 [^[81],^[82]]. En presencia de cualquiera de estas combinaciones, mCM continuó promoviendo la resistencia a trametinib en relación con OCM (Figura 4e), lo que indica que la inhibición de cualquiera de estas vías por sí sola no fue suficiente para revertir el fenotipo impulsado por mCM.

La actividad de SFK también aumentó en las células AKP tratadas con mCM bajo trametinib. Dado que las SFK son mediadores aguas abajo clave tanto de la señalización de PDGFR como de RET, probamos saracatinib (AZD0530), un potente inhibidor de SRC y SFK relacionadas, en combinación con trametinib [^[83]]. Bajo esta combinación, la viabilidad disminuyó al 4% en OCM y al 10% en mCM (Figura 4f); la diferencia entre las dos condiciones ya no fue significativa. Estos datos fueron consistentes con la hipótesis de que las SFK son un componente aguas abajo importante de la red de resistencia impulsada por mCM.

Masitinib combinado con la inhibición de MEK o RAS suprimió la resistencia mediada por macrófagos

Nuestros datos indican que los macrófagos secretan PDGF-BB y GDF-15 y activan cascadas de señalización intracelular, a través de la activación canónica del receptor, que promueven la resistencia a las terapias dirigidas, como trametinib. Por lo tanto, utilizamos datos de unión de quinasas in vitro para identificar un único fármaco multi-dirigido que actúe sobre múltiples puntos a lo largo de esta vía. Masitinib (AB1010) es un fármaco clínicamente relevante que inhibe RET, PDGFRA, las quinasas del ciclo celular y múltiples SFK (Figura 5a–b) [^[84],^[85]].

En los organoides AKP, masitinib tuvo un efecto mínimo sobre la viabilidad celular en OCM, mCM y medios OCM "enriquecidos" a 10 μM (Figura 5c). Luego, lo utilizamos en combinación con trametinib para probar si masitinib podría suprimir la resistencia impulsada por mCM o OCM "enriquecido". Masitinib redujo significativamente la capacidad tanto de mCM como de OCM "enriquecido" con PDGF-BB+GDF-15 para impulsar la resistencia a trametinib (Figura 5d).

Trametinib es un potente inhibidor de MEK en la vía de señalización de KRAS. El desarrollo continuo de inhibidores de RAS ofrece la oportunidad de explorar si masitinib es beneficioso, de manera conservada, para mediar la resistencia impulsada por mCM. Como se mostró anteriormente, mCM disminuye la sensibilidad a RMC-6236 en un 20%. Esto se reflejó en OCM "enriquecido" con PDGF-BB+GDF-15 (Figura 5e) [^[86]]. Es importante destacar que la combinación de masitinib con RMC-6236 abolió la resistencia impulsada por OCM "enriquecido" con PDGF-BB+GDF-15 y mCM, lo que se alinea con nuestros hallazgos utilizando trametinib (Figura 5e). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que mCM promueve la resistencia tanto a la inhibición de MEK como de RAS a través de la señalización acumulativa asociada a PDGFR, RET y SFK. Este fenotipo de resistencia se puede manipular mediante el cotratamiento con el inhibidor multi-quinasa masitinib.

Los macrófagos impactan en la respuesta a los fármacos en los organoides AKP

Para explorar el impacto de las células inmunitarias en la respuesta de los tumores a los fármacos, co-cultivamos (i) organoides de ratón Villin–CreERT2: Apcfl/fl
KrasG12D/+
Trp53fl/fl (AKP) con (ii) macrófagos murinos RAW 264.7 cultivados como una monocapa (2D). Los macrófagos, etiquetados con un rastreador de células vivas lisosomales de color rojo lejano (magenta), se integraron constantemente con los organoides AKP (GFP, verde). Los macrófagos típicamente migraron hacia el lumen del organoide, lo que sugiere una mayor auto-adhesión (Figura 1a).

A continuación, evaluamos la respuesta de AKP al inhibidor de la vía RAS dirigido, trametinib (Mekinist), un potente inhibidor de MEK que fracasó en los ensayos clínicos para el CRC mutante de KRAS [^[63]]. Los organoides AKP fueron sensibles al tratamiento con trametinib en medios de cultivo de organoides nativos (OCM; Figura 1b). Sin embargo, el co-cultivo de AKP con macrófagos RAW 264.7, diseñado para imitar un aspecto del entorno tumoral in vivo (ITME) de un paciente, resultó en una fuerte reducción de la respuesta a trametinib (Figura 1b). Es decir, los macrófagos RAW 264.7 proporcionan una señal que promueve la resistencia a al menos una terapia dirigida potente.

Para evaluar si esta resistencia emergente a los fármacos se debió a un factor secretado, probamos medios acondicionados por macrófagos (mCM). mCM por sí solo fue suficiente para promover la resistencia a trametinib: la viabilidad celular aumentó un 260% en comparación con OCM, aunque en menor medida que el aumento del 325% en la viabilidad observado en los co-cultivos AKP+RAW (Figura 1c). Para ampliar nuestro trabajo, evaluamos el inhibidor de KRAS RMC-6236, que se encuentra actualmente en ensayos clínicos contra el cáncer (NCT05379985). De manera similar a trametinib, las células AKP demostraron ser resistentes a RMC-6236 cuando se cultivaron en mCM en comparación con OCM nativo (Figura 1d). Estos datos sugieren que los macrófagos locales proporcionan factores secretados que promueven la resistencia de AKP a al menos dos fármacos dirigidos potentes de la vía RAS. Los datos de fármacos adicionales probados se proporcionan a continuación.

Cabe destacar que nuestros estudios identificaron dos inhibidores de la vía RAS que redujeron la supervivencia de AKP incluso en presencia de mCM. Regorafenib, el único inhibidor multi-quinasa aprobado por la FDA para el CRC mutante de KRAS, mostró (limitada) capacidad para matar las células AKP a 10 μM; esta actividad no se vio afectada por mCM (Figura 1d). El tratamiento de las células AKP con dabrafenib, que se utiliza en terapias de combinación para tumores colorrectales mutantes de BRAF [^[64]–^[66]], condujo a una mayor reducción de la viabilidad; sorprendentemente, dabrafenib mostró aún mayor potencia en mCM en comparación con OCM nativo (Figura 1d).

Para explorar estos cambios asociados a mCM en la sensibilidad de AKP a los fármacos en respuesta a una variedad de inhibidores de la vía RAS, examinamos datos de inhibición in vitro publicados previamente para trametinib, regorafenib y dabrafenib para evaluar los efectos o patrones a nivel de kinoma. Regorafenib y dabrafenib mostraron perfiles de inhibición de quinasas amplios que contrastan con el perfil estrecho de trametinib (Figura 1e). A partir de esto, hipotetizamos que la resistencia a los fármacos inducida por mCM se inhibió mediante regorafenib y dabrafenib a través de mecanismos multi-dirigidos, una hipótesis comprobable.

Los macrófagos secretan PDGF-BB y GDF-15 que juntos promueven la resistencia a trametinib

Para identificar los factores secretores asociados a la resistencia derivados de los macrófagos presentes en mCM, utilizamos una amplia matriz de anticuerpos para capturar la presencia o ausencia de citocinas/quimiocinas y ligandos de ratón. Esto identificó varias citocinas secretadas, incluyendo PDGF-BB y GDF-15, que activan cascadas de señalización intracelular que involucran quinasas inhibidas por regorafenib y dabrafenib (Figura 2a).

Para evaluar los papeles de los ligandos individuales, "enriquecimos" medios OCM nativos con PDGF-BB o GDF-15 recombinantes. La adición de GDF-15 recombinante por sí sola disminuyó la viabilidad de AKP en un 20% en comparación con OCM nativo, lo que indica una mayor sensibilidad a trametinib. En contraste, PDGF-BB recombinante disminuyó ligeramente la respuesta de AKP a trametinib, aumentando la viabilidad media en un 121%, aunque un 26% menos que con mCM (Figura 2b).

La adición de PDGF-BB y GDF-15 a medios OCM nativos recapitula los niveles de resistencia a trametinib impulsada por mCM. Mostramos que no hay una diferencia significativa entre la viabilidad de mCM y la viabilidad de OCM "enriquecido" con PDGF-BB+GDF-15: ambos aumentaron la resistencia a los fármacos en un 147% (Figura 2c). Concluimos que la resistencia a trametinib impulsada por mCM es multifactorial y probablemente está mediada, al menos, por PDGF-BB más GDF-15.

Los macrófagos actúan a través de RET y PDGFR para promover la resistencia a trametinib

A continuación, utilizamos inhibidores dirigidos para examinar los papeles de los posibles receptores de GDF-15 y PDGF-BB comparando sus efectos sobre la actividad de trametinib en las células AKP cultivadas en mCM versus OCM.

El complejo receptor de GDF-15 en el colon no se ha caracterizado; en el cerebro, RET sirve como su receptor primario [^[54]]. La adición del inhibidor de RET GSK3179106 [^[68]] en medios "enriquecidos" con PDGF-BB+GDF-15 aumentó significativamente la sensibilidad de AKP a trametinib, según lo evaluado por la viabilidad celular (Figura 3a). Este resultado es consistente con la señalización de GDF-15 a través de RET para impactar en la respuesta a los fármacos.

Posteriormente, probamos la respuesta de AKP a la inhibición de RET en mCM utilizando GSK3179106 y el inhibidor multi-quinasa de RET selpercatinib [^[69]]. Ninguno de los dos abolió la resistencia a los fármacos impulsada por mCM, solo o en combinación con trametinib (Figura 3b). Además, probamos la respuesta de AKP con mCM al inhibidor de PDGFR dirigido CP673451 [^[70]]. La inhibición de la actividad de PDGFR con CP673451 no redujo la respuesta tratada con mCM para que coincidiera con la respuesta tratada con OCM, solo o en combinación con trametinib (Figura 3c). Concluimos que la inhibición de PDGFR o RET por sí sola no es suficiente para eliminar el fenotipo de resistencia completo mediado por mCM.

Para evaluar la capacidad de reducir la resistencia a los fármacos inducida por macrófagos específicamente a través de la inhibición de PDGFR y RET, probamos ambos compuestos (CP673451 y GSK3179106, respectivamente) juntos con trametinib en una combinación triple. Observamos que la respuesta de AKP a esta combinación triple, inhibiendo PDGFR, RET y MEK, no varió entre los medios OCM "enriquecidos" y OCM (Figura 3d). Sin embargo, mCM aún pudo impulsar la resistencia a esta combinación, lo que indica que nuestra red de resistencia impulsada por mCM incluye nodos adicionales y es mecanicamente diferente de la resistencia a trametinib impulsada por medios "enriquecidos" (Figura 3e).

En conjunto, estos datos sugieren que los PDGF-BB y GDF-15 derivados de los macrófagos probablemente contribuyen a la resistencia a los fármacos a través de la señalización asociada a PDGFR y RET en AKP. Es probable que se requieran factores secretados por macrófagos adicionales para explicar el fenotipo de resistencia completo observado en mCM.

Un papel para los miembros de la familia SRC en la mediación de la resistencia a los fármacos impulsada por mCM

Para identificar las vías aguas abajo que median la resistencia impulsada por mCM, utilizamos PAMGene para comparar las actividades de las vías de las células AKP tratadas con OCM versus mCM. La tecnología PAMGene utiliza el perfilado de quinasas para informar sobre las actividades de una amplia gama de vías intracelulares.

Bajo el tratamiento con trametinib, mCM aumentó la actividad de las quinasas en varias redes de señalización (Figura 4a). Las quinasas vinculadas al control del ciclo celular y la señalización JAK/STAT se elevaron, y las quinasas de tirosina mostraron algunos de los cambios más fuertes. En particular, la actividad asociada a PDGFR y a la familia de quinasas Src aumentó significativamente, mientras que la actividad asociada a RET aumentó de manera más modesta (Figura 4a).

Anteriormente, encontramos que mCM no alteró funcionalmente la respuesta de las células AKP a regorafenib. Por lo tanto, utilizamos el perfilado de PAMGene para comparar la actividad de las quinasas en las células AKP cultivadas en mCM versus OCM tratadas con regorafenib. En contraste con trametinib, el tratamiento con regorafenib se asoció con una actividad reducida de varias quinasas de tirosina en mCM, incluyendo aquellas asociadas con la señalización de PDGFR, RET y SFK (Figura 4b).

Basándonos en estos hallazgos, preguntamos a continuación si la resistencia a trametinib impulsada por mCM podría ser dirigida a nivel de red. Comparamos los perfiles de inhibición de fármacos publicados con las quinasas activadas por mCM de la Figura 4a, las quinasas inhibidas por dabrafenib o regorafenib, y las quinasas que no están completamente cubiertas por selpercatinib (Figura 4c) [^[71]–^[78]]. Esto nos permitió seleccionar compuestos para combinar con trametinib para atacar la red activada de manera más amplia.

Basándose en la mayor actividad de las quinasas del ciclo celular en las células AKP tratadas con mCM bajo trametinib, evaluamos si estas quinasas contribuyen al fenotipo de resistencia a los fármacos. El cotratamiento con trametinib y el inhibidor de CDK4/6 palbociclib no redujo la resistencia a los fármacos asociada a mCM: la viabilidad en mCM fue del 21% en comparación con el 4% en OCM (Figura 4d) [^[79],^[80]]. Esto sugiere que la resistencia observada en mCM no se explica simplemente por un aumento de la proliferación.

mCM también aumentó la actividad de los nodos de señalización aguas abajo de las quinasas receptoras de tirosina, incluyendo JAK/STAT y NF-κB. Para evaluar si estas vías contribuyen a la resistencia al trametinib, combinamos trametinib con el inhibidor de JAK, tofacitinib, o el inhibidor de NF-κB, JSH-23 [^[81],^[82]]. En presencia de cualquiera de estas combinaciones, mCM continuó promoviendo la resistencia al trametinib en relación con OCM (Figura 4e), lo que indica que la inhibición de cualquiera de estas vías por sí sola no fue suficiente para revertir el fenotipo inducido por mCM.

La actividad de SFK también aumentó en las células AKP tratadas con mCM bajo la exposición a trametinib. Dado que las SFK son mediadores aguas abajo clave tanto de la señalización de PDGFR como de RET, probamos saracatinib (AZD0530), un potente inhibidor de SRC y SFK relacionadas, en combinación con trametinib [^[83]]. Bajo esta combinación, la viabilidad disminuyó al 4% en OCM y al 10% en mCM (Figura 4f); la diferencia entre las dos condiciones ya no fue significativa. Estos datos fueron consistentes con la hipótesis de que las SFK son un componente aguas abajo importante de la red de resistencia inducida por mCM.

Masitinib combinado con la inhibición de MEK o RAS suprimió la resistencia mediada por macrófagos

Nuestros datos indican que los macrófagos secretan PDGF-BB y GDF-15 y activan cascadas de señalización intracelular, a través de la activación canónica del receptor, que promueven la resistencia a las terapias dirigidas, como el trametinib. Por lo tanto, utilizamos datos de unión de quinasas in vitro para identificar un fármaco multi-dirigido que actúe sobre múltiples puntos a lo largo de esta vía. Masitinib (AB1010) es un fármaco clínicamente relevante que inhibe RET, PDGFRA, quinasas del ciclo celular y múltiples SFK (Figura 5a–b) [^[84],^[85]].

En los organoides AKP, masitinib tuvo un efecto mínimo sobre la viabilidad celular en OCM, mCM y medios OCM "enriquecidos" a 10 μM (Figura 5c). Luego, lo utilizamos en combinación con trametinib para evaluar si masitinib podría suprimir la resistencia inducida por mCM o medios OCM "enriquecidos". Masitinib redujo significativamente la capacidad tanto de mCM como de medios OCM "enriquecidos" con PDGF-BB+GDF-15 para inducir resistencia al trametinib (Figura 5d).

Trametinib es un potente inhibidor de MEK en la vía de señalización de KRAS. El desarrollo continuo de inhibidores de RAS ofrece la oportunidad de explorar si masitinib es beneficioso, de manera conservada, para mediar la resistencia inducida por mCM. Como se mostró anteriormente, mCM disminuye la sensibilidad a RMC-6236 en un 20%. Esto se reflejó en los medios OCM "enriquecidos" con PDGF-BB+GDF-15 (Figura 5e) [^[86]]. Es importante destacar que la combinación de masitinib con RMC-6236 abolió la resistencia inducida por los medios OCM "enriquecidos" con PDGF-BB+GDF-15 y mCM, lo que se alinea con nuestros hallazgos utilizando trametinib (Figura 5e). En conjunto, estos datos respaldan un modelo en el que mCM promueve la resistencia tanto a la inhibición de MEK como de RAS a través de la señalización acumulativa asociada con PDGFR, RET y SFK. Este fenotipo de resistencia se puede manipular mediante el cotratamiento con el inhibidor multi-quinasa masitinib.

Discusión

Las terapias dirigidas para el cáncer colorrectal con mutación de KRAS han mostrado un éxito limitado en la clínica; por razones que aún no se comprenden del todo. En este estudio, nos centramos en la resistencia a los fármacos, mediada por los macrófagos, que forman parte del microambiente tumoral inmunitario en el cáncer colorrectal.

Utilizando organoides AKP y medios acondicionados por macrófagos, encontramos que las señales derivadas de los macrófagos alteraron la eficacia de múltiples fármacos dirigidos, incluido el trametinib. Dos fármacos que no fueron inhibidos por estas señales fueron regorafenib y dabrafenib: la superposición en sus perfiles inhibitorios sugirió vías candidatas para mediar la resistencia. El perfilamiento proteómico de los medios acondicionados identificó PDGF-BB y GDF-15 como factores prominentes secretados por los macrófagos. La reconstitución de los medios de organoides nativos con ambas proteínas recombinantes reprodujo la resistencia al trametinib. Es interesante destacar que GDF-15 solo en los medios nativos aumentó la sensibilidad de AKP al trametinib. Estos resultados respaldan el modelo de que la resistencia es impulsada por combinaciones de ligandos, no por factores únicos, y que la resistencia a los fármacos es una propiedad emergente de la señalización de redes multifactoriales.

Los experimentos de "adición" de PDGF-BB/GDF-15 recombinantes nos permitieron evaluar un posible papel de RET en la actividad de GDF-15. Los medios enriquecidos resultaron ser más sensibles al inhibidor de RET restringido al intestino, GSK3179106, que OCM o mCM, lo que implica funcionalmente un papel de la actividad de RET. Cabe destacar que nuestros estudios muestran que existen factores adicionales fuera de PDGF-BB y GDF-15 en mCM que promueven la resistencia a los fármacos.

El perfilamiento del cinoma respaldó aún más el aumento de la señalización asociada con PDGFR en la resistencia a trametinib inducida por mCM. También observamos la activación de efectores aguas abajo compartidos, predominantemente las SFK. Esto respalda un modelo en el que (i) PDGF-BB activa la señalización de PDGFR, (ii) la señalización de RET media la actividad de GDF-15 y (iii) juntos impulsan la resistencia de manera dependiente de SFK (Figura 6). Este modelo combinatorio explica por qué la inhibición selectiva de PDGFR o RET por sí sola no superó la resistencia en mCM.

Estas observaciones respaldan la necesidad de un enfoque inhibitorio multi-nodo en lugar de un enfoque de un solo objetivo. El perfil inhibitorio de masitinib cubre RET, PDGFR y SFK, nodos clave en nuestro modelo de resistencia, entre otros objetivos. Aprovechamos esto con los inhibidores de la vía RAS, trametinib y RMC-6236, para suprimir la red de resistencia inducida por mCM.

En resumen, mostramos que los medios acondicionados por macrófagos activan las redes de resistencia en nuestro modelo preclínico de cáncer colorrectal con mutación de KRAS. Proporcionamos evidencia de que la combinación de PDGF-BB y GDF-15 contribuye a la resistencia a las terapias dirigidas. La resistencia se asocia con una mayor actividad relacionada con PDGFR, RET y SFK, donde la alineación de esta red con los perfiles inhibitorios de los inhibidores multi-quinasa ofrece la oportunidad de reducir el impacto de la resistencia. En términos más generales, estos hallazgos respaldan un enfoque basado en redes para la terapia combinada en la medicina de precisión.

Materiales y métodos

Cultivo de organoides de cáncer colorrectal murino

La línea de organoides de ratón, AKP, se generó a partir de la colonia BCVAPK ID:PCB41–1g que expresa KRAS oncogénico más la pérdida de APC y p53 (Villin–CreERT2: Apcfl/fl
KrasG12D/+
Trp53fl/fl) [^[87]], y se etiquetó con proteína fluorescente verde (GFP) como se describe a continuación. La derivación de organoides intestinales de ratón Vil-CreERT2; Apcfl/fl; KrasG12D/+; Trp53fl/fl se realizó de acuerdo con la Licencia del Departamento de Asuntos de Interior: PPL 60/4492, autorizada por el Organismo de Revisión Ética y de Bienestar Animal de la Universidad de Glasgow, y se llevó a cabo bajo la Ley del Reino Unido sobre Animales (Procedimientos Científicos).

Los organoides AKP se cultivaron utilizando Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL (356231) en placas de cultivo de múltiples pocillos Thermo Scientific 6 Nunc™ (140685). Los organoides se cultivaron en Advanced DMEM + L-Glutamine, Penicillin/streptomycin, HEPES (Advanced DMEM*) suplementado con 50 ng/mL de EGF, 100 ng/mL de Noggin y 1x N2/B27 (OCM).

Los organoides se pasaron cada 2 a 3 días para mantener estructuras saludables. Los organoides de reserva en gotas de Matrigel se interrumpieron en Advanced DMEM y se recogieron en tubos de falcon de 15 ml. La suspensión de organoides se centrifugó luego a 4 °C, 1500 rpm durante 8 minutos para separar el Matrigel del pellet de organoides. El medio y el Matrigel se aspiraron antes de una mayor interrupción mecánica y resuspensión en 6 ml de Advanced DMEM. Como se indicó anteriormente, se repitieron la centrifugación y la aspiración, dejando solo el pellet de organoides. Resuspendimos las células en 50% de Matrigel y las sembramos en cúpulas de 20 μL.

Desarrollo de organoides etiquetados

El vector lentiviral pLV-EKAREN4 (TA)-NLS-Puro (167830) se obtuvo de Addgene para etiquetar los organoides con proteínas fluorescentes verdes (GFP). Las células HEK293T se obtuvieron del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC). Para generar partículas lentivirales, las células HEK293T se transfectaron con 0,5 μg de vector lentiviral, 2 μg de psPAX2 y pCMV-VSV-G (vectores de empaquetamiento) a 37 °C, 5% CO2 durante 24 horas. El sobrenadante de la transfección se eliminó y se reemplazó con medio de cultivo de organoides. Los sobrenadantes lentivirales se recogieron y se limpiaron utilizando un filtro de jeringa de 0,45 μm. El sobrenadante se utilizó luego para infectar los organoides AKP en presencia de 10 μg/ml de polibreno. Los organoides GFP se seleccionaron utilizando 10 μg/ml de puromicina.

Cultivo de macrófagos murinos

Las células RAW 264.7 se obtuvieron del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC). Las células RAW 264.7 se cultivaron en DMEM 10% FBS y 1% Penicillin/streptomycin. Las células se pasaron cuando alcanzaron una confluencia del 70%.

Tratamiento con fármacos

Los organoides se pasaron como se indicó anteriormente y los pellets se resuspendieron luego en un pequeño volumen de Advanced DMEM (100–200 μl) para el recuento. Se realizaron recuentos celulares utilizando cámaras de recuento de células y el cellometer 1000 auto utilizando tinción Trypan blue (Gibco, 11538886) de células vivas/muertas. El recuento de células vivas se utilizó para determinar el volumen de suspensión de organoides necesario para los experimentos. Se utilizaron placas de pocillos negros ópticos de 96 pocillos (PerkinElmer 6005182 Viewplate-96 Black Clear Bottom) para los ensayos de respuesta a fármacos. Los organoides AKP se sembraron a ~3000 células/pocillo en un volumen total de 6 μL, donde el contenido mínimo de Matrigel fue del 50%.

Los organoides sembrados se trataron durante 48 horas con los siguientes fármacos: trametinib (GSK1120212), regorafenib (BAY 73–4506), dabrafenib (GSK2118436), palbociclib (S4482), JSH-23 (S7351), CP-673451 (S1536), GSK3179106 (S8821), tofacitinib (S2789), selpercatinib (S8781), saracatinib (S1006), masitinib mesylate (E0814), RMC-6236 (E1597) y estaurosporina (AM-2282) se obtuvieron de Selleckchem. Todos los compuestos se reconstituyeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La estaurosporina se utilizó como control positivo a una concentración final de 0,25 μM. Los fármacos se solubilizaron en Corning® DMSO (Dimethyl Sulfoxide) (25–950-CQ) para una dosis final de 0,1% de DMSO.

Ensayos de cocultivo

Los organoides y RAW 264.7 se pasaron como se indicó anteriormente y se resuspendieron independientemente en el medio. AKP y RAW 264.7 se mezclaron en las siguientes proporciones: 1:1, 5:1, 10:1, 20:1. La mezcla de AKP:RAW 264.7 se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Las células se resuspendieron luego en 80% de Matrigel y se sembraron como cúpulas de 6 μL.

Generación de medios acondicionados por macrófagos (mCM)

El sobrenadante de RAW 264.7 se recogió antes del paso a una confluencia del 70% y se centrifugó para eliminar las células y los desechos. El sobrenadante se eliminó y se congeló en alícuotas. OCM se mezcló antes de los experimentos en una proporción de 1:1 con el sobrenadante de RAW 264.7 para crear mCM. Esta mezcla se utilizó luego para realizar el cribado de fármacos.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se midió utilizando el kit de ensayo Promega CellTiter-Blue (G8080) utilizando el protocolo del fabricante. Las placas se cargaron en la máquina Nanoglo de Promega después de una incubación de 3 a 4 horas y la fluorescencia por pocillo se midió a alta velocidad utilizando una excitación de 520 nm con emisión de 580–640 nm. Las mediciones se exportaron a archivos de Excel. Tres pocillos por placa se trataron con estaurosporina para inducir la muerte celular del 100%. La fluorescencia promedio de los pocillos de control positivo de estaurosporina se restó de los datos brutos de la placa. El 100% de la viabilidad se calculó a partir de los controles de solo 0,1% de DMSO. Luego, cada tratamiento se calculó como un porcentaje de viabilidad en relación con este control. Cada condición de medio se comparó y se normalizó con su control correspondiente de 0,1% de DMSO.

Microscopía de fluorescencia

Se añadieron 150 nM de Invitrogen lysotracker deep red (L12492) directamente al medio de cultivo de RAW 264.7 durante 1 hora. El medio se eliminó, las células se lavaron con PBS y se añadió nuevo medio. El reactivo NucBlue Live ReadyProbes (R37605) se añadió según las instrucciones del fabricante a todas las células. Se obtuvieron imágenes utilizando el software Opera Phenix y Harmony. La excitación láser a 405 nm, 488 nm y 640 nm se ajustó al 100% de potencia durante 100 ms, excepto para 488 nm a 60 ms. Se utilizaron filtros de emisión de 435–480 nm, 500–550 nm y 650–760 nm respectivamente. Fiji se utilizó para analizar y compilar las imágenes.

Perfilado del secretoma

El sobrenadante de RAW 264.7 se recogió y se analizó utilizando el Bio-Techne Proteome Profiler Mouse XL Cytokine Array (ARY028). La señal se cuantificó a partir de las imágenes de quimioluminiscencia utilizando Fiji y se presentó como la media de las dos réplicas integradas.

Experimentos con medios suplementados

Se adquirieron proteínas recombinantes de PeproTech: PDGF-BB (315–18) y GDF-15 (120–28C) y se diluyeron según las instrucciones del fabricante. Se diluyeron en OCM y se utilizaron para los ensayos de cribado de fármacos.

Ensayo de actividad de quinasas PAMGene

Los organoides se trataron con 0,1% de DMSO, 20 nM de trametinib o 10 μM de regorafenib durante 1 hora antes de su recolección. Todos los pasos se realizaron sobre hielo. Se siguió el protocolo para la lisis de organoides 3D según lo publicado por PAMGene como PROT-7643. Se tomó una alícuota antes del almacenamiento a −20 °C para realizar ensayos de BCA y determinar la concentración total de proteínas. Las muestras lisadas se cargaron en chips de quinasas de tirosina y serina/treonina, y los datos se procesaron utilizando los protocolos proporcionados (https://pamgene.com/ps12/), donde n=2.

Estadística y reproducibilidad

Los datos normalizados de la respuesta a los fármacos se importaron a Prism 10 como un análisis agrupado. Todos los experimentos incluyeron un mínimo de dos variables: tipo de medio (OCM, mCM, medio ‘suplementado’) o cocultivos (AKP, 1:1 AKP:RAW, 20:1 AKP:RAW), y se probaron en un mínimo de 3 condiciones de fármacos (DMSO, fármaco único, combinaciones de fármacos), lo que requirió un ANOVA de dos vías. Esto se realizó dentro de Prism para ajustar un modelo completo con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples, y el valor de P se estableció en 0,05. Se realizaron pruebas de normalidad de Anderson-Darling y Shapiro-Wilk para evaluar la bondad de ajuste del conjunto de datos. Las estadísticas de fila proporcionaron la media de viabilidad celular y la desviación estándar. Se utilizaron un mínimo de 6 réplicas biológicas para generar los gráficos, que incluyeron un máximo de 3 réplicas técnicas por réplica biológica. Las réplicas biológicas se definieron mediante placas sembradas, tratadas y analizadas por separado, desde el pasaje 4-18 de los organoides AKP. Las estadísticas completas para cada gráfico se informan en la tabla suplementaria 1.

Cultivo de organoides de cáncer colorrectal murino

La línea de organoides murinos, AKP, se generó a partir de la colonia BCVAPK ID:PCB41–1g que expresa KRAS oncogénico más pérdida de APC y p53 (Villin–CreERT2: Apcfl/fl
KrasG12D/+
Trp53fl/fl) [^[87]], y se etiquetó con proteína fluorescente verde (GFP) como se describe a continuación. La derivación de organoides intestinales murinos Vil-CreERT2; Apcfl/fl; KrasG12D/+; Trp53fl/fl se realizó de acuerdo con la Licencia del Departamento de Asuntos Internos: PPL 60/4492, autorizada por el Organismo de Revisión Ética y de Bienestar Animal de la Universidad de Glasgow, y se llevó a cabo bajo la Ley del Reino Unido sobre Animales (Procedimientos Científicos).

Los organoides AKP se cultivaron utilizando Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, sin fenol rojo, sin LDEV, 10 mL (356231) en placas de cultivo de 6 pocillos Thermo Scientific Nunc™ (140685). Los organoides se cultivaron en Advanced DMEM + L-Glutamina, penicilina/estreptomicina, HEPES (Advanced DMEM*) suplementado con 50 ng/mL de EGF, 100 ng/mL de Noggin y 1x N2/B27 (OCM).

Los organoides se pasaron cada 2 o 3 días para mantener estructuras saludables. Los organoides de reserva en gotas de Matrigel se rompieron en Advanced DMEM y se recogieron en tubos de falcon de 15 ml. La suspensión de organoides se centrifugó luego a 4 °C, 1500 rpm durante 8 minutos para separar el Matrigel del pellet de organoides. El medio y el Matrigel se aspiraron antes de la posterior disrupción mecánica y resuspensión en 6 ml de Advanced DMEM. Como se indicó anteriormente, la centrifugación y la aspiración se repitieron, dejando solo el pellet de organoides. Resuspendimos las células en 50% de Matrigel y las sembramos en domos de 20 μL.

Desarrollo de organoides etiquetados

El vector lentiviral pLV-EKAREN4 (TA)-NLS-Puro (167830) se obtuvo de Addgene para etiquetar los organoides con proteínas fluorescentes verdes (GFP). Las células HEK293T se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Para generar partículas lentivirales, las células HEK293T se transfectaron con 0,5 μg de vector lentiviral, 2 μg de psPAX2 y pCMV-VSV-G (vectores de empaquetamiento) a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. El sobrenadante de la transfección se eliminó y se reemplazó con medio de cultivo de organoides. Los sobrenadantes lentivirales se recogieron y se aclararon utilizando un filtro de jeringa de 0,45 μm. El sobrenadante se utilizó luego para infectar los organoides AKP en presencia de 10 μg/ml de polibreno. Los organoides GFP se seleccionaron utilizando 10 μg/ml de puromicina.

Cultivo de macrófagos murinos

Las células RAW 264.7 se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Las células RAW 264.7 se cultivaron en DMEM 10% FBS y 1% de penicilina/estreptomicina. Las células se pasaron cuando alcanzaron una confluencia del 70%.

Tratamiento con fármacos

Los organoides se pasaron como se indicó anteriormente y los pellets se resuspendieron en un pequeño volumen de Advanced DMEM (100–200 μl) para el recuento. Se realizaron recuentos celulares utilizando cámaras de recuento de células y el cellometer 1000 auto utilizando tinción de Trypan blue (Gibco, 11538886) para células vivas/muertas. El recuento de células vivas se utilizó para determinar el volumen de suspensión de organoides necesario para los experimentos. Se utilizaron placas de pocillos negros ópticos de 96 pocillos (PerkinElmer 6005182 Viewplate-96 Black Clear Bottom) para los ensayos de respuesta a fármacos. Los organoides AKP se sembraron a ~3000 células/pocillo en un volumen total de 6 μL, donde el contenido mínimo de Matrigel fue del 50%.

Los organoides sembrados se trataron durante 48 horas con los siguientes fármacos: trametinib (GSK1120212), regorafenib (BAY 73–4506), dabrafenib (GSK2118436), palbociclib (S4482), JSH-23 (S7351), CP-673451 (S1536), GSK3179106 (S8821), tofacitinib (S2789), selpercatinib (S8781), saracatinib (S1006), masitinib mesylate (E0814), RMC-6236 (E1597) y estaurosporina (AM-2282), que se obtuvieron de Selleckchem. Todos los compuestos se reconstituieron según las instrucciones del fabricante. La estaurosporina se utilizó como control positivo a una concentración final de 0,25 μM. Los fármacos se solubilizaron en Corning® DMSO (dimetilsulfóxido) (25–950-CQ) para una dosis final del 0,1% de DMSO.

Ensayos de cocultivo

Los organoides y RAW 264.7 se pasaron como se indicó anteriormente y se resuspendieron independientemente en medio. AKP y RAW 264.7 se mezclaron en las siguientes proporciones: 1:1, 5:1, 10:1, 20:1. La mezcla de AKP:RAW 264.7 se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Las células se resuspendieron luego en 80% de Matrigel y se sembraron como domos de 6 μL.

Generación de medio acondicionado de macrófagos (mCM)

El sobrenadante de RAW 264.7 se recogió antes del pasaje al 70% de confluencia y se centrifugó para eliminar las células y los desechos. El sobrenadante se eliminó y se congeló en alícuotas. El OCM se mezcló antes de los experimentos en una proporción de 1:1 con el sobrenadante de RAW 264.7 para crear mCM. Esta mezcla se utilizó luego para realizar el cribado de fármacos.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se midió utilizando el kit Promega CellTiter-Blue (G8080) utilizando el protocolo del fabricante. Las placas se cargaron en la máquina Nanoglo de Promega después de una incubación de 3 a 4 horas y la fluorescencia por pocillo se midió a alta velocidad utilizando una excitación de 520 nm con emisión de 580-640 nm. Las mediciones se exportaron a archivos de Excel. Tres pocillos por placa se trataron con estaurosporina para inducir el 100% de muerte celular. La fluorescencia media de los pocillos de control positivo de estaurosporina se restó de los datos brutos de la placa. El 100% de viabilidad se calculó a partir de los controles de solo 0,1% de DMSO. Cada tratamiento se calculó luego como un porcentaje de viabilidad en relación con este control. Cada condición de medio se comparó y se normalizó a su control correspondiente de 0,1% de DMSO.

Microscopía de fluorescencia

Se añadieron 150 nM de Invitrogen lysotracker deep red (L12492) directamente al medio de cultivo de RAW 264.7 durante 1 hora. El medio se eliminó, las células se lavaron con PBS y se añadió medio fresco. Se añadió NucBlue Live ReadyProbes Reagent (R37605) según las instrucciones del fabricante a todas las células. Las imágenes se obtuvieron utilizando el software Opera Phenix y Harmony. La excitación láser a 405 nm, 488 nm y 640 nm se estableció al 100% de potencia durante 100 ms, excepto para 488 nm a 60 ms. Se utilizaron filtros de emisión de 435-480 nm, 500-550 nm y 650-760 nm respectivamente. Fiji se utilizó para analizar y compilar las imágenes.

Perfilado del secretoma

El sobrenadante de RAW 264.7 se recogió y se analizó utilizando el Bio-Techne Proteome Profiler Mouse XL Cytokine Array (ARY028). La señal se cuantificó a partir de las imágenes de quimioluminiscencia utilizando Fiji y se presentó como la media de las dos réplicas integradas.

Experimentos con medios suplementados

Las proteínas recombinantes se adquirieron de PeproTech: PDGF-BB (315–18) y GDF-15 (120–28C) y se diluyeron según las instrucciones del fabricante. Se diluyeron en OCM y se utilizaron para los ensayos de cribado de fármacos.

Ensayo de actividad de quinasas PAMGene

Los organoides se trataron con 0,1% de DMSO, 20 nM de trametinib o 10 μM de regorafenib durante 1 hora antes de su recolección. Todos los pasos se realizaron sobre hielo. Se siguió el protocolo para la lisis de organoides 3D según lo publicado por PAMGene como PROT-7643. Se tomó una alícuota antes del almacenamiento a −20 °C para realizar ensayos de BCA y determinar la concentración total de proteínas. Las muestras lisadas se cargaron en chips de quinasas de tirosina y serina/treonina, y los datos se procesaron utilizando los protocolos proporcionados (https://pamgene.com/ps12/), donde n=2.

Estadística y reproducibilidad

Los datos normalizados de la respuesta a los fármacos se importaron a Prism 10 como un análisis agrupado. Todos los experimentos incluyeron un mínimo de dos variables: tipo de medio (OCM, mCM, medio ‘suplementado’) o cocultivos (AKP, 1:1 AKP:RAW, 20:1 AKP:RAW), y se probaron en un mínimo de 3 condiciones de fármacos (DMSO, fármaco único, combinaciones de fármacos), lo que requirió un ANOVA de dos vías. Esto se realizó dentro de Prism para ajustar un modelo completo con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples, y el valor de P se estableció en 0,05. Se realizaron pruebas de normalidad de Anderson-Darling y Shapiro-Wilk para evaluar la bondad de ajuste del conjunto de datos. Las estadísticas de fila proporcionaron la media de viabilidad celular y la desviación estándar. Se utilizaron un mínimo de 6 réplicas biológicas para generar los gráficos, que incluyeron un máximo de 3 réplicas técnicas por réplica biológica. Las réplicas biológicas se definieron mediante placas sembradas, tratadas y analizadas por separado, desde el pasaje 4-18 de los organoides AKP. Las estadísticas completas para cada gráfico se informan en la tabla suplementaria 1.