Ensayos de microscopía de inmunofluorescencia múltiple para la evaluación farmacodinámica de la activación de la tirosina quinasa MET en la membrana plasmática y el núcleo.

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Contribuyeron por igual a este trabajo:
Tony Navas,
Apurva K. Srivastava

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Afiliación
Programa de Biomarcadores Farmacodinámicos Clínicos, Dirección de Investigación Aplicada/de Desarrollo, Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

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Programa de Biomarcadores Farmacodinámicos Clínicos, Dirección de Investigación Aplicada/de Desarrollo, Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

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Programa de Biomarcadores Farmacodinámicos Clínicos, Dirección de Investigación Aplicada/de Desarrollo, Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

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Rama de Pruebas Biológicas, Programa de Terapéutica de Desarrollo, Instituto Nacional del Cáncer en Frederick, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

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Rama de Pruebas Biológicas, Programa de Terapéutica de Desarrollo, Instituto Nacional del Cáncer en Frederick, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

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División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América

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Rama de Oncología Urológica, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América

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Rama de Oncología Urológica, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América

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Dirección actual: Instituto Knight del Cáncer, Universidad de Salud y Ciencias de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU.

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División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América

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División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América,
Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, Maryland, Estados Unidos de América

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Afiliación
Programa de Biomarcadores Farmacodinámicos Clínicos, Dirección de Investigación Aplicada/de Desarrollo, Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, Frederick, Maryland, Estados Unidos de América

La tirosina quinasa receptora HGF/SF (factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión) MET está sobreexpresada y/o activada en muchos tumores, lo que proporciona objetivos terapéuticos para conjugados anticuerpo-fármaco e inhibidores de la tirosina quinasa. La medición fiable de la MET activada es fundamental para la evaluación farmacodinámica de las terapias dirigidas a MET y para el uso ampliado y adecuado de dichas terapias en pacientes con tumores impulsados por la MET activada, con o sin amplificación de MET asociada o mutaciones activadoras conocidas. Para abordar la escasez de herramientas para medir directamente la activación de MET en las células tumorales dentro de las muestras de biopsia de los pacientes, desarrollamos un ensayo robusto y cuantitativo de inmunofluorescencia microscópica para medir los niveles de pY1235MET y MET total en muestras tumorales in vitro, in vivo y de pacientes. Validamos este ensayo mediante la evaluación de modelos preclínicos tratados con inhibidores de MET, experimentos de bloqueo con péptidos para demostrar la especificidad y la concordancia con las mediciones correspondientes de las mismas muestras utilizando un ensayo de sándwich validado previamente de lisados tumorales. Dado la importancia de la MET asociada a la membrana plasmática en el inicio de sus cascadas de señalización canónicas, así como la señalización no canónica demostrada a partir de la MET localizada en el núcleo en diferentes tipos de células tumorales y en respuesta a diversos estímulos ambientales, desarrollamos la capacidad de ensayo para medir los niveles de pY1235MET y MET total dentro de la membrana plasmática o el núcleo; estos ensayos permiten futuras exploraciones de la relevancia biológica y clínica de los patrones de localización subcelular de MET. Finalmente, utilizando microarreglos de tejidos de más de 50 muestras tumorales resecadas de pacientes con carcinoma colorrectal o cáncer de pulmón no microcítico, demostramos que los niveles tumorales de pY1235MET no siempre se correlacionan con la expresión de MET total, lo que sugiere que la medición de la MET activada en el tumor podría tener el potencial de ser un biomarcador independiente para identificar a pacientes adicionales que podrían beneficiarse de la terapia dirigida a MET, más allá de aquellos con amplificación de MET tumoral, sobreexpresión de MET o mutaciones activadoras de MET establecidas.

Citación: Navas T, Srivastava AK, Lawrence SM, Hollingshead MG, Alcoser SY, Miller SB, et al. (2026) Ensayos de inmunofluorescencia multiplex para la evaluación farmacodinámica de la activación de la tirosina quinasa MET en la membrana plasmática y el núcleo. PLoS One 21(5): e0349090.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0349090

Editor: Irina V. Lebedeva, Weill Cornell Medicine, ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

Recibido: 22 de diciembre de 2025; Aceptado: 23 de abril de 2026; Publicado: 12 de mayo de 2026

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido, distribuido, transmitido, modificado, utilizado o utilizado de cualquier otra manera por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo se pone a disposición bajo la dedicación de dominio público Creative Commons CC0.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes se encuentran en el artículo y en sus archivos de información complementaria.

Financiación: Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) y con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de la Salud, bajo el número de contrato HHSN261201500003I. Las contribuciones de los autores del NIH se realizaron como parte de sus funciones oficiales como empleados federales del NIH, cumplen con los requisitos de la política de la agencia y se consideran obras del Gobierno de los Estados Unidos. Sin embargo, las conclusiones y los resultados presentados en este artículo son los de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones del NIH o del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU. El Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, que es financiado por el gobierno federal y operado por Leidos Biomedical Research, Inc., brindó apoyo en forma de salarios para los autores TN, AKS, SML, RJK y REP. Leidos Biomedical Research, Inc. es el contratista principal para la operación del Laboratorio Nacional Frederick y, por lo tanto, no puede realizar ningún negocio que represente un conflicto de intereses con este contrato. Los financiadores no tuvieron ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflictos de intereses: He leído la política de la revista y los siguientes autores de este manuscrito tienen conflictos de intereses: Shivaani Kummar: Consultor/miembro de la junta asesora: Springworks Therapeutics, SeaGen, Bayer, Genome & Company, HarbourBiomed, BPGbio Therapeutics, Oxford Biotherapeutics, Mundibiopharma, BPGbio, Inc., Gilead, Mirati; GI Innovation Inc, XYone Therapeutics, Genome Insight, Aadi Biosciences, MOMA Therapeutics, Daiichi Sankyo, Parabilis, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Navexio, PATHOMIQ (cofundador), Fortress Biotech, Inc (participación), Sift Biosciences (participación). Tony Navas: Empleado de AbbVie y puede tener acciones. Todos los demás autores declaran no tener posibles conflictos de intereses.

Las alteraciones moleculares específicas que dan como resultado la hiperactivación de la tirosina quinasa receptora MET se han demostrado que están asociadas con un mal pronóstico y, en algunos casos, se ha demostrado que confieren respuesta a las terapias dirigidas a MET en pacientes con tumores sólidos de diversas histologías, incluido el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), el cáncer gástrico, el carcinoma colorrectal (CCR) y el carcinoma de células renales papilares tipo 1 [1–4]. Estas alteraciones incluyen las mutaciones de exclusión del exón 14 de MET que conducen a isoformas empalmadas alternativamente que carecen de una porción regulatoria crítica del dominio yuxtamembrana, así como la amplificación del gen MET y/o la sobreexpresión de proteínas ^[5]. Hasta la fecha, varios ensayos clínicos de agentes dirigidos a MET han utilizado la amplificación de MET y/o las mutaciones de exclusión del exón 14 para seleccionar a los pacientes; si bien se ha demostrado que las mutaciones de exclusión del exón 14 del tumor, que se sabe que producen MET constitutivamente activado, confieren sensibilidad a los inhibidores de MET ^[1,2,5], la amplificación del gen MET e incluso la sobreexpresión de la proteína MET a menudo han sido insuficientes para predecir la respuesta a los agentes dirigidos a MET ^[2,6,7], y el repertorio completo de defectos moleculares que pueden conferir sensibilidad a los inhibidores de MET aún no se ha establecido.

La identificación y confirmación de mutaciones adicionales predictivas que activan MET, así como de nuevos agentes terapéuticos diseñados para inhibir la señalización de MET, pueden facilitarse mediante estudios farmacodinámicos con ensayos que generen mediciones precisas y exactas de la activación de MET. Tras la unión del ligando del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y la dimerización del receptor, la señalización de MET se inicia mediante la autofosforilación de los residuos de tirosina 1234 y 1235 (pY1234/1235) dentro del dominio quinasa de MET intracelular; esto, a su vez, conduce a la fosforilación activadora de los residuos de tirosina 1349 y 1356 en el extremo C de MET, a los que luego se reclutan proteínas adaptadoras y de señalización para mediar los eventos de señalización posteriores ^[2]. Dada la función crítica de la fosforilación del dominio intracelular de MET en el proceso de transducción de señales, varios estudios han intentado examinar los niveles de expresión de MET fosforilado en muestras de tumores clínicos; estos incluyen evaluaciones cualitativas basadas en inmunohistoquímica (IHQ) de la expresión de MET fosforilado utilizando anticuerpos monoclonales anti-pY1349MET ^[8] y anticuerpos policlonales anti-pY1235MET ^[9], que no demostraron ninguna asociación entre los niveles de MET fosforilado y la supervivencia del paciente, así como un ensayo de IHQ cuantitativo que utiliza un anticuerpo monoclonal anti-pY1234/1235MET ^[10]. Sin embargo, además de las limitaciones inherentes de los análisis cualitativos y los problemas de especificidad de los anticuerpos que han complicado las evaluaciones cuantitativas previas basadas en microscopía ^[11], muchos de estos intentos anteriores de evaluar los niveles de MET fosforilado se han visto complicados por el uso de procedimientos de recolección de muestras que no mitigan adecuadamente la inestabilidad conocida de los isoformas fosforilados de MET durante incluso períodos relativamente cortos de isquemia ^[6]. Para abordar estos problemas, previamente desarrollamos, validamos y demostramos la idoneidad clínica de un inmunoensayo tipo sándwich basado en quimioluminiscencia, así como procedimientos complementarios para la recolección y el procesamiento de muestras que minimizan el tiempo de isquemia y estabilizan las modificaciones proteicas postraduccionales lábiles, para medir de manera confiable el MET de longitud completa pY1234/1235 en lisados de muestras de biopsia de tumores obtenidas mediante aguja gruesa ^[6,11,12]. Este ensayo inmunoenzimático (ELISA) también proporciona mediciones específicas y cuantitativas de MET activado de longitud completa en muestras de tumores de pacientes ^[11,12]. Sin embargo, dado que el ELISA de pY1234/1235MET utiliza un anticuerpo de captura que reconoce el extremo N de MET para garantizar la cuantificación específica de MET de longitud completa, este ensayo no detecta los fragmentos C-terminales intracelulares biológicamente activos, fosforilados en Y1234/1235, que resultan de la escisión proteolítica durante la transducción de la señal de MET. Además, la viabilidad clínica del uso de dichos ensayos basados en lisados como herramientas de diagnóstico complementarias para los agentes dirigidos a MET se ve limitada por el requisito de una muestra de biopsia tumoral de aguja gruesa de tamaño completo (18-gauge) con un contenido tumoral viable suficientemente alto, aproximadamente ≥ 25% ^[13].

Las evaluaciones basadas en lisados de los niveles de pY1234/1235MET en el tumor también se ven limitadas por la falta de información sobre la localización subcelular, lo que puede dificultar la delineación exhaustiva de la respuesta celular a los inhibidores de MET en estudios de mecanismo de acción clínicos y preclínicos. El tráfico intracelular de las quinasas de tirosina receptoras está bien documentado ^[14], y varios estudios han demostrado la translocación de MET al núcleo en respuesta a estímulos ambientales específicos, incluidos los cambios en la densidad celular ^[15], el pH ^[16], el estrés oxidativo ^[17] y la estimulación con HGF [8,18–20], aunque también se ha detectado la localización nuclear de MET independiente de HGF en algunas líneas celulares cancerosas [21–23]. MET contiene una señal de localización nuclear (NLS) ubicada en la región juxtamembrana codificada por el exón 14 ^[16], y tanto la translocación nuclear del dominio C-terminal de MET escindido proteolíticamente ^{[15,16,21,23]} como la localización de MET de longitud completa en la envoltura nuclear ^[8,17,24] se han observado en líneas celulares cancerosas. Se han descrito varios roles biológicos para MET nuclear, incluida la fosforilación de PARP1, lo que resulta en una respuesta disminuida a los inhibidores de PARP ^[17]; la regulación al alza de la expresión de SOX y β-catenina para promover la transición epitelio-mesenquimal (TEM) ^[25]; y la activación de la señalización de NF-κB a través de la regulación al alza de la expresión de TAK1 ^[22]. El valor pronóstico o predictivo de la distribución de MET en ubicaciones y/o estados de fosforilación subcelulares específicos sigue siendo un tema de debate y puede depender de la histología del tumor. Estudios previos han encontrado que MET total localizado en la membrana plasmática, pero no pY1349MET, es un factor pronóstico en el mesotelioma ^[8], que los niveles de MET nuclear están asociados con la enfermedad en etapa tardía y una mala supervivencia general en pacientes con carcinoma hepatocelular ^[22], y que ni los niveles de MET citoplasmático ni nuclear son pronósticos en pacientes con carcinomas de células escamosas orales ^[23].

Para permitir una cuantificación sólida de MET activado tanto a nivel celular como subcelular, incluido MET de longitud completa y los productos de escisión C-terminal que resultan de la proteólisis durante la transducción de la señal, desarrollamos un ensayo basado en microscopía de inmunofluorescencia para medir MET y pY1235MET en muestras de tumores de pacientes. Dado que se ha demostrado que la fosforilación de Y1234 es prescindible para la activación de MET en algunas circunstancias, por ejemplo, en presencia de mutaciones específicas del dominio quinasa de MET oncogénico, nuestro objetivo fue cuantificar en su lugar los niveles de pY1235MET, que son universalmente necesarios para la transducción de la señal de MET ^[26]. Como se detalla a continuación, utilizamos nuestro nuevo anticuerpo monoclonal (clon 23111) que, como hemos demostrado previamente ^[11], reconoce selectivamente MET fosforilado en Y1235 independientemente del estado de fosforilación de Y1234 para la medición confiable del contenido tumoral de pY1235MET, el contenido nuclear de las células tumorales y el contenido de la membrana plasmática de las células tumorales para permitir análisis detallados de la dinámica temporal y espacial de la activación de MET y la respuesta a las terapias dirigidas a MET.

El anticuerpo monoclonal de ratón contra MET total (generado mediante inmunización con un péptido correspondiente al extremo C de MET) se compró a Cell Signaling Technology (CST; clon D1C2) y se conjugó directamente a Alexa Fluor (AF) 488; el anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con AF647 o AF546 MET4 (clon 8G6) ^[27,28] se utilizó para medir el ectodominio de MET en muestras fijadas con formalina de líneas celulares no tratadas, modelos de xenoinjerto SNU-5 tratados con el inhibidor de la tirosina quinasa (ITQ) MET/ALK, crizotinib, y modelos hHGF knock-in H596 frente a MET total. Un anticuerpo monoclonal de conejo específico para pY1235MET (“anti-pY1235MET”; clon 23111; US11340219B2, EP3430051B1), y con reactividad indetectable al sitio adyacente pY1234 en MET, se descubrió y desarrolló previamente en colaboración con Epitomics Inc. (Abcam) utilizando antígenos de fosfopéptidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos de MET que flanquean el residuo 1235 ^[11]; este anticuerpo está disponible a través del Developmental Studies Hybridoma Bank (ID de registro de anticuerpos: AB_2888958; https://dshb.biology.uiowa.edu/CPTC-MET-1). El clon 23111 se conjugó directamente a AF546. El anticuerpo monoclonal de conejo dirigido contra un epítopo intracelular propietario de la subunidad alfa-1 de Na+/K+-ATPasa se compró a Abcam (clon EP1845Y) y se conjugó directamente a AF647. El anticuerpo secundario anti-conejo AF546 se compró a Life Technologies.

Las células A549 o HT29 se cultivaron en portaobjetos de cámara hasta alcanzar una confluencia del 80% antes de ser sometidas a privación de suero durante 24 horas. Las células se incubaron con o sin 100 nM de crizotinib (un ITQ MET/ALK) durante 4 horas antes de la estimulación con 20 ng/ml de HGF recombinante (derivado de HEK293, Peprotech), el ligando de MET, durante 15 minutos (A549) o 24 horas (HT29) en un medio libre de suero. Las células se fijaron en NBF al 10% durante 15 minutos, se permeabilizaron en BSA al 1% en PBS con Tween-20 al 0,5% y Triton X-100 al 0,1%, y se tiñeron con el anticuerpo anti-pY1235MET (10 μg/mL) seguido de 10 μg/mL de anticuerpo secundario anti-conejo AF546. Las láminas se visualizaron mediante un Nikon 90i Andor Camera, y las imágenes se analizaron utilizando el software NIS Elements.

Las células fijadas con formalina, incluidas en parafina (FFPE) obtenidas de las líneas celulares GTL-16, HT29, MDA-MB-231 y SNU-1 no tratadas (Repositorio de Tumores del Programa de Desarrollo de la NCI) se tiñeron con DAPI y anticuerpos de inmunofluorescencia conjugados anti-MET [MET4 ^[27]] y anti-pY1235MET. La cuantificación de la tinción total de MET y pY1235MET se realizó utilizando el software Definiens Tissue Studio.

Para el análisis de microscopía de inmunofluorescencia, los tejidos tumorales de xenoinjerto GTL-16 congelados rápidamente o los cultivos celulares se incubaron con anticuerpos monoclonales de inmunofluorescencia conjugados anti-MET y anti-pY1235MET que se preincubaron durante la noche a 4 °C con tampón, un péptido MET no fosforilado correspondiente a los aminoácidos 1229-1240 (MYDKEYYSVHNK), o el mismo péptido fosforilado en la tirosina 1234 (MYDKE[pY]YSVHNK), en la tirosina 1235 (MYDKEY[pY]SVHNK), o en ambos residuos de tirosina (MYDKE[pY][pY]SVHNK). Cada péptido estuvo presente a 20 veces la concentración molar del anticuerpo anti-pY1235MET.

Para el análisis de Western blotting de los experimentos de bloqueo de péptidos in vitro, las células GTL-16 se trataron primero con crizotinib (0, 25 o 100 nM) durante 4 horas. Los grumos celulares se recolectaron, se lisaron en tampón de extracción celular (Invitrogen) que contenía cóctel de inhibidores de fosfatasas PhosSTOP (Roche) y tabletas de cóctel de inhibidores de proteasas cOmplete Mini EDTA-free (Roche), se separaron por electroforesis en un gel de proteínas NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa iBlot Transfer Stack (Invitrogen). MET fosforilado en la tirosina 1235 se detectó mediante un anticuerpo primario de conejo conjugado con digoxigenina (DIG) anti-pY1235MET y un anticuerpo secundario anti-DIG conjugado con AF790 (Licor), mientras que MET de longitud completa se evaluó utilizando el anticuerpo anti-MET total D1C2 no conjugado seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con 680-LT. Cada muestra se incubó durante la noche con los anticuerpos, así como con tampón o uno de los 4 péptidos MET mencionados anteriormente (no fosforilado, pY1234, pY1235 o pY1234/1235) presentes a una concentración molar 30 veces la concentración molar del anticuerpo primario anti-pY1235MET. Después de 3 lavados con tampón Licor, las muestras se visualizaron utilizando el software Odyssey.

El Frederick National Laboratory está acreditado por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International y sigue la Política del Servicio de Salud Pública para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la NCI (IACUC) y se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo de comité de cuidado y uso de animales aprobado, de acuerdo con los procedimientos descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (National Research Council; 1996; National Academy Press; Washington, DC).

Los ratones desnudos atímicos (nu/nu NCr; colonias de cría internas de la Rama de Pruebas Biológicas de la NCI, FNLCR) fueron implantados con las líneas celulares cancerosas humanas especificadas mediante implantación subcutánea. Para el experimento con tumores de xenoinjerto H596, las células H596 se implantaron en ratones SCID de tipo salvaje o en ratones homocigotos con inserción génica de HGF humano (hHGFki/ki) como se describió anteriormente ^[29]; los tumores se recolectaron después de 33 días. El programa de uso de animales en el FNLCR está acreditado por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International y sigue la Política del Servicio de Salud Público de los EE. UU. para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en cumplimiento con un protocolo de comité de cuidado y uso de animales aprobado.

Los ratones se alojaron en jaulas de policarbonato estériles con tapas filtrantes, mantenidas en una instalación de bioseguridad con un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad, y se les proporcionó alimento y agua esterilizados ad libitum. Para todos los experimentos, todos los ratones fueron sacrificados mediante métodos aprobados por el IACUC (compatibles con las Directrices de la AVMA para la eutanasia), que incluyeron la inducción y el mantenimiento de la anestesia con isoflurano, seguido de exsanguinación o exposición a dióxido de carbono durante un mínimo de 10 minutos, seguida de una observación adicional o dislocación cervical. Se monitorizaron diariamente todos los animales para detectar signos clínicos de malestar (postura encorvada, pelaje áspero, inactividad, condición corporal general, pérdida de peso, inapetencia y/o autoaislamiento). Los animales que presentaban signos de malestar fueron tratados con alimento húmedo/HydrogelTM si los signos eran leves (peso < 20%; solo 1 signo clínico aparente) o fueron eutanasiados de forma humanitaria ese mismo día, según lo descrito anteriormente, si los signos eran más graves.

Crizotinib (PF 02341066; NSC D749769-Y), tivantinib (NSC 758242) y pazopanib (NSC 737754) se obtuvieron del Programa de Terapéutica en Desarrollo (DTP), NCI. Crizotinib y pazopanib se administraron por sonda oral en un vehículo de solución salina. Tivantinib se administró por vía oral durante 8 días en un vehículo de solución de PEG 400:20% de vitamina E TPGS (60:40). Todas las muestras de tumores xenógenos tratados con fármacos se recogieron como parte de un estudio previo utilizando métodos para preservar los sitios de fosforilación de proteínas lábiles ^[11]. Las muestras de biopsia tumoral se recogieron utilizando dispositivos de biopsia de tejidos blandos Temno Evolution de calibre 18 (Merit Medical System), mientras que los tumores xenógenos completos se recogieron mediante una técnica de escisión estándar y se seccionaron inmediatamente en 2-4 partes iguales con tijeras de punta fina. Cada muestra de biopsia o cuadrante tumoral se congeló inmediatamente en un criovial Sarstedt de fondo cónico y tapa roscada de 1,5 mL sellado con una junta tórica (preenfriado en nitrógeno líquido) al tocar la biopsia con el interior del tubo dentro de un minuto después de completar el procedimiento de recolección, y se almacenó a -80 °C. En el momento del análisis de las biopsias de aguja gruesa, las muestras se descongelaron a temperatura ambiente en formaldehído tamponado neutro al 10% (NBF) y se procesaron en bloques de parafina con tejido de control positivo para biomarcadores para su seccionamiento, utilizando un método previamente descrito para preservar las fosfoproteínas y otros biomarcadores lábiles ^[11]. En el momento del análisis de los cuadrantes tumorales, las muestras se cortaron (dentro de los tubos de criovial) en pequeñas secciones del tamaño de una biopsia de aguja y se fijaron inmediatamente en formaldehído tamponado neutro al 10% (NBF) que contenía el cóctel inhibidor de fosfatasas PhosSTOP (Roche) durante 24 horas, y luego se incluyeron en parafina para su seccionamiento.

Los estudios clínicos NCT01468922 y NCT00026884 fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Nacional del Cáncer. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. El diseño y la realización del estudio cumplieron con todas las regulaciones, directrices y políticas locales aplicables.

Se recogieron biopsias de aguja gruesa (calibre 18) de lesiones metastásicas de pacientes con cánceres avanzados y refractarios incluidos en ensayos clínicos realizados por la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer (DCTD) y el Centro de Investigación del Cáncer del Centro Clínico del NIH, Bethesda, Maryland: estudios NCT01468922 y NCT00026884. Los pacientes se incluyeron en el estudio NCT01468922 desde el 23 de enero de 2012 hasta el 18 de marzo de 2015. Para los análisis retrospectivos de muestras de tejido tumoral archivadas recogidas bajo el protocolo NCT00026884, las muestras se utilizaron con fines de investigación el 12 de octubre de 2011, y los autores no tuvieron acceso a información identificable del paciente para estas muestras. Cada muestra de biopsia se colocó en un criovial preenfriado, se congeló en un plazo de 2 minutos después de la recolección y se almacenó a -80 °C. En el momento del análisis, las muestras de biopsia se descongelaron en fijador y se incluyeron en parafina con tejido de control positivo para biomarcadores para su seccionamiento, utilizando un método previamente descrito para preservar las fosfoproteínas y otros biomarcadores lábiles ^[11]. Un resumen de los procedimientos para el procesamiento de muestras clínicas y preclínicas se puede encontrar en los Procedimientos Operativos Estándar (POE) 340507, 340550, 340546 y 340548 publicados en el sitio web de NCI/DCTD (http://dctd.cancer.gov/ResearchResources/ResearchResources-biomarkers.htm).

Se adquirieron arreglos de tejidos que contenían tejido tumoral resecado de pacientes con carcinoma colorrectal (CRC) o CPNP de Indivumed GmbH. Las muestras de tejido se sometieron a tiempos de isquemia de < 5 minutos mientras se transferían a formaldehído tamponado neutro antes de su inclusión y preparación de cada arreglo de tejidos para su seccionamiento.

Los ratones que albergaban tumores xenógenos SNU-5 fueron tratados una vez al día (QD) durante 4 días mediante sonda oral (PO) con vehículo (agua) o 12,5 o 25 mg/kg de crizotinib (n = 4 animales por grupo), y se recogieron tres muestras de biopsia Temno Evolution de calibre 18 por animal 4 horas después de la administración de la dosis final del fármaco. Las muestras se colocaron en crioviales preenfriados, que se transfirieron directamente a nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 °C. Tras su extracción del criostorage, las muestras se descongelaron en fijador de formalina y luego se incluyeron en parafina. Las secciones de FFPE se tiñeron con DAPI y anticuerpos anti-pY1235MET conjugados con fluorescencia (10 μg/mL) y anti-MET (clon D1C2, 2,5 μg/mL).

Las imágenes de microscopía de fluorescencia se recogieron utilizando un escáner de portaobjetos de inmunofluorescencia FL Aperio y el software de análisis de espectro (Leica Biosystems) o, para imágenes de microscopía confocal, utilizando un microscopio Nikon Eclipse Ni-E con un cabezal de escaneo A1si. Se determinaron el MET total, pY1235MET y la relación MET total/pY1235MET según lo descrito anteriormente.

Para el análisis de MET localizado en la membrana plasmática, se utilizó la expresión de Na+/K+-ATPasa para segmentar la membrana plasmática. A continuación, se cuantificó la expresión total de MET y pY1235MET dentro de la membrana plasmática utilizando el software Definiens Tissue Studio y el análisis del área del marcador. Los niveles de expresión del marcador se evaluaron de forma independiente utilizando controles isotípicos y líneas celulares biológicamente relevantes para determinar los umbrales de intensidad positivos. Para el análisis de la expresión total de MET y pY1235MET localizada en el núcleo, se segmentaron las regiones nucleares positivas para DAPI antes de medir la expresión de MET dentro de los núcleos utilizando el software Definiens Tissue Studio y el análisis del área del marcador.

Los valores p para las comparaciones de los niveles de analitos entre los grupos se obtuvieron de pruebas de Mann-Whitney no paramétricas no pareadas. Las evaluaciones de la asociación entre los valores de ELISA y IFA se realizaron utilizando análisis de correlación de rango de Spearman.

Para verificar que nuestro nuevo anticuerpo anti-pY1235MET detecta la activación del receptor MET en células tumorales intactas, las células de adenocarcinoma colorrectal HT29 y las células de carcinoma pulmonar A549, que tienen niveles bajos y moderados de MET activado, respectivamente ^[11], se trataron in vitro con HGF, con o sin la adición del inhibidor de la tirosina quinasa MET/ALK, crizotinib. Este anticuerpo permitió la visualización de la sobreexpresión de pY1235MET después del tratamiento con 20 ng/mL de HGF durante 4 horas, así como la eliminación casi completa de la señal de pY1235MET cuando las células se preincubaron con 100 nM de crizotinib antes del tratamiento con HGF (Fig. 1A y Fig. S1A del material suplementario). De manera similar, este anticuerpo detectó la sobreexpresión de pY1235MET inducida por HGF en la línea celular de CPNP H596, que alberga una mutación de omisión del exón 14 de MET que altera la degradación del receptor y prolonga la señalización de MET (Fig. S1A del material suplementario); la preincubación de las células H596 con crizotinib redujo solo parcialmente esta sobreexpresión de pY1235MET mediada por HGF, lo que es consistente con la actividad modesta previamente informada de crizotinib en esta línea celular ^[30].

A, El IFA de pY1235MET detecta la inhibición mediada por crizotinib de la activación de MET inducida por HGF en las células de adenocarcinoma colorrectal HT29. Las células HT29 se incubaron con o sin 100 nM de crizotinib durante 4 horas antes de la estimulación con 20 ng/mL de HGF durante 24 horas. Las células se recogieron, se fijaron en formaldehído tamponado neutro al 10% durante 10 minutos y se tiñeron con DAPI, anticuerpo anti-pY1235MET de conejo [clon 23111, ^[11]] y anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con AF546. B, Especificidad de la señal del IFA del anticuerpo anti-pY1235MET demostrada mediante el bloqueo con péptidos. Las secciones de FFPE de tumores xenógenos de carcinoma gástrico GTL-16 amplificado por MET no tratadas se incubaron con un anticuerpo anti-MET conjugado con AF488 (clon D1C2, Cell Signaling Technology) o el anticuerpo anti-pY1235MET junto con tampón (-) o un péptido MET no fosforilado correspondiente a los aminoácidos 1229-1240 (no fosforilado) o el mismo péptido fosforilado en la tirosina 1234 (pY1234), en la tirosina 1235 (pY1235) o en ambos residuos de tirosina (pY1234/1235). Cada péptido estaba presente en una concentración molar 30 veces superior a la del anticuerpo anti-pY1235MET. C, D, Cuantificación basada en IFA multiplex de pY1235MET (verde) y MET total (magenta) en líneas celulares con un rango de niveles de expresión y activación de MET de referencia, que incluyen: GTL-16, una línea celular amplificada por MET con señalización de MET constitutiva independiente de ligandos ^[11]; HT29, una línea celular no amplificada por MET con niveles moderados de expresión y activación de MET ^[31]; la línea celular de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231, que presenta una expresión moderada de MET y una activación de MET de referencia muy débil ^[32]; y la línea celular de carcinoma gástrico SNU-1, que tiene una expresión de MET insignificante ^[33]. El MET total se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón AF647 conjugado MET4 (clon 8G6). C, Imágenes representativas de microscopía de inmunofluorescencia que muestran los niveles de MET total y pY1235MET para las 4 líneas celulares. D, Cuantificación de MET total y pY1235MET en imágenes de IFA. El área de la célula tumoral que es positiva para cada marcador dentro de cada campo de la imagen se divide por el número de núcleos en el mismo campo para generar una medida del área del marcador positiva por célula, y dichos valores se promedian en varios campos de la imagen para obtener la media del área del marcador por célula para cada modelo de línea celular. Cada punto representa el valor de un campo de imagen individual; las líneas horizontales indican las medias ± desviaciones estándar.

Para definir la especificidad del antígeno de este anticuerpo anti-pY1235MET, realizamos a continuación experimentos de bloqueo con péptidos utilizando tejido tumoral del modelo xenógeno de carcinoma gástrico GTL-16 amplificado por MET, que presenta altos niveles de señalización de MET de referencia ^[11]. La tinción de pY1235MET observada en los tumores GTL-16 no tratados se eliminó mediante la preincubación del anticuerpo anti-pY1235MET con un exceso molar de 30 veces de péptidos fosforilados en pY1235 o péptidos fosforilados en pY1234/pY1235 que correspondían a los aminoácidos 1229-1240 de la proteína MET de longitud completa, mientras que la preincubación del anticuerpo con los péptidos no fosforilados o fosforilados en pY1234 correspondientes no atenuó la intensidad de la tinción del anticuerpo anti-pY1235MET (Fig. 1B). Como se esperaba, la tinción del MET total utilizando el anticuerpo dirigido al extremo C-terminal no se vio afectada por la preincubación con ninguno de los péptidos que correspondían a los aminoácidos 1229-1240 (Fig. 1B). Se obtuvieron resultados comparables cuando se repitieron los experimentos de bloqueo con péptidos utilizando Western blotting (Fig. S1B del material suplementario).

Para evaluar la sensibilidad y la capacidad cuantitativa de este ensayo pY1235MET, analizamos los niveles de pY1235MET y MET total en líneas celulares que presentaban una variedad de niveles basales de activación de MET. Como se esperaba, la línea celular GTL-16 presentaba niveles altos tanto de MET total como de pY1235MET, mientras que HT29, una línea celular que no presenta amplificación de MET, exhibió niveles moderados de ambos ^[31], y la línea celular de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 mostró una expresión basal débil de MET y una activación basal muy débil de MET ^[32] (Fig. 1C y D). La línea celular de carcinoma gástrico SNU-1, que se sabe que tiene una expresión de MET insignificante ^[33], no produjo una expresión apreciable de MET total ni de pY1235MET cuando se evaluó mediante inmunofluorescencia (IFA). Estas diferencias relativas en pY1235MET y MET total en las 4 líneas celulares se reflejaron tanto en las imágenes de microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 1C) como en los resultados del análisis cuantitativo de imágenes generados utilizando Definiens Tissue Studio (Fig. 1D). Como se muestra en la Fig. 1D, se observó una medición consistente del punto final en múltiples campos de microscopía dentro de cada modelo de línea celular.

Para validar el ensayo basado en microscopía de inmunofluorescencia para pY1235MET, comparamos su rendimiento con el de nuestro ensayo ELISA previamente desarrollado, que mide pY1234/1235MET y MET total en extractos de muestras de tumores y reporta su relación calculada, “pY1234/1235MET/MET” ^[11]. Esta normalización de pY1234/1235MET a los niveles de MET total es necesaria en los inmunoensayos basados en lisados tumorales para abordar las variaciones inter-muestras en el contenido tumoral, un problema que es irrelevante para los ensayos de microscopía que utilizan enfoques de segmentación de imágenes para restringir las mediciones a las células tumorales. En modelos xenógenos SNU-5 de carcinoma gástrico amplificado de MET tratados con 12,5 o 25 mg/kg de crizotinib diariamente durante 4 días, el análisis de IFA de núcleos tumorales recolectados 4 horas después de la administración de la dosis final de crizotinib reveló una disminución significativa y dependiente de la dosis en el área positiva para pY1235MET por célula, sin cambios significativos en los niveles de MET total (Fig. 2A-C). Los efectos farmacodinámicos de crizotinib sobre los niveles de activación de MET, medidos por el IFA de pY1235MET, fueron concordantes con los medidos utilizando el ELISA previamente validado pY1234/1235MET/MET con muestras de los mismos tumores (Spearman r = 0,93; P < 0,0001; Fig. 2D), lo que demuestra la precisión del IFA en la medición de la farmacodinámica de la activación de MET. Curiosamente, las respuestas farmacodinámicas dependientes de la dosis del biomarcador pY1235MET en el modelo SNU-5 correspondieron a las respuestas dependientes de la dosis en el crecimiento tumoral observadas previamente en otro modelo de carcinoma gástrico amplificado de MET y dependiente de MET: GTL-16, en un estudio anterior ^[11], lo que destaca la capacidad de este ensayo para medir cambios biológicamente relevantes en la activación de MET.

A, Secciones de microarrays de tejido de modelos xenógenos SNU-5 tratados con vehículo o las dosis indicadas de crizotinib (QD × 4, vía oral); los núcleos tumorales se recolectaron 4 horas después de la administración de la dosis final y se congelaron rápidamente. Las secciones de tejido FFPE se tiñeron con DAPI, anticuerpo anti-pY1235MET conjugado con DIG (clon 23111 ^[11]) seguido de anticuerpo secundario anti-DIG y anticuerpo anti-MET MET4 conjugado con AF647 (clon 8G6) ^[27]. Se muestran imágenes de núcleos tumorales de cada uno de los 4 animales en cada grupo de tratamiento. B, Imágenes enmascaradas de cada tumor, que muestran MET total (rojo) y pY1235MET (verde), para el análisis cuantitativo utilizando Definiens Tissue Studio. C, Cuantificación de pY1235MET (verde) y MET total (magenta) para las imágenes de IFA mostradas anteriormente. Cada punto representa una medición de un área diferente de una muestra de biopsia de un núcleo tumoral único; dentro de cada grupo, los puntos con el mismo símbolo indican los núcleos recolectados del mismo animal. Las líneas horizontales indican la media y la desviación estándar para cada grupo, y los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (****P < 0,0001; n = 4 animales y 1-3 núcleos/animal por grupo). D, Los cambios farmacodinámicos inducidos por crizotinib medidos utilizando un ensayo ELISA previamente validado ^[11] proporcionan una validación ortogonal de las mediciones de pY1235MET basadas en IFA. Cada punto representa el efecto farmacodinámico sobre la activación de MET medido por IFA (pY1235MET) y ELISA (relación pY1234/1235MET/MET total) para un solo tumor SNU-5 del grupo de tratamiento indicado; las mediciones se muestran como un cambio porcentual con respecto a la media del vehículo (es decir, 100 * [valor de la muestra - media del vehículo] / media del vehículo). Los datos de ELISA se informaron previamente ^[11]. Se muestra el coeficiente de correlación de Spearman y el valor de P correspondiente.

La idoneidad para el propósito del IFA de pY1235MET se demostró en un estudio de xenoinjerto tumoral SNU-5 diseñado para simular lo más fielmente posible una aplicación clínica del ensayo. Los ratones que albergaban tumores SNU-5 fueron tratados con el inhibidor de VEGFR pazopanib, el supuesto inhibidor de MET tivantinib o la combinación de pazopanib y tivantinib. Se sabe que la inhibición de VEGFR produce un aumento compensatorio en la señalización de MET ^[34], y nuestros resultados previamente publicados de ELISA de MET fosforilado mostraron que 8 días de tratamiento con pazopanib indujeron un aumento significativo en pY1234/1235MET/MET en relación con el tratamiento con vehículo en el modelo de xenoinjerto SNU-5, lo que se atenuó con el cotratamiento con el inhibidor de MET tivantinib ^[11]. El análisis de IFA de los mismos tumores SNU-5 que se analizaron previamente mediante ELISA demostró una tendencia similar: el tratamiento con pazopanib produjo un aumento significativo en la relación pY1235MET/MET en relación con el tratamiento con vehículo, mientras que el tratamiento con la combinación de pazopanib y tivantinib (con tivantinib administrado una o dos veces al día) produjo una disminución significativa en pY1235MET/MET en relación con el tratamiento con pazopanib como agente único (Fig. 3A-B). Estos cambios inducidos por pazopanib y la combinación también se reflejaron en las mediciones absolutas de pY1235MET, sin normalización a los niveles de MET total (Fig. S2A-B). El análisis de IFA de MET fosforilado también demostró un aumento similar inducido por pazopanib en pY1235MET para otro modelo de carcinoma gástrico amplificado de MET, MKN45 (Fig. S2C-D).

Los animales fueron tratados durante 8 días con vehículo (QD), tivantinib (200 mg/kg QD), pazopanib (100 mg/kg QD) o una combinación de pazopanib (100 mg/kg QD) con 200 mg/kg QD de tivantinib o 200 mg/kg dos veces al día (BID) de tivantinib (n = 4-6 animales por grupo de tratamiento); las muestras de biopsia del núcleo tumoral se recolectaron 4 horas después de la administración de la dosis final y se congelaron rápidamente. A, Imágenes representativas del tejido tumoral de cada grupo de tratamiento, que muestran la tinción para pY1235MET (rojo), MET total (verde) y DAPI (azul). MET total se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón AF546-conjugado MET4 (clon 8G6). B, Cuantificación basada en IFA multiplex de la relación pY1235MET/MET total después del tratamiento. Las líneas horizontales indican la media y la desviación estándar para cada grupo, y los asteriscos indican diferencias significativas entre el grupo tratado con pazopanib y los grupos tratados con vehículo y combinación (*P < 0,05, **P < 0,01).

Dado que la señalización canónica de MET es biológicamente importante mediante MET localizado en la membrana plasmática, a continuación, buscamos aplicar el IFA de pY1235MET a la medición de MET activado en la membrana plasmática. Con este fin, desarrollamos un IFA multiplex utilizando anticuerpos contra MET total, pY1235MET y la subunidad α1 del marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa y evaluamos simultáneamente los 3 analitos en los gránulos celulares de las líneas celulares SNU-5, HT29 y MDA-MB-231 (Fig. 4A). El software Definiens Tissue Studio Developer se utilizó para crear una máscara de membrana plasmática utilizando el marcador de Na+/K+-ATPasa (Fig. 4B). La máscara de membrana plasmática se utilizó luego para calcular el área de membrana plasmática y el porcentaje de área de membrana positiva (% MAP) para cada uno de los otros marcadores: MET total, pY1235MET y MET total que está colocalizado con pY1235MET (es decir, MET+ y pY1235MET+ dual; Fig. 4C). Los valores de % MAP para MET total, pY1235MET y MET dual colocalizado + pY1235MET fueron los más altos en las células SNU-5, moderados en las células HT29 y cercanos a 0 en las células MDA-MB-231 (Fig. 4C), lo que corresponde a los niveles de expresión generales de estos analitos en las diferentes líneas celulares (como se muestra en las Fig. 1 y 2).

A, Imágenes representativas de los gránulos celulares SNU-5, HT29 y MDA-MB-231 teñidos con DAPI (azul) y para MET total (verde), pY1235MET (rojo) y el marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa (magenta). MET total se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón AF546-conjugado MET4 (clon 8G6). B, Imágenes de fluorescencia de alta magnificación (20X) que muestran la tinción para el marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa (izquierda), pY1235MET y MET total, así como imágenes correspondientes que muestran las regiones enmascaradas de la membrana plasmática (azul claro) con pY1235MET colocalizado (rojo) o MET total (verde), establecidas utilizando un algoritmo Definiens personalizado. C, Cuantificación de pY1235MET localizado en la membrana plasmática (rojo), MET total (verde) o MET dual colocalizado + pY1235MET (naranja) para cada línea celular, derivados de imágenes enmascaradas de la membrana plasmática. Se muestran los valores medios del porcentaje de área de membrana positiva (% MAP) (± desviaciones estándar) (n = 3 gránulos celulares por modelo y 3 campos de imagen por gránulo celular).

Para demostrar la idoneidad clínica del IFA de pY1235MET que incorpora un marcador de membrana plasmática, a continuación, medimos los niveles de MET total y pY1235MET localizados en la membrana en muestras de biopsia de núcleos pretratamiento obtenidas de pacientes con carcinomas avanzados ^[12]. Medimos niveles medios altos de MET total asociado a la membrana plasmática en 2 pacientes con carcinomas de ovario y esófago (46,9 % MAP y 44,0 % MAP, respectivamente), mientras que un tercer paciente con un tumor de histología desconocida tenía un nivel más modesto (22,3 %; Fig. 5A-C). El caso de carcinoma de ovario tenía un nivel medio de % MAP de pY1235MET relativamente más alto (26,2 %) en relación con los casos de carcinoma de esófago (5,8 %) y histología desconocida (1,8 %). En consecuencia, los valores de % MAP para MET dual colocalizado y pY1235MET fueron los más altos en el caso de carcinoma de ovario (20,1 %), seguidos de los casos de carcinoma de esófago y histología desconocida (5,2 % y 1,3 %, respectivamente). Los experimentos de bloqueo de péptidos confirmaron la especificidad del antígeno de la tinción del anticuerpo pY1235MET de estas muestras clínicas (Fig. S3A). En conjunto, estos datos confirman que este IFA multiplex de pY1235MET puede detectar y cuantificar las diferencias en los niveles de MET total localizado en la membrana plasmática, pY1235MET y MET dual colocalizado y pY1235MET en muestras de biopsia clínicas.

A, Tumores de pacientes teñidos con DAPI (azul) y para MET total (verde), pY1235MET (rojo) y el marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa (magenta). MET total se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón AF546-conjugado MET4 (clon 8G6). Se anotan las histologías tumorales; “desconocido” indica un paciente con carcinoma de origen primario desconocido. B, Imágenes de fluorescencia de alta magnificación que muestran la tinción para el marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa (izquierda), pY1235MET y MET total, y las imágenes enmascaradas correspondientes que muestran las regiones de MET dual colocalizado en la membrana plasmática (dorado) dentro de la máscara de membrana plasmática (azul claro) establecidas utilizando un algoritmo Definiens personalizado. C, Cuantificación basada en Definiens del área de membrana positiva para pY1235MET (arriba, rojo), MET total (medio, verde) o MET dual colocalizado y pY1235MET (abajo, naranja). Se muestran los valores medios de % MAP (n = 5-20 campos de imagen por grupo).

La localización nuclear de la proteína MET de longitud completa y de los fragmentos C-terminales se ha demostrado que ocurre en varios tipos diferentes de células tumorales y también en respuesta a cambios ambientales, como la disminución de la densidad celular y el pH intracelular o el aumento de la señalización de HGF ^[19,35]. Para medir MET nuclear y pY1235MET utilizando la inmunofluorescencia multiplexa (IFA), enmascaramos el área nuclear utilizando la señal de fluorescencia de DAPI y luego cuantificamos MET total y pY1235MET dentro de esa máscara nuclear para calcular los respectivos valores porcentuales del área nuclear positiva (% NAP). En un estudio preclínico de adecuación para el propósito en NSCLC H596, en ratones portadores de tumores con genotipo salvaje SCID o con inserción homozigótica del gen humano HGF (hHGFki/ki) ^[29], los núcleos de las células tumorales tanto de los ratones SCID de genotipo salvaje como de los ratones hHGFki/ki fueron positivos para pY1235MET, según lo determinado por IFA (Fig. 6A-B). Sin embargo, en comparación con los ratones SCID de genotipo salvaje, los tumores H596 de los ratones hHGFki/ki exhibieron niveles significativamente más altos de % NAP de pY1235MET (31,4% frente a 60,2%; Fig. 6C). Los datos de bloqueo con péptidos confirmaron la especificidad del anticuerpo pY1235MET para la detección de MET activado nuclear (Fig. S3B del material suplementario). También evaluamos la expresión nuclear de pY1235MET en 3 muestras de biopsia obtenidas de un nódulo tumoral resecado en un paciente con carcinoma papilar renal hereditario (HPRC) y encontramos que las 3 muestras eran evaluables y positivas para pY1235MET nuclear (Fig. 7A-B). Dentro de estas muestras, muchos de los núcleos que presentaban una fuerte tinción de pY1235MET no parecían ser positivos para la tinción de MET total utilizando el anticuerpo D1C2 dirigido al C-terminal, lo que sugiere que el fragmento(s) de pY1235MET localizado(s) en el núcleo carece(n) del epítopo C-terminal reconocido por el anticuerpo D1C2 (Fig. 7A); estos resultados son consistentes con informes previos de un fragmento de MET proapoptótico de 40 kDa (“p40MET”) que se genera mediante la escisión por caspasas y que consiste en los residuos 1000-1374 de MET ^[36], manteniendo así el sitio de fosforilación NLS y Y1235 de MET, al tiempo que carece de los residuos C-terminales más distales que presumiblemente son reconocidos por D1C2. Se observó heterogeneidad intratumoral, con niveles variables de % NAP de pY1235MET en las 3 regiones tumorales: 17,1%, 2,4% y 17,9%, respectivamente (Fig. 7B). En conjunto, estos datos indican que esta IFA multiplexa de pY1235MET se puede utilizar para detectar y cuantificar la expresión nuclear de pY1235MET en muestras tumorales clínicas y preclínicas.

Los tumores de NSCLC H596 se obtuvieron de ratones SCID de genotipo salvaje o de ratones con inserción homozigótica del gen hHGF (hHGFki/ki) 33 días después de la implantación del tumor (mediante inyección subcutánea de células tumorales), y se detectaron niveles elevados de hHGF en el plasma de los ratones hHGFki/ki portadores de tumores, como se describió anteriormente ^[29]. A, Imágenes representativas de inmunofluorescencia y las imágenes correspondientes enmascaradas que muestran la expresión de pY1235MET en tumores H596 de ratones SCID de genotipo salvaje o hHGFki/ki. Las secciones de tejido FFPE se evaluaron mediante inmunofluorescencia después de la tinción con DAPI (azul), anticuerpo anti-pY1235MET conjugado con AF546 (verde) y anticuerpo anti-MET MET4 conjugado con AF647 (rosa); también se muestran las imágenes generadas por Definiens de las máscaras de pY1235MET (rojo). B, Imágenes representativas de inmunofluorescencia confocal de alta magnificación de la expresión de pY1235MET en tumores H596 de ratones SCID de genotipo salvaje o hHGFki/ki, que muestran la localización nuclear (azul) de pY1235MET (verde) y MET total (rojo). C, Cuantificación de la tinción nuclear de pY1235MET, expresada como el porcentaje del área transversal nuclear teñida con DAPI positiva para pY1235MET (% NAP). Las líneas horizontales indican las medias y las desviaciones estándar; cada punto representa un animal individual (n = 5-6 animales por grupo).

A, Imágenes representativas de inmunofluorescencia (aumento de 40X) de secciones de biopsia tumoral FFPE teñidas con DAPI (azul) o anticuerpos contra pY1235MET (verde) o MET total (magenta), que demuestran la presencia de pY1235MET localizado en el núcleo en tumores humanos de HPRC. MET total se detectó utilizando el anticuerpo anti-MET MET4 conjugado con AF647. Las 3 regiones tumorales que se muestran representan 3 núcleos de biopsia tumoral independientes tomados de la misma lesión en un solo paciente. B, Cuantificación de la tinción nuclear de pY1235MET. Las líneas horizontales indican las medias y las desviaciones estándar de los análisis de 3-4 ROI por región.

Las aberraciones genéticas de MET han demostrado tener valor pronóstico en pacientes con NSCLC y carcinoma colorrectal (CRC), y la amplificación de MET y las mutaciones específicas que activan MET son marcadores predictivos de la respuesta clínica a las terapias dirigidas a MET en estos tipos de tumores ^[37,38]. Sin embargo, la sobreexpresión de MET no ha sido consistentemente predictiva de la respuesta a dichas terapias en los múltiples estudios clínicos que han empleado ensayos de inmunohistoquímica (IHQ) diagnóstica para evaluar cualitativamente la expresión de MET ^[37-39]. Por lo tanto, un ensayo clínico cuantitativo que mida directamente los niveles de activación de MET, en lugar de medir la expresión total de MET, puede ser más útil para identificar tumores que utilizan la señalización de MET. Como primer paso hacia la aplicación de la IFA multiplexa de pY1235MET para comprender la relación entre MET total, pY1235MET y la respuesta a los agentes dirigidos a MET, evaluamos la prevalencia y la magnitud de MET y su forma activada pY1235 en casos de NSCLC y CRC en arreglos de tejidos. El área del marcador de MET total en los 10 tumores de pacientes con NSCLC que se evaluaron no siempre correspondió al área del marcador de pY1235MET dentro de los mismos tumores; de hecho, los resultados del ensayo de las áreas del marcador de pY1235MET generalmente fueron iguales o superaron (en algunos casos, sustancialmente) los resultados del ensayo de las áreas de MET total, con niveles medios de pY1235MET y MET total que oscilaron entre 0,5 y 138,3 μm2/célula y entre 0,2 y 57,1 μm2/célula, respectivamente (Fig. 8A-B). En los 57 tumores de pacientes con CRC examinados, también observamos heterogeneidad en los valores relativos del área del marcador/célula para pY1235MET y MET total, con niveles medios de pY1235MET y MET total que oscilaron entre 0,3 y 123,6 μm2/célula y entre 0,01 y 151,7 μm2/célula, respectivamente (Fig. 9A-C). Si bien el área del marcador por célula para algunos especímenes fue mayor para pY1235MET en comparación con MET total, lo contrario fue cierto para otros especímenes, y algunos especímenes tuvieron áreas de marcador/célula similares para pY1235MET y MET total. Además, el nivel de pY1235MET tumoral no se asoció con la etapa de la enfermedad del CRC (Fig. 9B-C). Dado que no se dispuso de información sobre el tratamiento y la respuesta del paciente para estos especímenes de arreglos de tejidos tumorales, los análisis futuros de los niveles de MET total y pY1235MET en tejido de biopsia tumoral de pacientes tratados con agentes específicos dirigidos a MET, y con datos de perfil molecular tumoral y respuesta clínica de referencia, serán fundamentales para definir el valor predictivo potencial de las mediciones de la IFA de pY1235MET en estudios clínicos.

A, Imágenes de inmunofluorescencia de secciones representativas de biopsia de núcleos tumorales FFPE teñidas para MET total (verde), pY1235MET (dorado) o Na+/K+-ATPasa (magenta). MET total se detectó utilizando el anticuerpo anti-MET total D1C2 conjugado con AF488. Cada columna muestra un solo espécimen tumoral de un paciente único. B, Cuantificación del área del marcador positiva por célula para MET total y pY1235MET. Cada etiqueta del eje x representa un tumor único, y cada uno de los siguientes tumores fueron pares obtenidos de un paciente único: A1 y A2; B7 y B8; C5 y C6; C11 y C12; y E7 y E8. La etapa de la enfermedad para cada espécimen se indica en azul. Cada punto representa el valor para un ROI individual (n = 3 ROI por tumor); las líneas verticales indican las medias ± desviaciones estándar.

A, Imágenes de secciones representativas de biopsia de núcleos tumorales FFPE evaluadas por inmunofluorescencia para MET total (verde), pY1235MET (dorado) o Na+/K+-ATPasa (magenta). MET total se detectó utilizando el anticuerpo anti-MET total D1C2 conjugado con AF488. Cada columna muestra un espécimen tumoral único de un paciente único. B, Cuantificación del área del marcador positiva por célula para MET total y pY1235MET. Cada etiqueta del eje x representa un tumor único, y cada uno de los siguientes tumores fueron pares obtenidos de un paciente único: A1 y A2; A7 y A8; B5 y B6; B7 y B8; B11 y B12; y E11 y E12. La etapa de la enfermedad para cada espécimen se indica en azul. Cada punto representa el valor para un ROI individual (n = 3 ROI por tumor); las líneas verticales indican las medias ± desviaciones estándar. C, Área media del marcador positiva por célula para MET total y pY1235MET en todos los especímenes de arreglos de tejidos tumorales de CRC.

Las mediciones fiables y específicas de los niveles de activación de MET en el tejido tumoral, como indicador de la transducción de la señal de MET, pueden facilitar una mejor selección de pacientes para las terapias oncológicas dirigidas a MET, y la combinación de estas mediciones con información espacial subcelular detallada puede proporcionar claridad con respecto a las funciones biológicas de varias subpoblaciones de MET activado dentro de una célula tumoral. El ensayo de inmunofluorescencia de pY1235MET descrito aquí proporciona esta información deseada y utiliza solo un pequeño número de secciones de tejido de un solo núcleo de biopsia tumoral, lo que, para las IFA validadas previamente y adecuadas para su propósito, ha sido el número de secciones de biopsia que produce al menos 3000 células tumorales viables ^[40]. Esta IFA se basa en nuestro inmunoensayo sándwich basado en lisado tumoral previamente desarrollado para pY1234/1235MET ^[11], que carece de la información de localización subcelular mencionada y también consume un núcleo de biopsia completo. Es importante destacar que el uso en esta IFA de un anticuerpo que se une específicamente al C-terminal de MET permite medir la fosforilación de Y1235 tanto en MET de longitud completa como en los productos de escisión C-terminal resultante de la proteólisis durante la transducción de la señal, una característica única de esta IFA en relación con el inmunoensayo sándwich, que mide solo MET de longitud completa. Hemos demostrado aquí la especificidad de nuestro anticuerpo anti-pY1235MET en las mediciones basadas en microscopía, así como la concordancia entre los datos de la IFA de pY1235MET y el inmunoensayo sándwich previamente validado de pY1234/1235MET. Los procedimientos operativos estándar (POE) de recolección y procesamiento de muestras utilizados para esta IFA y para el inmunoensayo sándwich publicado anteriormente especifican tiempos de isquemia mínimos (