MSIanalyzer: la secuenciación dirigida con nanoporos permite el análisis a nivel de un solo nucleótido de la diversidad de la inestabilidad de los microsatélites.

Presentamos MSIanalyzer, una herramienta basada en el secuenciamiento dirigido que permite perfilar la inestabilidad de microsatélites (MSI) a nivel de unidad de repetición de un solo nucleótido, con anotación a nivel de base de las interrupciones no repetitivas cuando se pueden identificar. Utilizando el secuenciamiento de Oxford Nanopore de los cinco loci del panel de Bethesda, caracterizamos las distribuciones de unidades de repetición en líneas celulares deficientes en reparación de errores de emparejamiento (MMR) y en líneas celulares y muestras de tejido humano primario con MMR competente. Al operar sobre lecturas de secuenciación individuales, MSIanalyzer captura los motivos de repetición al tiempo que permite las interrupciones y aplica pruebas estadísticas conscientes de los grupos para las comparaciones entre muestras que tienen en cuenta la agrupación a nivel de lectura dentro de las muestras. Utilizando el ADN aislado de linfocitos humanos primarios como control, MSIanalyzer reveló pronunciadas contracciones de repetición específicas del locus y distribuciones alélicas más amplias en las líneas celulares de cáncer colorrectal deficientes en MMR (HCT15, HCT116), cambios intermedios en la distribución de la repetición en la línea celular de cáncer de próstata deficiente en MMR DU145 y perfiles estables en los controles competentes en MMR.

En todos los loci, múltiples alelos de unidades de repetición se encontraron con frecuencia dentro de muestras individuales, lo que destaca una importante heterogeneidad intra-muestral. En un análisis piloto de pares tumor-normal clínicos, la mayoría de los loci se clasificaron como inestables en un caso MSI-H, pero no en dos casos MSS, en línea con los resultados de un ensayo comercial de PCR fluorescente y electroforesis capilar para la detección de MSI. Las mezclas de ADN preparadas como modelo de contenido tumoral variable demostraron además la atenuación esperada de las señales asociadas con la MSI a medida que disminuye la fracción tumoral, al tiempo que permanecen detectables en múltiples loci en condiciones de bajo contenido tumoral (10%). En conjunto, estos resultados demuestran que MSIanalyzer detecta la diversidad de microsatélites a nivel de lectura y permite una caracterización cuantitativa a nivel de distribución de los patrones de MSI, proporcionando una base para los estudios mecanicistas de la inestabilidad de la repetición y la futura validación clínica.