Preactivación con citocinas y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC): una estrategia eficaz para potenciar las funciones efectoras de las células NK humanas frente a modelos tumorales tridimensionales.

Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que pertenecen a la familia de linfocitos innatos (ILC). En humanos, las células NK suelen representar entre el 5 y el 15% de los linfocitos circulantes en la sangre periférica y, en general, se identifican como linfocitos CD3−CD14−CD19− que expresan CD56. Una característica distintiva clave de las células NK es su capacidad para reconocer y eliminar rápidamente las células anormales, como las células infectadas por virus o las células tumorales, sin necesidad de sensibilización previa, a diferencia de las células T, que requieren una activación antigénica. La activación y las funciones efectoras de las células NK están estrictamente reguladas por el complejo equilibrio de las señales recibidas de los receptores activadores e inhibidores de la superficie celular (^[1], ^[2]).

Entre los receptores activadores, CD16a (FcγRIIIa) reconoce la porción cristalizable del fragmento (Fc) de los anticuerpos IgG. Este reconocimiento desencadena la activación de las células NK y la posterior eliminación de la célula diana en un proceso conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (^[3]). Una vez activadas, las células NK liberan rápidamente gránulos citolíticos que contienen perforina y granzimas para inducir la muerte de la célula diana. Este potente mecanismo se explota terapéuticamente, en particular mediante el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) para la terapia dirigida contra el cáncer (^[4], ^[5]). Un ejemplo clínicamente relevante es cetuximab, un mAb IgG1 que se dirige al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que se utiliza ampliamente en el tratamiento del cáncer colorrectal (CRC) y del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) (^[6], ^[7]).

Dado el papel crucial de las células NK en la vigilancia inmunitaria del cáncer y su inherente idoneidad para aplicaciones alogénicas "listas para usar", sin el riesgo de inducir la enfermedad de injerto contra huésped, las terapias basadas en células NK se están desarrollando actualmente y se están investigando en ensayos clínicos (^[1], ^[8]–^[10]). Algunas de estas estrategias terapéuticas tienen como objetivo aumentar la eficacia de las células NK transferidas de forma adoptiva. Los enfoques incluyen varias estrategias de estimulación con citocinas (como la interleucina (IL)-2/IL-15 o la expansión basada en células de soporte), la combinación con mAbs que explotan la ADCC como mecanismo de acción o con inhibidores de puntos de control inmunitario, y/o la ingeniería de células NK específicas para antígenos (^[1], ^[11]–^[19]). Entre estas, la transferencia adoptiva de células NK con memoria inducida por citocinas (CIML) ha surgido como una inmunoterapia prometedora para diferentes neoplasias (^[18], ^[20], ^[21]). Estas células se generan estimulando brevemente las células NK con una combinación de IL-12, IL-15 e IL-18 durante 16 a 18 horas, lo que da como resultado células NK con funciones efectoras mejoradas. Tras la eliminación de las citocinas y un período de reposo, las células conservan un estado de preparación mejorado, que se caracteriza por una mayor citotoxicidad, una producción de citocinas superior y una persistencia prolongada in vivo (^[22], ^[23]). Aunque la definición clásica de las células NK CIML requiere un período de reposo posterior, estas células preactivadas se infunden a menudo directamente en los pacientes en entornos clínicos y también se denominan células NK CIML (por ejemplo, NCT01898793, NCT02782546, NCT03068819, NCT04024761 y NCT04634435). Por lo tanto, en este estudio, utilizamos el término "pre-CIML" para referirnos a las células NK analizadas inmediatamente después del período de preactivación con citocinas de 16 a 18 horas, sin la fase de reposo adicional. Su aplicación ya está dando resultados favorables contra las neoplasias hematológicas, lo que demuestra que el impulso inicial de citocinas por sí solo es una estrategia clínica potente (^[18], ^[21]).

Aunque la transferencia adoptiva de células NK ha demostrado una eficacia sustancial en las neoplasias hematológicas, los datos preclínicos y clínicos indican que su eficacia en pacientes con tumores sólidos se ve obstaculizada por varios factores, incluido el microambiente tumoral inmunosupresor (TME), los mecanismos de evasión inmunitaria tumoral, la escasa infiltración de células NK en los sitios tumorales y la falta de modelos predictivos y fisiológicamente relevantes para el desarrollo de la terapia (^[24], ^[25]). Para comprender mejor la funcionalidad de las células NK en los tumores sólidos y diseñar terapias basadas en células NK mejoradas, se necesitan modelos in vitro más precisos que recapitulen el entorno tumoral. En este contexto, se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionales (3D), como los esferoides tumorales y los organoides tumorales. Los esferoides tumorales son modelos 3D ampliamente utilizados, sin andamio, formados por la agregación de líneas celulares cancerosas o células derivadas de pacientes. Estas estructuras se autoorganizan en arquitecturas similares a microtumores que imitan las características tumorales, como la hipoxia, la cohesión y la interacción entre células, y los gradientes de nutrientes (^[26], ^[27]). Por el contrario, los organoides tumorales son modelos 3D más complejos derivados de tejidos tumorales de pacientes que conservan las características histopatológicas, genéticas y fenotípicas clave del tumor original y son capaces de retener la heterogeneidad de las células tumorales en mayor medida (^[28], ^[29]).

Los avances recientes en la inmunoterapia basada en células NK han incorporado modelos tumorales 3D para investigar la actividad de las células NK en el cáncer de cuello uterino, el cáncer gástrico, el CRC y otros tumores sólidos (^[30]–^[33]). Sin embargo, la evaluación de las células NK CIML, solas o en combinación con mAbs como cetuximab, en el contexto de modelos tumorales 3D sigue siendo muy limitada. Para abordar esta brecha, investigamos las respuestas antitumorales de estas células NK en esferoides de cáncer colorrectal y de pulmón, así como en organoides de CRC derivados de pacientes. Evaluamos múltiples funciones de las células NK, incluida la desgranulación, la producción de interferón gamma (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), la citotoxicidad antitumoral y la infiltración tumoral. Nuestros hallazgos demuestran que las células NK pre-CIML muestran funciones efectoras mejoradas contra los modelos tumorales 3D. Además, los mAbs que desencadenan la ADCC, como cetuximab, potencian aún más la actividad de las células NK en estos sistemas. Este enfoque proporciona una comprensión más completa del comportamiento de las células NK en los tumores sólidos y destaca la relevancia traslacional de la preactivación con citocinas y las estrategias de mejora de la ADCC para mejorar las inmunoterapias basadas en células NK contra los tumores sólidos.

Materiales y métodos

Cultivos celulares A549 y HCT-116

La línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano A549 se cultivó en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Corning) suplementado con un 5% de suero fetal bovino (FBS, Gibco) inactivado por calor, un 1% de aminoácidos no esenciales de MEM (NEAA, Gibco) y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S, Gibco). Este medio de cultivo se denominará en lo sucesivo DMEM completo o cDMEM. Las líneas celulares de CRC de tipo salvaje HCT-116 y HCT-116 transfectadas con ZsGreen fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Julián Pardo (IIS Aragón) y se mantuvieron en las mismas condiciones. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2.

Aislamiento de células NK

Los concentrados de buffy coat de donantes sanos fueron proporcionados por el Biobanco Vasco (https://www.biobancovasco.bioef.eus/). Todos los donantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del País Vasco para la Investigación con Medicamentos (CEIm-E) (PI+CES-BIOEF 2020-10).

Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron de los concentrados de buffy coat mediante centrifugación de gradiente de densidad con Ficoll® Paque Plus (GE Healthcare), como se describió anteriormente (^[34]). Las PBMC aisladas se crioconservaron para su uso posterior (^[34]) o se procesaron inmediatamente para el aislamiento de células NK utilizando el kit de aislamiento de células NK humanas (Miltenyi Biotec). Todos los experimentos se realizaron con células NK purificadas (normalmente > 80% de células CD3−CD14−CD19−CD56+).

Las células NK purificadas se sembraron a 2 × 106 células/mL en placas de 6 pocillos en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con L-glutamina (Corning), un 10% de FBS inactivado por calor, un 1% de NEAA, un 1% de piruvato de sodio (Gibco) y un 1% de P/S (en lo sucesivo, medio RPMI completo o cRPMI). Las células se cultivaron durante la noche (16-18 horas) a 37 °C con 10 ng/mL de interleucina humana recombinante (rh) IL-12 (Miltenyi Biotec), 50 ng/mL de rhIL-15 (Miltenyi Biotec) y 50 ng/mL de rhIL-18 (MBL International Corporation), o en medio solo para obtener células NK pre-CIML o células NK de control, respectivamente. Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron tres veces con cRPMI y, posteriormente, se procesaron según los requisitos de cada ensayo de cocultivo (figura suplementaria en línea 1).

Generación de esferoides

La formación y la caracterización de esferoides se realizaron como se informó en (^[35]). Brevemente, entre 1000 y 10 000 células A549, HCT-116 o HCT-116-Green se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo con ultra bajo agarre (Corning) en 100 µL de cDMEM por pocillo. Las densidades de células por pocillo específicas de la línea celular se optimizaron para una formación eficiente de esferoides en función del ensayo experimental. Las placas se centrifugaron a 300 g durante 1 minuto para promover la agregación celular. Las líneas celulares A549 y HCT-116 generaron un esferoide maduro por pocillo en aproximadamente 48 horas, lo que se confirmó mediante microscopía. Los protocolos detallados para la optimización de la densidad de siembra celular, el análisis de la viabilidad y la tasa de crecimiento de los esferoides y las técnicas de cocultivo se describen en (^[35]).

Establecimiento y cultivo de organoides

Los organoides de CRC utilizados en este estudio se establecieron, secuenciaron y cultivaron como se describió anteriormente (^[36]). Brevemente, los organoides se establecieron a partir de tejidos tumorales frescos obtenidos de pacientes que proporcionaron un consentimiento informado por escrito, bajo las aprobaciones éticas REC 12-EE-0493 y 18-EE-0025 y, posteriormente, se almacenaron bajo la licencia HTA 12121. El ADN genómico de los organoides se secuenció en la Unidad de Secuenciación Avanzada del Instituto Francis Crick.

El medio de los organoides se preparó utilizando Ad-DF+++ como medio base (que consiste en Advanced DMEM/F-12 (Gibco) suplementado con un 1% de GlutaMAX (Gibco), un 1% de HEPES (Gibco) y un 1% de P/S), y añadiendo los siguientes componentes al medio base: 100 ng/mL de rh Noggin (Prepotech), 40% de suplemento de medio acondicionado R-Spondin-1 3dGRO (Merck), suplemento B-27™ (Gibco), 50 ng/mL de rh EGF (Stem Cell Technologies), 10 nM de prostaglandina E2 (Tocris Biosciences), 1,25 mM de N-acetil-L-cisteína, 10 mM de nicotinamida, 500 nM de inhibidor de TGF-β/ALK5 A83-01, 10 μM de inhibidor de p38 MAPK SB202190 y 10 nM de [Leu15]-Gastrina I humana (todos de Sigma-Aldrich).

Los organoides se incrustaron en una mezcla de 70% de Geltrex (Geltrex™ LDEV-free reduced growth factor basement membrane extract, Gibco) y 30% de medio de organoides, se sembraron en pequeñas gotas en placas de 6 pocillos y se dejaron durante 30 minutos a 37 °C y 5% de CO2. Después de la solidificación de las gotas, se añadió medio de organoides suplementado con 10 μM de inhibidor de Rock Y-27632 dihidrocloruro (Sigma-Aldrich). Los organoides se mantuvieron a 37 °C y 5% de CO2 y se pasaron cada 2 semanas sustituyendo el medio de cultivo por Ad-DF+++ frío para desprender las gotas de geltrex. El sobrenadante se recogió y se lavó por centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C. A continuación, se eliminó el sobrenadante y los organoides se incubaron con TrypLE Express (Gibco) durante 5-10 minutos a 37 °C para facilitar su disociación. Se detuvo la reacción añadiendo un 5% de FBS y, a continuación, se lavaron las muestras con Ad-DF+++. A continuación, tras una disociación mecánica por pipeteo, se lavaron y resuspendieron los organoides en medio fresco de 70% de Geltrex/30% de organoides. La suspensión se replantó en placas de 6 pocillos, dividiéndola en proporciones entre 1:3 y 1:6 en función de la tasa de crecimiento. Cuando fue necesario, los organoides se crioconservaron en Recovery™ Cell Culture Freezing Medium (Thermo Fisher Scientific) hasta su uso posterior.

Ensayo funcional de células NK

Para evaluar la desgranulación y la producción de citocinas de las células NK en respuesta a los modelos tumorales 3D, las células NK se cocultivaron con esferoides tumorales u organoides (figura suplementaria en línea 1). Se resuspendieron en cRPMI un número igual de células NK pre-CIML o de control y se añadieron a los cultivos de esferoides en placas de 96 pocillos de fondo ultra bajo en U a un volumen final de 200 µL por pocillo. Las relaciones efector:diana (E:T) se fijaron en 1:1, en función de la densidad inicial de siembra de células tumorales: 104 células viables por pocillo para A549 y 5 × 103 células viables por pocillo para las células HCT-116 de tipo salvaje.

Para el co-cultivo de células NK con organoides tumorales, primero se recogieron los organoides y una fracción de ellos se disoció en células individuales y se contó para estimar el contenido de células tumorales por organoide. Los organoides completos, que se estimó que contenían 2×10⁵ células, se resuspendieron en cRPMI y se añadieron por pocillo en una placa de 24 pocillos, previamente tratada con la solución de enjuague antiadherente (STEMCELL Technologies). A continuación, se añadió un número igual de células NK pre-CIML o de control viables en una proporción E:T de 2:1, en un volumen final de 500 µL de cRPMI por pocillo.

La citotoxicidad mediada por anticuerpos dependiente de células NK (ADCC) se indujo en los co-cultivos de células NK y esferoides, y en los co-cultivos de células NK y organoides, añadiendo 1 µg/mL de cetuximab (Erbitux 100 mg/20 mL, Merck) a los pocillos correspondientes. Se añadió anti-CD107a-FITC (clon REA792, Miltenyi Biotec) al inicio de los co-cultivos (0,4 μL/pocillo para esferoides, 2 μL/pocillo para organoides). Después de 1 hora, se añadieron 1 μL/mL de Golgi-Plug y 0,66 μL/mL de Golgi-Stop (ambos de BD Biosciences). El co-cultivo se mantuvo durante 16-18 horas adicionales (esferoides) o 4 horas (organoides), según la optimización previa y los protocolos publicados (^[35], ^[37]).

Al final del cultivo, todas las muestras se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante centrifugación a 300 g durante 5 minutos. Los co-cultivos de esferoides y sus controles de células NK solamente se digirieron con tripsina-EDTA (Gibco) durante 5-15 minutos hasta la disociación completa y se filtraron a través de filtros de malla de nailon de 35 µm. Los co-cultivos de organoides y sus controles de células NK solamente se filtraron directamente sin disociación enzimática (^[37]). Todas las muestras se lavaron con PBS y se tiñeron con el tinte LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 4 °C. Después de dos lavados con solución salina tamponada con PBS al 2,5% con albúmina bovina (BSA), las células se tiñeron con anti-CD3-BV510 (clon UCHT1), anti-CD14-BV510 (clon MφP9), anti-CD19-BV510 (clon SJ25C1) y anti-CD7-PE (clon M-T701), todos de BD Biosciences. Aunque CD56 es el marcador canónico de las células NK y se probó inicialmente, su expresión se perdió tras el protocolo de disociación de esferoides, que incluye la tripsinización. Por lo tanto, las células NK en estos ensayos de co-cultivo se definieron como CD3⁻CD14⁻CD19⁻CD7⁺, ya que CD7 se expresa constitutivamente en la línea celular NK y permite su identificación fiable, especialmente cuando se utilizan células NK purificadas (^[38]). A continuación, para la tinción intracelular, las muestras se lavaron dos veces en solución salina tamponada con PBS al 2,5% con BSA, se fijaron y se tiñeron con anti-IFN-γ-PE-Cy7 (clon B27, BD Biosciences) y anti-TNF-α-APC (clon mAb11, Biolegend) utilizando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), según las instrucciones del fabricante. Finalmente, las muestras se lavaron, se resuspendieron en 250 µL de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa X-20. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo 10.8.1.

Ensayo de eliminación de esferoides

Para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK contra los esferoides tumorales, se resuspendió un número igual de células NK de control o pre-CIML viables en cRPMI y se añadieron a los esferoides preformados en placas de 96 pocillos con fondo en U y ultra baja adherencia, a un volumen final de 200 µL por pocillo (Figura Suplementaria en línea 1). Para este ensayo, las proporciones E:T se fijaron en 5:1, basándose en las densidades iniciales de siembra de células tumorales: 5x10³ células viables/pocillo para A549 y 1,5×10³ células viables/pocillo para las células HCT-116 parentales. Al inicio del co-cultivo, se añadió la sonda CellEvent™ Caspase-3/7 Green (Thermo Fisher Scientific) a una dilución de 1:100, y se añadió 1 µg/mL de cetuximab a las condiciones correspondientes. Después de 24 horas, se adquirieron imágenes de luz transmitida y de fluorescencia utilizando un microscopio invertido Primovert (Zeiss) y se analizaron utilizando el software FIJI (ImageJ). La citotoxicidad se cuantificó en función de la intensidad de fluorescencia verde en una región de interés (ROI) estrictamente dentro del área del esferoide. Los pocillos que contenían esferoides tumorales solos se utilizaron para determinar la fluorescencia de fondo.

Ensayo de infiltración de células NK

Las células NK pre-CIML o de control se etiquetaron fluorescentemente con el tinte de proliferación celular eFluor™ 670 (eBioscience) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado con PBS, se co-cultivaron un número igual de células viables con esferoides HCT-116-Green en placas de 96 pocillos con fondo en U y ultra baja adherencia, a un volumen final de 200 µL por pocillo (Figura Suplementaria en línea 1). La proporción E:T se fijó en 3:1, basándose en una densidad inicial de siembra de células tumorales de 10³ células viables/pocillo. Se añadió cetuximab a 1 µg/mL a las condiciones designadas. Para cada donante y condición de células NK, se prepararon tres esferoides.

Después de 20 horas de co-cultivo, los esferoides se transfirieron a portaobjetos de cámara para la microscopía confocal. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 Airyscan equipado con un objetivo Plan-Apochromat 10x/0.45 M27. Se capturaron imágenes Z-stack en tres canales: GFP, Cy5 y luz transmitida con un tubo fotomultiplicador de luz transmitida (T-PMT), que normalmente abarcaba entre 120 y 180 µm de profundidad con intervalos de 9-10 µm, para garantizar una cobertura completa de las células NK infiltrantes. Se generaron proyecciones de intensidad máxima de los Z-stacks utilizando el software FIJI en los tres canales. La infiltración de células NK se evaluó cuantificando el área positiva para Cy5 dentro del perímetro del esferoide definido utilizando la proyección T-PMT. También se utilizó un sistema de puntuación cualitativa: las imágenes aleatorias fueron evaluadas de forma independiente por tres observadores cegados que asignaron puntuaciones de 1 a 3 basándose en la distribución de las células NK (1: infiltración pero confinada a una sola región; 2: infiltración en múltiples regiones con una distribución dispersa no uniforme; 3: distribución uniforme en todo el esferoide). A partir de las proyecciones T-PMT, las imágenes se aleatorizaron y se puntuaron en función del grado de disrupción del esferoide (1: esferoide con integridad preservada; 2: daño parcial; 3: pérdida de la integridad estructural), y se cuantificó la circularidad y el área del esferoide. A partir del canal GFP, se cuantificó el área positiva para GFP, la circularidad y la intensidad integrada total.

Ensayos de eliminación de organoides

Para evaluar la sensibilidad de los organoides tumorales a la eliminación mediada por células NK, se resuspendieron organoides completos, que se estimó que contenían 2×10⁴ células, en 100 µL de cRPMI y se añadieron por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U y ultra baja adherencia. Se añadieron un número igual de células NK de control o pre-CIML viables en cRPMI para alcanzar una proporción E:T de 5:1, en un volumen final de 200 µL por pocillo (Figura Suplementaria en línea 1). Cuando se indicó, se añadió 1 µg/mL de cetuximab a los co-cultivos. Se añadió 2 µL de la sonda CellEvent™ Caspase-3/7 Green a cada pocillo para controlar la muerte celular.

La imagen en tiempo real de los co-cultivos se realizó utilizando el sistema xCELLigence RTCA eSight (Agilent). Se capturaron imágenes de GFP y de campo claro cada 15 minutos durante la primera hora, y luego cada hora hasta 24 horas. Las imágenes y los vídeos se procesaron con el software RTCA eSight (Agilent) para cuantificar la intensidad integrada total verde (GRI × µm²/imagen) y el área total verde (µm²/imagen), ambos indicativos de la muerte celular en los co-cultivos. Los datos exportados se analizaron para evaluar la cinética de la muerte celular tumoral a lo largo del tiempo. Los indicadores cuantitativos de la eliminación mediada por células NK incluyeron el área bajo la curva (AUC) y la pendiente inicial del aumento en el área verde y en la intensidad de fluorescencia verde. Además, el área tumoral y la intensidad de fluorescencia se evaluaron específicamente en el punto temporal de 24 horas.

Análisis estadístico

Los programas GraphPad Prism 9.5.1 y SPICE v6.1 (Vaccine Research Center, NIAID) se utilizaron para la representación gráfica y el análisis estadístico. Se evaluó la distribución de los datos utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Dependiendo de la distribución y el diseño experimental, se emplearon la prueba t pareada, la prueba t no pareada o la prueba ANOVA de dos vías para las distribuciones paramétricas, y la prueba de rangos con signo de Wilcoxon para las distribuciones no paramétricas, según se especifica en cada leyenda de la figura. Las diferencias entre los gráficos circulares se determinaron con la prueba de permutación no paramétrica con 100.000 iteraciones. La significación estadística se definió como p