Superando las barreras inmunológicas mediadas por pequeñas vesículas extracelulares en el microambiente tumoral mediante péptidos pegilados que se pueden activar estratégicamente.

En comparación con la quimioterapia convencional, la inmunoterapia contra el cáncer ha inaugurado una nueva era en el tratamiento del cáncer, ofreciendo una vía prometedora para mejorar las respuestas clínicas duraderas y las tasas de supervivencia a largo plazo.^[1]–^[3] A pesar del éxito clínico de estrategias representativas como el bloqueo de puntos de control inmunitarios (ICB) y la transferencia adoptiva de células T (ACT), la falta de beneficios terapéuticos en una población general de pacientes representa una necesidad insatisfecha significativa.^[3]–^[7] Esta respuesta terapéutica heterogénea puede atribuirse principalmente al microambiente tumoral (TME), que se ha demostrado que dificulta la inmunidad antitumoral y promueve la resistencia a la inmunoterapia.^[6]

Entre los diversos mecanismos de evasión inmune dentro del TME, las pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tumor (TDE) se han identificado recientemente como contribuyentes significativos.^[8],^[9] Las pequeñas vesículas extracelulares (EV) son partículas encerradas en una bicapa lipídica que suelen tener entre 50 y 150 nm de diámetro.^[10],^[11] Las TDE, una población enriquecida en componentes asociados al tumor, median la comunicación intercelular y modulan el comportamiento de las células del estroma y del sistema inmunitario para facilitar la progresión tumoral y atenuar la inmunidad antitumoral.^[10],^[12]–^[14] Aunque las TDE son predominantemente inmunosupresoras en muchos modelos tumorales, también pueden realizar funciones inmunostimulantes dependiendo de su carga molecular, lo que refleja los roles inmunológicos heterogéneos de estas vesículas.^[15] En relación con el considerable impacto de las TDE en la resistencia a la inmunoterapia, se han desarrollado varias estrategias con el objetivo de inhibirlas.^[12],^[16],^[17] El enfoque predominante es interferir con la maquinaria de biogénesis, desde la formación de cuerpos multivesiculares hasta la liberación de pequeñas EV.^[18]–^[21] Sin embargo, estas estrategias encuentran varios obstáculos, incluyendo las inconsistencias funcionales de las proteínas involucradas en la biogénesis de pequeñas EV en diferentes especies celulares, la posible toxicidad para las células normales y la necesidad de la administración intracelular de inhibidores.

Para superar estas limitaciones, desarrollamos una estrategia innovadora que se dirige directamente a las TDE secretadas en un estudio previo.^[22] Esta estrategia aprovecha un péptido estructurado en alfa-hélice (AH-Pep) que reconoce y rompe específicamente las vesículas encerradas en una bicapa lipídica dentro del rango de 50 a 150 nm, basándose en la curvatura de la membrana.^[23] Cabe destacar que la actividad de disrupción de la membrana de AH-Pep se mejora en condiciones ligeramente ácidas, que son características del TME. Además, dado que se basa en las características estructurales de las pequeñas EV, este enfoque es independiente de las complejas vías de biogénesis de pequeñas EV, lo que implica una amplia aplicabilidad en diferentes tipos de cáncer. Inicialmente desarrollado para uso antiviral, se ha demostrado que AH-Pep exhibe una especificidad similar para las TDE y que induce su ruptura, evitando así que el PD-L1 exosómico (exoPD-L1) se una a PD-1 en las células T.^[12],^[22],^[24] Este bloqueo restauró la activación de las células T CD8⁺ y mejoró las respuestas inmunitarias antitumorales.

A pesar de estos resultados alentadores derivados del efecto sinérgico con los anticuerpos anti-PD-1, la administración intratumoral de este estudio de prueba de concepto justifica una mayor investigación debido a sus posibles limitaciones en la aplicabilidad clínica. En el presente estudio, se desarrolló una formulación de administración sistémica eficaz de AH-Pep mediante la aplicación de la técnica ampliamente utilizada de la PEGilación (modificación con polietilenglicol) en la administración de fármacos.^[25] La PEGilación se ha reconocido ampliamente por su capacidad para prolongar la vida media de los agentes terapéuticos, lo que ha dado como resultado la aprobación por la FDA de numerosos fármacos PEGilados.^[26],^[27] Sus perfiles de seguridad y eficacia están bien documentados, lo que la convierte en una herramienta valiosa para mejorar la estabilidad de los fármacos. Sin embargo, la PEGilación convencional también puede ocultar los sitios activos de los fármacos, lo que podría disminuir su eficacia terapéutica.^[28],^[29]

Aquí, diseñamos un péptido PEGilado estratégicamente activable (PEG-SA-Pep) introduciendo la capacidad de respuesta del TME a través de un enlazador sensible al pH,^[30] lo que permite la liberación activada del péptido activo en las lesiones tumorales (Fig. 1). Este diseño también se beneficia de las propiedades de disrupción de la membrana mejoradas por el ácido de AH-Pep, que aumentan la potencia de ruptura de las vesículas.^[22] Esta modificación garantiza que PEG-SA-Pep permanezca estable en condiciones fisiológicas, pero se active dentro del TME ligeramente ácido (pH 6,5-6,8), un enfoque designado como la estrategia ExoPERM (ruptura activada por el pH de las membranas de los exosomas). Al aprovechar la diferencia de pH entre las condiciones fisiológicas y del TME, la estrategia ExoPERM minimiza los efectos fuera del objetivo y permite la desintegración selectiva de las TDE. Además, al evitar las complejidades de la intervención intracelular y las vías de biogénesis de pequeñas EV, esta estrategia ofrece un método directo y potente para contrarrestar la inmunosupresión mediada por las TDE.

El presente estudio investigó la posible sinergia de la estrategia ExoPERM con los regímenes actuales de inmunoterapia contra el cáncer, centrándose en su capacidad para superar los desafíos inmunosupresores planteados por las TDE. Con este fin, se evalúa PEG-SA-Pep en combinación con dos inmunoterapias basadas en células T prominentes, a saber, ICB utilizando anticuerpos anti-PD-1 (aPD-1) y ACT. Estos hallazgos sugieren que PEG-SA-Pep restaura la función efectora de las células T CD8⁺ y mejora la infiltración de células T dentro del TME, complementando eficazmente la eficacia limitada de las monoterapia. En general, este estudio sugiere una nueva justificación terapéutica para abordar la inmunosupresión mediada por las TDE a través de la estrategia ExoPERM, lo que podría ampliar los beneficios terapéuticos para los pacientes con cánceres resistentes a la inmunoterapia.

Resultados

Síntesis y caracterización de PEG-SA-pep

Para permitir la administración sistémica de AH-Pep, diseñamos dos variantes PEGiladas: PEG-SA-Pep, una formulación sensible al pH diseñada para la liberación selectiva en el TME, y PEG-NA-Pep (péptido PEGilado no activable), que sirve como control no responsivo. PEG-SA-Pep incorpora un enlazador de anhídrido carboxi-dimetil maleico (CDM) entre la porción de PEG y el péptido (Fig. 1a del material suplementario). Este enlazador CDM sufre hidrólisis en condiciones ligeramente ácidas (pH 6,5-6,8) características del TME, lo que desencadena la liberación selectiva de AH-Pep. Por el contrario, PEG-NA-Pep presenta un enlace amida estable con PEG y carece de sensibilidad al pH. Esta estrategia de diseño permite un análisis comparativo de las formulaciones sensibles al pH frente a las no responsivas en un marco experimental controlado, lo que dilucida el impacto de la liberación de AH-Pep activada por el pH en la eficacia terapéutica.

La síntesis de PEG-SA-Pep se llevó a cabo en dos pasos. Primero, se sintetizó un PEG-CDM, que posteriormente se verificó utilizando la espectroscopia de RMN ¹H (Fig. 1b del material suplementario). Posteriormente, el PEG-CDM se conjugó con AH-Pep para obtener PEG-SA-Pep. La conjugación exitosa de los derivados de PEG y AH-Pep se evaluó utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas MALDI-TOF (Fig. 1c, d del material suplementario), lo que reveló que la PEGilación mejoró la hidrofilicidad y se produjo una conjugación eficaz. Para evaluar el impacto de la modificación de AH-Pep en su estructura secundaria, que es crucial para su actividad biológica, se realizó espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Los resultados revelaron que tanto PEG-NA-Pep como PEG-SA-Pep mantuvieron la característica conformación de alfa-hélice de AH-Pep desnudo (Fig. 1e del material suplementario), lo que respalda su aplicación terapéutica prevista para interrumpir las TDE.

Tras la caracterización estructural, evaluamos los perfiles de liberación dependientes del pH de AH-pep en condiciones fisiológicas (pH 7,4) y del TME (pH 6,5) (Fig. 2a). PEG-NA-Pep, con un enlazador amida estable, mostró una liberación mínima de péptido en todas las condiciones de pH probadas, lo que confirmó su naturaleza insensible al pH. En contraste, la dinámica de liberación de PEG-SA-Pep difería, alcanzando una liberación tres veces mayor a las 24 horas a un pH ácido de 6,5 y manteniendo una liberación insignificante a un pH fisiológico de 7,4. Para verificar aún más la especificidad química del escisión del enlazador, realizamos un análisis HPLC, que confirmó que el escisión del enlazador SA se produce selectivamente en condiciones ácidas que imitan el TME (Fig. 2 del material suplementario). Este perfil de liberación sensible al pH, junto con la estructura de alfa-hélice conservada de AH-Pep, respalda la idoneidad de PEG-SA-Pep para la intervención terapéutica dirigida dentro del TME.

Disrupción sensible al pH in vitro de las TDE y restauración de la función de las células T

Tras su caracterización fisicoquímica, evaluamos a continuación la capacidad de PEG-SA-Pep para contrarrestar la inmunosupresión mediada por las TDE in vitro. Las TDE se aislaron del sobrenadante de cultivo de las células de melanoma murino B16F10 y posteriormente se utilizaron para ensayos funcionales in vitro. El análisis de seguimiento de partículas (NTA) reveló un diámetro medio de partícula de aproximadamente 147 nm, y la tinción de Western confirmó la presencia de marcadores de exosomas, como CD9, junto con PD-L1 en las vesículas aisladas (Fig. 3a, b del material suplementario).

Como se muestra en la Fig. 2b, según lo medido por NTA, PEG-SA-Pep interrumpió significativamente las TDE en condiciones ligeramente ácidas (pH 6,5), lo que confirma que su diseño sensible al pH permite una liberación eficaz de la carga útil. Este comportamiento se asemeja al de AH-Pep desnudo, que redujo la concentración de TDE en aproximadamente un 50 % a pH fisiológico y exhibió una mayor interrupción a pH ácido, probablemente debido a una mayor interacción hidrofóbica con las membranas de las TDE. En contraste, PEG-NA-Pep, que carece de sensibilidad al pH, indujo una interrupción mínima de las TDE sin una diferencia significativa entre las condiciones de pH, probablemente porque el impedimento estérico del PEG impide las interacciones péptido-TDE. Además, las imágenes representativas de NTA revelaron la agregación de vesículas tras el tratamiento con AH-Pep, con PEG-SA-Pep que exhibió un patrón similar a pH ácido, lo que es consistente con la desestabilización de la membrana, un hallazgo corroborado aún más por la reducción significativa de las TDE intactas mediante el análisis de integridad de la vesícula basado en la fluorescencia (Fig. 4 y 5 del material suplementario). Cabe destacar que una caracterización adicional reveló que la actividad de disrupción de la membrana de AH-Pep es agotable tras la interacción (Fig. 6 del material suplementario), lo que subraya la necesidad de un sistema de administración capaz de garantizar la disponibilidad sostenida del péptido dentro del TME. Para excluir posibles daños en la membrana fuera del objetivo, confirmamos que, a pesar de su naturaleza de disrupción de la membrana inherente, los péptidos no causaron daños en la membrana plasmática ni interrupción lisosomal intracelular en las células normales, lo que subraya su selectividad dependiente de la curvatura y su citotoxicidad insignificante.

Dado que PEG-SA-Pep interrumpió eficazmente las TDE en condiciones ácidas, examinamos a continuación si esta desestabilización de la membrana podría afectar la función inmunosupresora de exoPD-L1. La unión de las TDE a PD-1 en las células T CD8⁺ a través de exoPD-L1 es un mecanismo de escape inmunitario bien establecido.^[12],^[24] ELISA confirmó que las TDE intactas promovieron de forma robusta la interacción PD-1/exoPD-L1, lo que se redujo significativamente con AH-Pep, lo que refleja las tendencias observadas en las mediciones de NTA (Fig. 2c, d). PEG-NA-Pep, que carece de capacidad de respuesta al pH, tuvo un efecto insignificante en la unión PD-1/exoPD-L1 independientemente de las condiciones de pH. En contraste, PEG-SA-Pep exhibió una actividad sensible al pH marcada, reduciendo sustancialmente la unión PD-1/exoPD-L1 en condiciones ligeramente ácidas (pH 6,5), pero mostrando efectos insignificantes a pH fisiológico (7,4), lo que es consistente con su actividad de disrupción de vesículas sensible al pH.

Para investigar más a fondo los efectos de la ruptura de los TDE en las interacciones de las células T, realizamos un análisis de microscopía confocal para visualizar y cuantificar la asociación entre los TDE y las células T CD8⁺ esplénicas (Fig. 2e, f). Los TDE intactos mostraron fuertes señales de fluorescencia en las células T, lo que indica una asociación vesicular sustancial. En línea con observaciones anteriores, el tratamiento con AH-Pep redujo notablemente la acumulación de TDE en diferentes condiciones de pH. En particular, en comparación con AH-Pep, PEG-SA-Pep redujo la acumulación de TDE a un pH de 6,5 a niveles similares a los de AH-Pep, mientras que los efectos de PEG-NA-Pep fueron mínimos independientemente del pH, lo que indica que la actividad dependía del pH. Esta reducción refleja tanto la desintegración de las vesículas como la alteración de la unión PD-1/exoPD-L1.

Existe una amplia evidencia que indica que las interacciones entre los TDE y las células T desempeñan un papel regulador en las funciones de las células T.^[31]–^[34] Para evaluar este efecto, analizamos la expresión de Ki-67 y granzima B (GrB) en las células T CD8⁺ mediante citometría de flujo (Fig. 2g, h). Los TDE suprimieron notablemente las proporciones de células T CD8⁺ Ki-67⁺ y GrB⁺ hasta aproximadamente el 10% y el 30%, respectivamente, lo que es consistente con un fenotipo de agotamiento funcional. Esta supresión se revirtió sustancialmente con AH-Pep desnudo, restaurando tanto la proliferación como la actividad efectora. En condiciones ligeramente ácidas, en comparación con el control, PEG-SA-Pep aumentó significativamente las proporciones de células T CD8⁺ Ki-67⁺ y GrB⁺, lo que resultó en aumentos de 3,4 y 1,8 veces, respectivamente. En contraste, PEG-NA-Pep tuvo efectos mínimos. Además, estos hallazgos se corroboraron mediante el análisis de citometría de flujo de la expresión de los principales marcadores de agotamiento PD-1 y gen activador de linfocitos-3 (LAG-3) en las células T CD8⁺ esplénicas (Fig. S7). Estos hallazgos sugieren que PEG-SA-Pep neutraliza el agotamiento de las células T CD8⁺ inducido por los TDE y que la alteración estructural de las vesículas y la reducción de la interacción con exoPD-L1 pueden contribuir a este efecto.

Farmacocinética y biodistribución in vivo de PEG-SA-Pep

Para garantizar una estabilidad suficiente en la circulación antes de la evaluación in vivo, primero evaluamos la estabilidad sérica de cada péptido durante 48 h (Fig. S8). El análisis por HPLC reveló que el AH-Pep no modificado se degradó rápidamente, mientras que los variantes pegiladas, incluido PEG-NA-Pep y PEG-SA-Pep, mantuvieron una estabilidad notable durante todo el período de incubación. Estos resultados demuestran que la pegilación confiere una protección sustancial contra la degradación proteolítica, minimizando así la pérdida prematura de PEG-SA-Pep durante la circulación sistémica. Motivados por estos perfiles de estabilidad favorables, examinamos a continuación la farmacocinética y la biodistribución in vivo tras la administración sistémica de los péptidos en ratones con tumores. Todos los péptidos probados mostraron una disminución dependiente del tiempo en la concentración plasmática (Fig. S9). Aunque la pegilación normalmente prolonga la circulación, en comparación con PEG-NA-Pep, PEG-SA-Pep disminuye más rápidamente, lo que puede atribuirse a una distribución tisular eficiente y a una activación selectiva del tumor. Esta observación está respaldada por los resultados del análisis de biodistribución en el tiempo, en el que PEG-SA-Pep se acumuló rápidamente en los tumores, alcanzando su punto máximo a las 6 h después de la inyección (Fig. 3a). En comparación con AH-Pep (58,74 ± 10,39) y PEG-NA-Pep (94,29 ± 10,55), PEG-SA-Pep exhibió un área bajo la curva (AUC) sustancialmente mayor para la acumulación tumoral (184,6 ± 12,4), lo que representa aumentos de 3,14 y 1,96 veces, respectivamente. Un análisis cuantitativo adicional de los tumores y los órganos principales a las 6 y 24 h después de la inyección reveló que AH-Pep se acumuló predominantemente en el hígado y los riñones, lo que sugiere una rápida eliminación (Fig. 3b, c). En contraste, la acumulación tumoral de PEG-SA-Pep se mantuvo en ambos puntos temporales, en línea con su distribución selectiva del tumor previamente observada. PEG-NA-Pep mostró niveles de acumulación tumoral comparables a los de AH-Pep, lo que sugiere que la pegilación por sí sola puede conferir un beneficio limitado en el direccionamiento tumoral en ausencia de una característica dependiente del pH. Este patrón puede reflejar una retención selectiva del tumor, posiblemente facilitada por la escisión dependiente del pH que facilita la persistencia del péptido dentro del microambiente tumoral (TME).

Animados por la alta acumulación tumoral in vivo de PEG-SA-Pep, investigamos a continuación su eficacia en la eliminación de los TDE in vivo (Fig. 3d). Con este fin, se administró por vía intravenosa a ratones portadores de tumores B16F10 AH-Pep (15 mg/kg), PEG-NA-Pep (15 mg/kg) o PEG-SA-Pep (5, 10 o 15 mg/kg) (Fig. 3e). Después de dos dosis, se cuantificaron los niveles de exoPD-L1 en plasma mediante ELISA (Fig. 3f). Como se esperaba, en comparación con los controles portadores de tumores tratados con PBS, los ratones sin tumor presentaron niveles más bajos de exoPD-L1 en plasma. Ni AH-Pep ni PEG-NA-Pep disminuyeron significativamente la expresión de exoPD-L1 en comparación con los controles de PBS, lo que indica una eficacia in vivo limitada. En contraste, el tratamiento con 10 mg/kg de PEG-SA-Pep condujo a una reducción dependiente de la dosis de los niveles de exoPD-L1. En la dosis más alta probada (15 mg/kg), en comparación con ningún tratamiento, el tratamiento con PEG-SA-Pep disminuyó el nivel de exoPD-L1 circulante a niveles comparables a los de los ratones sin tumor. Estos hallazgos sugieren que PEG-SA-Pep agota eficazmente los pequeños EVs inmunosupresores circulantes in vivo, probablemente debido a su mayor acumulación tumoral y su interacción eficiente con los TDE.

Eficacia terapéutica in vivo de PEG-SA-Pep en combinación con ICB

Habiendo establecido que PEG-SA-Pep logra una acumulación tumoral favorable y neutraliza selectivamente los pequeños EVs de forma dependiente del pH, investigamos a continuación si esta intervención dirigida podría superar la inmunosupresión mediada por los TDE y potenciar la eficacia de la terapia aPD-1. Realizamos estudios de eficacia antitumoral en ratones C57BL/6 portadores de melanoma B16F10 y administramos los tratamientos ya sea como monoterapia o en combinación con aPD-1 (Fig. 4a). Coherente con nuestra hipótesis, la monoterapia con PEG-SA-Pep, PEG-NA-Pep o AH-Pep desnudo no logró provocar una supresión tumoral significativa, lo que demuestra que la eliminación de los TDE por sí sola no es suficiente para un control eficaz del crecimiento tumoral (Fig. 4b, c). Este efecto terapéutico limitado probablemente refleja el direccionamiento preferencial de los péptidos hacia los pequeños EVs en lugar de las células tumorales directamente, como lo demuestra la mínima citotoxicidad observada en las células tumorales B16F10 y los fibroblastos NIH3T3 (Fig. S10).

En particular, se observó un notable efecto sinérgico cuando PEG-SA-Pep se coadministró con aPD-1. Esta combinación resultó en una profunda inhibición del crecimiento tumoral, superando significativamente la monoterapia con aPD-1 y todos los demás tratamientos combinados (Fig. 4b, c). En contraste, la combinación de aPD-1 con AH-Pep o PEG-NA-Pep no ofreció ningún beneficio terapéutico significativo en comparación con aPD-1 solo. Este resultado refleja la escasa acumulación tumoral preferencial observada tanto para AH-Pep desnudo como para PEG-NA-Pep, siendo esta última aún más comprometida por su escudo de PEG no escindible. Estos resultados subrayan que la escisión dependiente del pH y la posterior alteración de los TDE son fundamentales para potenciar la ICB. La eficacia superior del régimen de PEG-SA-Pep + aPD-1 se vio respaldada aún más por una reducción sustancial de los pesos y tamaños de los tumores extirpados al final del experimento (día 20 después de la inoculación; Fig. 4d, e). Afortunadamente, no se observó toxicidad sistémica significativa en ninguno de los grupos de tratamiento, como lo reflejan los pesos corporales y el análisis histológico de los órganos principales (Fig. S11). Además, aunque en comparación con el tratamiento de control, el tratamiento con PEG-SA-Pep atenuó notablemente la correlación entre el nivel de PD-L1 exosomal y la carga tumoral, la concentración total de EVs en plasma disminuyó solo modestamente (Fig. S12 y S13). Esta depleción selectiva, en la que los marcadores específicos del tumor se reducen significativamente mientras que el grupo total de EVs se conserva sustancialmente, sugiere que PEG-SA-pep tiene efectos secundarios mínimos.

Para investigar los mecanismos inmunitarios responsables de este efecto sinérgico, analizamos el paisaje inmunitario tumoral. El análisis de citometría de flujo de los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) reveló que, en comparación con la monoterapia con aPD-1, la combinación de PEG-SA-Pep + aPD-1 condujo a un aumento significativo de la frecuencia de linfocitos T citotóxicos CD8⁺ entre las células inmunitarias CD45⁺, con un aumento de 1,84 veces (Fig. 4f). Simultáneamente, este régimen indujo una disminución significativa de la proporción de Tregs CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ inmunosupresores (Fig. 4g, Fig. S14) y alivió el fenotipo de agotamiento de las células T CD8⁺, caracterizado por la marcada disminución de la expresión de PD-1 y LAG-3 (Fig. S15), lo que indica una reprogramación fundamental del TME hacia un estado más inflamado y antitumoral. Para evaluar si esta reactivación inmunitaria local se asoció con una respuesta sistémica, evaluamos la capacidad proliferativa de los esplenocitos. Tras la estimulación ex vivo con el antígeno asociado al melanoma GP100, los esplenocitos del grupo PEG-SA-Pep + aPD-1 exhibieron una frecuencia notablemente mayor de células Ki-67⁺ proliferantes, lo que apoya la inducción de una inmunidad sistémica tumoral robusta (Fig. 4h). En conjunto, estos resultados sugieren que la alteración dependiente del pH de los TDE por PEG-SA-Pep, que es fundamental para nuestra estrategia ExoPERM, contribuye a aliviar la presión inmunosupresora dentro del TME, lo que a su vez provoca una potente respuesta antitumoral de las células T sistémicas que se sinergiza con la terapia aPD-1.

Eficacia terapéutica in vivo de PEG-SA-Pep en combinación con ACT

Si bien nuestros hallazgos demostraron que PEG-SA-Pep mejora las respuestas de las células T CD8⁺ cuando se combina con aPD-1, una inmunoterapia eficaz, particularmente en tumores sólidos, depende no solo de la activación de las células T, sino también de la infiltración exitosa de estas células en el tejido tumoral. La densa arquitectura estromal y la matriz fibrótica del TME a menudo sirven como barreras importantes para la penetración eficaz de las células T en el núcleo del tumor. Por lo tanto, buscamos determinar si PEG-SA-Pep también podría reducir estas limitaciones físicas. Con este fin, las células T CD8⁺ aisladas de ratones portadores de tumores CT26 se transfirieron de forma adoptiva a receptores portadores de tumores pretratados con PEG-SA-Pep, tras lo cual se evaluó posteriormente la distribución intratumoral de las células transferidas (Fig. 5a).

La inmunofluorescencia de secciones de tumores reveló una localización intratumoral diferencial de las células T transferidas marcadas con Dil en los diferentes grupos de tratamiento. En ratones tratados con PBS, AH-Pep o PEG-NA-Pep, las células T se acumularon principalmente en la periferia del tumor y mostraron una infiltración mínima en el núcleo del tumor (Fig. 5b, c). Esta distribución restringida probablemente contribuyó a la eficacia terapéutica limitada observada en estos grupos. En contraste, en comparación con los otros grupos, el grupo pretratado con PEG-SA-Pep exhibió una penetración de células T notablemente mejorada en las regiones más profundas del tumor, con una intensidad de fluorescencia intratumoral que aumentó más de tres veces. Estos hallazgos sugieren que PEG-SA-Pep no solo promueve el reclutamiento de células T, sino que también facilita la distribución espacial de las células T dentro del microambiente tumoral (TME), lo que podría mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT). Se ha informado que los exosomas derivados de células tumorales (TDE) activan los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), contribuyendo así al estroma fibrótico a través de la deposición de α-actina de músculo liso (α-SMA) y colágeno, lo que dificulta el acceso de las células T en los tumores sólidos.^[35]–^[38] Por lo tanto, hipotetizamos que la interrupción de los TDE mediada por PEG-SA-Pep podría atenuar la fibrosis impulsada por los CAF, lo que resultaría en un TME menos fibrótico que permitiría una mayor infiltración de células T. Para validar esta hipótesis, primero realizamos experimentos in vitro utilizando la línea de fibroblastos murinos NIH3T3. Como se esperaba, el tratamiento con TDE indujo una regulación al alza significativa de la α-SMA en las células NIH3T3, lo que fue consistente con la activación de los fibroblastos hacia un estado similar al de los miofibroblastos. Cabe destacar que esta activación fue efectivamente abolida por PEG-SA-Pep en condiciones ligeramente ácidas (pH 6.5), lo que confirmó que la interrupción de los TDE dependiente del pH previene la activación de los fibroblastos (Figura suplementaria 16). Corroborando estos hallazgos in vivo, en comparación con el tratamiento con PBS, el tratamiento con PEG-SA-Pep redujo los niveles de α-SMA en aproximadamente un 75%, mientras que los tratamientos con AH-Pep y PEG-NA-Pep no alteraron significativamente la expresión de α-SMA (Fig. 5d, e). Estos resultados indican que PEG-SA-Pep mitiga la fibrosis inducida por los TDE, aliviando así las barreras físicas dentro del TME.

Para evaluar aún más si la remodelación del TME mediada por PEG-SA-Pep podría mejorar la eficacia de la ACT, precondicionamos ratones portadores de tumores con PEG-SA-Pep antes de la transferencia adoptiva de células T CD8⁺ (Fig. 5f). A pesar de la coadministración de IL-12, la ACT por sí sola resultó en solo una modesta supresión del crecimiento tumoral, probablemente debido a una infiltración insuficiente de células T y a las persistentes barreras fibróticas típicas de los tumores sólidos (Fig. 5g, h). El pretratamiento con AH-Pep o PEG-NA-Pep tampoco mejoró los resultados terapéuticos, lo que resultó en un perfil de crecimiento tumoral comparable al de la ACT por sí sola. En contraste, el precondicionamiento con PEG-SA-Pep resultó en un beneficio terapéutico notable, con una progresión tumoral consistentemente retrasada en todos los ratones tratados. Esta mayor eficacia antitumoral probablemente se debe a la remodelación del estroma inducida por PEG-SA-Pep, lo que mejora la accesibilidad de los tejidos y promueve la acumulación intratumoral de las células T CD8⁺ transferidas, un efecto que puede verse aún más reforzado por la activación mediada por IL-12. Estos hallazgos respaldan el uso de PEG-SA-Pep como un enfoque de modulación del TME para aumentar la eficacia de la ACT.

Síntesis y caracterización de PEG-SA-pep

Para permitir la administración sistémica de AH-Pep, diseñamos dos variantes pegiladas: PEG-SA-Pep, una formulación sensible al pH diseñada para la liberación selectiva en el TME, y PEG-NA-Pep (péptido pegilado no activable), que sirve como control no sensible. PEG-SA-Pep incorpora un enlazador de anhídrido carboxi-dimetil maleico (CDM) entre la porción PEG y el péptido (Figura suplementaria 1a). Este enlazador CDM sufre hidrólisis en condiciones ligeramente ácidas (pH 6.5-6.8) características del TME, lo que desencadena la liberación selectiva de AH-Pep. Por el contrario, PEG-NA-Pep presenta un enlace amida estable con PEG y carece de sensibilidad al pH. Esta estrategia de diseño permite un análisis comparativo de las formulaciones sensibles al pH frente a las no sensibles en un marco experimental controlado, lo que dilucida el impacto de la liberación de AH-Pep activada por el pH en la eficacia terapéutica.

La síntesis de PEG-SA-Pep se llevó a cabo en dos pasos. Primero, se sintetizó un PEG-CDM, que posteriormente se verificó mediante espectroscopia de RMN ¹H (Figura suplementaria 1b). Posteriormente, el PEG-CDM se conjugó con AH-Pep para obtener PEG-SA-Pep. La conjugación exitosa de los derivados de PEG y AH-Pep se evaluó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas MALDI-TOF (Figura suplementaria 1c, d), lo que reveló que la pegilación mejoró la hidrofilicidad y se produjo una conjugación eficaz. Para evaluar el impacto de la modificación de AH-Pep en su estructura secundaria, que es crucial para su actividad biológica, se realizó espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Los resultados revelaron que tanto PEG-NA-Pep como PEG-SA-Pep mantuvieron la característica conformación de hélice alfa del AH-Pep desnudo (Figura suplementaria 1e), lo que respalda su aplicación terapéutica prevista para interrumpir los TDE.

Tras la caracterización estructural, evaluamos los perfiles de liberación dependientes del pH de AH-pep en condiciones fisiológicas (pH 7.4) y del TME (pH 6.5) (Fig. 2a). PEG-NA-Pep, con un enlazador amida estable, mostró una liberación mínima de péptido en todas las condiciones de pH probadas, lo que confirmó su naturaleza insensible al pH. En contraste, la dinámica de liberación de PEG-SA-Pep difería, alcanzando una liberación tres veces mayor a las 24 horas a un pH ácido de 6.5 y manteniendo una liberación insignificante a un pH fisiológico de 7.4. Para verificar aún más la especificidad química de la escisión del enlazador, realizamos un análisis de HPLC, que confirmó que la escisión del enlazador SA se produce selectivamente en condiciones ácidas que imitan el TME (Figura suplementaria 2). Este perfil de liberación sensible al pH, junto con la estructura de hélice alfa conservada de AH-Pep, respalda la idoneidad de PEG-SA-Pep para la intervención terapéutica dirigida dentro del TME.

Interrupción in vitro sensible al pH de los TDE y restauración de la función de las células T

Tras su caracterización fisicoquímica, evaluamos a continuación la capacidad de PEG-SA-Pep para contrarrestar la inmunosupresión mediada por los TDE in vitro. Los TDE se aislaron del sobrenadante de cultivo de las células de melanoma murino B16F10 y posteriormente se utilizaron para ensayos funcionales in vitro. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) reveló un diámetro medio de partícula de aproximadamente 147 nm, y el Western blot confirmó la presencia de marcadores exosómicos, como CD9, junto con PD-L1 en las vesículas aisladas (Figura suplementaria 3a, b).

Como se muestra en la Fig. 2b, según lo medido por NTA, PEG-SA-Pep interrumpió significativamente los TDE en condiciones ligeramente ácidas (pH 6.5), lo que confirmó que su diseño sensible al pH permite una liberación eficaz de la carga útil. Este comportamiento se asemeja al del AH-Pep desnudo, que redujo la concentración de TDE en aproximadamente un 50% a pH fisiológico y exhibió una mayor interrupción a pH ácido, probablemente debido a una mayor interacción hidrofóbica con las membranas de los TDE. En contraste, PEG-NA-Pep, que carece de sensibilidad al pH, indujo una interrupción mínima de los TDE sin una diferencia significativa entre las condiciones de pH, probablemente porque el impedimento estérico del PEG impide las interacciones péptido-TDE. Además, las imágenes representativas de NTA revelaron la agregación de vesículas tras el tratamiento con AH-Pep, con PEG-SA-Pep que exhibió un patrón similar a pH ácido, lo que es consistente con la desestabilización de la membrana, un hallazgo corroborado aún más por la reducción significativa de los TDE intactos mediante el análisis de integridad de las vesículas basado en la fluorescencia (Figura suplementaria 3c y 4). Cabe destacar que una caracterización adicional reveló que la actividad de interrupción de la membrana de AH-Pep es agotable tras la interacción (Figura suplementaria 5), lo que subraya la necesidad de un sistema de administración capaz de garantizar una disponibilidad sostenida del péptido dentro del TME. Para excluir posibles daños en la membrana fuera del objetivo, confirmamos que, a pesar de su naturaleza de interrupción de la membrana inherente, los péptidos no causaron daños en la membrana plasmática ni interrupción lisosómica intracelular en las células normales, lo que subraya su selectividad dependiente de la curvatura y su citotoxicidad insignificante (Figura suplementaria 6).

Dado que PEG-SA-Pep interrumpió eficazmente los TDE en condiciones ácidas, examinamos a continuación si esta desestabilización de la membrana podría afectar la función inmunosupresora de exoPD-L1. La unión de los TDE a PD-1 en las células T CD8⁺ a través de exoPD-L1 es un mecanismo de escape inmunitario bien establecido.^[12],^[24] ELISA confirmó que los TDE intactos promovieron robustamente la interacción PD-1/exoPD-L1, lo que se redujo significativamente con AH-Pep, lo que reflejó las tendencias observadas en las mediciones de NTA (Fig. 2c, d). PEG-NA-Pep, que carece de sensibilidad al pH, tuvo un efecto insignificante sobre la unión PD-1/exoPD-L1 independientemente del pH. En contraste, PEG-SA-Pep exhibió una marcada actividad selectiva del pH, reduciendo sustancialmente la unión PD-1/exoPD-L1 en condiciones ligeramente ácidas (pH 6.5) pero mostrando efectos insignificantes a pH fisiológico (7.4), lo que es consistente con su actividad de interrupción de vesículas selectiva del pH.

Para investigar aún más los efectos de la ruptura de los TDE en las interacciones de las células T, realizamos un análisis de microscopía confocal para visualizar y cuantificar la asociación entre los TDE y las células T CD8⁺ del bazo (Fig. 2e, f). Los TDE intactos exhibieron fuertes señales de fluorescencia en las células T, lo que indica una asociación vesicular sustancial. En línea con las observaciones anteriores, el tratamiento con AH-Pep redujo marcadamente la acumulación de TDE en todas las condiciones de pH. Cabe destacar que, en comparación con AH-Pep, PEG-SA-Pep redujo la acumulación de TDE a un pH de 6.5 a niveles similares a los de AH-Pep, mientras que los efectos de PEG-NA-Pep fueron mínimos independientemente del pH, lo que indica que la actividad fue sensible al pH. Esta reducción refleja tanto la desintegración de las vesículas como la interrupción de la unión PD-1/exoPD-L1.

Una amplia evidencia indica que las interacciones entre los TDE y las células T desempeñan un papel regulador en las funciones de las células T.^[31]–^[34] Para evaluar este efecto, analizamos la expresión de Ki-67 y granzima B (GrB) en las células T CD8⁺ mediante citometría de flujo (Fig. 2g, h). Los TDE suprimieron marcadamente las proporciones de células T CD8⁺ Ki-67⁺ y GrB⁺ a aproximadamente el 10% y el 30%, respectivamente, lo que es consistente con un fenotipo funcionalmente agotado. Esta supresión se revirtió sustancialmente con AH-Pep desnudo, lo que restauró tanto la proliferación como la actividad efectora. En condiciones ligeramente ácidas, en comparación con el control, PEG-SA-Pep aumentó significativamente las proporciones de células T CD8⁺ Ki-67⁺ y GrB⁺, lo que resultó en aumentos de 3,4 y 1,8 veces, respectivamente. En contraste, PEG-NA-Pep tuvo efectos mínimos. Además, estos hallazgos fueron corroborados por el análisis de citometría de flujo de la expresión de los principales marcadores de agotamiento PD-1 y gen activador de linfocitos-3 (LAG-3) en las células T CD8⁺ del bazo (Figura suplementaria 7). Estos hallazgos sugieren que PEG-SA-Pep neutraliza el agotamiento de las células T CD8⁺ inducido por los TDE y que la interrupción estructural de las vesículas y la reducción de la unión de exoPD-L1 pueden contribuir a este efecto.

Farmacocinética y biodistribución in vivo de PEG-SA-Pep

Para garantizar una estabilidad suficiente en circulación antes de la evaluación in vivo, primero evaluamos la estabilidad sérica de cada péptido durante 48 horas (Figura S8 en el material suplementario). El análisis por HPLC reveló que el AH-Pep no modificado se degradaba rápidamente, mientras que los variantes pegiladas, incluido el PEG-NA-Pep y el PEG-SA-Pep, mantuvieron una estabilidad notable durante todo el período de incubación. Estos resultados demuestran que la pegilación confiere una protección sustancial contra la degradación proteolítica, minimizando así la pérdida prematura de PEG-SA-Pep durante la circulación sistémica. Motivados por estos perfiles de estabilidad favorables, examinamos a continuación la farmacocinética in vivo y la biodistribución tras la administración sistémica de los péptidos en ratones con tumores. Todos los péptidos probados mostraron una disminución dependiente del tiempo en la concentración plasmática (Figura S9 en el material suplementario). Aunque la pegilación normalmente prolonga la circulación, en comparación con el PEG-NA-Pep, el PEG-SA-Pep disminuye más rápidamente, lo que puede atribuirse a una eficiente distribución tisular y a una activación selectiva en el tumor. Esta observación está respaldada por los resultados del análisis de biodistribución a lo largo del tiempo, en el que el PEG-SA-Pep se acumuló rápidamente en los tumores, alcanzando su punto máximo a las 6 horas después de la inyección (Figura 3a). En comparación con el AH-Pep (58,74 ± 10,39) y el PEG-NA-Pep (94,29 ± 10,55), el PEG-SA-Pep exhibió un área bajo la curva (AUC) sustancialmente mayor para la acumulación tumoral (184,6 ± 12,4), lo que representa aumentos de 3,14 y 1,96 veces, respectivamente. Un análisis cuantitativo adicional de los tumores y los órganos principales a las 6 y 24 horas después de la inyección reveló que el AH-Pep se acumulaba predominantemente en el hígado y los riñones, lo que sugiere una rápida eliminación (Figura 3b, c). En contraste, la acumulación tumoral de PEG-SA-Pep se mantuvo en ambos puntos temporales, en línea con su distribución selectiva en el tumor previamente observada. El PEG-NA-Pep mostró niveles de acumulación tumoral comparables a los del AH-Pep, lo que sugiere que la pegilación por sí sola puede conferir un beneficio limitado en el direccionamiento tumoral en ausencia de una característica de respuesta al pH. Este patrón puede reflejar una retención selectiva en el tumor, posiblemente facilitada por la escisión dependiente del pH que favorece la persistencia del péptido dentro del microambiente tumoral (TME).

Animados por la alta acumulación tumoral in vivo del PEG-SA-Pep, investigamos a continuación su eficacia en la eliminación de los TDE (exosomas derivados del tumor) in vivo (Figura 3d). Con este fin, se administró por vía intravenosa a ratones con tumores B16F10 AH-Pep (15 mg/kg), PEG-NA-Pep (15 mg/kg) o PEG-SA-Pep (5, 10 o 15 mg/kg) (Figura 3e). Después de dos dosis, los niveles plasmáticos de exoPD-L1 se cuantificaron mediante ELISA (Figura 3f). Como se esperaba, en comparación con los controles con tumores tratados con PBS, los ratones sin tumor presentaban niveles plasmáticos de exoPD-L1 más bajos. Ni el AH-Pep ni el PEG-NA-Pep disminuyeron significativamente la expresión de exoPD-L1 en comparación con los controles con PBS, lo que indica una eficacia in vivo limitada. En contraste, el tratamiento con 10 mg/kg de PEG-SA-Pep condujo a una reducción dependiente de la dosis de los niveles de exoPD-L1. En la dosis más alta probada (15 mg/kg), en comparación con ningún tratamiento, el tratamiento con PEG-SA-Pep disminuyó el nivel de exoPD-L1 circulante a niveles comparables a los de los ratones sin tumor. Estos hallazgos sugieren que el PEG-SA-Pep agota eficazmente los pequeños EVs inmunosupresores circulantes in vivo, probablemente debido a su mayor acumulación tumoral y a su interacción eficiente con los TDE.

Eficacia terapéutica in vivo del PEG-SA-Pep en combinación con ICB

Habiendo establecido que el PEG-SA-Pep logra una acumulación tumoral favorable y neutraliza selectivamente los pequeños EVs de forma dependiente del pH, investigamos a continuación si esta intervención dirigida podría superar la inmunosupresión mediada por los TDE y potenciar la eficacia de la terapia anti-PD-1 (aPD-1). Realizamos estudios de eficacia antitumoral en ratones C57BL/6 con melanoma B16F10 y administramos los tratamientos ya sea como monoterapia o en combinación con aPD-1 (Figura 4a). Coherente con nuestra hipótesis, la monoterapia con PEG-SA-Pep, PEG-NA-Pep o AH-Pep desnudo no logró provocar una supresión tumoral significativa, lo que demuestra que la eliminación de los TDE por sí sola no es suficiente para un control eficaz del crecimiento tumoral (Figura 4b, c). Este efecto terapéutico limitado probablemente refleja el direccionamiento preferencial de los péptidos hacia los pequeños EVs en lugar de las células tumorales directamente, como lo demuestra la mínima citotoxicidad observada en las células tumorales B16F10 y los fibroblastos NIH3T3 (Figura S10 en el material suplementario).

Notablemente, se observó un notable efecto sinérgico cuando el PEG-SA-Pep se coadministró con aPD-1. Esta combinación resultó en una profunda inhibición del crecimiento tumoral, superando significativamente la monoterapia con aPD-1 y todos los demás tratamientos combinados (Figura 4b, c). En contraste, la combinación de aPD-1 con AH-Pep o PEG-NA-Pep no ofreció ningún beneficio terapéutico significativo en comparación con la monoterapia con aPD-1. Este resultado refleja la escasa acumulación tumoral preferencial observada tanto para el AH-Pep desnudo como para el PEG-NA-Pep, siendo este último aún más afectado por su escudo de PEG no escindible. Estos resultados subrayan que la escisión dependiente del pH y la posterior interrupción de los TDE son fundamentales para potenciar la ICB. La eficacia superior del régimen de PEG-SA-Pep + aPD-1 se vio respaldada aún más por una reducción sustancial en el peso y el tamaño de los tumores extirpados al final del experimento (día 20 después de la inoculación; Figura 4d, e). Afortunadamente, no se observó toxicidad sistémica significativa en todos los grupos de tratamiento, como lo reflejan el peso corporal y el análisis histológico de los órganos principales (Figura S11 en el material suplementario). Además, aunque en comparación con el tratamiento de control, el tratamiento con PEG-SA-Pep atenuó notablemente la correlación entre el nivel de PD-L1 exosomal y la carga tumoral, la concentración total de EVs en el plasma disminuyó solo modestamente (Figuras S12 y S13 en el material suplementario). Esta depleción selectiva, en la que los marcadores específicos del tumor se reducen significativamente mientras que el conjunto total de EVs se conserva sustancialmente, sugiere que el PEG-SA-pep tiene efectos secundarios mínimos.

Para investigar los mecanismos inmunitarios responsables de este efecto sinérgico, analizamos el paisaje inmunitario tumoral. El análisis citométrico de flujo de los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) reveló que, en comparación con la monoterapia con aPD-1, la combinación de PEG-SA-Pep + aPD-1 condujo a un aumento significativo en la frecuencia de los linfocitos T citotóxicos CD8⁺ entre las células inmunitarias CD45⁺, con un aumento de 1,84 veces (Figura 4f). Simultáneamente, este régimen indujo una disminución significativa en la proporción de Tregs inmunosupresores CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ (Figura 4g, Figura S14 en el material suplementario) y alivió el fenotipo de agotamiento de los linfocitos T CD8⁺, caracterizado por la marcada disminución de la expresión de PD-1 y LAG-3 (Figura S15 en el material suplementario), lo que indica una reprogramación fundamental del TME hacia un estado más inflamado y antitumoral. Para evaluar si esta reactivación inmunitaria local estaba asociada con una respuesta sistémica, evaluamos la capacidad proliferativa de los esplenocitos. Tras la estimulación ex vivo con el antígeno asociado al melanoma GP100, los esplenocitos del grupo PEG-SA-Pep + aPD-1 exhibieron una frecuencia marcadamente mayor de células Ki-67⁺ proliferantes, lo que apoya la inducción de una inmunidad sistémica tumoral robusta (Figura 4h). En conjunto, estos resultados sugieren que la interrupción dependiente del pH de los TDE por el PEG-SA-Pep, que es fundamental para nuestra estrategia ExoPERM, contribuye a aliviar la presión inmunosupresora dentro del TME, lo que a su vez provoca una potente respuesta de células T antitumoral sistémica que se sinergiza con la terapia aPD-1.

Eficacia terapéutica in vivo del PEG-SA-Pep en combinación con ACT

Si bien nuestros hallazgos demostraron que el PEG-SA-Pep mejora las respuestas de las células T CD8⁺ cuando se combina con aPD-1, una inmunoterapia eficaz, particularmente en tumores sólidos, depende no solo de la activación de las células T, sino también de la infiltración exitosa de estas células en el tejido tumoral. La densa arquitectura estromal y la matriz fibrótica del TME a menudo sirven como barreras importantes para la penetración eficaz de las células T en el núcleo del tumor. Por lo tanto, buscamos determinar si el PEG-SA-Pep también podría reducir estas limitaciones físicas. Con este fin, las células T CD8⁺ aisladas de ratones con tumores CT26 se transfirieron de forma adoptiva en receptores con tumores pretratados con PEG-SA-Pep, tras lo cual se evaluó posteriormente la distribución intratumoral de las células transferidas (Figura 5a).

La imagen de inmunofluorescencia de las secciones de tumor reveló una localización intratumoral diferencial de las células T transferidas marcadas con Dil en los diferentes grupos de tratamiento. En los ratones tratados con PBS, AH-Pep o PEG-NA-Pep, las células T se acumularon principalmente en la periferia del tumor y mostraron una infiltración mínima en el núcleo del tumor (Figura 5b, c). Esta distribución restringida probablemente contribuyó a la eficacia terapéutica limitada observada en estos grupos. En contraste, en comparación con los otros grupos, el grupo pretratado con PEG-SA-Pep exhibió una penetración marcadamente mejorada de las células T en las regiones más profundas del tumor, con un aumento de la intensidad de fluorescencia intratumoral de más de tres veces. Estos hallazgos sugieren que el PEG-SA-Pep no solo promueve el reclutamiento de células T, sino que también facilita la distribución espacial de las células T dentro del TME, lo que podría mejorar la eficacia del ACT. Se ha informado que los TDE activan los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), contribuyendo así a la fibrosis del estroma a través de la deposición de α-actina de músculo liso (α-SMA) y colágeno, lo que dificulta el acceso de las células T en los tumores sólidos.^[35]–^[38] Por lo tanto, hipotetizamos que la interrupción de los TDE mediada por el PEG-SA-Pep puede atenuar la fibrosis impulsada por los CAF, lo que resulta en un TME menos fibrótico que permite una mayor infiltración de células T. Para validar esta hipótesis, primero realizamos experimentos in vitro utilizando la línea de fibroblastos murinos NIH3T3. Como se esperaba, el tratamiento con TDE indujo una robusta regulación al alza de α-SMA en las células NIH3T3, lo que fue consistente con la activación de los fibroblastos hacia un estado similar a los miofibroblastos. Notablemente, esta activación se abolió eficazmente mediante el PEG-SA-Pep en condiciones ligeramente ácidas (pH 6,5), lo que confirma que la interrupción dependiente del pH de los TDE previene la activación de los fibroblastos (Figura S16 en el material suplementario). Corroborando estos hallazgos in vivo, en comparación con el tratamiento con PBS, el tratamiento con PEG-SA-Pep redujo los niveles de α-SMA en aproximadamente un 75%, mientras que los tratamientos con AH-Pep y PEG-NA-Pep no alteraron significativamente la expresión de α-SMA (Figura 5d, e). Estos resultados indican que el PEG-SA-Pep mitiga la fibrosis inducida por los TDE, lo que a su vez alivia las barreras físicas dentro del TME.

Para evaluar aún más si la remodelación del TME mediada por el PEG-SA-Pep podría mejorar la eficacia del ACT, precondicionamos a los ratones con tumores con PEG-SA-Pep antes de la transferencia adoptiva de células T CD8⁺ (Figura 5f). A pesar de la coadministración de IL-12, el ACT solo resultó en una supresión modesta del crecimiento tumoral, probablemente debido a una infiltración insuficiente de células T y a las persistentes barreras fibróticas típicas de los tumores sólidos (Figura 5g, h). El pretratamiento con AH-Pep o PEG-NA-Pep tampoco mejoró los resultados terapéuticos, lo que resultó en un perfil de crecimiento tumoral comparable al del ACT solo. En contraste, el precondicionamiento con PEG-SA-Pep resultó en un beneficio terapéutico notable, con una progresión tumoral consistentemente retrasada en todos los ratones tratados. Esta mayor eficacia antitumoral probablemente se debe a la remodelación del estroma inducida por el PEG-SA-Pep, lo que mejora la accesibilidad de los tejidos y promueve la acumulación intratumoral de las células T CD8⁺ transferidas, un efecto que puede verse reforzado aún más por la activación mediada por IL-12. Estos hallazgos respaldan el uso de PEG-SA-Pep como un enfoque de modulación del TME para aumentar la eficacia del ACT.

Discusión

Los TDE (exosomas derivados de tumores) han surgido como actores clave en la inmunosupresión del cáncer, lo que ha llevado a la exploración exhaustiva de estrategias de inhibición de los pequeños exosomas.^[9],^[16],^[39] Los primeros esfuerzos se han centrado en impedir la biogénesis de los pequeños exosomas mediante diversas modalidades.^[19],^[24],^[40],^[41] Sin embargo, estos enfoques corren el riesgo de comprometer la función celular normal debido a la alteración inespecífica de las vías de los exosomas.^[42] En consecuencia, se han comenzado a explorar alternativas más seguras que se centran en atacar directamente los pequeños exosomas secretados, con el objetivo de neutralizar selectivamente los vesículas que promueven el crecimiento tumoral y reducir el impacto sobre las funciones celulares normales.^[22],^[43],^[44] Sin embargo, es importante señalar que los efectos inmunomoduladores de los TDE pueden variar según su carga molecular y el contexto biológico.^[15] Si bien se ha caracterizado ampliamente que estas vesículas tienen efectos inmunosupresores, varios estudios también han informado que los efectos de estimulación inmunitaria mediados por los exosomas están impulsados por composiciones específicas de su carga.^[45]–^[47] Esta heterogeneidad subraya la importancia de tener en cuenta los fenotipos específicos de los exosomas tumorales al considerar los enfoques terapéuticos dirigidos a los TDE.

Para abordar esta necesidad, diseñamos PEG-SA-Pep como una formulación de administración sistémica sensible al pH de nuestro péptido AH-Pep, que habíamos desarrollado previamente.^[22] Nuestro diseño evita las limitaciones comunes de la PEGilación mediante la incorporación de un enlazador sensible al pH que mantiene una capa protectora de PEG durante la circulación sistémica y permite la activación selectiva del péptido en el microambiente tumoral (MET) ácido. Específicamente, se seleccionó un tamaño de PEG de 5 kDa para optimizar el equilibrio entre la estabilidad farmacocinética y la seguridad inmunogénica, mientras que se empleó una conjugación específica del extremo N para bloquear mecánicamente el desencadenante de la inserción en la membrana y garantizar la homogeneidad del producto.^[48],^[49] Se espera que esta activación específica del MET minimice los efectos fuera del objetivo y facilite la alteración local de la membrana de los pequeños exosomas dentro del microambiente tumoral ácido, mediada por la ruptura de la membrana inducida por el péptido. Es importante destacar que este mecanismo de ruptura se ve aún más facilitado por la interacción preferencial del péptido con la alta curvatura de la membrana característica de los pequeños exosomas, lo que los distingue de las membranas celulares planas.^[22],^[23] Al confinar esta actividad al MET ácido, la estrategia ExoPERM proporciona selectividad funcional hacia el conjunto de pequeños exosomas inmunosupresores que se encuentran en el lecho tumoral, incluidos los TDE y los abundantes pequeños exosomas derivados de las células del estroma y del sistema inmunitario (por ejemplo, los fibroblastos asociados al cáncer y los macrófagos asociados al tumor), en lugar de discriminar entre subtipos específicos. Esta activación restringida al MET ofrece, por lo tanto, amplios beneficios terapéuticos al eliminar las vesículas pro-tumorogénicas independientemente de su origen celular.

En los ensayos funcionales in vitro de células T, PEG-SA-Pep restauró eficazmente la función efectora de las células T CD8+ en presencia de TDE (Fig. 2g, h), lo que es consistente con la hipótesis de que la liberación dependiente del pH de AH-Pep libre contribuye a esta restauración. Este comportamiento dependiente del pH también promovió la acumulación selectiva de PEG-SA-Pep en el tumor y redujo significativamente los niveles de exoPD-L1 en el plasma (Fig. 3a, f), lo que limita la interacción con PD-1 y mitiga la inmunosupresión mediada por los TDE. Se demostró eficazmente el potencial terapéutico de PEG-SA-Pep en combinación con la inmunoterapia de control de puntos de control inmunitarios (ICB). En particular, si bien, en comparación con la monoterapia con aPD-1, el uso de PEG-SA-Pep como agente único provocó una supresión tumoral limitada, la coadministración con aPD-1 condujo a una regresión tumoral significativamente mayor (Fig. 4b–e). Estas observaciones sugieren que la alteración de los TDE funciona principalmente para revertir la evasión inmunitaria en lugar de como una intervención citotóxica directa. En línea con esta justificación, la robusta eficacia antitumoral de la terapia combinada se acompañó de alteraciones favorables en el microambiente inmunitario del tumor, incluido el aumento de los infiltrados de linfocitos T (TIL) y la reducción de las poblaciones de células T reguladoras (Treg) (Fig. 4f–h). En consecuencia, estos efectos probablemente surgen de la alteración de los TDE inmunosupresores por PEG-SA-Pep, lo que reduce la señalización mediada por el exosomal PD-L1 y puede aliviar otras señales supresoras derivadas de los TDE dentro del MET, apoyando así una mejor actividad de las células T efectoras y mejorando la eficacia de aPD-1. En un campo en el que la resistencia a la ICB sigue siendo un obstáculo importante, PEG-SA-Pep ofrece un enfoque viable desde el punto de vista traslacional para mejorar el beneficio terapéutico y la durabilidad de la ICB, particularmente en tumores refractarios a aPD-1.

Además, PEG-SA-Pep demostró notables efectos sinérgicos sobre la terapia de células T activadas (ACT) al aumentar significativamente la acumulación intratumoral de las células T CD8+ transferidas (Fig. 5b, c). Esta mejora se acompañó de la remodelación del estroma fibrótico, como lo demuestra la reducción de la expresión de α-SMA (Fig. 5d, e). Esta observación se alinea con nuestro análisis in vitro que confirma que PEG-SA-Pep abolece eficazmente la activación de los fibroblastos mediada por los TDE. En consecuencia, el mecanismo dual propuesto, en el que se atacan tanto las barreras físicas como las inmunosupresoras, probablemente proporciona una justificación convincente para el mayor control tumoral observado cuando se utiliza PEG-SA-Pep con ACT (Fig. 5g, h) a través de la neutralización de los TDE, que son causas conocidas de los fibroblastos asociados al cáncer activados y la promoción de la remodelación de la matriz extracelular.^[50],^[51] Estos hallazgos tienen una importancia clínica particular dada la reciente aprobación acelerada por parte de la FDA de lifileucel (Amtagvi), una terapia de TIL para el melanoma avanzado a principios de 2024, lo que marcó un hito en la extensión de la ACT a los tumores sólidos.^[52] A medida que las TIL y otras terapias basadas en células continúan expandiéndose a diversas indicaciones de tumores sólidos, las estrategias para mejorar la infiltración y la función de las células T serán cruciales para maximizar los resultados terapéuticos.^[53],^[54] Si bien nuestros hallazgos respaldan el impacto funcional de la alteración de los TDE en la remodelación del estroma y la infiltración de células T, los estudios futuros que utilicen el perfilado transcriptómico serán valiosos para dilucidar completamente las complejas redes moleculares moduladas por la estrategia ExoPERM.

En conclusión, este estudio establece una estrategia ExoPERM, un enfoque sensible al pH para la alteración selectiva de los exosomas inmunosupresores, incluidos los TDE, dentro del MET. Utilizando PEG-SA-Pep como una implementación representativa, proporcionamos evidencia de que la estrategia ExoPERM neutraliza el exoPD-L1 al tiempo que preserva las funciones celulares normales, ofreciendo una alternativa potencialmente más segura y con un mecanismo distinto a los inhibidores inespecíficos de la biogénesis. Esta estrategia supera dos barreras importantes para la inmunoterapia contra el cáncer: la supresión inmunitaria, que limita la eficacia de la ICB, y el estroma fibrótico, que restringe la ACT. Al abordar ambos, facilita la transición de los tumores inmunológicamente fríos a los tumores calientes con infiltración de células T. Su diseño modular, que permite la variación de los enlazadores, las cargas terapéuticas y los socios de combinación, respalda una amplia adaptación e integración con los regímenes de tratamiento establecidos. Dados los recientes avances clínicos tanto en las inmunoterapias basadas en anticuerpos como en las basadas en células, las estrategias como la estrategia ExoPERM, que mejoran la infiltración y la función de las células T, pueden ampliar el alcance de los tratamientos actuales, particularmente en los tumores resistentes a las modalidades existentes.

A pesar de la eficacia funcional de la estrategia ExoPERM, nuestro enfoque actual proporciona selectividad mediada por el entorno en lugar de especificidad del origen celular. Como tal, la estrategia actúa sobre el conjunto de la población de pequeños exosomas dentro del nicho tumoral, y aún queda por dilucidar completamente la distinción de los efectos específicos de los TDE del panorama más amplio de los pequeños exosomas asociados al MET. Las investigaciones futuras que exploren la incorporación de motivos de orientación a los TDE en la estrategia ExoPERM serán valiosas para refinar la precisión del objetivo y minimizar los posibles efectos fuera del objetivo. Además, si bien nuestro estudio utilizó modelos establecidos de melanoma y cáncer colorrectal, se justifica una mayor validación en una gama más amplia de tipos de tumores clínicamente relevantes para generalizar la aplicabilidad terapéutica de la estrategia ExoPERM. En general, esta plataforma ofrece un prometedor enfoque sensible al MET para superar la evasión inmunitaria mediada por los pequeños exosomas y mejorar la eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer.

Materiales y métodos

Materiales

mPEG (Mn: 5 kDa) se compró a Sigma‒Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ácido 3-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-dihidrofuran-3-il) propanoico (CDM) se obtuvo de Ambeed (Arlington Heights, IL, EE. UU.). Para la síntesis del péptido de control (PEG-NA-Pep), se compró PEG-succinimidil glutarato (Mn: 5 kDa) a creative PEGWorks (Durham, NC, EE. UU.). El cloruro de oxalilo se obtuvo de Tokyo Chemical Industry (TCI; Tokio, Japón). Para etiquetar los TDE, los colorantes fluorescentes DiO’ y DiOC18(3) se compraron a Thermo Fisher Scientific, Inc. (Rockford, IL, EE. UU.).

Péptidos

AH-Pep (SGSWLRDVWDWICTVLTDFKTWLQSKL) se sintetizó químicamente y se suministró en forma liofilizada con una pureza >90% por Anygen (Gwangju, Corea). La concentración molar de las soluciones de péptidos se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis) (Optizen 3220UV, KLAB).

Líneas celulares y animales

La línea celular de melanoma murino B16F10 (KCLB-8008) se obtuvo del Banco de Líneas Celulares de Corea y se cultivó en DMEM (Capricorn Scientific) suplementado con un 5% de suero fetal bovino (SFB) (Capricorn Scientific) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Capricorn Scientific). Las células utilizadas en todos los experimentos in vitro se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2.

Para los experimentos in vivo, se compraron ratones C57BL/6 machos de 5 a 6 semanas de edad a Orient Bio y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Sungkyunkwan (número SKKUIACUC2024-05-16-1).

Síntesis de PEG-CDM

El grupo carboxilo de CDM se activó utilizando cloruro de oxalilo para conjugarlo con el grupo hidroxilo de mPEG, formando PEG-CDM a través de un enlace éster. Brevemente, se disolvieron 50 mg de CDM en 2 ml de diclorometano (DCM), seguido de la adición de 46,3 μl de cloruro de oxalilo y 8 μl de N,N-dimetilformamida (DMF). La mezcla se agitó en hielo durante 10 minutos y luego a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la evaporación en condiciones de vacío, se añadió 180 mg de PEG disuelto en 4 ml de DCM con 6 μl de piridina a la mezcla de reacción, que luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Para apagar la reacción, se añadieron 10 ml de una solución saturada de NH4Cl. La mezcla resultante se transfirió a un embudo de separación y se recogió la capa orgánica inferior que contenía el producto. El producto se precipitó en éter dietílico y luego se lavó por centrifugación a 2500 × g durante 20 minutos a 4 °C. Después de desechar el sobrenadante, el precipitado se secó al vacío para obtener el producto final PEG-CDM.

Preparación de PEG-SA-Pep

Para lograr la conjugación selectiva del grupo amino del extremo N de AH-pep con PEG-CDM, el pH del sistema de disolventes se controló cuidadosamente para inhibir la activación de la cadena lateral de la amina durante el proceso de reacción.^[55] Brevemente, se disolvieron 20 mg de PEG-CDM en 6 ml de PBS (pH 7,4) y se disolvieron 5 mg de AH-Pep en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). La solución de AH-Pep se añadió gota a gota a la solución de PEG-CDM bajo agitación continua. Se permitió que la reacción continuara durante la noche a 4 °C. La mezcla resultante se dializó contra agua destilada, ajustando el pH a 8 con NaOH. La solución final se liofilizó para obtener PEG-SA-Pep. Como control, se sintetizó PEG-NA-pep utilizando el mismo procedimiento, excepto que se utilizó PEG-succinimidil glutarato en lugar de PEG-CDM.

Prueba de liberación de PEG-SA-Pep en diversas condiciones de pH

Para determinar el perfil de liberación in vitro de AH-Pep liberado de PEG-SA-Pep, se empleó un método de diálisis. Brevemente, cada muestra de péptido se dispersó en un tampón de fosfato de 100 mM (PB) a un pH de 7,4 o 6,5, y la solución se transfirió a un tubo de membrana de diálisis con un límite de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa. A continuación, el tubo de diálisis se sumergió en PB al pH correspondiente (7,4 o 6,5) y se agitó suavemente en un baño de agua a 100 rpm durante los puntos de tiempo predeterminados. En cada punto, la cantidad de AH-Pep liberado se cuantificó utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (Optizen 3220 UV, Mecasys Co., Daejeon, Corea) y se trazó el perfil de liberación en consecuencia.

Aislamiento de TDE

Para el aislamiento in vitro de TDE, se utilizó un sistema de filtración tangencial (TFF) equipado con una cápsula de filtro de membrana Omega con un límite de peso molecular de 300 kDa (Pall Corporation).^[56] Brevemente, las células B16F10, con una confluencia de aproximadamente el 70%, se lavaron dos veces con PBS y se cultivaron en DMEM sin suero durante 24 h. A continuación, se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se sometieron a una centrifugación secuencial a 300 × g durante 5 min y a 2000 × g durante 20 min para eliminar los restos celulares y las vesículas grandes, respectivamente. El sobrenadante se filtró posteriormente a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm antes de procesarlo con el sistema TFF. Para los experimentos in vivo, se obtuvo plasma libre de células a partir de muestras de sangre para el aislamiento de TDE. Los TDE del plasma de ratón se purificaron utilizando un kit de aislamiento total de exosomas (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Prueba de ruptura de TDE in vitro

La concentración de TDE, que es fundamental para evaluar la eficiencia de la ruptura de TDE, se midió mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA; NanoSight LM10; Malvern Panalytical). Cada péptido se preparó suspendiendo PB a una concentración de 6 μM e incubándolo durante 6 h. Las suspensiones de TDE (1 × 109 partículas/ml en PBS) se incubaron posteriormente con o sin péptidos a temperatura ambiente, lo que resultó en una concentración final de 3 μM de AH-Pep. Después de la incubación, las suspensiones se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para eliminar los agregados antes del análisis por el sistema NTA.

Ensayo de unión PD-1/PD-L1

Para cuantificar la afinidad de unión entre PD-L1 en las pequeñas EV y PD-1, se obtuvo plasma de ratones WT o portadores de tumores B16F10. Las pequeñas EV se aislaron siguiendo un protocolo descrito previamente. A continuación, las pequeñas EV se co-incubaron con cada péptido en diversas condiciones de pH. La capacidad de unión de PD-L1 a PD-1 se midió posteriormente utilizando un kit ELISA para ratón PD-L1 (número de catálogo DY1019-05; R&D Systems) según las instrucciones del fabricante y según se informó previamente.^[22]

Aislamiento y estimulación de linfocitos T CD8+

Se extrajeron los bazo de ratones C57BL/6, se disociaron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm para obtener suspensiones de células individuales. A continuación, se lisaron los glóbulos rojos utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (BioLegend, San Diego, CA). Los linfocitos T CD8+ se aislaron de las suspensiones de células individuales utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8a+ nativos para ratón (Miltenyi Biotec) y columnas LS (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ nativos recién aislados se sembraron y se activaron durante 48 h con anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (2 μg/ml) en un medio RPMI 1640 suplementado con 1× solución de aminoácidos no esenciales (MilliporeSigma, número de catálogo M7145) y 50 μM de β-mercaptoetanol (MilliporeSigma, número de catálogo 60-24-2).

Captación celular de TDE por linfocitos T CD8+

Los linfocitos T CD8+ esplénicos se aislaron y activaron como se describió anteriormente y se sembraron a 1 × 106 células por pocillo en una placa de 12 pocillos con fondos de vidrio pre-recubiertos con fibronectina (2 μg/cm2; MilliporeSigma, número de catálogo F1141). Para rastrear la captación celular de TDE, se utilizó el colorante lipofílico DiO para etiquetar las membranas de los TDE. Brevemente, se añadieron 10 μL de solución de colorante DiO (3 mg/mL, DMSO:etanol = 1:9, v/v) a 1 mL de la suspensión de TDE. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, los TDE etiquetados se pasaron a través de un filtro de 0,8 μm y se purificaron utilizando una columna PD-10 (Cytiva, Marlborough, MA) mediante centrifugación a 1000 × g durante 2 min para eliminar el colorante no unido.

A continuación, los TDE etiquetados con DiO se pre-incubaron con o sin 3 μM de cada péptido durante 10 min antes de añadirlos a las células. Después de 3 h de incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Tras la fijación, las células se lavaron con PBS y los núcleos se tiñeron con DAPI. Se colocaron cubreobjetos sobre los portaobjetos para la obtención de imágenes con un microscopio confocal Leica TCS SP8 (Leica Microsystems). Para cuantificar la captación de TDE etiquetados con DiO, las células también se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec) y se evaluó la intensidad de fluorescencia utilizando el software FlowJo (BD Life Science, Franklin Lakes, NJ).

Ensayo de ruptura de linfocitos T CD8+ in vitro

La concentración de TDE, que es fundamental para evaluar la eficiencia de la ruptura de TDE, se midió mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA; NanoSight LM10; Malvern Panalytical). Cada péptido se preparó suspendiendo PB a una concentración de 6 μM e incubándolo durante 6 h. Las suspensiones de TDE (1 × 109 partículas/ml en PBS) se incubaron posteriormente con o sin péptidos a temperatura ambiente, lo que resultó en una concentración final de 3 μM de AH-Pep. Después de la incubación, las suspensiones se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para eliminar los agregados antes del análisis por el sistema NTA.

Ensayo de unión PD-1/PD-L1

Para cuantificar la afinidad de unión entre PD-L1 en las pequeñas EV y PD-1, se obtuvo plasma de ratones WT o portadores de tumores B16F10. Las pequeñas EV se aislaron siguiendo un protocolo descrito previamente. A continuación, las pequeñas EV se co-incubaron con cada péptido en diversas condiciones de pH. La capacidad de unión de PD-L1 a PD-1 se midió posteriormente utilizando un kit ELISA para ratón PD-L1 (número de catálogo DY1019-05; R&D Systems) según las instrucciones del fabricante y según se informó previamente.^[22]

Aislamiento y estimulación de linfocitos T CD8+

Se extrajeron los bazo de ratones C57BL/6, se disociaron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm para obtener suspensiones de células individuales. A continuación, se lisaron los glóbulos rojos utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (BioLegend, San Diego, CA). Los linfocitos T CD8+ se aislaron de las suspensiones de células individuales utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8a+ nativos para ratón (Miltenyi Biotec) y columnas LS (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ nativos recién aislados se sembraron y se activaron durante 48 h con anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (2 μg/ml) en un medio RPMI 1640 suplementado con 1× solución de aminoácidos no esenciales (MilliporeSigma, número de catálogo M7145) y 50 μM de β-mercaptoetanol (MilliporeSigma, número de catálogo 60-24-2).

Captación celular de TDE por linfocitos T CD8+

Los linfocitos T CD8+ esplénicos se aislaron y activaron como se describió anteriormente y se sembraron a 1 × 106 células por pocillo en una placa de 12 pocillos con fondos de vidrio pre-recubiertos con fibronectina (2 μg/cm2; MilliporeSigma, número de catálogo F1141). Para rastrear la captación celular de TDE, se utilizó el colorante lipofílico DiO para etiquetar las membranas de los TDE. Brevemente, se añadieron 10 μL de solución de colorante DiO (3 mg/mL, DMSO:etanol = 1:9, v/v) a 1 mL de la suspensión de TDE. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, los TDE etiquetados se pasaron a través de un filtro de 0,8 μm y se purificaron utilizando una columna PD-10 (Cytiva, Marlborough, MA) mediante centrifugación a 1000 × g durante 2 min para eliminar el colorante no unido.

A continuación, los TDE etiquetados con DiO se pre-incubaron con o sin 3 μM de cada péptido durante 10 min antes de añadirlos a las células. Después de 3 h de incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Tras la fijación, las células se lavaron con PBS y los núcleos se tiñeron con DAPI. Se colocaron cubreobjetos sobre los portaobjetos para la obtención de imágenes con un microscopio confocal Leica TCS SP8 (Leica Microsystems). Para cuantificar la captación de TDE etiquetados con DiO, las células también se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec) y se evaluó la intensidad de fluorescencia utilizando el software FlowJo (BD Life Science, Franklin Lakes, NJ).

Ensayo de agotamiento de linfocitos T CD8+ in vitro

Los linfocitos T CD8+ se aislaron del bazo de ratón y se estimularon como se describió anteriormente para evaluar el agotamiento de las células T inducido por los TDE. Los TDE se pre-incubaron con o sin 3 μM de cada péptido durante 10 min en PBS ajustado a pH 7,4 o 6,5 y, a continuación, se añadieron a los linfocitos T CD8+ estimulados. Las células se incubaron durante 48 h. Para evaluar la expresión intracelular de Ki-67, se recogieron 1 × 106 células mediante centrifugación a 350 × g durante 5 min y se permeabilizaron con etanol al 70% enfriado. Después de una incubación de 1 h a -20 °C, las células se lavaron dos veces con PBS que contenía 1% de FBS. A continuación, las células se tiñeron con anti-ratón Ki-67-PE/Dazzle 594 (clon 16A8; BioLegend) durante 30 min a temperatura ambiente, tras lo cual se lavaron dos veces y se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB; Miltenyi Biotec).

Para la tinción intracelular de GrB, los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron con suspensiones de TDE durante 48 h, seguido de tratamiento con monensina (1 μg/ml; Thermo Fisher Scientific) durante 6 h adicionales para promover la acumulación intracelular. Después del tratamiento, se recogieron 1 × 106 células y se bloquearon con anticuerpo anti-ratón CD16/32 (clon 2.4G2; BioLegend) durante 15 min sobre hielo para evitar la unión inespecífica al receptor Fc. A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron con el tampón Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), seguido de dos lavados con el tampón 1× Perm/Wash (BD Biosciences). A continuación, las células se tiñeron con anti-humano/ratón Granzima B-FITC (clon QA16A02; BioLegend) y se analizaron mediante citometría de flujo (Guava easyCyte; Millipore, Sigma).

Para etiquetar los marcadores representativos de las células T agotadas, los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron con suspensiones de TDE durante 48 h. Después del tratamiento, se recogieron 1 × 105 células y se bloquearon con anticuerpo anti-ratón CD16/32 (clon 2.4G2; Biolegend) durante 15 min sobre hielo para evitar la unión inespecífica al receptor Fc. A continuación, las células se tiñeron con anti-CD233 (LAG-3) conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 125223; Biolegend) y anti-CD279 (PD-1) conjugado con FITC (número de catálogo 135213; Biolegend) durante 30 min a temperatura ambiente, tras lo cual se lavaron dos veces y se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB; Miltenyi Biotec).

Farmacocinética y biodistribución in vivo de PEG-SA-Pep

Para investigar el comportamiento in vivo de AH-Pep, se preparó AH-Pep etiquetado con Cy5.5. Brevemente, AH-Pep y Cy5.5-maleimida se disolvieron en DMSO a concentraciones de 25 mg/ml y 10 mg/ml, respectivamente. Cada solución se añadió gota a gota a 3 ml de PBS bajo agitación, y la mezcla se incubó durante la noche a 4 °C. El producto de la reacción se purificó mediante diálisis frente a agua destilada utilizando una membrana MWCO de 2 kDa y, a continuación, se liofilizó para obtener el AH-Pep etiquetado con Cy5.5 seco. Para preparar PEG-SA-Pep o PEG-NA-Pep etiquetados con Cy5.5, el AH-Pep etiquetado con Cy5.5 se pegiló según un procedimiento descrito previamente.

Para el análisis farmacocinético, se inyectaron por vía intravenosa a ratones portadores de tumores B16F10 péptidos etiquetados con Cy5.5 a concentraciones equivalentes. Se recogieron muestras de sangre en puntos de tiempo predeterminados y se midió la intensidad de fluorescencia de Cy5.5 utilizando un lector de microplacas (BioTek Instruments) para determinar los perfiles de circulación de los péptidos.

Para evaluar la biodistribución, se recogieron los principales órganos, incluidos el hígado, los pulmones, los riñones, el bazo, el corazón y el tumor, de los ratones en puntos de tiempo definidos. Los tejidos se homogeneizaron utilizando un kit de homogeneización (InnogeneTech, Gimpo, Corea) y se midió la intensidad de fluorescencia con un lector de microplacas para evaluar la distribución y la eliminación de los péptidos etiquetados con Cy5.5.

Evaluación in vivo de la expresión de PD-L1 en los TDE en el plasma

Cuando el volumen tumoral medio alcanzó aproximadamente los 800 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Para evaluar los efectos dependientes de la dosis de PEG-SA-Pep sobre los niveles de PD-L1 en el plasma, se administró por vía intravenosa dos veces cada formulación de péptido. Un día después de la inyección final, se recogió sangre y se separó el plasma. Los TDE derivados del plasma se aislaron utilizando un kit de aislamiento total de exosomas (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los niveles de PD-L1 asociados a los TDE se cuantificaron utilizando un kit ELISA para ratón PD-L1 (número de catálogo DY1019-05; R&D Systems).

Evaluación in vivo de la eficacia antitumoral de PEG-SA-Pep

El día 12 después de la inoculación subcutánea de células B16F10, los ratones C57BL/6 portadores de tumores se asignaron aleatoriamente a ocho grupos de tratamiento: G1 (PBS), G2 (AH-Pep), G3 (PEG-NA-Pep), G4 (PEG-SA-Pep), G5 (aPD-1), G6 (AH-Pep+aPD-1), G7 (PEG-NA-Pep+aPD-1) y G8 (PEG-SA-Pep+aPD-1). Los ratones recibieron una inyección intravenosa de péptidos a 15 mg/kg en 200 μl de PBS y una inyección intraperitoneal de aPD-1 a 5 mg/kg de aPD-1 en un volumen de 100 μl. Se midieron diariamente los volúmenes tumorales y el peso corporal. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: volumen (mm3) = 0,5 × longitud (mm) × anchura2 (mm2). Los ratones se sacrificaron según las directrices de cuidado de los animales si el diámetro del tumor superaba los 20 mm, si la carga tumoral alcanzaba el 15% del peso corporal o si la pérdida de peso corporal superaba el 20%. Todos los ratones fueron sacrificados antes del día 21, antes de alcanzar la carga tumoral máxima permitida. Se recogieron el tumor, los principales órganos y las muestras de sangre para su posterior análisis.

Evaluación in vivo de la respuesta inmune antitumoral

Para analizar las células T CD8+ dentro de las células TIL CD45+, los tejidos tumorales se disociaron enzimáticamente utilizando un kit de disociación tumoral y un disociador GentleMACS (Miltenyi Biotec). Los suspensiones resultantes se filtraron secuencialmente a través de tamices celulares de 70 y 40 μm para obtener suspensiones de células individuales. Las células TIL se enriquecieron utilizando microesferas CD45 (Miltenyi Biotec) según el protocolo del fabricante. A continuación, las células TIL aisladas se bloquearon con Trustain FcXTM (número de catálogo 101320, Biolegend) y, a continuación, se tiñeron con anti-CD3 conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 100245, Biolegend), anti-CD8a conjugado con Alexa Fluor 488 (número de catálogo 100726, Biolegend), anti-CD233 (LAG-3) conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 125223, Biolegend) y anti-CD279 (PD-1) conjugado con FITC (número de catálogo 135213, Biolegend) para el análisis citométrico de flujo.

Para etiquetar los marcadores representativos de las células T agotadas, los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron con suspensiones de TDE durante 48 h, seguido

Para evaluar la proliferación antígeno-específica de los linfocitos T esplénicos, los bazo fueron disociados mecánicamente y pasados a través de un tamiz celular de 40 μm para generar suspensiones de células individuales. Los esplenocitos aislados se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo en placas de 12 pocillos, suplementadas con medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 1% de AA, 1× solución de aminoácidos no esenciales (número de catálogo M7145; MilliporeSigma) y 50 μM de β-mercaptoetanol (número de catálogo 60-24-2; MilliporeSigma). Las células se estimularon con GP100, un antígeno asociado al melanoma. Después de 48 h, los linfocitos T esplénicos se tiñeron con anti-Ki-67 conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 652409; Biolegend) para evaluar la proliferación. Todas las células marcadas de los tumores y los bazo se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec), y los datos se procesaron con el software FlowJo™.

Aislamiento y activación de linfocitos T adoptivos

Para el experimento de transferencia adoptiva de linfocitos T policlonales, las células de cáncer colorrectal murino CT26 se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB/c. Siete días después de la inoculación, se recolectaron los ganglios linfáticos de drenaje tumoral (GLDT) de los ratones con tumor CT26, de acuerdo con un protocolo descrito previamente.^[57] Los GLDT se disociaron mecánicamente para generar suspensiones de células individuales, y las células T CD8+ se aislaron utilizando microesferas magnéticas, como se describió anteriormente. Antes de la transferencia adoptiva, las células T CD8+ aisladas se activaron durante 48 h con anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (2 μg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con 1× solución de aminoácidos no esenciales (MilliporeSigma, número de catálogo M7145) y 50 μM de β-mercaptoetanol (MilliporeSigma, número de catálogo 60-24-2).

Capacidad de infiltración tumoral de los linfocitos T adoptivos

Los modelos de ratón con tumor CT26 se establecieron como se describió anteriormente. El día 5 después de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: G1 (PBS), G2 (AH-Pep), G3 (PEG-NA-Pep) y G4 (PEG-SA-Pep). Cada péptido se administró por vía intravenosa a una dosis de 15 mg/kg en 200 μl de PBS. Las células T CD8+ activadas se aislaron de los GLDT de los ratones con tumor CT26 y se marcaron con Dil, un tinte lipofílico utilizado para la tinción de la membrana. El día 15, se recolectaron los tejidos tumorales, se incluyeron y se cortaron en secciones criogénicas. Las secciones de tejido se fijaron en acetona a hielo y se bloquearon con PBS que contenía 1% de BSA durante 1 h. Para la tinción con α-SMA, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-α-SMA-FITC. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido láser (CLSM; TCS SP8 HyVolution; Leica Microsystems CMS GmbH, Alemania).

Eficacia antitumoral in vivo de PEG-SA-Pep con ACT

Para estudiar el ACT en un modelo de ratón con tumor CT26, las células de cáncer CT26 se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB/c. El día 7 después de la inoculación, los ratones con tumor se asignaron aleatoriamente a seis grupos de tratamiento: G1 (PBS), G2 (células T + PBS), G3 (células T + IL-12), G4 (AH-Pep + células T + IL-12), G5 (PEG-NA-Pep + células T + IL-12) y G6 (PEG-SA-Pep + células T + IL-12). Los péptidos se administraron por vía intravenosa a una dosis de 15 mg/kg en 200 μl de PBS. Un día antes de la transferencia adoptiva, los ratones se sometieron a linfodepleción mediante inyección intraperitoneal de ciclofosfamida a 4 mg/h. Las células T CD8+ activadas aisladas de los GLDT de los ratones con tumor CT26 se inyectaron por vía intravenosa a una dosis de 2 × 106 células/h. La IL-12 recombinante se administró intratumoralmente a 60 ng/h. El volumen tumoral se midió diariamente hasta el día 23 utilizando la fórmula: volumen (mm3) = 0,5 × longitud (mm) × ancho2 (mm2).

Estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8. Los métodos estadísticos detallados y los valores de p se proporcionan en las leyendas de las figuras. Los niveles de significación se indican como *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001 y ****p < 0,0001; n.s. indica "no significativo". El número de réplicas experimentales (n) se indica en las leyendas de las figuras, y cada muestra representa una réplica biológica independiente o un experimento separado, según se especifique. Se asumió que los datos seguían una distribución normal, aunque esto no se evaluó formalmente. Tanto la recopilación de datos como el análisis se realizaron de forma ciega a las condiciones experimentales. Los investigadores desconocían la asignación de los grupos durante los experimentos y la evaluación de los resultados.

Materiales

mPEG (Mn: 5 kDa) se compró a Sigma‒Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ácido 3-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-dihidrofurano-3-il) propanoico (CDM) se obtuvo de Ambeed (Arlington Heights, IL, EE. UU.). Para la síntesis del péptido de control (PEG-NA-Pep), se compró PEG-succinimidil glutarato (Mn: 5 kDa) a creative PEGWorks (Durham, NC, EE. UU.). El cloruro de oxalilo se obtuvo de Tokyo Chemical Industry (TCI; Tokio, Japón). Para etiquetar los TDE, los tintes fluorescentes DiO’ y DiOC18(3) se compraron a Thermo Fisher Scientific, Inc. (Rockford, IL, EE. UU.).

Péptidos

AH-Pep (SGSWLRDVWDWICTVLTDFKTWLQSKL) se sintetizó químicamente y se suministró en forma liofilizada con una pureza >90% por Anygen (Gwangju, Corea). La concentración molar de las soluciones de péptidos se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis) (Optizen 3220UV, KLAB).

Líneas celulares y animales

La línea celular de melanoma murino B16F10 (KCLB-8008) se obtuvo del Banco de Líneas Celulares de Corea y se cultivó en DMEM (Capricorn Scientific) suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS; Capricorn Scientific) y 1% de penicilina/estreptomicina (Capricorn Scientific). Las células utilizadas en todos los experimentos in vitro se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.

Para los experimentos in vivo, se compraron ratones C57BL/6 machos de 5 a 6 semanas de edad a Orient Bio y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Sungkyunkwan (número SKKUIACUC2024-05-16-1).

Síntesis de PEG-CDM

El grupo carboxilo de CDM se activó utilizando cloruro de oxalilo para conjugarlo con el grupo hidroxilo de mPEG, formando PEG-CDM mediante un enlace éster. Brevemente, se disolvieron 50 mg de CDM en 2 ml de diclorometano (DCM), seguido de la adición de 46,3 μl de cloruro de oxalilo y 8 μl de N,N-dimetilformamida (DMF). La mezcla se agitó en hielo durante 10 min y luego a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la evaporación en condiciones de vacío, se añadieron 180 mg de PEG disueltos en 4 ml de DCM con 6 μl de piridina a la mezcla de reacción, que luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Para apagar la reacción, se añadieron 10 ml de una solución saturada de NH4Cl. La mezcla resultante se transfirió a un embudo de separación, y se recogió la capa orgánica inferior que contenía el producto. El producto se precipitó en éter dietílico y luego se lavó por centrifugación a 2500 × g durante 20 min a 4 °C. Después de desechar el sobrenadante, el precipitado se secó al vacío para obtener el producto final PEG-CDM.

Preparación de PEG-SA-Pep

Para lograr la conjugación selectiva del grupo amino N-terminal de AH-pep con PEG-CDM, el pH del sistema de disolventes se controló cuidadosamente para inhibir la activación de la cadena lateral de la amina durante el proceso de reacción.^[55] Brevemente, se disolvieron 20 mg de PEG-CDM en 6 ml de PBS (pH 7,4) y se disolvieron 5 mg de AH-Pep en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). La solución de AH-Pep se añadió gota a gota a la solución de PEG-CDM bajo agitación continua. Se permitió que la reacción continuara durante la noche a 4 °C. La mezcla resultante se dializó contra agua destilada, y se ajustó el pH a 8 utilizando NaOH. La solución final se liofilizó para obtener PEG-SA-Pep. Como control, se sintetizó PEG-NA-pep utilizando el mismo procedimiento, excepto que se utilizó PEG-succinimidil glutarato en lugar de PEG-CDM.

Prueba de liberación de PEG-SA-Pep en diversas condiciones de pH

Para determinar el perfil de liberación in vitro de AH-Pep liberado de PEG-SA-Pep, se empleó un método de diálisis. Brevemente, cada muestra de péptido se dispersó en 100 mM de tampón de fosfato (PB) a un pH de 7,4 o 6,5, y la solución se transfirió a un tubo de membrana de diálisis con un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 12-14 kDa. El tubo de diálisis se sumergió luego en PB al pH correspondiente (7,4 o 6,5) y se agitó suavemente en un baño de agua a 100 rpm durante puntos de tiempo predeterminados. En cada punto, se cuantificó la cantidad de AH-Pep liberado utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (Optizen 3220 UV, Mecasys Co., Daejeon, Corea), y se trazó el perfil de liberación en consecuencia.

Aislamiento de TDE

Para el aislamiento in vitro de TDE, se utilizó un sistema de filtración tangencial (TFF) equipado con una cápsula de filtro de membrana Omega con un punto de corte de peso molecular de 300 kDa (Pall Corporation).^[56] Brevemente, las células B16F10 con aproximadamente un 70% de confluencia se lavaron dos veces con PBS y se cultivaron en DMEM sin suero durante 24 h. Los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron y se sometieron a una centrifugación secuencial a 300 × g durante 5 min y 2000 × g durante 20 min para eliminar los restos celulares y las vesículas grandes, respectivamente. El sobrenadante se filtró posteriormente a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm antes de procesarlo con el sistema TFF. Para los experimentos in vivo, se obtuvo plasma libre de células a partir de muestras de sangre para el aislamiento de TDE. Los TDE del plasma de ratón se purificaron utilizando un kit de aislamiento total de exosomas (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

Prueba de ruptura de TDE in vitro

La concentración de TDE, que es fundamental para evaluar la eficiencia de la ruptura de los TDE, se midió utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA; NanoSight LM10; Malvern Panalytical). Se preparó cada péptido suspendiendo PB a una concentración de 6 μM e incubándolo durante 6 h. Las suspensiones de TDE (1 × 109 partículas/ml en PBS) se incubaron posteriormente con o sin péptidos a temperatura ambiente, lo que resultó en una concentración final de 3 μM de AH-Pep. Después de la incubación, las suspensiones se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para eliminar los agregados antes del análisis mediante el sistema NTA.

Ensayo de unión PD-1/PD-L1

Para cuantificar la afinidad de unión entre PD-L1 en los pequeños EVs y PD-1, se obtuvo plasma de ratones WT o con tumor B16F10. Los pequeños EVs se aislaron siguiendo un protocolo descrito previamente. Los pequeños EVs se incubaron posteriormente con cada péptido en diversas condiciones de pH. La capacidad de unión de PD-L1 a PD-1 se midió posteriormente utilizando un kit ELISA para ratón PD-L1 (número de catálogo DY1019-05; R&D Systems) según las instrucciones del fabricante y según se informó previamente.^[22]

Aislamiento y estimulación de linfocitos T CD8+

Se recolectaron los bazo de ratones C57BL/6, se disociaron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm para obtener suspensiones de células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos (BioLegend, San Diego, CA). Los linfocitos T CD8+ se aislaron de las suspensiones de células individuales utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD8+ nativos de ratón (Miltenyi Biotec) y columnas LS (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ nativos recién aislados se sembraron y se activaron durante 48 h con anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (2 μg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con 1× solución de aminoácidos no esenciales (MilliporeSigma, número de catálogo M7145) y 50 μM de β-mercaptoetanol (MilliporeSigma, número de catálogo 60-24-2).

Captación celular de TDE por linfocitos T CD8+

Se aislaron y activaron células CD8+ esplénicas, según se describió previamente, y se sembraron a una concentración de 1 × 106 células por pocillo en una placa de 12 pocillos con fondo de vidrio, previamente recubierta con fibronectina (2 μg/cm2; MilliporeSigma, número de catálogo F1141). Para rastrear la captación celular de los TDE, se utilizó el colorante lipofílico DiO para marcar las membranas de los TDE. Brevemente, se añadieron 10 μL de solución madre del colorante DiO (3 mg/mL, DMSO:etanol = 1:9, v/v) a 1 mL de la suspensión de TDE. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Los TDE marcados se pasaron a continuación a través de un filtro de 0,8 μm y se purificaron utilizando una columna PD-10 (Cytiva, Marlborough, MA) mediante centrifugación a 1000 × g durante 2 min para eliminar el colorante no unido.

Los TDE marcados con DiO se preincubaron posteriormente con o sin 3 μM de cada péptido durante 10 min antes de añadirlos a las células. Después de 3 h de incubación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con un 4% de paraformaldehído. Tras la fijación, las células se lavaron con PBS y los núcleos se tiñeron con DAPI. Se colocaron cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio para la obtención de imágenes mediante un microscopio confocal Leica TCS SP8 (Leica Microsystems). Para cuantificar la captación de los TDE marcados con DiO, las células también se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec), y se evaluó la intensidad de fluorescencia utilizando el software FlowJo (BD Life Science, Franklin Lakes, NJ).

Ensayo in vitro de agotamiento de linfocitos T CD8+

Se aislaron linfocitos T CD8+ del bazo de ratón y se estimularon según se describió previamente para evaluar el agotamiento de las células T inducido por los TDE. Los TDE se preincubaron con o sin 3 μM de cada péptido durante 10 min en PBS ajustado a un pH de 7,4 o 6,5 y, a continuación, se añadieron a los linfocitos T CD8+ estimulados. Las células se incubaron durante 48 h. Para evaluar la expresión intracelular de Ki-67, se recogieron 1 × 106 células mediante centrifugación a 350 × g durante 5 min y se permeabilizaron con etanol al 70% enfriado. Después de una incubación de 1 h a -20 °C, las células se lavaron dos veces con PBS que contenía un 1% de FBS. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpo anti-Ki-67-PE/Dazzle 594 (clon no. 16A8; BioLegend) durante 30 min a temperatura ambiente, tras lo cual se lavaron dos veces y se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB; Miltenyi Biotec).

Para la tinción intracelular de GrB, los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron con suspensiones de TDE durante 48 h, seguido de un tratamiento con monensina (1 μg/ml; Thermo Fisher Scientific) durante 6 h adicionales para promover la acumulación intracelular. Después del tratamiento, se recogieron 1 × 106 células y se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón (clon no. 2.4G2; BioLegend) durante 15 min sobre hielo para evitar la unión inespecífica al receptor Fc. A continuación, las células se fijaron y permeabilizaron con el tampón Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), seguido de dos lavados con tampón 1× Perm/Wash (BD Biosciences). A continuación, las células se tiñeron con anti-granzima B-FITC humano/ratón (clon no. QA16A02; BioLegend) y se analizaron mediante citometría de flujo (Guava easyCyte; Millipore, Sigma).

Para marcar marcadores representativos de células T agotadas, los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron con suspensiones de TDE durante 48 h. Después del tratamiento, se recogieron 1 × 105 células y se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 de ratón (clon no. 2.4G2; Biolegend) durante 15 min sobre hielo para evitar la unión inespecífica al receptor Fc. A continuación, las células se tiñeron con anti-CD233 (LAG-3) conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 125223; Biolegend) y anti-CD279 (PD-1) conjugado con FITC (número de catálogo 135213; Biolegend) durante 30 min a temperatura ambiente, tras lo cual se lavaron dos veces y se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB; Miltenyi Biotec).

Farmacocinética y biodistribución in vivo de PEG-SA-Pep

Para investigar el comportamiento in vivo de AH-Pep, se preparó AH-Pep marcado con Cy5.5. Brevemente, AH-Pep y Cy5.5-maleimida se disolvieron en DMSO a concentraciones de 25 mg/ml y 10 mg/ml, respectivamente. Cada solución se añadió gota a gota a 3 ml de PBS bajo agitación, y la mezcla se incubó durante la noche a 4 °C. El producto de la reacción se purificó mediante diálisis contra agua destilada utilizando una membrana de 2 kDa MWCO y, a continuación, se liofilizó para obtener el AH-Pep marcado con Cy5.5 seco. Para preparar PEG-SA-Pep o PEG-NA-Pep marcados con Cy5.5, el AH-Pep marcado con Cy5.5 se pegiló según un procedimiento descrito previamente.

Para el análisis farmacocinético, se inyectaron por vía intravenosa a ratones con tumores B16F10 péptidos marcados con Cy5.5 a concentraciones equivalentes. Se recogieron muestras de sangre en puntos temporales predeterminados, y se midió la intensidad de fluorescencia de Cy5.5 utilizando un lector de microplacas (BioTek Instruments) para determinar los perfiles de circulación de los péptidos.

Para evaluar la biodistribución, se recogieron los principales órganos, incluidos el hígado, los pulmones, los riñones, el bazo, el corazón y el tumor, de los ratones en puntos temporales definidos. Los tejidos se homogeneizaron utilizando un kit de homogeneización (InnogeneTech, Gimpo, Corea), y se midió la intensidad de fluorescencia con un lector de microplacas para evaluar la distribución y la eliminación de los péptidos marcados con Cy5.5.

Evaluación in vivo de la expresión de PD-L1 en los TDE en plasma

Cuando el volumen tumoral medio alcanzó aproximadamente los 800 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Para evaluar los efectos dependientes de la dosis de PEG-SA-Pep sobre los niveles de PD-L1 en plasma, se administró por vía intravenosa dos veces cada formulación de péptido. Un día después de la inyección final, se recogió sangre y se separó el plasma. Los TDE derivados del plasma se aislaron utilizando un kit de aislamiento total de exosomas (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los niveles de PD-L1 asociados a los TDE se cuantificaron utilizando un kit ELISA de PD-L1 de ratón (número DY1019-05; R&D Systems).

Eficacia antitumoral in vivo de PEG-SA-Pep

El día 12 después de la inoculación subcutánea de células B16F10, los ratones C57BL/6 portadores de tumores se asignaron aleatoriamente a ocho grupos de tratamiento: G1 (PBS), G2 (AH-Pep), G3 (PEG-NA-Pep), G4 (PEG-SA-Pep), G5 (aPD-1), G6 (AH-Pep+aPD-1), G7 (PEG-NA-Pep+aPD-1) y G8 (PEG-SA-Pep+aPD-1). Los ratones recibieron una inyección intravenosa de péptidos a 15 mg/kg en 200 μl de PBS y una inyección intraperitoneal de aPD-1 a 5 mg/kg de aPD-1 en un volumen de 100 μl. Los volúmenes tumorales y el peso corporal se midieron diariamente. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: volumen (mm3) = 0,5 × longitud (mm) × anchura2 (mm2). Los ratones se sacrificaron de acuerdo con las directrices de cuidado de los animales si el diámetro del tumor excedía los 20 mm, si la carga tumoral alcanzaba el 15% del peso corporal o si la pérdida de peso corporal excedía el 20%. Todos los ratones se sacrificaron antes del día 21, antes de alcanzar la carga tumoral máxima permitida. Se recogieron el tumor, los principales órganos y las muestras de sangre para análisis posteriores.

Evaluación in vivo de la respuesta inmune antitumoral

Para analizar las células CD8+ dentro de las células TIL CD45+, los tejidos tumorales se disociaron enzimáticamente utilizando un kit de disociación tumoral y un disociador GentleMACS (Miltenyi Biotec). Los suspensiones resultantes se filtraron secuencialmente a través de tamices celulares de 70 y 40 μm para obtener suspensiones de células individuales. Las células TIL se enriquecieron utilizando Microbeads CD45 (Miltenyi Biotec) según el protocolo del fabricante. Las células TIL aisladas se bloquearon primero con Trustain FcXTM (número de catálogo 101320, Biolegend) y, a continuación, se tiñeron con anti-CD3 conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 100245, Biolegend), anti-CD8a conjugado con Alexa Fluor 488 (número de catálogo 100726, Biolegend), anti-CD233 (LAG-3) conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 125223, Biolegend) y anti-CD279 (PD-1) conjugado con FITC (número de catálogo 135213, Biolegend) para el análisis por citometría de flujo.

Para investigar la población de células Tregs, que se caracterizan por la expresión de células CD25+Foxp3+ entre las células T CD4+, las células se tiñeron con anti-CD25 conjugado con azul Pacífico (número de catálogo 102021; Biolegend), anti-Foxp3 conjugado con Alexa Fluor 488 (número de catálogo 320011; Biolegend) y anti-CD4 conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 100455; Biolegend).

Para evaluar la proliferación antígeno-específica de las células T esplénicas, los bazo se disociaron mecánicamente y se pasaron a través de un tamiz celular de 40 μm para generar suspensiones de células individuales. Las células esplénicas aisladas se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo en placas de 12 pocillos suplementadas con medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS, un 1% de AA, una solución de aminoácidos no esenciales 1× (número de catálogo M7145; MilliporeSigma) y 50 μM de β-mercaptoetanol (número de catálogo 60-24-2; MilliporeSigma). Las células se estimularon con GP100, un antígeno asociado al melanoma. Después de 48 h, las células T esplénicas se tiñeron con anti-Ki-67 conjugado con PE/Dazzle 594 (número de catálogo 652409; Biolegend) para evaluar la proliferación. Todas las células marcadas de los tumores y los bazo se analizaron mediante citometría de flujo (MACSQuant VYB, Miltenyi Biotec), y los datos se procesaron con el software FlowJo™.

Aislamiento y activación de células T adoptivas

Para el experimento de transferencia adoptiva de células T policlonales, se inocularon por vía subcutánea células de cáncer de colon CT26 de ratón en ratones BALB/c. Siete días después de la inoculación, se recogieron los ganglios linfáticos de drenaje tumoral (TDLN) de los ratones con tumor CT26 de acuerdo con un protocolo descrito previamente.^[57] Los TDLN se disociaron mecánicamente para generar suspensiones de células individuales, y las células T CD8+ se aislaron utilizando microesferas magnéticas, como se describió anteriormente. Antes de la transferencia adoptiva, las células T CD8+ aisladas se activaron durante 48 h con anticuerpos anti-CD3 (5 μg/ml) y anti-CD28 (2 μg/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con una solución de aminoácidos no esenciales 1× (MilliporeSigma, número de catálogo M7145) y 50 μM de β-mercaptoetanol (MilliporeSigma, número de catálogo 60-24-2).

Capacidad de infiltración tumoral de las células T adoptivas

Se establecieron los modelos de ratón con tumor CT26, como se describió anteriormente. El día 5 después de la inoculación, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: G1 (PBS), G2 (AH-Pep), G3 (PEG-NA-Pep) y G4 (PEG-SA-Pep). Cada péptido se administró por vía intravenosa a una dosis de 15 mg/kg en 200 μl de PBS. Las células T CD8+ activadas se aislaron de los TDLN de los ratones con tumor CT26 y se marcaron con Dil, un colorante lipofílico utilizado para la tinción de la membrana. El día 15, se recogieron los tejidos tumorales, se incluyeron y se cortaron en secciones criogénicas. Las secciones de tejido se fijaron en acetona fría y se bloquearon con PBS que contenía un 1% de BSA durante 1 h. Para la tinción con α-SMA, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-α-SMA-FITC. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de escaneo láser (CLSM; TCS SP8 HyVolution; Leica Microsystems CMS GmbH, Alemania).

Eficacia antitumoral in vivo de PEG-SA-Pep con ACT

Para estudiar ACT en un modelo de ratón con tumor CT26, se inocularon por vía subcutánea células de cáncer CT26 en ratones BALB/c. El día 7 después de la inoculación, los ratones con tumor se asignaron aleatoriamente a seis grupos de tratamiento: G1 (PBS), G2 (células T + PBS), G3 (células T + IL-12), G4 (AH-Pep + células T + IL-12), G5 (PEG-NA-Pep + células T + IL-12) y G6 (PEG-SA-Pep + células T + IL-12). Los péptidos se administraron por vía intravenosa a una dosis de 15 mg/kg en 200 μl de PBS. Un día antes de la transferencia adoptiva, los ratones se sometieron a linfodepleción mediante inyección intraperitoneal de ciclofosfamida a 4 mg/h. Las células T CD8+ activadas aisladas de los TDLN de los ratones con tumor CT26 se inyectaron por vía intravenosa a una dosis de 2 × 106 células/h. Se administró IL-12 recombinante por vía intratumoral a 60 ng/h. El volumen tumoral se midió diariamente hasta el día 23 utilizando la fórmula: volumen (mm3) = 0,5 × longitud (mm) × anchura2 (mm2).

Estadísticas

Se realizaron análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism 8. Los métodos estadísticos detallados y los valores de p se proporcionan en las leyendas de las figuras. Los niveles de significación se indican como *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001 y ****p < 0,0001; n.s. indica “no significativo”. El número de réplicas experimentales (n) se indica en las leyendas de las figuras, y cada muestra representa una réplica biológica independiente o un experimento separado, según se especifique. Se asumió que los datos seguían una distribución normal, aunque esto no se evaluó formalmente. Tanto la recopilación de datos como el análisis se realizaron de forma ciega con respecto a las condiciones experimentales. Los investigadores desconocían la asignación de los grupos durante los experimentos y la evaluación de los resultados.