Descubrimiento de andamios tetracíclicos de azaindol/indol fusionados con pirimidina como nuevos inhibidores potentes de CDK7.

CDK7 es una serina/treonina quinasa distinta que pertenece a la familia de las quinasas dependientes de ciclinas, y que desempeña funciones esenciales tanto en la regulación del ciclo celular como en el control transcripcional^[1],^[2]. Como subunidad catalítica del complejo ternario de la quinasa activadora de CDK (CAK), que consta de CDK7, ciclina H y MAT1, CDK7 fosforila el bucle T de múltiples CDK, incluyendo CDK1, CDK2, CDK4 y CDK6^[3],^[4]. Esta fosforilación activa estas quinasas, promoviendo así la progresión del ciclo celular. Además de su función en la regulación del ciclo celular, el complejo CAK actúa como un componente del factor de transcripción general IIH (TFIIH), donde CDK7 fosforila el dominio C-terminal (CTD) de la ARN polimerasa II (Pol II) en la serina 5 y la serina 7, ayudando así en la iniciación de la transcripción. Además, CDK7 fosforila CDK9, que a su vez fosforila el CTD de Pol II en Ser2, impulsando así la elongación de la transcripción[5–8]. Más allá de sus funciones principales en el control del ciclo celular y la regulación transcripcional, se ha demostrado que CDK7 ejerce efectos pro-oncogénicos al fosforilar directamente o modular la expresión de factores oncogénicos críticos, como c-Myc^[9],^[10]. Esto enfatiza el papel significativo y diverso de CDK7 en el proceso de oncogénesis.

De hecho, existe una creciente evidencia que indica que la desregulación de CDK7 está estrechamente relacionada con la progresión maligna. La disminución de CDK7 perjudica significativamente la proliferación de las células cancerosas, mientras que se ha documentado una expresión elevada de CDK7 en una variedad de tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, cáncer de pulmón de células pequeñas) y se correlaciona con un mal pronóstico clínico^[1],^[11]. Cabe destacar que las células cancerosas exhiben con frecuencia una "adicción transcripcional", caracterizada por una profunda dependencia de un aumento de la producción transcripcional para apoyar la proliferación rápida y mantener la expresión de factores oncogénicos, como MYC^[10],^[12], RUNX1^[13],^[14] y TAL1^[14], que están asociados con super-potenciadores. CDK7 desempeña un papel crucial en la mediación de esta vulnerabilidad. En consecuencia, CDK7 está surgiendo como un objetivo terapéutico muy prometedor.

Impulsado por su importante potencial terapéutico, el desarrollo de inhibidores selectivos de CDK7 ha surgido como un área de investigación destacada, atrayendo un interés significativo tanto de la comunidad académica como de la industria. Los primeros inhibidores covalentes, como THZ1, demostraron una potente actividad antitumoral al interrumpir la transcripción impulsada por super-potenciadores; sin embargo, sufrieron inhibición fuera del objetivo de CDK12/13, lo que resultó en una represión transcripcional más amplia y toxicidades limitantes de la dosis^[14],^[15]. Los avances posteriores han producido compuestos más selectivos[16–20], que abarcan tanto inhibidores no covalentes (por ejemplo, SY-5609, CT7001/Samuraciclib) como derivados covalentes (por ejemplo, Q901, XL-102/Tacaciclib, YKL-5–124). Actualmente, varios inhibidores de CDK7 están en ensayos clínicos (Figura 1), incluidos tanto inhibidores covalentes (SY-1365, LY3405105, Q901 (NCT05394103), XL102) como agentes no covalentes (CT7001 (NCT04802759), SY-5609 (NCT04929223), TY-2699a (NCT05866692), EOC237 (NCT05895825), GTAEXS-617 (NCT05985655)). Cabe destacar que los primeros inhibidores covalentes, como SY-1365, LY-3405105 y XL102, se interrumpieron debido a una eficacia inadecuada o una toxicidad intolerable^[16],^[21],^[22]. Entre los candidatos que aún están en desarrollo, Samuraciclib ha demostrado tasas de beneficio clínico prometedoras en el cáncer de mama HR+/HER2- después de la progresión del inhibidor de CDK4/6 cuando se administra en combinación con fulvestrant, presentando perfiles de toxicidad manejables^[23]. Además, SY-5609, un inhibidor selectivo de CDK7 no covalente exhaustivamente investigado, se está evaluando actualmente en ensayos clínicos de fase I/II para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (NCT04929223). Sin embargo, persisten desafíos considerables, que incluyen una baja exposición plasmática y una biodisponibilidad oral subóptima^[16], lo que puede limitar su aplicabilidad clínica.

La restricción conformacional lograda a través de la macrocicilización o el cierre de anillos se ha validado como una estrategia eficaz para mejorar la potencia, la selectividad y las propiedades generales similares a las de un fármaco. Este enfoque reduce las penalizaciones entrópicas asociadas con la unión al objetivo y estabiliza la conformación bioactiva^[24],^[25]. En este estudio, presentamos el diseño racional y la evaluación biológica de andamios de azaindol/indol fusionados con pirimidina como inhibidores de CDK7. Estos andamios se derivaron del andamio de SY-5609 utilizando una estrategia de ciclación para restringir la flexibilidad conformacional. Esta investigación condujo a la identificación de 7a, que exhibe una potente actividad in vitro, alta selectividad y una eficacia antitumoral significativa in vivo. En consecuencia, estos hallazgos proporcionan una base sólida para el desarrollo continuo de 7a como un agente terapéutico de próxima generación dirigido a CDK7.

Resultados y discusión

Al comienzo de este proyecto, no estaba disponible ninguna estructura de cocristal de CDK7 humano en complejo con SY-5609. En consecuencia, modelamos el modo de unión de SY-5609 utilizando la estructura Cryo-EM de acceso público del CAK humano en complejo con CT7001, que se ha depositado en el Banco de datos de proteínas (PDB ID: 7B5Q). Luego, acoplamos SY-5609 en el bolsillo de unión al ATP de CDK7 mediante el programa Glide de Schrödinger. Basándonos en este sistema modelado, primero caracterizamos el modo de unión previsto de SY-5609 dentro del bolsillo de unión al ATP de CDK7 (Figura 2A) para guiar el desarrollo de inhibidores de CDK7 más potentes y selectivos.

Se identificaron interacciones intermoleculares clave: el andamio de 2-aminopirimidina se ancla a la región de unión mediante dos enlaces de hidrógeno con Met94; el nitrógeno básico en el anillo de piperidina (unido al grupo amino) forma un enlace de hidrógeno mediado por un puente salino con Asp97, reforzando así la afinidad de unión; el sustituyente de indol en la posición 4 se proyecta hacia afuera para formar un enlace de hidrógeno con Lys41; y el grupo 5-trifluorometilo establece contactos hidrofóbicos con el residuo de la puerta de enlace Phe91, una interacción que puede contribuir a la actividad y la selectividad del objetivo. Basándonos en estas perspectivas de unión, hipotetizamos que la ciclación de la posición 5 del anillo de pirimidina con el resto de indol a través de un enlazador de carbono hidrofóbico lograría dos objetivos clave (Figura 2C): (1) mejorar las interacciones con el bolsillo hidrofóbico formado por Phe91, Ala39 e Ile75; (2) restringir la flexibilidad rotacional del anillo de indol (mediante la restricción conformacional) para mejorar tanto la afinidad de unión como la selectividad del objetivo.

Las simulaciones de acoplamiento (Figura 2B) confirmaron que el derivado de pirimidina-indol fusionado ciclado adoptó un modo de unión superponible con el de SY-5609, lo que validó nuestra base de diseño. En consecuencia, diseñamos y sintetizamos una serie de derivados tetracyclicos de pirimidina-indol fusionados. Las evaluaciones biológicas posteriores y los análisis de la relación estructura-actividad (SAR) identificaron el compuesto 7a como un inhibidor de CDK7 altamente selectivo, que exhibió una potencia superior a la de SY-5609 tanto en los ensayos de inhibición de la quinasa CDK7 como en los ensayos de antiproliferación contra la línea celular de cáncer colorrectal HCT116.

Exploración preliminar de la SAR de los inhibidores tetracyclicos de pirimidina-indol fusionados de CDK7

Como se resume en la Tabla 1, los derivados tetracyclicos sintetizados inicialmente se diseñaron para investigar los impactos del tamaño del anillo fusionado y las variaciones de los sustituyentes (por ejemplo, restos de dimetilpiperidina frente a piperidina) y el reemplazo de grupos funcionales (por ejemplo, metilsulfona en 7c en lugar del grupo óxido de dimetilfosfina (DMPO) en otros compuestos) sobre las actividades biológicas. En términos de inhibición enzimática de CDK7, el compuesto 7a exhibió la actividad más potente con un valor de IC50 de 1,9 nM, que fue superior al del compuesto original SY-5609 (IC50 = 2,5 nM). Para la actividad antiproliferativa contra las células de cáncer colorrectal humano HCT116, 7a también mostró la mayor eficacia (IC50 = 1,7 nM), superando a SY-5609 (IC50 = 11,4 nM). En contraste, todos los compuestos probados mostraron una actividad inhibidora moderada contra las células K562, con valores de IC50 en el rango micromolar (por ejemplo, 1,921 μM para 7a y 2,348 μM para SY-5609). Este perfil se alinea con la selectividad de las células tumorales de SY-5609, lo que implica que los compuestos objetivo pueden compartir un patrón de selectividad de objetivo similar al de la molécula original.

Dado el prometedor potencial de actividad enzimática de CDK7 y la eficacia antiproliferativa de los compuestos 7a-7d, perfilamos aún más sus actividades inhibitorias contra otros miembros de la familia CDK (CDK1/Ciclina A2, CDK2/Ciclina E1, CDK6/Ciclina D3, CDK9/Ciclina T1) (Tabla 2). Cabe destacar que la inhibición fuera del objetivo de CDK1 y CDK6 es un impulsor importante bien documentado de los efectos adversos clínicos de las terapias dirigidas a CDK[26–28].

Como se muestra en la Tabla 2, 7a, 7b y 7d exhibieron una selectividad excepcional para CDK7 sobre estos CDK fuera del objetivo clínicamente relevantes: específicamente, mostraron una selectividad de 277,9-, 243,9- y 2132,4 veces para CDK7 versus CDK1, y aproximadamente 3919-, 2507- y 977 veces de selectividad para CDK7 sobre CDK6, respectivamente. Contra CDK2 y CDK9, estos análogos también mantuvieron una alta selectividad: 7a retuvo una selectividad de aproximadamente 353 y 292 veces, 7b mostró una selectividad de aproximadamente 733 y 383 veces, y 7d exhibió una selectividad de aproximadamente 337 y 135 veces para CDK7.

En contraste, el reemplazo del resto DMPO (presente en 7a, 7b, 7d) con un grupo metilsulfona (en 7c) disminuyó notablemente la inhibición selectiva de CDK7: la selectividad de CDK7/CDK1 disminuyó a 114,7 veces, aproximadamente la mitad de la selectividad de 7a. Estos hallazgos demuestran que el grupo DMPO es fundamental para preservar la inhibición selectiva de CDK7, lo que es favorable para minimizar los posibles efectos secundarios clínicos.

Entre estos análogos, 7a emerge como el candidato principal más prometedor: combina una potente actividad inhibidora de CDK7 (IC50 = 1,9 nM) con una robusta selectividad sobre un panel de CDK fuera del objetivo. Este favorable perfil de actividad-selectividad convierte a 7a en un andamio ideal para la optimización. En consecuencia, seleccionamos 7a como el compuesto principal para llevar a cabo modificaciones estructurales posteriores (centradas en el anillo de benceno de indol y el resto de piperidina), con el fin de profundizar en la exploración de la SAR de este andamio tetracyclico.

Exploración de la SAR de los sustituyentes 2-amino en la pirimidina

Para delinear aún más la SAR del andamio tetracyclico de pirimidina-indol fusionado, a continuación, investigamos el impacto de las modificaciones estructurales en la posición 2-amino del anillo de pirimidina, con los datos biológicos correspondientes resumidos en la Tabla 3.

En primer lugar, el reemplazo del resto de 2-amino-piperidina (el sustituyente clave en el compuesto principal 7a) con restos que contienen hidroxilo (ya sea andamios alquílicos lineales o cicloalquílicos) generalmente resultó en una actividad antiproliferativa disminuida contra las células HCT116: la mayoría de los derivados (por ejemplo, 8a, 8b, 8c, 8e, 8g) exhibieron valores de IC50 de HCT116 en el rango micromolar (2,551–8,357 μM), mucho menos potentes que el compuesto principal. Esta pérdida de potencia se atribuye probablemente a la interrupción del enlace de hidrógeno crítico entre el nitrógeno básico (de la piperidina original) y el residuo Asp97 (Figura 1B), ya que estos sustituyentes que contienen hidroxilo alteran la propiedad electrónica o la orientación espacial del donante de nitrógeno clave.

Cabe destacar que dos derivados (8d y 8f), que poseen cadenas laterales lineales de tres carbonos que contienen grupos hidroxilo, conservaron una actividad antiproliferativa contra HCT116 a nivel nanomolar (CI50 = 110 nM y 170 nM, respectivamente), lo que se correlacionó con su moderada potencia inhibitoria enzimática de CDK7 (CI50 = 4,8 nM para 8d; 21,9 nM para 8f). Esta observación sugiere que la longitud de la cadena de tres carbonos de estos análogos que contienen grupos hidroxilo es favorable para preservar parcialmente la interacción del enlace de hidrógeno con Asp97, conservando así (aunque en menor medida) la actividad. La estereoquímica modula aún más la potencia: el derivado 8e (con un centro quiral configurado en R en la cadena lateral hidroxilo) exhibió una actividad notablemente disminuida contra HCT116 (CI50 = 2550,7 nM), mientras que 8d, que posee una cadena lateral de tres carbonos estructuralmente análoga con un centro quiral configurado en S, conservó la potencia nanomolar, lo que destaca la importancia de la concordancia estereoquímica para una unión óptima al bolsillo de CDK7.

De manera consistente, el compuesto 8l con una actividad antiproliferativa débil contra HCT116 (CI50 = 2835,3 nM) también mostró una potencia inhibitoria de CDK7 sustancialmente reducida (CI50 = 33,6 nM). Estos resultados, en conjunto, refuerzan una correlación positiva entre la inhibición enzimática de CDK7 y la eficacia antiproliferativa celular para este andamiaje tetracíclico, al tiempo que subrayan los papeles críticos de la longitud de la cadena lateral y la estereoquímica en el mantenimiento de la interacción clave del enlace de hidrógeno con Asp97.

En segundo lugar, la modificación del resto 2-amino-piperidina mediante su sustitución por un anillo de pirrolidina (por ejemplo, 8m) o la alteración de la posición del nitrógeno básico en el marco de la piperidina (por ejemplo, el cambio de sustitución meta a para) condujo a una pérdida drástica de la actividad: por ejemplo, 8m mostró una CI50 notablemente elevada contra HCT116 (2179,3 nM). Estos cambios probablemente interrumpen la alineación espacial precisa y la basicidad requeridas para el enlace de hidrógeno clave con el residuo Asp97, lo que destaca el papel crítico del anillo de piperidina (incluida su tamaño y la posición espacial del nitrógeno básico) en el mantenimiento de esta interacción esencial y, en consecuencia, la unión al objetivo y la potencia celular.

Cabe destacar que la introducción de un grupo metilo en el nitrógeno básico del resto 2-amino-piperidina ejerció solo un impacto menor en la actividad: el compuesto 8o conservó una potente actividad antiproliferativa contra HCT116 (CI50 = 35,5 nM), lo que sugiere que esta sutil alquilación es bien tolerada y no compromete la eficacia biológica del andamiaje.

Exploración de la relación estructura-actividad (SAR) de los sustituyentes en el anillo de benceno de indol

Para dilucidar la SAR asociada con los sustituyentes en el anillo de benceno de indol de 7a, se sintetizó una serie de análogos (resumidos en la Tabla 4) y se evaluó su potencia inhibitoria enzimática y sus actividades antiproliferativas celulares.

Inicialmente, el grupo DMPO se reemplazó por grupos funcionales de moléculas pequeñas, como el bromo (9a) y el acetilo (9b). Como se muestra en la Tabla 4, estas modificaciones estructurales tuvieron un efecto insignificante sobre la actividad inhibitoria de CDK7. Específicamente, 9a exhibió una CI50 de 1,7 nM contra CDK7, mientras que 9b mostró una CI50 de CDK7 de 2,4 nM. Ambos valores fueron comparables a los del compuesto original 7a (1,9 nM). Cabe destacar que 9a mostró una potente actividad antiproliferativa contra las células K562 (CI50 = 556,4 nM), lo que difería notablemente de 7a y SY-5609 (este último inhibe preferentemente la proliferación de células HCT116 sobre K562). Esta divergencia en la selectividad celular implica que 9a puede interactuar con entidades moleculares fuera del objetivo. Por lo tanto, se justifica la realización de estudios adicionales de deconvolución del objetivo para verificar su especificidad del objetivo y eliminar posibles efectos fuera del objetivo.

En contraste, el reemplazo del resto DMPO por sustituyentes alicíclicos más voluminosos (por ejemplo, 9c, 9d) que no contienen aceptores de enlaces de hidrógeno condujo a una reducción de la potencia de manera dependiente del volumen. Por ejemplo, 9c, que posee un grupo cicloalquilo de tamaño moderado, exhibió un valor de CI50 de 280,6 nM contra las células HCT116. En comparación, 9d, que contiene un sustituyente alicíclico más voluminoso, mostró una disminución drástica de la potencia antiproliferativa contra las células HCT116 con un valor de CI50 aumentado a 833,6 nM, lo que sugiere que un impedimento estérico excesivo puede interrumpir la conformación óptima de unión ligando-objetivo. Además, esta reducción de la potencia también puede atribuirse a la pérdida de interacciones de enlace de hidrógeno con Lys41, un residuo proximal al bolsillo de unión de CDK7 (Figura 2A).

El desplazamiento del grupo DMPO de la posición 7 a la posición 6 del anillo de benceno de indol (lo que da como resultado 9e) provocó una pérdida completa de la actividad antiproliferativa, con su valor de CI50 contra las células HCT116 superando los 10 μM. Sin embargo, el reemplazo del andamiaje de indol por un resto de azaindol (lo que da como resultado 9f) mejoró significativamente la potencia antiproliferativa contra las células HCT116 (CI50 = 2,095 μM) en comparación con el análogo inactivo con la posición desplazada 9e. Este resultado sugiere que el andamiaje de azaindol puede restaurar parcialmente las interacciones críticas de unión ligando-proteína, lo que puede atribuirse a la distribución electrónica ajustada y la capacidad de enlace de hidrógeno del anillo de azaindol.

Animado por este hallazgo, se sintetizó un panel de derivados de azaindol para optimizar la actividad. El reemplazo del grupo DMPO por sustituyentes de metil carbamato (9g) o sulfonamida (por ejemplo, 9h, 9i, 9j) no solo mejoró la actividad antiproliferativa contra las células HCT116 hasta el rango nanomolar (por ejemplo, 9h: CI50 de HCT116 = 57,6 nM), sino que también preservó o incluso mejoró la potencia inhibitoria de CDK7. Por ejemplo, 9h mostró una CI50 de CDK7 de 1,0 nM, lo que fue más potente que el compuesto original 7a. Sin embargo, estos análogos sufrieron una selectividad comprometida hacia CDK1: 9g y 9h mostraron valores de CI50 de CDK1 de 38,8 nM y 140,9 nM, respectivamente.

Para dilucidar la base estructural que subyace a la actividad inhibitoria mejorada de CDK1 de estos derivados, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular de 9g en complejo con CDK1 (ID de PDB: 6GU3). Como se muestra en la Figura 3A, el modo de unión predicho reveló que el núcleo de aminopirimidina de 9g forma interacciones de enlace de hidrógeno canónicas con el residuo Leu83 de la región de unión. Se observó un enlace de hidrógeno de puente salino entre el nitrógeno de piperidina protonado de 9g y la cadena lateral de carboxilato de Asp86 en CDK1. Además, se detectó un enlace de hidrógeno crucial entre el oxígeno carbonílico del resto de carbamato en 9g y el grupo hidroxilo de Tyr15 en CDK1. Se propone que esta interacción de enlace de hidrógeno adicional es el determinante estructural primario de la potencia inhibitoria aumentada de CDK1 de 9g. En contraste, la superposición estructural del complejo predicho 7a-CDK7 sobre CDK1 (Figura 3B) reveló una colisión estérica entre los sustituyentes de dimetilo del grupo DMPO en 7a y Tyr15 de CDK1. En comparación, en CDK7, estos grupos de dimetilo están orientados hacia el anillo de fenilo de Phe23, formando una interacción hidrofóbica favorable. Este patrón de unión distinto subraya el papel crítico del grupo DMPO en la conferencia tanto de la afinidad de unión como del reconocimiento selectivo de CDK7 sobre otros miembros de la familia CDK.

Cabe destacar que el reemplazo del grupo DMPO por restos heterocíclicos de cinco miembros produjo derivados que conservaron una potente actividad inhibitoria de CDK7 y eficacia antiproliferativa contra las células HCT116, comparable a la de 7a. Curiosamente, 9m (CI50 de CDK7 = 4,3 nM) que posee un grupo pirazol en la posición C6 del andamiaje de indol, exhibió una potencia inhibitoria de CDK7 similar a la de 9l (CI50 de CDK7 = 3,6 nM), que incorpora un sustituyente de pirazol en la posición C6 del núcleo de azaindol. Para racionalizar los potentes perfiles biológicos de estos derivados sustituidos por heterociclos, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular de 7a y 9l en complejo con CDK7 (ID de PDB: 8R9U). Como se ilustra en el modelo de unión (Figura 3D), 9l adoptó una conformación similar a la de 7a dentro del sitio activo de CDK7, con tres interacciones clave de enlace de hidrógeno conservadas: (1) el resto de aminopirimidina con Met94 en la región de unión; (2) el átomo de nitrógeno básico de la cadena lateral de piperidina con Asp97; y (3) el grupo NH del sustituyente de azaindol con Asp155. Estas interacciones características, que son fundamentales para la afinidad de unión de 7a, se conservaron bien en 9l, lo que proporciona una base estructural para la potencia inhibitoria de CDK7 comparable de estos análogos sustituidos por heterociclos de cinco miembros.

Lamentablemente, de manera similar a los derivados de carbamato/sulfonamida, estos análogos sustituidos por heterociclos tampoco lograron una selectividad satisfactoria de CDK1. Por ejemplo, 9l exhibió un valor de CI50 de CDK1 de 67,6 nM. Mecánicamente, de manera similar al resto de sulfonamida, se encontró que el grupo pirazol en estos análogos forma un enlace de hidrógeno con el residuo Tyr15 de CDK1 (Figura 3A), una interacción que se propone que contribuye a su unión mejorada a CDK1 y, por lo tanto, a su selectividad comprometida.

En conjunto, la exploración sistemática de la SAR delineó las características farmacofóricas esenciales de este andamiaje de inhibidores de CDK7 tetracíclicos (Figura 4): el núcleo de 2-aminopirimidina actúa como un anclaje de unión al sitio de unión conservado, la cadena lateral de piperidina es indispensable para una unión de alta afinidad al objetivo a través de la interacción con Asp97, el sistema de anillos fusionados rigidiza la conformación molecular para optimizar la ocupación del bolsillo hidrofóbico y el sustituyente DMPO funciona como el interruptor de selectividad crítico para lograr una inhibición específica de CDK7 sobre otros miembros de la familia CDK. Las modificaciones estructurales menores a estos motivos centrales pueden conducir a cambios drásticos en la potencia enzimática, la eficacia celular y la selectividad de isoforma, lo que proporciona una hoja de ruta clara y racional para la optimización estructural posterior de esta serie de inhibidores.

Efectos celulares de 7a

Como subunidad catalítica central de la factor de iniciación de la transcripción TFIIH, CDK7 se ha establecido como un mediador de la fosforilación del residuo Ser5 dentro de los repetidos heptapéptidos de CTD de la ARN polimerasa II^[5-8]. Dado que 7a exhibe una potente actividad inhibitoria contra CDK7 en los ensayos bioquímicos de quinasa y ejerce robustos efectos antiproliferativos en las células de cáncer de colon HCT116, a continuación, buscamos validar estas observaciones a nivel celular, centrándonos en las consecuencias funcionales de 7a en el eje de fosforilación de CDK7-ARN polimerasa II CTD. SY-5609 se incluyó como un control positivo. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con 7a o SY-5609 indujo una reducción dependiente de la concentración de los niveles de p-Ser5 de la ARN polimerasa II en relación con el control de DMSO. Estos hallazgos proporcionan evidencia celular directa de que 7a se dirige e inhibe la actividad de la quinasa CDK7 en las células HCT116 intactas. La supresión de la fosforilación de p-Ser5 de la ARN polimerasa II por 7a es indicativa de la unión del objetivo CDK7 en el contexto celular. Esto es compatible con un papel de la inhibición de CDK7 en el mecanismo antiproliferativo de 7a, aunque se requieren experimentos adicionales para determinar si este representa el mecanismo de acción primario o actúa en concierto con otras vías.

Perfil ADME in vitro y perfil farmacocinético in vivo de 7a

Dado que 7a presenta una prometedora actividad in vitro, a continuación, caracterizamos sus propiedades ADME in vitro y su perfil farmacocinético in vivo en ratones, como se resume en la Tabla 5. 7a exhibió una baja permeabilidad de Caco-2 y una alta relación de eflujo (ER), lo que indica que es un sustrato potencial de la glicoproteína P (P-gp), una proteína transportadora ABC que media en el eflujo de xenobióticos a través de las membranas biológicas y que se asocia con frecuencia con la resistencia a los fármacos y la absorción oral deficiente. La baja permeabilidad puede deberse a su lipofilicidad subóptima (cLogD = 0,36), un atributo fisicoquímico clave que rige la difusión transmembrana pasiva.

Para la estabilidad metabólica, 7a mostró un rendimiento in vitro favorable en microsomas hepáticos humanos, como lo demuestra una moderada aclaración intrínseca (CLint = 14,34 ml/min/kg). Tras la administración intravenosa a ratones a 1 mg/kg (n = 3), 7a mostró una aclaración sistémica moderada (Cl = 65,1 ml/min/kg) y una exposición plasmática razonable (AUC(0-t) = 251,6 h*ng/ml). En contraste, la administración oral de 7a a ratones a 5 mg/kg (n = 3) resultó en una disminución sustancial del rendimiento farmacocinético: la Cmax disminuyó a 27 ng/ml, la AUC0-t disminuyó a 30,2 h·ng/ml y la biodisponibilidad oral (F%) fue de solo el 2,4%. Esta escasa exposición oral se alinea con la lipofilicidad subóptima de 7a y su propiedad de ser sustrato de P-gp (alta ER), dos determinantes bien reconocidos de la absorción oral limitada de fármacos.

Eficacia antitumoral in vivo de 7a en el modelo de xenoinjerto HCT116

Para caracterizar aún más la eficacia antitumoral in vivo del compuesto 7a, evaluamos su actividad terapéutica en un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal humano HCT116 establecido en ratones BALB/c nude hembra. Dado que la biodisponibilidad oral de 7a es baja, los animales recibieron 7a mediante inyección intraperitoneal (i.p.) a dosis de 5 mg/kg y 20 mg/kg, una vez al día (QD) durante 21 días consecutivos. SY-5609, un control positivo clínicamente validado, se administró por vía oral (p.o.) a 2 mg/kg QD durante el mismo período de tratamiento. El volumen tumoral y el peso corporal se controlaron semanalmente durante todo el estudio para evaluar simultáneamente la eficacia antitumoral y la tolerabilidad sistémica. Como se muestra en la Figura 6, el grupo control vehículo fue sacrificado prematuramente, ya que los volúmenes tumorales en estos ratones excedieron el volumen tumoral máximo permitido de 2000 mm³, de acuerdo con las directrices éticas institucionales. Este hallazgo refleja un crecimiento tumoral sin restricciones en ausencia de tratamiento. En contraste, el compuesto 7a exhibió una robusta actividad antitumoral dependiente de la dosis contra los xenoinjertos HCT116, con un crecimiento tumoral significativamente inhibido de manera dependiente de la dosis. En particular, la eficacia antitumoral de 7a a 5 mg/kg fue comparable a la del control positivo SY-5609, lo que subraya su potente actividad antitumoral a esta dosis. Es importante destacar que no se observaron cambios significativos en el peso corporal entre los grupos de tratamiento, lo que indica un perfil de seguridad preliminar favorable de 7a a las dosis probadas.

En conjunto, hemos identificado con éxito un andamio tetracíclico de pirimidina fusionada con indol/azaindol como un nuevo quimiotipo de inhibidores de CDK7 altamente selectivos. Estos hallazgos demuestran que 7a, a pesar de sus propiedades farmacocinéticas subóptimas, exhibe una potente eficacia antitumoral in vivo y, por lo tanto, justifica una mayor optimización estructural para mejorar su perfil farmacocinético al tiempo que se conserva su actividad inhibidora específica de CDK7 y su eficacia antitumoral.

Exploración preliminar de la relación estructura-actividad (SAR) de los inhibidores de CDK7 tetracíclicos de pirimidina fusionada con indol

Como se resume en la Tabla 1, los derivados tetracíclicos sintetizados inicialmente se diseñaron para investigar los efectos del tamaño del anillo fusionado y las variaciones de los sustituyentes (por ejemplo, grupos dimetilpiperidina frente a piperidina) y el reemplazo de grupos funcionales (por ejemplo, metilsulfona en 7c en lugar del grupo óxido de dimetilfosfina (DMPO) en otros compuestos) sobre las actividades biológicas. En términos de inhibición enzimática de CDK7, el compuesto 7a exhibió la actividad más potente con un valor de IC50 de 1,9 nM, que fue superior al del compuesto original SY-5609 (IC50 = 2,5 nM). Para la actividad antiproliferativa contra las células de cáncer colorrectal humano HCT116, 7a también mostró la mayor eficacia (IC50 = 1,7 nM), superando a SY-5609 (IC50 = 11,4 nM). En contraste, todos los compuestos probados mostraron una actividad inhibidora moderada contra las células K562, con valores de IC50 en el rango micromolar (por ejemplo, 1,921 μM para 7a y 2,348 μM para SY-5609). Este perfil se alinea con la selectividad de las células tumorales de SY-5609, lo que implica que los compuestos objetivo pueden compartir un patrón de selectividad de objetivo similar al de la molécula original.

Dado que los compuestos 7a a 7d presentan una prometedora actividad enzimática de CDK7 y eficacia antiproliferativa, analizamos más a fondo sus actividades inhibitorias contra otros miembros de la familia CDK (CDK1/ciclina A2, CDK2/ciclina E1, CDK6/ciclina D3, CDK9/ciclina T1) (Tabla 2). En particular, la inhibición fuera del objetivo de CDK1 y CDK6 es un factor importante bien documentado que contribuye a los efectos adversos clínicos de las terapias dirigidas a CDK^[26-28].

Como se muestra en la Tabla 2, 7a, 7b y 7d exhibieron una selectividad excepcional para CDK7 sobre estos CDK fuera del objetivo clínicamente relevantes: específicamente, mostraron una selectividad de 277,9-, 243,9- y 2132,4 veces para CDK7 frente a CDK1, y aproximadamente 3919-, 2507- y 977 veces de selectividad para CDK7 sobre CDK6, respectivamente. Contra CDK2 y CDK9, estos análogos también mantuvieron una alta selectividad: 7a retuvo una selectividad de aproximadamente 353 y 292 veces, 7b mostró una selectividad de aproximadamente 733 y 383 veces, y 7d exhibió una selectividad de aproximadamente 337 y 135 veces para CDK7.

En contraste, reemplazar el grupo DMPO (presente en 7a, 7b, 7d) con un grupo metilsulfona (en 7c) disminuyó notablemente la inhibición selectiva de CDK7: la selectividad de CDK7/CDK1 disminuyó a 114,7 veces, aproximadamente la mitad de la selectividad de 7a. Estos hallazgos demuestran que el grupo DMPO es fundamental para preservar la inhibición selectiva de CDK7, lo que es favorable para minimizar los posibles efectos secundarios clínicos.

Entre estos análogos, 7a emerge como el candidato principal más prometedor: combina una potente actividad inhibidora de CDK7 (IC50 = 1,9 nM) con una robusta selectividad sobre un panel de CDK fuera del objetivo. Este favorable perfil de actividad-selectividad convierte a 7a en un andamio ideal para la optimización. En consecuencia, seleccionamos 7a como el compuesto principal para llevar a cabo modificaciones estructurales posteriores (centradas en el anillo de benceno de indol y el grupo piperidina), con el fin de profundizar en la exploración de la relación estructura-actividad de este andamio tetracíclico.

Exploración de la relación estructura-actividad de los sustituyentes en la posición 2-amino de la pirimidina

Para dilucidar aún más la relación estructura-actividad del andamio tetracíclico de pirimidina fusionada con indol, investigamos a continuación el impacto de las modificaciones estructurales en la posición 2-amino del anillo de pirimidina, con los datos biológicos correspondientes resumidos en la Tabla 3.

En primer lugar, reemplazar el grupo 2-amino-piperidina (el sustituyente clave en el compuesto principal 7a) con cadenas laterales que contienen hidroxilo (ya sean marcos alquílicos lineales o cicloalquílicos) generalmente resultó en una disminución de la actividad antiproliferativa contra las células HCT116: la mayoría de los derivados (por ejemplo, 8a, 8b, 8c, 8e, 8g) exhibieron valores de IC50 de HCT116 en el rango micromolar (2,551-8,357 μM), mucho menos potentes que el compuesto principal. Esta pérdida de potencia probablemente se debe a la interrupción del enlace de hidrógeno crítico entre el nitrógeno básico (de la piperidina original) y el residuo Asp97 (Figura 1B), ya que estos sustituyentes que contienen hidroxilo alteran la propiedad electrónica o la orientación espacial del donante de nitrógeno clave.

En particular, dos derivados (8d y 8f), que contienen cadenas laterales lineales que contienen hidroxilo de tres carbonos, conservaron una actividad antiproliferativa de HCT116 a nivel nanomolar (IC50 = 110 nM y 170 nM, respectivamente), lo que se correlacionó con su actividad inhibidora enzimática de CDK7 moderada (IC50 = 4,8 nM para 8d; 21,9 nM para 8f). Esta observación sugiere que la longitud de la cadena de tres carbonos de estos análogos que contienen hidroxilo es favorable para preservar parcialmente la interacción del enlace de hidrógeno con Asp97, conservando así (aunque reducida) la actividad. La estereoquímica modula aún más la potencia: el derivado 8e (con un centro quiral configurado en R en la cadena lateral de hidroxilo) exhibió una actividad de HCT116 marcadamente disminuida (IC50 = 2550,7 nM), mientras que 8d, que posee una cadena lateral de tres carbonos estructuralmente análoga con un centro quiral configurado en S, conservó una potencia nanomolar, lo que destaca la importancia de la concordancia estereoquímica para una unión óptima al bolsillo de CDK7.

De manera consistente, el compuesto 8l con una actividad antiproliferativa débil de HCT116 (IC50 = 2835,3 nM) también mostró una potencia inhibidora de CDK7 sustancialmente reducida (IC50 = 33,6 nM). Estos resultados en conjunto refuerzan una correlación positiva entre la inhibición enzimática de CDK7 y la eficacia antiproliferativa celular para este andamio tetracíclico, al tiempo que también resaltan los papeles críticos de la longitud de la cadena lateral y la estereoquímica en el mantenimiento de la interacción clave del enlace de hidrógeno con Asp97.

En segundo lugar, modificar el grupo 2-amino-piperidina reemplazándolo con un anillo de pirrolidina (por ejemplo, 8m) o alterar la posición del nitrógeno básico en el marco de piperidina (por ejemplo, cambiar de sustitución meta a para) condujo a una pérdida drástica de la actividad: por ejemplo, 8m mostró un valor de IC50 de HCT116 marcadamente elevado (2179,3 nM). Estos cambios probablemente interrumpen la alineación espacial precisa y la basicidad requeridas para el enlace de hidrógeno clave con el residuo Asp97, lo que destaca el papel crítico del anillo de piperidina (incluido su tamaño y la posición espacial del nitrógeno básico) en el mantenimiento de esta interacción esencial y, en consecuencia, la unión al objetivo y la potencia celular.

En particular, introducir un grupo metilo en el nitrógeno básico del grupo 2-amino-piperidina ejerció solo un impacto menor en la actividad: el compuesto 8o conservó una potente actividad antiproliferativa de HCT116 (IC50 = 35,5 nM), lo que sugiere que esta sutil alquilación es bien tolerada y no compromete la eficacia biológica del andamio.

Exploración de la relación estructura-actividad de los sustituyentes en el anillo de benceno de indol

Para dilucidar la relación estructura-actividad asociada con los sustituyentes en el anillo de benceno de indol de 7a, se sintetizó una serie de análogos (resumidos en la Tabla 4) y se evaluó su potencia inhibidora enzimática y sus actividades antiproliferativas celulares.

Inicialmente, el grupo DMPO se reemplazó con grupos funcionales de moléculas pequeñas, como bromo (9a y acetilo (9b)). Como se muestra en la Tabla 4, estas modificaciones estructurales tuvieron un efecto insignificante en la actividad inhibidora de CDK7. Específicamente, 9a exhibió un valor de IC50 de 1,7 nM contra CDK7, mientras que 9b mostró un valor de IC50 de CDK7 de 2,4 nM. Ambos valores fueron comparables a los del compuesto original 7a (1,9 nM). En particular, 9a mostró una potente actividad antiproliferativa contra las células K562 (IC50 = 556,4 nM), que difería marcadamente de 7a y SY-5609 (este último inhibe preferentemente la proliferación de células HCT116 sobre K562). Esta selectividad celular divergente implica que 9a puede interactuar con entidades moleculares fuera del objetivo. Por lo tanto, se justifican estudios adicionales de deconvolución del objetivo para verificar su especificidad del objetivo y eliminar los posibles efectos fuera del objetivo.

En contraste, reemplazar el grupo DMPO con sustituyentes alicíclicos voluminosos (por ejemplo, 9c, 9d) que no contienen grupos aceptores de enlaces de hidrógeno condujo a una reducción de la potencia de manera dependiente del volumen. Por ejemplo, 9c, que contiene un grupo cicloalquílico de tamaño moderado, exhibió un valor de IC50 de 280,6 nM contra las células HCT116. En comparación, 9d, que tiene un sustituyente alicíclico más voluminoso, mostró una disminución drástica de la potencia antiproliferativa contra las células HCT116 con un valor de IC50 aumentado a 833,6 nM, lo que sugiere que el exceso de impedimento estérico puede interrumpir la conformación óptima de unión ligando-objetivo. Además, esta reducción de la potencia también puede atribuirse a la pérdida de interacciones de enlaces de hidrógeno con Lys41, un residuo proximal al bolsillo de unión de CDK7 (Figura 2A).

Trasladar el grupo DMPO de la posición 7 a la posición 6 del anillo de benceno de indolo (resultando en 9e) provocó una pérdida completa de la actividad antiproliferativa, con su valor de IC50 contra las células HCT116 superando los 10 μM. Sin embargo, reemplazar el andamio de indolo con una fracción de azaindolo (produciendo 9f) mejoró significativamente la potencia antiproliferativa contra las células HCT116 (IC50 = 2,095 μM) en comparación con el análogo inactivo con la posición desplazada, 9e. Este resultado sugiere que el andamio de azaindolo puede restaurar parcialmente las interacciones críticas de unión ligando-proteína, lo que puede atribuirse a la distribución electrónica ajustada y a la capacidad de enlace de hidrógeno del anillo de azaindolo.

Animado por este hallazgo, se sintetizó además un panel de derivados de azaindolo para optimizar la actividad. Reemplazar el grupo DMPO con un grupo metil carbamato (9 g) o sustituyentes sulfonamida (por ejemplo, 9h, 9i, 9j) no solo mejoró la actividad antiproliferativa contra las células HCT116 hasta el rango nanomolar (por ejemplo, 9h: HCT116 IC50 = 57,6 nM), sino que también preservó o incluso mejoró la potencia inhibitoria de CDK7. Por ejemplo, 9h mostró una IC50 de CDK7 de 1,0 nM, lo que fue más potente que el compuesto original 7a. No obstante, estos análogos sufrieron una selectividad comprometida hacia CDK1: 9 g y 9h mostraron valores de IC50 de CDK1 de 38,8 nM y 140,9 nM, respectivamente.

Para dilucidar la base estructural que subyace a la actividad inhibitoria de CDK1 mejorada de estos derivados, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular de 9 g en complejo con CDK1 (ID de PDB: 6GU3). Como se muestra en la Figura 3A, el modo de unión predicho reveló que el núcleo de aminopirimidina de 9 g forma interacciones de enlace de hidrógeno canónicas con el residuo de la región de unión Leu83. Se observó un enlace de hidrógeno de puente salino entre el nitrógeno de piperidina protonado de 9 g y la cadena lateral de carboxilato de Asp86 en CDK1. Además, se detectó un enlace de hidrógeno crucial entre el oxígeno carbonílico de la fracción de carbamato en 9 g y el grupo hidroxilo de Tyr15 en CDK1. Se propone que esta interacción adicional de enlace de hidrógeno es el determinante estructural primario para la potencia inhibitoria de CDK1 aumentada de 9 g. En contraste, la superposición estructural del complejo predicho 7a-CDK7 sobre CDK1 (Figura 3B) reveló una colisión estérica entre los sustituyentes de dimetilo del grupo DMPO en 7a y Tyr15 de CDK1. En comparación, en CDK7, estos grupos de dimetilo están orientados hacia el anillo de fenilo de Phe23, formando una interacción hidrofóbica favorable. Este patrón de unión distinto subraya el papel crítico del grupo DMPO en la conferencia tanto de la afinidad de unión como del reconocimiento selectivo de CDK7 sobre CDK1.

Cabe destacar que reemplazar el grupo DMPO con fracciones heterocíclicas de cinco miembros produjo derivados que conservaron una potente actividad inhibitoria de CDK7 y eficacia antiproliferativa contra las células HCT116, comparable a la de 7a. Curiosamente, 9 m (CDK7 IC50 = 4,3 nM) que porta un grupo pirazol en la posición C6 del andamio de indolo, exhibió una potencia inhibitoria de CDK7 similar a la de 9 l (CDK7 IC50 = 3,6 nM), que incorpora un sustituyente pirazol en la posición C6 del núcleo de azaindolo. Para racionalizar los potentes perfiles biológicos de estos derivados sustituidos con heterociclos, realizamos simulaciones de acoplamiento molecular de 7a y 9 l en complejo con CDK7 (ID de PDB: 8R9U). Como se ilustra en el modelo de unión (Figura 3D), 9 l adoptó una conformación similar a la de 7a dentro del sitio activo de CDK7, con tres interacciones clave de enlace de hidrógeno conservadas: (1) el motivo de aminopirimidina con Met94 en la región de unión; (2) el átomo de nitrógeno básico de la cadena lateral de piperidina con Asp97; y (3) el grupo NH del sustituyente de azaindolo con Asp155. Estas interacciones características, cruciales para la afinidad de unión de 7a, se conservaron bien en 9 l, proporcionando una justificación estructural para la potencia inhibitoria de CDK7 comparable de estos análogos sustituidos con heterociclos de cinco miembros.

Lamentablemente, de manera similar a los derivados de carbamato/sulfonamida, estos análogos sustituidos con heterociclos tampoco lograron una selectividad de CDK1 satisfactoria. Por ejemplo, 9 l exhibió un valor de IC50 de CDK1 de 67,6 nM. Mecánicamente, de manera similar a la fracción de sulfonamida, se descubrió que el grupo pirazol en estos análogos forma un enlace de hidrógeno con el residuo de Tyr15 de CDK1 (Figura 3A), una interacción que se propone que contribuye a su unión a CDK1 mejorada y, por lo tanto, a su selectividad comprometida.

En conjunto, la exploración sistemática de la relación estructura-actividad (SAR) delineó las características farmacofóricas esenciales de este andamio tetracíclico de inhibidores de CDK7 (Figura 4): el núcleo de 2-aminopirimidina actúa como el anclaje de unión a la región de unión conservada, la cadena lateral de piperidina es indispensable para el compromiso del objetivo de alta afinidad a través de la interacción de Asp97, el sistema de anillos fusionados rigidiza la conformación molecular para optimizar la ocupación de la cavidad hidrofóbica, y el sustituyente DMPO funciona como el interruptor de selectividad crítico para lograr una inhibición específica de CDK7 sobre otros miembros de la familia CDK. Las modificaciones estructurales menores a estos motivos centrales pueden conducir a cambios drásticos en la potencia enzimática, la eficacia celular y la selectividad de isoforma, lo que proporciona una hoja de ruta clara y racional para la optimización estructural posterior de esta serie de inhibidores.

Efectos celulares de 7a

Como subunidad catalítica central del factor de iniciación de la transcripción TFIIH, se ha establecido que CDK7 media en la fosforilación del residuo de Ser5 dentro de las repeticiones heptapéptidas de CTD de RNA Pol II[5–8]. Dado que 7a exhibe una potente actividad inhibitoria contra CDK7 en ensayos bioquímicos de quinasa y ejerce robustos efectos antiproliferativos en las células de cáncer de colon HCT116, a continuación, buscamos validar estas observaciones a nivel celular, centrándonos en las consecuencias funcionales de 7a en el eje de fosforilación de CDK7-RNA Pol II CTD. SY-5609 se incluyó como un control positivo. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con 7a o SY-5609 indujo una reducción dependiente de la concentración en los niveles de p-Ser5 RNA Pol II en relación con el control de DMSO. Estos hallazgos proporcionan evidencia celular directa de que 7a se dirige e inhibe la actividad de la quinasa CDK7 en las células HCT116 intactas. La supresión de la fosforilación de p-Ser5 RNA Pol II por 7a indica el compromiso del objetivo CDK7 en el contexto celular. La supresión de la fosforilación de p-Ser5 RNA Pol II por 7a indica el compromiso del objetivo CDK7 en el contexto celular. Esto es compatible con un papel de la inhibición de CDK7 en el mecanismo antiproliferativo de 7a, aunque se requieren experimentos adicionales para determinar si este representa el mecanismo de acción primario o actúa en concierto con otras vías.

Efectos celulares de 7a

Como subunidad catalítica central del factor de iniciación de la transcripción TFIIH, se ha establecido que CDK7 media en la fosforilación del residuo de Ser5 dentro de las repeticiones heptapéptidas de CTD de RNA Pol II[5–8]. Dado que 7a exhibe una potente actividad inhibitoria contra CDK7 en ensayos bioquímicos de quinasa y ejerce robustos efectos antiproliferativos en las células de cáncer de colon HCT116, a continuación, buscamos validar estas observaciones a nivel celular, centrándonos en las consecuencias funcionales de 7a en el eje de fosforilación de CDK7-RNA Pol II CTD. SY-5609 se incluyó como un control positivo. Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con 7a o SY-5609 indujo una reducción dependiente de la concentración en los niveles de p-Ser5 RNA Pol II en relación con el control de DMSO. Estos hallazgos proporcionan evidencia celular directa de que 7a se dirige e inhibe la actividad de la quinasa CDK7 en las células HCT116 intactas. La supresión de la fosforilación de p-Ser5 RNA Pol II por 7a indica el compromiso del objetivo CDK7 en el contexto celular. La supresión de la fosforilación de p-Ser5 RNA Pol II por 7a indica el compromiso del objetivo CDK7 en el contexto celular. Esto es compatible con un papel de la inhibición de CDK7 en el mecanismo antiproliferativo de 7a, aunque se requieren experimentos adicionales para determinar si este representa el mecanismo de acción primario o actúa en concierto con otras vías.

Perfil ADME in vitro y perfil farmacocinético in vivo de 7a

Dado que 7a presenta una prometedora actividad in vitro, a continuación, caracterizamos sus propiedades ADME in vitro y su perfil farmacocinético in vivo en ratones, como se resume en la Tabla 5. 7a exhibió una baja permeabilidad de Caco-2 y una alta relación de eflujo (ER), lo que indica que es un sustrato potencial de la P-glucoproteína (P-gp), una proteína transportadora ABC que media en el eflujo de xenobióticos a través de las membranas biológicas y que se asocia con frecuencia con la resistencia a los fármacos y la absorción oral deficiente. La baja permeabilidad puede deberse a su lipofilicidad subóptima (cLogD = 0,36), un atributo fisicoquímico clave que rige la difusión transmembrana pasiva.

Para la estabilidad metabólica, 7a mostró un rendimiento in vitro favorable en microsomas de hígado humano, como lo demuestra el aclaramiento intrínseco moderado (CLint = 14,34 mL/min/kg). Tras la administración intravenosa a ratones a 1 mg/kg (n = 3), 7a mostró un aclaramiento sistémico moderado (Cl = 65,1 mL/min/kg) y una exposición plasmática razonable (AUC(0-t) = 251,6 h*ng/mL). En contraste, la administración oral de 7a a ratones a 5 mg/kg (n = 3) resultó en un rendimiento farmacocinético sustancialmente disminuido: la Cmax disminuyó a 27 ng/mL, la AUC0-t disminuyó a 30,2 h·ng/mL y la biodisponibilidad oral (F%) fue de solo el 2,4%. Esta mala exposición oral se alinea con la lipofilicidad subóptima de 7a y la propiedad de sustrato de P-gp (alta ER), dos determinantes bien reconocidos de la absorción oral limitada de fármacos.

Eficacia antitumoral in vivo de 7a en el modelo de xenoinjerto HCT116

Para caracterizar aún más la eficacia antitumoral in vivo del compuesto 7a, evaluamos su actividad terapéutica en un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal humano HCT116 establecido en ratones BALB/c hembra. Dado que 7a tiene baja biodisponibilidad oral, los animales recibieron 7a mediante inyección intraperitoneal (i.p.) a dosis de 5 mg/kg y 20 mg/kg, una vez al día (QD) durante 21 días consecutivos. SY-5609, un control positivo clínicamente validado, se administró por vía oral (p.o.) a 2 mg/kg QD durante el mismo período de tratamiento. El volumen tumoral y el peso corporal se controlaron semanalmente durante todo el estudio para evaluar simultáneamente la eficacia antitumoral y la tolerabilidad sistémica. Como se muestra en la Figura 6, el grupo control del vehículo fue sacrificado prematuramente, ya que los volúmenes tumorales en estos ratones excedieron el volumen tumoral máximo permitido de 2000 mm³, de acuerdo con las pautas éticas institucionales. Este hallazgo refleja un crecimiento tumoral sin restricciones en ausencia de tratamiento. En contraste, el compuesto 7a exhibió una robusta actividad antitumoral dependiente de la dosis contra los xenoinjertos de HCT116, con un crecimiento tumoral significativamente inhibido de manera dependiente de la dosis. En particular, la eficacia antitumoral de 7a a 5 mg/kg fue comparable a la del control positivo SY-5609, lo que subraya su potente actividad antitumoral a esta dosis. Es importante destacar que no se observaron cambios significativos en el peso corporal en los grupos de tratamiento, lo que indica un perfil de seguridad preliminar favorable de 7a a las dosis probadas.

En conjunto, hemos identificado con éxito un andamio tetracíclico de indolo/azaindolo fusionado como un nuevo quimiotipo de inhibidores de CDK7 altamente selectivos. Estos hallazgos demuestran que 7a, a pesar de sus propiedades farmacocinéticas subóptimas, exhibe una potente eficacia antitumoral in vivo y, por lo tanto, justifica una mayor optimización estructural para mejorar su perfil farmacocinético al tiempo que se conserva su actividad inhibitoria específica de CDK7 y su eficacia antitumoral.

Síntesis química

La síntesis de derivados de indolo/azaindolo fusionados se describió a través de las vías sintéticas descritas en los Esquemas 1 a 3.

Como se ilustra en el Esquema 1, la construcción del núcleo tetracíclico comenzó con indoles/azaindoles hidrazinas disponibles comercialmente (10) y cetonas cíclicas (11). Estos sustratos se sometieron a la síntesis de indoles de Fischer para obtener los correspondientes intermedios tricíclicos fusionados de indol/azaindol (12). La posterior introducción del grupo protector N-(trimetilsilil)etoximetilo (SEM) (13) se llevó a cabo en condiciones básicas (NaH/THF). La oxidación regioselectiva del carbono α adyacente al grupo carbonilo se logró posteriormente utilizando 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ), obteniendo suavemente el derivado de cetona (14).

A continuación, la adición nucleofílica de formiato de etilo a la posición α de la cetona (promovida por t-BuOK en tolueno) produjo el intermedio hidroximetileno (15), que se utilizó directamente en la condensación con el derivado de guanidina (19) para construir el anillo de pirimidina, obteniendo así el importante andamio tetracíclico fusionado de indol/azaindol (16). La posterior funcionalización del grupo bromuro aromático se logró con éxito mediante tres estrategias de acoplamiento catalítico distintas: reacciones de acoplamiento cruzado catalizadas por paladio (compuestos 17, 9b, 9c-9d, 9 g-9k, 9n-9q), acoplamiento mediado por yoduro cuproso(I) (compuesto 26) y acoplamiento catalizado por el sistema óxido cuproso(I)/salicilaldoxima (compuestos 9 l, 9 m, 9r).

La desprotección eficiente del grupo SEM se logró mediante una secuencia de dos pasos: el tratamiento con HCl/dioxano a 60 °C produjo solo una desprotección parcial (normalmente, la eliminación del segmento trimetilsiletilo, manteniendo el grupo hidroximetilo). Afortunadamente, la concentración de la mezcla de reacción seguida de la agitación con etilendiamina (EDA) permitió la eliminación suave del grupo hidroximetilo residual, proporcionando los compuestos objetivo. Para los derivados que contienen piperidina (7a, 7d, 8n, 9a-9r)/pirrolidina (8 m) o grupos ciclobutanol (8i), se introdujo ocasionalmente un grupo protector terc-butoxicarbonilo (Boc) o terc-butildimetilsililo (TBS); notablemente, este grupo Boc y TBS se pudo eliminar simultáneamente con la desprotección del SEM.

La síntesis de los compuestos 7b-7c, 7e, 8i y 8 m se muestra en el Esquema 2. Para estos compuestos, aunque la formación del anillo de pirimidina mediante la condensación del intermedio hidroximetileno con derivados de guanidina era factible, esta vía presentaba rendimientos insatisfactoriamente bajos. Para abordar esto, el intermedio hidroximetileno (15a o 15d) se convirtió primero en un derivado de pirimidin-2-amina mediante la reacción con guanidina. Posteriormente, el grupo 2-amino se transformó en un grupo saliente de trifluorometanosulfonato (OTf), que luego se sometió a una sustitución nucleofílica eficiente con derivados de amina primaria (22–1, 22–2 o 22–3) para obtener los correspondientes intermedios (24, 25). Los compuestos objetivo finales 7b-7c, 7e, 8i y 8 m se obtuvieron posteriormente mediante pasos secuenciales de acoplamiento cruzado y desprotección global.

Sección experimental

Química

A menos que se especifique lo contrario, los materiales de partida y los disolventes cromatográficos se compraron a proveedores comerciales y se utilizaron sin purificación posterior. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C se adquirieron en un espectrómetro Bruker AV400 MHz o AV 600 MHz, con DMSO-d6 (δ H = 2.50 ppm, δ C = 39.52 ppm), metanol-d4 (δ H = 3.31 ppm, δ C = 49.00 ppm) o cloroformo-d (δ H = 7.26 ppm, δ C = 77.16 ppm) como disolvente deuterado y tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Los desplazamientos químicos (δ) se informaron en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se indicaron en Hz. Las multiplicidades de la señal se designaron como s (uniplete), d (duble), dd (doble de dobletes), ddd (doble de doblete de dobletes), dt (doble de tripletes), t (triplete), q (cuarteto), br s (uniplete ancho) y m (multiplete). La cromatografía en columna se llevó a cabo bajo presión utilizando gel de sílice disponible comercialmente (200-300 malla). Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se registraron en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap. La pureza de todos los compuestos finales se determinó mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), y se confirmó que todos tenían una pureza > 95%.

Procedimientos generales para la síntesis del compuesto 12a, 12b y 12d

El compuesto 10 (1.00 equiv.) y cicloheptanona (11a, 1.00 equiv.) o 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b, 1.00 equiv.) se disolvieron en ácido acético (0.22 M) y se calentaron a reflujo a 145 °C durante 2 h. Después de la finalización, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y luego se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3, que luego se extrajo con EtOAc tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Finalmente, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, éter de petróleo) para obtener los compuestos 12a, 12b y 12d (rendimiento del 45-87%).

4-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol (12a)

Se utilizaron clorhidrato de 2-bromofenilhidrazina (10a) y cicloheptanona (11a) para preparar el compuesto 12a (aceite amarillo pálido, rendimiento del 87%). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7.87 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 2.87 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.94-1.87 (m, 2H), 1.82-1.74 (m, 4H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 138.30, 132.81, 130.38, 122.83, 120.17, 116.88, 115.08, 103.86, 31.73, 29.53, 28.60, 27.38, 24.93.

3-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol (12b)

Se utilizaron clorhidrato de 3-bromofenilhidrazina (10b) y cicloheptanona (11a) para preparar la mezcla del compuesto 12b y 1-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol en una relación de 1:1 (aceite amarillo pálido, rendimiento del 83%).

8-bromo-1,1-dimetil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol (12d)

Se utilizaron clorhidrato de 2-bromofenilhidrazina (10a) y 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b) para preparar el compuesto 12d (aceite amarillo pálido, rendimiento del 45.2%). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7.83 (s, 1H), 7.38 (dt, J = 7.8, 0.8 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.92-1.87 (m, 2H), 1.76-1.72 (m, 2H), 1.35 (s, 6H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 142.59, 134.28, 128.96, 123.42, 120.31, 117.34, 110.18, 104.28, 39.21, 31.61, 29.26, 21.51, 20.15.

Síntesis del compuesto 12c

Se añadieron 2-bromo-6-hidrazinilpiridina (10c, 1 g, 5.32 mmol) y ciclohexanona (11a, 595 mg, 5.32 mmol) en ácido polifosfórico (1 g) y se calentó a 160 °C durante 16 h. Después de la finalización, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y luego se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3, que luego se extrajo con EtOAc (200 mL × 3). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Finalmente, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, éter de petróleo a éter de petróleo/EtOAc = 10/1) para obtener el compuesto 13c (aceite amarillo pálido, rendimiento del 79%). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.63 (s, 2H), 3.47 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 1.95-1.86 (m, 2H), 1.83-1.71 (m, 4H), 0.90 (t, J = 8.2 Hz, 2H), -0.08 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 148.68, 141.43, 134.57, 129.01, 120.91, 120.59, 115.05, 71.06, 67.00, 32.94, 29.58, 28.35, 27.89, 25.90, 19.08, -0.00.

8-bromo-1,1-dimetil-9-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol (13d)

Se utilizó el intermedio 12d y DMF anhidro para preparar el compuesto 13d (aceite amarillo pálido, rendimiento del 93%). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7.37-7.31 (m, 2H), 6.91 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 5.84 (s, 2H), 3.60 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.89-1.81 (m, 2H), 1.77-1.72 (m, 2H), 1.44 (s, 6H), 0.99-0.94 (m, 2H), -0.01 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 143.95, 133.75, 131.55, 127.60, 120.81, 117.41, 111.90, 103.82, 72.92, 64.03, 43.41, 32.64, 28.93, 21.90, 19.74, 18.25, -1.44.

Procedimiento general para la síntesis del intermedio 14

A una solución del intermedio 13 (1.00 equiv.) en una mezcla de THF/H2O (V/V = 10/1, 0.13-0.23 M) o una mezcla de dioxano/H2O (V/V = 10/1, 0.10 M) se añadió 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ, 2.00 equiv.) porciones a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 h) y luego se apagó con la adición de una solución saturada de NaHCO3. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se extrajo con MTBE tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Finalmente, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo a éter de petróleo/EtOAc = 10/1 o éter de petróleo a éter de petróleo/EtOAc = 4/1) para obtener el intermedio 14 (rendimiento del 55-67%).

4-bromo-5-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7,8,9-tetrahidro-ciclohepta[b]indol-10(5H)-ona (14a)

El intermedio 15a y el intermedio crudo 19–7 se utilizaron para preparar el compuesto 16 g. Sólido amarillo, con un rendimiento del 66%. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,65 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,43 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,05 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 6,00 (s, 2H), 5,24 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,65 (dd, J = 15,9, 6,4 Hz, 6H), 3,20 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,64–2,59 (m, 2H), 2,20–2,11 (m, 2H), 1,78 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 0,95–0,88 (m, 2H), –0,04 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 161,91, 156,33, 145,12, 133,74, 130,39, 129,02, 122,60, 122,35, 121,71, 113,11, 103,18, 71,65, 65,16, 58,52, 37,62, 33,76, 29,14, 27,96, 26,62, 18,28, –1,26. EM-MS (m/z): 517 (M + H)+.

El intermedio 15a y el intermedio crudo 19–8 se utilizaron para preparar el compuesto 16h.

El intermedio 16b se utilizó para preparar el compuesto 7a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 63% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 169,40, 154,79, 151,35, 144,85, 138,60 (d, J = 4,5 Hz), 129,85 (d, J = 7,6 Hz), 128,10, 126,16 (d, J = 10,6 Hz), 123,57, 123,07 (d, J = 12,1 Hz), 116,05 (d, J = 99,7 Hz), 112,28, 47,52, 47,10, 44,93, 31,22, 31,04, 29,26, 24,29, 21,64, 18,33 (d, J = 6,0 Hz), 17,86 (d, J = 7,6 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,34. HRMS (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410,2104, encontrado: 410,2103. Pureza UPLC 100,00%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 7d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 47% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,50 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,57-7,45 (m, 2H), 4,62 (br, s, 1H), 3,70 (dd, J = 12,5, 4,0 Hz, 1H), 3,39 (dt, J = 12,8, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,19 (m, 1H), 3,17-3,07 (m, 1H), 2,93 (s, 2H), 2,34-2,24 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1H), 1,96 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,91-1,81 (m, 1H), 1,47 (s, 3H), 1,46 (s, 3H). RMN de 13C (101 MHz, MeOD) δ 166,75, 160,67, 154,81, 140,25 (d, J = 49,5 Hz), 126,85 (d, J = 7,1 Hz), 126,68 (d, J = 2,0 Hz), 126,46 (d, J = 10,1 Hz), 124,36 (d, J = 12,1 Hz), 119,18, 117,28 (d, J = 100,0 Hz), 116,29, 108,94, 47,38, 47,01, 44,86, 40,03, 33,89, 28,87, 26,62, 26,55, 21,62, 19,07, 17,97. HRMS (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2261, encontrado: 424,2257. Pureza UPLC 99,19%.

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 8a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 55% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,90 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,49 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C20H26N4O2P+ (M + H+): 385,1788, encontrado: 385,1784. Pureza UPLC 95,56%.

El intermedio 16c se utilizó para preparar el compuesto 8b. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 56% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,92 (br, s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,51 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,15-4,05 (m, 1H), 3,58-3,44 (m, 1H), 3,36 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,85-2,72 (m, 2H), 2,12-2,03 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,30 (d, J = 6,3 Hz, 3H). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,61. HRMS (m/z): calculado para C22H28N4O2P+ (M + H+): 411,1944, encontrado: 411,1940. Pureza UPLC 95,05%.

El intermedio 16d se utilizó para preparar el compuesto 8c. Sólido de color marrón claro, con un rendimiento del 27% en 4 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,93 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,51 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,35 (td, J = 7,7, 2,4 Hz, 1H), 4,37 (td, J = 8,5, 7,5, 3,8 Hz, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,79 (dd, J = 14,2, 8,7 Hz, 1H), 3,41 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,91-2,78 (m, 2H), 2,16-2,05 (m, 2H), 1,96 (s, 3H), 1,92 (s, 3H). HRMS (m/z): calculado para C20H23F3N4O2P+ (M + H+): 439,1510, encontrado: 439,1505. Pureza UPLC 98,62%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 8d.

El intermedio 16 (16a-16p, 1,00 eq.), Pd(OAc)2 (0,30 eq.), Xantphos (0,60 eq.) y K3PO4 (3,00 eq.) en DMF desgasificado (0,1 M) se añadieron a una solución bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 145 °C en un horno de microondas y se agitó a 145 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 45 min), y luego se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se filtró a través de una almohadilla de celita. La solución orgánica se lavó con agua 3 veces y con una solución saturada de NaCl 1 vez. La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (17a-17p) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El óxido de fosfina crudo (17a-17p) se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó mediante un evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó mediante un evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener los compuestos objetivo (7a, 7d, 8a-8h, 8j-8l, 8n, 9e-9f).

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 7a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 63% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 169,40, 154,79, 151,35, 144,85, 138,60 (d, J = 4,5 Hz), 129,85 (d, J = 7,6 Hz), 128,10, 126,16 (d, J = 10,6 Hz), 123,57, 123,07 (d, J = 12,1 Hz), 116,05 (d, J = 99,7 Hz), 112,28, 47,52, 47,10, 44,93, 31,22, 31,04, 29,26, 24,29, 21,64, 18,33 (d, J = 6,0 Hz), 17,86 (d, J = 7,6 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,34. HRMS (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410,2104, encontrado: 410,2103. Pureza UPLC 100,00%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 7d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 47% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,50 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,57-7,45 (m, 2H), 4,62 (br, s, 1H), 3,70 (dd, J = 12,5, 4,0 Hz, 1H), 3,39 (dt, J = 12,8, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,19 (m, 1H), 3,17-3,07 (m, 1H), 2,93 (s, 2H), 2,34-2,24 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1H), 1,96 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,91-1,81 (m, 1H), 1,47 (s, 3H), 1,46 (s, 3H). RMN de 13C (101 MHz, MeOD) δ 166,75, 160,67, 154,81, 140,25 (d, J = 49,5 Hz), 126,85 (d, J = 7,1 Hz), 126,68 (d, J = 2,0 Hz), 126,46 (d, J = 10,1 Hz), 124,36 (d, J = 12,1 Hz), 119,18, 117,28 (d, J = 100,0 Hz), 116,29, 108,94, 47,38, 47,01, 44,86, 40,03, 33,89, 28,87, 26,62, 26,55, 21,62, 19,07, 17,97. HRMS (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2261, encontrado: 424,2257. Pureza UPLC 99,19%.

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 8a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 55% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,90 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,49 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H).

El intermedio 16c se utilizó para preparar el compuesto 8b.

El intermedio 16d se utilizó para preparar el compuesto 8d.

El intermediario 16e se utilizó para preparar el compuesto 8d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 67% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,57 (s, 1H), 8,85 (ancho, s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,02 (ancho, s, 1H), 7,51 (dd, J = 12,7, 6,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,19 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 4,56 (s, 2H), 2,88 (s, 3H).

El intermediario 16f se utilizó para preparar el compuesto 9e. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 61% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,74 (dd, J = 8,0, 2,6 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,83 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 4,55 (s, 1H), 3,62 (dd, J = 12,3, 3,9 Hz, 1H), 3,36 (dd, J = 9,3, 5,3 Hz, 3H), 3,24 (dd, J = 12,5, 9,6 Hz, 1H), 3,11 (td, J = 12,9, 11,5, 3,5 Hz, 1H), 2,91-2,78 (m, 2H), 2,33 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 2,20-2,05 (m, 3H), 1,97 (qd, J = 10,3, 5,9 Hz, 1H), 1,83 (d, J = 13,3 Hz, 7H).

El intermediario 16n se utilizó para preparar el compuesto 9f. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOH-d4) δ 9,02 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,92-7,86 (m, 1H), 4,51 (ancho, s, 1H), 3,66-3,60 (m, 1H), 3,43-3,35 (m, 3H), 3,23 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,15-3,09 (m, 1H), 2,93-2,82 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 1H), 2,22-2,06 (m, 3H), 2,00-1,93 (m, 1H), 1,87 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,84 (d, J = 1,2 Hz, 3H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 167,51, 153,55, 152,73, 149,24 (d, J = 129,9 Hz), 149,14 (d, J = 24,2 Hz), 144,10, 130,81 (d, J = 3,0 Hz), 122,40, 121,89, 119,39 (d, J = 21,1 Hz), 109,83, 46,15, 45,69, 43,53, 30,21, 29,64, 27,83, 22,43, 20,29, 15,10, 14,62. RMN de 31P (162 MHz, MeOD) δ 42,63. EMS (m/z): calculado para C21H28N6OP+ (M + H+): 411,2057, encontrado: 411,2055. Pureza de HPLC: 99,43%.

Síntesis del compuesto 22-1

A una solución del tert-butil (S)-(6-oxopiperidin-3-il)carbamato (20, 100 mg, 0,467 mmol) disponible comercialmente en THF anhidro (4,6 mL) se añadió ZrCl4 (260 mg, 1,12 mmol) a -10 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a -10 °C y, a continuación, se añadió MeMgBr (3 M en THF, 2 mL, 6,00 mmol). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche) y, a continuación, se apagó añadiendo NaOH al 30% en agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (21) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El tert-butil (S)-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)carbamato crudo (21) se disolvió en DCM (4 mL) y se añadió TFA (0,4 mL) por goteo. La reacción se agitó durante 12 horas y el disolvente se eliminó con un evaporador rotatorio para obtener el (S)-6,6-dimetilpiperidin-3-amina cruda (22-1) que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis del intermediario 23

A una solución del intermediario 15a o 15d (1,00 equiv.) en etanol (0,11 M) se añadió morfolina (10,00 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 1 hora y, a continuación, se añadió clorhidrato de guanidinio (5,00 equiv.) y metóxido de sodio (5,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche) y, a continuación, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para obtener el residuo, que se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NH4Cl y una solución saturada de NaCl, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior (1,00 equiv.) en una mezcla de AcOH/H2O (V/V = 10/1, 0,15 M) se añadió NaNO2 en agua (4,0 M, 4,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión y, a continuación, se apagó con una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior en DCM anhidro (0,1 M) se añadió TEA (5,00 equiv.) y Tf2O (3,00 equiv.) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión y, a continuación, se apagó añadiendo una solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó posteriormente mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, PE/EA = 5/1) para obtener el intermediario 23.

9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il trifluorometanosulfonato (23a)

El intermediario 15a se utilizó para preparar el intermediario 23a. Sólido amarillo, 49% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,79 (d, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,50 (d, J = 7,5, 1,2 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,03 (s, 2H), 3,73–3,61 (m, 2H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,93–2,80 (m, 2H), 2,25–2,13 (m, 2H), 0,92 (t, 2H), −0,03 (s, 9H).

8-bromo-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-il trifluorometanosulfonato (23b)

El intermediario crudo 15d se utilizó para preparar el intermediario crudo 23b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis de los intermediarios 24 y 25

A una solución del intermediario 23 (1,00 eq.) en NMP (0,1 M) se añadió el intermediario 22 (3,00 eq.) y DIPEA (5,00 eq.). La mezcla de reacción se calentó a 90 °C y se agitó a 90 °C hasta que se produjo la conversión completa, y luego se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con solución saturada de NH4Cl durante 3 veces y con solución saturada de NaCl durante 1 vez, y luego se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó aún más mediante cromatografía en columna flash para obtener los intermediarios 24 y 25.

(S)-9-bromo-N-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (24a)

El intermediario 23a y el compuesto crudo 22-1 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 24a, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

(S)-8-bromo-N-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-amina (24b)

El intermediario crudo 23b y el intermediario crudo 22-1 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 24b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

9-bromo-N-((1s,3s)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)ciclobutil)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (25a)

El intermediario 23a y el compuesto 22-2 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 25a, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Tert-butilo (S)-3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)pirrolidina (25b)

El intermediario 25b se utilizó para preparar el compuesto 8m. Sólido amarillo claro, 63% de rendimiento. RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ 11,23 (s, 1H), 8,87 (s, 3H), 8,07 (s, 1H), 7,45 (dd, J = 12,8, 7,2 Hz, 1H), 7,24 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 4,59 (s, 1H), 3,50–3,45 (m, 1H), 3,43–3,37 (m, 1H), 3,34–3,25 (m, 4H), 2,75–2,66 (m, 2H), 2,32–2,23 (m, 1H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,04–1,90 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,80 (s, 3H). RMN de 13C (151 MHz, DMSO) δ 162,76, 153,55, 146,07, 144,19, 136,82 (d, J = 3,0 Hz), 127,98 (d, J = 7,6 Hz), 126,39, 124,03 (d, J = 7,6 Hz), 121,20, 120,36 (d, J = 9,1 Hz), 116,26, 110,26, 50,55, 50,01, 43,99, 30,09, 29,82, 29,61, 23,63, 18,56 (d, J = 1,5 Hz), 18,09 (d, J = 1,1 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,30. RMN de masas de alta resolución (HRMS) (m/z): calculado para C25H34N4O2P+ (M + H+): 396,1948, encontrado: 396,1948. Pureza por HPLC: 99,83%.

Síntesis del compuesto 7c

A una solución del intermediario crudo 24a (65,9 mg, 0,1 mmol) en NMP (1 mL) se añadió CuI (76 mg, 0,4 mmol) y NaSO2Me (40,8 mg, 0,4 mmol). La solución de la mezcla se desgasificó durante 30 min y luego se calentó a 140 °C y se agitó a 140 °C hasta que se produjo la conversión completa (normalmente, 4 h), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La solución orgánica se lavó con solución de NH4Cl/NH4OH (V/V = 10/1) durante 3 veces y con solución saturada de NaCl durante 1 vez, y luego se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (26) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El compuesto crudo 26 se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M, 4 mL) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se lavó con hexano durante 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%, 4 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 7c (sólido amarillo claro, 42% de rendimiento, 2 etapas). RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,81 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,54 (s, 1H), 3,59–3,51 (m, 1H), 3,44 (q, J = 7,8, 7,2 Hz, 3H), 3,26 (s, 3H), 2,94–2,78 (m, 2H), 2,37–2,24 (m, 1H), 2,21 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 2,16–2,07 (m, 1H), 2,04–1,89 (m, 3H), 1,51 (s, 6H). RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) δ 133,68, 131,00, 129,97, 124,71, 124,21, 123,84, 122,73, 112,75, 58,32, 55,87, 46,79, 44,43, 43,06, 33,84, 31,20, 30,83, 25,66, 24,33, 18,37. RMN de masas de alta resolución (HRMS) (m/z): calculado para C25H34N4O2P+ (M + H+): 440,2115, encontrado: 440,2112. Pureza por HPLC: 99,08%.

Síntesis del compuesto 8o

A una solución de hidruro de litio y aluminio (LiAlH4, 52 mg, 1,354 mmol) en THF anhidro (1,3 mL) se añadió el compuesto 16a (0,47 M en THF anhidro, 290 mg, 0,451 mmol) durante un período de 15 min bajo una atmósfera de argón a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche, y luego se calentó a 60 °C y se agitó durante 1 h. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se apagó con agua, se extrajo con EtOAc durante 3 veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El residuo anterior se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se lavó con hexano durante 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%, 4 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (ACN/H2O = 5/95 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 8o (sólido blanco, 66% de rendimiento, 2 etapas). RMN de 1H (500 MHz, Metanol-d4) δ 8,83 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,2 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 81,1 Hz, 1H), 4,02–3,74 (m, 1H), 3,67–3,48 (m, 1H), 3,41 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,19–2,77 (m, 7H), 2,46–2,22 (m, 1H), 2,21–2,12 (m, 2H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,03–1,96 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,67 (s, 1H). RMN de 13C (151 MHz, DMSO) δ 148,26, 136,90, 127,92 (d, J = 6,0 Hz), 126,36, 124,37 (d, J = 4,5 Hz) 121,16, 120,85, 116,26 (d, J = 101,2 Hz), 110,31, 55,96, 53,12, 45,90, 42,90, 29,94, 29,52, 27,92, 23,26, 21,48, 18,53 (d, J = 3,0 Hz), 18,07 (d, J = 3,0 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,49. RMN de masas de alta resolución (HRMS) (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2266, encontrado: 424,2262. Pureza por HPLC: 99,94%.

Síntesis del compuesto 9a

El intermediario 16a (64 mg, 0,100 mmol) se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 min. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano tres veces. A continuación, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10 %) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 5/95 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9a (sólido blanco, 73 % de rendimiento). RMN de 1H (500 MHz, metanol-d4) δ 8,55 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,17 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 4,52 (ancho, s, 1H), 3,60 (dd, J = 12,4, 3,7 Hz, 1H), 3,39-3,33 (m, 3H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,10 (td, J = 13,0, 11,8, 3,4 Hz, 1H), 2,92-2,76 (m, 2H), 2,37-2,30 (m, 1H), 2,21-2,10 (m, 2H), 2,09-2,01 (m, 1H), 2,00-1,90 (m, 1H), 1,86-1,78 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, metanol-d4) δ 168,2, 152,7, 149,2, 148,6, 134,2, 122,9, 118,7, 117,4, 111,4, 109,6, 108,2, 52,8, 47,5, 46,9, 44,9, 31,5, 31,3, 29,2, 23,7, 21,5. EMS (m/z): calculado para C21H26N7O2+ (M + H+): 408,2142, encontrado: 408,2138.

El intermediario 16n o 16o (1,00 eq.), pirazol o imidazol (2,00 eq.), Cu2O (2,00 eq.), Cs2CO3 (2,00 eq.) y salicilaldoxima (0,65 eq.) se añadieron a un matraz de fondo redondo en 0,16 M de acetonitrilo anhidro desgasificado bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 85 °C y se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 días), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se apagó con la adición de una solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.

El residuo anterior se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 minutos. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano tres veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10 %) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9 l, 9 m y 9 r.

(S)-N-(piperidin-3-il)-10-(1H-pirazol-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']-pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9 l)

El intermediario 16o y el pirazol se utilizaron para preparar el compuesto 9 l. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 30 % en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,85 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,56 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,54 (t, J = 2,2 Hz, 1H), 4,45 (s, 1H), 3,64 (dd, J = 12,6, 3,8 Hz, 1H), 3,40–3,33 (m, 2H), 3,33–3,31 (m, 1H), 3,26–3,20 (m, 1H), 3,17–3,08 (m, 1H), 2,93–2,80 (m, 2H), 2,37–2,28 (m, 1H), 2,20–2,11 (m, 2H), 2,10–2,04 (m, 1H), 2,02–1,93 (m, 1H), 1,90–1,78 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C22H25N8+ (M + H+): 401,2197, encontrado: 401,2195. Pureza UPLC: 95,14 %.

(S)-N-(piperidin-3-il)-10-(1H-pirazol-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (9 m)

El intermediario 16n y el pirazol se utilizaron para preparar el compuesto 9 m. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 34 % en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,66 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,75 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,56 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 4,54 (an, s, 1H), 3,65–3,59 (m, 1H), 3,41–3,32 (m, 3H), 3,28–3,21 (m, 1H), 3,16–3,07 (m, 1H), 2,93–2,77 (m, 2H), 2,41–2,29 (m, 1H), 2,23–2,11 (m, 2H), 2,10–2,01 (m, 1H), 2,01–1,90 (m, 1H), 1,88–1,77 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C23H26N7+ (M + H+): 400,2244, encontrado: 400,2244.

(S)-10-(1H-imidazol-1-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']-pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9 r)

El intermediario 16o y el imidazol se utilizaron para preparar el compuesto 9 r. Sólido blanco, con un rendimiento del 28 % en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 9,66 (s, 1H), 9,21 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,37 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,79–7,71 (m, 2H), 4,42 (an, s, 1H), 3,63–3,59 (m, 1H), 3,38 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 3,15 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,12–3,06 (m, 1H), 2,91–2,82 (m, 2H), 2,31–2,24 (m, 1H), 2,21–2,08 (m, 2H), 2,07 (p, J = 7,5 Hz, 1H), 1,98 (tt, J = 10,6, 5,3 Hz, 1H), 1,87–1,81 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C23H27N8+ (M + H+): 415,2353, encontrado: 415,2350.

Cultivo celular y líneas celulares

Las líneas celulares HCT116 y K562 se obtuvieron de Procell (números de catálogo CL-0096 y CL-0130, respectivamente). Las células HCT116 se mantuvieron en DMEM con alta concentración de glucosa suplementado con L-glutamina, mientras que las células K562 se cultivaron en IMDM con L-glutamina (ambos de Gibco, Thermo Fisher Scientific). Ambos medios se suplementaron con un 10 % de suero fetal bovino (SFB, Gibco, A5256701) y un 1 % de penicilina-estreptomicina (P/S, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2 y se pasaron rutinariamente cada 2-3 días.

Ensayo de antiproliferación in vitro

Las células HCT116 y K562 en fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de 96 pocillos a densidades de 1500 y 8000 células por pocillo, respectivamente, y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2. El medio de cultivo se reemplazó posteriormente por medio fresco que contenía diluciones seriadas de los compuestos de prueba o el control vehículo, y las células se cultivaron durante 72 horas. A continuación, se añadió el reactivo del kit de recuento celular-8 (CCK-8) (TargetMol, C0005) a cada pocillo, seguido de una incubación a 37 °C durante 1-2 horas. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (BioTek Synergy H1). Los valores de concentración inhibitoria media (IC50) se calcularon mediante análisis de regresión no lineal utilizando GraphPad Prism. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos independientes.

Ensayo de inhibición de quinasas

Las potencias inhibitorias de los compuestos probados contra las CDK se evaluaron utilizando un ensayo enzimático basado en la fluorescencia, con detección realizada en una plataforma Calliper EZ Reader II. Los valores de IC50 se determinaron en presencia de ATP a concentración Km y socios CDK/ciclina (Biortus): 116 μM de ATP con 0,02 nM de CDK1/ciclina A2, 100 μM de ATP con 0,015 nM de CDK2/ciclina E1, 164 μM de ATP con 20 nM de CDK6/ciclina D3, 50 μM de ATP con 3 nM de CDK7/ciclina H/MAT1, 30 μM de ATP con 8 nM de CDK9/ciclina T1. Se utilizaron sustratos peptídicos fluorescentes (Biortus) a una concentración final de 2 μM para todos los ensayos: CDK7tide se utilizó como sustrato para CDK1, CDK2, CDK6 y CDK7, mientras que CDK9tide se utilizó específicamente para los ensayos de CDK9. Los valores de IC50 se calcularon utilizando el software GraphPad Prism.

Acoplamiento molecular

Se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando Schrödinger Suite 2022-3 (versión Maestro 13.5). Todos los cálculos se realizaron con los parámetros predeterminados a menos que se indique lo contrario. Las estructuras cristalinas de CDK7 (código PDB: 8RGU) y CDK1 (código PDB: 6GU3) se obtuvieron de la base de datos del Banco de proteínas. Las estructuras de las proteínas se prepararon utilizando el Asistente de preparación de proteínas en Maestro. Se generaron cuadrículas de receptor utilizando el panel de generación de cuadrículas de receptor en Maestro. El centroide del sitio de unión del ligando cocristalizado se utilizó para definir el centro de la caja de la cuadrícula. Los ligandos se construyeron en Maestro y se prepararon utilizando LigPrep. Se generaron estados de ionización a pH 7,0 ± 2,0 utilizando Epik, y se generaron tautómeros con la configuración predeterminada. Se realizó una minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS4. El acoplamiento de ligandos se realizó utilizando Glide en modo de precisión estándar (SP) con los parámetros predeterminados. La función de puntuación de acoplamiento se estableció en SP, y el número de poses por ligando se limitó a 5. Se realizó una minimización posterior al acoplamiento para refinar las geometrías de los ligandos. La pose de mayor rango basada en GlideScore se seleccionó para el análisis posterior y la generación de figuras.

Ensayo de Western blot

Las células HCT116 se trataron con 7a o SY-5609 a las concentraciones indicadas durante 24 h. Las células se recogieron, se lavaron con PBS frío (Corning) y se lisaron en tampón RIPA (Beyotime, P0013E). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo BCA (Pierce/Thermo Fisher Scientific). Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Beyotime, FFP24). Después de bloquear con el reactivo QuickBlock™ (Beyotime, P0252), las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra la RNA polimerasa II fosforilada en Ser5 (Abcam, ab5131) y GAPDH (Cell Signaling, ab4787), ambos diluidos 1:1000 en el tampón de dilución de anticuerpos primarios QuickBlock™ (Beyotime, P0256). A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Cell Signaling, 7074P2; Anti-rabbit IgG) diluido 1:2000 en el tampón de dilución de anticuerpos secundarios QuickBlock™ (Beyotime, P0258) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se capturaron con un sistema de imagen de gel Tanon.

Ensayo de eficacia antitumoral in vivo

Los experimentos con animales se informaron de acuerdo con las directrices ARRIVE (Investigación con animales: Informe de experimentos in vivo) y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur. Se obtuvieron ratones nudosos BALB/c hembra (de 5 a 6 semanas de edad, de 18 a 22 g) de Zhuhai BesTest Bio-Tech Co., Ltd. y se aclimataron durante 1 semana antes de la experimentación. Los animales se alojaron en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) en condiciones controladas (temperatura de 20 a 26 °C, humedad relativa de 40 a 70 %, ciclo de luz/oscuridad de 12 h y 10 a 20 cambios de aire por hora). Los ratones se mantuvieron en jaulas micro-aisladas esterilizadas (máximo 5 por jaula) con enriquecimiento ambiental (túneles esterilizados, almohadillas para anidar y bloques para roer). Se proporcionó dieta para roedores esterilizada e irradiada y agua esterilizada ad libitum.

Para la inoculación tumoral, se recogieron las células HCT116 y se resuspendieron en PBS. Se inocularon por vía subcutánea 1 × 107 células HCT116 suspendidas en 200 μL de PBS en el flanco derecho de cada ratón nudoso. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 120-200 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 6 por grupo): control vehículo, 7a dosis baja (5 mg/kg), 7a dosis alta (20 mg/kg) y control positivo (SY-5609, 2 mg/kg). Los compuestos se disolvieron en 5 % de DMSO/salina (v/v). Se administró 7a por vía intraperitoneal (i.p.) una vez al día durante 21 días consecutivos, mientras que SY-5609 se administró por vía oral (p.o.) con la misma frecuencia. El grupo control recibió 5 % de DMSO/salina (i.p.) con el mismo programa. Las dimensiones del tumor se midieron con un calibre de Vernier y el volumen se calculó utilizando la fórmula V = 0,5 × longitud × ancho². Al final del estudio, los ratones se anestesiaron con inhalación de dióxido de carbono (CO2) seguida de eutanasia humana mediante dislocación cervical, en estricta concordancia con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las regulaciones institucionales de bienestar animal, para minimizar el sufrimiento de los animales.

Química

A menos que se especifique lo contrario, los materiales de partida y los disolventes cromatográficos se compraron a proveedores comerciales y se utilizaron sin purificación posterior. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C se adquirieron en un espectrómetro Bruker AV400 MHz o AV 600 MHz, con DMSO-d6 (δ H = 2,50 ppm, δ C = 39,52 ppm), metanol-d4 (δ H = 3,31 ppm, δ C = 49,00 ppm) o cloroformo-d (δ H = 7,26 ppm, δ C = 77,16 ppm) como disolvente deuterado y tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Los desplazamientos químicos (δ) se informaron en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se indicaron en Hz. Las multiplicidades de la señal se designaron como s (uniplete), d (duble), dd (doble de doblete), ddd (doble de doblete de doblete), dt (doble de triplete), t (triplete), q (cuarteto), br s (uniplete ancho) y m (multiplete). La cromatografía en columna se llevó a cabo bajo presión utilizando gel de sílice disponible comercialmente (200-300 malla). Los espectros de masa de alta resolución (HRMS) se registraron en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap. La pureza de todos los compuestos finales se determinó mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), y se confirmó que todos tenían una pureza > 95 %.

Procedimientos generales para la síntesis del compuesto 12a, 12b y 12d

El compuesto 10 (1,00 equiv.) y cicloheptanona (11a, 1,00 equiv.) o 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b, 1,00 equiv.) se disolvieron en ácido acético (0,22 M) y se calentaron a reflujo a 145 °C durante 2 h. Después de la finalización, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y luego se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3, que luego se extrajo con EtOAc tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Finalmente, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, éter de petróleo) para obtener los compuestos 12a, 12b y 12d (rendimiento del 45 % al 87 %).

4-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol (12a)

Se utilizaron 2-bromofenilhidrazina clorhidrato (10a) y cicloheptanona (11a) para preparar el compuesto 12a (aceite amarillo pálido, rendimiento del 87 %). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,87 (s, 1H), 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 7,6, 0,9 Hz, 1H), 6,95 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 2,87 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,79 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 1,94-1,87 (m, 2H), 1,82-1,74 (m, 4H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 138,30, 132,81, 130,38, 122,83, 120,17, 116,88, 115,08, 103,86, 31,73, 29,53, 28,60, 27,38, 24,93.

3-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol (12b)

Se utilizaron 3-bromofenilhidrazina clorhidrato (10b) y cicloheptanona (11a) para preparar la mezcla del compuesto 12b y 1-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta[b]indol en una relación de 1:1 (aceite amarillo pálido, rendimiento del 83 %).

8-bromo-1,1-dimetil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol (12d)

Se utilizaron 2-bromofenilhidrazina clorhidrato (10a) y 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b) para preparar el compuesto 12d (aceite amarillo pálido, rendimiento del 45,2 %). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,83 (s, 1H), 7,38 (dt, J = 7,8, 0,8 Hz, 1H), 7,25 (dd, J = 7,6, 0,9 Hz, 1H), 6,94 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 2,66 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 1,92-1,87 (m, 2H), 1,76-1,72 (m, 2H), 1,35 (s, 6H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 142,59, 134,28, 128,96, 123,42, 120,31, 117,34, 110,18, 104,28, 39,21, 31,61, 29,26, 21,51, 20,15.

Síntesis del compuesto 12c

Se utilizaron 2-bromo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8,9,10-hexahidro-ciclohepta-^[4,5]pirrolo[2,3-b]piridina (12c) y anhidro THF para preparar el compuesto 13c (aceite amarillo pálido, rendimiento del 79 %). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,63 (s, 2H), 3,47 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 2,93 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,75 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 1,95-1,86 (m, 2H), 1,83-1,71 (m, 4H), 0,90 (t, J = 8,2 Hz, 2H), -0,08 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 148,68, 141,43, 134,57, 129,01, 120,91, 120,59, 115,05, 71,06, 67,00, 32,94, 29,58, 28,35, 27,89, 25,90, 19,08, -0,00.

8-bromo-1,1-dimetil-9-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol (13d)

Se utilizaron el intermedio 12d y anhidro DMF para preparar el compuesto 13d (aceite amarillo pálido, rendimiento del 93 %). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,37-7,31 (m, 2H), 6,91 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 5,84 (s, 2H), 3,60 (t, J = 8,2 Hz, 2H), 2,63 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 1,89-1,81 (m, 2H), 1,77-1,72 (m, 2H), 1,44 (s, 6H), 0,99-0,94 (m, 2H), -0,01 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 143,95, 133,75, 131,55, 127,60, 120,81, 117,41, 111,90, 103,82, 72,92, 64,03, 43,41, 32,64, 28,93, 21,90, 19,74, 18,25, -1,44.

Procedimiento general para la síntesis del intermedio 14

A una solución del intermedio 13 (1,00 equiv.) en una mezcla de THF/H2O (V/V = 10/1, 0,13-0,23 M) o una mezcla de dioxano/H2O (V/V = 10/1, 0,10 M) se añadió 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ, 2,00 equiv.) porciones. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 h) y luego se apagó con la adición de una solución saturada de NaHCO3. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se extrajo con MTBE tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Finalmente, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo a éter de petróleo/EtOAc = 10/1 o éter de petróleo a éter de petróleo/EtOAc = 4/1) para obtener el intermedio 14 (rendimiento del 55 % al 67 %).

4-bromo-5-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7,8,9-tetrahidro-ciclohepta[b]indol-10(5-H)-ona (14a)

El intermedio 15a y el intermedio crudo 19–7 se utilizaron para preparar el compuesto 16 g. Sólido amarillo, con un rendimiento del 66%. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,65 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,43 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,05 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 6,00 (s, 2H), 5,24 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,65 (dd, J = 15,9, 6,4 Hz, 6H), 3,20 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,64–2,59 (m, 2H), 2,20–2,11 (m, 2H), 1,78 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 0,95–0,88 (m, 2H), –0,04 (s, 9H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 161,91, 156,33, 145,12, 133,74, 130,39, 129,02, 122,60, 122,35, 121,71, 113,11, 103,18, 71,65, 65,16, 58,52, 37,62, 33,76, 29,14, 27,96, 26,62, 18,28, –1,26. EM-MS (m/z): 517 (M + H)+.

El intermedio 15a y el intermedio crudo 19–8 se utilizaron para preparar el compuesto 16h.

El intermedio 16b se utilizó para preparar el compuesto 7a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 63% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 169,40, 154,79, 151,35, 144,85, 138,60 (d, J = 4,5 Hz), 129,85 (d, J = 7,6 Hz), 128,10, 126,16 (d, J = 10,6 Hz), 123,57, 123,07 (d, J = 12,1 Hz), 116,05 (d, J = 99,7 Hz), 112,28, 47,52, 47,10, 44,93, 31,22, 31,04, 29,26, 24,29, 21,64, 18,33 (d, J = 6,0 Hz), 17,86 (d, J = 7,6 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,34. HRMS (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410,2104, encontrado: 410,2103. Pureza UPLC 100,00%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 7d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 47% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,50 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,57-7,45 (m, 2H), 4,62 (br, s, 1H), 3,70 (dd, J = 12,5, 4,0 Hz, 1H), 3,39 (dt, J = 12,8, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,19 (m, 1H), 3,17-3,07 (m, 1H), 2,93 (s, 2H), 2,34-2,24 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1H), 1,96 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,91-1,81 (m, 1H), 1,47 (s, 3H), 1,46 (s, 3H). RMN de 13C (101 MHz, MeOD) δ 166,75, 160,67, 154,81, 140,25 (d, J = 49,5 Hz), 126,85 (d, J = 7,1 Hz), 126,68 (d, J = 2,0 Hz), 126,46 (d, J = 10,1 Hz), 124,36 (d, J = 12,1 Hz), 119,18, 117,28 (d, J = 100,0 Hz), 116,29, 108,94, 47,38, 47,01, 44,86, 40,03, 33,89, 28,87, 26,62, 26,55, 21,62, 19,07, 17,97. HRMS (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2261, encontrado: 424,2257. Pureza UPLC 99,19%.

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 8a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 55% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,90 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,49 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C20H26N4O2P+ (M + H+): 385,1788, encontrado: 385,1784. Pureza UPLC 95,56%.

El intermedio 16c se utilizó para preparar el compuesto 8b. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 56% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,92 (br, s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,51 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,15-4,05 (m, 1H), 3,58-3,44 (m, 1H), 3,36 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,85-2,72 (m, 2H), 2,12-2,03 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,30 (d, J = 6,3 Hz, 3H). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,61. HRMS (m/z): calculado para C22H28N4O2P+ (M + H+): 411,1944, encontrado: 411,1940. Pureza UPLC 95,05%.

El intermedio 16d se utilizó para preparar el compuesto 8c. Sólido de color marrón claro, con un rendimiento del 27% en 4 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,93 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,51 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,35 (td, J = 7,7, 2,4 Hz, 1H), 4,37 (td, J = 8,5, 7,5, 3,8 Hz, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,79 (dd, J = 14,2, 8,7 Hz, 1H), 3,41 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,91-2,78 (m, 2H), 2,16-2,05 (m, 2H), 1,96 (s, 3H), 1,92 (s, 3H). HRMS (m/z): calculado para C20H23F3N4O2P+ (M + H+): 439,1510, encontrado: 439,1505. Pureza UPLC 98,62%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 8d.

El intermedio 16 (16a-16p, 1,00 eq.), Pd(OAc)2 (0,30 eq.), Xantphos (0,60 eq.) y K3PO4 (3,00 eq.) en DMF desgasificado (0,1 M) se añadieron a una solución bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 145 °C en un horno de microondas y se agitó a 145 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 45 min), y luego se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se filtró a través de una almohadilla de celita. La solución orgánica se lavó con agua 3 veces y con una solución saturada de NaCl 1 vez. La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (17a-17p) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El óxido de fosfina crudo (17a-17p) se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó mediante un evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó mediante un evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener los compuestos objetivo (7a, 7d, 8a-8h, 8j-8l, 8n, 9e-9f).

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 7a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 63% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,41 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 169,40, 154,79, 151,35, 144,85, 138,60 (d, J = 4,5 Hz), 129,85 (d, J = 7,6 Hz), 128,10, 126,16 (d, J = 10,6 Hz), 123,57, 123,07 (d, J = 12,1 Hz), 116,05 (d, J = 99,7 Hz), 112,28, 47,52, 47,10, 44,93, 31,22, 31,04, 29,26, 24,29, 21,64, 18,33 (d, J = 6,0 Hz), 17,86 (d, J = 7,6 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,34. HRMS (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410,2104, encontrado: 410,2103. Pureza UPLC 100,00%.

El intermedio 16p se utilizó para preparar el compuesto 7d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 47% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,50 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,57-7,45 (m, 2H), 4,62 (br, s, 1H), 3,70 (dd, J = 12,5, 4,0 Hz, 1H), 3,39 (dt, J = 12,8, 4,5 Hz, 1H), 3,29-3,19 (m, 1H), 3,17-3,07 (m, 1H), 2,93 (s, 2H), 2,34-2,24 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 1H), 2,06-1,97 (m, 1H), 1,96 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,91-1,81 (m, 1H), 1,47 (s, 3H), 1,46 (s, 3H). RMN de 13C (101 MHz, MeOD) δ 166,75, 160,67, 154,81, 140,25 (d, J = 49,5 Hz), 126,85 (d, J = 7,1 Hz), 126,68 (d, J = 2,0 Hz), 126,46 (d, J = 10,1 Hz), 124,36 (d, J = 12,1 Hz), 119,18, 117,28 (d, J = 100,0 Hz), 116,29, 108,94, 47,38, 47,01, 44,86, 40,03, 33,89, 28,87, 26,62, 26,55, 21,62, 19,07, 17,97. HRMS (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2261, encontrado: 424,2257. Pureza UPLC 99,19%.

El intermedio 16a se utilizó para preparar el compuesto 8a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 55% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,90 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,49 (dd, J = 13,2, 7,3 Hz, 1H), 7,36 (td, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,52 (br, s, 1H), 3,61 (dd, J = 12,5, 3,9 Hz, 1H), 3,40 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,36 (dt, J = 12,3, 4,2 Hz, 1H), 3,25 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,14-3,09 (m, 1H), 2,91-2,77 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,21-2,05 (m, 3H), 2,00-1,94 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,87-1,79 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C20H26N4O2P+ (M + H+): 385,1788, encontrado: 385,1784. Pureza UPLC 95,56%.

El intermedio 16c se utilizó para preparar el compuesto 8b. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 56% en

El intermediario 16e se utilizó para preparar el compuesto 8d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 67% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,57 (s, 1H), 8,85 (ancho, s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,02 (ancho, s, 1H), 7,51 (dd, J = 12,7, 6,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 4,48 (s, 2H), 2,88 (s, 3H).

El intermediario 16f se utilizó para preparar el compuesto 9e. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 61% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,74 (dd, J = 8,0, 2,6 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,83 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 4,55 (s, 1H), 3,62 (dd, J = 12,3, 3,9 Hz, 1H), 3,36 (dd, J = 9,3, 5,3 Hz, 3H), 3,24 (dd, J = 12,5, 9,6 Hz, 1H), 3,11 (td, J = 12,9, 11,5, 3,5 Hz, 1H), 2,91-2,78 (m, 2H), 2,33 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 2,20-2,05 (m, 3H), 1,97 (qd, J = 10,3, 5,9 Hz, 1H), 1,83 (d, J = 13,3 Hz, 7H).

El intermediario 16n se utilizó para preparar el compuesto 9f. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOH-d4) δ 9,02 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,92-7,86 (m, 1H), 4,51 (ancho, s, 1H), 3,66-3,60 (m, 1H), 3,43-3,35 (m, 3H), 3,23 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,15-3,09 (m, 1H), 2,93-2,82 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 1H), 2,22-2,06 (m, 3H), 2,00-1,93 (m, 1H), 1,87 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,84 (d, J = 1,2 Hz, 3H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 167,51, 153,55, 152,73, 149,24 (d, J = 129,9 Hz), 149,14 (d, J = 24,2 Hz), 144,10, 130,81 (d, J = 3,0 Hz), 122,40, 121,89, 119,39 (d, J = 21,1 Hz), 109,83, 46,15, 45,69, 43,53, 30,21, 29,64, 27,83, 22,43, 20,29, 15,10, 14,62. RMN de 31P (162 MHz, MeOD) δ 42,63. EMS (m/z): calculado para C21H28N6OP+ (M + H+): 411,2057, encontrado: 411,2055. Pureza de HPLC: 99,43%.

Síntesis del compuesto 22-1

A una solución del tert-butil (S)-(6-oxopiperidin-3-il)carbamato comercialmente disponible (20, 100 mg, 0,467 mmol) en THF anhidro (4,6 mL) se añadió ZrCl4 (260 mg, 1,12 mmol) a -10 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a -10 °C, y luego se añadió MeMgBr (3 M en THF, 2 mL, 6,00 mmol). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche), y luego se apagó mediante la adición de NaOH al 30% en agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (21) se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

El tert-butil (S)-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)carbamato crudo (21) se disolvió en DCM (4 mL) al que se añadió TFA (0,4 mL) por goteo. La reacción se agitó durante 12 horas y el disolvente se eliminó por evaporación rotatoria para obtener el (S)-6,6-dimetilpiperidin-3-amina cruda (22-1) que se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis del intermediario 23

A una solución del intermediario 15a o 15d (1,00 equiv.) en etanol (0,11 M) se añadió morfolina (10,00 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 1 hora, y luego se añadió clorhidrato de guanidinio (5,00 equiv.) y metóxido de sodio (5,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para obtener el residuo, que se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NH4Cl y una solución saturada de NaCl, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior (1,00 equiv.) en una mezcla de AcOH/H2O (V/V = 10/1, 0,15 M) se añadió NaNO2 en agua (4,0 M, 4,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión, y luego se apagó con una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior en DCM anhidro (0,1 M) se añadió TEA (5,00 equiv.) y Tf2O (3,00 equiv.) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión, y luego se apagó mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó posteriormente mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, PE/EA = 5/1) para obtener el intermediario 23.

9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il trifluorometanosulfonato (23a)

El intermediario 15a se utilizó para preparar el intermediario 23a. Sólido amarillo, 49% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,79 (d, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,50 (d, J = 7,5, 1,2 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,03 (s, 2H), 3,73–3,61 (m, 2H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,93–2,80 (m, 2H), 2,25–2,13 (m, 2H), 0,92 (t, 2H), −0,03 (s, 9H).

8-bromo-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-il trifluorometanosulfonato (23b)

El intermediario crudo 15d se utilizó para preparar el intermediario crudo 23b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis de los intermediarios 24 y 25

A una solución del intermediario 23 (1,00 eq.) en NMP (0,1 M) se añadió el intermediario 22 (3,00 eq.) y DIPEA (5,00 eq.). La mezcla de reacción se calentó a 90 °C y se agitó a 90 °C hasta que se produjo la conversión completa, y luego se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NH4Cl durante 3 veces y con una solución saturada de NaCl durante 1 vez, y luego se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó aún más mediante cromatografía en columna flash para obtener los intermediarios 24 y 25.

(S)-9-bromo-N-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (24a)

El intermediario 23a y el compuesto crudo 22-1 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 24a, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

(S)-8-bromo-N-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-amina (24b)

El intermediario crudo 23b y el intermediario crudo 22-1 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 24b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

9-bromo-N-((1s,3s)-3-((terc-butildimetilsilil)oxi)ciclobutil)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (25a)

El intermediario 23a y el compuesto 22-2 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 25a, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Tert-butilo (S)-3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimidio[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)pirrolidina-1-carboxilato (25b)

El intermediario 25b se utilizó para preparar el compuesto 8m. Sólido amarillo claro, 63% de rendimiento. RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ 11,23 (s, 1H), 8,87 (s, 3H), 8,07 (s, 1H), 7,45 (dd, J = 12,8, 7,2 Hz, 1H), 7,24 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 4,59 (s, 1H), 3,50–3,45 (m, 1H), 3,43–3,37 (m, 1H), 3,34–3,25 (m, 4H), 2,75–2,66 (m, 2H), 2,32–2,23 (m, 1H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,04–1,90 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,80 (s, 3H). RMN de 13C (151 MHz, DMSO) δ 162,76, 153,55, 146,07, 144,19, 136,82 (d, J = 3,0 Hz), 127,98 (d, J = 7,6 Hz), 126,39, 124,03 (d, J = 7,6 Hz), 121,20, 120,36 (d, J = 9,1 Hz), 116,26, 110,26, 50,55, 50,01, 43,99, 30,09, 29,82, 29,61, 23,63, 18,56 (d, J = 1,5 Hz), 18,09 (d, J = 1,1 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,30. EM (m/z): calculado para C25H34N4O2P+ (M + H+): 396,1948, encontrado: 396,1948. Pureza por HPLC: 99,83%.

Síntesis del compuesto 7c

A una solución del intermediario crudo 24a (65,9 mg, 0,1 mmol) en NMP (1 mL) se añadió CuI (76 mg, 0,4 mmol) y NaSO2Me (40,8 mg, 0,4 mmol). La solución de la mezcla se desgasificó durante 30 min y luego se calentó a 140 °C y se agitó a 140 °C hasta que se produjo la conversión completa (normalmente, 4 h), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con EtOAc. La solución orgánica se lavó con una solución de NH4Cl/NH4OH (V/V = 10/1) durante 3 veces y con una solución saturada de NaCl durante 1 vez, y luego se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (26) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El compuesto crudo 26 se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M, 4 mL) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se lavó con hexano durante 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%, 4 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 7c (sólido amarillo claro, 42% de rendimiento, 2 etapas). RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,81 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,54 (s, 1H), 3,59–3,51 (m, 1H), 3,44 (q, J = 7,8, 7,2 Hz, 3H), 3,26 (s, 3H), 2,94–2,78 (m, 2H), 2,37–2,24 (m, 1H), 2,21 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 2,16–2,07 (m, 1H), 2,04–1,89 (m, 3H), 1,51 (s, 6H). RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) δ 133,68, 131,00, 129,97, 124,71, 124,21, 123,84, 122,73, 112,75, 58,32, 55,87, 46,79, 44,43, 43,06, 33,84, 31,20, 30,83, 25,66, 24,33, 18,37. EM (m/z): calculado para C25H34N4O2P+ (M + H+): 440,2115, encontrado: 440,2112. Pureza por HPLC: 99,08%.

Síntesis del compuesto 8o

A una solución de hidruro de litio y aluminio (LiAlH4, 52 mg, 1,354 mmol) en THF anhidro (1,3 mL) se añadió el compuesto 16a (0,47 M en THF anhidro, 290 mg, 0,451 mmol) durante un período de 15 min bajo una atmósfera de argón a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche, y luego se calentó a 60 °C y se agitó durante 1 h. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se apagó con agua, se extrajo con EtOAc durante 3 veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El residuo anterior se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 min. Luego, el disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se lavó con hexano durante 3 veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10%, 4 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó por evaporación al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (ACN/H2O = 5/95 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 8o (sólido blanco, 66% de rendimiento, 2 etapas). RMN de 1H (500 MHz, Metanol-d4) δ 8,83 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,2 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 81,1 Hz, 1H), 4,02–3,74 (m, 1H), 3,67–3,48 (m, 1H), 3,41 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,19–2,77 (m, 7H), 2,46–2,22 (m, 1H), 2,21–2,12 (m, 2H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,03–1,96 (m, 1H), 1,93 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,67 (s, 1H). RMN de 13C (151 MHz, DMSO) δ 148,26, 136,90, 127,92 (d, J = 6,0 Hz), 126,36, 124,37 (d, J = 4,5 Hz) 121,16, 120,85, 116,26 (d, J = 101,2 Hz), 110,31, 55,96, 53,12, 45,90, 42,90, 29,94, 29,52, 27,92, 23,26, 21,48, 18,53 (d, J = 3,0 Hz), 18,07 (d, J = 3,0 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,49. EM (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424,2266, encontrado: 424,2262. Pureza por HPLC: 99,94%.

Síntesis del compuesto 9a

El intermediario 16a (64 mg, 0,100 mmol) se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 minutos. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano tres veces. A continuación, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10 %) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 5/95 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9a (sólido blanco, 73 % de rendimiento). RMN de 1H (500 MHz, metanol-d4) δ 8,55 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,17 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 4,52 (ancho, s, 1H), 3,60 (dd, J = 12,4, 3,7 Hz, 1H), 3,39-3,33 (m, 3H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,10 (td, J = 13,0, 11,8, 3,4 Hz, 1H), 2,92-2,76 (m, 2H), 2,37-2,30 (m, 1H), 2,21-2,10 (m, 2H), 2,09-2,01 (m, 1H), 2,00-1,90 (m, 1H), 1,86-1,78 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, metanol-d4) δ 168,50, 156,07, 152,83, 149,21, 148,58, 134,31, 122,87, 118,65, 117,34, 111,41, 109,61, 108,23, 52,80, 47,49, 46,93, 44,92, 31,45, 31,31, 29,17, 23,64, 21,54. EMS (m/z): calculado para C21H26N7O2+ (M + H+): 408,2142, encontrado: 408,2138.

El intermediario 16n o 16o (1,00 eq.), pirazol o imidazol (2,00 eq.), Cu2O (2,00 eq.), Cs2CO3 (2,00 eq.) y salicilaldoxima (0,65 eq.) se añadieron a un matraz de fondo redondo en 0,16 M de acetonitrilo anhidro desgasificado bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 85 °C y se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 días), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se apagó con la adición de solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

El intermediario 16a (64 mg, 0,100 mmol) se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 minutos. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano tres veces. A continuación, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10 %) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 5/95 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9a (sólido blanco, 73 % de rendimiento). RMN de 1H (500 MHz, metanol-d4) δ 8,55 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,42 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,17 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 4,52 (ancho, s, 1H), 3,60 (dd, J = 12,4, 3,7 Hz, 1H), 3,39-3,33 (m, 3H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,10 (td, J = 13,0, 11,8, 3,4 Hz, 1H), 2,92-2,76 (m, 2H), 2,37-2,30 (m, 1H), 2,21-2,10 (m, 2H), 2,09-2,01 (m, 1H), 2,00-1,90 (m, 1H), 1,86-1,78 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, metanol-d4) δ 168,50, 156,07, 152,83, 149,21, 148,58, 134,31, 122,87, 118,65, 117,34, 111,41, 109,61, 108,23, 52,80, 47,49, 46,93, 44,92, 31,45, 31,31, 29,17, 23,64, 21,54. EMS (m/z): calculado para C21H26N7O2+ (M + H+): 408,2142, encontrado: 408,2138.

El intermediario 16n o 16o (1,00 eq.), pirazol o imidazol (2,00 eq.), Cu2O (2,00 eq.), Cs2CO3 (2,00 eq.) y salicilaldoxima (0,65 eq.) se añadieron a un matraz de fondo redondo en 0,16 M de acetonitrilo anhidro desgasificado bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 85 °C y se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 días), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se apagó con la adición de solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en el siguiente paso sin una purificación adicional.

El residuo anterior se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M) y se calentó a 60 °C durante 30 minutos. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se lavó con hexano tres veces. Luego, el sólido se añadió a etilendiamina en THF (10 %) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9 l, 9 m y 9 r.

(S)-N-(piperidin-3-il)-10-(1H-pirazol-1-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']-pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9 l)

El intermediario 16o y el pirazol se utilizaron para preparar el compuesto 9 l. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 30 % en dos pasos. RMN de 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 7.87 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 2.87 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.94–1.87 (m, 2H), 1.82–1.74 (m, 4H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 138.30, 132.81, 130.38, 122.83, 120.17, 116.88, 115.08, 103.86, 31.73, 29.53, 28.60, 27.38, 24.93.

3-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidrocyclohepta[b]indol (12b)

3-bromofenilhidrazina clorhidrato (10b) y cicloheptanona (11a) se utilizaron para preparar la mezcla del compuesto 12b y 1-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidrocyclohepta[b]indol en una proporción de 1:1 (aceite de color amarillo pálido, con un rendimiento del 83 %).

8-bromo-1,1-dimetil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol (12d)

2-bromofenilhidrazina clorhidrato (10a) y 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b) se utilizaron para preparar el compuesto 12d (aceite de color amarillo pálido, con un rendimiento del 45,2 %). RMN de 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 7.83 (s, 1H), 7.38 (dd, J = 7.8, 0.8 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 1.92–1.87 (m, 2H), 1.76–1.72 (m, 2H), 1.35 (s, 6H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 142.59, 134.28, 128.96, 123.42, 120.31, 117.34, 110.18, 104.28, 39.21, 31.61, 29.26, 21.51, 20.15.

4-bromo-5,6,7,8,9,10-hexahidrocyclohepta[b]indol (12a)

2-bromofenilhidrazina clorhidrato (10a) y cicloheptanona (11a) se utilizaron para preparar el compuesto 12a (aceite de color amarillo pálido, con un rendimiento del 87 %). RMN de 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 7.87 (s, 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 2.87 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 1.94–1.87 (m, 2H), 1.82–1.74 (m, 4H). RMN de 13C (101 MHz, CDCl3) δ 138.30, 132.81, 130.38, 122.83, 120.17, 116.88, 115.08, 103.86, 31.73, 29.53, 28.60, 27.38, 24.93.

Síntesis del compuesto 12c

El compuesto 10 (1,00 eq.) y cicloheptanona (11a) o 2,2-dimetil-ciclohexan-1-ona (11b) se disolvieron en ácido acético (0,22 M) y se reflujaron a 145 °C durante 2 h. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y, a continuación, se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3, que luego se extrajo con acetato de etilo tres veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Por último, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, éter de petróleo) para obtener los compuestos 12a, 12b y 12d (rendimiento del 45 % al 87 %).

2-bromo-6-hidrazinilpiridina (10c, 1 g, 5,32 mmol) y ciclohexanona (11a, 595 mg, 5,32 mmol) se añadieron en ácido polifosfórico (1 g) y se calentaron a 160 °C durante 16 h. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y, a continuación, se neutralizó con una solución saturada de NaHCO3, que luego se extrajo con EtOAc (200 mL × 3). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Por último, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice) utilizando una mezcla de disolventes adecuada para obtener el compuesto deseado.

Procedimiento general para la síntesis del intermediario 14

A una solución del intermediario 13 (1,00 eq.) en una mezcla de THF/H2O (V/V = 10/1, 0,13–0,23 M) o una mezcla de dioxano/H2O (V/V = 10/1, 0,10 M) se añadió 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ, 2,00 eq.) porciones a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, 3 h) y, a continuación, se añadió una solución saturada de NaHCO3 para apagar la reacción. El disolvente se eliminó mediante evaporador rotatorio y el residuo se extrajo con MTBE durante 3 veces. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. Por último, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice) utilizando una mezcla de disolventes adecuada para obtener el intermediario 14 (rendimiento del 55-67%).

4-bromo-5-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7,8,9-tetrahidrociclohepta[b]indol-10(5H)-ona (14a)

El intermediario 13a y la mezcla de THF/H2O se utilizaron para preparar el compuesto 14a (sólido marrón, 63% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 8,44 (dd, J = 7,9, 1,1 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 7,7, 1,1 Hz, 1H), 7,09 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 6,02 (s, 2H), 3,65–3,59 (m, 2H), 3,20–3,15 (m, 2H), 2,84–2,79 (m, 2H), 2,08–2,00 (m, 2H), 1,98–1,90 (m, 2H), 0,94–0,87 (m, 2H), −0,04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) δ 198,31, 150,75, 130,27, 129,40, 123,71, 121,58, 116,78, 103,23, 71,79, 65,41, 43,38, 25,69, 24,96, 21,85, 18,26, −1,27.

3-bromo-5-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7,8,9-tetrahidrociclohepta[b]indol-10(5H)-ona (14b)

La mezcla del intermediario 13b y 1-bromo-5-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8,9,10-hexahidrociclohepta[b]indol (1:1) y la mezcla de THF/H2O se utilizaron para preparar el compuesto 14b (sólido marrón, 55% de rendimiento basado en 13b). RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 8,28 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,36 (dd, J = 8,5, 1,7 Hz, 1H), 5,44 (s, 2H), 3,55–3,49 (m, 2H), 3,14 (dd, J = 6,8, 5,6 Hz, 2H), 2,83–2,79 (m, 2H), 2,08–2,02 (m, 3H), 1,95 (td, J = 6,6, 4,2 Hz, 2H), 0,90 (dd, J = 8,7, 7,5 Hz, 2H), −0,04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) δ 199,55, 150,13, 139,15, 127,29, 127,15, 125,02, 118,13, 117,80, 113,64, 73,59, 67,82, 44,86, 27,33, 26,28, 23,32, 19,20, 0,00.

2-bromo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-7,8,9,10-tetrahidrociclohepta^[4,5]pirrolo[2,3-b]piridin-5(6H)-ona (14c)

El intermediario 13c y la mezcla de dioxano/H2O se utilizaron para preparar el compuesto 14c (sólido amarillo, 67% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 8,28 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,36 (dd, J = 8,5, 1,7 Hz, 1H), 5,44 (s, 2H), 3,52 (t, J = 8,3, 7,9 Hz, 2H), 3,14 (t, J = 6,5, 6,0 Hz, 2H), 2,81 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,08–2,00 (m, 4H), 1,97–1,92 (m, 2H), 0,90 (t, J = 8,1 Hz, 2H), −0,04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) δ 199,55, 150,13, 139,15, 127,29, 127,15, 125,02, 118,13, 117,80, 113,64, 73,59, 67,82, 44,86, 27,33, 26,28, 23,32, 19,20, 0,00.

8-bromo-1,1-dimetil-9-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,9-tetrahidro-4H-carbazol-4-ona (14d)

El intermediario 13d y la mezcla de THF/H2O se utilizaron para preparar el compuesto 14d (sólido marrón, 63% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 8,36 (dd, J = 7,8, 1,1 Hz, 1H), 7,45 (dd, J = 7,8, 1,1 Hz, 1H), 7,08 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 5,90 (s, 2H), 3,66 (t, J = 8,6, 8,0 Hz, 2H), 2,62 (t, J = 6,9, 6,2 Hz, 2H), 2,10 (t, J = 7,0, 6,2 Hz, 2H), 1,58 (s, 6H), 0,00 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, Cloroformo-d) δ 194,73, 158,84, 133,90, 129,82, 128,45, 124,17, 121,47, 112,94, 103,75, 72,70, 64,91, 41,64, 35,09, 33,63, 27,40, 18,32, −1,33.

Aquí tienes la traducción al español de los datos proporcionados:

3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)-1,1,1-trifluoropropan-2-ol (16d)

El intermediario 15a y el intermediario crudo 19-4 se utilizaron para preparar el compuesto crudo 16d, que se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.

(S)-3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)butan-1-ol (16e)

El intermediario 15a y el intermediario crudo 19-5 se utilizaron para preparar el compuesto 16e. Sólido amarillo, rendimiento del 56%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.30 (s, 1H), 3.69 - 3.56 (m, 4H), 3.25 - 3.16 (m, 2H), 2.71 - 2.52 (m, 2H), 2.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 2.10 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 1.94 (dddd, J = 13.7, 9.8, 5.9, 3.0 Hz, 1H), 1.36 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.26 (dq, J = 7.1, 4.5, 3.5 Hz, 2H), 0.95 - 0.88 (m, 2H), -0.04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 161.17, 145.08, 133.62, 130.19, 128.94, 122.48, 122.31, 121.46, 112.92, 103.09, 71.54, 65.05, 58.59, 43.67, 41.63, 28.96, 27.76, 26.59, 22.53, 18.17, -1.38. EM-MS (m/z): 531 (M + H)+.

(R)-3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)butan-1-ol (16f)

El intermediario 15a y el intermediario crudo 19-6 se utilizaron para preparar el compuesto 16f. Sólido amarillo, rendimiento del 56%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.43 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.28 (p, J = 8.6, 7.3 Hz, 1H), 3.67 - 3.60 (m, 4H), 3.38 (ddd, J = 13.7, 7.5, 5.6 Hz, 1H), 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.63 - 2.58 (m, 2H), 2.27 - 2.16 (m, 1H), 2.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 1.88 (dddd, J = 13.4, 9.7, 6.5, 3.2 Hz, 1H), 1.37 (ddd, J = 15.7, 7.8, 5.0 Hz, 1H), 1.31 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.27 - 1.23 (m, 1H), 0.94 - 0.88 (m, 2H), -0.04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 163.25, 162.59, 157.45, 146.38, 134.96, 131.61, 130.25, 123.73, 123.61, 122.91, 114.32, 104.41, 72.89, 66.39, 59.97, 45.02, 42.85, 30.33, 29.09, 27.96, 23.75, 19.53, 0.00. EM-MS (m/z): 531 (M + H)+.

3-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)propan-1-ol (16 g)

El intermediario 15a y el intermediario crudo 19-7 se utilizaron para preparar el compuesto 16 g. Sólido amarillo, rendimiento del 66%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.43 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.05 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.24 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.65 (dt, J = 15.9, 6.4 Hz, 6H), 3.20 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.64 - 2.59 (m, 2H), 2.20 - 2.11 (m, 2H), 1.78 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 0.95 - 0.88 (m, 2H), -0.04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 161.91, 156.33, 145.12, 133.74, 130.39, 129.02, 122.60, 122.35, 121.71, 113.11, 103.18, 71.65, 65.16, 58.52, 37.62, 33.76, 29.14, 27.96, 26.62, 18.28, -1.26. EM-MS (m/z): 517 (M + H)+.

4-((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)butan-1-ol (16 h)

El intermediario 15a y el intermediario crudo 19-8 se utilizaron para preparar el compuesto 16 h. Sólido amarillo, rendimiento del 74%. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.98 (s, 2H), 5.28 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.69 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.66 - 3.60 (m, 2H), 3.52 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.62 - 2.57 (m, 2H), 2.12 (p, J = 6.4 Hz, 2H), 1.78 - 1.65 (m, 4H), 0.94 - 0.88 (m, 2H), -0.04 (s, 9H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) δ 162.89, 162.63, 157.74, 146.15, 134.99, 131.93, 130.13, 123.58, 123.42, 114.71, 104.29, 72.87, 66.36, 63.84, 42.83, 31.32, 30.58, 29.38, 27.87, 27.71, 19.54, 0.00. EM-MS (m/z): 531 (M + H)+.

1-(((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)metil)ciclobutan-1-ol (16 i)

Espero que esta traducción sea útil.

1-(((9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il)amino)metil)ciclobutano-1-ol (16i)

The intermediate 15a and crude intermediate 19–9 were used to prepare compound 16i. Yellow solid, 62% yield. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.26 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.68 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.65-3.60 (m, 2H), 3.52 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 3.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.62-2.57 (m, 2H), 2.12 (p, J = 6.4 Hz, 2H), 1.78-1.65 (m, 4H), 0.94-0.88 (m, 2H), -0.04 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 162.89, 162.63, 157.74, 146.15, 134.99, 131.93, 130.13, 123.58, 123.42, 114.71, 104.29, 72.87, 66.36, 63.84, 42.83, 31.32, 30.58, 29.38, 27.87, 27.71, 19.54, 0.00. ESI-MS (m/z): 531 (M+H)+.

El intermediario 16e se utilizó para preparar el compuesto 8e. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 67% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16f se utilizó para preparar el compuesto 8f. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 62% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16g se utilizó para preparar el compuesto 8g. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16h se utilizó para preparar el compuesto 8h. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 68% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16i se utilizó para preparar el compuesto 8i. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16j se utilizó para preparar el compuesto 8j. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 68% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16k se utilizó para preparar el compuesto 8k. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC 97.93%.

El intermediario 16l se utilizó para preparar el compuesto 8l. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 68% en 2 etapas. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.57 (s, 1H), 8.85 (an, s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.02 (an, s, 1H), 7.51 (dd, J = 12.7, 6.8 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 3.56-3.53 (m, 3H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.78-2.71 (m, 2H), 2.04-1.93 (m, 2H), 1.88-1.81 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.39, 152.49, 150.02, 143.11, 137.05 (d, J = 3.0 Hz), 127.83 (d, J = 7.6 Hz), 126.25, 124.83 (d, J = 7.6 Hz), 121.46 (d, J = 10.6 Hz), 120.45, 116.52 (d, J = 92.1 Hz), 110.34, 57.55, 44.73, 38.53, 30.13, 29.25, 22.73, 20.43, 18.53, 18.06. 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 37.74. HRMS (m/z): calculado para C21H28N4O2P+ (M + H+): 399.1944, encontrado: 399.1944. Pureza UPLC

Aquí tienes la traducción al español de los datos proporcionados:

(S)-Dimetil(2-(piperidin-3-ilamino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)fosfina óxido (7a)

El intermediario 16a se utilizó para preparar el compuesto 7a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 63% en 2 pasos. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8.83 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 13.2, 7.3 Hz, 1H), 7.41 (td, J = 7.7, 2.6 Hz, 1H), 4.52 (br, s, 1H), 3.61 (dd, J = 12.5, 3.9 Hz, 1H), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.36 (dt, J = 12.3, 4.2 Hz, 1H), 3.25 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 3.14 - 3.09 (m, 1H), 2.91 - 2.77 (m, 2H), 2.36 - 2.32 (m, 1H), 2.21 - 2.05 (m, 3H), 2.00 - 1.94 (m, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.87 - 1.79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 169.40, 154.79, 151.35, 144.85, 138.60 (d, J = 4.5 Hz), 129.85 (d, J = 7.6 Hz), 128.10, 126.16 (d, J = 10.6 Hz), 123.57, 123.07 (d, J = 12.1 Hz), 116.05 (d, J = 99.7 Hz), 112.28, 47.52, 47.10, 44.93, 31.22, 31.04, 29.26, 24.29, 21.64, 18.33 (d, J = 6.0 Hz), 17.86 (d, J = 7.6 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37.34. EM (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410.2104, encontrado: 410.2103. Pureza por HPLC: 100.00%.

(S)-(6,6-Dimetil-2-(piperidin-3-ilamino)-6,7-dihidro-5H-pirimid[5,4-c]carbazol-8-il)dimetilfosfina óxido (7d)

El intermediario 16p se utilizó para preparar el compuesto 7d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 47% en 2 pasos. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8.50 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.57 - 7.45 (m, 2H), 4.62 (br, s, 1H), 3.70 (dd, J = 12.5, 4.0 Hz, 1H), 3.39 (dt, J = 12.8, 4.5 Hz, 1H), 3.29 - 3.19 (m, 1H), 3.17 - 3.07 (m, 1H), 2.93 (s, 2H), 2.34 - 2.24 (m, 1H), 2.21 - 2.09 (m, 1H), 2.06 - 1.97 (m, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.87 - 1.81 (m, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.46 (s, 3H). RMN de 13C (101 MHz, MeOD) δ 166.75, 160.67, 154.81, 140.25 (d, J = 49.5 Hz), 126.85 (d, J = 7.1 Hz), 126.68 (d, J = 2.0 Hz), 126.46 (d, J = 10.1 Hz), 124.36 (d, J = 12.1 Hz), 119.18, 117.28 (d, J = 100.0 Hz), 116.29, 108.94, 47.38, 47.01, 44.86, 40.03, 33.89, 28.87, 26.62, 26.55, 21.62, 18.68, 17.97. EM (m/z): calculado para C23H31N5OP+ (M + H+): 424.2261, encontrado: 424.2257. Pureza por HPLC: 99.19%.

(S)-(2-((2-hidroxipropil)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)dimetilfosfina óxido (8a)

El intermediario 16b se utilizó para preparar el compuesto 8a. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 55% en 2 pasos. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8.90 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.49 (dd, J = 13.2, 7.3 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 7.8, 2.6 Hz, 1H), 4.15 - 4.06 (m, 1H), 3.62 - 3.42 (m, 2H), 3.35 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.79 - 2.73 (m, 2H), 2.05 (t, J = 13.4, 10.0 Hz, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.29 (d, J = 6.3 Hz, 3H). EM (m/z): calculado para C20H26N4O2P+ (M + H+): 385.1788, encontrado: 385.1784. Pureza por HPLC: 95.56%.

(R)-(2-((2-hidroxipropil)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)dimetilfosfina óxido (8b)

El intermediario 16c se utilizó para preparar el compuesto 8b. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 56% en 2 pasos. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8.92 (br, s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.49 (dd, J = 13.2, 7.3 Hz, 1H), 7.36 (td, J = 7.7, 2.6 Hz, 1H), 4.15 - 4.05 (m, 1H), 3.58 - 3.44 (m, 1H), 3.36 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.85 - 2.72 (m, 2H), 2.12 - 2.03 (m, 2H), 1.93 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.30 (d, J = 6.3 Hz, 3H). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37.61. EM (m/z): calculado para C22H28N4O2P+ (M + H+): 411.1944, encontrado: 411.1940. Pureza por HPLC: 95.05%.

Dimetil(2-((3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropil)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)fosfina óxido (8c)

El intermediario 16d se utilizó para preparar el compuesto 8c. Sólido de color marrón claro, con un rendimiento del 27% en 4 pasos. RMN de 1H (400 MHz, Metanol-d4) δ 8.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.51 (dd, J = 13.2, 7.3 Hz, 1H), 7.35 (td, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 4.37 (td, J = 8.5, 7.5, 3.8 Hz, 1H), 4.04 (s, 1H), 3.79 (dd, J = 14.2, 8.7 Hz, 1H), 3.41 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.91 - 2.78 (m, 2H), 2.16 - 2.05 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.92 (s, 3H). EM (m/z): calculado para C20H23F3N4O2P+ (M + H+): 439.1510, encontrado: 439.1505. Pureza por HPLC: 98.62%.

(S)-(2-((4-hidroxibutan-2-il)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4’,5′:3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)fosfina óxido de dimetilo (8n)

El intermedio crudo 16 m se utilizó para preparar el compuesto 8n. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 36% en 4 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8,89 (s, 1H), 7,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 13,1, 7,1 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 7,7, 2,6 Hz, 1H), 4,39 (s, 1H), 3,55 (dd, J = 13,1, 3,8 Hz, 2H), 3,42 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,24 (t, J = 11,2 Hz, 2H), 2,88-2,83 (m, 2H), 2,40 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 2,15-2,11 (m, 2H), 2,01-1,94 (m, 2H), 1,93 (s, 3H), 1,91 (s, 3H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 170,15, 153,71, 152,01, 142,79, 138,65 (d, J = 3,02 Hz), 129,90 (d, J = 7,55 Hz), 128,20, 126,32 (d, J = 10,57 Hz), 123,16, 123,08, 116,23 (d, J = 99,66 Hz), 112,32, 47,86, 43,86, 31,38, 31,10, 29,30, 23,98, 18,35, 17,87. RMN de 31P (162 MHz, MeOD) δ 42,63. RME (m/z): calculado para C22H29N5OP+ (M + H+): 410,2110, encontrado: 410,2103. Pureza por HPLC: 100,00 %.

(S)-fosfina óxido de dimetilo(2-(piperidin-3-ilamino)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'' :4',5']pirrolo[2',3' :6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il) (9f)

El intermedio 16o se utilizó para preparar el compuesto 9f. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 65% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 9,02 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,92-7,86 (m, 1H), 4,51 (s, 1H), 3,66-3,60 (m, 1H), 3,43-3,35 (m, 3H), 3,23 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,15-3,09 (m, 1H), 2,93-2,82 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 1H), 2,22-2,06 (m, 3H), 2,00-1,93 (m, 1H), 1,87 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 1,84 (d, J = 1,2 Hz, 3H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 167,51, 153,55, 152,73, 149,24 (d, J = 129,9 Hz), 149,14 (d, J = 24,2 Hz), 144,10, 130,81 (d, J = 3,0 Hz), 122,40, 121,89, 119,39 (d, J = 21,1 Hz), 109,83, 46,15, 45,69, 43,53, 30,21, 29,64, 27,83, 22,43, 20,29, 15,10, 14,62. RMN de 31P (162 MHz, MeOD) δ 42,63. RME (m/z): calculado para C21H28N6OP+ (M + H+): 411,2057, encontrado: 411,2055. Pureza por HPLC: 99,43 %.

Síntesis del compuesto 22-1

A una solución del tert-butil (S)-(6-oxopiperidin-3-il)carbamato (20, 100 mg, 0,467 mmol) disponible comercialmente en THF anhidro (4,6 mL) se añadió ZrCl4 (260 mg, 1,12 mmol) a -10 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a -10 °C, y luego se añadió MeMgBr (3 M en THF, 2 mL, 6,00 mmol). La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche), y luego se apagó mediante la adición de NaOH al 30% en agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo (21) se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El tert-butil (S)-(6,6-dimetilpiperidin-3-il)carbamato crudo (21) se disolvió en DCM (4 mL) al que se añadió TFA (0,4 mL) por goteo. La reacción se agitó durante 12 horas y el disolvente se eliminó por evaporación rotatoria para obtener el (S)-6,6-dimetilpiperidin-3-amina cruda (22-1) que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis del intermedio 23

A una solución del intermedio 15a o 15d (1,00 equiv.) en etanol (0,11 M) se añadió morfolina (10,00 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 85 °C durante 1 h, y luego se añadió clorhidrato de guanidinio (5,00 equiv.) y metóxido de sodio (5,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 85 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche), y luego se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para obtener el residuo, que se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una solución saturada de NH4Cl y una solución saturada de NaCl, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior (1,00 equiv.) en una mezcla de AcOH/H2O (V/V = 10/1, 0,15 M) se añadió NaNO2 en agua (4,0 M, 4,00 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que se completó la conversión, y luego se apagó con una solución saturada de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

A una solución del residuo anterior en DCM anhidro (0,1 M) se añadió TEA (5,00 equiv.) y Tf2O (3,00 equiv.) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C hasta que se completó la conversión, y luego se apagó mediante la adición de una solución saturada de NH4Cl y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó posteriormente mediante cromatografía en columna flash (gel de sílice, PE/EA = 5/1) para obtener el intermedio 23.

9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il trifluorometanosulfonato (23a)

El intermediario 15a se utilizó para preparar el intermediario 23a. Sólido amarillo, 49% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,79 (d, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,50 (d, J = 7,5, 1,2 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,03 (s, 2H), 3,73–3,61 (m, 2H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,93–2,80 (m, 2H), 2,25–2,13 (m, 2H), 0,92 (t, 2H), −0,03 (s, 9H).

8-bromo-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-il trifluorometanosulfonato (23b)

El intermediario crudo 15d se utilizó para preparar el intermediario crudo 23b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

9-bromo-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-il trifluorometanosulfonato (23a)

El intermediario 15a se utilizó para preparar el intermediario 23a. Sólido amarillo, 49% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,79 (d, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 8,34 (s, 1H), 7,50 (d, J = 7,5, 1,2 Hz, 1H), 7,14 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,03 (s, 2H), 3,73–3,61 (m, 2H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,93–2,80 (m, 2H), 2,25–2,13 (m, 2H), 0,92 (t, 2H), −0,03 (s, 9H).

8-bromo-6,6-dimetil-7-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-2-il trifluorometanosulfonato (23b)

El intermediario crudo 15d se utilizó para preparar el intermediario crudo 23b, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

Procedimientos generales para la síntesis de los intermediarios 24 y 25

A una solución del intermediario 23 (1,00 eq.) en NMP (0,1 M) se añadió el intermediario 22 (3,00 eq.) y la DIPEA (3,00 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadió agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (sílice) utilizando una mezcla de acetato de etilo y hexano como eluyente.

(S)-dimetil(2-((6,6-dimetilpiperidin-3-il)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)fosfina óxido (7b)

El intermediario crudo 24a se utilizó para preparar el compuesto 7b. Sólido amarillo claro, 48% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,81 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,52 (dd, J = 13,1, 7,3 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,8, 2,5 Hz, 1H), 4,57 (an, s, 1H), 3,54 (dd, J = 12,9, 4,2 Hz, 1H), 3,47–3,37 (m, 3H), 2,94–2,77 (m, 2H), 2,35–2,25 (m, 1H), 2,24–2,15 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 2,05–1,97 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,90–1,85 (m, 1H), 1,49 (d, J = 2,3 Hz, 6H). RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,81 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,52 (dd, J = 13,1, 7,3 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,8, 2,5 Hz, 1H), 4,57 (an, s, 1H), 3,54 (dd, J = 12,9, 4,2 Hz, 1H), 3,47–3,37 (m, 3H), 2,94–2,77 (m, 2H), 2,35–2,25 (m, 1H), 2,24–2,15 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 2,05–1,97 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,90–1,85 (m, 1H), 1,49 (d, J = 2,3 Hz, 6H). EM de alta resolución (m/z): calculado para C24H33N5OP+ (M + H+): 438,2417, encontrado: 438,2417. Pureza UPLC 97,32%.

(S)-(2-((6,6-dimetilpiperidin-3-il)amino)-6,6-dimetil-6,7-dihidro-5H-pirimido[5,4-c]carbazol-8-il)dimetilfosfina óxido (7e)

El intermediario crudo 24b se utilizó para preparar el compuesto 7e. Sólido amarillo claro, 19% de rendimiento en 6 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,51 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,53 (dd, J = 13,0, 7,3 Hz, 1H), 7,48 (td, J = 7,6, 2,4 Hz, 1H), 4,58 (an, s, 1H), 3,64–3,59 (m, 1H), 3,41–3,35 (m, 1H), 2,94 (s, 2H), 2,28–2,21 (m, 1H), 2,05–2,00 (m, 1H), 2,00–1,96 (m, 1H), 1,95 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,92–1,88 (m, 1H), 1,51 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 1,48 (s, 3H), 1,46 (s, 3H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 166,48, 163,15, 140,03 (d, J = 3,0 Hz), 126,90 (d, J = 7,6 Hz), 126,59 (d, J = 1,5 Hz), 126,37 (d, J = 10,6 Hz), 124,15 (d, J = 12,1 Hz), 119,07, 117,34 (d, J = 98,2 Hz), 116,43, 108,94, 55,90, 49,57, 46,61, 43,10, 40,13, 33,90, 33,83, 26,64, 26,56, 25,43, 18,59 (d, J = 1,5 Hz), 18,11 (d, J = 1,5 Hz). RMN de 31P (162 MHz, metanol-d4) δ 46,62. EM de alta resolución (m/z): calculado para C25H35N5OP+ (M + H+): 452,2574, encontrado: 452,2573. Pureza UPLC 99,29%.

(2-(((1s,3s)-3-hidroxiciclobutil)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)dimetilfosfina óxido (8i)

El intermediario crudo 25a se utilizó para preparar el compuesto 8i. Sólido marrón claro, 47% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,99 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 13,2, 7,4 Hz, 1H), 7,40 (td, J = 7,8, 2,5 Hz, 1H), 4,13 (p, J = 7,2 Hz, 1H), 3,41 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,96–2,88 (m, 2H), 2,87–2,80 (m, 2H), 2,17–2,09 (m, 2H), 2,09–2,01 (m, 2H), 1,94–1,89 (m, 7H). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,57. EM de alta resolución (m/z): calculado para C21H26N4O2P+ (M + H+): 397,1793, encontrado: 397,1789. Pureza UPLC 95,19%.

(S)-dimetil(2-(pirrolidin-3-ilamino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)fosfina óxido (8m)

El intermediario 25b se utilizó para preparar el compuesto 8m. Sólido amarillo claro, 63% de rendimiento. RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ 11,23 (s, 1H), 8,87 (an, s, 3H), 8,07 (s, 1H), 7,45 (dd, J = 12,8, 7,2 Hz, 1H), 7,24 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 4,59 (an, s, 1H), 3,50–3,45 (m, 1H), 3,43–3,37 (m, 1H), 3,34–3,25 (m, 4H), 2,75–2,66 (m, 2H), 2,32–2,23 (m, 1H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,05–1,90 (m, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,80 (s, 3H). RMN de 13C (151 MHz, DMSO) δ 162,76, 153,55, 146,07, 144,19, 136,82 (d, J = 3,0 Hz), 127,98 (d, J = 7,6 Hz), 126,39, 124,03 (d, J = 7,6 Hz), 121,20, 120,36 (d, J = 9,1 Hz), 116,26, 110,26, 50,55, 50,01, 43,99, 30,09, 30,82, 29,61, 23,63, 18,56 (d, J = 1,5 Hz), 18,09 (d, J = 1,1 Hz). RMN de 31P (162 MHz, DMSO) δ 37,30. EM de alta resolución (m/z): calculado para C25H34N4O2P+ (M + H+): 396,1948, encontrado: 396,1948. Pureza UPLC 99,83%.

(S)-(2-((6,6-dimetilpiperidin-3-il)amino)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-9-il)dimetilfosfina óxido (7b)

El intermediario crudo 24a se utilizó para preparar el compuesto 7b. Sólido amarillo claro, 48% de rendimiento en 3 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,81 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,52 (dd, J = 13,1, 7,3 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,8, 2,5 Hz, 1H), 4,57 (an, s, 1H), 3,54 (dd, J = 12,9, 4,2 Hz, 1H), 3,47–3,37 (m, 3H), 2,94–2,77 (m, 2H), 2,35–2,25 (m, 1H), 2,24–2,15 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 2,05–1,97 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,90–1,85 (m, 1H), 1,49 (d, J = 2,3 Hz, 6H). RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,81 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,52 (dd, J = 13,1, 7,3 Hz, 1H), 7,43 (td, J = 7,8, 2,5 Hz, 1H), 4,57 (an, s, 1H), 3,54 (dd, J = 12,9, 4,2 Hz, 1H), 3,47–3,37 (m, 3H), 2,94–2,77 (m, 2H), 2,35–2,25 (m, 1H), 2,24–2,15 (m, 1H), 2,13–2,05 (m, 1H), 2,05–1,97 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,91 (s, 3H), 1,90–1,85 (m, 1H), 1,49 (d, J = 2,3 Hz, 6H). EM de alta resolución (m/z): calculado para C24H33N5OP+ (M + H+): 438,2417, encontrado: 438,2417. Pureza UPLC 97,32%.

El compuesto intermedio crudo 24b se utilizó para preparar el compuesto 7e. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 19% en 6 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,51 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,53 (dd, J = 13,0, 7,3 Hz, 1H), 7,48 (td, J = 7,6, 2,4 Hz, 1H), 4,58 (ancho, s, 1H), 3,64–3,59 (m, 1H), 3,41–3,35 (m, 1H), 2,94 (s, 2H), 2,28–2,21 (m, 1H), 2,05–2,00 (m, 1H), 2,00–1,96 (m, 1H), 1,95 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,89–1,77 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, metanol-d4) δ 168,7, 149,2, 147,8, 142,9, 136,1, 130,2, 129,9, 127,6, 123,5, 122,8, 121,5, 112,2, 47,3, 47,1, 44,9, 31,4, 31,1, 29,2, 26,8, 24,0, 21,6. EM (m/z): calculado para C22H26N5+ (M + H+): 376,2137, encontrado: 376,2131. Pureza en HPLC: 95,69%.

Procedimientos generales para la síntesis de los compuestos 9c y 9d

A una solución del compuesto intermedio 16a (1,00 equiv.), Pd(PPh3)4 (0,10 equiv.), K2CO3 (5,00 equiv.) en DMF/H2O desgasificado (V/V = 10/1, 0,05 M) se añadió el correspondiente éster de ácido borónico pinacol (1,50 equiv.) bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se calentó a 95 °C bajo microondas y se agitó a 95 °C hasta que se completó la conversión (normalmente, durante la noche), y luego se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo y se filtró a través de una almohadilla de celita. El disolvente se eliminó mediante evaporación al vacío para obtener el producto de Suzuki crudo, que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.

El producto de Suzuki crudo anterior se añadió a una solución de HCl-dioxano (4 M, 4 ml) y se calentó a 60 °C durante 30 minutos. A continuación, el disolvente se eliminó mediante evaporación al vacío y el residuo se lavó tres veces con hexano. A continuación, el sólido se añadió a THF (10%, 4 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporación al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener los compuestos objetivo 9c y 9d.

(S)-9-(ciclo pent-1-en-1-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (9c)

Se utilizó el éster de ácido 1-ciclo pentenil borónico pinacol para preparar el compuesto 9c. Sólido de color marrón claro, con un rendimiento del 66% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,48 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,25 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 6,22 (s, 1H), 4,57 (s, 1H), 3,60–3,55 (m, 1H), 3,40–3,35 (m, 3H), 3,29–3,24 (m, 1H), 3,18–3,08 (m, 1H), 2,89–2,81 (m, 3H), 2,70–2,66 (m, 1H), 2,42–2,32 (m, 1H), 2,23–2,03 (m, 5H), 2,02–1,94 (m, 1H), 1,89–1,77 (m, 1H), 1,33–1,28 (m, 1H), 1,20 (s, 1H). EM (m/z): calculado para C25H30N5+ (M + H+): 400,2501, encontrado: 400,2498.

(S)-9-(ciclohex-1-en-1-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (9d)

Se utilizó el éster de ácido ciclohex-1-en-1-il borónico pinacol para preparar el compuesto 9d. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 57% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,45 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,23 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 5,95 (s, 1H), 4,57 (s, 1H), 3,60–3,54 (m, 1H), 3,41–3,33 (m, 3H), 3,29–3,24 (m, 1H), 3,18–3,07 (m, 1H), 2,93–2,73 (m, 2H), 2,47–2,25 (m, 4H), 2,23–2,11 (m, 2H), 2,10–1,95 (m, 2H), 1,92–1,84 (m, 2H), 1,83–1,74 (m, 2H), 1,35–1,26 (s, 2H). EM (m/z): calculado para C26H32N5+ (M + H+): 414,2658, encontrado: 414,2652. Pureza en HPLC: 95,22%.

(S)-9-(ciclo pent-1-en-1-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirimid[4',5':3,4]ciclohepta[1,2-b]indol-2-amina (9c)

Metil (S)-(2-(piperidin-3-ilamino)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)carbamato (9 g)

El carbamato de metilo se utilizó para preparar el compuesto 9 g. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 54% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOD) δ 8,63 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,76 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,46 (an, s, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,64-3,57 (m, 1H), 3,40-3,30 (m, 1H), 3,29-3,22 (m, 3H), 3,16-3,10 (m, 1H), 2,87-2,76 (m, 2H), 2,36-2,28 (m, 1H), 2,17-2,08 (m, 2H), 2,05-1,99 (m, 1H), 1,98-1,90 (m, 1H), 1,88-1,77 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 168,50, 156,07, 152,83, 149,21, 148,58, 134,31, 122,87, 118,65, 117,34, 111,41, 109,61, 108,23, 52,80, 47,49, 46,93, 44,92, 31,45, 31,31, 29,17, 23,64, 21,54. EM (m/z): calculado para C21H26N7O2+ (M + H+): 408,2142, encontrado: 408,2138.

(S)-N-metil-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)metanosulfonamida (9 h)

La N-metilmetanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 h. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 57% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOD) δ 8,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,50 (an, s, 1H), 3,62 (dd, J = 12,5, 3,3 Hz, 1H), 3,41 (s, 3H), 3,39-3,36 (m, 1H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,15-3,08 (m, 4H), 2,92-2,79 (m, 2H), 2,35-2,27 (m, 1H), 2,20-2,11 (m, 2H), 2,11-2,04 (m, 1H), 2,00-1,92 (m, 1H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 169,26, 154,52, 152,01, 151,22, 148,90, 144,49, 134,13, 123,12, 119,63, 115,56, 111,36, 47,48, 47,04, 44,92, 37,36, 37,10, 31,52, 31,16, 29,18, 23,76, 21,60. EM (m/z): calculado para C21H28N7O2S+ (M + H+): 442,2020, encontrado: 442,2018. Pureza de HPLC: 95,08%.

(S)-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)metanosulfonamida (9 i)

La metanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 i. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 49% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 8,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 6,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,48 (an, s, 1H), 3,64-3,56 (m, 1H), 3,40-3,31 (m, 5H), 3,30-3,28 (m, 1H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,19-3,05 (m, 1H), 2,94-2,75 (m, 2H), 2,39-2,25 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 2H), 2,08-2,01 (m, 1H), 2,01-1,89 (m, 1H), 1,88-1,76 (m, 1H). RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) δ 169,38, 154,29, 150,67, 149,41, 148,96, 143,81, 134,76, 123,07, 117,10, 111,52, 108,30, 47,42, 47,01, 44,92, 41,81, 31,46, 31,21, 29,12, 23,73, 21,51. EM (m/z): calculado para C20H26N7O2S+ (M + H+): 428,1863, encontrado: 428,1862. Pureza de HPLC: 95,26%.

(S)-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)etanosulfonamida (9 j)

La etanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 j. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 61% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOD) δ 8,72 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 7,93 (s, 1H), 6,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,50 (an, s, 1H), 3,63-3,59 (m, 1H), 3,55 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 3,36 (dd, J = 12,6, 4,6 Hz, 1H), 3,33-3,31 (m, 2H), 3,28-3,21 (m, 1H), 3,16-3,10 (m, 1H), 2,91-2,78 (m, 2H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,19-2,11 (m, 2H), 2,10-2,02 (m, 1H), 2,00-1,91 (m, 1H), 1,87-1,79 (m, 1H), 1,36 (t, J = 7,4 Hz, 3H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 169,71, 153,88, 150,99, 149,47, 149,01, 143,11, 134,72, 123,11, 117,07, 111,54, 108,37, 48,60, 47,38, 47,04, 44,92, 31,47, 31,20, 29,11, 23,69, 21,50, 8,40. EM (m/z): calculado para C21H28N7O2S+ (M + H+): 442,2025, encontrado: 442,2019. Pureza de HPLC: 100,00%.

(S)-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)etanosulfonamida (9 k)

La ciclopropanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 k. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 53% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 8,77 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,05 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,46 (an, s, 1H), 3,64-3,57 (m, 1H), 3,40-3,32 (m, 3H), 3,26-3,18 (m, 1H), 3,16-3,08 (m, 1H), 3,08-3,00 (m, 1H), 2,92-2,78 (m, 2H), 2,36-2,27 (m, 1H), 2,19-2,01 (m, 3H), 2,00-1,88 (m, 1H), 1,88-1,76 (m, 1H), 1,26-1,19 (m, 2H), 1,06-1,00 (m, 2H). EM (m/z): calculado para C22H28N7O2S+ (M + H+): 454,2020, encontrado: 454,2019. Pureza de HPLC: 98,48%.

Metil (S)-(2-(piperidin-3-ilamino)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)carbamato (9 g)

El carbamato de metilo se utilizó para preparar el compuesto 9 g. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 54% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOD) δ 8,63 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,76 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,46 (an, s, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,64-3,57 (m, 1H), 3,40-3,30 (m, 1H), 3,29-3,22 (m, 3H), 3,16-3,10 (m, 1H), 2,87-2,76 (m, 2H), 2,36-2,28 (m, 1H), 2,17-2,08 (m, 2H), 2,05-1,99 (m, 1H), 1,98-1,90 (m, 1H), 1,88-1,77 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, MeOD) δ 168,50, 156,07, 152,83, 149,21, 148,58, 134,31, 122,87, 118,65, 117,34, 111,41, 109,61, 108,23, 52,80, 47,49, 46,93, 44,92, 31,45, 31,31, 29,17, 23,64, 21,54. EM (m/z): calculado para C21H26N7O2+ (M + H+): 408,2142, encontrado: 408,2138.

(S)-N-metil-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)metanosulfonamida (9 h)

La N-metilmetanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 h. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 57% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, MeOD) δ 8,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,50 (an, s, 1H), 3,62 (dd, J = 12,5, 3,3 Hz, 1H), 3,41 (s, 3H), 3,39-3,36 (m, 1H), 3,34 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,15-3,08 (m, 4H), 2,92-2,79 (m, 2H), 2,35-2,27 (m, 1H), 2,20-2,11 (m, 2H), 2,11-2,04 (m, 1H), 2,00-1,92 (m, 1H), 1,87-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 169,26, 154,52, 152,01, 151,22, 148,90, 144,49, 134,13, 123,12, 119,63, 115,56, 111,36, 47,48, 47,04, 44,92, 37,36, 37,10, 31,52, 31,16, 29,18, 23,76, 21,60. EM (m/z): calculado para C21H28N7O2S+ (M + H+): 442,2020, encontrado: 442,2018.

(S)-N-(2-(piperidin-3-ilamino)-8-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-10-il)metanosulfonamida (9 i)

La metanosulfonamida se utilizó para preparar el compuesto 9 i. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 49% en 2 etapas. RMN de 1H (400 MHz, MeOD) δ 8,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 6,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,48 (an, s, 1H), 3,64-3,56 (m, 1H), 3,40-3,31 (m, 5H), 3,30-3,28 (m, 1H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,19-3,05 (m, 1H), 2,94-2,75 (m, 2H), 2,39-2,25 (m, 1H), 2,21-2,09 (m, 2H), 2,08-2,01 (m, 1H), 2,01-1,89 (m, 1H), 1,88-1,76 (m, 1H). RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) δ 169,38, 154,29, 150,67, 149,41

30 minutos. Luego, el disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria y el residuo se lavó con hexano tres veces. Luego, el sólido se añadió a una solución de etilendiamina en THF (10%) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se eliminó mediante evaporación rotatoria y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (ACN/H2O = 10/90 a 90/10) para obtener el compuesto objetivo 9n a 9q.

(S)-10-(3,5-dimetil-isoxazol-4-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9n)

Se utilizó 3,5-dimetil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)isoxazol para preparar el compuesto 9n. Sólido de color amarillo claro, rendimiento del 60% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8,90 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,55 (s ancho, 1H), 3,67-3,62 (m, 1H), 3,42-3,34 (m, 3H), 3,30-3,24 (m, 1H), 3,18-3,10 (m, 1H), 2,95-2,83 (m, 2H), 2,61 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,37-2,30 (m, 1H), 2,22-2,07 (m, 3H), 2,03-1,93 (m, 1H), 1,91-1,80 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 168,66, 160,34, 154,22, 152,80, 150,48, 146,23, 143,78, 133,00, 123,18, 120,16, 118,86, 117,41, 116,92, 111,33, 47,44, 47,08, 44,94, 31,58, 31,17, 29,11, 23,76, 21,52, 12,42, 11,66. EM (m/z): calculado para C24H28N7O+ (M + H+): 430,2350, encontrado: 430,2349. Pureza HPLC: 98,00%.

(S)-N-(piperidin-3-il)-10-(tiofen-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9o)

Se utilizó ácido 3-tiofenborónico para preparar el compuesto 9o. Sólido de color amarillo claro, rendimiento del 57% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8,61 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,70 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 4,9, 2,8 Hz, 1H), 4,46 (s ancho, 1H), 3,63-3,57 (m, 1H), 3,41-3,35 (m, 1H), 3,34-3,31 (m, 2H), 3,23 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,15-3,10 (m, 1H), 2,93-2,81 (m, 2H), 2,34-2,28 (m, 1H), 2,18-2,10 (m, 2H), 2,09-2,02 (m, 1H), 2,01-1,96 (m, 1H), 1,85-1,78 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 169,42, 153,64, 152,40, 150,04, 149,66, 143,44, 143,01, 133,27, 127,28, 127,27, 123,83, 122,93, 120,06, 116,24, 111,50, 47,41, 47,05, 44,93, 31,63, 31,26, 29,20, 23,53, 21,58. EM (m/z): calculado para C23H25N6S+ (M + H+): 417,1856, encontrado: 417,1851. Pureza HPLC: 99,07%.

(S)-10-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9p)

Se utilizó ácido (1-metil-1H-pirazol-5-il)borónico para preparar el compuesto 9p. Sólido de color amarillo claro, rendimiento del 54% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8,84 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,64 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 4,54 (s ancho, 1H), 4,26 (s, 3H), 3,64 (d, J = 10,9 Hz, 1H), 3,40-3,36 (m, 3H), 3,30-3,22 (m, 1H), 3,16-3,10 (m, 1H), 2,95-2,84 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 1H), 2,20-2,13 (m, 2H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,89-1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, Metanol-d4) δ 169,60, 154,08, 153,10, 149,83, 145,34, 143,71, 143,25, 139,07, 133,10, 123,15, 120,59, 118,65, 111,42, 107,56, 47,44, 47,11, 44,93, 39,74, 31,62, 31,16, 29,19, 23,69, 21,62. EM (m/z): calculado para C23H27N8+ (M + H+): 415,2353, encontrado: 415,2350. Pureza HPLC: 99,99%.

(S)-10-(furan-2-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9q)

Se utilizó 2-(furan-2-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano para preparar el compuesto 9q. Sólido de color amarillo claro, rendimiento del 59% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, Metanol-d4) δ 8,72 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,59 (dd, J = 3,4, 1,7 Hz, 1H), 4,49 (s, 1H), 3,65-3,61 (m, 1H), 3,40-3,37 (m, 1H), 3,34 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,23 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,13 (td, J = 10,3, 5,5 Hz, 1H), 2,90-2,84 (m, 2H), 2,35-2,30 (m, 1H), 2,15 (dd, J = 13,8, 6,2 Hz, 2H), 2,07 (p, J = 7,5 Hz, 1H), 2,03 (tt, J = 10,6, 5,3 Hz, 1H), 1,87-1,81 (m, 1H). EM (m/z): calculado para C23H27N8+ (M + H+): 415,2353, encontrado: 415,2350.

El ácido 3-tiofenoborónico se utilizó para preparar el compuesto 9o. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 57% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,61 (s, 1H), 7,94 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,70 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 4,9, 2,8 Hz, 1H), 4,46 (br, s, 1H), 3,63–3,57 (m, 1H), 3,41–3,35 (m, 1H), 3,34–3,31 (m, 2H), 3,23 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,15–3,10 (m, 1H), 2,93–2,81 (m, 2H), 2,34–2,28 (m, 1H), 2,18–2,10 (m, 2H), 2,09–2,02 (m, 1H), 2,01–1,96 (m, 1H), 1,85–1,78 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, CD3OD) δ 169,42, 153,64, 152,40, 150,04, 149,66, 143,44, 143,01, 133,27, 127,28, 127,27, 123,83, 122,93, 120,06, 116,24, 111,50, 47,41, 47,05, 44,93, 31,63, 31,26, 29,20, 23,53, 21,58. HRMS (m/z): calculado para C23H25N6S+ (M+H+): 417,1856, encontrado: 417,1851. Pureza UPLC 99,07%.

(S)-10-(1-metil-1H-pirazol-5-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9p)

El ácido (1-metil-1H-pirazol-5-il)borónico se utilizó para preparar el compuesto 9p. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 54% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,84 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,64 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,73 (s, 1H), 4,54 (br, s, 1H), 4,26 (s, 3H), 3,64 (d, J = 10,9 Hz, 1H), 3,40–3,36 (m, 3H), 3,28–3,22 (m, 1H), 3,16–3,09 (m, 1H), 2,95–2,84 (m, 2H), 2,36–2,29 (m, 1H), 2,20–2,13 (m, 2H), 2,12–2,05 (m, 1H), 2,03–1,94 (m, 1H), 1,89–1,79 (m, 1H). RMN de 13C (151 MHz, metanol-d4) δ 169,60, 154,08, 153,10, 149,83, 145,34, 143,71, 143,25, 139,07, 133,10, 123,15, 120,59, 118,65, 111,42, 107,56, 47,44, 47,11, 44,93, 39,74, 31,62, 31,16, 29,19, 23,69, 21,62. HRMS (m/z): calculado para C23H27N8+ (M+H+): 415,2353, encontrado: 415,2350. Pureza UPLC 99,99%.

(S)-10-(furan-2-il)-N-(piperidin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropirido[3'',2'':4',5']pirrolo[2',3':6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-amina (9q)

El 2-(furan-2-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano se utilizó para preparar el compuesto 9q. Sólido de color amarillo claro, con un rendimiento del 59% en 2 etapas. RMN de 1H (600 MHz, metanol-d4) δ 8,72 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,59 (dd, J = 3,4, 1,7 Hz, 1H), 4,49 (s, 1H), 3,65–3,61 (m, 1H), 3,40–3,37 (m, 1H), 3,34 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,23 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 3,13 (td, J = 10,3, 5,5 Hz, 1H), 2,90–2,84 (m, 2H), 2,35–2,30 (m, 1H), 2,15 (dd, J = 13,8, 6,2 Hz, 2H), 2,07 (p, J = 7,5 Hz, 1H), 1,98 (tt, J = 10,6, 5,3 Hz, 1H), 1,87–1,81 (m, 1H). HRMS (m/z): calculado para C23H27N8+ (M+H+): 415,2353, encontrado: 415,2350.

Cultivo celular y líneas celulares

Las líneas celulares HCT116 y K562 se obtuvieron de Procell (números de catálogo CL-0096 y CL-0130, respectivamente). Las células HCT116 se mantuvieron en DMEM con alta concentración de glucosa suplementado con L-glutamina, mientras que las células K562 se cultivaron en IMDM con L-glutamina (ambos de Gibco, Thermo Fisher Scientific). Ambos medios se suplementaron con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco, A5256701) y un 1% de penicilina-estreptomicina (P/S, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2 y se pasaron rutinariamente cada 2-3 días.

Ensayo de antiproliferación in vitro

Las células HCT116 y K562 en la fase de crecimiento logarítmico se sembraron en placas de 96 pocillos a densidades de 1500 y 8000 células por pocillo, respectivamente, y se incubaron durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Posteriormente, el medio de cultivo se reemplazó por medio fresco que contenía diluciones seriadas de los compuestos de prueba o el control vehículo, y las células se cultivaron durante 72 horas. El reactivo del kit de conteo celular-8 (CCK-8) (TargetMol, C0005) se añadió a cada pocillo, seguido de una incubación a 37 °C durante 1-2 horas. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (BioTek Synergy H1). Los valores de concentración inhibitoria media (IC50) se calcularon mediante análisis de regresión no lineal utilizando GraphPad Prism. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos independientes.

Ensayo de inhibición de quinasas

Las potencias inhibitorias de los compuestos probados contra las CDQ se evaluaron utilizando un ensayo enzimático basado en la fluorescencia, con detección realizada en una plataforma Calliper EZ Reader II. Los valores de IC50 se determinaron en presencia de ATP a concentración Km y socios de CDQ/ciclina (Biortus): 116 μM de ATP con 0,02 nM de CDQ1/ciclina A2, 100 μM de ATP con 0,015 nM de CDQ2/ciclina E1, 164 μM de ATP con 20 nM de CDQ6/ciclina D3, 50 μM de ATP con 3 nM de CDQ7/ciclina H/MAT1, 30 μM de ATP con 8 nM de CDQ9/ciclina T1. Se utilizaron sustratos peptídicos fluorescentes (Biortus) a una concentración final de 2 μM para todos los ensayos: CDK7tide se utilizó como sustrato para CDQ1, CDQ2, CDQ6 y CDQ7, mientras que CDK9tide se utilizó específicamente para los ensayos de CDQ9. Los valores de IC50 se calcularon utilizando el software GraphPad Prism.

Acoplamiento molecular

Se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando Schrödinger Suite 2022-3 (Maestro versión 13.5). Todos los cálculos se realizaron con los parámetros predeterminados, a menos que se indique lo contrario. Las estructuras de cristal de CDQ7 (código PDB: 8RGU) y CDQ1 (código PDB: 6GU3) se obtuvieron del Protein Data Bank. Las estructuras de las proteínas se prepararon utilizando el Protein Preparation Wizard en Maestro. Se generaron rejillas de receptor utilizando el panel Receptor Grid Generation en Maestro. El centroide del sitio de unión del ligando co-cristalizado se utilizó para definir el centro de la caja de rejilla. Los ligandos se construyeron en Maestro y se prepararon utilizando LigPrep. Se generaron estados de ionización a pH 7,0 ± 2,0 utilizando Epik, y se generaron tautómeros con la configuración predeterminada. Se realizó la minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS4. El acoplamiento de ligandos se realizó utilizando Glide en modo de precisión estándar (SP) con los parámetros predeterminados. La función de puntuación de acoplamiento se estableció en SP, y el número de poses por ligando se limitó a 5. Se realizó la minimización posterior al acoplamiento para refinar las geometrías de los ligandos. La pose de mayor rango basada en GlideScore se seleccionó para el análisis posterior y la generación de figuras.

Ensayo de Western blot

Las células HCT116 se trataron con 7a o SY-5609 a las concentraciones indicadas durante 24 horas. Las células se recogieron, se lavaron con PBS helado (Corning) y se lisaron en tampón RIPA (Beyotime, P0013E). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un kit de ensayo de BCA (Pierce/Thermo Fisher Scientific). Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Beyotime, FFP24). Después de bloquear con el reactivo QuickBlock™ (Beyotime, P0252), las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra la RNA polimerasa II fosforilada en Ser5 (Abcam, ab5131) y GAPDH (Cell Signaling, ab4787), ambos diluidos 1:1000 en el tampón de dilución de anticuerpos primarios QuickBlock™ (Beyotime, P0256). A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Cell Signaling, 7074P2; Anti-rabbit IgG) diluido 1:2000 en el tampón de dilución de anticuerpos secundarios QuickBlock™ (Beyotime, P0258) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se capturaron con un sistema de imagen de gel Tanon.

Ensayo de eficacia antitumoral in vivo

Los experimentos con animales se informaron de acuerdo con las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur. Se obtuvieron ratones hembra BALB/c desnudos (de 5 a 6 semanas de edad, de 18 a 22 g) de Zhuhai BesTest Bio-Tech Co., Ltd. y se aclimataron durante 1 semana antes de la experimentación. Los animales se alojaron en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) en condiciones controladas (temperatura de 20 a 26 °C, humedad relativa de 40 a 70%, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y 10 a 20 cambios de aire por hora). Los ratones se mantuvieron en jaulas de microaislador esterilizadas (máximo 5 por jaula) con enriquecimiento ambiental (túneles esterilizados, almohadillas para anidar y bloques para roer). Se proporcionó dieta esterilizada irradiada y agua esterilizada ad libitum.

Para la inoculación tumoral, se recogieron las células HCT116 y se resuspendieron en PBS. Un total de 1 × 107 células HCT116 suspendidas en 200 μL de PBS se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón desnudo. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 120-200 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 6 por grupo): control vehículo, 7a dosis baja (5 mg/kg), 7a dosis alta (20 mg/kg) y control positivo (SY-5609, 2 mg/kg). Los compuestos se disolvieron en 5% de DMSO/salina (v/v). Se administró 7a por vía intraperitoneal (i.p.) una vez al día durante 21 días consecutivos, mientras que SY-5609 se administró por vía oral (p