La deleción de EGFR en células mieloides reprograma el paisaje inmunosupresor del cáncer colorrectal.

A pesar de los avances en el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (CCM), este sigue siendo la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer, con opciones terapéuticas eficaces limitadas. Si bien la inhibición de EGFR es una terapia de primera línea estándar para pacientes con CCM que no presentan mutaciones en KRAS, con frecuencia se desarrolla resistencia, lo que limita su beneficio clínico. Los modelos murinos de CCM han demostrado que la deleción de EGFR en las células mieloides reduce la carga tumoral, y la presencia de células mieloides positivas para EGFR se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CCM. Sin embargo, el papel de estas células en la respuesta terapéutica a las terapias anti-EGFR sigue siendo poco conocido. En este estudio, integramos modelos murinos, secuenciación de ARN de células individuales (scRNAseq), proteómica y conjuntos de datos de CCM derivados de pacientes para investigar cómo la señalización de EGFR en las células mieloides moldea el microambiente tumoral (MET). En un ensayo terapéutico preclínico, demostramos que la deleción de EGFR en las células mieloides de ratones con CCM redujo el crecimiento tumoral, mientras que la pérdida de EGFR solo en las células epiteliales tumorales intestinales no tuvo ningún impacto terapéutico. La deleción de EGFR también disminuyó la abundancia de macrófagos F4/80hi, particularmente los subconjuntos Spp1+ y C1qc+, y redujo las vías inflamatorias como TGFβ, IFNγ y la señalización JAK/STAT en las células mieloides. Estos cambios alteraron las interacciones entre células mieloides y células T, lo que resultó en un MET menos inmunosupresor, caracterizado por una expresión reducida de los puntos de control inmunitario. Además, identificamos la trombospondina-1 (THBS1) como un ligando derivado de células mieloides que interactúa con las células T, y confirmamos su regulación por la señalización de EGFR mediante análisis proteómico. El análisis de los conjuntos de datos de CCM humanos reveló que una alta expresión de EGFR y THBS1 se correlaciona con malos resultados en los pacientes. En conjunto, estos hallazgos establecen la señalización de EGFR en las células mieloides como un regulador crítico del MET inmunosupresor y sugieren que el direccionamiento de EGFR dentro de subconjuntos mieloides específicos podría representar una prometedora estrategia terapéutica en el CCM. Contenido similar que están viendo otros usuarios

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Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer. En los últimos años, las tasas de incidencia en la población general han disminuido, a pesar de un aumento entre las personas más jóvenes [1, 2]. El CCR se origina en las criptas, con mayor frecuencia con la aparición de un adenoma después de la pérdida del gen APC, seguido del desarrollo de adenocarcinoma que coincide con la pérdida de TP53, mientras que, en caso de enfermedad invasiva, se producen mutaciones activadoras de KRAS ^[3]. Además de las alteraciones genéticas, los factores ambientales como la dieta y el tabaquismo o las afecciones inflamatorias también se han relacionado con el desarrollo del CCR. Específicamente, la enfermedad inflamatoria intestinal es un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer colorrectal asociado a colitis (CAC), lo que destaca la conexión entre la inflamación crónica y la tumorigénesis ^[4]. Los tratamientos convencionales para el CCR suelen incluir la resección quirúrgica combinada con quimioterapia y/o radioterapia para las etapas iniciales (I-III) ^[5]. El tratamiento de primera línea para pacientes metastásicos con KRAS/BRAF de tipo salvaje emplea quimioterapia en combinación con anticuerpos bloqueadores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mientras que los pacientes con mutaciones KRAS/BRAF son resistentes a este tratamiento y reciben quimioterapia combinada con inhibición antiangiogénica (anticuerpos anti-VEGFA) ^[6]. Sin embargo, entre los pacientes con KRAS/BRAF de tipo salvaje y, por lo tanto, elegibles para las terapias anti-EGFR, una fracción relativamente alta no responde, por razones que aún se desconocen. EGFR es una tirosina quinasa receptora que puede encontrarse desregulada en una variedad de cánceres epiteliales ^[7]. En los últimos años, sin embargo, se ha asociado EGFR con un papel promotor del tumor cuando se expresa en células mieloides que infiltran los tumores colorrectales y el carcinoma hepatocelular (CHC) [8, 9]. En modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM), la deleción constitutiva de Egfr, específicamente en las células mieloides antes de la iniciación del tumor, condujo a una reducción de la carga tumoral en el CCR y el CHC, mientras que la deleción de EGFR en las células tumorales (células epiteliales intestinales y hepatocitos) no afectó (CCR) o incluso mejoró (CHC) el crecimiento tumoral [8, 9]. Lo más importante es que las células mieloides positivas para EGFR también se encontraron en pacientes con CCR y CHC humanos, y su presencia se correlacionó con una reducción de la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia general [8, 9]. La promoción tumoral se relacionó con las citocinas derivadas de las poblaciones mieloides positivas para EGFR, como la interleucina (IL) 6 y la IL1β [8, 9, 10]. En un ensayo terapéutico preclínico en el que se eliminó EGFR en las células tumorales intestinales de GEMM con CCR establecido, no se observó una reducción del tumor ^[8]. Esto plantea la pregunta de si la eficacia de las terapias anti-EGFR en pacientes con CCR depende de la inhibición de EGFR en las células tumorales, las células mieloides o ambas. Las células mieloides asociadas al tumor representan una población heterogénea en los tumores sólidos que pueden adquirir diferentes estados de activación para apoyar o suprimir el crecimiento tumoral. Las tecnologías de célula única son herramientas importantes para caracterizar e identificar la diversidad celular y los diferentes fenotipos dentro de los tumores. En los últimos años, la presencia de macrófagos asociados al tumor (MAT) que expresan marcadores como C1QC o SPP1 en los tumores colorrectales humanos ha llamado mucho la atención, ya que se ha demostrado que tienen un papel promotor del tumor. Algunos informes también muestran que el aumento de la presencia de MAT que expresan SPP1 se correlaciona con un peor resultado para los pacientes con CCR [11, 12]. También se han descrito monocitos marcados por la expresión de CHIL3 como promotores del tumor ^[13]. Las células linfoides y sus estados de activación también desempeñan un papel importante en los tumores. En el CCR, se han descrito varios subconjuntos y fenotipos de células T a través de tecnologías de célula única, que permiten la detección de marcadores relacionados con estados ingenuos, activados, en reposo, agotados o reguladores [14, 15]. Es importante comprender cómo las poblaciones mieloides afectan el crecimiento tumoral directa o indirectamente modulando la migración, la diferenciación y la activación de otras células inmunitarias del microambiente tumoral (MET), como las células T o las células asesinas naturales (NK). En este contexto, es importante aclarar el papel de la expresión de EGFR en las células mieloides asociadas al tumor en el CCR. Todavía se desconoce qué población de células mieloides expresa EGFR y cómo esto influye en las células tumorales y el microambiente circundante.

En este estudio, mostramos en un ensayo terapéutico preclínico que la deleción inducible de EGFR en las células mieloides de GEMM con CCR establecido da como resultado una reducción del tumor, lo que indica que la eficacia terapéutica de la inhibición de EGFR depende en gran medida de su acción sobre las células mieloides. Para investigar las actividades celulares resultantes en el CCR tras la deleción de EGFR en el compartimento mieloide, realizamos una secuenciación de ARN de célula única de alto rendimiento (scRNAseq). Analizamos estos datos recién generados para predecir si y cómo la expresión de EGFR en las células mieloides podría afectar la composición del MET y la comunicación entre células dentro del MET del CCR. El atlas celular resultante sirvió de base para un mapa de comunicación que reveló pares de receptores-ligandos candidatos involucrados en la interacción entre las células mieloides y las células T del MET. También evaluamos las alteraciones dependientes de EGFR de la expresión génica a nivel de proteínas mediante el análisis proteómico basado en espectrometría de masas de poblaciones mieloides clasificadas. Además, utilizamos un conjunto de datos de célula única de CCR humano para comparar y validar nuestros hallazgos en células mieloides humanas con firmas génicas bajas y altas de EGFR e identificamos la coexpresión de EGFR y trombospondina-1 (THBS1) como marcadores pronósticos para la progresión tumoral en el CCR humano. En conjunto, nuestro estudio mejora nuestra comprensión de los circuitos reguladores génicos dependientes de EGFR en las células mieloides, revelando alteraciones en su fenotipo con posibles consecuencias en la interacción entre los diferentes componentes dentro del MET.

Resultados
La deleción de EGFR en las células mieloides del CCR establecido conduce a una reducción de la carga tumoral
Anteriormente, observamos una reducción del crecimiento tumoral en ratones que carecían constitutivamente de EGFR en las células mieloides (EgfrΔMyl), mientras que la falta de EGFR en las células epiteliales intestinales no tuvo impacto en el crecimiento tumoral ^[8]. Para investigar si, en un entorno terapéutico, la inhibición de EGFR en las células mieloides conduciría a la regresión del tumor, utilizamos la línea de ratón LysM-CreERT2 inducible con tamoxifeno para eliminar EGFR específicamente en las células mieloides (EgfrΔMyl-ER) de tumores colorrectales inducidos por AOM/DSS ya establecidos (Fig. 1A). La recombinación y la reducción de la expresión de Egfr tras la administración de tamoxifeno se confirmaron en los macrófagos peritoneales aislados de ratones AOM/DSS tratados con EgfrΔMyl-ER (Fig. S1A, B y Material Suplementario 1A). 40-50 días después de la administración de tamoxifeno y la deleción de EGFR, las áreas tumorales del colon se redujeron significativamente en los ratones EgfrΔMyl-ER, mientras que el número de tumores se mantuvo igual (Fig. 1B, C). Interesantemente, en los ratones EgfrΔMyl, el número de tumores se redujo en comparación con los controles, lo que sugiere que la expresión de EGFR en las células mieloides mejora la iniciación del tumor en las primeras fases (Fig. 1C). Por lo tanto, la señalización de EGFR en las células mieloides regula la iniciación y la promoción de los tumores de colon en el modelo tumoral AOM/DSS, lo que destaca su relevancia terapéutica.

Fig. 1: La deleción de EGFR en las células mieloides reduce la carga tumoral de la tumorigénesis intestinal asociada a la colitis.
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A. Descripción general del modelo AOM/DSS utilizado para inducir tumores colorrectales asociados a la colitis. La activación de LysM-CreERT2 se indujo mediante una dieta con tamoxifeno cuando los tumores se habían desarrollado y continuó durante 40-50 días. El tamoxifeno también se administró a los ratones Egfrfl/fl de control. Análisis de la carga tumoral en los respectivos ratones AOM/DSS tratados: B. Área tumoral y C. número tumoral después de la deleción de Egfr en las células mieloides de tumores establecidos en ratones EgfrΔMyl-ER (n = 13 y n = 12) en comparación con los ratones Egfrfl/fl de control (n = 17), ratones EgfrΔMyl (n = 16), que carecen constitutivamente de Egfr en las células mieloides, y sus controles (Egfrfl/fl, n = 16). D. Área tumoral y E. número tumoral en ratones que carecen de Egfr en las células dendríticas (EgfrΔCd11c, n = 13) y controles (Egfrfl/fl, n = 13). F. Cuantificación de granulocitos, macrófagos F4/80hi, células mieloides F4/80lo, monocitos y cDC1 entre las células vivas en tumores AOM/DSS EgfrΔMyl (n = 13) y Egfrfl/fl (n = 11) utilizando citometría de flujo. G. Tinción de inmunofluorescencia multiplex representativa de tumores Egfrfl/fl y EgfrΔMyl-ER. El panel de tinción incluyó anticuerpos contra MPO, F4/80 y CD11c. Se utilizó DAPI para la detección de núcleos. Los círculos y las líneas indican qué área se muestra ampliada. Ampliación: x1, x5, x20. Barras de escala: 1 mm, 500 µm, 100 µm. H. Cuantificación de las células MPO-, F4/80- y CD11c-positivas dentro de los tumores AOM/DSS (Egfrfl/fl, n = 4; EgfrΔMyl-ER, n = 5). Todos los datos se representan como media ± SEM, con cada punto de datos representando un ratón. B-F. Se muestran datos de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de Student no pareada *P < 0,05, **P < 0,01.

Para determinar las poblaciones de células mieloides en las que se elimina EGFR, evaluamos la eficiencia de la recombinación en los tumores AOM/DSS de ratones con el reportero LysM-Cre x LSL-YFP ^[16]. La expresión de YFP, y por lo tanto la recombinación, fue mayor en los granulocitos, seguida de los macrófagos, los monocitos y las células dendríticas (CD) (Fig. S1C, D). La reducción de la expresión de Egfr se confirmó en los granulocitos y los macrófagos clasificados de los tumores AOM/DSS (Fig. S1E). Además, pudimos detectar niveles reducidos de proteína EGFR en macrófagos peritoneales cultivados de ratones AOM/DSS tratados con EgfrΔMyl (Fig. S1F y Material Suplementario 1B). Estos resultados indican que Egfr se elimina eficazmente en varias poblaciones mieloides, incluidos los granulocitos y los macrófagos de los tumores EgfrΔMyl.

Para excluir que la deleción de EGFR en las CD sea responsable de la reducción del crecimiento tumoral, cruzamos ratones Egfrfl/fl con ratones CD11c-Cre (EgfrΔCd11c) y analizamos la carga tumoral inducida por AOM/DSS. La recombinación de Egfr se confirmó en las CD esplénicas, junto con la ausencia de expresión de Egfr (Fig. S1G y Material Suplementario 1C). Sin embargo, no se detectaron diferencias en el área tumoral o el número (Fig. 1D, E), lo que excluye que la deleción de EGFR en las CD sea responsable del menor desarrollo del CCR.

A continuación, investigamos si la deleción de EGFR afecta a los infiltrados mieloides en los tumores AOM/DSS. La citometría de flujo de los tumores EgfrΔMyl mostró que el número de macrófagos F4/80hi y monocitos se redujo, mientras que no se observaron diferencias cuantitativas en los granulocitos, las células mieloides F4/80lo o las poblaciones de CD1 convencionales (cDC1) (Fig. 1F). La reducción de la infiltración de macrófagos se confirmó además tras la deleción específica de EGFR en las células mieloides en tumores ya establecidos utilizando el modelo inducible EgfrΔMyl-ER, según se determinó mediante la inmunofluorescencia multiplex en secciones de tumores AOM/DSS (Fig. 1G, H). Por lo tanto, concluimos que la deleción de EGFR en las células mieloides reduce el número de macrófagos y monocitos en el MET del CCR.

La transcriptómica de célula única revela un MET del CCR alterado tras la deleción de EGFR en las células mieloides
Para dilucidar cómo la expresión de EGFR en las células mieloides afecta al MET global del CCR, clasificamos las células CD45-negativas (CD45-) y CD45-positivas (CD45+) de los tumores colorrectales inducidos por AOM/DSS agrupados de tres ratones Egfrfl/fl y tres ratones EgfrΔMyl y realizamos una secuenciación de ARN de célula única 10x (scRNAseq) (Fig. S2A). Después del control de calidad y el filtrado, obtuvimos 8.284 células de los tumores Egfrfl/fl y 4.758 células de los tumores EgfrΔMyl (Fig. S2B). Para definir las poblaciones principales de estos tumores, combinamos los cuatro conjuntos de datos resultantes, realizamos una agrupación basada en gráficos y anotamos cada grupo en función de la expresión de genes marcadores canónicos (Fig. S2C-E y Tabla S1). Para garantizar que la agrupación no supervisada capture la identidad celular intrínseca y el estado transcripcional en lugar de las diferencias en la proliferación, se aplicó la regresión del ciclo celular antes de la reducción de la dimensionalidad y la agrupación. Este paso minimizó la variación en la expresión génica atribuible a la fase del ciclo celular. Después de la regresión del ciclo celular, las células se clasificaron en 22 grupos (Fig. 2A). Detectamos un gran número de células mieloides, incluidos neutrófilos que expresan Csf3r (Grupo 0, 13), poblaciones monócitas y de macrófagos marcadas por Fcgr1 (Grupo 1, 3), así como células dendríticas (CD) definidas por la expresión de Flt3 (Grupo 8, 12, 17) y un pequeño grupo de mastocitos que expresan Mcpt (Grupo 16). Los macrófagos F4/80hi (Adgre1hi) se definieron por la expresión de C1qc (Grupo 1), mientras que la alta expresión de Spp1 y Vegfa caracterizó una población mixta de macrófagos y monocitos (Grupo 3) ^[17]. Los linfocitos se identificaron como células B por Cd79a (Grupo 2, 19), células plasmáticas que expresan Jchain (Grupo 10) y células T positivas para Tcrb y Cd3e (Grupo 5, 6, 7, 11, 18). Entre las células CD45-, detectamos células epiteliales Epcam+ (Grupo 4, 14, 15), fibroblastos Col3a1+ (Grupo 20) y un grupo proliferativo mixto que expresa altos niveles de Mki67 y Top2a (Grupo 9) (Fig. 2A y S2D, E). Fig. 2: La transcriptómica de una sola célula revela un microambiente tumoral de cáncer colorrectal alterado tras la deleción de EGFR en células mieloides. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo. Un diagrama UMAP de células inmunitarias y no inmunitarias (n = 13.042 células en total) de tumores de colon clasificados de ratones AOM/DSS tratados, Egfrfl/fl (n = 3) y EgfrΔMyl (n = 3), que muestra 22 grupos de células (secuenciación de ARN de una sola célula 10x). Cada grupo se representa mediante un color diferente. B Gráfico de barras que muestra la distribución relativa (%) de los principales tipos de células en tumores AOM/DSS Egfrfl/fl (gris) y EgfrΔMyl (rojo). C Diagrama UMAP de las puntuaciones de actividad de la vía EGFR analizadas por PROGENy entre diferentes grupos de tumores de colon AOM/DSS en un fondo combinado. El rojo indica una alta expresión y el azul, una baja expresión. D Diagramas de violín que muestran la actividad de la vía EGFR en diferentes poblaciones celulares de tumores de cáncer colorrectal humano (secuenciación de ARN de una sola célula 10x) evaluada por PROGENy. La deleción de EGFR en células mieloides resultó en alteraciones cuantitativas en las poblaciones dentro del microambiente tumoral (MET) de los tumores AOM/DSS (Fig. 2A, B). Los tumores EgfrΔMyl mostraron una reducción en el número de granulocitos y macrófagos en comparación con Egfrfl/fl. En contraste, el número de células T y B aumentó, lo que indica un efecto adicional en el compartimento linfoide de esos tumores (Fig. 2B y Tabla S2). El ARNm de Egfr se detectó solo en unas pocas células, principalmente en células epiteliales y fibroblastos, donde se sabe que la expresión es alta (datos no mostrados). Esto no es sorprendente, ya que la cobertura promedio para genes individuales de la secuenciación de ARN de una sola célula utilizando la plataforma 10x puede ser baja ^[17]. Por lo tanto, para evaluar la actividad de EGFR en las poblaciones celulares de los tumores de cáncer colorrectal, analizamos datos de una sola célula de tumores AOM/DSS y CRC humanos utilizando PROGENy, un algoritmo que estima la actividad de las vías de señalización relevantes basándose en firmas génicas consensuadas obtenidas de experimentos de perturbación ^[18]. Además de las células epiteliales, la actividad de EGFR fue mayor en los neutrófilos que expresan altos niveles de S100a9, así como en el grupo de macrófagos/monocitos Spp1+ de los tumores AOM/DSS (Fig. 2C). A continuación, comprobamos la relevancia de nuestros hallazgos en el MET de CRC humano analizando una cohorte de CRC publicada perfilada utilizando la misma tecnología ^[19]. En línea con nuestras observaciones en ratones, los grupos de macrófagos inflamatorios y Spp1+ mostraron las puntuaciones de actividad de EGFR más altas (entre todos los subconjuntos inmunitarios), también en los datos de CRC humano reanalizados (Fig. 2D). En conjunto, nuestros datos indican que la deleción de EGFR en células mieloides conduce a un cambio en el infiltrado inmunitario de los tumores AOM/DSS, caracterizado por una reducción en el número de granulocitos y macrófagos y un aumento en el número de células T. Además, la actividad de EGFR parece ser mayor en los macrófagos Spp1+ tanto en ratones como en humanos con CRC, lo que sugiere un papel específico de la señalización de EGFR en esta subpoblación de macrófagos. Señalización alterada en células mieloides que carecen de EGFR Para investigar el impacto de la expresión de EGFR en la señalización de las células mieloides y su función relacionada en la promoción del tumor, subagrupamos las poblaciones de células mieloides para aumentar la especificidad del subconjunto y caracterizar en profundidad los patrones de expresión de ARN diferenciales. La clasificación de los grupos específicos de mieloides se basó en publicaciones anteriores [17, 20]. Identificamos dos grupos principales de macrófagos, un grupo C1qc marcado por la alta expresión de Adgre1 (F4/80, Grupo 0) y uno que expresa Spp1 y Vegfa (Grupo 2) (Fig. 3A, B y Tabla S3). Se ha demostrado previamente que ambos tipos de macrófagos apoyan el crecimiento tumoral [11, 12, 19, 21]. Los neutrófilos se subagruparon en cuatro subconjuntos caracterizados por los genes inflamatorios S100a8 y S100a9, Tnf, Hmox1 y Mmp8, respectivamente (Grupo 1, 3, 7, 11). Además, identificamos monocitos Chil3 (Grupo 5) y tres grupos de CD, cDC1 marcado por la expresión de Cst3, células dendríticas reguladoras mieloides migratorias (mDC3) caracterizadas por la expresión de CD200, así como Fscn1 [22, 23] y células dendríticas plasmocitoides (pDC) que expresan Siglech ^[24] (Grupo 4, 6, 8). La mayoría de las células cDC2 que expresan Zbtb46 y Sirpa se agruparon con las mDC (datos no mostrados). Los tumores AOM/DSS también contenían un número muy bajo de células similares a mastocitos y basófilos (Grupo 9, 10) (Fig. 3A, B y S2D, E). Aunque el número total de células mieloides se redujo en los tumores EgfrΔMyl, no observamos diferencias en los porcentajes relativos entre los grupos correspondientes (Fig. 2B y 3C y Tabla S2). Fig. 3: La falta de EGFR en las células mieloides altera la señalización en las células mieloides. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo. A Un diagrama UMAP de la composición de las células mieloides, coloreado por grupos, en tumores Egfrfl/fl y EgfrΔMyl (secuenciación de ARN de una sola célula 10x). B Diagrama de puntos de los genes expresados diferencialmente en la parte superior por grupo. La intensidad del color refleja la fuerza de la expresión, y el tamaño del punto indica el porcentaje de células que expresan los genes en cada grupo. C Gráfico de barras que muestra la distribución relativa (%) de los subconjuntos de mieloides entre los tumores AOM/DSS Egfrfl/fl (gris) y EgfrΔMyl (rojo). D Mapa de calor de las vías y los procesos biológicos relacionados con EGFR enriquecidos de forma diferencial en los grupos de mieloides EgfrΔMyl frente a Egfrfl/fl, analizado por GSVA. La significación se evaluó utilizando estadísticas t moderadas bayesianas empíricas ajustadas con Benjamini-Hochberg. *Padj < 0,05, Padj < 0,01, *Padj < 0,001. E Análisis de PROGENy de las vías de señalización descendentes de EGFR PI3K y JAK/STAT. Prueba de rango de Wilcoxon *P < 0,05, *P < 0,001, **P < 0,0001. Vías y procesos biológicos diferenciales enriquecidos en EgfrΔMyl y Egfrfl/fl F macrófagos C1qc y G macrófagos Spp1 por GSVA (Padj < 0,05). H, I Genes expresados diferencialmente en EgfrΔMyl frente a Egfrfl/fl. H macrófagos C1qc e I macrófagos Spp1, utilizando limma con valores P ajustados de Benjamini-Hochberg (Padj < 0,05). Dado que no pudimos detectar directamente el ARNm de Egfr en las células mieloides, realizamos un análisis de variación de conjuntos de genes (GSVA) en los grupos de células EgfrΔMyl frente a Egfrfl/fl para cuantificar las diferencias en las vías de señalización relacionadas con EGFR (Fig. 3D). Curiosamente, estas se redujeron más en ambos grupos de CD, seguidas de los macrófagos Spp1+ y C1qc+. Esto fue inesperado, ya que nuestros datos demostraron que la recombinación mediada por LysM-Cre de Egfr se produce principalmente en los granulocitos (Fig. S1D). En contraste, los granulocitos neutrofílicos, especialmente aquellos que expresan Hmox1, mostraron una regulación al alza de las vías asociadas con EGFR, posiblemente debido a mecanismos de compensación activados (Fig. 3D). Las vías de señalización aguas abajo de EGFR incluyen ERK/MAPK, PI3K/AKT y JAK/STAT. Para investigar qué vías podrían estar alteradas entre las células mieloides deficientes en EGFR, utilizamos PROGENy (Tabla S4). Los resultados confirmaron la alteración de la señalización de EGFR en los neutrófilos S100a9 y las CD migratorias (Fig. S3A). Sin embargo, la firma de PI3K disminuyó en todos los subconjuntos de macrófagos, neutrófilos y CD, excluyendo los monocitos, los neutrófilos Hmox1 y las pDC (Fig. 3E). Además, la actividad de JAK/STAT se redujo en los macrófagos, monocitos y cDC1 de los tumores EgfrΔMyl, mientras que aumentó o no cambió en los granulocitos (Fig. 3E). Además, GSVA reveló una fuerte reducción de las vías relacionadas con la inflamación, como el interferón γ (IFNγ), IL6, IL12 y la señalización del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) en ambos grupos de macrófagos. Las vías de IFNγ e IL6 también se atenuaron en los monocitos. Los macrófagos C1qc+ también mostraron una reducción de la vía de IL1. Es importante destacar que las vías relacionadas con la migración y la proliferación, como el huso mitótico y el punto de control G2M, se redujeron en ambos grupos de macrófagos, lo que posiblemente contribuye a la reducción del número que observamos en los tumores EgfrΔMyl. En contraste, las vías relacionadas con el anabolismo lipídico, PPARα, ROS y el metabolismo del glutatión se regularon al alza en los macrófagos EgfrΔMyl, lo que sugiere una alta actividad metabólica en los macrófagos C1qc+ y Spp1+ (Fig. 3F, G y S3B). Curiosamente, los monocitos que expresan Chil3 mostraron un aumento en la expresión de los genes que regulan la actividad fagocítica y los genes que interfieren con la migración de las células epiteliales, lo que posiblemente contrarresta el potencial invasivo de las células de CRC (Fig. S3B). Por lo tanto, concluimos que la deleción de EGFR en las células mieloides conduce a distintos efectos en subpoblaciones específicas de células mieloides en los tumores AOM/DSS al alterar la actividad de las vías de señalización implicadas en la inflamación, la proliferación, la migración y la supervivencia. Los macrófagos C1qc de los tumores EgfrΔMyl también mostraron una reducción significativa de los genes que codifican las citocinas inflamatorias Il1a e Il1b, las quimiocinas Cxcl2 y Cxcl3, las proteínas de unión al calcio S100a8 y S100a9 y Thbs1, que codifica la trombospondina-1. Es importante destacar que los genes que se han relacionado con fenotipos supresores en las células mieloides, como Cd274 (que codifica PDL1), también se redujeron (Fig. 3H). Los macrófagos Spp1+ demostraron una reducción del gen coestimulador Cd86 y el gen del receptor de eliminación Msr1 (Fig. 3I). Curiosamente, tanto en los monocitos como en los macrófagos C1qc+ y Spp1+, la expresión del receptor de quimiocinas Ccr1, que se sabe que está implicado en el reclutamiento celular, se redujo (Fig. 3H, I y S3C). En ambas poblaciones de macrófagos, observamos una reducción de la expresión del gen del punto de control Lilrb4a y una reducción de los genes de la vía JAK/STAT, como Stat1 en C1qc+ y Jak2 y Tnaip3 en los macrófagos Spp1+ (Fig. 3H, I y Tabla S5). De manera similar, los monocitos mostraron una reducción de los genes activados por IFN (Fig. S3C). En contraste, el gen que codifica la citocina inflamatoria Mif se expresó a niveles más altos en los macrófagos C1qc+ y Spp1+, mientras que Cxcr4 se reguló al alza en los macrófagos Spp1+ y los monocitos (Fig. 3H, I y S3C). MIF y CXCR4 pueden formar complejos que promueven el reclutamiento de leucocitos ^[25]. En conjunto, nuestros datos muestran que la deleción de Egfr en las células mieloides conduce a la reducción de la señalización de PI3K y JAK/STAT y a la alteración de procesos clave relacionados con la inflamación, la migración y la proliferación en los macrófagos C1qc+ y Spp1+. Dado que la actividad de EGFR es más fuerte en los macrófagos Spp1+ (Fig. 2C), esto indica que la falta de EGFR en los macrófagos Spp1+ puede causar efectos autónomos a nivel celular, mientras que la expresión génica alterada que observamos en los macrófagos C1qc+ puede estar mediada también por factores extracelulares. La deleción de EGFR en las células mieloides reduce la inmunosupresión en el CRC Entre las diferencias más destacadas que observamos entre los tumores Egfrfl/fl y EgfrΔMyl fue un cambio en la abundancia de las subpoblaciones de células T (Fig. 2A, B). La infiltración de células T en el tejido tumoral y su fenotipo son parámetros pronósticos importantes para el resultado y la respuesta terapéutica del CRC humano [15, 26]. Por lo tanto, caracterizamos las diferencias dentro del compartimento de células T de los tumores EgfrΔMyl. Para lograr una separación más rigurosa, empleamos un enfoque de subagrupación selectiva centrado en los genes expresados por diferentes poblaciones de linfocitos T [27, 28]. Utilizando esta estrategia, pudimos identificar 9 subgrupos diferentes (Figs. 4A, B y S4A; Tabla S6): poblaciones de células T CD4 (Grupo 0, 1, 2, 4), tres poblaciones de células T CD8 (Grupo 3, 5, 6) y dos grupos que contienen linfocitos innatos (Grupo 7, 8). Fig. 4: La deleción de EGFR en células mieloides reduce la inmunosupresión en el CCRC. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo. A. Mapa UMAP que muestra la composición de las células T/NK/ILC en el análisis de ARNsc 10x de tumores AOM/DSS Egfrfl/fl y EgfrΔMyl, codificado por grupos. B. Gráfico de puntos de los genes con mayor expresión diferencial en cada grupo. La intensidad del color representa el nivel de expresión, y el tamaño del punto indica el porcentaje de células que expresan los genes dentro de cada grupo. C. Distribución relativa (%) de los subgrupos de células T/NK/ILC en tumores AOM/DSS Egfrfl/fl (gris) y EgfrΔMyl (rojo). D. Cuantificación de las células T CD4+ y CD8+ entre las células vivas, y Foxp3+ CTLA4+ entre las células CD4+ en tumores AOM/DSS (Egfrfl/fl, n = 4; EgfrΔMyl, n = 5) utilizando citometría de flujo, prueba t de Student no pareada *P < 0,05. Los datos se representan como media ± SEM, y cada punto de datos representa un ratón. Gráficos de dispersión que muestran la expresión génica diferencial de las células T CD4 y CD8 totales, y las células T reguladoras (Tregs) en tumores EgfrΔMyl frente a Egfrfl/fl, utilizando limma con valores de P ajustados por Benjamini-Hochberg (Padj < 0,05). Las Tregs representaron el grupo más prominente entre las células T y mostraron altos niveles de expresión de Foxp3 y Ctla4, y su número se redujo significativamente en ratones que carecían de EGFR en las células mieloides (Fig. 4C). Las células de memoria (Grupo 2) que expresan Tnfsf8 y Cd40lg también se redujeron en los tumores EgfrΔMyl, mientras que las células de tipo ingenuo (Grupo 1, 3) marcadas por Lef1 y Sell aumentaron (Fig. 4C). Es importante destacar que las células T CD8 agotadas (Grupo 6) que expresan Klrd1 y Pdcd1 se detectaron con una frecuencia menor en los tumores EgfrΔMyl, lo que indica un entorno inmunostimulante (Fig. 4C). El análisis de citometría de flujo de tumores AOM/DSS independientes nos permitió confirmar la reducción de las Tregs entre las células T CD4 en los tumores EgfrΔMyl. En contraste, los números relativos de células T de tipo ingenuo o de memoria no cambiaron (Figs. 4D y S4B, C). El análisis de la expresión génica diferencial de las células T CD4 y CD8 en los tumores EgfrΔMyl reveló una reducción en los marcadores relacionados con el agotamiento, como Ctla4, Pdcd1 y Lilrb4 en las células T CD4 y CD8 (Fig. 4E, F y Tabla S7). Las células T CD8 también mostraron una expresión reducida de los genes de los puntos de control inmunitario Havcr2 y Gzmk (Fig. 4F). Además, Ifngr1 y Ccl5 se regularon a la baja en ambas poblaciones de células T, mientras que los marcadores asociados con un fenotipo de células T de tipo ingenuo o residentes en el tejido, como Sell, Tcf7 y Lef1, se regularon al alza (Fig. 4E, F). Los genes expresados diferencialmente en las Tregs incluyeron Pcsk1, Areg y Lilrb4, que se han descrito en las Tregs activadas (Fig. 4G).

En conclusión, nuestros datos indican que la deleción de EGFR en las células mieloides conduce a un cambio en el fenotipo de las células T que infiltran los tumores AOM/DSS hacia un entorno menos supresor, reflejado por una reducción en el número de células Tregs y menos células T CD8 agotadas.

Las redes de comunicación célula a célula predichas se alteran entre las células mieloides y las células T en el CCRC de ratones EgfrΔMyl.

Habiendo observado una alteración de la señalización de quimiocinas y citocinas en las células mieloides deficientes en EGFR, a continuación, nuestro objetivo fue analizar más a fondo el conjunto de datos de ARNsc generado para inferir cómo se comunican las células en el microambiente tumoral colorrectal (TME). Por lo tanto, aplicamos CellChat para predecir computacionalmente las posibles redes de comunicación intercelular ^[29]. Inicialmente, especificamos las interacciones y vías predichas más prominentes dentro de los tumores AOM/DSS, basándonos en las probabilidades calculadas más altas. Las vías de alto rango incluyeron moléculas coestimuladoras (PDL1, CD80, CD86), quimiocinas y vías de interacción celular (NECTIN, CD226), que se regularon a la baja en los tumores EgfrΔMyl. En contraste, las vías MHC-I, CD23 y relacionadas con ICOS se enriquecieron en los tumores EgfrΔMyl (Fig. S5A). Además, las señales que se originan en las células mieloides se dirigieron predominantemente hacia las células T y fueron las más abundantes dentro de los tumores Egfrfl/fl (Fig. 5A). Los pares ligando-receptor, como THBS1-CD47, H2AA/AB1-CD4, CCL6-CCR2 y CD80/86-CTLA4, mostraron las puntuaciones de probabilidad más altas en los tumores Egfrfl/fl (Figs. 5B y S5B). Los cambios predichos en las interacciones tras la deleción de EGFR en las células mieloides sugirieron una alteración de la comunicación cruzada con las células T, lo que se refleja en las diferencias en las probabilidades de varios pares ligando-receptor. Específicamente, las interacciones que incluyen CCL6-CCR2, CXCL16-CXCR6, THBS1-CD47, CD274-PDCD1 y CD80/86-CTLA4 mostraron una probabilidad reducida, mientras que la probabilidad de la interacción H2-K1/D1-CD8B1 de las células T aumentó en los tumores EgfrΔMyl (Fig. 5B). Fig. 5: Interacciones celulares alteradas entre las células mieloides y las células T en los tumores de ratón CCRC EgfrΔMyl. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo. A. Interacciones ligando-receptor predichas entre los grupos de células tumorales, mieloides, T y otras en los tumores Egfrfl/fl calculadas por CellChat. B. Las 212 probabilidades de interacción superiores se calcularon mediante CellChat, y cada probabilidad mostrada fue significativa (Padj < 0,05). Las puntuaciones de interacción de célula mieloide a célula T se muestran en orden descendente de diferencia de probabilidad de Egfrfl/fl a EgfrΔMyl. Los pares ligando-receptor en negrita están en línea con los resultados de iTalk (Fig. S5C, Supl.). C-E. Análisis basado en iTalk de la predicción de ganancia (rojo) y/o pérdida (azul, marrón o púrpura) de las interacciones ligando-receptor entre los grupos de células mieloides y células T en los tumores EgfrΔMyl frente a los tumores Egfrfl/fl. Las líneas sólidas marcan los cambios significativos para el ligando, y las líneas discontinuas indican que no hay cambios significativos para el ligando. Una flecha marca los cambios significativos para el receptor, y una elipse indica que no hay cambios significativos para el receptor. El ancho de la línea y del esquema indica los niveles de expresión relativos. Las puntuaciones de fuerza representan el producto de los cambios de plegamiento del ligando y el receptor; se muestran las 50 puntuaciones de interacción superiores (Padj < 0,05). Los gráficos de Circos muestran las 50 interacciones ligando-receptor predichas superiores para C. Punto de control, D. Citocinas y E. Otros. El esquema explicativo en E se adapta de Wang et al., 2019.

Para caracterizar aún más las interacciones de las células mieloides y las células T en los tumores Egfrfl/fl y EgfrΔMyl, aplicamos un enfoque computacional ortogonal, iTalk ^[30]. De manera similar a CellChat, iTalk identificó interacciones ligando-receptor alteradas relacionadas con la regulación del punto de control y las citocinas (Fig. S5C). De manera notable, se predijo una disminución en la interacción CD274-PDCD1, en línea con la regulación a la baja del ligando CD274 en los macrófagos C1qc+, cDC1 y los granulocitos S100a9, así como con la expresión reducida del receptor PDCD1 en las células T (Fig. 5C y Tabla S8). Es importante destacar que la interacción CD86-CTLA4 también se redujo debido a la disponibilidad reducida del ligando CD86 en los monocitos/macrófagos Spp1+ y las células dendríticas, y CTLA4 que se origina en las células T. Además, las interacciones de las células T CD4 a través de ICOS también se encontraron reguladas a la baja. Las redes relacionadas con las citocinas también se vieron afectadas, con una pérdida predicha de los pares ligando-receptor IL1A/B-IL1R2/IL1RN entre diferentes grupos de células mieloides y células T. Específicamente, las señales relacionadas con IL1 que se originan en los granulocitos, los macrófagos y las células dendríticas dirigidas a las células T CD4 se regularon a la baja de manera significativa (Fig. 5D). Otras interacciones que se regularon a la baja dentro del TME de EgfrΔMyl incluyeron los pares THBS1-ITGB1/ITGA4, con una probabilidad de ligando THBS1 significativamente menor de las células mieloides a los subconjuntos de células T (Fig. 5E y Tabla S8). Se identificó computacionalmente una pérdida significativa de una interacción THBS1-CD47 entre los macrófagos C1qc+ que expresan THBS1 y las células T CD4, CD8 y reguladoras que expresan CD47 (valor de Padj = 0,01; Tabla S8).

En conjunto, nuestros datos sugieren una posible disminución de la comunicación cruzada entre las células mieloides y las células T en los tumores AOM/DSS de los ratones EgfrΔMyl, que involucra pares ligando-receptor de puntos de control inmunitario y citocinas.

La integración de datos proteómicos con la transcriptómica de células individuales de las células mieloides revela objetivos comunes en los macrófagos.

A continuación, buscamos investigar si los cambios observados a nivel de ARN se traducen en alteraciones en la expresión de proteínas. Dado que el número de células mieloides clasificadas obtenidas de los tumores murinos AOM/DSS no es suficiente para los análisis de inmunoblot, clasificamos los granulocitos, los macrófagos y las poblaciones mononucleares de los tumores Egfrfl/fl y EgfrΔMyl y realizamos una espectrometría de masas de nanoflujo.

Después de la cuantificación y la normalización, pudimos identificar un promedio de 4000 a 5000 proteínas distintas por muestra (Fig. S6A). Una comparación de las dos réplicas biológicas dentro de cada población celular reveló solo pequeñas variaciones (Fig. S6B). El análisis de la expresión diferencial de proteínas reveló alteraciones en todas las diferentes poblaciones celulares entre los dos genotipos (Fig. S6C). Los macrófagos F4/80+ de los tumores EgfrΔMyl exhibieron una reducción de las proteínas trombospondina THBS1 y THBS4, así como de los miembros de la señalización de la insulina y la maquinaria de coagulación ^[31]. Además, observamos una regulación al alza de las proteínas involucradas en la captación y el procesamiento de antígenos, como LAMP2, ITGAM y PSME1 (Fig. 6A y Tabla S9). Comparamos los genes expresados diferencialmente por scRNAseq con las proteínas correspondientes en los tumores EgfrΔMyl frente a los tumores Egfrfl/fl. Entre las diferentes poblaciones de células mieloides clasificadas, los macrófagos mostraron la mayoría de los objetivos comunes (Figs. 6B y S6D; Tabla S9). Fig. 6: Análisis proteómico de las células mieloides y comparación con scRNAseq revela objetivos comunes en los macrófagos. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen a tamaño completo. A. Gráfico de dispersión de las proteínas expresadas diferencialmente detectadas mediante espectrometría de masas de nanoflujo de los macrófagos clasificados por FACS de los tumores EgfrΔMyl y Egfrfl/fl (Egfrfl/fl, n = 2; EgfrΔMyl, n = 2, P < 0,1). B. Gráfico de correlación de los genes regulados al alza y a la baja (scRNAseq, Padj < 0,05) y las proteínas (proteómica, P < 0,1) de los macrófagos EgfrΔMyl frente a los macrófagos Egfrfl/fl aislados de los tumores AOM/DSS. C. Co-inmunotinción para F4/80, THBS1 y EGFR en los tumores AOM/DSS Egfrfl/fl y EgfrΔMyl-ER. Las flechas indican las células triple positivas. Es importante destacar que Thbs1 y Plek se regularon a la baja tanto a nivel de ARN como de proteínas en los tumores EgfrΔMyl (Fig. 6B). Se ha demostrado que ambas proteínas son importantes en los macrófagos activados [32, 33]. En línea con este hallazgo, pudimos detectar además la coexpresión de EGFR y THBS1 en los macrófagos asociados al tumor, lo que confirma la presencia de estas células en el TME del CCRC murino (Fig. 6C).

Es interesante destacar que la diferencia relativa entre las muestras EgfrΔMyl y Egfrfl/fl fue más pronunciada a nivel de proteínas que a nivel de ARN, lo que sugiere mecanismos postranscripcionales adicionales que controlan los patrones de expresión de esas proteínas. Las moléculas reguladas al alza de forma mutua incluyeron Mif, que se ha asociado con la colitis y los macrófagos asociados al tumor ^[25], y Bax, que se ha relacionado con la inducción de la apoptosis, lo que posiblemente explique la reducción del número de macrófagos en los tumores EgfrΔMyl (Figs. 6B y 1F) ^[34]. En contraste, los granulocitos y los monocitos demostraron una correlación limitada entre la expresión de ARN y proteínas, lo que sugiere que estas poblaciones exhiben una alta plasticidad y cambios rápidos dentro del TME (Fig. S6D). Basándonos en nuestros hallazgos, concluimos que la señalización de EGFR en las poblaciones de células mieloides influye tanto en su transcriptoma como en su proteoma en los tumores AOM/DSS. Además, una comparación de los cambios transcripcionales y traslacionales indica que los macrófagos se ven afectados por la deleción de Egfr, lo que destaca a THBS1 como un posible objetivo que influye en las poblaciones celulares circundantes.

La vía de EGFR está activa en las células mieloides inflamatorias y SPP1+ en el CCRC humano.

Habiendo definido el papel de EGFR en las distintas poblaciones de células mieloides y su influencia en sus interacciones con las células T dentro del TME, a continuación, buscamos determinar la relevancia de nuestros hallazgos en el CCRC humano. Utilizando el conjunto de datos de scRNAseq del CCRC humano descrito por Lee et al. ^[19], primero aplicamos PROGENy para evaluar la actividad de la vía de EGFR en las diferentes poblaciones celulares. Entre las poblaciones de células mieloides, detectamos una alta actividad en los grupos de macrófagos inflamatorios y SPP1+ (Figuras 2D y 7A). A continuación, estratificamos las células dentro de los grupos de macrófagos humanos en función de una alta o baja actividad de la vía de EGFR (EGFRhigh o EGFRlow). Para validar los genes expresados diferencialmente obtenidos de nuestros grupos de macrófagos murinos EgfrΔMyl frente a Egfrfl/fl, los comparamos con los genes expresados diferencialmente en macrófagos humanos EGFRlow frente a EGFRhigh. En línea con los resultados obtenidos de los macrófagos murinos de tumores AOM/DSS, los genes que incluyen IL1A, IL1B, IL6, CXCL2, THBS1 y S100A8/9 se redujeron en los macrófagos inflamatorios EGFRlow (Figura 7B y Tabla S10). Los macrófagos humanos SPP1+ con actividad EGFRlow también mostraron una reducción de los genes ortólogos identificados en los datos del ratón, incluidos IL1A, IL1B, CXCL2 y PLEK (Figura 7C y Tabla S10). Curiosamente, los genes que codifican los ligandos de EGFR, como AREG y EREG, también se redujeron significativamente en ambos grupos de macrófagos EGFRlow, lo que indica posibles bucles autocrinos y paracrinos relacionados con la señalización de EGFR en estas células (Figuras 7B y 7C). Estos hallazgos demuestran una amplia similitud entre los genes afectados en las células mieloides del ratón y del CRC humano. Figura 7: La vía de EGFR está activa en las células mieloides proinflamatorias y SPP1+ en el CRC humano. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen de tamaño completo. Un mapa UMAP que muestra la actividad de la vía de EGFR en los grupos de células mieloides del CRC humano, detectada mediante scRNAseq y PROGENy. Gráficos de dispersión de la expresión génica diferencial de EGFRlow frente a EGFRhigh en función de las puntuaciones calculadas por PROGENy en B, grupos de macrófagos inflamatorios y C, grupos de macrófagos SPP1+. La codificación por colores indica los genes que se alteran significativamente (Padj < 0,05). D Gráficos de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia global (OS) asociada con la expresión de EGFR y/o THBS1 en tumores de CRC humano. Gráficos de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia global asociada con la expresión de EGFR y la firma de células mieloides (Sig) para E, macrófagos C1qc+ y F, macrófagos Spp1+. Los resultados clínicos asociados con la expresión de EGFR, las firmas de células mieloides (Sig) y THBS1 para G, macrófagos C1qc+ y H, macrófagos Spp1+. Se utilizó la prueba de log-rank para evaluar la significación en los gráficos de supervivencia. Aprovechar los datos de scRNAseq disponibles de cohortes de CRC humanas de tamaño muy limitado para predecir los resultados de supervivencia representa un gran desafío. Para superar esta limitación, analizamos un conjunto de datos de acceso público de 516 pacientes, que consiste principalmente en muestras de CRC en estadio II y III (Tabla S11) ^[35]. Primero, estos pacientes se estratificaron en grupos de alta o baja expresión de EGFR. El análisis de supervivencia mostró entonces que la alta expresión de EGFR no tuvo un impacto significativo en el resultado en comparación con la baja expresión de EGFR (Figura 7D) (P = 0,1, prueba de log-rank). THBS1, que identificamos como un indicador sólido de la actividad de EGFR en las células mieloides en los conjuntos de datos del ratón y del ser humano (Figuras 3H, 6B y 7B), mostró en cambio un valor pronóstico significativo. La alta expresión de THBS1 se asoció con un peor resultado de supervivencia (Figura 7D) (P = 0,0014, prueba de log-rank). Un análisis combinado de EGFR y THBS1 reveló un efecto sinérgico para solo unos pocos pacientes, y los pacientes con alta expresión de ambos genes mostraron resultados ligeramente peores (Figura 7D) (P = 0,0014, prueba de log-rank). A continuación, nuestro objetivo fue probar si las firmas de los subconjuntos de macrófagos o granulocitos que identificamos en nuestro modelo murino tienen valor pronóstico para la supervivencia global en los pacientes con CRC. Por lo tanto, utilizamos los principales marcadores que impulsan los grupos de C1qc+, macrófagos Spp1+ y los de los neutrófilos S100a9+. Los genes de la firma C1qc+ mostraron la correlación más fuerte en los datos de CRC humanos (Figura S7A). Luego, realizamos GSVA para estratificar a los pacientes con CRC en un grupo de alta (Sighigh) y un grupo de baja (Siglow) expresión. La expresión elevada de las tres firmas de células mieloides se correlacionó con peores resultados de supervivencia, lo que indica que el enriquecimiento de estas poblaciones de células mieloides en el CRC humano primario se asocia con un peor pronóstico (Figuras 7E, 7F y S7B) (P < 0,021, prueba de log-rank). La baja expresión de EGFR se sinergizó con una baja expresión de las firmas de macrófagos C1qc+, Spp1+ o neutrófilos S100a9+, al tiempo que exhibía la probabilidad de supervivencia global más alta para los pacientes con CRC (Figuras 7E, 7F y S7B) (P < 0,0051, prueba de log-rank). Sin embargo, la alta coexpresión de EGFR y las firmas de células mieloides no se correlacionó con peores resultados de supervivencia en comparación con las firmas de células mieloides solas (Figuras 7E, 7F y S7B). Para evaluar aún más los posibles efectos sinérgicos de EGFR, THBS1 y las firmas de células mieloides, integramos THBS1 en las respectivas firmas y luego reevaluamos la supervivencia dentro de estos subgrupos. La expresión concomitante alta de THBS1, EGFR y las firmas de macrófagos C1qc+ y Spp1+ mostró una ligera influencia negativa en los resultados de supervivencia de los pacientes con CRC (Figura 7G y 7H). Sin embargo, no se observó la misma tendencia negativa en combinación con las firmas de neutrófilos (Figura S7C). Es importante destacar que tanto las combinaciones de firmas de macrófagos C1qc+ como Spp1+ de triple alta fueron factores pronósticos adversos independientes para la supervivencia libre de recurrencia (RFS) y no se vieron influenciadas por el estadio tumoral, el estado de la quimioterapia adyuvante, la edad, el sexo y el estado de la mutación de KRAS, mientras que se correlacionaron con una peor RFS (Figura S7D–G). El valor pronóstico adverso de la firma de triple Spp1+ se demostró aún más cuando agrupamos las razones de riesgo ajustadas de múltiples cohortes independientes de CRC utilizando modelos de efectos aleatorios. En la población general de pacientes con CRC analizados, la razón de riesgo agrupada para la firma de triple Spp1+ fue de 1,41 (IC del 95 % 1,04–1,91, P = 0,02, I² = 0 %) (Figura S8A). En los análisis estratificados por estadio, la firma Spp1+ se asoció con peores resultados de supervivencia en el estadio III (OS: razón de riesgo agrupada = 1,64, IC del 95 % 1,01–2,65, P = 0,04; supervivencia/RFS: razón de riesgo agrupada = 1,92, IC del 95 % 1,10–3,33, P = 0,02; I² = 0 % para ambos) (Figura S8B y S8C). En conjunto, demostramos que la firma de triple alta Spp1+ es un factor pronóstico adverso independiente sólido para el CRC. Es importante destacar que demostramos la presencia de macrófagos C1QC+ (CD68+) que coexpresan EGFR y THBS1 en el estroma del CRC humano (Figura 8A). Además, utilizamos una cohorte humana de CRC disponible que combina la imagen molecular espacial de todo el transcriptoma con la secuenciación de ARN de un solo núcleo para identificar los macrófagos CD68+ dentro del TME (Figura 8B, área del polígono amarillo) ^[36]. Dentro de esta área, también pudimos detectar transcritos de C1QC, SPP1, EGFR y THBS1 (Figura 8C), lo que confirma que los macrófagos que coexpresan estos marcadores se encuentran en el TME del CRC humano. Figura 8: Coexpresión de EGFR, C1QC, SPP1 y THBS1 en los macrófagos CD68+ en el TME del CRC humano. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen de tamaño completo. A Tinción de inmunofluorescencia múltiple del CRC humano. El panel de tinción incluyó anticuerpos contra CD68, C1QC, EGFR y THBS1. DAPI se utilizó para la detección de núcleos. Aumento: x3, x5, x20. Las barras de escala: 1 mm y 100 µm. Las puntas de flecha indican los macrófagos triple positivos para C1QC, EGFR y THBS1. B Tinción de inmunofluorescencia para los marcadores indicados de las muestras de CRC humano informadas por Crowell et al. 2025 (datos de WTx CosMx SMI): DAPI, B2M/CD298 (blanco), CD68, CD45 y PanCK. El polígono amarillo indica el macrófago de interés analizado para la presencia de transcritos de ARN EGFR+ THBS1+ SPP1+ C1QC+. C Mapas espaciales de los transcritos de ARN SPP1, C1QC, EGFR, THBS1 superpuestos a las imágenes de inmunofluorescencia que muestran solo el canal CD68 y los polígonos que indican los límites de las células. El polígono amarillo indica el macrófago de interés. Barras de escala: 100 µm y 10 µm. En resumen, estos resultados sugieren que nuestros hallazgos de los tumores inducidos por AOM/DSS en ratones son relevantes para el CRC humano, y que una presencia más fuerte de los macrófagos C1qc+, Spp1+ y los neutrófilos S100a9+ se correlaciona con un peor pronóstico en los pacientes con CRC. En particular, nuestros resultados destacan una fuerte correlación de los macrófagos C1qc+ y Spp1+ en combinación con una alta expresión de EGFR y THBS1 con malos resultados de supervivencia para los pacientes con CRC. Discusión En este estudio, mostramos cómo la señalización de EGFR en las células mieloides moldea su fenotipo y afecta la composición general del TME del CRC. Al realizar un análisis de scRNAseq imparcial de tumores en ratones con deleción condicional de EGFR en las células mieloides, demostramos una infiltración alterada de células inmunitarias y un TME menos inmunosupresor, acompañado de una activación reducida de las vías de señalización inflamatorias en las células mieloides, lo que afecta su comunicación con las células T. Es importante destacar que identificamos Thbs1 derivado de mieloides como un mediador afectado por la señalización de EGFR y destacamos su papel pronóstico en la supervivencia del CRC humano. Es importante destacar que nuestro estudio preclínico demuestra que la deleción de EGFR en las células mieloides dentro de los tumores de CRC establecidos conduce a una reducción del tamaño del tumor (Figura S9). Estos hallazgos sugieren fuertemente que el direccionamiento específico de EGFR en las células mieloides puede ser de gran beneficio terapéutico para los pacientes con CRC. La inhibición de EGFR es el estándar de atención para los pacientes con CRC metastásico con KRAS de tipo salvaje. Sin embargo, no todos los pacientes se benefician de este tratamiento, y la expresión general de EGFR en los tumores de CRC no predice los resultados terapéuticos, lo que destaca una comprensión incompleta de cómo los inhibidores de EGFR ejercen sus efectos. Por lo tanto, es necesaria una comprensión mecanicista más profunda para una mejor estratificación de los pacientes y el éxito de la terapia ^[37]. Nosotros y otros hemos demostrado un papel promotor del tumor de las células mieloides positivas para EGFR en pacientes con cáncer y modelos de ratón de CRC, lo que sugiere que la eficacia terapéutica de los inhibidores de EGFR puede estar impulsada por su acción sobre las células mieloides [8, 10]. En varias entidades tumorales, el TME está dominado por los TAM y su presencia a menudo se asocia con un mal pronóstico [38, 39]. En los últimos años, los estudios de scRNAseq han revelado distintas subpoblaciones de TAM asociadas con diferentes resultados en el CRC, lo que ha desplazado el enfoque de la dicotomía clásica M1-M2 hacia un espectro de fenotipos intermedios dentro del TME [17, 40, 41]. Utilizando scRNAseq y citometría de flujo, detectamos una reducción de los números de macrófagos F4/80hi y monocitos LY6Chi en los tumores AOM/DSS de EgfrΔMyl, mientras que el número de neutrófilos permaneció sin cambios. Una disminución de los macrófagos CD68+ también se confirmó en EgfrMyl-ER cuando se eliminó EGFR en los tumores AOM/DSS desarrollados ^[10]. El agrupamiento no supervisado de nuestros datos de scRNAseq identificó una reducción de los subgrupos de macrófagos Spp1+ y C1qc+ en los tumores de los ratones EgfrΔMyl. La reducción de los números puede atribuirse a una diferenciación alterada de los progenitores mieloides o a una menor captación en el TME. Si bien las vías de diferenciación no mostraron cambios significativos entre los macrófagos y monocitos de tipo salvaje y EgfrΔMyl, se redujeron varias vías de señalización migratorias y quimiotácticas en ausencia de EGFR. También observamos una reducción de los niveles de Ccr1 en los monocitos y macrófagos EgfrΔMyl. De hecho, la captación alterada de estas células se había atribuido previamente a la inhibición de CCR1 ^[42]. Por lo tanto, la regulación a la baja de las vías relacionadas con la migración destaca a EGFR como un factor clave para la captación de macrófagos Spp1+ y C1qc+ en los tumores de CRC. Es interesante destacar que los estudios recientes han demostrado que los pacientes con TAMs SPP1hi o C1QChi mostraron peores resultados clínicos [12, 43, 44, 45]. Además, los macrófagos C1QC expresan altos niveles de ADGRE1, que codifica F4/80 en ratones, y se asocian con la fagocitosis, las proteínas del complemento y la presentación de antígenos ^[17]. Por el contrario, los macrófagos SPP1 expresan genes angiogénicos y se han relacionado con la señalización de TGFβ e IL1 ^[12]. Por lo tanto, la deleción de EGFR en las células mieloides puede aliviar la inmunosupresión al reducir la infiltración de macrófagos Spp1+ y C1qc+ en los tumores. También demostramos que ambos grupos de macrófagos no solo se redujeron en número, sino que también mostraron una reducción de una amplia gama de diversas citocinas inflamatorias, como TGFβ, IFNγ e IL6. Resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio habían informado de una reducción en la expresión de IL6 en células mieloides Cd11b+ deficientes en EGFR [8, 9]. Se ha demostrado que una alta señalización de TGFβ promueve la angiogénesis, la metástasis y la diferenciación de células Treg ^[45]. Por lo tanto, estos mecanismos que promueven el tumor podrían reducirse en tumores EgfrΔMyl. Además, la reducción de la señalización de IFNγ podría ser responsable de la disminución de la expresión de genes de puntos de control como Lilrb4a o CD274 (PDL1), ya que se ha demostrado que este último está regulado por IFNγ ^[46]. Por lo tanto, la alteración de la infiltración de macrófagos, junto con la disminución de la expresión de citocinas inflamatorias que promueven el tumor, podría explicar por qué la deleción de EGFR en las células mieloides da como resultado una reducción del crecimiento tumoral. La deficiencia de EGFR en las células mieloides también afecta a las vías de señalización posteriores. Utilizando PROGENy, detectamos la mayor actividad de EGFR entre los grupos de células mieloides en neutrófilos S100a9+ y macrófagos Spp1+ de tipo salvaje. La deleción de EGFR indujo la mayor reducción en las vías relacionadas con EGFR en macrófagos Spp1+ y subpoblaciones de células dendríticas (DC), y en menor medida en macrófagos TAM C1qc+, lo que resultó en una reducción de la actividad de las vías JAK/STAT y PI3K/AKT en estas células. La vía JAK/STAT es esencial para la expresión de genes estimulados por IFN, incluidos algunos genes de puntos de control ^[47]. La activación de STAT3 en las células mieloides también se ha correlacionado con la polarización de los macrófagos y un peor pronóstico para los pacientes con cáncer [48, 49]. Además, también se ha demostrado que promueve el crecimiento tumoral en el modelo AOM/DSS ^[50]. La vía PI3K también es un importante regulador de las funciones de las células mieloides, que influye, entre otras cosas, en su polarización y migración hacia los tumores [51, 52, 53]. Los factores de crecimiento, como el EGF o el TGFβ, producidos por las células tumorales pueden modular la polarización de los macrófagos a través de PI3K [54, 55]. En esta línea, se ha demostrado que el bloqueo de PI3K reduce la supresión inmune al alterar la expresión de genes, incluido Thbs1 ^[53]. Por lo tanto, nuestros datos indican que la falta de señalización de EGFR en los macrófagos da como resultado una reducción de la activación de las vías posteriores, como JAK/STAT y PI3K, lo que influye en la expresión de importantes mediadores inmunes, lo que posiblemente afecta a otras células en el microambiente tumoral (TME). La migración, diferenciación y activación de las células T están impulsadas principalmente por las células dendríticas y los macrófagos ^[56]. La diferenciación de las células T y la infiltración de las células Treg contribuyen a la inmunosupresión en el CCRC, mientras que el bloqueo de la diferenciación de las células Treg conduce a una disminución de la carga tumoral en el colon [57, 58]. La reducción de la activación de la vía TGFβ observada en los macrófagos C1qc+ y Spp1+ puede contribuir a la disminución del número de células Treg en los tumores EgfrΔMyl, lo que a su vez podría conducir a una reducción de la carga tumoral. Curiosamente, el análisis computacional de las interacciones célula a célula en nuestro conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) indica una alteración de la comunicación cruzada entre las células mieloides y las células T, que involucra interacciones ligando-receptor de puntos de control. Tras la deleción de EGFR, las probabilidades de interacción de los pares ligando-receptor de puntos de control y citocinas asociadas con la supresión de las células T disminuyeron, lo que sugiere nuevamente que la señalización de EGFR en las células mieloides apoya la inmunosupresión mediada por las células T. Los macrófagos infiltrantes del tumor desempeñan un papel en la inducción del agotamiento de las células T, lo que a menudo se correlaciona con un mal pronóstico [59, 60]. En nuestra cohorte, detectamos una reducción de la expresión de las moléculas de agotamiento Pdcd1 y Havcr2 en las células T CD8+ en los tumores EgfrΔMyl. Esto coincidió con una reducción de la expresión de Ifngr1 en las células T CD8 y una reducción de la señalización de IFN II en los macrófagos que carecían de EGFR. En línea con nuestras observaciones, se demostró recientemente que la activación crónica de la señalización de IFNγ en las células T citotóxicas limita las respuestas antitumorales al disminuir la generación de células T con una expresión intermedia del marcador de agotamiento ^[61]. En conjunto, estos resultados reflejan un estado potencialmente menos inmunosupresor para las células T en los tumores de CCRC murinos que carecen de EGFR en las células mieloides. Al integrar los datos transcriptómicos y proteómicos, demostramos una reducción en la expresión de THBS1 en los macrófagos F4/80hi EgfrΔMyl, lo que es consistente con la regulación a la baja observada de la vía TGFβ. En particular, la diferencia fue más pronunciada a nivel de proteína que a nivel de transcrito, lo que posiblemente refleja la regulación postranscripcional y/o postraduccional, así como las diferencias metodológicas entre scRNAseq y LC–MS/MS. Es importante destacar que la inmunohistoquímica confirmó la coexpresión de THBS1 y EGFR en los macrófagos asociados al tumor (TAM), lo que apoya aún más la relación entre la señalización de EGFR en las células mieloides y la abundancia de la proteína THBS1 dentro del TME. Un trabajo reciente identificó células mononucleares y macrófagos infiltrantes del tumor como la principal fuente de THBS1, relacionando su expresión con un mayor potencial metastásico y peores resultados en los pacientes ^[62]. En línea con estas observaciones, mostramos que una alta expresión de THBS1 se asocia con peores resultados de supervivencia en una cohorte de pacientes con CCRC. Además, utilizando firmas mieloides identificadas en nuestro modelo murino, encontramos que la coexpresión de una alta firma de EGFR, THBS1 y macrófagos C1qc+ se correlaciona con una peor supervivencia general en los pacientes. De manera consistente, el análisis de un conjunto de datos de scRNAseq de CCRC humano reveló que una baja actividad de EGFR se asoció con una reducción de la expresión de THBS1 en los macrófagos proinflamatorios. Nuestros resultados sugieren que THBS1 derivado de las células mieloides probablemente sirve como un ligando clave en la comunicación de las células T, que se regula a la baja en las células mieloides de los tumores EgfrΔMyl. En particular, el análisis predictivo de la interacción célula a célula reveló que, junto con los macrófagos, los neutrófilos también contribuyen a la producción de THBS1, lo que destaca la complejidad del TME y la necesidad de una mayor investigación. La evidencia funcional in vivo apoya aún más la relevancia biológica del eje EGFR-THBS1 identificado en nuestro estudio. Omatsu et al. demostraron que la deleción específica de mieloides de Thbs1 utilizando la línea LysM-Cre redujo significativamente la carga metastásica en un modelo de implantación ortotópica que utiliza organoides tumorales murinos (MTO) ^[62]. En el mismo estudio, los autores también mostraron que THBS1 derivado del TME promueve la disfunción/agotamiento de las células T citotóxicas en el CCRC, y la administración ex vivo de THBS1 promovió la expresión de marcadores asociados al agotamiento en las células T y suprimió la actividad citotóxica de las células T ^[62]. Aunque este trabajo no evaluó la señalización de EGFR, proporciona evidencia in vivo de que THBS1 derivado de monocitos/macrófagos contribuye a la progresión del CCRC, lo que apoya firmemente nuestros hallazgos. En conjunto, estos datos sugieren que la señalización de EGFR en las células mieloides, posiblemente a través de las vías asociadas a THBS1, promueve la inmunosupresión en el CCRC y puede afectar la respuesta a la inmunoterapia. En futuros estudios, las estrategias de administración dirigida (por ejemplo, nanopartículas dirigidas a macrófagos EGFR⁺F4/80⁺) podrían permitir la inhibición específica de mieloides de EGFR al tiempo que se limitan los efectos fuera del objetivo y se apoya la combinación con inhibidores de puntos de control inmunitarios. En conjunto, estos hallazgos establecen una relación entre la señalización de EGFR en los macrófagos, la expresión de THBS1 y el pronóstico del paciente, y sugieren que THBS1 derivado de las células mieloides puede servir como un posible biomarcador para la futura estratificación de pacientes, lo que enfatiza la relevancia clínica de nuestros hallazgos. Materiales y métodos Experimentos con ratones y material humano Se cruzaron ratones Egfrfl/fl ^[63] con ratones LysM-Cre ^[64], tamoxifeno (Tx)-inducible LysM-CreER o ratones Cd11c-Cre ^[65]. La detección de los alelos Egfrfl y EgfrΔ se realizó mediante PCR, utilizando los cebadores R4 (GCCTGTGTCCGGGTCTCGTCG), R6 (CAACCAGTGCACCTAGCCTGG) y Egfr-fwd (AAGTTTAAG). Los experimentos se realizaron con ratones de 8 a 12 semanas de edad. El tamaño de la muestra se eligió de acuerdo con la configuración experimental publicada anteriormente ^[8]. El material de CCRC humano, utilizado para la inmunofluorescencia múltiple, se obtuvo del Departamento de Cirugía General de la Universidad Médica de Viena. Tumorogénesis Brevemente, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con AOM, las hembras con 12,5 y los machos con 10 mg/kg (A5486; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), seguido de una dieta y agua normal durante 5 días. Luego, los ratones recibieron 2,5% de DSS (02160110-CF; MP Biomedicals, Santa Ana, CA) en agua autoclavada durante 5 días, seguido de mantenimiento con agua autoclavada normal durante 16 días y dos ciclos adicionales de DSS (5 días de 2,5% de DSS y 5 días de 2% de DSS). Los ratones se sacrificaron 30 días después del último tratamiento con DSS. Para la deleción inducible de EGFR en tumores establecidos, se alimentó a los ratones con una dieta de tamoxifeno (GENOdiet CreActive T400, GEN16/T400-R; Genobios) hasta el final del experimento. Aislamiento de células peritoneales Los macrófagos peritoneales se aislaron según lo descrito anteriormente ^[66]. Brevemente, se realizó un lavado peritoneal con 10 ml de PBS (D8537; Sigma-Aldrich) que contenía 2 mM de EDTA (8040.2; Roth Calbiochem). La suspensión celular resultante se centrifugó durante 6 minutos a 300 × g a 4 °C. Las células se colocaron en un medio RPMI-1640 (R8758; Sigma-Aldrich) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB; F7524, Sigma-Aldrich) y 1% de penicilina/estreptomicina (P4333; Sigma-Aldrich) y se lavaron después de 60 minutos. Selección celular magnética Para el aislamiento de células dendríticas (DC) del bazo, realizamos una selección celular magnética positiva utilizando un anticuerpo biotinilado Cd11c (N418; BioLegend) y partículas IMag streptavidina (557812; BD Biosciences), según las instrucciones del fabricante. La calidad de la selección se evaluó mediante análisis citométrico de flujo, lo que reveló que la mayoría de las células vivas seleccionadas eran CD45+/CD11c+. Citometría de flujo y selección celular Los pólipos del colon se cortaron en trozos y se digirieron en un medio RPMI suplementado con 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 1,5 mg/ml de colagenasa VIII (C2139; Sigma-Aldrich) y 0,5 mg/ml de DNasa I (D5319; Sigma-Aldrich) durante 1 hora a 37 °C, con agitación a 300 rpm. Las muestras se filtraron a través de un tamiz celular de 70 μm y se lavaron una vez con solución salina tamponada con Hank (H6648; Sigma-Aldrich) que contenía 10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina y 5 mM de EDTA y dos veces con PBS que contenía 5% de SFB, 5 mM de EDTA y 20 μg/ml de DNasa I. Las suspensiones celulares se bloquearon inicialmente con Fc-block (CD16/CD32, 101301; BioLegend) seguido del tinte con anticuerpos fluorescentes durante 30 minutos a 4 °C. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S12. Los datos se adquirieron utilizando un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo v10.6 (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Se aplicaron estrategias de separación adecuadas para la clasificación activada por fluorescencia y las células se resuspendieron en RPMI suplementado con 2 mM de EDTA y 20 μg/ml de DNasa I. Las células se clasificaron en TRIzol LS Reagent (10296010; Thermo Fisher Scientific) para el aislamiento de ARN o en RPMI suplementado con 50% de SFB para el aislamiento de proteínas con un FACSAria III (BD Biosciences). Tinción intracelular Para la detección de antígenos intracelulares, las células se tiñeron para los antígenos externos y luego se fijaron y permeabilizaron utilizando el conjunto de tinción Foxp3/Transcription factor (00-5523; Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Inmunofluorescencia e inmunofluorescencia múltiple Se prepararon secciones de parafina de 4 μm de espesor para inmunofluorescencia mediante su desparafinación mediante incubación a 65 °C durante 15 minutos, seguida de la rehidratación utilizando una serie de alcoholes según los protocolos estándar. Para la tinción de inmunofluorescencia de secciones de tumores de CCRC de ratón, se realizó la recuperación de antígenos a pH 9,0. Las muestras se bloquearon con un kit de ratón en ratón (M.O.M MKB-2213-1; Vector Laboratories) para evitar la unión inespecífica y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios para F4/80, EGFR y THBS1. Para la inmunofluorescencia múltiple, las muestras se bloquearon con 2% de BSA, 5% de suero de caballo y 0,1% de Triton en PBS. Para detectar múltiples marcadores tisulares, utilizamos el kit de detección Opal 6-Plex (NEL811001KT, Akoya Biosciences) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), seguido de la incubación con el anticuerpo secundario acoplado a HRP (10 minutos, TA). Luego, las láminas se tiñeron con el fluoróforo Opal apropiado (10 minutos, TA). Se utilizó tratamiento con microondas para eliminar el complejo primario-secundario de HRP. Este proceso se repitió hasta cuatro veces para detectar los respectivos marcadores tisulares. Finalmente, las muestras se contrateñieron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S12. Las láminas se escanearon con el escáner de láminas VS200 (Evident) y se analizaron utilizando el software HALO (Indica Labs, v4.1).

Transcripción inversa cuantitativa

Se realizó el aislamiento de ARN total a partir de macrófagos peritoneales y células dendríticas (DCs) con TRIzol (15596026; Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La síntesis de ADN complementario (cDNA) se realizó utilizando SuperScript VILO Master Mix (11756050; Invitrogen). Las células mieloides clasificadas por FACS se clasificaron en TRIzol LS Reagent (10296010; Invitrogen) y el ARN se aisló utilizando el kit miRNeasy Micro Cleanup Kit (217084; Qiagen). Para la síntesis de cDNA, se utilizó LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010; New England BioLabs).

Se utilizaron los ensayos de expresión génica TaqMan (Egfr FAM: Mm01187858m1; Tbp VIC: Mm01277042m1 y Hprt VIC: Mm03024075_m1, Thermo Fisher Scientific) y el TaqMan™ Fast Advanced Master Mix para qRT-PCR (4444557; Applied Biosystems™) para la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) según las instrucciones del fabricante y se realizó en un sistema de PCR en tiempo real (CFX96 Touch System, Bio-Rad). Los cambios en la expresión entre los genotipos se calcularon utilizando el método ∆∆Ct, con Tbp (proteína de unión a la caja TATA) y Hprt (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa) como genes de referencia.

Western blot

Las células se lisaron en tampones apropiados utilizando protocolos estándar ^[67]. Los lisados proteicos se resuspendieron en el tampón de carga apropiado mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa PVDF (GE10600023; Merck). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: EGFR (71655; Cell Signaling) y HSP90 (4874; Cell Signaling), durante la noche a 4 °C, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó quimioluminiscencia mejorada (ECL; GERPN2235; Merck) y el sistema de imagen de geles Chemi-Doc (Bio-Rad) para la revelación.

Clasificación de células individuales, preparación de bibliotecas y secuenciación de tumores de CRC de ratón (10x Genomics)

Se agruparon tumores de CRC de tres ratones por grupo. Las suspensiones de células individuales recolectadas de las muestras de CRC se teñieron con anticuerpos contra CD45, CD326, CD11b, CD64, F4/80 y Gr-1 (como se muestra en la Tabla S12) para la purificación por FACS, que se realizó para obtener una concentración de 800 células por µl en un instrumento BD Aria III.

Las suspensiones de células individuales CD45+ y CD45- clasificadas se cargaron en un chip de célula única Chromium (10x Genomics) según las instrucciones del fabricante para la co-encapsulación con cuentas de gel codificadas por barras a una tasa de captura objetivo de 10.000 células individuales por muestra. El mRNA capturado se codificó por barras durante la síntesis de cDNA, y los pasos posteriores se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante utilizando el Chromium Single Cell 3′ Solution v3.1 (10x Genomics). Todas las muestras de tumores se procesaron simultáneamente con el Chromium Controller (10x Genomics), y las bibliotecas resultantes se prepararon en paralelo para evitar los efectos de lote. Se verificó la calidad de las bibliotecas finales en un Tape Station (Agilent) utilizando la cinta HS D1000. La concentración de ADN se determinó utilizando un analizador Qubit (Thermo Fisher Scientific). Todas las bibliotecas se secuenciaron con una lectura de índice de 8 bases, una lectura 1 de 26 bases que contiene códigos de barras de identificación de células e identificadores moleculares únicos (UMI), y una lectura 2 de 98 bases que contiene secuencias de transcritos en un instrumento Illumina HiSeq 4000.

Procesamiento y análisis de datos de scRNAseq

Se realizó la alineación utilizando cellRanger (v3.0.2) en los datos brutos utilizando la anotación mm10. Se utilizó cellRanger aggr para agregar las muestras. Se realizaron pasos de filtrado para eliminar células de baja calidad, gotitas vacías, múltiples y contaminación mitocondrial utilizando funciones del paquete R Pagoda2 (v1.0.10) ^[68]. Se aplicó la función gene.vs.molecule.cell.filter() para excluir las células con recuentos de genes anómalamente altos (max.cell.size establecido en 5e4 y min.cell.size en 500). Para evaluar la contaminación mitocondrial, se calculó la proporción de lecturas mitocondriales utilizando la función PercentageFeatureSet() del paquete R Seurat (v4) ^[69]. Definimos el conjunto de todos los genes que comienzan con “MT-” como genes mitocondriales y descartamos las células con más del 20% de sus recuentos mapeados a ellos.

Todos los siguientes pasos se realizaron utilizando el paquete R Seurat (v4) ^[69]. Para tener en cuenta las diferencias en la profundidad de secuenciación entre las células, utilizamos la función NormalizeData(), seguida de la función ScaleData(). Luego, aplicamos la función FindVariableFeatures() para identificar las características más variables en el conjunto de datos utilizando el método de transformación de estabilización de la varianza (VST). Seleccionamos los 2000 genes variables principales. Las cuatro muestras diferentes se integraron utilizando la función FindIntegrationAnchors().

Para corregir las posibles variaciones en la expresión génica debido a que las células se encuentran en diferentes fases del ciclo celular, realizamos la regresión del ciclo celular utilizando la función CellCycleScoring(). Este algoritmo estima la fase del ciclo celular de cada célula utilizando un conjunto de genes marcadores del ciclo celular y, a continuación, elimina el efecto del ciclo celular de los datos de expresión génica. Específicamente, primero calculamos una puntuación de fase S y una puntuación de fase G2M (basadas en genes anotados). El algoritmo luego elimina el efecto del ciclo celular de los datos de expresión génica utilizando un modelo de regresión lineal.

Después de realizar un análisis de componentes principales (PCA) en los genes más variables, se generaron incrustaciones UMAP utilizando los 30 componentes principales superiores y los parámetros predeterminados ^[70].

Para agrupar las células, aplicamos la agrupación basada en gráficos utilizando el algoritmo de Louvain, utilizando la función FindClusters() con una resolución de 0,5. Se ejecutó FindNeighbors() con los parámetros predeterminados. La sub-agrupación de células mieloides y células T para resolver aún más la heterogeneidad de estos tipos de células se realizó en estos subconjuntos, con el mismo enfoque y parámetros.

Identificación de las vías de señalización de EGFR, PI3K y JAK/STAT utilizando un modelo PROGENy y el paquete decoupleR

El paquete R/Bioconductor decoupleR (v2.10.0) utiliza un conjunto de métodos computacionales para inferir actividades biológicas a partir de datos ómicos ^[18]. Utilizamos el método de la media ponderada (wmean) para evaluar las actividades de los reguladores, que implica multiplicar cada característica objetivo por su peso asociado y sumar los resultados para obtener una puntuación de enriquecimiento. Para obtener una distribución nula, realizamos permutaciones de características objetivo aleatorias y las utilizamos para calcular una puntuación z (normwmean) y una estimación corregida (corrwmean) multiplicando wmean por el -log10 del valor p empírico obtenido. Nuestro análisis utilizando el paquete R/Bioconductor PROGENy (v1.26.0) y el paquete decoupleR nos permitió identificar las vías de señalización que pueden estar reguladas por la vía de señalización de EGFR en diferentes tipos de células en nuestro conjunto de datos, proporcionando una mayor comprensión de los mecanismos biológicos subyacentes a nuestros datos.

Interacciones receptor-ligando y análisis de la red de comunicación celular

Para investigar la comunicación de la red entre diferentes células en nuestro conjunto de datos de scRNAseq, utilizamos los paquetes R CellChat ^[29] e iTALK ^[30]. CellChat (v1) utiliza pares de ligandos-receptores y datos de expresión génica para predecir eventos de señalización intercelular e identificar posibles vías de señalización entre los tipos de células. Para analizar el número diferencial de interacciones o la fuerza de la interacción entre diferentes tipos de células, realizamos un análisis diferencial. Las vías de señalización significativas se clasificaron en función de las diferencias en el flujo de información general dentro de las redes inferidas entre KO y WT.

Seguimos el flujo de trabajo estándar de CellChat (v1), que implicó los siguientes pasos: (1) Cargar la base de datos CellChatDB para el análisis de la comunicación entre células. (2) Llamar al método createCellChat() con los datos de ARN y los metadatos del objeto Seurat. (3) Aplicar la función identifyOverExpressedGenes() para identificar los genes que están sobreexpresados en una población celular en comparación con otras. (4) Calcular la probabilidad de comunicación para cada interacción célula-célula utilizando la función computeCommunProb() y eliminar las interacciones célula-célula que involucran menos de 10 células. (5) Agregar la red de comunicación por vía de señalización utilizando la función aggregateNet(). (6) Visualizar la red de interacción utilizando netVisualcircle(), con gráficos que muestran el número de interacciones y la fuerza/intensidad de la interacción. (7) Visualizar las interacciones significativas de grupos de células específicos utilizando netVisualbubble(), con las fuentes y los objetivos especificados como células mieloides y células T, respectivamente.

Las interacciones receptor-ligando se investigaron más a fondo utilizando iTalk (v0.1.0) ^[30]. Los pares de ligandos-receptores se seleccionaron en función de los valores de fuerza más altos. La fuerza de la predicción se calculó mediante el producto de la expresión media del ligando y el receptor para el diagrama de caja o mediante el producto del cambio logarítmico de la expresión del ligando y el receptor en los diagramas de circos, como se describe en el paquete iTalk. La función LRPlot() se utilizó para los diagramas de circos, que muestran los pares de ligandos-receptores predichos entre las células mieloides y las células T. Solo se muestran las 50 interacciones principales según los valores de fuerza más altos, con un valor de p ajustado < 0,05 para el ligando o el receptor. La corrección del valor p para las pruebas múltiples se realizó según Benjamini-Hochberg.

Análisis de expresión génica diferencial entre genotipos

Los análisis de expresión génica diferencial se calcularon utilizando modelos lineales, implementados en el paquete R/Bioconductor limma (v3.54.2) ^[71]. La corrección del valor p para las pruebas múltiples se realizó según Benjamini-Hochberg ^[72].

Análisis de variación del conjunto de genes

Se realizó GSVA utilizando el paquete R/Bioconductor GSVA (v1.46) ^[73]. Los conjuntos de genes específicos de vías y términos se obtuvieron de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) ^[74]. Los valores de expresión génica se transformaron en puntuaciones de conjuntos de genes utilizando la función GSVA con una distribución de Poisson como función de densidad acumulativa. Las diferencias en las puntuaciones de GSVA se calcularon utilizando modelos lineales, implementados en el paquete R/Bioconductor limma (v3.54.2) ^[71]. La corrección del valor p para las pruebas múltiples se realizó según Benjamini-Hochberg ^[72].

Preparación de muestras para espectrometría de masas

Las células mieloides clasificadas se lavaron una vez con PBS frío y se resuspendieron en tampón de lisis RIPA que contiene 25 mM de clorhidrato de trizma (Tris-HCl) pH = 7,6 (T1503; Sigma-Aldrich), 1% p/v de desoxicolato de sodio (D6750; Sigma-Aldrich), 150 mM de cloruro de sodio (NaCl; 1.06404; Sigma-Aldrich), 0,1% p/v de dodecilsulfato de sodio (SDS; 1610418; Bio-Rad), 1% v/v de Nonidet P-40 (N-6507; Sigma-Aldrich), complementado con 1 mM de ortovanadato de sodio (Na3VO4; S6508; Sigma-Aldrich), 10 mM de fluoruro de sodio (NaF; 7681-49-4; Thermo Fisher Scientific), 1 ug/ml de aprotinina (A1153-1MG; Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml de 4-2-(aminoetil)bencenosulfonilfluoruro (AEBSF; 1248390500; Merck), 250 U de benzonasa (70746-4; Sigma-Aldrich), 10 U de DNasa I (DN25-1G; Scient Labo) y 1x PhosphoSTOP (4906845001; Sigma-Aldrich). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4 °C y se congelaron en nitrógeno líquido. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (23227; Thermo Fisher). En total, se utilizaron 2 µg de proteína por muestra para el procesamiento posterior. Los enlaces disulfuro de las proteínas se redujeron con 40 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y luego se alquilaron con 10 mM de cloroacetamida (CAA) durante 60 minutos a 37 °C. La digestión de proteínas y la limpieza se realizaron utilizando una versión adaptada del protocolo automatizado basado en cuentas paramagnéticas en un solo recipiente, con mejora de fase sólida (Auto-SP3) en la plataforma de manipulación de líquidos Bravo (Agilent) ^[75]. Brevemente, para la preparación de las cuentas, las cuentas Sera-Mag Speed A y B (Cytiva) se agitaron hasta que el pellet se disolvió. La suspensión se colocó en un soporte magnético y, después de un minuto, se eliminó el sobrenadante. Las cuentas se retiraron del soporte magnético y se suspendieron en agua. Este procedimiento se repitió tres veces. Se combinaron un total de 10 µl de la suspensión A con 10 µl de la suspensión B, y el volumen final se ajustó a 100 µl con H2O. A cada muestra, se añadió un total de 5 µl de la suspensión A + B. Para inducir la unión de las proteínas a las suspensiones, se añadió etanol a cada muestra hasta una concentración final del 50% (v/v). Las muestras se incubaron luego durante 15 minutos a temperatura ambiente y a 800 rpm. Después de la incubación, las muestras se colocaron nuevamente en un soporte magnético y, después de un minuto, se eliminó el sobrenadante. Las muestras se retiraron del soporte magnético y se suspendieron en etanol al 80%. Este procedimiento se repitió tres veces. Finalmente, las muestras se resuspendieron en un tampón TEAB al 100 mM que contenía tripsina (relación enzima/proteína de 1:25) y se digirieron durante la noche en un agitador a 37 °C y 1000 rpm. Después de la digestión, los péptidos recuperados se secaron por centrifugación al vacío (1300 rpm a 45 °C) y se almacenaron a –80 °C hasta su uso.

Análisis LC-MS/MS
Se realizó un análisis de LC-MS/MS de nanoflujo acoplando un HPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris (Thermo Fisher Scientific, Alemania). Las muestras de péptidos se disolvieron en 15 µl de tampón de carga (ácido fórmico al 0,1% (FA), 2% de ACN en H2O compatible con MS) y se inyectaron 2 µl para cada análisis. Las muestras se cargaron en una precolumna (trampa) a velocidades de flujo más altas (PEPMAP 100 C18 5 µm, 0,3 mm x 5 mm, Thermo Scientific), utilizando una bomba de carga y luego se cambió a una columna analítica (100 µm × 30 cm, rellena internamente con Reprosil-Pur 120 C18-AQ, resina de 1,9 µm, Dr. Maisch) a una velocidad de flujo de 3 µl/min en un 98% de tampón A (0,1% de FA en H2O compatible con MS). Después de la carga, los péptidos se separaron utilizando un gradiente de 120 minutos del 2% al 38% de tampón B (0,1% de FA, 80% de ACN en H2O compatible con MS) a una velocidad de flujo de 350 nl/min. El Orbitrap Exploris 480 se operó en modo independiente de datos (DIA), con un rango m/z de 350–1400. Los espectros de escaneo completo se adquirieron en el Orbitrap a una resolución de 120 000 después de la acumulación hasta el valor objetivo establecido del 300% (100% = 1e6) y un tiempo máximo de inyección de 45 ms. Los escaneos completos fueron seguidos por escaneos DIA. Se definieron un total de 47 ventanas de aislamiento, con un rango m/z de 406-986. Los espectros de escaneo DIA se adquirieron a una resolución de 30 000 después de la acumulación hasta el valor objetivo establecido del 1000% (100%=1e5) y un tiempo máximo de inyección de 54 ms. La energía de colisión normalizada (NCE) se estableció en 28%.

Búsqueda en bases de datos y análisis de datos
Todos los archivos de datos DIA–MS se analizaron con un flujo de trabajo directDIA utilizando Spectronaut 17.3 (Biognosys, Zúrich, Suiza). Para la búsqueda Pulsar, se utilizó el proteoma de referencia canónico revisado de ratón UniProt (20 404 entradas, descargado el 7 de diciembre de 2022). La configuración predeterminada para la coincidencia de la base de datos incluyó la digestión completa y específica de tripsina, una longitud de péptido de entre 7 y 52 aminoácidos y un máximo de 2 clivajes perdidos. La metionina N-terminal se eliminó durante el preprocesamiento de la base de datos de proteínas. La carbamidometilación en la cisteína se utilizó como modificación fija, y la acetilación N-terminal de la proteína y la oxidación de la metionina se establecieron como modificaciones variables. Las tasas de descubrimiento falso (FDR) se establecieron en 0,01 para la coincidencia de espectros de péptidos (PSM), la identificación de péptidos y proteínas. Otros parámetros de Spectronaut para la identificación incluyeron la intensidad máxima como estrategia de extracción MZ, 0,01 de valor Q de precursor, 0,2 de valor PEP de precursor y secuencia eliminada como definición de un solo resultado. Para la cuantificación, el valor Q identificado se estableció para el filtrado de precursores, MaxLFQ como método LFQ de proteínas y la cuantificación MS2 con el área como tipo de cantidad. Para un análisis más profundo, solo se consideraron las proteínas sin valores faltantes. Para el análisis de los datos del proteoma, se utilizó el servidor público en usegalaxy.org ^[76]. El análisis se basó en el paquete R/Bioconductor limma (v3.5). Las pruebas estadísticas de significación se realizaron utilizando la función voom() ^[77].

Análisis de conjuntos de datos humanos
Se accedió a datos de scRNAseq publicados previamente desde la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE132465 ^[19]. La matriz bruta se filtró y normalizó según los criterios utilizados por los autores, utilizando el paquete Seurat (v4.1.1). Se verificaron seis anotaciones principales de tipos de células y metadatos y se utilizaron posteriormente. Implementamos el paquete PROGENy (v1.26.0) a través del paquete decoupleR R/Bioconductor (v2.10.0) para calcular la actividad de la vía EGFR, como se describió anteriormente. Luego, utilizamos la función quantile() para distinguir las células mieloides con baja o alta actividad de EGFR. La expresión génica diferencial de EGFR con baja o alta actividad se calculó a través de la función FindMarkers() y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon predeterminada. Se accedió a un conjunto de CRC disponible públicamente con datos de expresión génica bruta desde la base de datos GEO con el número de acceso GSE39582 ^[35]. Después del control de calidad y la eliminación de lotes con el paquete R/Bioconductor ArrayQualityMetrics, quedaron un total de 516 muestras de pacientes con CRC para el análisis posterior. Los puntos de corte para los distintos grupos de pacientes en el análisis de supervivencia se definieron con el paquete R survminer (v0.4.9). Se utilizaron las estadísticas de rango logarítmico máximo para estratificar a los pacientes en grupos de alta y baja expresión génica. Para predecir los resultados de supervivencia para los pacientes con CRC según las firmas génicas identificadas en nuestros datos de scRNAseq 10x de ratón, utilizamos los genes de mayor expresión de los subgrupos de células mieloides C1qc+ macrófagos, Spp1+ macrófagos y S100a9+ neutrófilos. El paquete R/Bioconductor GSVA (v1.52.3) se utilizó para estimar las puntuaciones de enriquecimiento para los tres conjuntos de datos de células mieloides, respectivamente. La función gsvaParam() se utilizó con una distribución gaussiana como función de densidad acumulativa, adecuada para los datos de microarrays.

Los datos de imágenes moleculares espaciales de todo el transcriptoma (WTx CosMx SMI) de las muestras de pacientes con CRC, junto con secciones consecutivas de imágenes digitales de inmunofluorescencia, fueron informados previamente por Crowell et al ^[36]. Reanalizamos el conjunto de datos utilizando los datos de nivel celular procesados, las anotaciones de límites de células coincidentes, las coordenadas de transcritos y las imágenes de inmunofluorescencia proporcionadas con la versión publicada del conjunto de datos. Los macrófagos EGFR+ THBS1+ se identificaron entre las células filtradas anotadas como macrófagos asociados al tumor, requiriendo una expresión detectable tanto de EGFR como de THBS1. Luego, se verificó que los macrófagos EGFR+ THBS1+ seleccionados expresaran de manera detectable los transcritos C1QC (y/o SPP1), EGFR y THBS1.

Análisis de supervivencia
El paquete R de supervivencia (v3.7.0) se utilizó para los análisis de supervivencia, la prueba de rango logarítmico para el análisis estadístico entre grupos y el paquete R corrplot (v0.94) para los gráficos de correlación génica. Se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariable para evaluar el valor pronóstico independiente de las firmas de macrófagos en GSE39582, y en dos cohortes independientes adicionales de CRC: CMC-BSN (n = 185) ^[78] y AC-ICAM (n = 348 solo con datos de ARNm, n = 281 con datos de mutación) ^[79]. Los modelos de regresión de Cox se ajustaron para el estadio patológico (III-IV frente a I-II), la quimioterapia adyuvante (no disponible para CMC-BSN), la edad (continua), el sexo y el estado de mutación de RAS. También se realizaron análisis de subgrupos que incluyeron solo a pacientes en estadio III. Se trazaron gráficos de bosque que mostraban las razones de riesgo con intervalos de confianza del 95% utilizando el paquete forestplot (v3.1.7). Realizamos un metaanálisis de efectos aleatorios utilizando el método de máxima verosimilitud restringida (REML) sobre las razones de riesgo ajustadas de las firmas triples C1qc⁺ o Spp1⁺ derivadas de los modelos de Cox ajustados en cada conjunto de datos independiente. El metaanálisis se realizó utilizando el paquete metafor (v4.8-0) ^[80].

Estadística y diseño de figuras
Se utilizó GraphPad Prism 8 para el análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± SEM. La significación estadística se calculó mediante una prueba t de Student no pareada para comparar dos grupos experimentales con varianza similar, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó la calculadora de GraphPad para la eliminación de valores atípicos estadísticamente significativos. Se consideró que un valor de P < 0,05 es estadísticamente significativo (*P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001, ****P < 0,0001). Se utilizó Adobe Illustrator CS6 para la creación y el diseño de figuras. Disponibilidad de datos

Los datos se pueden consultar en el repositorio NCBI Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE279941. Los datos proteómicos se pueden consultar en PRIDE con el número de acceso PXD058770. El código relevante de este estudio está disponible en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.19197271) y GitHub (https://github.com/ReniaFari/EGFRmyeloidCRC). Referencias: Siegel RL, Wagle NS, Star J, Kratzer TB, Smith RA, Jemal A. Estadísticas del cáncer colorrectal, 2026. CA Cancer J Clin. 2026;76:e70067. PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Bray F, Laversanne M, Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Soerjomataram I, et al. Estadísticas globales del cáncer 2022: estimaciones de GLOBOCAN de la incidencia y la mortalidad en todo el mundo para 36 tipos de cáncer en 185 países. CA Cancer J Clin. 2024;74:229–63. PubMed
Google Scholar
Li J, Ma X, Chakravarti D, Shalapour S, DePinho RA. Características genéticas y biológicas del cáncer colorrectal. Genes Dev; 2021;35:787–820. Shah SC, Itzkowitz SH. Cáncer colorrectal en la enfermedad inflamatoria intestinal: mecanismos y tratamiento. Gastroenterology. 2022;162:715–30. Artículo
PubMed
Google Scholar
Dariya B, Aliya S, Merchant N, Alam A, Nagaraju GP. Biología, diagnóstico y enfoques terapéuticos del cáncer colorrectal. Crit Rev Oncogenesis. 2020;25:71–94. Artículo
PubMed
Google Scholar
Venook AP, Niedzwiecki D, Lenz H, Innocenti F, Fruth B, Meyerhardt JA, et al. Efecto de la quimioterapia de primera línea combinada con cetuximab o bevacizumab sobre la supervivencia global en pacientes con cáncer colorrectal avanzado o metastásico con KRAS de tipo salvaje: un ensayo clínico aleatorizado. JAMA. 2017;317:2392–401. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Uribe ML, Marrocco I, Yarden Y. EGFR en el cáncer: mecanismos de señalización, fármacos y resistencia adquirida. Cancers. 2021;13:2748. Srivatsa S, Paul MC, Cardone C, Holcmann M, Amberg N, Pathria P, et al. EGFR en las células mieloides asociadas al tumor promueve el desarrollo del cáncer colorrectal en ratones y se asocia con los resultados de los pacientes. Gastroenterology. 2017;153:178–90. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Lanaya H, Natarajan A, Komposch K, Li L, Amberg N, Chen L, et al. EGFR tiene un papel promotor del tumor en los macrófagos hepáticos durante la formación del carcinoma hepatocelular. Nat Cell Biol. 2014;16:972–81. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Hardbower DM, Coburn LA, Asim M, Singh K, Sierra JC, Barry DP, et al. La activación de macrófagos mediada por EGFR promueve la tumorigénesis asociada a la colitis. Oncogene. 2017;36:3807–19. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Deng H, Chen Y, Liu Y, Liu L, Xu R. El complemento C1QC como un posible marcador pronóstico y objetivo terapéutico en el carcinoma de colon basado en el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula e inmunohistoquímica. Bosn J Basic Med Sci. 2022;22:912–22. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Qi J, Sun H, Zhang Y, Wang Z, Xun Z, Li Z, et al. El análisis de una sola célula y espacial revela la interacción de los fibroblastos FAP+ y los macrófagos SPP1+ en el cáncer colorrectal. Nat Commun. 2022;13:1–20. Artículo
Google Scholar
Baharom F, Ramirez-Valdez RA, Khalilnezhad A, Khalilnezhad S, Dillon M, Hermans D, et al. La vacunación sistémica induce células T CD8+ y remodela el microambiente tumoral. Cell. 2022;185:4317–32. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Liu Y, Zhang Q, Xing B, Luo N, Gao R, Yu K, et al. Enlace fenotípico inmunitario entre el cáncer colorrectal y la metástasis hepática. Cancer Cell. 2022;40:424–37. Artículo
PubMed
Google Scholar
Zhang L, Yu X, Zheng L, Zhang Y, Li Y, Fang Q, et al. El seguimiento de la línea celular revela relaciones dinámicas de las células T en el cáncer colorrectal. Nature. 2018;564:268–72. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Abram CL, Roberge GL, Hu Y, Lowell CA. Análisis comparativo de la eficiencia y la especificidad de las cepas de deleción de mieloides-Cre utilizando ratones reporteros ROSA-EYFP. J Immunol Methods. 2014;408:89–100. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Zhang L, Li Z, Skrzypczynska KM, Fang Q, Zhang W, O’Brien SA, et al. Los análisis de una sola célula informan sobre los mecanismos de las terapias dirigidas a las células mieloides en el cáncer de colon. Cell. 2020;181:442–59. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Badia-I-Mompel P, Velez Santiago J, Braunger J, Geiss C, Dimitrov D, Muller-Dott S, et al. decoupleR: conjunto de métodos computacionales para inferir actividades biológicas a partir de datos ómicos. Bioinform Adv. 2022;2:vbac16. Artículo
Google Scholar
Lee HO, Hong Y, Etlioglu HE, Cho YB, Pomella V, Van den Bosch B, et al. Los programas de expresión génica dependientes de la línea celular influyen en el panorama inmunitario del cáncer colorrectal. Nat Genet. 2020;52:594–603. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Cheng S, Li Z, Gao R, Xing B, Gao Y, Yang Y, et al. Un atlas transcripcional de células mieloides infiltrantes tumorales de una sola célula en varios tipos de cáncer. Cell. 2021;184:792–809. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Liu Y, Liu X, Xu Q, Gao X, Linghu E. Un modelo pronóstico del cáncer de colon basado en la puntuación de los componentes del microambiente mediante la secuenciación de una sola célula. Vivo. 2022;36:753–63. Artículo
CAS
Google Scholar
Yamakita Y, Matsumura F, Lipscomb MW, Chou P, Werlen G, Burkhardt JK, et al. Fascin1 promueve la migración celular de las células dendríticas maduras. J Immunol. 2011;186:2850–9. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Saichi M, Ladjemi MZ, Korniotis S, Rousseau C, Ait Hamou Z, Massenet-Regad L, et al. La secuenciación de ARN de una sola célula de las células presentadoras de antígenos de la sangre en el COVID-19 grave revela defectos multiproceso en la inmunidad antiviral. Nat Cell Biol. 2021;23:5 2021;23:538-51. Artículo
Google Scholar
Zhang J, Raper A, Sugita N, Hingorani R, Salio M, Palmowski MJ, et al. Caracterización de Siglec-H como un nuevo receptor endocítico expresado en los precursores de células dendríticas plasmocitoides de ratón. Blood. 2006;107:3600–8. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Noe JT, Mitchell RA. Control de la inmunidad tumoral dependiente de MIF. Front Immunol. 2020;11:609948. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Van den Eynde M, Mlecnik B, Bindea G, Fredriksen T, Church SE, Lafontaine L, et al. El vínculo entre el multiverso de los microambientes inmunitarios en las metástasis y la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal. Cancer Cell. 2018;34:1012–26. Artículo
PubMed
Google Scholar
Andreatta M, Corria-Osorio J, Muller S, Cubas R, Coukos G, Carmona SJ. Interpretación de los estados de las células T a partir de los datos de transcriptómica de una sola célula utilizando atlas de referencia. Nat Commun. 2021;12:2965. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Szabo PA, Levitin HM, Miron M, Snyder ME, Senda T, Yuan J, et al. La transcriptómica de una sola célula de las células T humanas revela firmas de tejido y activación en la salud y la enfermedad. Nat Commun. 2019;10:4706. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Jin S, Guerrero-Juárez CF, Zhang L, Chang I, Ramos R, Kuan C, et al. Inferencia y análisis de la comunicación entre células utilizando CellChat. Nat Commun. 2021;12:1 2021;12:1–20. Artículo
Google Scholar
Wang Y, Wang R, Zhang S, Song S, Jiang C, Han G, et al. iTALK: un paquete R para caracterizar e ilustrar la comunicación intercelular. Preprint en https://doi.org/10.1101/507871 2019. Zhang N, Czepielewski RS, Jarjour NN, Erlich EC, Esaulova E, Saunders BT, et al. La expresión del factor V por los macrófagos residentes aumenta la defensa del huésped en la cavidad peritoneal. J Exp Med. 2019;216:1291–300. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Zhu Y, Sun X, Tan S, Luo C, Zhou J, Zhang S, et al. La firma génica relacionada con los macrófagos M2 en la rinosinusitis crónica con pólipos nasales. Front Immunol. 2022;13:1047930. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Zhao Y, Xiong Z, Lechner EJ, Klenotic PA, Hamburg BJ, Hulver M, et al. La trombospondina-1 desencadena la producción de IL-10 por los macrófagos y promueve la resolución de la lesión pulmonar experimental. Mucosal Immunol. 2014;7:440–8. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Chauhan D, Bartok E, Gaidt MM, Bock FJ, Herrmann J, Seeger JM, et al. La apoptosis inducida por BAX/BAK da como resultado la maduración de IL-1β dependiente de caspasa-8 en los macrófagos. Cell Rep. 2018;25:2354–68. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Marisa L, de Reynies A, Duval A, Selves J, Gaub MP, Vescovo L, et al. Clasificación de la expresión génica del cáncer de colon en subtipos moleculares: caracterización, validación y valor pronóstico. PLoS Med. 2013;10:e1001453. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Crowell HL, Ruano I, Hu Z, Hong Y, Caratù G, Piessevaux H, et al. Trazado de la transformación de la malignidad del cáncer colorrectal desde la escala celular hasta la tisular. Preprint en https://doi.org/10.1101/2025.06.23.660674 2025. Linardou H, Dahabreh IJ, Kanaloupiti D, Siannis F, Bafaloukos D, Kosmidis P, et al. Evaluación de las mutaciones somáticas de k-RAS como un mecanismo asociado con la resistencia a los agentes dirigidos a EGFR: una revisión sistemática y un metaanálisis de estudios en cáncer de pulmón no microcítico avanzado y cáncer colorrectal metastásico. Lancet Oncol. 2008;9:962–72. Artículo
CAS
PubMed
Google Scholar
Bied M, Ho WW, Ginhoux F, Bleriot C. Funciones de los macrófagos en el desarrollo tumoral: una perspectiva espacio-temporal. Cell Mol Immunol. 2023;20:983–92. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrófagos como herramientas y objetivos en la terapia contra el cáncer. Nat Rev Drug Discov. 2022;21:799–820. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Peng J, Sun B, Chen C, Zhou J, Chen Y, Chen H, et al. La secuenciación de ARN de una sola célula destaca la heterogeneidad intratumoral y la progresión maligna en el adenocarcinoma ductal pancreático. Cell Res. 2019;29:725–38. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Azizi E, Carr AJ, Plitas G, Cornish AE, Konopacki C, Prabhakaran S, et al. Mapa de una sola célula de diversos fenotipos inmunitarios en el microambiente tumoral de la mama. Cell. 2018;174:1293–308. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Le K, Sun J, Ghaemmaghami J, Smith MR, Ip WKE, Phillips T, et al. El bloqueo de CCR1 induce un cambio fenotípico en los macrófagos y desencadena una actividad antilinfoma favorable. Blood Adv. 2023;7:3952–67. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Liu X, Qin J, Nie J, Gao R, Hu S, Sun H, et al. Los fibroblastos asociados al cáncer ANGPTL2+ y los macrófagos SPP1+ son aceleradores de la metástasis del cáncer colorrectal. Front Immunol. 2023;14:1185208. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Sathe A, Mason K, Grimes SM, Zhou Z, Lau BT, Bai X, et al. Las metástasis del cáncer colorrectal en el hígado establecen una red inmunosupresora espacial entre los macrófagos SPP1+ asociados al tumor y los fibroblastos. Clin Cancer Res. 2023;29:244–60. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Bill R, Wirapati P, Messemaker M, Roh W, Zitti B, Duval F, et al. La polaridad de los macrófagos CXCL9:SPP1 identifica una red de programas celulares que controlan los cánceres humanos. Science. 2023;381:515–24. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Moon JW, Kong S, Kim BS, Kim HJ, Lim H, Noh K, et al. IFNgamma induce la sobreexpresión de PD-L1 por la señalización JAK2/STAT1/IRF-1 en el carcinoma gástrico positivo para EBV. Sci Rep. 2017;7:17810. Artículo
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Ivashkiv N, Ivashkiv V. IFNgamma: regulación de la inmunidad, el metabolismo, la enfermedad y la inmunoterapia contra el cáncer. Nat Rev Immunol. 2018;18:545–58. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Chang Q, Bournazou E, Sansone P, Berishaj M, Gao SP, Daly L, et al. El circuito de retroalimentación IL-6/JAK/Stat3 impulsa la tumorigénesis y la metástasis. Neoplasia. 2013;15:848–62. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Kortylewski M, Xin H, Kujawski M, Lee H, Liu Y, Harris T, et al. Regulación del equilibrio IL-23 y IL-12 por la señalización de Stat3 en el microambiente tumoral. Cancer Cell. 2009;15:114–23. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central
Google Scholar
Pathria P, Gotthardt D, Prchal-Murphy M, Putz E, Holcmann M, Schlederer M, et al. La STAT3 mieloide promueve la formación de cáncer colorrectal asociado a colitis en ratones. Oncoimmunology. 2015;4:e998529. Artículo
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Rahmani M, Nkwocha J, Hawkins E, Pei X, Parker RE, Kmieciak M, et al. El cotargeting de BCL-2 y PI3K induce la apoptosis mitocondrial dependiente de BAX en células de LMA. Cancer Res. 2018;78:3075–86. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Sahin E, Haubenwallner S, Kuttke M, Kollmann I, Halfmann A, Dohnal AM, et al. La PTEN de los macrófagos regula la expresión y secreción de arginasa I, modulando las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. J Immunol. 2014;193:1717–27. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Kaneda MM, Messer KS, Ralainirina N, Li H, Leem CJ, Gorjestani S, et al. PI3Kgamma es un interruptor molecular que controla la supresión inmunitaria. Nature. 2016;539:437–42. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Lian G, Chen S, Ouyang M, Li F, Chen L, Yang J. Las células de cáncer de colon secretan EGF para promover la polarización M2 de los TAM a través de la vía EGFR/PI3K/AKT/mTOR. Technol Cancer Res Treat. 2019;18:1078116716. Artículo

Google Scholar
Wu J, Jiang L, Wang S, Peng L, Zhang R, Liu ZTGF. beta1 promueve la polarización de macrófagos de tipo M2 y activa la vía de señalización PI3K/mTOR al inhibir ISG20 para sensibilizar el cáncer de ovario a la cisplatina. Int Immunopharmacol. 2024;134:112235. Artículo
CAS
PubMed

Google Scholar
Cao LL, Kagan JC. Dirigirse a las vías de la inmunidad innata para la inmunoterapia del cáncer. Immunity. 2023;56:2206–17. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Zhang X, Liu X, Zhou W, Du Q, Yang M, Ding Y, et al. El bloqueo del eje IDO-quinurenina-AhR mejoró el cáncer de colon asociado a colitis al inhibir la tolerancia inmunitaria. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2021;12:1179–99. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Hashimoto M, Kojima Y, Sakamoto T, Ozato Y, Nakano Y, Abe T, et al. El análisis de colocalización espacial y unicelular revela un entorno inmunosupresor mediado por MDK con células T reguladoras en la carcinogénesis del cáncer colorrectal. EBioMedicine. 2024;103:105102. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Mei Y, Xiao W, Hu H, Lu G, Chen L, Sun Z, et al. Los análisis unicelulares revelan un microambiente tumoral supresor del cáncer colorrectal humano. Clin Transl Med. 2021;11:e422. Kersten K, Hu KH, Combes AJ, Samad B, Harwin T, Ray A, et al. La codependencia espacio-temporal entre macrófagos y células T CD8+ agotadas en el cáncer. Cancer Cell. 2022;40:624–38. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Mazet JM, Mahale JN, Tong O, Watson RA, Lechuga-Vieco AV, Pirgova G, et al. La señalización de IFNgamma en las células T citotóxicas restringe las respuestas antitumorales al inhibir el mantenimiento y la diversidad de las células T similares a las células madre intratumorales. Nat Commun. 2023;14:321. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Omatsu M, Nakanishi Y, Iwane K, Aoyama N, Duran A, Muta Y, et al. Las células mononucleares infiltrantes tumorales productoras de THBS1 contribuyen a la inmunosupresión y la metástasis en el cáncer colorrectal. Nat Commun. 2023;14:5534. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Natarajan A, Wagner B, Sibilia M. El receptor del EGF es necesario para una regeneración hepática eficiente. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:17081–6. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Clausen BE, Burkhardt C, Reith W, Renkawitz R, Förster I. Dirigirse a genes de forma condicional en macrófagos y granulocitos utilizando ratones LysMcre. Transgenic Res. 1999;8:265–77. Artículo
CAS
PubMed

Google Scholar
Caton ML, Smith-Raska MR, Reizis B. La señalización Notch-RBP-J controla la homeostasis de las células dendríticas CD8+ en el bazo. J Exp Med. 2007;204:1653–64. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Zhang X, Goncalves R, Mosser DM. El aislamiento y la caracterización de macrófagos murinos. Curr Protoc Immunol. 2008;Chapter 14:11–4. Google Scholar
Linder M, Glitzner E, Srivatsa S, Bakiri L, Matsuoka K, Shahrouzi P, et al. El EGFR es necesario para el desarrollo de tumores óseos dependiente de FOS a través de la señalización RSK2/CREB. EMBO Mol Med. 2018;10:e9408. Barkas N, Petukhov V, Kharchenko P, Steiger S, Rydbirk R. Biederstedt E pagoda2: análisis de células individuales y expresión diferencial. R package version 1.0.12. 2021. Stuart T, Butler A, Hoffman P, Hafemeister C, Papalexi E, Mauck WMR, et al. Integración integral de datos de células individuales. Cell. 2019;177:1888–902. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Becht E, McInnes L, Healy J, Dutertre C, Kwok IWH, Ng LG, et al. Reducción de dimensionalidad para la visualización de datos de células individuales utilizando UMAP. Nat Biotechnol. 2019;37:38–44. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, et al. limma potencia los análisis de expresión diferencial para datos de secuenciación de ARN y microarrays. Nucleic Acids Res. 2015;43:e47. Artículo
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Hochberg Y, Benjamini Y. Procedimientos más potentes para pruebas de significación múltiple. Stat Med. 1990;9:811–8. Artículo
CAS
PubMed

Google Scholar
Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: análisis de variación del conjunto de genes para datos de microarrays y secuenciación de ARN. BMC Bioinforma. 2013;14:7. Artículo

Google Scholar
Liberzon A, Birger C, Thorvaldsdottir H, Ghandi M, Mesirov JP, Tamayo P. La base de datos de firmas moleculares (MSigDB) y la colección de conjuntos de genes característicos. Cell Syst. 2015;1:417–25. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Muller T, Kalxdorf M, Longuespee R, Kazdal DN, Stenzinger A, Krijgsveld J. Preparación automatizada de muestras con SP3 para proteómica clínica de bajo rendimiento. Mol Syst Biol. 2020;16:e9111. Artículo
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Galaxy Community. La plataforma Galaxy para análisis de datos accesibles, reproducibles y colaborativos: actualización de 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52:W83–94. Artículo

Google Scholar
Law CW, Chen Y, Shi W, Smyth GK. voom: pesos de precisión que desbloquean herramientas de análisis de modelos lineales para recuentos de secuenciación de ARN. Genome Biol. 2014;15:R29. Artículo
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Lee J, Kim J, Chu HBK, Oh S, Kang S, Lee S, et al. Análisis integral de la secuenciación de ARN del cáncer colorrectal en una cohorte coreana. Mol Cells. 2024;47:100033. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Roelands J, Kuppen PJK, Ahmed EI, Mall R, Masoodi T, Singh P, et al. Un atlas integrado del tumor, el sistema inmunitario y el microbioma del cáncer de colon. Nat Med. 2023;29:1273–86. Artículo
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar
Viechtbauer W. Realización de metaanálisis en R con el paquete metafor. J Stat Softw. 2010;36:1–48. Agradecimientos Nos gustaría agradecer a Martina Hammer y al personal del Departamento de Investigación Biomédica de la Universidad Médica de Viena por el mantenimiento de las colonias de ratones. Estamos agradecidos a Christine Tuppy, Marija Veljanoska y Luise Bellach por su ayuda con la genotipificación y a Alexandra Bogusch, Bilge Göcen-Oguz, Lilyana Mireva y Temenuschka Baykuscheva-Gentscheva por su asistencia técnica. Agradecemos al servicio de secuenciación biomédica (BSF) de la Universidad Médica de Viena y al Centro de Medicina Molecular de la Academia Austriaca de Ciencias por su asistencia con la secuenciación de ARN de células individuales. Estamos agradecidos a Michael Bergmann del Departamento de Cirugía General de la Universidad Médica de Viena por proporcionar secciones de tejido de CRC humano. También agradecemos el excelente apoyo de Gerald Timelthaler y Dominik Kirchhofer del Servicio de Microscopía e Imagen, así como la gran ayuda del servicio de citometría de flujo del Centro de Investigación del Cáncer y la Universidad Médica de Viena. Nos gustaría agradecer a Yu Yang de la Facultad de Medicina Li Ka Shing de la Universidad de Hong Kong por su apoyo estadístico con el análisis multivariante. Agradecemos a Thomas Bauer por su ayuda con el resumen gráfico. Financiación Este trabajo fue apoyado por subvenciones obtenidas por MS: la beca ERC Advanced (ERC-2015 AdG TNT-Tumors 694883) del Consejo Europeo de Investigación (ERC), el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie No 766214 (META-CAN), el Fondo de Ciencia Austriaco FWF, el programa DK-PhD W1212 "Inflamación e Inmunidad" y DocFunds DOC 188 "SHIELD". DK recibió además el apoyo del Fondo de Investigación del Cáncer Fellinger y del Fondo de la Ciudad de Viena para la Investigación Interdisciplinaria Innovadora del Cáncer. El trabajo de AN recibió además el apoyo de una subvención del Centro Integral del Cáncer. MF recibió el apoyo de una subvención especial de investigación (SFB) del Fondo de Ciencia Austriaco (FWF) – SFB-F6103. El trabajo de UK recibió el apoyo del programa Horizonte Europa de la Unión Europea (FOR 5146) a través de la red ERC ARTEMIS (acuerdo de subvención No. 101136299). UK recibió además el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (BMBF) a través del Centro Alemán para la Investigación del Pulmón (DZL 3.0: 82DZL004B4; DZL 4.0: 82DZL004C4), las redes MSCoreSys SMART-CARE (031L0212B) y SMART-CARE2 (16LW0234), así como las redes LiSyM-Cancer SMART-NAFLD (031L0256A) y C-TIP-HCC (031L0257C). Financiación de acceso abierto proporcionada por la Universidad Médica de Viena. Información del autor Notas del autor Estos autores contribuyeron por igual: Ourania Fari, Angelika Neuhofer. Autores y afiliaciones Centro de Investigación del Cáncer, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria Ourania Fari, Angelika Neuhofer, Martin Holcmann, Tatiana Chontorotzea, Iros Barozzi, Thomas Mohr, Bernadette Blauensteiner, Dana Krauß, Yu-Tian Xiao y Maria Sibilia Centro Integral del Cáncer, Universidad Médica y Hospital General, Viena, Austria Ourania Fari, Angelika Neuhofer, Martin Holcmann, Tatiana Chontorotzea, Iros Barozzi, Thomas Mohr, Bernadette Blauensteiner, Dana Krauß, Yu-Tian Xiao, Matthias Farlik y Maria Sibilia División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina 3, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria Michaela Lang División de Biología de Sistemas de la Señalización, Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Heidelberg, Alemania Dario L. Frey, Barbara Helm y Ursula Klingmüller Centro de Investigación del Pulmón Traslacional (TLRC), Centro Alemán para la Investigación del Pulmón (DZL), Heidelberg, Alemania Dario L. Frey, Barbara Helm y Ursula Klingmüller Departamento de Dermatología, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria Matthias Farlik Autores Ourania Fari Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Angelika Neuhofer Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Martin Holcmann Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Tatiana Chontorotzea Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Iros Barozzi Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Thomas Mohr Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Bernadette Blauensteiner Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Dana Krauß Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Yu-Tian Xiao Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Michaela Lang Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Dario L. Frey Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Barbara Helm Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Ursula Klingmüller Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Matthias Farlik Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Maria Sibilia Ver publicaciones del autor Buscar autor en: PubMed Google Scholar Contribuciones MS conceptualizó, diseñó y supervisó el proyecto y obtuvo la financiación necesaria para todo el estudio. OF, AN y MH realizaron la mayoría de los experimentos de laboratorio. TC realizó la mayoría de los análisis computacionales. OF, TM, IB, DK, YX y BB ayudaron con los análisis bioinformáticos de datos. MF fue fundamental en la preparación de las bibliotecas, proporcionando consejos y material experimental importantes. ML ayudó con los experimentos con ratones. DF, BH y UK realizaron los análisis proteómicos. MF, IB, UK y MH proporcionaron contribuciones intelectuales, metodología y/o reactivos. OF, AN y MH redactaron el borrador original junto con MF y MS, y todos los autores lo revisaron y editaron. Autor de correspondencia Correspondencia a Maria Sibilia. Declaraciones éticas

Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Aprobación ética
Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de animales de la Universidad de Medicina de Viena, de acuerdo con las políticas institucionales y las directrices federales. Los experimentos con animales se aprobaron por el Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Medicina de Viena y el Ministerio Federal de Ciencia e Investigación de Austria (número de licencia para animales BMBWF-66.009/0369-V/3b/2019). El material de CRC humano se obtuvo del Departamento de Cirugía General de la Universidad de Medicina de Viena (ID de aprobación ética 1580/2017). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos. Información adicional Nota del editor: Springer Nature se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales. Información complementaria Información complementaria (descargar DOCX) SupTab 1 (descargar XLSX) SupTab 2 (descargar XLSX) SupTab 3 (descargar XLSX) SupTab 4 (descargar XLSX) SupTab 5 (descargar XLSX) SupTab 6 (descargar XLSX) SupTab 7 (descargar XLSX) SupTab 8 (descargar XLSX) SupTab 9 (descargar XLSX) SupTab 10 (descargar XLSX) SupTab 11 (descargar XLSX) SupTab 12 (descargar XLSX) Derechos y permisos

Acceso abierto Este artículo se distribuye bajo una licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito adecuado al autor original y a la fuente, se proporcione un enlace a la licencia Creative Commons y se indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros incluidos en este artículo se incluyen en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito del material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Reproducciones y permisos Acerca de este artículo Citar este artículo Fari, O., Neuhofer, A., Holcmann, M. et al. La deleción de EGFR en las células mieloides reprograma el panorama inmunosupresor del cáncer colorrectal. Cell Death Differ (2026). https://doi.org/10.1038/s41418-026-01774-x Descargar cita Recibido: 09 de julio de 2025 Revisado: 29 de abril de 2026 Aceptado: 20 de mayo de 2026 Publicado: 02 de junio de 2026 Versión de registro: 02 de junio de 2026 DOI: https://doi.org/10.1038/s41418-026-01774-x