Descubrimiento de un nuevo y potente péptido dirigido a KRAS(G12V) con actividad antiproliferativa contra células de cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer en todo el mundo, lo que supone una importante carga para la salud pública^[1],^[2]. Como protooncogén clave, el homólogo del oncogén del sarcoma de rata de Kirsten (KRAS) impulsa la tumorigénesis y la progresión del CCR cuando está mutado^[3]. El codón 12 de KRAS es un punto caliente de mutación que está críticamente implicado en la tumorigénesis del CCR. Entre las mutaciones del codón 12 de KRAS, G12V (30%), G12C (11–13%) y G12D (35%) son las variantes más prevalentes en los cánceres humanos^[4],^[5]. Se han desarrollado múltiples inhibidores de moléculas pequeñas y péptidos dirigidos a KRASG12D[6–8]. Sin embargo, como la segunda mutación oncogénica de KRAS más frecuente, KRASG12V sigue siendo un objetivo terapéutico poco explorado^[9]. Por lo tanto, el desarrollo de agentes dirigidos a KRASG12V sigue siendo una necesidad insatisfecha importante.

Como GTPasa pequeña que pertenece a la superfamilia RAS, KRAS modula procesos celulares fundamentales, como la proliferación, la supervivencia y la migración^[10]. Sin embargo, KRASG12V difiere sustancialmente de KRASG12D tanto en estructura como en función oncogénica. La sustitución por valina en el codón 12 (G12V) genera un marcado impedimento estérico y un aumento de la hidrofobicidad, estabilizando una conformación proteica rígida y compacta que puede contribuir a una hidrólisis de GTP deficiente y a una menor capacidad de unión por los inhibidores disponibles actualmente^[11]. Por el contrario, el ácido aspártico polar y cargado negativamente en G12D proporciona una interfaz favorable para la unión de inhibidores, lo que apoya el desarrollo extensivo de inhibidores no covalentes y de agentes covalentes emergentes^[12],^[13]. KRASG12V es una mutación oncogénica de KRAS que se ha relacionado con la desregulación de la señalización de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), la alteración del control del ciclo celular relacionado con p21/CDKN1A (inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas 1 A) y la progresión del cáncer colorrectal^[11],[14–16]. Por lo tanto, las características estructurales y funcionales únicas de KRASG12V hacen que el desarrollo de nuevos e inhibidores potentes contra esta mutación sea particularmente desafiante.

Actualmente, las terapias en investigación para pacientes con cánceres con mutación KRASG12V incluyen inhibidores pan-KRAS (ON), degradadores pan-KRAS y agentes de ARN de interferencia (ARNi) selectivos para KRASG12V. Entre estos, RMC-5127 ejerce actividad inhibidora a través de la unión no covalente y un mecanismo de complejo ternario, con eficacia preclínica superior a la de otros agentes en fase clínica^[17]. La molécula pequeña ACBI3 degrada las proteínas KRAS que albergan 13 mutaciones diferentes mediante el reclutamiento de las ligasas de ubiquitina E3^[18]. El siRNA-EFTX-G12V silencia selectivamente la mutación KRASG12V, sin efecto sobre el KRAS de tipo salvaje u otras isoformas^[19]. Además, LY4066434 y BBO-11818 funcionan como inhibidores pan-KRAS^[20],^[21]. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores existentes muestran una estabilidad de unión deficiente hacia KRASG12V y muestran efectos inhibitorios modestos en modelos celulares. Hasta la fecha, ningún inhibidor dirigido específicamente a KRASG12V ha recibido la aprobación clínica^[9].

Muchas moléculas pequeñas enfrentan desafíos para lograr una unión de alta afinidad a KRASG12V, lo que crea obstáculos sustanciales en el desarrollo de fármacos dirigidos a KRASG12V^[22]. Además, la interfaz de unión de KRASG12V es plana y extensa, lo que dificulta una unión eficaz por parte de compuestos de moléculas pequeñas^[23]. En contraste, los péptidos exhiben una mayor flexibilidad estructural y pueden interactuar de manera más extensa con la interfaz de unión de KRASG12V, lo que potencialmente permite interacciones más amplias y estables con KRASG12V. Los estudios han demostrado que el péptido H-REV107 interactúa con KRASG12V e inhibe el crecimiento tumoral^[24]. En consecuencia, la construcción y el cribado de una biblioteca de péptidos basada en la secuencia H-REV107 representa una estrategia racional para identificar inhibidores dirigidos a KRASG12V. En este estudio, el péptido H-REV107 se utilizó como control.

El cribado virtual basado en el acoplamiento molecular puede mejorar significativamente la eficiencia y la precisión en la identificación de moléculas bioactivas a partir de bibliotecas de compuestos. Las puntuaciones de acoplamiento se pueden utilizar para priorizar los compuestos con perfiles de unión predichos favorables^[25],^[26]. En nuestro trabajo anterior, realizamos un cribado virtual basado en el acoplamiento molecular para identificar compuestos de alta afinidad dirigidos a proteínas específicas a partir de bibliotecas de compuestos^[27],^[28]. Además, previamente identificamos el péptido cíclico D-péptido NKTP-3 como un inhibidor de doble objetivo de NRP1 y KRASG12D en el cáncer de pulmón. Nuestras investigaciones previas sobre KRASG12D han proporcionado una base experimental sólida para este estudio^[7]. En este estudio, identificamos nuevos inhibidores peptídicos dirigidos a KRASG12V, entre los cuales el Péptido-1 exhibió la mejor afinidad de unión y potencia inhibitoria.

Materiales y métodos

Reactivos

Los péptidos 1-4, H-REV107 y el péptido revuelto se sintetizaron en GL Biochem (Shanghái, China). Las proteínas mutantes recombinantes de KRAS humano, que incluyen KRASG12V (núm. de catálogo ab268713), KRASG12D (núm. de catálogo ab314422), KRASG12C (núm. de catálogo ab314426), KRASG13D (núm. de catálogo ab315077) y KRASQ61H (núm. de catálogo ab315078), se compraron a Abcam (Cambridge, Reino Unido). Además, las proteínas mutantes recombinantes de KRAS humano, que incluyen KRASG12S (núm. de catálogo KRS-H5144) y KRASG12A (núm. de catálogo KRS-H51H1), se compraron a ACROBiosystems (Newark, DE, EE. UU.). El kit de etiquetado de proteínas RED-NHS de 2ª generación (núm. de catálogo MO-L011) y las capilares Monolith NT.115 (núm. de catálogo MO-K022) se compraron a NanoTemper Technologies (Múnich, Alemania). shControl y shKRASG12V se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores para ERK1 y p21 se sintetizaron en Sangon Biotech (Shanghái, China). El reactivo TRIzol (núm. de catálogo 15596026) se compró a Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad Thermo Fisher (núm. de catálogo 4374966) se compró a Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La solución de tinción FxCycle™ PI/RNase (núm. de catálogo F10797) se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Cultivo celular

Las líneas celulares SW480 (núm. de catálogo CCL-228, KRASG12V), SW620 (núm. de catálogo CCL-227, KRASG12V) y HT-29 (núm. de catálogo HTB-38, KRASWT) se compraron al American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Las células NCM460 (núm. de catálogo iCell-h373) se obtuvieron de Cellverse (Shanghái, China). Las células SNU-C4 (KRASG12V) se adquirieron del Banco de líneas celulares coreano (KCLB, Seúl, República de Corea). El medio RPMI 1640 y el medio DMEM se obtuvieron de Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd. (Nanjing, China). El suero fetal bovino (SFB) se compró a Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; núm. de catálogo 10099141). Opti-MEM™ se obtuvo de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). Las células SW480, SW620 y SNU-C4 se cultivaron en medio RPMI 1640, mientras que las células HT-29 y NCM460 se cultivaron en medio DMEM. Todos los medios se suplementaron con un 10% de suero fetal bovino (SFB), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2.

Construcción de la biblioteca de péptidos

La biblioteca de péptidos se construyó según los métodos descritos anteriormente^[7]. Se construyó una biblioteca de péptidos combinatoria utilizando el módulo QuaSAR-CombiGen en el software Molecular Operating Environment (MOE). La biblioteca, que consta de 59.319 péptidos, se generó mediante el ensamblaje de dos fragmentos de tripéptidos y un fragmento de tetrapéptido. La biblioteca virtual se exportó como una base de datos que contenía 59.319 péptidos. Posteriormente, se aplicó la minimización de energía en MOE para convertir las estructuras de péptidos bidimensionales (2D) en la base de datos en conformaciones tridimensionales (3D) optimizadas.

Cribado virtual

Se construyó la base de datos 3D que contenía 59.319 péptidos para el acoplamiento molecular. La estructura cristalina del complejo péptido KRASG12V–H-REV107 (ID de PDB: 7C41, resolución: 2,28 Å) se recuperó de la base de datos del Banco de proteínas (PDB). El complejo se refinó estructuralmente utilizando el módulo de preparación de la estructura, seguido de la minimización de energía. La base de datos de péptidos se acopló posteriormente en el bolsillo activo de KRASG12V utilizando el módulo de acoplamiento. Se realizó un acoplamiento de receptor rígido-ligando flexible contra KRASG12V. El acoplamiento molecular se realizó en dos etapas: colocación inicial mediante el algoritmo Triangle Matcher para generar las posturas de unión de los péptidos, seguida de un refinamiento de receptor rígido para optimizar las conformaciones del ligando. Se utilizaron las funciones de puntuación London dG y GBVI/WSA dG para priorizar rápidamente las posturas y calcular las energías libres de unión precisas. Finalmente, se seleccionaron los cuatro péptidos principales clasificados por la puntuación de acoplamiento para la evaluación in vitro, y también se registró la puntuación de acoplamiento del péptido de referencia H-REV107.

Ensayo de termoforesis a microescala

Se realizó la termoforesis a microescala (MST) para determinar la constante de disociación (Kd) de la unión de péptidos a KRASG12V cargado con GppNHp, evaluando así la afinidad del péptido en un estado similar al activo. La proteína recombinante humana KRASG12V se cargó con 200 μM de GppNHp utilizando un procedimiento de intercambio de nucleótidos mediado por 5 mM de EDTA para aproximar el estado similar al activo^[29],^[30]. Después del intercambio de nucleótidos, se añadieron 20 mM de MgCl2 para detener la reacción y estabilizar la unión del nucleótido. El exceso de nucleótido no unido se eliminó mediante ultrafiltración, y posteriormente se etiquetó fluorescentemente la proteína recombinante humana KRASG12V de 10 μM con el kit de etiquetado de proteínas RED-NHS de 2ª generación. Después de la purificación, el stock de proteínas etiquetadas era de 2 μM. Los péptidos 1-4, H-REV107 y el péptido revuelto se prepararon en tampón PBST (tampón fosfato con Tween-20). Se añadió DMSO para mejorar la solubilidad del péptido. Todos los péptidos se sometieron a una dilución serial de dos veces para generar 16 gradientes de concentración. Los péptidos diluidos se incubaron con la proteína KRASG12V etiquetada fluorescentemente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la incubación, las muestras se cargaron en capilares estándar y se realizaron mediciones MST en un instrumento Monolith NT.115 utilizando un modelo de unión 1:1 para KRASG12V y el péptido. Las mediciones se realizaron a 26 °C con una potencia LED del 100%, una potencia MST del 20% y un tiempo de adquisición de datos de 30 s. El procesamiento de datos y el análisis de afinidad se realizaron utilizando el software MO. Affinity Analysis (NanoTemper Technologies).

Simulaciones de dinámica molecular

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular (DM) para investigar la estabilidad y el comportamiento dinámico del complejo KRASG12V–Péptido-1 en condiciones fisiológicas. El complejo se parametrizó utilizando el campo de fuerza AMBER99SB-ILDN, se colocó en una caja de agua cúbica con una distancia mínima de 1,0 nm del soluto al borde de la caja y se solvató. Se añadieron iones de Na+ y Cl- para neutralizar el sistema. Posteriormente, el sistema se sometió a 5000 pasos de minimización de energía de descenso más pronunciado, seguida de una equilibración NVT y NPT secuencial. Se analizaron la desviación media cuadrática de la raíz (RMSD), la fluctuación media cuadrática de la raíz (RMSF), la estructura secundaria, el radio de giración (Rg) y el número de enlaces de hidrógeno, y se realizó el procesamiento de datos utilizando GraphPad Prism 9.5.

Cálculo MM/PBSA

Se utilizó MM/PBSA para calcular la energía libre de unión a partir de las trayectorias de simulación de DM equilibradas. El método MM/PBSA se aplicó según se describió anteriormente^[31]. Se realizó un análisis de descomposición de energía en los residuos del bolsillo de unión del complejo KRASG12V–Péptido-1, cuantificando las contribuciones de las interacciones de van der Waals, las interacciones electrostáticas, la energía libre de solvatación polar y la energía de solvatación no polar.

Paisaje de energía libre

Se realizó un análisis del paisaje de energía libre (FEL), según se describió previamente^[32]. Basándose en las trayectorias de simulación de dinámica molecular (DM) equilibradas, se seleccionaron RMSD y Rg como variables colectivas bidimensionales para construir el FEL bidimensional del complejo KRASG12V-Péptido-1, caracterizando así su distribución conformacional y estabilidad energética. Además, se generaron diagramas FEL 2D y 3D para identificar las conformaciones dominantes, las barreras energéticas y los estados de menor energía del complejo.

Ensayo de estabilidad sérica

Se evaluó la estabilidad sérica del Péptido-1 en suero humano al 25% (v/v). Esta condición de suero diluido se utilizó para mantener la actividad proteolítica derivada del suero, al tiempo que se minimiza la viscosidad de la muestra y la interferencia de la matriz durante el análisis HPLC posterior^[7]. Brevemente, se utilizó suero humano obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.; número de catálogo H4522) en este estudio. El suero se recogió mediante venopunción estándar en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se centrifugó a 3.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar el suero de las células sanguíneas. El sobrenadante de suero resultante se filtró, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Antes del ensayo de estabilidad, el suero congelado se descongeló, se diluyó al 25% (v/v) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) precalentada y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los componentes insolubles. A continuación, se añadió el Péptido-1 al sobrenadante recogido y se mezcló a fondo para alcanzar una concentración final de 5 μM. La mezcla se incubó a 37 °C bajo una agitación suave continua para simular las condiciones fisiológicas. En puntos temporales predeterminados (0, 30, 90, 180 y 360 minutos), se extrajeron alícuotas de 200 μL y se mezclaron inmediatamente con un volumen igual de acetonitrilo frío, seguido de incubación a 4 °C durante 30 minutos para garantizar una precipitación completa de las proteínas. A continuación, las muestras se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes clarificados se recogieron y se analizaron mediante HPLC de fase inversa, según se describió previamente^[33]. La cantidad restante de Péptido-1 en cada punto temporal se cuantificó en función del área del pico integrado correspondiente al péptido intacto. El porcentaje de Péptido-1 restante se calculó normalizando el área del pico en cada punto temporal con respecto al valor en 0,0 minutos (definido como 100% de péptido intacto).

Ensayo MTT

El ensayo MTT se realizó según se describió previamente^[34]. Se seleccionaron las líneas celulares SW480, SW620, SNU-C4, HT-29 y NCM460 para investigar la actividad antiproliferativa de los péptidos. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10³ células por pocillo en sus medios completos correspondientes. Los pocillos del borde se llenaron con PBS para evitar el efecto de borde. Después de la incubación a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 horas para alcanzar una confluencia del 70-80%, las células se trataron con 16 concentraciones seriadas diluidas de cada péptido durante 72 horas. A continuación, se añadieron 10 μL de 5 mg/mL de MTT a cada pocillo y se incubó durante 4 horas. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 μL de DMSO para disolver los cristales de formazán. Se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas, y los valores de IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism 9.5.

Ensayo NanoBRET celular para la interacción con KRASG12V

Se realizó el ensayo de interacción NanoBRET competitivo para evaluar la interacción celular del Péptido-1 con KRASG12V en células SW480. Brevemente, las células SW480 se sembraron en placas blancas opacas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 10⁴ a 2,0 × 10⁴ células por pocillo y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se transfectaron transitoriamente con un plásmido que codifica KRASG12V marcado con NanoLuc e se incubaron durante 18-24 horas. Para el ensayo de competición, las células se trataron con un trazador de Péptido-1 marcado fluorescentemente a una concentración fija de 0,3 μM y diluciones seriadas de Péptido-1 no marcado que oscilan entre 0,01 y 30 μM. Después de la incubación a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 horas, se añadió el sustrato NanoBRET según las instrucciones del fabricante, y se registraron las señales de emisión del donante y del aceptor utilizando un lector de luminiscencia de doble longitud de onda. La relación BRET se calculó como la relación de emisión aceptor/donante, seguida de la sustracción del fondo y la normalización^[35]. Se ajustaron las curvas de respuesta a dosis utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros para determinar el valor aparente de IC50.

Supresión de KRASG12V mediada por shRNA lentiviral

La transfección de shKRASG12V se realizó según se describió previamente^[7]. Se añadió polibreno al medio Opti-MEM™ para preparar una solución a una concentración final de 6 μg/mL. Las partículas lentivirales que codifican el shRNA dirigido a KRAS o el shRNA de control no dirigido se diluyeron por separado en medio Opti-MEM que contiene 6 μg/mL de polibreno. La suspensión lentiviral diluida se añadió a las células SW480. Después de 3 días de incubación, las líneas celulares transfectadas de forma estable se seleccionaron utilizando puromicina a una concentración final de 5 μg/mL. Además, la eficiencia de la supresión se verificó antes de los ensayos MTT posteriores. A continuación, las células seleccionadas se sembraron en placas de 96 pocillos, y sus valores de IC50 se determinaron mediante el ensayo MTT.

Ensayo de fosforilación de ERK1/2 mediante ELISA

Los niveles totales y fosforilados de ERK1/2 en las células SW480 se midieron utilizando el kit ELISA InstantOne para ERK1/ERK2 (total/fosfo) de múltiples especies (85-86012, Thermo Fisher Scientific). Brevemente, las células SW480 se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 70-80%. A continuación, las células se trataron con Péptido-1 (1 μM) o H-REV107 (10 μM) durante 12 horas, mientras que el grupo de control recibió el tratamiento con el vehículo correspondiente. Antes de la lisis celular, las células se estimularon con EGF (10 ng/mL) durante 10 minutos. Después del tratamiento, se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron suavemente con PBS y se lisaron con una mezcla de lisis celular 1× recién preparada durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave. A continuación, se añadieron los lisados celulares y el reactivo de anticuerpo a la placa de ensayo InstantOne según las instrucciones del fabricante y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el reactivo de detección durante 10-30 minutos, seguido de la solución de parada para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm con corrección a 650 nm. Se determinaron por separado las señales de ERK1/2 fosforilado y ERK1/2 total, y el nivel relativo de fosforilación de ERK1/2 se expresó como la relación p-ERK1/2/ERK1/2 total y se normalizó con respecto al grupo de control^[36].

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa

Se realizó RT-qPCR según se describió previamente^[37],^[38]. Después de que las células SW480 se trataran con Péptido-1 a 1 y 5 μM durante 24 horas, se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol, y se determinó su concentración y pureza. Posteriormente, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher). Utilizando el ADNc como plantilla, se realizó qPCR con cebadores específicos de genes en condiciones estándar de desnaturalización, hibridación y extensión. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: ERK1 (sentido, 5'-CCCATACCTGGAGCAGTATTATG-3'; antisentido, 5'-CTATTGTGTGCTCCCTCTCATC-3'), p21 (sentido, 5'-TTGGCCCAAGAGGTCGGCTCC-3'; antisentido, 5'-GCGGATTAGGGCTTCCTCTTG-3') y GAPDH (sentido, 5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'; antisentido, 5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'). Los niveles de ARNm de ERK1 y p21 se detectaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500. GAPDH se utilizó como gen de referencia interno, y los niveles relativos de expresión de ARNm de los genes diana se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCt.

Ensayo citométrico de flujo de la distribución del ciclo celular

La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo después del tratamiento con Péptido-1. Las células SW480 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con Péptido-1 a diferentes concentraciones (0,5, 2,5 y 12,5 μM) durante 24 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 5 minutos, se lavaron dos veces con PBS frío y se prepararon como suspensiones de células individuales. A continuación, las células se fijaron con etanol al 70% a -20 °C durante la noche. Después de la fijación, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con la solución de tinción PI/RNasa durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad^[39]. Por último, se midió el contenido de ADN celular mediante citometría de flujo, y se calcularon los porcentajes de células en las fases G0/G1, S y G2/M utilizando un software de análisis del ciclo celular.

Análisis estadístico

El procesamiento y la visualización de los datos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.5; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, y los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE). Las comparaciones estadísticas entre los grupos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideraron altamente significativas las diferencias con P < 0,001.

Reactivos

Los péptidos 1-4, H-REV107 y el péptido aleatorio se sintetizaron en GL Biochem (Shanghái, China). Las proteínas mutantes de KRAS recombinantes humanas, incluidas KRASG12V (número de catálogo ab268713), KRASG12D (número de catálogo ab314422), KRASG12C (número de catálogo ab314426), KRASG13D (número de catálogo ab315077) y KRASQ61H (número de catálogo ab315078), se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Además, las proteínas mutantes de KRAS recombinantes humanas, incluidas KRASG12S (número de catálogo KRS-H5144) y KRASG12A (número de catálogo KRS-H51H1), se adquirieron de ACROBiosystems (Newark, DE, EE. UU.). El kit de etiquetado de proteínas RED-NHS de 2ª generación (número de catálogo MO-L011) y las capilares Monolith NT.115 (número de catálogo MO-K022) se adquirieron de NanoTemper Technologies (Múnich, Alemania). shControl y shKRASG12V se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores para ERK1 y p21 se sintetizaron en Sangon Biotech (Shanghái, China). El reactivo TRIzol (número de catálogo 15596026) se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Thermo Fisher (número de catálogo 4374966) se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). La solución de tinción FxCycle™ PI/RNasa (número de catálogo F10797) se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Cultivo celular

Las líneas celulares SW480 (número de catálogo CCL-228, KRASG12V), SW620 (número de catálogo CCL-227, KRASG12V) y HT-29 (número de catálogo HTB-38, KRASWT) se adquirieron del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Las células NCM460 (número de catálogo iCell-h373) se obtuvieron de Cellverse (Shanghái, China). Las células SNU-C4 (KRASG12V) se adquirieron del Banco de Líneas Celulares Coreano (KCLB, Seúl, República de Corea). El medio RPMI 1640 y el medio DMEM se obtuvieron de Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd. (Nanjing, China). El suero fetal bovino (SFB) se adquirió de Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; número de catálogo 10099141). Opti-MEM™ se obtuvo de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). Las células SW480, SW620 y SNU-C4 se cultivaron en medio RPMI 1640, mientras que las células HT-29 y NCM460 se cultivaron en medio DMEM. Todos los medios se suplementaron con un 10% de suero fetal bovino (SFB), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.

Construcción de la biblioteca de péptidos

La biblioteca de péptidos se construyó según los métodos descritos previamente^[7]. Se construyó una biblioteca combinatoria de péptidos utilizando el módulo QuaSAR-CombiGen en el software Molecular Operating Environment (MOE). La biblioteca, que consta de 59.319 péptidos, se generó mediante el ensamblaje de dos fragmentos de tripéptidos y un fragmento de tetrapéptido. La biblioteca virtual se exportó como una base de datos que contenía 59.319 péptidos. Posteriormente, se aplicó la minimización de energía en MOE para convertir las estructuras de péptidos bidimensionales (2D) de la base de datos en conformaciones tridimensionales (3D) optimizadas.

Cribado virtual

Se construyó una base de datos 3D que contiene 59.319 péptidos para el acoplamiento molecular. La estructura cristalina del complejo péptido KRASG12V–H-REV107 (ID del PDB: 7C41, resolución: 2,28 Å) se obtuvo de la base de datos del Banco de Datos de Proteínas (PDB). El complejo se refinó estructuralmente utilizando el módulo de Preparación de la Estructura, seguido de la minimización de la energía. Luego, la base de datos de péptidos se acopló al bolsillo activo de KRASG12V utilizando el módulo de Acoplamiento. Se realizó un acoplamiento de receptor rígido-ligando flexible contra KRASG12V. El acoplamiento molecular se realizó en dos etapas: colocación inicial mediante el algoritmo Triangle Matcher para generar las posibles conformaciones de unión de los péptidos, seguido del refinamiento de Receptor Rígido para optimizar las conformaciones del ligando. Se utilizaron las funciones de puntuación London dG y GBVI/WSA dG para priorizar rápidamente las conformaciones y calcular las energías libres de unión precisas, respectivamente. Finalmente, se seleccionaron los cuatro péptidos principales clasificados por la puntuación de acoplamiento para la evaluación in vitro, y también se registró la puntuación de acoplamiento del péptido de referencia H-REV107.

Ensayo de termoforesis a microescala

Se realizó termoforesis a microescala (MST) para determinar la constante de disociación (Kd) de la unión del péptido a KRASG12V cargado con GppNHp, evaluando así la afinidad del péptido en un estado de unión a nucleótidos similar al activo. La proteína recombinante humana KRASG12V se cargó con 200 μM de GppNHp utilizando un procedimiento de intercambio de nucleótidos mediado por 5 mM de EDTA para aproximar el estado de unión a nucleótidos similar al activo ^[29], ^[30]. Después del intercambio de nucleótidos, se añadieron 20 mM de MgCl2 para detener la reacción y estabilizar la unión del nucleótido. El exceso de nucleótido no unido se eliminó mediante ultrafiltración y, posteriormente, la proteína recombinante humana KRASG12V cargada con 10 μM de GppNHp se etiquetó fluorescentemente utilizando el kit de etiquetado de proteínas RED-NHS de 2ª generación. Después de la purificación, la concentración del stock de proteínas etiquetadas fue de 2 μM. Los péptidos 1-4, H-REV107 y el péptido aleatorio se prepararon en tampón PBST (tampón fosfato con Tween-20). Se añadió DMSO para mejorar la solubilidad del péptido. Todos los péptidos se sometieron a una dilución serial de dos veces para generar 16 gradientes de concentración. Los péptidos diluidos se incubaron con la proteína KRASG12V etiquetada fluorescentemente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la incubación, las muestras se cargaron en capilares estándar y se realizaron las mediciones de MST en un instrumento Monolith NT.115 utilizando un modelo de unión 1:1 para KRASG12V y el péptido. Las mediciones se realizaron a 26 °C con una potencia del LED del 100%, una potencia de MST del 20% y un tiempo de adquisición de datos de 30 s. El procesamiento de datos y el análisis de la afinidad de unión se realizaron utilizando el software MO. Affinity Analysis (NanoTemper Technologies).

Simulaciones de dinámica molecular

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular (DM) para investigar la estabilidad y el comportamiento dinámico del complejo KRASG12V–Péptido-1 en condiciones fisiológicas. El complejo se parametrizó utilizando el campo de fuerza AMBER99SB-ILDN, se colocó en una caja cúbica de agua con una distancia mínima de 1,0 nm desde el soluto hasta el borde de la caja y se solvató. Se añadieron iones Na+ y Cl- para neutralizar el sistema. Posteriormente, el sistema se sometió a 5000 pasos de minimización de energía mediante el método de descenso más pronunciado, seguido de la equilibración secuencial NVT y NPT. Se analizaron la desviación media cuadrática de la raíz (RMSD), la fluctuación media cuadrática de la raíz (RMSF), la estructura secundaria, el radio de giración (Rg) y el número de enlaces de hidrógeno, y el procesamiento de datos se realizó utilizando GraphPad Prism 9.5.

Cálculo MM/PBSA

Se utilizó MM/PBSA para calcular la energía libre de unión a partir de las trayectorias de simulación de DM equilibradas. El método MM/PBSA se aplicó como se describió anteriormente ^[31]. Se realizó un análisis de descomposición de energía en los residuos del bolsillo de unión del complejo KRASG12V–Péptido-1, cuantificando las contribuciones de las interacciones de van der Waals, las interacciones electrostáticas, la energía libre de solvatación polar y la energía de solvatación no polar.

Paisaje de energía libre

Se realizó un análisis del paisaje de energía libre (PEL) como se describió anteriormente ^[32]. Basándose en las trayectorias de simulación de DM equilibradas, se seleccionaron la RMSD y el Rg como dos variables colectivas bidimensionales para construir el PEL bidimensional del complejo KRASG12V–Péptido-1, caracterizando así su distribución conformacional y su estabilidad energética. Además, se generaron diagramas de PEL 2D y 3D para identificar las conformaciones dominantes, las barreras de energía y los estados de menor energía del complejo.

Ensayo de estabilidad sérica

Se evaluó la estabilidad sérica del Péptido-1 en suero humano al 25% (v/v). Esta condición de suero diluido se utilizó para mantener la actividad proteolítica derivada del suero, al tiempo que se minimiza la viscosidad de la muestra y la interferencia de la matriz durante el análisis posterior por HPLC ^[7]. Brevemente, se utilizó suero humano obtenido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.; número de catálogo H4522) en este estudio. El suero se recogió por el proveedor utilizando venopunción estándar en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, se centrifugó a 3.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar el suero de las células sanguíneas. El sobrenadante de suero resultante se filtró, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Antes del ensayo de estabilidad, el suero congelado se descongeló, se diluyó al 25% (v/v) con tampón fosfato salino (PBS) precalentado a pH 7,4 y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los componentes insolubles. A continuación, se añadió el Péptido-1 al sobrenadante recogido y se mezcló a fondo para alcanzar una concentración final de 5 μM. La mezcla se incubó a 37 °C bajo una agitación suave continua para simular las condiciones fisiológicas. En puntos temporales predeterminados (0, 30, 90, 180 y 360 minutos), se extrajeron alícuotas de 200 μL y se mezclaron inmediatamente con un volumen igual de acetonitrilo frío, seguido de la incubación a 4 °C durante 30 minutos para garantizar la precipitación completa de las proteínas. A continuación, las muestras se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C, y los sobrenadantes clarificados se recogieron y se analizaron mediante HPLC de fase inversa como se describió anteriormente ^[33]. La cantidad restante de Péptido-1 en cada punto temporal se cuantificó en función del área del pico integrado correspondiente al péptido intacto. El porcentaje de Péptido-1 restante se calculó normalizando el área del pico en cada punto temporal con respecto al valor en 0,0 minutos (definido como el 100% del péptido intacto).

Ensayo MTT

Se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente ^[34]. Se seleccionaron las células SW480, SW620, SNU-C4, HT-29 y NCM460 para investigar la actividad antiproliferativa de los péptidos. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10³ células por pocillo en sus medios completos correspondientes. Los pocillos del borde se llenaron con PBS para evitar el efecto del borde. Después de la incubación a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 horas para alcanzar una confluencia del 70-80%, las células se trataron con 16 concentraciones seriadas diluidas de cada péptido durante 72 horas. A continuación, se añadieron 10 μL de 5 mg/mL de MTT a cada pocillo y se incubaron durante 4 horas. Se eliminó el sobrenadante y se añadió 100 μL de DMSO para disolver los cristales de formazán. Se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas, y los valores de IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism 9.5.

Ensayo de NanoBRET celular para la interacción con KRASG12V

Se realizó el ensayo competitivo de interacción con el objetivo NanoBRET para evaluar la interacción celular del Péptido-1 con KRASG12V en las células SW480. Brevemente, las células SW480 se sembraron en placas blancas opacas de 96 pocillos a una densidad de 1,5 × 10⁴ a 2,0 × 10⁴ células por pocillo y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se transfectaron transitoriamente con un plásmido que codifica KRASG12V etiquetado con NanoLuc y se incubaron durante 18-24 horas. Para el ensayo de competencia, las células se trataron con un trazador de Péptido-1 etiquetado fluorescentemente a una concentración fija de 0,3 μM y diluciones seriadas de Péptido-1 no etiquetado que oscilan entre 0,01 y 30 μM. Después de la incubación a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 horas, se añadió el sustrato NanoBRET según las instrucciones del fabricante, y se registraron las señales de emisión del donante y del aceptor utilizando un lector de luminiscencia de doble longitud de onda. La relación BRET se calculó como la relación de emisión aceptor/donante, seguida de la sustracción del fondo y la normalización ^[35]. Se ajustaron las curvas de respuesta a dosis utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros para determinar el valor aparente de IC50.

Supresión de KRASG12V mediada por shRNA lentiviral

La transfección de shKRASG12V se realizó como se describió anteriormente ^[7]. Se añadió polibreno al medio Opti-MEM™ para preparar una solución a una concentración final de 6 μg/mL. Las partículas lentivirales que codifican el shRNA dirigido a KRAS o el shRNA de control no dirigido se diluyeron por separado en medio Opti-MEM que contiene 6 μg/mL de polibreno. La suspensión lentiviral diluida se añadió a las células SW480. Después de 3 días de incubación, las líneas celulares transfectadas de forma estable se seleccionaron utilizando puromicina a una concentración final de 5 μg/mL. Además, la eficacia de la supresión se verificó antes de los ensayos MTT posteriores. A continuación, las células seleccionadas se sembraron en placas de 96 pocillos y se determinaron sus valores de IC50 mediante el ensayo MTT.

Ensayo de fosforilación de ERK1/2 mediante ELISA

Los niveles totales y fosforilados de ERK1/2 en las células SW480 se midieron utilizando el kit ELISA InstantOne para ERK1/ERK2 (total/fosfo) de múltiples especies (85-86012, Thermo Fisher Scientific). Brevemente, las células SW480 se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 70-80%. A continuación, las células se trataron con Péptido-1 (1 μM) o H-REV107 (10 μM) durante 12 horas, mientras que el grupo de control recibió el tratamiento con el vehículo correspondiente. Antes de la lisis celular, las células se estimularon con EGF (10 ng/mL) durante 10 minutos. Después del tratamiento, se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron suavemente con PBS y se lisaron con una mezcla de lisis celular 1× recién preparada durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave. A continuación, se añadieron lisados celulares y reactivo de anticuerpos a la placa de ensayo InstantOne según las instrucciones del fabricante y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el reactivo de detección durante 10-30 minutos, seguido de la solución de parada para detener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm con corrección a 650 nm. Se determinaron por separado las señales de ERK1/2 fosforilado y ERK1/2 total, y el nivel relativo de fosforilación de ERK1/2 se expresó como la relación p-ERK1/2/ERK1/2 total y se normalizó con respecto al grupo de control ^[36].

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa

Se realizó RT-qPCR como se describió anteriormente ^[37], ^[38]. Después de que las células SW480 se trataran con Péptido-1 a 1 y 5 μM durante 24 horas, se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol y se determinó su concentración y pureza. A continuación, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher). Utilizando el ADNc como plantilla, se realizó qPCR con cebadores específicos de genes en condiciones estándar de desnaturalización, hibridación y extensión. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: ERK1 (sentido, 5'-CCCATACCTGGAGCAGTATTATG-3'; antisentido, 5'-CTATTGTGTGCTCCCTCTCATC-3'), p21 (sentido, 5'-TTGGCCCAAGAGGTCGGCTCC-3'; antisentido, 5'-GCGGATTAGGGCTTCCTCTTG-3') y GAPDH (sentido, 5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'; antisentido, 5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'). Los niveles de ARNm de ERK1 y p21 se detectaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500. GAPDH se utilizó como gen de referencia interno, y los niveles relativos de expresión de ARNm de los genes diana se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCt.

Ensayo citométrico de flujo de la distribución del ciclo celular

La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo después del tratamiento con Péptido-1. Las células SW480 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con Péptido-1 a diferentes concentraciones (0,5, 2,5 y 12,5 μM) durante 24 horas. Después del tratamiento, las células se recogieron por centrifugación a 1.000 rpm durante 5 minutos, se lavaron dos veces con PBS frío y se prepararon como suspensiones de células individuales. A continuación, las células se fijaron con etanol al 70% a -20 °C durante la noche. Después de la fijación, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con la solución de tinción PI/RNasa durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad ^[39]. Finalmente, se midió el contenido de ADN celular mediante citometría de flujo y se calcularon los porcentajes de células en las fases G0/G1, S y G2/M utilizando un software de análisis del ciclo celular.

Análisis estadístico

El procesamiento y la visualización de los datos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.5; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico y los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE). Las comparaciones estadísticas entre los grupos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las diferencias con P < 0,001 se consideraron altamente significativas.

Resultados y discusión

Selección de péptidos dirigidos a KRASG12V basada en el acoplamiento molecular

Utilizando un flujo de trabajo integrado que combinaba el cribado computacional con la validación experimental, identificamos péptidos dirigidos a KRASG12V para su posterior evaluación experimental. Este flujo de trabajo incluyó el acoplamiento molecular, los ensayos de afinidad de unión, el análisis de la relación estructura-actividad, las simulaciones de dinámica molecular y la evaluación de la actividad celular in vitro. El flujo de trabajo general se muestra en la Figura 1. En primer lugar, se realizó un cribado virtual preliminar de la biblioteca de péptidos construida, que contenía 59.319 secuencias, contra KRASG12V utilizando el módulo Dock en MOE, y se calcularon las puntuaciones de acoplamiento para cada complejo KRASG12V-Péptido. En general, las puntuaciones de acoplamiento más bajas indican interacciones KRASG12V-Péptido más favorables y un potencial de unión previsto más fuerte. Posteriormente, los cuatro péptidos principales clasificados por la puntuación de acoplamiento (Péptidos 1-4), junto con el péptido de referencia co-cristalizado (H-REV107) de la estructura KRASG12V (ID PDB: 7C41), se seleccionaron para su posterior evaluación. Además, las secuencias de aminoácidos de los Péptidos 1-4 se enumeran en la Tabla 1. Como se muestra en la Figura 2, H-REV107 exhibió una puntuación de acoplamiento de -7,34 ± 0,39 kcal/mol, mientras que los Péptidos 1-4 mostraron consistentemente puntuaciones de acoplamiento más bajas. En particular, el Péptido-1 mostró la puntuación de acoplamiento más baja (-13,65 ± 0,77 kcal/mol), lo que indica una interacción más favorable con KRASG12V y un mayor potencial de unión previsto.

Validación de la unión y correlación con las predicciones del acoplamiento

Para evaluar aún más las afinidades de unión de los Péptidos 1-4 seleccionados por acoplamiento para KRASG12V cargado con GppNHp, se midieron los valores de Kd mediante MST en un estado ligado a un nucleótido de tipo activo, y los resultados se resumen en la Tabla 1. Los valores de Kd más bajos indican una mayor afinidad de unión entre el péptido y la proteína recombinante humana KRASG12V. H-REV107 exhibió un Kd de 2,57 ± 0,14 μM, mientras que los Péptidos 1-4 mostraron consistentemente valores de Kd más bajos que oscilaron entre 0,85 y 1,69 μM. Entre ellos, el Péptido-1 mostró el valor de Kd más bajo (0,85 ± 0,03 μM), lo que indica la mayor afinidad de unión para la proteína recombinante humana KRASG12V. Para evaluar aún más la especificidad de secuencia de la unión del Péptido-1 a KRASG12V, se generó un péptido aleatorio mediante la aleatorización de la secuencia de aminoácidos del Péptido-1. El péptido aleatorio mostró un valor de Kd de > 10 μM, lo que indica que la interacción del Péptido-1 con KRASG12V depende de su disposición específica de residuos en lugar de una simple composición de aminoácidos, lo que sugiere que no se trata de una unión no específica.

Para evaluar la relación entre las predicciones del acoplamiento y la afinidad de unión determinada experimentalmente, se realizó una regresión lineal entre las puntuaciones de acoplamiento medias y los valores de Kd de los Péptidos 1-4 y H-REV107 (Figura 3). Se observó una fuerte correlación positiva (R2 = 0,9611; Y = 0,2812X + 4,6699), lo que indica una buena concordancia entre la energía libre de unión prevista y la afinidad experimental. En particular, las puntuaciones de acoplamiento más favorables (valores más bajos) se asociaron con valores de Kd más bajos, lo que refleja una mayor afinidad de unión. Entre los péptidos probados, el Péptido-1 exhibió tanto la puntuación de acoplamiento más baja como el valor de Kd más bajo, lo que apoya la idea de que el Péptido-1 es el que presenta la mayor afinidad de unión entre los péptidos probados.

Análisis de la relación estructura-actividad

Dado que los Péptidos 1-4 presentan afinidades de unión medibles para la proteína recombinante humana KRASG12V, se analizaron sistemáticamente sus patrones de interacción en las posturas de acoplamiento óptimas. El análisis de interacción se centró principalmente en la formación de enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. Para ilustrar más claramente las características de la unión, la Tabla 2 resume los principales residuos de KRASG12V involucrados en la formación de enlaces de hidrógeno, el número correspondiente de enlaces de hidrógeno y los residuos que participan en las interacciones hidrofóbicas. Un análisis detallado de la interacción mostró que todos los Péptidos 1-4 formaron enlaces de hidrógeno con los residuos de la bolsa activa de KRASG12V Gly13, Ala59, Gln61, Asn85, Asn86, Asp92 y Lys117. En particular, el Péptido-1 y el Péptido-4 formaron cada uno enlaces de hidrógeno adicionales con Tyr32 y Tyr96, mientras que estos residuos participaron principalmente en interacciones hidrofóbicas con los Péptidos 2-3.

Las distintas características estructurales de los Péptidos 1-4 condujeron a diferencias en sus patrones de interacción, lo que puede subyacer a sus diferentes afinidades de unión para KRASG12V. Un análisis más profundo mostró que, en comparación con el Péptido-4, el Péptido-2 formó tres enlaces de hidrógeno con Asn85, lo que indica interacciones de unión más fuertes, lo que es consistente con su valor de Kd más bajo y su mayor afinidad. En relación con el Péptido-2, el Péptido-3 formó un enlace de hidrógeno adicional con Ala59, lo que sugiere una conformación de unión más estable, lo que está de acuerdo con su mayor afinidad observada experimentalmente. Entre los Péptidos 1-4, el Péptido-1 formó el mayor número de enlaces de hidrógeno con KRASG12V, lo que apoya la interacción general más fuerte. En conjunto, los patrones de interacción se correlacionaron estrechamente con las tendencias de afinidad de unión observadas.

Análisis de MD de la interacción KRASG12V-Péptido-1

Dado que el Péptido-1 presenta una alta afinidad de unión y una postura de acoplamiento estable hacia KRASG12V, se sometió a 50 ns de simulaciones de dinámica molecular para evaluar aún más la estabilidad del complejo KRASG12V-Péptido-1 en condiciones fisiológicas. El análisis de RMSD (Figura 5(A)) mostró que el RMSD de KRASG12V apo continuó aumentando durante la simulación, sin alcanzar un equilibrio claro. En contraste, el complejo KRASG12V-Péptido-1 se estabilizó después de aproximadamente 5 ns, con el RMSD permaneciendo alrededor de 0,2 nm. Estos resultados indican que el Péptido-1 se une de forma estable a KRASG12V y contribuye a la estabilidad conformacional del complejo durante la simulación. El análisis de Rg (Figura 5(B)) mostró que el complejo KRASG12V-Péptido-1 mantuvo un radio de gyración estable durante la simulación, con un valor de Rg de aproximadamente 1,56 nm, lo que indica una conformación compacta y estructuralmente estable. El análisis de la estructura secundaria (Figura 5(C)) reveló además que KRASG12V se compuso predominantemente de α-hélices, espirales y láminas β durante la simulación, sin transiciones obvias en los elementos de la estructura secundaria, lo que sugiere que la estructura secundaria general de la proteína permaneció estable. El análisis de RMSF (Figura 5(D)) mostró que la mayoría de los residuos de KRASG12V en el complejo exhibieron solo fluctuaciones limitadas, con valores de RMSF generalmente inferiores a 0,2 nm, lo que indica que la unión del Péptido-1 mejoró la estabilidad conformacional de la proteína. La mayor flexibilidad se limitó principalmente a las regiones terminales distales al sitio de unión. En particular, los residuos de la interfaz clave mostraron valores de RMSF inferiores a 0,1 nm, lo que sugiere aún más que el Péptido-1 restringió eficazmente las fluctuaciones conformacionales locales alrededor del sitio de unión.

Para dilucidar aún más el mecanismo de unión del Péptido-1 con KRASG12V, se realizó una descomposición de energía por residuos y un análisis de enlaces de hidrógeno para los residuos de la bolsa activa del complejo. Como se muestra en la Figura 5(E), los residuos clave, incluidos Asp92, Asn85, Asn86, Gly13, Lys117 y Tyr32, exhibieron contribuciones significativas a la energía libre de unión, con la mayoría de los valores inferiores a -1 kcal/mol, lo que indica su papel fundamental en la estabilización del complejo. La Figura 5(F) reveló además que la unión del Péptido-1 a KRASG12V se gobernó por una combinación de interacciones, principalmente contribuciones de Van der Waals y electrostáticas, donde las interacciones de Van der Waals proporcionaron la principal fuerza estabilizadora, mientras que las interacciones electrostáticas mejoraron la especificidad de la unión en los sitios clave. De manera consistente, la Figura 5(G) mostró que el complejo KRASG12V-Péptido-1 mantuvo un patrón de enlace de hidrógeno estable con una alta ocupación durante la simulación, lo que apoya aún más el papel esencial de la red de enlace de hidrógeno en el mantenimiento de la estabilidad conformacional del complejo. Estos hallazgos confirman aún más la coherencia entre el acoplamiento molecular, los datos de afinidad de unión y los resultados de la dinámica molecular, lo que revela que las interacciones de unión previstas se mantuvieron estables durante la simulación y podrían mantenerse en condiciones fisiológicas simuladas.

Análisis FEL del complejo KRASG12V-Péptido-1

Para evaluar aún más la estabilidad conformacional y el comportamiento dinámico del complejo desde una perspectiva energética, se realizó un análisis FEL en las trayectorias de dinámica molecular, como se muestra en la Figura 6. Tanto las distribuciones de energía libre bidimensionales como tridimensionales construidas utilizando RMSD y Rg exhibieron una región de baja energía bien definida, que se agrupó principalmente en valores de RMSD de aproximadamente 0,15-0,20 nm y valores de Rg de aproximadamente 1,56-1,57 nm, lo que indica la presencia de una conformación dominante estable durante la simulación. En particular, los valores de RMSD y Rg correspondientes al mínimo global fueron muy consistentes con los análisis conformacionales anteriores. En conjunto, los resultados de FEL corroboran aún más los hallazgos dinámicos desde una perspectiva termodinámica, lo que apoya la estabilidad conformacional favorable y el estado energéticamente preferido del complejo.

Estabilidad del Péptido-1 en suero humano

Dado el complejo KRASG12V-Péptido-1 estable observado durante la simulación de dinámica molecular de 50 ns, se evaluó aún más la estabilidad del Péptido-1 en suero humano. Como se muestra en la Figura 7, el Péptido-1 exhibió una disminución modesta y dependiente del tiempo en la proporción de péptido intacto restante. Más del 90% del Péptido-1 se retuvo durante los primeros 90 minutos, y aproximadamente el 80% permaneció después de 360 minutos de incubación. En particular, no se observó una fase de degradación rápida pronunciada durante el período probado. Estos resultados sugieren que el Péptido-1 posee una estabilidad in vitro favorable en suero humano, lo que apoya su posterior evaluación en ensayos basados en células.

Efectos antiproliferativos in vitro de los péptidos dirigidos a KRASG12V

Para evaluar la actividad in vitro antitumoral contra el cáncer colorrectal de los péptidos seleccionados, se midieron sus efectos inhibitorios sobre la proliferación de las células SW480 mediante el ensayo MTT, y los valores de IC50 correspondientes se resumen en la Tabla 3. Se utilizó H-REV107 como péptido de referencia y mostró un valor de IC50 de >10 μM. En comparación, los péptidos 1-4 mostraron una mayor actividad antiproliferativa. Entre ellos, el Péptido-1 mostró el efecto inhibitorio más potente, con un valor de IC50 de 0,92 ± 0,04 μM, lo que indica una actividad antiproliferativa superior. Por el contrario, el péptido aleatorio no logró alcanzar una inhibición del 50%, incluso a la concentración más alta probada (10 μM), lo que demuestra aún más que la actividad biológica del Péptido-1 depende de su secuencia de aminoácidos específica en lugar de efectos no específicos. Además, el análisis integrado de la energía libre de unión, la afinidad de unión y la actividad antiproliferativa de los Péptidos 1-4 (Figura 8) reveló una fuerte consistencia general entre estos parámetros, lo que apoya aún más la correlación entre las predicciones computacionales y los resultados experimentales.

Para evaluar aún más la interacción del Péptido-1 con KRASG12V a nivel celular, se realizó un ensayo de interacción con un objetivo celular NanoBRET. Como se muestra en la Figura 9, las concentraciones crecientes de Péptido-1 no etiquetado indujeron una disminución dependiente de la concentración en la señal BRET normalizada, lo que arrojó un valor de IC50 aparente de 1,91 ± 0,20 μM. Estos resultados respaldan la interacción del Péptido-1 con KRASG12V en las células SW480.

Para evaluar aún más la actividad antiproliferativa del Péptido-1, se evaluaron sus efectos sobre la proliferación de líneas celulares adicionales de cáncer colorrectal (SW620, SNU-C4 y HT-29) y células epiteliales colónicas normales (NCM460) mediante el ensayo MTT, como se resume en la Tabla 4. El Péptido-1 exhibió una pronunciada actividad antiproliferativa contra las células SW620 y SNU-C4 con mutación KRASG12V, con valores de IC50 de 1,06 ± 0,07 μM y 1,27 ± 0,09 μM, respectivamente. En contraste, el Péptido-1 no mostró una actividad antiproliferativa apreciable en las células HT-29 con KRASWT, con un valor de IC50 >10 μM. De manera similar, el péptido aleatorio no mostró una actividad evidente en esta línea celular. En comparación con su actividad en las células SW480 con mutación KRASG12V, el efecto marcadamente más débil del Péptido-1 en las células HT-29 apoya aún más que su actividad celular está preferentemente asociada con el contexto de mutación KRASG12V en lugar de una citotoxicidad amplia o no específica.

Además, su efecto inhibitorio sobre las células NCM460 fue notablemente más débil (IC50 >10 μM), lo que sugiere una menor citotoxicidad hacia las células epiteliales colónicas normales al tiempo que se mantiene una potente actividad contra las células tumorales. Además, el péptido aleatorio no mostró una actividad evidente en ninguna de las líneas celulares probadas, lo que demuestra aún más que el efecto antitumoral del Péptido-1 depende de su secuencia de aminoácidos específica y características estructurales en lugar de efectos no específicos. En conjunto, estos resultados indican que el Péptido-1 ejerce una potente y consistente actividad antiproliferativa contra múltiples líneas celulares de cáncer colorrectal al tiempo que muestra efectos inhibitorios más débiles sobre las células epiteliales colónicas normales, lo que apoya aún más su potencial como péptido antitumoral contra el cáncer colorrectal.

Actividad antiproliferativa dependiente de KRASG12V del péptido-1

Para validar aún más la dependencia del objetivo de la actividad antiproliferativa del Péptido-1, se estableció un modelo celular SW480 con reducción de KRASG12V (shKRASG12V) utilizando shRNA y se comparó con las células de control (shControl). La actividad antiproliferativa se evaluó mediante el ensayo MTT (Tabla 5). El Péptido-1 conservó una potente actividad inhibitoria en las células shControl (IC50 = 0,92 ± 0,04 μM), mientras que su actividad se redujo notablemente en las células shKRASG12V, lo que indica que su efecto antiproliferativo está estrechamente asociado con la expresión de KRASG12V. En contraste, el péptido aleatorio no mostró una actividad detectable en ninguno de los modelos celulares, lo que excluye la citotoxicidad no específica. En conjunto, estos resultados sugieren que la actividad antiproliferativa del Péptido-1 en las células SW480 está estrechamente asociada con la expresión de KRASG12V y es poco probable que resulte de una citotoxicidad no específica.

Cambios asociados al Péptido-1 en la señalización de ERK y la distribución del ciclo celular

Para explorar preliminarmente las respuestas celulares posteriores asociadas con el tratamiento con Péptido-1, se examinaron la fosforilación de ERK1/2, la expresión de mRNA de ERK1/p21 y la distribución del ciclo celular. Como se muestra en la Figura 10(A), la estimulación con EGF aumentó notablemente el nivel de p-ERK1/2/total ERK1/2. En comparación con el tratamiento con EGF solo, el cotratamiento con EGF y Péptido-1 redujo la fosforilación de ERK1/2. Esta reducción mostró una tendencia similar a la observada con el péptido de referencia positivo H-REV107, pero fue más pronunciada en las condiciones experimentales presentes. Estos resultados sugieren que el tratamiento con Péptido-1 se asocia con una reducción de la actividad de señalización relacionada con ERK inducida por EGF en las células SW480 con mutación KRASG12V.

Un análisis RT-qPCR adicional mostró que el tratamiento con Péptido-1 redujo la expresión de mRNA de ERK1 y aumentó la expresión de mRNA de p21, con una tendencia relacionada con la concentración (Figura 10B). En paralelo, el análisis del ciclo celular reveló un aumento gradual en la proporción de células en la fase G0/G1 con el aumento de las concentraciones de Péptido-1, acompañado de una disminución correspondiente en las poblaciones de las fases S y G2/M (Figura 10C). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el tratamiento con Péptido-1 se asocia con cambios en la señalización relacionada con ERK, la regulación al alza de p21 y la acumulación del ciclo celular en G0/G1, lo que proporciona evidencia preliminar de las respuestas posteriores relacionadas con su actividad antiproliferativa.

Selección de péptidos dirigidos a KRASG12V basada en el acoplamiento

Utilizando un flujo de trabajo integrado que combinó el cribado computacional con la validación experimental, identificamos péptidos dirigidos a KRASG12V para una evaluación experimental posterior. Este flujo de trabajo incluyó el acoplamiento molecular, los ensayos de afinidad de unión, el análisis de la relación estructura-actividad, las simulaciones de dinámica molecular y la evaluación de la actividad celular in vitro. El flujo de trabajo general se muestra en la Figura 1. Primero, se realizó un cribado virtual preliminar de la biblioteca de péptidos construida que contenía 59.319 secuencias contra KRASG12V utilizando el módulo Dock en MOE, y se calcularon las puntuaciones de acoplamiento para cada complejo KRASG12V-Péptido. En general, las puntuaciones de acoplamiento más bajas indican interacciones KRASG12V-Péptido más favorables y un potencial de unión predicho más fuerte. Posteriormente, los cuatro péptidos con la clasificación más alta según la puntuación de acoplamiento (Péptidos 1-4), junto con el péptido de referencia co-cristalizado (H-REV107) de la estructura KRASG12V (ID de PDB: 7C41) se seleccionaron para una evaluación adicional. Además, las secuencias de aminoácidos de los Péptidos 1-4 se enumeran en la Tabla 1. Como se muestra en la Figura 2, H-REV107 exhibió una puntuación de acoplamiento de -7,34 ± 0,39 kcal/mol, mientras que los Péptidos 1-4 mostraron consistentemente puntuaciones de acoplamiento más bajas. En particular, el Péptido-1 mostró la puntuación de acoplamiento más baja (-13,65 ± 0,77 kcal/mol), lo que indica una interacción más favorable con KRASG12V y un mayor potencial de unión predicho.

Validación de la unión y correlación con las predicciones de acoplamiento

Para evaluar aún más las afinidades de unión de los Péptidos 1-4 seleccionados por acoplamiento para GppNHp-KRASG12V, se midieron los valores de Kd mediante MST en un estado similar al de un nucleótido activo, y los resultados se resumen en la Tabla 1. Los valores de Kd más bajos indican una mayor afinidad de unión entre el péptido y la proteína recombinante humana KRASG12V. H-REV107 exhibió un Kd de 2,57 ± 0,14 μM, mientras que los Péptidos 1-4 mostraron valores de Kd consistentemente más bajos que oscilaron entre 0,85 y 1,69 μM. Entre ellos, el Péptido-1 mostró el valor de Kd más bajo (0,85 ± 0,03 μM), lo que indica la mayor afinidad de unión para la proteína recombinante humana KRASG12V. Para evaluar aún más la especificidad de la secuencia del Péptido-1 en la unión a KRASG12V, se generó un péptido aleatorio mediante la aleatorización de la secuencia de aminoácidos del Péptido-1. El péptido aleatorio mostró un valor de Kd de >10 μM, lo que indica que la interacción del Péptido-1 con KRASG12V depende de su secuencia de residuos específica en lugar de una simple composición de aminoácidos, lo que contradice la unión no específica.

Para evaluar la relación entre las predicciones de acoplamiento y la afinidad de unión determinada experimentalmente, se realizó una regresión lineal entre las puntuaciones de acoplamiento promedio y los valores de Kd de los Péptidos 1-4 y H-REV107 (Figura 3). Se observó una fuerte correlación positiva (R2 = 0,9611; Y = 0,2812X + 4,6699), lo que indica una buena concordancia entre la energía libre de unión predicha y la afinidad experimental. En particular, las puntuaciones de acoplamiento más favorables (valores más bajos) se asociaron con valores de Kd más bajos, lo que refleja una mayor afinidad de unión. Entre los péptidos probados, el Péptido-1 exhibió tanto la puntuación de acoplamiento más baja como el valor de Kd más bajo, lo que respalda al Péptido-1 como el mejor ligando entre los péptidos probados.

Para evaluar aún más la selectividad de unión del Péptido-1 hacia KRASG12V, también se evaluaron sus afinidades de unión para varias mutaciones representativas de KRAS, incluidas KRASG12D, KRASG12C, KRASG12A, KRASG12S, KRASG13D y KRASQ61H, mediante MST. Como se muestra en la Tabla S1, el Péptido-1 no mostró una unión apreciable a estas mutaciones de KRAS en las mismas condiciones experimentales, con valores de Kd mayores que 10 μM. Estos resultados indican que el Péptido-1 exhibió una unión débil o indetectable a las mutaciones de KRAS probadas dentro del rango del ensayo. Junto con su afinidad de unión para KRASG12V, estos datos sugieren que el Péptido-1 puede mostrar un perfil de unión preferencial hacia KRASG12V en lugar de interactuar ampliamente con múltiples mutaciones de KRAS.

Análisis de la relación estructura-actividad

Dado que se midieron las afinidades de unión de los Péptidos 1-4 para la proteína recombinante humana KRASG12V, se analizaron sistemáticamente sus patrones de interacción en las posturas de acoplamiento óptimas. El análisis de interacción se centró principalmente en los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. Para ilustrar más claramente las características de unión, la Tabla 2 resume los residuos clave de KRASG12V involucrados en la formación de enlaces de hidrógeno, el número correspondiente de enlaces de hidrógeno y los residuos que participan en las interacciones hidrofóbicas. Un análisis detallado de la interacción mostró que todos los Péptidos 1-4 formaron enlaces de hidrógeno con los residuos de la bolsa activa de KRASG12V Gly13, Ala59, Gln61, Asn85, Asn86, Asp92 y Lys117. En particular, el Péptido-1 y el Péptido-4 formaron cada uno enlaces de hidrógeno adicionales con Tyr32 y Tyr96, mientras que estos residuos participaron principalmente en interacciones hidrofóbicas con los Péptidos 2-3.

Las distintas características estructurales de los Péptidos 1-4 condujeron a diferencias en sus patrones de interacción, lo que puede subyacer a sus diferentes afinidades de unión para KRASG12V. Un análisis adicional mostró que, en comparación con el Péptido-4, el Péptido-2 formó tres enlaces de hidrógeno con Asn85, lo que indica interacciones de unión más fuertes, lo que es consistente con su valor de Kd más bajo y su mayor afinidad. En relación con el Péptido-2, el Péptido-3 formó un enlace de hidrógeno adicional con Ala59, lo que sugiere una conformación de unión más estable, en concordancia con su mayor afinidad observada experimentalmente. Entre los Péptidos 1-4, el Péptido-1 formó el mayor número de enlaces de hidrógeno con KRASG12V, lo que respalda la interacción general más fuerte. En conjunto, los patrones de interacción se correlacionaron estrechamente con las tendencias de afinidad de unión observadas.

Análisis de MD de la interacción KRASG12V-Péptido-1

Dado su alta afinidad de unión y su pose de acoplamiento estable con KRASG12V, el Péptido-1 se sometió a simulaciones de dinámica molecular de 50 ns para evaluar más a fondo la estabilidad del complejo KRASG12V-Péptido-1 en condiciones fisiológicas. El análisis de RMSD (Figura 5(A)) mostró que el RMSD de KRASG12V apo continuó aumentando a lo largo de la simulación, sin alcanzar un equilibrio claro. En contraste, el complejo KRASG12V-Péptido-1 se estabilizó después de aproximadamente 5 ns, con el RMSD permaneciendo alrededor de 0,2 nm. Estos resultados indican que el Péptido-1 se une de forma estable a KRASG12V y contribuye a la estabilidad conformacional del complejo a lo largo de la simulación. El análisis de Rg (Figura 5(B)) mostró que el complejo KRASG12V-Péptido-1 mantuvo un radio de gyración estable a lo largo de la simulación, con un valor de Rg de aproximadamente 1,56 nm, lo que indica una conformación compacta y estructuralmente estable. El análisis de la estructura secundaria (Figura 5(C)) reveló además que KRASG12V estaba compuesto predominantemente por α-hélices, espirales y láminas β durante la simulación, sin transiciones anormales obvias en los elementos de la estructura secundaria, lo que sugiere que la estructura secundaria general de la proteína permaneció estable. El análisis de RMSF (Figura 5(D)) mostró que la mayoría de los residuos de KRASG12V en el complejo exhibieron solo fluctuaciones limitadas, con valores de RMSF generalmente por debajo de 0,2 nm, lo que indica que la unión del Péptido-1 mejoró la estabilidad conformacional de la proteína. Una mayor flexibilidad se limitó principalmente a las regiones terminales distales al sitio de unión. En particular, los residuos clave de la interfaz mostraron todos valores de RMSF por debajo de 0,1 nm, lo que sugiere aún más que el Péptido-1 restringió eficazmente las fluctuaciones conformacionales locales alrededor del sitio de unión.

Para dilucidar aún más el mecanismo de unión del Péptido-1 con KRASG12V, se realizaron análisis de descomposición de energía por residuo y de enlaces de hidrógeno para los residuos de la bolsa activa del complejo. Como se muestra en la Figura 5(E), los residuos clave, incluidos Asp92, Asn85, Asn86, Gly13, Lys117 y Tyr32, exhibieron contribuciones significativas a la energía libre de unión, con la mayoría de los valores por debajo de -1 kcal/mol, lo que indica su papel fundamental en la estabilización del complejo. La Figura 5(F) reveló además que la unión del Péptido-1 a KRASG12V se rige por una combinación de interacciones, principalmente contribuciones de Van der Waals y electrostáticas, donde las interacciones de Van der Waals proporcionaron la principal fuerza estabilizadora, mientras que las interacciones electrostáticas mejoraron la especificidad de la unión en los sitios clave. De manera consistente, la Figura 5(G) mostró que el complejo KRASG12V-Péptido-1 mantuvo un patrón de enlace de hidrógeno estable con alta ocupación a lo largo de la simulación, lo que apoya aún más el papel esencial de la red de enlace de hidrógeno en el mantenimiento de la estabilidad conformacional del complejo. Estos hallazgos confirman aún más la coherencia entre el acoplamiento molecular, los datos de afinidad de unión y los resultados de la dinámica molecular, lo que revela que las interacciones de unión predichas permanecieron estables a lo largo de la simulación y podrían mantenerse en condiciones fisiológicas simuladas.

Análisis FEL del complejo KRASG12V-Péptido-1

Para evaluar aún más la estabilidad conformacional y el comportamiento dinámico del complejo desde una perspectiva energética, se realizó un análisis FEL en las trayectorias de dinámica molecular, como se muestra en la Figura 6. Tanto las distribuciones de energía libre bidimensionales como tridimensionales construidas utilizando RMSD y Rg exhibieron una región de baja energía bien definida, agrupada principalmente en valores de RMSD de aproximadamente 0,15-0,20 nm y valores de Rg de aproximadamente 1,56-1,57 nm, lo que indica la presencia de una conformación dominante estable durante la simulación. En particular, los valores de RMSD y Rg correspondientes al mínimo global fueron altamente consistentes con los análisis conformacionales anteriores. En conjunto, los resultados de FEL corroboran aún más los hallazgos dinámicos desde una perspectiva termodinámica, lo que respalda la estabilidad conformacional favorable y el estado energéticamente preferido del complejo.

Estabilidad del péptido-1 en suero humano

Dado el complejo KRASG12V-Péptido-1 estable observado durante la simulación de dinámica molecular de 50 ns, se evaluó aún más la estabilidad del Péptido-1 en suero humano. Como se muestra en la Figura 7, el Péptido-1 exhibió una disminución modesta y dependiente del tiempo en la proporción de péptido intacto restante. Se retuvo más del 90% del Péptido-1 durante los primeros 90 minutos, y aproximadamente el 80% permaneció después de 360 minutos de incubación. En particular, no se observó una fase de degradación rápida pronunciada durante el período probado. Estos resultados sugieren que el Péptido-1 posee una estabilidad in vitro favorable en suero humano, lo que respalda su evaluación adicional en ensayos basados en células.

Efectos antiproliferativos in vitro de los péptidos dirigidos a KRASG12V

Para evaluar la actividad antitumoral in vitro de los péptidos seleccionados, se midieron sus efectos inhibitorios sobre la proliferación de células SW480 mediante el ensayo MTT, y los valores de IC50 correspondientes se resumen en la Tabla 3. H-REV107 se utilizó como péptido de referencia y exhibió un valor de IC50 >10 μM. En comparación, los Péptidos 1-4 mostraron una actividad antiproliferativa más fuerte. Entre ellos, el Péptido-1 mostró el efecto inhibitorio más potente, con un valor de IC50 de 0,92 ± 0,04 μM, lo que indica una actividad antiproliferativa superior. Por el contrario, el péptido revuelto no logró alcanzar el 50% de inhibición incluso a la concentración probada más alta (10 μM), lo que demuestra aún más que la actividad biológica del Péptido-1 depende de su secuencia de aminoácidos específica en lugar de efectos no específicos. Además, el análisis integrado de la energía libre de unión, la afinidad de unión y la actividad antiproliferativa de los Péptidos 1-4 (Figura 8) reveló una fuerte coherencia general entre estos parámetros, lo que respalda aún más la correlación entre las predicciones computacionales y los resultados experimentales.

Para evaluar aún más la interacción del Péptido-1 con KRASG12V a nivel celular, se realizó un ensayo de interacción con el objetivo NanoBRET a nivel celular. Como se muestra en la Figura 9, las concentraciones crecientes de Péptido-1 no etiquetado indujeron una disminución dependiente de la concentración en la señal BRET normalizada, lo que produjo un valor de IC50 aparente de 1,91 ± 0,20 μM. Estos resultados respaldan la interacción del Péptido-1 con KRASG12V en las células SW480.

Para evaluar aún más la actividad antiproliferativa del Péptido-1, se evaluaron sus efectos sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer colorrectal adicionales (SW620, SNU-C4 y HT-29) y células epiteliales colónicas normales (NCM460) mediante el ensayo MTT, como se resume en la Tabla 4. El Péptido-1 exhibió una actividad antiproliferativa pronunciada contra las células SW620 y SNU-C4 mutadas en KRASG12V, con valores de IC50 de 1,06 ± 0,07 μM y 1,27 ± 0,09 μM, respectivamente. En contraste, el Péptido-1 no mostró una actividad antiproliferativa apreciable en las células HT-29 KRASWT, con un valor de IC50 >10 μM. De manera similar, el péptido revuelto no mostró una actividad obvia en esta línea celular. En comparación con su actividad en las células SW480 mutadas en KRASG12V, el efecto marcadamente más débil del Péptido-1 en las células HT-29 respalda aún más que su actividad celular está asociada preferentemente con el contexto mutado en KRASG12V en lugar de una citotoxicidad amplia o no específica.

Además, su efecto inhibitorio sobre las células NCM460 fue marcadamente más débil (IC50 >10 μM), lo que sugiere una menor citotoxicidad hacia las células epiteliales colónicas normales al tiempo que se mantiene una actividad potente contra las células tumorales. Además, el péptido revuelto no mostró una actividad obvia en ninguna de las líneas celulares probadas, lo que demuestra aún más que el efecto antitumoral del Péptido-1 depende de su secuencia de aminoácidos específica y características estructurales en lugar de efectos no específicos. En conjunto, estos resultados indican que el Péptido-1 ejerce una actividad antiproliferativa potente y consistente contra múltiples líneas celulares de cáncer colorrectal al tiempo que muestra efectos inhibitorios más débiles sobre las células epiteliales colónicas normales, lo que respalda aún más su potencial como péptido antitumoral.

Actividad antiproliferativa dependiente de KRASG12V del péptido-1

Para validar aún más la dependencia del objetivo de la actividad antiproliferativa del Péptido-1, se estableció un modelo celular SW480 con reducción de KRASG12V (shKRASG12V) utilizando shRNA y se comparó con las células de control (shControl). La actividad antiproliferativa se evaluó mediante el ensayo MTT (Tabla 5). El Péptido-1 conservó una actividad inhibitoria potente en las células shControl (IC50 = 0,92 ± 0,04 μM), mientras que su actividad se redujo notablemente en las células shKRASG12V, lo que indica que su efecto antiproliferativo está estrechamente asociado con la expresión de KRASG12V. Por el contrario, el péptido revuelto no mostró una actividad detectable en ninguno de los modelos celulares, lo que excluye la citotoxicidad no específica. En conjunto, estos resultados sugieren que la actividad antiproliferativa del Péptido-1 en las células SW480 está estrechamente asociada con la expresión de KRASG12V y es poco probable que resulte de una citotoxicidad no específica.

Cambios asociados con el Péptido-1 en la señalización de ERK y la distribución del ciclo celular

Para explorar preliminarmente las respuestas celulares posteriores asociadas con el tratamiento con Péptido-1, se examinaron la fosforilación de ERK1/2, la expresión de mRNA de ERK1/p21 y la distribución del ciclo celular. Como se muestra en la Figura 10(A), la estimulación con EGF aumentó marcadamente el nivel de p-ERK1/2/ERK1/2 total. En comparación con el tratamiento con EGF solo, el cotratamiento con EGF y Péptido-1 redujo la fosforilación de ERK1/2. Esta reducción mostró una tendencia similar a la observada con el péptido de referencia positivo H-REV107, pero fue más pronunciada en las condiciones experimentales presentes. Estos resultados sugieren que el tratamiento con Péptido-1 se asocia con una reducción de la actividad de señalización relacionada con ERK inducida por EGF en las células SW480 mutadas en KRASG12V.

Además, el análisis de RT-qPCR mostró que el tratamiento con Péptido-1 redujo la expresión de mRNA de ERK1 y aumentó la expresión de mRNA de p21, con una tendencia relacionada con la concentración (Figura 10B). En paralelo, el análisis del ciclo celular reveló un aumento gradual en la proporción de células en la fase G0/G1 con el aumento de las concentraciones de Péptido-1, acompañado de una disminución correspondiente en las poblaciones de las fases S y G2/M (Figura 10C). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el tratamiento con Péptido-1 se asocia con cambios en la señalización relacionada con ERK, la regulación al alza de p21 y la acumulación del ciclo celular en G0/G1, lo que proporciona evidencia preliminar de las respuestas posteriores relacionadas con su actividad antiproliferativa.

Conclusiones

KRASG12V es un impulsor oncogénico clínicamente relevante en el cáncer colorrectal, que contribuye sustancialmente a la progresión maligna a través de sus propiedades estructurales y funcionales únicas. A pesar de su alta prevalencia e importancia biológica, el desarrollo de inhibidores efectivos dirigidos a KRASG12V sigue siendo limitado, lo que destaca una necesidad insatisfecha crítica en el descubrimiento actual de fármacos contra el cáncer. En consecuencia, el desarrollo de inhibidores peptídicos basados en el andamio H-REV107 representa una estrategia racional para el direccionamiento de KRASG12V. Este estudio implementó una estrategia de cribado virtual basada en la estructura para identificar cuatro péptidos que se dirigen a KRASG12V de la biblioteca de péptidos que contiene 59.319 secuencias. Entre ellos, el Péptido-1 exhibió la puntuación de acoplamiento más favorable, lo que sugiere una unión prevista superior. Los ensayos MST validaron las afinidades de unión mejoradas de los cuatro péptidos hacia KRASG12V de tipo activo en relación con el péptido de referencia H-REV107, con el Péptido-1 que exhibió la interacción más fuerte. El acuerdo observado entre las puntuaciones de acoplamiento computacional y los valores de Kd derivados de MST respalda la utilidad de este flujo de trabajo de cribado para priorizar los péptidos que se unen a KRASG12V, mientras que el perfil de selectividad MST sugiere aún más que el Péptido-1 puede interactuar preferentemente con KRASG12V sobre otras mutaciones representativas de KRAS en las mismas condiciones del ensayo.

Los análisis estructurales y de dinámica molecular revelaron que las diferentes afinidades de unión entre los péptidos 1–4 se debieron principalmente a distintas redes de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas dentro del sitio activo de KRASG12V. El péptido 1 formó la interfaz de interacción más extensa y estable con los residuos críticos del sitio, y las simulaciones de dinámica molecular respaldaron la estabilidad conformacional del complejo KRASG12V–Péptido 1 en condiciones fisiológicas, caracterizadas por fluctuaciones de residuos restringidas, una compactación estructural preservada y un paisaje de energía libre bien definido y de baja energía en relación con el KRASG12V en forma libre (apo). La descomposición de la energía destacó las contribuciones cooperativas de las fuerzas de Van der Waals, las interacciones electrostáticas y los enlaces de hidrógeno persistentes a una unión estable y de alta afinidad.

El péptido 1 demostró una estabilidad in vitro favorable en suero humano, conservando más del 90% del péptido intacto en 90 minutos y aproximadamente el 80% después de 360 minutos, lo que respalda su idoneidad para la evaluación en ensayos celulares. En los ensayos celulares, el péptido 1 mostró la actividad antiproductiva más potente entre los péptidos 1–4 en las células SW480 y mantuvo una actividad constante en otras líneas celulares de cáncer colorrectal, al tiempo que exhibía un efecto inhibidor más débil sobre las células epiteliales normales del colon. El análisis celular NanoBRET respaldó la interacción intracelular del péptido 1 con KRASG12V en las células SW480. Además, el péptido 1 exhibió actividad antiproductiva asociada a KRASG12V en las células SW480, sin una citotoxicidad no específica aparente. El tratamiento con el péptido 1 se asoció con una reducción de la fosforilación de ERK1/2 inducida por EGF, la disminución de ERK1, el aumento de p21 y un aumento de la acumulación de células en la fase G0/G1 del ciclo celular. En conjunto, el péptido 1 exhibió una actividad antiproductiva apreciable en las células de cáncer colorrectal, posiblemente en asociación con la interacción con el objetivo intracelular KRASG12V, los cambios en la señalización relacionada con ERK y la alteración de la distribución del ciclo celular.