Mejora de la respuesta inmunoterapéutica en el cáncer colorrectal mediante un péptido tumoral que penetra en el tumor y se dirige a la neuropilina 1.

El cáncer colorrectal es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo (^[1]). Aunque los resultados clínicos han mejorado con importantes avances en las terapias sistémicas, incluidos los agentes citotóxicos, las terapias dirigidas a moléculas específicas y los inhibidores de los puntos de control inmunitario (ICI), el pronóstico sigue siendo desfavorable para los pacientes con enfermedad irresecable o metastásica. Uno de los principales desafíos en el tratamiento de los tumores sólidos, incluido el cáncer colorrectal, es la especificidad tumoral limitada y la escasa penetración intratumoral de los fármacos (^[2]). Estos factores impiden que el tratamiento sistémico alcance su máximo potencial y contribuyen a la resistencia terapéutica.

El péptido que penetra en el tumor iRGD (RGD internalizante), que se une a las integrinas αv y a la neuropilina 1 (NRP1), ha surgido como una estrategia prometedora para mejorar la administración intratumoral de los fármacos coadministrados (^[3]). El iRGD promueve la acumulación selectiva y la penetración profunda de los fármacos en el tejido tumoral a través de un proceso de múltiples etapas que implica la unión a la integrina, la escisión proteolítica que expone un motivo CendR y la transcytosis mediada por NRP1 (^[4]–^[6]). Su utilidad se ha demostrado ampliamente en varios modelos preclínicos, particularmente en combinación con agentes de quimioterapia citotóxica (^[7]–^[9]).

En los últimos años, los ICI, en particular los anticuerpos anti–proteína de muerte celular programada 1 (anti–PD-1) y anti–ligando de la proteína de muerte celular programada 1 (anti–PD-L1), han surgido como terapias innovadoras capaces de lograr una supervivencia a largo plazo en tipos de cáncer seleccionados. Sin embargo, en el cáncer colorrectal, el beneficio clínico de los ICI se limita en gran medida a los tumores con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), que representan solo un pequeño subconjunto de pacientes (^[10]–^[12]). A pesar de que los estudios clínicos emergentes sugieren que, en condiciones específicas, los cánceres colorrectales con microsatélites estables (MSS) también pueden responder a los ICI (^[13], ^[14]), la eficacia general de los ICI en esta población sigue siendo limitada, lo que destaca la necesidad de estrategias de combinación que puedan mejorar las respuestas terapéuticas.

Se espera que la actividad antitumoral de los ICI dependa, al menos en parte, de una disponibilidad adecuada dentro del microambiente tumoral, donde tiene lugar la modulación inmunitaria (^[15]). En los tumores sólidos, como el cáncer colorrectal, las características del microambiente tumoral que dificultan la regulación inmunitaria eficaz, como la vasculatura anormal y la densa arquitectura del estroma, también pueden limitar la distribución local de los anticuerpos terapéuticos y, por lo tanto, comprometer la eficacia del tratamiento. Desde esta perspectiva, el iRGD puede proporcionar un método potencial para mejorar la distribución intratumoral de las inmunoterapias basadas en anticuerpos. Por otro lado, un estudio reciente en cáncer gástrico informó que el tratamiento con iRGD facilitó la infiltración de linfocitos y mejoró la actividad antitumoral de las células T deficientes en PD-1 (^[16]), lo que indica que el iRGD también puede aumentar el acceso de las células inmunitarias a los tumores en ciertos contextos. No obstante, aún se desconoce si el iRGD puede mejorar la eficacia terapéutica de los ICI en el cáncer colorrectal.

La vía de penetración tumoral del iRGD está mediada por NRP1, que se asocia con la progresión tumoral y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer (^[17]–^[19]). Sin embargo, el perfil de expresión de NRP1 y su relevancia pronóstica en el cáncer colorrectal siguen siendo controvertidos, probablemente debido a la heterogeneidad metodológica y las variaciones en las cohortes de pacientes (^[20]–^[22]). Además, dado que NRP1 se expresa en múltiples compartimentos celulares dentro del microambiente tumoral (^[23], ^[24]), incluidos las células endoteliales, los fibroblastos y las células inmunitarias, es plausible que su función se extienda más allá de los mecanismos intrínsecos a las células tumorales.

En este estudio, investigamos si la administración concurrente de iRGD aumenta la eficacia terapéutica de un anticuerpo anti–PD-1 en modelos de ratón sinérgicos de cáncer colorrectal. Para dilucidar la contribución funcional de NRP1, utilizamos líneas celulares de cáncer colorrectal con deleción de NRP1 (KO) para evaluar la administración de fármacos y las respuestas al tratamiento in vivo. Además, evaluamos el perfil de expresión de NRP1 en los compartimentos epitelial y del estroma utilizando muestras de una cohorte homogénea de pacientes con cáncer colorrectal en estadio III que se sometieron a cirugía curativa. En conjunto, estos enfoques proporcionan información mecanicista sobre el papel de NRP1 en la regulación de la permeabilidad terapéutica y establecen una base para el desarrollo de estrategias de combinación basadas en iRGD para el tratamiento del cáncer colorrectal.

Materiales y métodos

Líneas celulares y reactivos

Las líneas celulares de cáncer de colon murino MC38 (RRID: CVCLB288) y CT26 (RRID: CVCL7254) fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Yoshiro Itatani (Universidad de Kioto). Las células se utilizaron en un número bajo de pasajes después de la descongelación. No se realizó la autenticación de la línea celular en este estudio, y todas las células se analizaron rutinariamente para detectar la contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección por PCR LookOut Mycoplasma (Sigma-Aldrich) y se confirmó que eran negativas.

Las células MC38 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Nacalai Tesque, 08459-65), y las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Nacalai Tesque, 30264-85), ambos suplementados con 10 % de suero fetal bovino (MP Biomedicals, 2917354H) y 1 % de penicilina/estreptomicina (FUJIFILM Wako, 168-23191) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2. Las células MC38-NRP1-KO se generaron utilizando el sistema CRISPR-Cas9 con un plásmido px458 (RRID: Addgene48138) que codifica un ARN guía dirigido al gen NRP1. Las células positivas para la proteína fluorescente verde se clasificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia, y los clones de una sola célula se expandieron y se validaron mediante Western blot para confirmar la deleción de NRP1. Como control, las células MC38 se transfectaron con un vector vacío no dirigido (MC38-EV). El péptido iRGD (acetil-CRGDKGPDC-NH2; LifeTein, LT216216) y el anticuerpo anti–PD-1 (Bio X Cell, BE0146, RRID: AB10949053) se utilizaron en este estudio.

Inmunoblotting

Los niveles de proteína NRP1 se evaluaron mediante inmunoblotting utilizando lisados de células MC38-NRP1-KO y MC38-EV. Las células se lisaron en tampón de SDS (1 mol/L de Tris-HCl pH 6,8, 10 % de SDS y 50 % de glicerol) que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas (Nacalai Tesque, 04080-11 y 07574-61). Los lisados se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore). Las membranas se bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque 03953-95) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con un anticuerpo primario anti-NRP1 (1:1000, Abcam, ab81321, RRID: AB1640739) a 4 °C y un anticuerpo secundario anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:500, Agilent, P0448, RRID: AB2617138) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La β-actina se utilizó como control de carga. Las señales se detectaron utilizando el sustrato Western Blotting Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific, 32132) y se visualizaron utilizando un sistema LAS-4000 (FUJIFILM).

Experimentos de tratamiento tumoral

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación de Animales de la Facultad de Medicina, Universidad de Kioto (número de aprobación: Med Kyoto 24328) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (RRID: MGI:2159769) y BALB/c (RRID: MGI:2161072) de seis semanas de edad, que se adquirieron de Japan SLC, Inc. y CLEA Japan, Inc., respectivamente.

Los ratones se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho con 1 × 106 células MC38 (C57BL/6) o 5 × 105 células CT26 (BALB/c) bajo anestesia con isoflurano. En los días 6 y 7 después de la inoculación, los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos de tratamiento. Los tratamientos incluyeron inyecciones intraperitoneales de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o anticuerpo anti–PD-1 (50 μg/ratón para MC38 y 100 μg/ratón para CT26) con o sin tratamiento intravenoso con iRGD (25 μmol/kg) dos veces por semana durante 3 a 4 semanas. El volumen tumoral se calculó como (longitud × ancho2)/2 y se registró dos veces por semana.

En un estudio separado, los ratones C57BL/6 se inocularon por vía subcutánea con 2 × 106 células MC38-NRP1-KO en el flanco derecho y se trataron con anticuerpo anti–PD-1 (50 μg, intraperitoneal, semanal) e iRGD (25 μmol/kg, intravenoso, dos veces por semana) a partir del día 28. Los volúmenes tumorales se midieron hasta el día 52, cuando se sacrificaron los ratones.

Ensayo de permeabilidad in vivo

Los ensayos de permeabilidad tumoral se realizaron utilizando el colorante azul de Evans según un protocolo publicado anteriormente (^[5]). Realizamos el ensayo de permeabilidad tumoral en ratones con tumores MC38 o CT26, así como en ratones con tumores MC38-NRP1-KO o MC38-EV. Los ratones con tumores se anestesiaron y luego se inyectaron por vía intravenosa con 100 μL de colorante azul de Evans (10 mg/mL, MP Biomedicals, 151108), seguido de iRGD (12,5 μmol/kg) o PBS solo 5 minutos después. Después de 30 minutos, los ratones se perfundieron con PBS y se recolectaron los tejidos. El azul de Evans se extrajo de los tejidos utilizando N,N-dimetilformamida (FUJIFILM Wako, 045-2916) a 37 °C durante 24 a 48 horas. La absorbancia se midió a 600 nm utilizando un espectrofotómetro. Los valores de absorbancia se corrigieron restando los valores de referencia obtenidos de los ratones que no recibieron inyección de azul de Evans y se normalizaron al peso del tejido (por cada 100 mg).

Inmunohistoquímica de CD8 en modelos de ratón

Para evaluar la distribución espacial de las células T CD8+, se prepararon secciones de parafina incrustada y fijadas con formalina (FFPE) de los tumores MC38 y CT26 tratados con PBS, iRGD, anticuerpo anti–PD-1 o su combinación. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 (1:200, Cell Signaling Technology, #98941, RRID: AB_2756376) después de la recuperación del antígeno utilizando tampón de Tris-EDTA (pH 9,0) a 120 °C durante 8 minutos. La incubación con el anticuerpo primario se realizó durante la noche a 4 °C, y la tinción se visualizó utilizando 3,3'-diaminobencidina. Para el análisis cuantitativo, se analizaron varios tumores por grupo, y se evaluaron 10 campos seleccionados aleatoriamente por tumor de forma ciega.

Para evaluar el estado de activación de las células T CD8+, se realizó inmunohistoquímica de la granzima B en los tumores MC38 y CT26 de ratones tratados con anticuerpo anti–PD-1 solo o en combinación con iRGD. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti–granzima B (1:200, Abcam, ab255598, RRID: AB_2860567) después de la recuperación del antígeno utilizando tampón de Tris-EDTA (pH 9,0) a 95 °C durante 20 minutos. Los procedimientos de inmunohistoquímica posteriores se realizaron como se describió para la inmunohistoquímica de CD8.

Citometría de flujo

Los tumores MC38 y CT26 tratados con PBS, iRGD, anticuerpo anti–PD-1 o su combinación se disociaron en suspensiones de células individuales. Las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (Invitrogen, L34955) y se bloquearon con una solución de bloqueo de Fc (BD Biosciences, 553141, RRID: AB394656), seguida de la tinción de superficie con anticuerpos contra CD45 (Thermo Fisher Scientific, 11-0451-82, RRID: AB465050), CD4 (BioLegend, 100540, RRID: AB893326), CD8a (BioLegend, 100712, RRID: AB312751) y CD25 (Thermo Fisher Scientific, 12-0251-82, RRID: AB465607). La tinción intracelular para Foxp3 (Thermo Fisher Scientific, 17-5773-82, RRID: AB469457) se realizó utilizando un kit de permeabilización estándar (eBioscience, 00-5523-00). Los datos se adquirieron utilizando un citómetro de flujo y se analizaron utilizando el software FlowJo (BD Biosciences, RRID: SCR_008520).

Inmunofluorescencia

Las secciones de tumores incrustadas en parafina de ratones con tumores MC38 y CT26 tratados con anticuerpo anti–PD-1 solo o anticuerpo anti–PD-1 más iRGD se tiñeron para evaluar la infiltración de células T y el estado proliferativo. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-CD8 (1:2000, Abcam, ab217344, RRID: AB2890649) y anticuerpo anti–Ki-67 (1:400, Cell Signaling Technology, #12202, RRID: AB2620142). La amplificación de la señal se realizó utilizando el sistema de amplificación de señal Tyramide Signal Amplification Plus (PerkinElmer, NEL754001KT), con las señales de CD8 y Ki-67 visualizadas utilizando fluoróforos cianina 5 y fluoresceína, respectivamente. Los núcleos se contrateñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Se tiñeron secciones incluidas en parafina de los tumores MC38-NRP1-KO y MC38-EV para evaluar la expresión de NRP1 y la vascularización tumoral. Las secciones se incubaron con el anticuerpo anti-NRP1 (1:100, R&D Systems, AF566, RRID: AB355445) y el anticuerpo anti-CD31 (1:100, Cell Signaling Technology, #77699, RRID: AB2722705), seguido de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, A-11055, RRID: AB2534102 y A-11012, RRID: AB2534079).

Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia BZ-X800 (Keyence, RRID: SCR_023617).

Pacientes

Analizamos retrospectivamente 110 pacientes con cáncer colorrectal en estadio III que se sometieron a resección primaria del tumor en el Hospital Universitario de Kioto entre abril de 2014 y marzo de 2018. El diagnóstico y la estadificación del cáncer colorrectal se confirmaron mediante examen patológico según la octava edición de la clasificación Tumor-Nodo-Metástasis de la Unión Internacional para el Control del Cáncer. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Escuela de Posgrado y la Facultad de Medicina de la Universidad de Kioto (número de aprobación: R2351-4), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, con la opción de no participar. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Inmunohistoquímica de NRP1 en tejidos de cáncer colorrectal humano

Las secciones de tumores incluidos en formalina y parafina (FFPE) se tiñeron con el sistema VENTANA BenchMark ULTRA (Roche Diagnostics, RRID: SCR013652) utilizando el anticuerpo anti-NRP1 (1:100, Abcam, ab81321, RRID: AB1640739). Las señales se detectaron utilizando un sistema basado en polímeros. La intensidad de la tinción de las células tumorales se puntuó en una escala de 0 a 3 y se multiplicó por el porcentaje de células teñidas para obtener una puntuación compuesta. Se definió una alta expresión con un umbral de 65, determinado a partir de la distribución de las puntuaciones de expresión. La tinción del estroma se evaluó con tinción moderada o intensa clasificada como alta expresión, basándose en la intensidad predominante, ya que la expresión de NRP1 en el estroma era relativamente homogénea e involucraba múltiples tipos de células, lo que hacía que la puntuación cuantitativa fuera poco práctica. Cada lámina fue evaluada de forma independiente por un patólogo y 2 cirujanos, todos los cuales desconocían los datos clínicos.

Para caracterizar aún más la expresión de NRP1 en el estroma a nivel celular, se tiñeron secciones seriadas de casos seleccionados para NRP1, CD31 y α-SMA. La tinción de NRP1 se realizó utilizando las mismas condiciones. La tinción de CD31 y α-SMA se realizó utilizando el anticuerpo anti-CD31 (1:30, Leica, NCL-CD31-1A10, RRID: AB442060) y el anticuerpo anti-α-SMA (1:1000, Sigma-Aldrich, A2547, RRID: AB476701), respectivamente. Las estructuras vasculares positivas para CD31 se utilizaron para definir las áreas asociadas a los vasos, mientras que las áreas del estroma positivas para α-SMA no vasculares se evaluaron como áreas ricas en fibroblastos asociados al cáncer (CAF).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SEM. GraphPad Prism (versión 10; GraphPad Software, RRID: SCR002798) y JMP (versión 18; SAS Institute, RRID: SCR014242) se utilizaron para el análisis de datos. Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney. Para las comparaciones entre más de 2 grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey o la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, según la distribución de los datos. El volumen tumoral a lo largo del tiempo se analizó utilizando un ANOVA de dos vías. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se compararon utilizando la prueba de rango logarítmico. Se utilizaron modelos de riesgos proporcionales de Cox para los análisis de supervivencia univariados y multivariados. La significación estadística se estableció en P < 0,05 para todas las pruebas.

Líneas celulares y reactivos

Las líneas celulares de cáncer de colon murino MC38 (RRID: CVCLB288) y CT26 (RRID: CVCL7254) fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Yoshiro Itatani (Universidad de Kioto). Las células se utilizaron en un número bajo de pasajes después de la descongelación. No se realizó la autenticación de la línea celular en este estudio, y todas las células se analizaron rutinariamente para detectar contaminación por Mycoplasma utilizando el kit de detección por PCR LookOut Mycoplasma (Sigma-Aldrich) y se confirmó que eran negativas.

Las células MC38 se cultivaron en medio Dulbecco modificado Eagle (Nacalai Tesque, 08459-65), y las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Nacalai Tesque, 30264-85), ambos suplementados con 10% de suero fetal bovino (MP Biomedicals, 2917354H) y 1% de penicilina/estreptomicina (FUJIFILM Wako, 168-23191) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. Las células MC38-NRP1-KO se generaron utilizando el sistema CRISPR-Cas9 con un plásmido px458 (RRID: Addgene48138) que codifica un ARN guía dirigido al gen NRP1. Las células positivas para la proteína fluorescente verde se clasificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia, y los clones de una sola célula se expandieron y se validaron mediante Western blot para confirmar la deleción de NRP1. Como control, las células MC38 se transfectaron con un vector vacío no dirigido (MC38-EV). El péptido iRGD (acetil-CRGDKGPDC-NH2; LifeTein, LT216216) y el anticuerpo anti-PD-1 (Bio X Cell, BE0146, RRID: AB10949053) se utilizaron en este estudio.

Inmunoblotting

Los niveles de proteína NRP1 se evaluaron mediante inmunoblotting utilizando lisados de células MC38-NRP1-KO y MC38-EV. Las células se lisaron en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio (SDS) (1 mol/L Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS y 50% glicerol) que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas (Nacalai Tesque, 04080-11 y 07574-61). Los lisados se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore). Las membranas se bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque 03953-95) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna con un anticuerpo primario anti-NRP1 (1:1000, Abcam, ab81321, RRID: AB1640739) a 4 °C y un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:500, Agilent, P0448, RRID: AB2617138) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó β-actina como control de carga. Las señales se detectaron utilizando el sustrato de Western blot Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific, 32132) y se visualizaron utilizando un sistema LAS-4000 (FUJIFILM).

Experimentos de tratamiento tumoral en animales

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Escuela de Posgrado de Medicina de la Universidad de Kioto (número de aprobación: Med Kyoto 24328) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE. Se compraron ratones hembra C57BL/6 (RRID: MGI:2159769) y BALB/c (RRID: MGI:2161072) de 6 semanas de edad de Japan SLC, Inc. y CLEA Japan, Inc., respectivamente.

Los ratones se inocularon subcutáneamente en el flanco derecho con 1 × 106 células MC38 (C57BL/6) o 5 × 105 células CT26 (BALB/c) bajo anestesia con isoflurano. En los días 6 y 7 después de la inoculación, los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos de tratamiento. Los tratamientos incluyeron inyecciones intraperitoneales de solución salina tamponada con fosfato (PBS) o anticuerpo anti-PD-1 (50 μg/ratón para MC38 y 100 μg/ratón para CT26) con o sin tratamiento intravenoso con iRGD (25 μmol/kg) dos veces por semana durante 3 a 4 semanas. El volumen tumoral se calculó como (longitud × ancho2)/2 y se registró dos veces por semana.

En un estudio separado, se inocularon ratones C57BL/6 subcutáneamente con 2 × 106 células MC38-NRP1-KO en el flanco derecho y se trataron con anticuerpo anti-PD-1 (50 μg, intraperitoneal, semanal) e iRGD (25 μmol/kg, intravenoso, dos veces por semana) a partir del día 28. Los volúmenes tumorales se midieron hasta el día 52, cuando se sacrificaron los ratones.

Ensayo de permeabilidad in vivo

Los ensayos de permeabilidad tumoral se realizaron utilizando tinte azul de Evans según un protocolo publicado anteriormente (^[5]). Realizamos el ensayo de permeabilidad tumoral en ratones con tumores MC38 o CT26, así como en ratones con tumores MC38-NRP1-KO o MC38-EV. Los ratones con tumores se anestesiaron y luego se inyectaron por vía intravenosa con 100 μL de tinte azul de Evans (MP Biomedicals, 151108) a 10 mg/mL, seguido de iRGD (12,5 μmol/kg) o PBS solo 5 minutos después. Después de 30 minutos, se perfundieron los ratones con PBS y se recolectaron los tejidos. El azul de Evans se extrajo de los tejidos utilizando N,N-dimetilformamida (FUJIFILM Wako, 045-2916) a 37 °C durante 24 a 48 horas. La absorbancia se midió a 600 nm utilizando un espectrofotómetro. Los valores de absorbancia se corrigieron restando los valores de referencia obtenidos de ratones que no recibieron inyección de azul de Evans y se normalizaron al peso del tejido (por cada 100 mg).

Inmunohistoquímica de CD8 en modelos murinos de tumores

Para evaluar la distribución espacial de las células T CD8+, se prepararon secciones de tumores MC38 y CT26 fijadas en formalina y incluidas en parafina (FFPE) tratadas con PBS, iRGD, anticuerpo anti-PD-1 o su combinación. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-CD8 (1:200, Cell Signaling Technology, #98941, RRID: AB_2756376) después de la recuperación del antígeno utilizando tampón de Tris-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (pH 9,0) a 120 °C durante 8 minutos. La incubación con el anticuerpo primario se realizó durante la noche a 4 °C, y la tinción se visualizó utilizando 3,3'-diaminobencidina. Para el análisis cuantitativo, se analizaron múltiples tumores por grupo, y se evaluaron 10 campos seleccionados aleatoriamente por tumor de forma ciega.

Para evaluar el estado de activación de las células T CD8+, se realizó inmunohistoquímica de la granzima B en tumores MC38 y CT26 de ratones tratados con anticuerpo anti-PD-1 solo o en combinación con iRGD. Las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-granzima B (1:200, Abcam, ab255598, RRID: AB_2860567) después de la recuperación del antígeno utilizando tampón de Tris-EDTA (pH 9,0) a 95 °C durante 20 minutos. Los procedimientos de inmunohistoquímica posteriores se realizaron como se describió para la inmunohistoquímica de CD8.

Citometría de flujo

Los tumores MC38 y CT26 tratados con PBS, iRGD, anticuerpo anti-PD-1 o su combinación se disociaron en suspensiones de células individuales. Las células se tiñeron con un tinte de viabilidad fijable (Invitrogen, L34955) y se bloquearon con una solución de bloqueo de Fc (BD Biosciences, 553141, RRID: AB394656), seguido de la tinción de superficie con anticuerpos contra CD45 (Thermo Fisher Scientific, 11-0451-82, RRID: AB465050), CD4 (BioLegend, 100540, RRID: AB893326), CD8a (BioLegend, 100712, RRID: AB312751) y CD25 (Thermo Fisher Scientific, 12-0251-82, RRID: AB465607). La tinción intracelular para Foxp3 (Thermo Fisher Scientific, 17-5773-82, RRID: AB469457) se realizó utilizando un kit de permeabilización estándar (eBioscience, 00-5523-00). Los datos se adquirieron utilizando un citómetro de flujo y se analizaron utilizando el software FlowJo (BD Biosciences, RRID: SCR_008520).

Inmunofluorescencia

Se tiñeron secciones de tumores incluidos en parafina de ratones con tumores MC38 y CT26 tratados con anticuerpo anti-PD-1 solo o anticuerpo anti-PD-1 más iRGD para evaluar la infiltración de células T y el estado proliferativo. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-CD8 (1:2000, Abcam, ab217344, RRID: AB2890649) y anticuerpo anti-Ki-67 (1:400, Cell Signaling Technology, #12202, RRID: AB2620142). La amplificación de la señal se realizó utilizando el sistema de amplificación de señal Tyramide Signal Amplification Plus (PerkinElmer, NEL754001KT), con las señales de CD8 y Ki-67 visualizadas utilizando fluoróforos cianina 5 y fluoresceína, respectivamente. Los núcleos se contrateñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Se tiñeron secciones incluidas en parafina de tumores MC38-NRP1-KO y MC38-EV para evaluar la expresión de NRP1 y la vascularización tumoral. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-NRP1 (1:100, R&D Systems, AF566, RRID: AB355445) y anticuerpo anti-CD31 (1:100, Cell Signaling Technology, #77699, RRID: AB2722705), seguido de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, A-11055, RRID: AB2534102 y A-11012, RRID: AB2534079).

Todas las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia BZ-X800 (Keyence, RRID: SCR_023617).

Pacientes

Analizamos retrospectivamente 110 pacientes con cáncer colorrectal en estadio III que se sometieron a resección primaria del tumor en el Hospital Universitario de Kioto entre abril de 2014 y marzo de 2018. El diagnóstico y la estadificación del cáncer colorrectal se confirmaron mediante examen patológico según la octava edición de la clasificación TNM de la Unión Internacional para el Control del Cáncer. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Escuela de Posgrado y la Facultad de Medicina de la Universidad de Kioto (número de aprobación: R2351-4), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, con la opción de no participar. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Inmunohistoquímica de NRP1 en tejidos de cáncer colorrectal humano

Las secciones tumorales fijadas en formalina y embebidas en parafina (FFPE) se tiñeron con el sistema VENTANA BenchMark ULTRA (Roche Diagnostics, RRID: SCR013652) utilizando el anticuerpo anti-NRP1 (1:100, Abcam, ab81321, RRID: AB1640739). Las señales se detectaron utilizando un sistema basado en polímeros. La intensidad de la tinción de las células tumorales se puntuó en una escala de 0 a 3 y se multiplicó por el porcentaje de células teñidas para obtener una puntuación compuesta. Se definió una alta expresión con un umbral de 65, determinado a partir de la distribución de las puntuaciones de expresión. La tinción estromal se evaluó con tinción moderada o intensa clasificada como alta expresión, basándose en la intensidad predominante, ya que la expresión de NRP1 en el estroma era relativamente homogénea e involucraba múltiples tipos de células, lo que hacía que la puntuación cuantitativa fuera poco práctica. Cada lámina fue evaluada de forma independiente por un patólogo y 2 cirujanos, todos los cuales desconocían los datos clínicos.

Para caracterizar aún más la expresión de NRP1 en el estroma a nivel celular, se tiñeron secciones seriadas de casos seleccionados para NRP1, CD31 y α-SMA. La tinción de NRP1 se realizó utilizando las mismas condiciones. La tinción de CD31 y α-SMA se realizó utilizando el anticuerpo anti-CD31 (1:30, Leica, NCL-CD31-1A10, RRID: AB442060) y el anticuerpo anti-α-SMA (1:1.000, Sigma-Aldrich, A2547, RRID: AB476701), respectivamente. Las estructuras vasculares positivas para CD31 se utilizaron para definir las áreas asociadas a los vasos sanguíneos, mientras que las áreas estromales positivas para α-SMA no vasculares se evaluaron como áreas ricas en fibroblastos asociados al cáncer (CAF).

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SEM. GraphPad Prism (versión 10; GraphPad Software, RRID: SCR002798) y JMP (versión 18; SAS Institute, RRID: SCR014242) se utilizaron para el análisis de datos. Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney. Para las comparaciones entre más de 2 grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor seguido de la prueba post hoc de Tukey o la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, según la distribución de los datos. El volumen tumoral a lo largo del tiempo se analizó utilizando un ANOVA de dos vías. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se compararon utilizando la prueba de rango logarítmico. Se utilizaron modelos de riesgos proporcionales de Cox para los análisis de supervivencia univariados y multivariados. La significación estadística se estableció en P < 0,05 para todas las pruebas.

Resultados

iRGD mejora la entrada dependiente de NRP1 de un trazador coinyectado en cánceres colorrectales

Realizamos ensayos de permeabilidad sistémica para investigar si el tratamiento con iRGD mejoraba la administración tumoral específica de los agentes coadministrados a los tumores colorrectales. Se inyectó por vía sistémica tinte azul de Evans, seguido de la administración de iRGD en los grupos indicados, en ratones con tumores MC38 subcutáneos. La inspección visual reveló un aumento de la coloración azul de los tumores en los ratones tratados con iRGD (Fig. 1A). Los valores de absorbancia corregidos para la absorbancia de fondo y normalizados al peso tumoral fueron más altos en los tumores que en otros órganos cuando se coadministró iRGD, lo que mostró una mayor acumulación de tinte selectiva para el tumor en comparación con los controles (Fig. 1B). Se obtuvieron resultados similares utilizando un segundo modelo de ratón de cáncer colorrectal preparado con células CT26 (Fig. 1C y D). iRGD mejoró la entrada de tinte en los tumores de forma dependiente de NRP1, ya que un anticuerpo anti-NRP1 inhibió este efecto (Fig. 1E). Para evaluar aún más la dependencia de NRP1, diseñamos células MC38-NRP1-KO y confirmamos la pérdida de la expresión de NRP1 utilizando ensayos de inmunoblot (Fig. 1F). En ausencia de iRGD, tanto los tumores EV como los tumores NRP1-KO mostraron una baja captación de azul de Evans. En el grupo EV, similar a las células parentales, la administración combinada de iRGD mejoró significativamente la captación de azul de Evans. En el grupo NRP1-KO, aunque no hubo una diferencia significativa, algunos tumores aún mostraron un aumento de la captación de azul de Evans con el tratamiento con iRGD (Fig. 1G).

iRGD potencia el efecto antitumoral del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 en modelos murinos de cáncer colorrectal

Los anticuerpos anti-PD-1 están ganando atención como prometedores agentes terapéuticos para el cáncer colorrectal, especialmente en tumores MSI-H (^[25]–^[27]). Basándonos en los resultados del ensayo de permeabilidad sistémica, evaluamos si la coadministración de iRGD mejoraba la eficacia antitumoral del anticuerpo anti-PD-1 en modelos murinos de cáncer colorrectal.

En ratones con tumores MSI-H MC38 subcutáneos (^[28], ^[29]), la mayor reducción tumoral se observó en el grupo de combinación tratado con iRGD y anticuerpo anti-PD-1 (Fig. 2A). Los análisis agrupados demostraron que el crecimiento tumoral se suprimió significativamente en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti-PD-1 (Fig. 2B) y el peso tumoral al sacrificio también se redujo significativamente (Fig. 2C). Coherente con los resultados de estudios previos, iRGD solo no mostró efectos antitumorales detectables (^[3], ^[30]). iRGD no mejoró las toxicidades fuera del objetivo según las mediciones del peso corporal, lo que es coherente con sus actividades específicas para el tumor (Fig. 2D).

De manera similar, en ratones con tumores MSS CT26 subcutáneos (^[28], ^[31]), se observó una reducción significativa tanto en el volumen como en el peso del tumor en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti-PD-1 (Fig. 2E–G). Los cambios en el peso corporal fueron comparables entre los grupos de tratamiento (Fig. 2H). Estos hallazgos sugieren que la adición de iRGD mejora la actividad terapéutica del anticuerpo anti-PD-1 contra tumores de cáncer colorrectal MSI-H y, potencialmente, contra cánceres MSS.

Aumento de la abundancia y alteraciones funcionales de las células CD8+ intratumorales mediante la terapia de combinación con iRGD y anti-PD-1

La eficacia terapéutica de los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) se ha asociado con la abundancia y el estado funcional de las células inmunitarias intratumorales, en particular las células CD8+ T, incluido su potencial proliferativo y su actividad efectora (^[32]–^[34]). Por lo tanto, para evaluar los efectos inmunológicos de iRGD en combinación con la terapia anti-PD-1, cuantificamos las células CD8+ intratumorales y evaluamos los marcadores de proliferación y activación citotóxica.

En los modelos MC38 y CT26, la inmunohistoquímica reveló que las células CD8+ aumentaron significativamente en el grupo de combinación iRGD/anti-PD-1 en comparación con los otros grupos de tratamiento (Fig. 3A–D). La tinción inmunofluorescente para CD8 y Ki-67 demostró que, tanto en los tumores MC38 como en los CT26, la frecuencia de células CD8+ positivas para Ki-67 aumentó en el grupo de combinación iRGD/anti-PD-1 en comparación con la monoterapia con anti-PD-1 (Fig. 3E y F). Además, las células positivas para granzima B se observaron principalmente en la periferia del tumor y aumentaron en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti-PD-1 (Fig. 3G y H).

El análisis de citometría de flujo respaldó aún más estos hallazgos. En los modelos MC38 y CT26, la proporción de células CD8+ dentro de la población de células inmunitarias CD45+ fue significativamente mayor en el grupo de combinación en comparación con todos los demás grupos de tratamiento, incluido la monoterapia con anti-PD-1 (Fig. 3I–L), lo que es coherente con los efectos antitumorales mejorados observados en los estudios de tratamiento. La proporción de células CD45+ tendió a ser la más alta en el grupo de combinación en el modelo MC38 (Fig. S1A y S1B, Material Suplementario), mientras que no se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en el modelo CT26 (Fig. S1C y S1D, Material Suplementario). La proporción de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) no diferenció significativamente entre los grupos de tratamiento en ninguno de los modelos (Fig. S1E–S1H, Material Suplementario). En conjunto, estos resultados indican que la adición de iRGD a la terapia anti-PD-1 se asocia con un aumento de la abundancia y la activación funcional de las células CD8+ intratumorales.

La eliminación de la expresión de NRP1 en las células de cáncer colorrectal no elimina los efectos de la terapia de combinación iRGD/anti-PD-1

A continuación, investigamos el papel de NRP1 en los efectos antitumorales de la terapia de combinación. Hipotetizamos que la eficacia mejorada se debía a la penetración dependiente de NRP1 del anticuerpo anti-PD-1 inducida por iRGD. Por lo tanto, examinamos la eficacia de la terapia de combinación iRGD/anti-PD-1 en ratones con tumores MC38-NRP1-KO subcutáneos. En particular, los tumores MC38-NRP1-KO crecieron significativamente más lentamente que los tumores de control MC38-EV, lo que sugiere un papel de NRP1 en la progresión del cáncer colorrectal (Fig. 4A). Contrariamente a nuestra expectativa de que los efectos de iRGD se eliminarían en los tumores NRP1-KO, se observó una tendencia a que los tumores del grupo de combinación tuvieran un volumen y un peso reducidos (Fig. 4B–D). El análisis de inmunofluorescencia de los tumores MC38-NRP1-KO reveló una expresión preservada de NRP1 en los vasos sanguíneos CD31+ y, en cierta medida, en las células estromales circundantes, lo que presumiblemente contribuyó al efecto residual de iRGD (Fig. 4E).

NRP1 se expresa ampliamente en el cáncer colorrectal humano

Para evaluar la aplicabilidad clínica de iRGD, examinamos la expresión de NRP1 en los tejidos de cáncer colorrectal humano. El análisis de inmunohistoquímica de muestras de 110 pacientes con cáncer colorrectal reveló diferentes grados de expresión de NRP1 en los compartimentos epitelial y estromal del tumor (Fig. 5A y B). Para caracterizar aún más el compartimento estromal, se evaluaron por separado las estructuras vasculares (Fig. 5C). Los pacientes se clasificaron en grupos de alta y baja expresión según los criterios para cada compartimento. La expresión de NRP1 en las células tumorales se detectó en todos los casos, con una distribución heterogénea (Fig. 5D). En el compartimento estromal, la expresión de NRP1 se detectó en más del 90% de los casos, y aproximadamente el 45% de los casos mostraron una tinción moderada a intensa (Fig. 5E). En las células endoteliales vasculares, se observó un patrón de distribución similar al del compartimento estromal (Fig. 5F). Se examinaron secciones seriadas con tinción de CD31 y α-SMA en casos representativos (Fig. S2, Material Suplementario). Se observó la expresión de NRP1 tanto en las áreas asociadas a los vasos sanguíneos como en las áreas estromales no vasculares, y la intensidad de la tinción tendió a ser mayor en las áreas asociadas a los vasos sanguíneos en comparación con las áreas estromales no vasculares (áreas ricas en CAF).

La expresión estromal de NRP1 se correlaciona con un peor pronóstico en el cáncer colorrectal.

El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que una alta expresión de NRP1 en el compartimento estromal, en lugar de en las células tumorales, se asoció significativamente con una menor supervivencia global (OS; tumor: Fig. 6A; P = 0,87; estroma: Fig. 6B; P = 0,002) y supervivencia libre de enfermedad (DFS; tumor: Fig. 6C; P = 0,85; estroma: Fig. 6D; P = 0,008). La expresión de NRP1 en las células tumorales no mostró una asociación significativa con la supervivencia específica del tumor (Fig. S3A del material suplementario; P = 0,34), mientras que la expresión de NRP1 en el estroma se asoció con resultados desfavorables (Fig. S3B del material suplementario; P = 0,015). La expresión de NRP1 en las células endoteliales vasculares se asoció significativamente con una menor OS (Fig. S3C del material suplementario; P = 0,012) y mostró una tendencia hacia una menor DFS (Fig. S3D del material suplementario; P = 0,094). Según las características clinicopatológicas estratificadas por la expresión de NRP1 en el estroma, los tumores bien diferenciados mostraron con mayor frecuencia una alta expresión de NRP1 en el estroma (P = 0,013), mientras que las pacientes fueron más propensas a presentar una baja expresión de NRP1 en el estroma (P = 0,002; Tabla S1 del material suplementario). Las variables que fueron significativas en el análisis univariado (P < 0,05) se incluyeron en un análisis de regresión de Cox multivariado. En este modelo, tanto la quimioterapia adyuvante [razón de riesgo (HR) = 2,634; intervalo de confianza (IC) del 95 %, 1,065–6,513; P = 0,036] como la alta expresión de NRP1 en el estroma (HR = 2,783; IC del 95 %, 1,040–7,452; P = 0,042) se asociaron de forma independiente con una peor OS (Tabla 1).

iRGD mejora la entrada dependiente de NRP1 de un trazador coinyectado en los cánceres colorrectales

Realizamos ensayos de permeabilidad sistémica para investigar si el tratamiento con iRGD mejoraba la administración tumoral específica de los agentes coadministrados en los tumores colorrectales. Se inyectó por vía sistémica tinte azul de Evans, seguido de la administración de iRGD en los grupos indicados, en ratones con tumores MC38 subcutáneos. La inspección visual reveló un aumento de la coloración azul de los tumores en los ratones tratados con iRGD (Fig. 1A). Los valores de absorbancia corregidos para la absorbancia de fondo y normalizados al peso tumoral fueron más altos en los tumores que en otros órganos cuando se coadministró iRGD, lo que mostró una acumulación de tinte tumoral significativamente mayor en comparación con los controles (Fig. 1B). Se obtuvieron resultados similares utilizando un segundo modelo de ratón de cáncer colorrectal preparado con células CT26 (Fig. 1C y D). iRGD mejoró la entrada de tinte en los tumores de forma dependiente de NRP1, ya que un anticuerpo anti-NRP1 inhibió este efecto (Fig. 1E). Para evaluar aún más la dependencia de NRP1, diseñamos células MC38-NRP1-KO y confirmamos la pérdida de la expresión de NRP1 mediante ensayos de inmunoblot (Fig. 1F). En ausencia de iRGD, tanto los tumores EV como los tumores NRP1-KO mostraron una baja captación de azul de Evans. En el grupo EV, similar a las células parentales, la administración combinada de iRGD mejoró significativamente la captación de azul de Evans. En el grupo NRP1-KO, aunque no hubo una diferencia significativa, algunos tumores aún mostraron un aumento de la captación de azul de Evans con el tratamiento con iRGD (Fig. 1G).

iRGD potencia el efecto antitumoral del tratamiento con anticuerpos anti–PD-1 en modelos murinos de cáncer colorrectal

Los anticuerpos anti–PD-1 están ganando atención como prometedores agentes terapéuticos para el cáncer colorrectal, especialmente en tumores MSI-H (^[25]–^[27]). Basándonos en los resultados del ensayo de permeabilidad sistémica, evaluamos si la coadministración de iRGD mejoraba la eficacia antitumoral del anticuerpo anti–PD-1 en modelos murinos de cáncer colorrectal.

En ratones con tumores MC38 MSI-H subcutáneos (^[28], ^[29]), la mayor reducción tumoral se observó en el grupo de combinación tratado con iRGD y anticuerpo anti–PD-1 (Fig. 2A). Los análisis agrupados demostraron que el crecimiento tumoral se suprimió significativamente en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti–PD-1 (Fig. 2B) y el peso tumoral en el momento del sacrificio también se redujo significativamente (Fig. 2C). Coherente con los resultados de estudios previos, iRGD solo no mostró efectos antitumorales detectables (^[3], ^[30]). iRGD no mejoró las toxicidades fuera del objetivo según las mediciones del peso corporal, lo que es coherente con sus actividades específicas del tumor (Fig. 2D).

De manera similar, en ratones con tumores CT26 MSS subcutáneos (^[28], ^[31]), se observó una reducción significativa tanto del volumen como del peso tumoral en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti–PD-1 (Fig. 2E–G). Los cambios en el peso corporal fueron comparables entre los grupos de tratamiento (Fig. 2H). Estos hallazgos sugieren que la adición de iRGD mejora la actividad terapéutica del anticuerpo anti–PD-1 contra los tumores de cáncer colorrectal MSI-H y, potencialmente, contra los cánceres MSS.

Aumento de la abundancia y alteraciones funcionales de las células CD8+ intratumorales mediante la terapia de combinación con iRGD y anti–PD-1

La eficacia terapéutica de los inhibidores de puntos de control inmunitarios (ICIs) se ha asociado con la abundancia y el estado funcional de las células inmunitarias intratumorales, en particular las células CD8+ T, incluido su potencial proliferativo y su actividad efectora (^[32]–^[34]). Por lo tanto, para evaluar los efectos inmunológicos de iRGD en combinación con la terapia anti–PD-1, cuantificamos las células CD8+ T intratumorales y evaluamos los marcadores de proliferación y activación citotóxica.

En los modelos MC38 y CT26, la inmunohistoquímica (IHQ) reveló que las células CD8+ T aumentaron significativamente en el grupo de combinación iRGD/anti–PD-1 en comparación con los otros grupos de tratamiento (Fig. 3A–D). La tinción inmunofluorescente para CD8 y Ki-67 demostró que, tanto en los tumores MC38 como en los CT26, la frecuencia de células CD8+ positivas para Ki-67 aumentó en el grupo de combinación iRGD/anti–PD-1 en comparación con la monoterapia con anti–PD-1 (Fig. 3E y F). Además, las células positivas para granzima B se observaron principalmente en la periferia del tumor y aumentaron en el grupo de combinación en comparación con la monoterapia con anti–PD-1 (Fig. 3G y H).

El análisis de citometría de flujo respaldó aún más estos hallazgos. En los modelos MC38 y CT26, la proporción de células CD8+ T dentro de la población de células inmunitarias CD45+ fue significativamente mayor en el grupo de combinación en comparación con todos los demás grupos de tratamiento, incluido la monoterapia con anti–PD-1 (Fig. 3I–L), lo que es coherente con los efectos antitumorales mejorados observados en los estudios de tratamiento. La proporción de células CD45+ tendió a ser la más alta en el grupo de combinación en el modelo MC38 (Fig. S1A y S1B del material suplementario), mientras que no se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en el modelo CT26 (Fig. S1C y S1D del material suplementario). La proporción de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) no diferenció significativamente entre los grupos de tratamiento en ninguno de los modelos (Fig. S1E–S1H del material suplementario). En conjunto, estos resultados indican que la adición de iRGD a la terapia anti–PD-1 se asocia con un aumento de la abundancia y la activación funcional de las células CD8+ T intratumorales.

La eliminación de la expresión de NRP1 en las células de cáncer colorrectal no elimina los efectos de la terapia de combinación iRGD/anti–PD-1

A continuación, investigamos el papel de NRP1 en los efectos antitumorales de la terapia de combinación. Hipotetizamos que la mayor eficacia se debía a la penetración dependiente de NRP1 del anticuerpo anti–PD-1 inducida por iRGD. Por lo tanto, examinamos la eficacia de la terapia de combinación iRGD/anti–PD-1 en ratones con tumores MC38-NRP1-KO subcutáneos. En particular, los tumores MC38-NRP1-KO crecieron significativamente más lentamente que los tumores de control MC38-EV, lo que sugiere un papel de NRP1 en la progresión del cáncer colorrectal (Fig. 4A). Contrariamente a nuestra expectativa de que los efectos de iRGD se eliminarían en los tumores NRP1-KO, aún se observó una tendencia a que los tumores del grupo de combinación tuvieran un volumen y un peso reducidos (Fig. 4B–D). El análisis de inmunofluorescencia de los tumores MC38-NRP1-KO reveló la preservación de la expresión de NRP1 en los vasos sanguíneos CD31+ y, en cierta medida, en las células estromales circundantes, lo que presumiblemente contribuyó al efecto residual de iRGD (Fig. 4E).

NRP1 se expresa ampliamente en el cáncer colorrectal humano

Para evaluar la aplicabilidad clínica de iRGD, examinamos la expresión de NRP1 en los tejidos de cáncer colorrectal humano. El análisis de IHQ de muestras de 110 pacientes con cáncer colorrectal reveló diferentes grados de expresión de NRP1 en los compartimentos epitelial y estromal del tumor (Fig. 5A y B). Para caracterizar aún más el compartimento estromal, se evaluaron por separado las estructuras vasculares (Fig. 5C). Los pacientes se clasificaron en grupos de alta y baja expresión según los criterios para cada compartimento. La expresión de NRP1 en las células tumorales se detectó en todos los casos, con una distribución heterogénea (Fig. 5D). En el compartimento estromal, la expresión de NRP1 se detectó en más del 90 % de los casos, y aproximadamente el 45 % de los casos mostraron una tinción moderada a intensa (Fig. 5E). En las células endoteliales vasculares, se observó un patrón de distribución similar al del compartimento estromal (Fig. 5F). Se examinaron secciones seriadas con tinción de CD31 y α-SMA en casos representativos (Fig. S2 del material suplementario). Se observó la expresión de NRP1 tanto en las áreas estromales asociadas a los vasos como en las no vasculares, y la intensidad de la tinción tendió a ser mayor en las áreas asociadas a los vasos en comparación con las áreas estromales no vasculares (ricas en CAF).

La expresión estromal de NRP1 se correlaciona con un peor pronóstico en el cáncer colorrectal

El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que una alta expresión de NRP1 en el compartimento estromal, en lugar de en las células tumorales, se asoció significativamente con una menor supervivencia global (OS; tumor: Fig. 6A; P = 0,87; estroma: Fig. 6B; P = 0,002) y supervivencia libre de enfermedad (DFS; tumor: Fig. 6C; P = 0,85; estroma: Fig. 6D; P = 0,008). La expresión de NRP1 en las células tumorales no mostró una asociación significativa con la supervivencia específica del tumor (Fig. S3A del material suplementario; P = 0,34), mientras que la expresión de NRP1 en el estroma se asoció con resultados desfavorables (Fig. S3B del material suplementario; P = 0,015). La expresión de NRP1 en las células endoteliales vasculares se asoció significativamente con una menor OS (Fig. S3C del material suplementario; P = 0,012) y mostró una tendencia hacia una menor DFS (Fig. S3D del material suplementario; P = 0,094). Según las características clinicopatológicas estratificadas por la expresión de NRP1 en el estroma, los tumores bien diferenciados mostraron con mayor frecuencia una alta expresión de NRP1 en el estroma (P = 0,013), mientras que las pacientes fueron más propensas a presentar una baja expresión de NRP1 en el estroma (P = 0,002; Tabla S1 del material suplementario). Las variables que fueron significativas en el análisis univariado (P < 0,05) se incluyeron en un análisis de regresión de Cox multivariado. En este modelo, tanto la quimioterapia adyuvante [razón de riesgo (HR) = 2,634; intervalo de confianza (IC) del 95 %, 1,065–6,513; P = 0,036] como la alta expresión de NRP1 en el estroma (HR = 2,783; IC del 95 %, 1,040–7,452; P = 0,042) se asociaron de forma independiente con una peor OS (Tabla 1).

Discusión

En este estudio, demostramos que iRGD mejora la administración intratumoral de un agente coinyectado en los tumores de cáncer colorrectal de forma dependiente de NRP1. Además, mostramos que la terapia de combinación con iRGD y anticuerpo anti–PD-1 suprimió eficazmente el crecimiento tumoral en modelos murinos de cáncer colorrectal y se asoció con un aumento de la abundancia de células CD8+ T intratumorales que exhiben características proliferativas y efectoras mejoradas. La eliminación de la expresión de NRP1 en las células de cáncer colorrectal no fue suficiente para eliminar los efectos de iRGD sobre la acumulación de tinte intratumoral o la respuesta terapéutica a la terapia anti–PD-1, lo que sugiere que el NRP1 estromal puede desempeñar un papel fundamental en la mediación de la función de iRGD. El análisis de los especímenes clínicos de cáncer colorrectal reveló una expresión generalizada de NRP1 tanto en los compartimentos tumoral como estromal. En particular, la expresión de NRP1 en el estroma, incluidos los vasos sanguíneos asociados al tumor, se asoció con un peor pronóstico.

iRGD mejoró selectivamente la entrada del tinte Evans blue en el tumor cuando se administró conjuntamente, sin afectar a los tejidos normales, lo que concuerda con la actividad específica del tumor de iRGD. Este efecto dependió de NRP1, ya que un anticuerpo bloqueante redujo significativamente la captación del tinte mediada por iRGD. Es importante destacar que la ablación genética de la expresión de NRP1 en las células tumorales no inhibió por completo la administración intratumoral, lo que sugiere la participación de NRP1 estromal en este efecto. Estos hallazgos coinciden con el perfil de expresión conocido de NRP1 en la vasculatura angiogénica y su papel en la mediación de la permeabilidad vascular (^[35]–^[38]).

El hallazgo de que la terapia combinada con iRGD y el anticuerpo anti–PD-1 redujo significativamente el crecimiento tumoral tanto en los modelos murinos de cáncer colorrectal MSI-H como MSS tiene importantes implicaciones. El éxito clínico de los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICIs) en el cáncer colorrectal se ha limitado a los tumores MSI-H, que representan solo una pequeña proporción de pacientes. Para la población mucho más amplia con cáncer colorrectal MSS, las opciones terapéuticas siguen siendo limitadas (^[25]). Nuestros datos sugieren que iRGD puede facilitar la respuesta en ciertas condiciones de cáncer colorrectal MSS a los ICIs al superar las barreras físicas y estromales que subyacen a la exclusión inmune (^[3], ^[39]), lo que permite que los ICIs lleguen y activen las células T efectoras dentro del microambiente tumoral. De hecho, la terapia combinada con iRGD y el anticuerpo anti–PD-1 aumentó significativamente el número de células T CD8+ intratumorales y mejoró su estado funcional tanto en los modelos MSI-H como MSS. Estos hallazgos sugieren que la permeabilidad vascular mediada por NRP1 mejora la administración intratumoral del anticuerpo anti–PD-1, lo que a su vez promueve la activación y proliferación de las células T CD8+ dentro del microambiente tumoral (Fig. 7). Un estudio reciente en modelos de carcinoma hepatocelular informó de manera similar sobre una mayor activación de las células T CD8+ intratumorales tras la coadministración de iRGD con la terapia anti–PD-L1 (^[40]). Sin embargo, aunque los modelos MC38 y CT26 utilizados en este estudio se emplean ampliamente, no reproducen completamente las características moleculares e inmunológicas de los cánceres colorrectales humanos MSI-H y MSS, respectivamente, especialmente cuando se establecen como tumores subcutáneos (^[41], ^[42]). Por lo tanto, es necesario realizar una validación adicional en modelos ortotópicos o genéticamente modificados que representen con mayor precisión el fenotipo de las enfermedades humanas MSI-H y MSS.

En consonancia con el estudio con Evans blue, la deleción específica de NRP1 en las células tumorales no eliminó el efecto antitumoral de la terapia combinada con iRGD y el anticuerpo anti–PD-1 en ratones con tumores colorrectales. Persistió una expresión residual de NRP1 en los compartimentos vascular y estromal de los tumores, lo que probablemente contribuyó a los efectos residuales de iRGD. Por lo tanto, la expresión de NRP1 en el estroma, además del compartimento epitelial, puede ser fundamental para mediar los efectos de iRGD. Sin embargo, los hallazgos actuales se basan en evidencia indirecta, ya que la deleción de NRP1 se limitó a las células tumorales. La evaluación definitiva de NRP1 estromal requeriría modelos de KO específicos para cada tipo celular que se dirijan a compartimentos estromales individuales. Aunque técnicamente es un desafío, esto representa una importante dirección para futuras investigaciones.

El análisis de inmunohistoquímica de muestras de cáncer colorrectal humano reveló una expresión generalizada de NRP1 tanto en los compartimentos epitelial como estromal, incluida la vasculatura tumoral, lo que sugiere que la terapia basada en iRGD puede tener una amplia aplicabilidad en el cáncer colorrectal. En nuestra cohorte de pacientes, una fuerte expresión de NRP1 estromal, incluida la de la vasculatura tumoral, se correlacionó con una menor supervivencia, lo que apoya que NRP1 estromal es un factor pronóstico negativo. Estos hallazgos sugieren que las terapias basadas en iRGD pueden ofrecer una posible estrategia terapéutica en el cáncer colorrectal. Nuestras conclusiones se basan en el análisis de una cohorte relativamente homogénea y en la elaboración de perfiles específicos de cada compartimento de la expresión de NRP1 en los tejidos tumorales. En contraste, las revisiones y los metaanálisis anteriores no han demostrado una asociación consistente entre la expresión de NRP1 y el pronóstico del cáncer colorrectal (^[20]). Esta inconsistencia puede atribuirse a la variabilidad metodológica, la falta de evaluación específica de cada compartimento y la heterogeneidad en las cohortes de pacientes. Estudios anteriores emplearon diversos enfoques, incluido el inmunohistoquímico, los análisis transcriptómicos utilizando conjuntos de datos públicos (^[43]) y la medición de NRP1 sérico (^[44], ^[45]), en lugar de una evaluación directa específica de cada compartimento en el tejido tumoral. Además, muchas de las cohortes informadas incluyeron pacientes con metástasis distantes, lo que dificulta la exclusión de la influencia de factores de confusión más allá de la expresión de NRP1.

El hallazgo de que la expresión de NRP1 en las células tumorales no se asoció con el pronóstico fue sorprendente porque la deleción específica de NRP1 en las células tumorales en nuestro modelo murino MC38 condujo a un crecimiento tumoral significativamente más lento en comparación con los controles. Se sabe que NRP1 en las células tumorales facilita la progresión del cáncer a través de efectos pleiotrópicos sobre el microambiente tumoral, como la activación paracrina del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular endotelial (^[46], ^[47]) y la regulación directa de las funciones de las células tumorales, como la adhesión y la migración (^[48], ^[49]). La carga estromal limitada en los modelos murinos subcutáneos (^[50], ^[51]) y la deleción selectiva de la expresión de NRP1 en las células tumorales probablemente revelaron la contribución de NRP1 en las células tumorales en nuestro estudio con animales. En contraste, en los cánceres colorrectales humanos, el papel de NRP1 en las células tumorales puede estar enmascarado debido al estroma relativamente abundante. En nuestra cohorte de pacientes, observamos con frecuencia casos con baja expresión de NRP1 en las células tumorales, pero alta expresión de NRP1 en el tejido estromal densamente infiltrado. Por lo tanto, el impacto pronóstico de la expresión de NRP1 en las células tumorales puede verse eclipsado por la contribución dominante de NRP1 estromal en el cáncer colorrectal humano. Se justifica una validación clínica adicional en conjuntos de datos más amplios y prospectivos, así como estudios adicionales con animales que utilicen modelos murinos de cáncer colorrectal ortotópicos clínicamente relevantes.

Conclusiones

Nuestro estudio demostró que la combinación del péptido que penetra en el tumor iRGD y la terapia con el anticuerpo anti–PD-1 proporcionó efectos terapéuticos significativos en los modelos de cáncer colorrectal, probablemente mediados por NRP1 estromal, particularmente en la vasculatura tumoral. La expresión de NRP1 estromal tuvo un alto valor clínico, ya que predijo un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal. Este hallazgo apoya su relevancia como un objetivo terapéutico para mejorar la administración de fármacos intratumoral y proporciona una base para una mayor investigación de las estrategias de combinación basadas en iRGD en el cáncer colorrectal.

Conclusiones

Nuestro estudio demostró que la combinación del péptido que penetra en el tumor iRGD y la terapia con el anticuerpo anti–PD-1 proporcionó efectos terapéuticos significativos en los modelos de cáncer colorrectal, probablemente mediados por NRP1 estromal, particularmente en la vasculatura tumoral. La expresión de NRP1 estromal tuvo un alto valor clínico, ya que predijo un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal. Este hallazgo apoya su relevancia como un objetivo terapéutico para mejorar la administración de fármacos intratumoral y proporciona una base para una mayor investigación de las estrategias de combinación basadas en iRGD en el cáncer colorrectal.