La inhibición de la señalización regulada por el ácido glicocólico circulante potencia la terapia de inhibición de puntos de control inmunitario en el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) representa una de las principales causas de mortalidad.^[1],^[2] Estudios previos han demostrado que las células tumorales que expresan el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) atenúan la infiltración de células T CD8+, lo que resulta en la progresión tumoral.^[3] Las terapias de bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB), que incluyen terapias anti-proteína de muerte celular programada 1 (PD-1)/PD-L1 o anti-proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos, han cambiado el panorama terapéutico y han proporcionado una respuesta clínica sin precedentes en varios tipos de cáncer.^[3]–^[5] Aunque la terapia ICB tiene efectos duraderos en un subconjunto de CCR con alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H), que representan aproximadamente el 15% de todos los casos de CCR, solo el 30-50% de estos pacientes pueden beneficiarse de esta terapia.^[6] Lamentablemente, los pacientes con inestabilidad de microsatélites estable (MSS)/reparación de desajustes deficiente (pMMR) (~85%) tienen una tasa de respuesta de solo 5-10%. La reprogramación metabólica contribuye a la evasión inmune tumoral y a la progresión, lo que también se considera un sello distintivo importante en los tumores. Se ha demostrado que la reprogramación metabólica en el CCR, regulada por el colesterol o los ácidos grasos, es suficiente para remodelar el microambiente tumoral (TME), lo que lleva a la resistencia a la terapia ICB.^[7]–^[10] Por lo tanto, la identificación de los principales metabolitos que regulan la resistencia a la terapia PD-L1 es necesaria para combatir un TME inmunosupresor en el CCR.

La expresión de PD-L1 en las células tumorales está regulada por varios procesos, que incluyen la transcripción y las modificaciones postraduccionales (PTM).^[11] Durante la transformación maligna de las células y la iniciación del tumor, el nivel de transcripción de PD-L1 está asociado con vías oncogénicas, como la activación aberrante de las vías WNT/β-catenina y RAS/MAPK.^[12],^[13] Además, las PTM, incluida la palmitoilación, son fundamentales para regular la estabilidad y la función de la proteína PD-L1, lo que conduce a una reducción de la inmunidad antitumoral en el TME.^[14] Se ha demostrado que el estrés metabólico altera la palmitoilación de proteínas inducida por la palmitoil transferasa.^[14],^[15] En particular, las palmitoil transferasas zinc finger DHHC-type palmitoil transferase (DHHC)3 y DHHC9 se han informado como reguladores clave para mediar la palmitoilación de PD-L1, lo que contribuye a la clasificación lisosomal durante la degradación de PD-L1 en varios tipos de cáncer.^[14],^[16] Por lo tanto, para identificar si y cómo las alteraciones metabólicas en el CCR regulan los efectos de la palmitoilación de PD-L1, es importante para mejorar la terapia ICB.

Los ácidos biliares (AB) se consideran reguladores importantes de la homeostasis del epitelio intestinal en el tracto gastrointestinal. Además de sus propiedades detergentes,^[17] los AB sirven como ligandos para los receptores nucleares (hormonales), como el receptor X farnesoide (FXR), controlando así numerosas funciones celulares, regulatorias y de señalización importantes, así como las respuestas inmunitarias.^[18] En el CCR, los niveles circulantes de AB están fuertemente asociados con la iniciación y la progresión del tumor.^[19],^[20] Sin embargo, la activación de FXR regula negativamente la proliferación de las células madre del cáncer intestinal, lo que lleva a una progresión más lenta del CCR.^[21] Por lo tanto, el papel de los AB en la regulación de la iniciación y el desarrollo del tumor aún es controvertido, y no se sabe si las alteraciones en la señalización mediada por AB en las células tumorales pueden afectar la vigilancia inmunitaria y la sensibilidad a la ICB.

El presente estudio demostró que la inactivación de FXR mediada por el AB primario sérico, el ácido glicólico (GCA), en el CCR es necesaria y suficiente para inhibir la respuesta antitumoral de las células T CD8+. Mecánicamente, GCA aumentó la expresión del factor de transcripción (FT) SRY-box transcription factor 14 (SOX14) al inhibir la función supresora de la transcripción de FXR, y en consecuencia promovió la palmitoilación y la estabilización de PD-L1 inducidas por DHHC9. En particular, la activación de FXR con el agonista GW4064 sensibilizó al CCR resistente a la ICB al tratamiento anti-PD-1/PD-L1. En conjunto, los hallazgos del presente estudio indican que la focalización de la vía de señalización de FXR es una estrategia potencial para aliviar el TME inmunosupresor y mejorar la sensibilidad al tratamiento anti-PDL-1 en el CCR.

Resultados

El aumento del GCA sérico en pacientes con CCR se asocia con un mal pronóstico clínico

Se ha sugerido que la elevación de los AB séricos se asocia con un mayor riesgo de múltiples tipos de cáncer^[22]; sin embargo, la asociación entre los AB y el CCR aún debe dilucidarse. Para investigar si los AB y qué AB se asocian con la tumorigénesis del CCR, recolectamos muestras de suero de 80 pacientes con CCR (Cohorte 1) y 20 individuos sanos, y medimos los niveles de 33 tipos de AB, incluidos los AB primarios libres, secundarios libres, primarios conjugados y secundarios conjugados, mediante LC-MS de alto rendimiento. Se encontró que solo 6 AB, es decir, ácido glicólico (GCA), ácido tauroquenodeoxicólico (TDCA), ácido taurocólico (TCA), ácido tauroquenodeoxicólico (TCDCA), ácido glicoquenodeoxicólico (GCDCA) y ácido glicodeoxicólico (GDCA) se expresaban de manera diferente; además, todos estos 6 AB se sobreexpresaron significativamente en el suero de los pacientes con CCR en comparación con los individuos sanos. En particular, la concentración de GCA se sobreexpresó en mayor medida en comparación con los otros cinco tipos de AB en los pacientes con CCR (Fig. 1a). También se encontró que los niveles de GCA en los pacientes con CCR en estadio III/IV o con metástasis distales eran más altos que los de los pacientes con CCR en estadio I/II o sin metástasis (Fig. 1b, c). Además, los niveles elevados de GCA se asociaron positivamente con una peor supervivencia libre de enfermedad y supervivencia general (Fig. 1d, e). Los análisis de supervivencia univariados y multivariados indicaron además que el GCA sérico sirvió como un biomarcador pronóstico independiente para un mal resultado en los pacientes con CCR (Fig. S1A, B). Además, validamos nuestros resultados utilizando una cohorte adicional de CCR y confirmamos que la concentración sérica de GCA aumentó en los pacientes en estadio III/IV o con metástasis distales (Fig. S1C, D), lo que condujo a una peor supervivencia libre de enfermedad y supervivencia general (Fig. S1E, F). Además, las concentraciones séricas más altas de GCA se asociaron significativamente con una menor supervivencia libre de enfermedad (SLD) y supervivencia general (SG) en los pacientes con CCR sin metástasis hepática (Fig. S1G, H). En conjunto, estos resultados indicaron que el aumento del GCA sérico en los pacientes con CCR se asoció con un mal pronóstico.

GCA promueve el crecimiento tumoral en un modelo de CCR en ratón al inhibir la actividad de FXR

Dado que los AB funcionan principalmente regulando la señalización de FXR en el intestino,^[17],^[19] examinamos los efectos de FXR con su agonista GW4064 en las líneas celulares de CCR MC38, CT26, HCT116 y SW620. Como se esperaba, la activación de FXR por GW4064 promovió significativamente la actividad de FXR (Fig. 1f y S2A). Se eliminó FXR en MC38, CT26, HCT116 y SW620 utilizando el sistema CRISPR/Cas9 (Fig. S2B), y se encontró que GW4064 no promovió la actividad de FXR en las células de CCR deficientes en Fxr (Fig. S2C). A continuación, cultivamos células MC38 con 0-200 µM de GCA y observamos que GCA suprimió la actividad de FXR de manera dependiente de la dosis (Fig. S2D). En particular, 100 nM de GCA disminuyó significativamente la activación de FXR sin afectar la proliferación de las células MC38, lo que sugiere que esta dosis de GCA es óptima para los experimentos in vitro (Fig. S2D). De manera consistente, se observó la misma tendencia en otras células de CCR (Fig. 1f y S2A). Y GCA inhibió la expresión transcripcional de los genes diana de FXR SHIP y IBABP en estas líneas celulares de CCR, lo que se confirmó mediante qPCR (Fig. 1g y S2E). Dado que los AB regulan la función de FXR alterando la expresión de FXR o la capacidad de unirse a RXR, que es necesaria para su actividad transcripcional descendente^[23], realizamos qPCR y experimentos de inmunoprecipitación, y encontramos que GCA inhibió la interacción entre FXR y RXR, sin afectar el nivel de ARNm de FXR (Fig. S2F, G). Además, también observamos que el agonista de FXR fue suficiente para restaurar la expresión de SHIP y IBABP en las células MC38 y HCT116 tratadas con GCA (Fig. S2H), lo que sugiere un papel negativo de GCA en la señalización de FXR en el CCR.

Para explorar aún más los roles de GCA en el CCR, las células MC38, CT26, HCT116 y SW620 se incubaron con GCA o GW4064, y se observó que el tratamiento tuvo poco efecto sobre la proliferación de las células tumorales in vitro (Fig. S2I). De manera consistente, la tasa de proliferación también fue comparable en las células FXR eliminadas (FXR-KO) y en las células de control (Fig. S2J). Sin embargo, utilizando ratones con eliminación específica del epitelio intestinal de Fxr (Fxr-ko, Fxr−/−), se encontró que Fxr se eliminó con éxito en los tejidos intestinales y en los tumores inducidos por AOM/DSS (Fig. S2K, L). La pérdida de FXR promovió el desarrollo del CCR, como lo demuestra una disminución de la longitud del colon en los ratones Fxr-ko (Fig. 1h). El análisis histológico mostró que los tumores derivados de los ratones Fxr-ko exhibieron un tamaño aumentado y una diferenciación deficiente (Fig. 1i). También generamos otro modelo de ratón ortotópico de CCR implantando células MC38 y Fxr-KO de control en la mucosa del colon. De manera consistente, los ratones con tumores Fxr-KO mostraron un aumento del crecimiento tumoral y una peor supervivencia general en comparación con los tumores de control (Fig. S3A), lo que sugiere que FXR actuó como un supresor tumoral en la tumorigénesis del CCR in vivo. Para confirmar aún más este resultado, inoculamos células MC38 en ratones C57BL/6 y observamos que el tratamiento con 400 mg/kg de GCA (gavaje intragástrico; ig) aumentó significativamente la carga tumoral sin efectos secundarios evidentes, según lo medido por la pérdida de peso durante el curso (Fig. S3B). A continuación, medimos las concentraciones de los AB que se elevaron significativamente en el suero de los pacientes con CCR en los ratones después de la administración de GCA (400 mg/kg). Si bien los niveles de GCA en suero y tumoral apenas eran detectables en los ratones portadores de tumores sin tratamiento con GCA, los ratones tratados con GCA exhibieron una acumulación medible, con niveles en suero que alcanzaron aproximadamente 150 nM y concentraciones tumorales de alrededor de 82 nmol/g (Fig. S3C, D). En particular, las concentraciones medianas de GCA en las cohortes humanas I y II fueron de aproximadamente 96,4 nM y 96,7 nM, respectivamente. Estos valores son comparables o ligeramente inferiores a los observados en los ratones tratados con GCA, lo que respalda la relevancia fisiológica de nuestro modelo experimental.

En particular, GCA aumentó significativamente el crecimiento tumoral en los modelos de CCR inducidos por AOM/DSS, como lo demuestra un aumento del número de tumores y una longitud de colon más corta en los ratones tratados con GCA (Fig. S3E). Sin embargo, el tratamiento con GCA no pudo promover aún más la tumorigénesis en los ratones Fxr-ko C57BL/6, lo que sugiere que FXR es el objetivo funcional de la tumorigénesis inducida por GCA. Si bien GCA promovió significativamente el crecimiento tumoral y disminuyó la supervivencia general en los ratones inmunocompetentes inoculando células MC38 o CT26 por vía subcutánea (Fig. S3F, G), no se observó una diferencia significativa en términos de tamaño tumoral o tasa de supervivencia entre los grupos tratados con GCA y los grupos de control cuando las células MC38 o CT26 se inocularon en ratones BALB/c inmunodeficientes (Fig. S3H, I). La qRT-PCR mostró que GCA suprimió la vía de señalización de FXR in vivo, como lo demuestra la disminución de la expresión de SHIP y IBABP en los tumores de MC38 o CT26 derivados de ratones inmunocompetentes o ratones desnudos (Fig. S3J, K). Para evitar los posibles efectos de la transformación bacteriana de GCA en el intestino, inyectamos GCA por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana en ratones con tumores de MC38 y encontramos un aumento del crecimiento tumoral en los ratones con tratamiento con GCA (Fig. S3L). En conjunto, nuestros datos indicaron que las respuestas inmunitarias desempeñaron un papel importante en el desarrollo del CCR inducido por GCA.

Basándose en la capacidad de GCA para inhibir la actividad de FXR, el presente estudio investigó a continuación si la alteración de la función de FXR podría afectar el crecimiento tumoral mediado por GCA. De hecho, se observó un aumento del tamaño tumoral y una disminución de la tasa de supervivencia en ratones inmunocompetentes, pero no en ratones BALB/c desnudos, cuando se trató a los animales con el antagonista de FXR, T-βMCA (Fig. 1j y S4A, B), lo que imita el comportamiento de los tumores inoculados en ratones inmunocompetentes o en ratones inmunodeficientes tratados con GCA. En consecuencia, se confirmó el papel supresor de FXR en el cáncer cuando se trató a ratones BALB/c desnudos inmunocompetentes, pero no inmunodeficientes, con el agonista de FXR, GW4064 (Fig. S4C-G). Para explorar si la alteración de la señalización de FXR era fundamental para el aumento del crecimiento tumoral inducido por GCA in vivo, se trató a los ratones con GCA en ausencia o presencia del agonista de FXR, GW4064, después de inocular células MC38 o CT26. Como se esperaba, los ratones que recibieron GW4064 mostraron una disminución del tamaño tumoral y una prolongación de la supervivencia general en comparación con los ratones tratados solo con GCA (Fig. 1k y S4H). Cabe destacar que GW4064 revirtió la expresión de los genes diana de FXR, I-BABP y SHP, que fueron inhibidos por GCA (Fig. S4I, J). En conjunto, estos datos sugieren que la alteración de la supresión tumoral mediada por FXR fue fundamental para la tumorigénesis inducida por GCA, y que las respuestas inmunitarias estuvieron implicadas en la regulación del desarrollo tumoral mediado por el eje GCA-FXR.

El tratamiento con GCA inhibe la infiltración de células T CD8+ y la respuesta antitumoral

Para investigar más a fondo los efectos de las células inmunitarias infiltradas en el tumor sobre la progresión tumoral mediada por GCA/FXR, se identificaron cinco grupos de células inmunitarias independientes (CD45+), incluidos los linfocitos B, las células T CD4+ y CD8+, los macrófagos y las células asesinas naturales, basándose en el análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) (Fig. 2a, izquierda). Se observó un aumento del número total de células T CD8+ y macrófagos en los tumores tratados con GW4064 en comparación con los no tratados (Fig. 2a, derecha). La expresión de los marcadores de los subtipos inmunitarios se mostró utilizando un panel de 21 marcadores (Fig. S5A). A continuación, se aislaron tumores MC38 de ratones que recibieron GCA (i.g.) durante 10 días, y se analizaron los porcentajes de subpoblaciones en las células inmunitarias mediante citometría de flujo. En consecuencia, se observó que las células T CD8+ y los macrófagos, pero no las células T CD4+ o las células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg), se redujeron en los tumores tratados con GCA (Fig. 2b). Para explorar si el efecto supresor de FXR sobre los tumores dependía de las células T CD8+ o de los macrófagos, se eliminaron las células T CD8+ o los macrófagos en los ratones utilizando un anticuerpo anti-CD8α específico o liposomas de clodronato (Fig. S5B), respectivamente, antes de inocular a los ratones con células MC38 con o sin tratamiento con GCA o GW4064. Cabe destacar que el tratamiento con GCA no aumentó aún más el crecimiento tumoral en los ratones con células T CD8+ agotadas en comparación con los controles no tratados (Fig. 2c). Además, también se encontró que el agonista de FXR no logró inhibir la progresión del tumor de CRC en ratones con células T CD8+ agotadas (Fig. 2d). Sin embargo, el crecimiento tumoral fue comparable tanto en los ratones con macrófagos agotados como en los ratones de control, independientemente del tratamiento con GCA o GW4064 (Fig. 2e, f). Además, se inocularon células CRC MC38 o CT26 en ratones Rag1−/− (que son deficientes en células T y B), y se observó que el tratamiento con el antagonista o el agonista de FXR tuvo un efecto limitado sobre el crecimiento tumoral en los ratones Rag1−/− (Fig. S5C, D). Estos datos sugieren que las células T CD8+, pero no los macrófagos, en el microambiente tumoral (TME) estuvieron implicadas en el crecimiento tumoral mediado por GCA/FXR.

A continuación, exploramos la vía de señalización enriquecida en la tumorigénesis inducida por GCA. El análisis de secuenciación de ARN de célula única reveló que los genes regulados al alza en los tumores activados por la señalización de FXR estaban asociados principalmente con las respuestas inmunitarias, incluidas las respuestas de IFN tipo I/II (Fig. S6A, B). Examinamos la expresión de los genes estimulados por IFN (ISG), incluidos CXCL9, CXCL10, BST2, STAT1 y IFITM3, mediante qPCR. Como se esperaba, los niveles de ARNm de estos ISG se regularon al alza significativamente en los tejidos tumorales de MC38 y CT26 derivados de ratones inmunocompetentes tratados con GW4064 (Fig. S6C), mientras que la expresión de los ISG disminuyó en los tumores tratados con GCA (Fig. S6D). Sin embargo, no se observó una alteración de los niveles de ARNm de los ISG en los tejidos tumorales derivados de ratones BALB/c desnudos inmunodeficientes cuando se trataron con GW4064 o GCA (Fig. S6E, F). Curiosamente, también se trataron células MC38 y HCT116 con GW4064 o GCA en cultivo, pero no se observó un aumento significativo en la expresión transcripcional de estos ISG en las células CRC tratadas con GW4064 o GCA (Fig. S6G, H), lo que sugiere una dependencia de las respuestas inmunitarias asociadas a la señalización de IFN in vivo.

Dado que el IFNγ es fundamental para la supresión tumoral mediada por las células T infiltradas en el tumor CD8+, utilizamos además el análisis de FACS para evaluar las células T CD8+ que expresan IFNγ. Se encontró que las células T CD8+ que expresan IFNγ disminuyeron significativamente en los tumores MC38 o CT26 tratados con GCA (Fig. 2g y S6I). Sin embargo, se observó un aumento de la frecuencia de células T CD8+ agotadas PD-1+ TIM3+ en los tumores tratados con GCA en comparación con los controles (Fig. 2g y S6I). Por el contrario, los tumores tratados con el agonista de FXR, GW4064, mostraron una población aumentada de células T CD8+ IFNγ+, acompañada de una atenuación de la infiltración de células T CD8+ agotadas (Fig. 2h y S6J). Por lo tanto, los resultados actuales sugieren que el GCA indujo la alteración de FXR, lo que afectó la actividad antitumoral de las células T CD8+ en el TME.

La sobreexpresión de PD-L1 es necesaria para la tumorigénesis mediada por GCA

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de la supresión de las respuestas inmunitarias de las células T mediada por GCA, se realizó una proteómica basada en la adquisición independiente de datos mediante espectrometría de masas (MS) en células MC38 tratadas con o sin GCA. El mapa de calor mostró que PD-L1 fue la proteína más significativamente aumentada entre las 20 proteínas expresadas de forma diferente (FC ≥ 2, p ≤ 0,05) que se anotaron tanto para la producción de citocinas como para las vías de regulación de la respuesta inmunitaria en las células MC38 tratadas con GCA (Fig. 2i). A continuación, se trataron las células CRC con GCA o GW4064 in vitro, y se evaluaron los cambios en los niveles de ARNm y proteína de PD-L1. Se encontró que los niveles de proteína y la expresión en la superficie celular de PD-L1, pero no sus niveles de ARNm, se regularon al alza en las células tumorales tratadas con GCA (Fig. 2j y S7A, C). Por el contrario, los niveles de proteína de PD-L1 disminuyeron en las células MC38 tratadas con el agonista de FXR, GW4064, en comparación con las células no tratadas (Fig. 2j y S7B, C), lo que sugiere que el aumento de PD-L1 mediado por GCA/FXR se reguló de forma postranscripcional. Funcionalmente, se co-cultivaron células T CD8+ infiltradas en el tumor con células MC38 o CT26 que habían sido pretratadas con GCA en condiciones de estimulación anti-CD3 y anti-CD28, y se encontró que la inactivación de FXR hizo que las células CRC fueran más resistentes a las células T CD8+ en los ensayos de eliminación de células tumorales mediadas por células T (Fig. S7D). Además, se corroboraron los resultados con un modelo de crecimiento tumoral subcutáneo in vivo y se encontró que la eliminación de Cd274 en las células MC38 o CT26 revirtió significativamente la tumorigénesis inducida por GCA (Fig. 2k, l). El análisis de qRT-PCR reveló que la eliminación de CD274 no afectó la supresión de los genes diana de FXR, I-BAPA y SHP, inducida por GCA (Fig. S7F, G). Si bien la terapia con dosis bajas de anti-PD-L1 (10 mg/kg) tiene un efecto mínimo sobre la supresión tumoral en ratones tratados con GCA con tumores subcutáneos o en ratones Fxr−/− con un modelo de CRC inducido por AOM/DSS, el bloqueo de la señalización PD-L1/PD-1 con una dosis alta de anti-PD-L1 (100 mg/kg) revirtió eficazmente la tumorigénesis inducida por GCA (Fig. S7H-J), lo que sugiere que el aumento de la expresión de PD-L1 en los tumores es fundamental para la disfunción de las células T CD8+ mediada por GCA/FXR durante el crecimiento tumoral.

GCA acelera la palmitoilación de PD-L1 a través de DHHC9 en las células tumorales

Dado que el tratamiento con GCA no alteró los niveles transcripcionales de PD-L1 en las células CRC, suprimimos a continuación las vías de degradación comunes que están implicadas en la regulación de PD-L1. Se observó que la acumulación total y en la superficie de PD-L1 mediada por GCA se revirtió con el 2-bromopalmitato, un inhibidor general de la palmitoilación, pero no con el inhibidor de la autofagia 3-MA o el inhibidor del proteasoma MG-132 en las células CRC (Fig. 3a, b). De manera similar, se observó un aumento de la expresión de PD-L1 en las células CRC tratadas con palmostatina B, el inhibidor de la acil proteína tioesterasa 1, que promueve la palmitoilación global, de forma dependiente de la dosis (Fig. 3c). Además, GCA mejoró la modificación de la palmitoilación de PD-L1 en las células CRC según los resultados del ensayo de etiquetado Click-iT, lo que indica que GCA estabilizó la proteína PD-L1 mediante la palmitoilación (Fig. 3d).

Para explorar las palmitoiltransferasas clave para la acumulación de PD-L1 mediada por GCA, se analizaron los niveles transcripcionales de las palmitoiltransferasas mediante el análisis de secuenciación de ARN, y se encontró que los niveles de expresión de DHHC9, DHHC1, DHHC12, DHHC18 y DHHC24 se encontraban entre los genes expresados de forma diferencial más altos en las células tratadas con GCA en comparación con los controles (Fig. 3e). A continuación, se eliminaron estos candidatos en las células CRC MC38 y HCT116 utilizando siRNA específicos, y se encontró que la acumulación de la proteína total y en la superficie de PD-L1 inducida por GCA se redujo significativamente en las células CRC con eliminación de DHHC9, pero no en las células CRC con eliminación de otras palmitoiltransferasas (Fig. 3f, g). Además, los niveles transcripcionales de DHHC9 se regularon al alza significativamente en las células CRC tratadas con GCA, lo que se confirmó mediante qPCR (Fig. S8A). Para investigar más a fondo la función de DHHC9 en la regulación de la modificación de la palmitoilación en PD-L1, se sobreexpresó DHHC9 en las células CRC. Se observó un aumento de la expresión de la proteína, pero no del ARNm, de PD-L1 en las células CRC con sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3h y S8B). En particular, la modificación de la palmitoilación en PD-L1 se acumuló significativamente con la sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3i). A continuación, evaluamos si DHHC9 era fundamental para la expresión de PD-L1 mediada por GCA. Como se esperaba, se observó una disminución de la expresión de la proteína, pero no de la expresión transcripcional, de PD-L1 en las células con eliminación de DHHC9 tratadas con GCA (Fig. S8C, D). Funcionalmente, se encontró que la capacidad de eliminación de células tumorales de las células T CD8+ derivadas del tumor aumentó significativamente cuando se co-cultivaron con células CRC con eliminación de DHHC9, incluso sin tratamiento con GCA (Fig. 3j). Por el contrario, la sobreexpresión de DHHC9 en las células MC38 o CT26 disminuyó la capacidad de eliminación de las células T CD8+, lo que condujo a un aumento del crecimiento tumoral (Fig. 3k). Además, esta capacidad de promoción tumoral no pudo ser revertida por el tratamiento con el agonista de FXR, GW4064 (Fig. 3k). En conjunto, estos resultados indicaron que la modificación de la palmitoilación mediada por DHHC9 fue fundamental para la estabilización de PD-L1 y el crecimiento tumoral inducidos por GCA/FXR.

El eje SOX14-DHHC9 regula la expresión de PD-L1 en las células CRC

Para identificar los factores de transcripción (FT) que son responsables de la regulación mediada por GCA de la expresión de PD-L1 en los tumores, analizamos todos los factores de transcripción expresados diferencialmente con un cambio de pliegue (FC) ≥ 2 en las células de CRC tratadas con GCA, y se observó que SOX14 se encontraba en la parte superior de la lista de los FT candidatos en términos de FC en la expresión (Fig. 4a). A continuación, se realizaron estudios de pérdida de función utilizando siRNA específicos dirigidos a los 5 principales FT candidatos. Los resultados mostraron que la inhibición de SOX14, pero no de otros candidatos, podía disminuir significativamente la expresión de la proteína PD-L1 en las células de CRC (Fig. 4b). Además, la expresión de mRNA del gen IBABP aguas abajo de FXR se asoció negativamente con la expresión de SOX14 en los tejidos tumorales derivados de 80 pacientes con CRC (Fig. 4c, parte superior). Posteriormente, exploramos si FXR inhibía directamente la transcripción de SOX14. La región promotora de SOX14 humano se analizó para identificar el sitio de unión a FXR utilizando la base de datos JASPAR, y se realizó un ensayo ChIP con un anticuerpo anti-FXR en condiciones de tratamiento con GCA o GW4064. Se observó que FXR se unía directamente al promotor de SOX14 (sitio 2), como lo demuestra el enriquecimiento de la secuencia diana (Fig. S9A). Además, GCA inhibió la capacidad de unión al ADN de FXR, mientras que el agonista de FXR, GW4064, promovió su unión al ADN en las células de CRC (Fig. S9B). Finalmente, se generaron constructos de reportero de luciferasa para probar la actividad transcripcional de las regiones WT y de las regiones con deficiencia de la secuencia de unión a FXR para los sitios de unión a FXR (sitio 2). Como se esperaba, la actividad de la luciferasa aumentó significativamente en las células HCT116 y SW620 transfectadas con constructos de la región WT tras la estimulación con GCA (Fig. S9C). Por el contrario, GW4064 disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de las células de CRC con constructos de la región WT, pero no de las células transfectadas con constructos de la región mut (Fig. S6C), lo que sugiere que FXR actúa como un supresor transcripcional de la expresión de SOX14. También se encontró que la inhibición de SOX14 disminuyó la expresión de PD-L1 mediante el uso de shRNA dirigido a SOX14 en múltiples líneas celulares de CRC, incluso después del tratamiento con GCA (Figs. 4d, e y S9D-F). Cabe destacar que se observaron niveles más altos de proteína PD-L1 en las células con sobreexpresión de SOX14 (Figs. 4f, g y S9E), lo que sugiere que el aumento de la expresión de SOX14 puede estar implicado en la expresión de PD-L1 inducida por GCA. Además, también investigamos si SOX14 estaba implicado en la regulación de la función promutora del tumor mediada por GCA mediante la inoculación de células con inhibición de SOX14 en el tejido subcutáneo o la mucosa del colon de ratones tratados con GCA. A continuación, descubrimos que la deficiencia de Sox14 inhibió el crecimiento tumoral inducido por GCA, lo que se acompañó de un aumento de la frecuencia de los linfocitos T CD8+ infiltrantes tumorales, así como del subconjunto de linfocitos T CD8+ IFNγ+, pero de una disminución del número de linfocitos T CD8+ agotados tanto en el modelo de CRC subcutáneo como ortotópico (Figs. 4h, i, S9G, H). Los datos indicaron que SOX14 era un FT clave en la regulación de la expresión de PD-L1 mediada por GCA.

Para identificar si SOX14 regula directamente la expresión de DHHC9, primero analizamos la correlación entre la expresión de mRNA de SOX14 y DHHC9 en 80 muestras humanas de CRC, y descubrimos que SOX14 se correlacionaba positivamente con la expresión de mRNA de DHHC9 (Fig. 4c, parte inferior). También se validó que GCA aumentaba significativamente la transcripción y la expresión de proteínas de SOX14 y DHHC9, así como la expresión de la proteína PD-L1, en las células murinas MC38 y humanas HCT116 (Fig. 4d, e). Sin embargo, la inhibición de SOX14 disminuyó la expresión transcripcional de DHHC9, así como los niveles de proteína de DHHC9 y PD-L1 en las células de CRC cuando se trataron con GCA (Fig. 4d, e). Por el contrario, se observaron expresiones más altas de DHHC9 y PD-L1 en las células de CRC con sobreexpresión de SOX14 en comparación con las células de control (Fig. 4f, g). Lo más importante es que la inhibición de DHHC9 y PD-L1 mediada por FXR se pudo revertir mediante la sobreexpresión de SOX14 en las células incubadas con un agonista de FXR (Fig. 4f, g), lo que sugiere que SOX14 es un potente FT aguas abajo de FXR para inducir la expresión transcripcional de DHHC9. A continuación, analizamos la base de datos JASPAR e identificamos dos secuencias de unión a SOX14 en la región promotora de DHHC9 humano mediante un ensayo ChIP. Solo la secuencia de unión predicha del sitio 1 se enriqueció en los promotores enriquecidos con ChIP (Fig. 4j, k). Además, se generaron constructos de reportero de luciferasa con regiones de deficiencia de unión a SOX14 para la unión a SOX14 para evaluar la actividad transcripcional, y se descubrió que la actividad de la luciferasa aumentó significativamente en las células MC38 y HCT116 con sobreexpresión de SOX14 transfectadas con constructos de la región DHHC9 WT, pero no en las células transfectadas con constructos de la región DHHC9mut (Fig. 4l). Esto indicó que SOX14 era fundamental para la expresión de DHHC9.

A continuación, examinamos si DHHC9 estaba implicado en la progresión tumoral mediada por SOX14 mediante la sobreexpresión de DHHC9 en las células de CRC con inhibición de SOX14. Descubrimos que la sobreexpresión de DHHC9 aumentó la expresión de PD-L1 en las células de CRC que presentaban una expresión reducida de PD-L1 debido a la inhibición de SOX14 (Fig. S9F). Y la sobreexpresión de DHHC9 bloqueó la inhibición tumoral mediada por la deficiencia de SOX14 (Fig. S9I). Además, la sobreexpresión de DHHC9 en las células deficientes en SOX14 condujo a un aumento de la infiltración de linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD8+ IFNγ+ efectores, pero a una disminución de la infiltración de linfocitos T CD8+ agotados PD-1+ TIM3+ (Fig. S9J). En conjunto, estos datos revelaron que DHHC9 era el objetivo transcripcional y funcional de SOX14.

El eje SOX14/DHHC9 mediado por GCA se correlaciona con una menor eficacia de la inmunoterapia en pacientes con CRC

Para comprender mejor el papel del eje SOX14/DHHC9 regulado por GCA en la inmunoterapia en pacientes con CRC, se realizó un análisis LC-MS en el suero de 41 pacientes con CRC-m MSI-H que recibieron bloqueo de PD-1 solo o en combinación con quimioterapia. La mayoría de los pacientes con CRC-m (15/20) con altos niveles de GCA se predijo que no responderían a la inmunoterapia, mientras que los pacientes con CRC-m (19/21) con bajas concentraciones de GCA mostraron respuesta a la inmunoterapia (Tabla S2). La resonancia magnética y la tomografía computarizada mostraron que el paciente 27 tenía un nivel relativamente alto de GCA en suero y progresión tumoral después del tratamiento con bloqueo de PD-1 (Fig. 5a, izquierda y c), mientras que el paciente 14, con una baja concentración de GCA en suero, mostró regresión tumoral (Fig. 5a, derecha y c). También examinamos las proteínas SOX14 y DHHC9 mediante inmunofluorescencia en tejidos tumorales fijados en formalina e incluidos en parafina de pacientes con CRC-m que recibieron bloqueo de PD-1. La mayoría de los pacientes con CRC-m con altas concentraciones de GCA en suero mostraron una fuerte tinción de SOX14, DHHC9 y PD-L1 acompañada de un bajo número de linfocitos T CD8+, y a menudo insensibilidad a la terapia anti-PD-1 (Fig. 5b, c). Por el contrario, los pacientes con bajos niveles de GCA en suero mostraron resultados opuestos (Fig. 5b, c). Además, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló una correlación significativa entre los altos niveles de GCA, SOX14, DHHC9 y PD-L1 y las tasas de supervivencia libre de progresión (SLP) más cortas de los pacientes con CRC-m que recibieron terapia anti-PD-1 (Fig. 5d-g). Por el contrario, un mayor número de linfocitos T CD8+ infiltrantes intratumorales se acompañó de tasas de SLP más prolongadas en pacientes con CRC que recibieron terapia anti-PD-1 (Fig. 5h). El análisis de correlación de Spearman mostró que la expresión de la proteína SOX14 se correlacionó positivamente con la expresión de las proteínas DHHC9 y PD-L1 en las muestras de tumores de CRC según las puntuaciones de tinción de inmunofluorescencia (Fig. 5i, j). La expresión de la proteína DHHC9 también se asoció positivamente con la proteína PD-L1 (Fig. 5k). Confirmamos además nuestros resultados de que el nivel de GCA en suero se asoció con la expresión de DHHC9 o SOX14 en los tumores de pacientes con CRC en otra cohorte (Fig. S10A, B). Además, la tinción de DHHC9 se correlacionó con la tinción de SOX14 en estos tumores de CRC (Fig. S10C). En general, estos resultados sugirieron que el eje GCA-SOX14/DHHC9/PD-L1 regulado por GCA desempeñó un papel importante en la eficacia de la inmunoterapia en el CRC-m, lo que podría ser útil como posibles marcadores pronósticos para el bloqueo de PD-1 en el futuro.

La inhibición de la expresión de SOX14 y DHHC9 inducida por GCA/FXR sensibiliza al CRC a la terapia anti-PD-1

Para explorar si el eje SOX14-DHHC9-PD-L1 es fundamental para la inmunosupresión mediada por GCA/FXR, se planteó la hipótesis de que la inhibición de Sox14 (Sox-KD) podría mejorar el tratamiento anti-PD-1 en el CRC bajo altos niveles de GCA en el microambiente tumoral (MET). A continuación, se injertaron ratones inmunocompetentes tratados con GCA con células de control o Sox14-KD de CRC, y se descubrió que la inhibición de Sox14 inhibió el crecimiento del cáncer de colon MC38 en presencia de terapia anti-PD-1 (Fig. 6a). Además, se observó un aumento de la infiltración de linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD8+ IFNγ+ efectores, y una disminución de los linfocitos T CD8+ agotados en las células Sox14-KD en comparación con las células de control en ratones con y sin anticuerpo anti-PD-1 (Fig. 6b). De manera similar, la inhibición de Dhhc9 también suprimió significativamente el crecimiento tumoral en ratones sometidos a terapia anti-PD-1 en comparación con los ratones con monoterapia. Además, la deficiencia de Dhhc9 mejoró la función antitumoral de los linfocitos T CD8+ en el MET, como lo demuestra la proporción de linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD8+ IFNγ+ enriquecidos en los tumores MC38 con inhibición de Dhhc9 con tratamiento anti-PD-1 (Fig. 6c, d). Dado que GCA regulaba negativamente la actividad de FXR, investigamos además si un agonista de FXR podría sinergizar las células de CRC con la terapia anti-PD-1. Como se esperaba, el tratamiento combinado con GW4064 y anti-PD-1 ralentizó significativamente el crecimiento tumoral, lo que se asoció con un mayor número de linfocitos T CD8+ IFNγ+ efectores y un menor porcentaje de linfocitos T agotados en los tumores en comparación con los que recibieron monoterapia, lo que sugiere que la activación de FXR promovió suficientemente los efectos antitumorales de la terapia anti-PD-1 (Fig. S11A-D). Además, la terapia anti-PD-1 disminuyó ligeramente la tumorigénesis de CRC mediada por AOM/DSS en ratones C57BL/6 y BALB/c (Fig. S11E, F). Cabe destacar que observamos que los ratones tratados con anti-PD-1 y GW4064 combinados tenían más probabilidades de beneficiarse del tratamiento, como lo demuestra un aumento de la longitud del colon con una disminución del número y el área de los tumores en los ratones que recibieron el tratamiento combinado en comparación con la monoterapia (Fig. S11E, F). Para reforzar las conclusiones actuales, se generó un cáncer de colon MC38 resistente al anti-PD-1 (MC38R) mediante tres rondas de selección in vivo/in vitro. El anticuerpo anti-PD-1 tuvo un efecto limitado en el crecimiento de las células MC38R en los modelos de CRC subcutáneo y ortotópico (Figs. 6e, f y S11G, H). Sin embargo, GW4064 inhibió el crecimiento tumoral de MC38R y sensibilizó las células MC38R a la terapia anti-PD-1, lo que se acompañó de una respuesta antitumoral significativamente mayor de los linfocitos T CD8+, como lo demuestra el aumento de la infiltración de linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD8+ IFNγ+ efectores, y la disminución de los linfocitos T CD8+ agotados en los tumores en comparación con la monoterapia con GW4064 (Figs. 6e, f y S11G, H). Los datos indicaron que la combinación de un agonista de FXR con la terapia anti-PD-1 mejoró la eficacia de la anti-PD-1 en el cáncer de colon resistente.

El aumento del GCA en suero en pacientes con CRC se asocia con un mal pronóstico clínico

Se ha sugerido que la elevación de los ácidos biliares (AB) en suero está asociada con un mayor riesgo de múltiples tipos de cáncer^[22]; sin embargo, la asociación entre los AB y el CCRC aún no se ha dilucidado. Para investigar si los AB y qué AB están asociados con la tumorigénesis del CCRC, recolectamos muestras de suero de 80 pacientes con CCRC (cohorte 1) y 20 individuos sanos, y medimos los niveles de 33 tipos de AB, incluidos los AB primarios libres, secundarios libres, primarios conjugados y secundarios conjugados, mediante LC-MS de ultra alto rendimiento. Se encontró que solo 6 AB, es decir, ácido glicólico (GCA), ácido tauroquenodeoxicólico (TDCA), ácido taurocólico (TCA), ácido tauroquenodeoxicólico (TCDCA), ácido glicoquenodeoxicólico (GCDCA) y ácido glicodeoxicólico (GDCA) se expresaban de manera diferente; además, todos estos 6 AB se encontraron significativamente sobreexpresados en el suero de pacientes con CCRC en comparación con individuos sanos. En particular, la concentración de GCA se encontró mayoritariamente sobreexpresada en comparación con los otros cinco tipos de AB en pacientes con CCRC (Fig. 1a). También se encontró que los niveles de GCA en pacientes con CCRC en estadio III/IV o con metástasis distales eran más altos que los encontrados en pacientes con CCRC en estadio I/II o sin metástasis (Fig. 1b, c). Además, los niveles elevados de GCA se asociaron positivamente con un peor pronóstico en términos de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global a los 5 años (Fig. 1d, e). Los análisis de supervivencia univariante y multivariante indicaron además que el GCA sérico sirvió como un biomarcador pronóstico independiente para un peor resultado en pacientes con CCRC (Fig. S1A, B). Además, validamos nuestros resultados utilizando una cohorte adicional de CCRC y confirmamos que la concentración sérica de GCA estaba aumentada en pacientes en estadio III/IV o con metástasis distales (Fig. S1C, D), lo que conducía a una peor supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global (Fig. S1E, F). Además, las concentraciones séricas más altas de GCA siguieron asociándose significativamente tanto con una menor supervivencia libre de enfermedad (SLD) como con una menor supervivencia global (SG) en pacientes con CCRC sin metástasis hepática (Fig. S1G, H). En conjunto, estos resultados indicaron que el aumento del GCA sérico en pacientes con CCRC se asoció con un peor pronóstico.

El GCA promueve el crecimiento tumoral en un modelo murino de CCRC mediante la inhibición de la actividad de FXR

Dado que los AB funcionan principalmente regulando la señalización de FXR en el intestino,^[17],^[19], examinamos los efectos de FXR y su agonista GW4064 en las líneas celulares de CCRC MC38, CT26, HCT116 y SW620. Como se esperaba, la activación de FXR por GW4064 promovió significativamente la actividad de FXR (Fig. 1f y S2A). Se eliminó FXR en las células MC38, CT26, HCT116 y SW620 mediante el sistema CRISPR/Cas9 (Fig. S2B), y se encontró que GW4064 no promovió la actividad de FXR en las células de CCRC murinas y humanas deficientes en Fxr (Fig. S2C). A continuación, cultivamos células MC38 con 0-200 µM de GCA y observamos que el GCA suprimió la actividad de FXR de manera dependiente de la dosis (Fig. S2D). Cabe destacar que 100 nM de GCA disminuyó significativamente la activación de FXR sin afectar la proliferación de las células MC38, lo que sugiere que esta dosis de GCA es óptima para los experimentos in vitro (Fig. S2D). De manera similar, se observó la misma tendencia en otras células de CCRC (Fig. 1f y S2A). Y el GCA inhibió la expresión transcripcional de los genes diana de FXR SHIP e IBABP en estas líneas celulares de CCRC, lo que se confirmó mediante qPCR (Fig. 1g y S2E). Dado que los AB regulan la función de FXR alterando la expresión de FXR o la capacidad de unirse a RXR, lo cual es necesario para su actividad transcripcional descendente^[23], realizamos qPCR y experimentos de inmunoprecipitación, y encontramos que el GCA inhibió la interacción entre FXR y RXR, sin afectar el nivel de ARNm de FXR (Fig. S2F, G). Además, también observamos que el agonista de FXR fue suficiente para restaurar la expresión de SHIP e IBABP en las células MC38 y HCT116 tratadas con GCA (Fig. S2H), lo que sugiere un papel negativo del GCA en la señalización de FXR en el CCRC.

Para explorar aún más los roles del GCA en el CCRC, las células MC38, CT26, HCT116 y SW620 se incubaron con GCA o GW4064, y se observó que el tratamiento tuvo poco efecto sobre la proliferación de las células tumorales in vitro (Fig. S2I). De manera similar, la tasa de proliferación también fue comparable tanto en las células FXR-eliminadas (FXR-KO) como en las células de control (Fig. S2J). Sin embargo, utilizando ratones con eliminación específica de Fxr en el epitelio intestinal (Fxr-ko, Fxr−/−), se encontró que Fxr se eliminó con éxito en los tejidos intestinales y en los tumores inducidos por AOM/DSS (Fig. S2K, L). La pérdida de FXR promovió el desarrollo del CCRC, como lo demuestra la disminución de la longitud del colon en los ratones Fxr-ko (Fig. 1h). El análisis histológico mostró que los tumores derivados de los ratones Fxr-ko exhibieron un tamaño aumentado y una diferenciación deficiente (Fig. 1i). También generamos otro modelo ortotópico de CCRC en ratones mediante la implantación de células Fxr-eliminadas y células de control MC38 en la mucosa del colon. De manera similar, los ratones con tumores Fxr-eliminados mostraron un aumento del crecimiento tumoral y un peor pronóstico en términos de supervivencia global en comparación con los tumores de control (Fig. S3A), lo que sugiere que FXR actuó como un supresor tumoral en la tumorigénesis del CCRC in vivo. Para confirmar aún más este resultado, inoculamos células MC38 en ratones C57BL/6 y observamos que un tratamiento de 400 mg/kg de GCA (administración intragástrica; ig) aumentó significativamente la carga tumoral sin efectos secundarios evidentes, según lo medido por la pérdida de peso durante el curso (Fig. S3B). A continuación, medimos las concentraciones de los AB que se encontraron significativamente elevadas en el suero de los pacientes con CCRC en los ratones después de la administración de GCA (400 mg/kg). Si bien los niveles de GCA en suero y tumoral apenas eran detectables en los ratones con tumores sin tratamiento con GCA, los ratones tratados con GCA exhibieron una acumulación medible, con niveles en suero que alcanzaron aproximadamente 150 nM y concentraciones tumorales alrededor de 82 nmol/g (Fig. S3C, D). En particular, las concentraciones medianas de GCA en suero en las cohortes humanas I y II fueron de aproximadamente 96,4 nM y 96,7 nM, respectivamente. Estos valores son comparables o ligeramente inferiores a los observados en los ratones tratados con GCA, lo que respalda la relevancia fisiológica de nuestro modelo experimental.

Cabe destacar que el GCA aumentó significativamente el crecimiento tumoral en los modelos de CCRC inducidos por AOM/DSS, como lo demuestra un aumento del número de tumores y una longitud del colon más corta en los ratones tratados con GCA (Fig. S3E). Sin embargo, el tratamiento con GCA no pudo promover aún más la tumorigénesis en los ratones Fxr-ko C57BL/6, lo que sugiere que FXR es el objetivo funcional de la tumorigénesis inducida por GCA. Si bien el GCA promovió significativamente el crecimiento tumoral y disminuyó la supervivencia global en ratones inmunocompetentes mediante la inoculación subcutánea de células MC38 o CT26 (Fig. S3F, G), no se observó una diferencia significativa en términos de tamaño tumoral o tasa de supervivencia entre los grupos tratados con GCA y los grupos de control cuando se inocularon células MC38 o CT26 en ratones BALB/c inmunodeficientes (Fig. S3H, I). La qRT-PCR mostró que el GCA suprimió la vía de señalización de FXR in vivo, como lo demuestra la disminución de la expresión de SHIP e IBABP en los tumores de MC38 o CT26 derivados de ratones inmunocompetentes o ratones inmunodeficientes tratados con GCA (Fig. S3J, K). Para evitar los posibles efectos de la transformación bacteriana del GCA en el intestino, inyectamos GCA por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana en ratones con tumores de MC38 y encontramos un aumento del crecimiento tumoral en los ratones con tratamiento con GCA (Fig. S3L). En conjunto, nuestros datos indicaron que las respuestas inmunitarias desempeñaron un papel importante en el desarrollo del CCRC inducido por GCA.

Basándonos en la capacidad del GCA para inhibir la actividad de FXR, el presente estudio investigó a continuación si la alteración de la función de FXR podría afectar el crecimiento tumoral mediado por GCA. De hecho, se observó un aumento del tamaño tumoral y una disminución de la tasa de supervivencia en ratones inmunocompetentes, pero no en ratones BALB/c inmunodeficientes, cuando se trató a los animales con el antagonista de FXR T-βMCA (Fig. 1j y S4A, B), lo que imita el comportamiento del tumor inoculado en ratones inmunocompetentes o en ratones inmunodeficientes tratados con GCA. De manera similar, el papel supresor del cáncer de FXR se confirmó cuando se trató a ratones BALB/c inmunocompetentes, pero no inmunodeficientes, con el agonista de FXR GW4064 (Fig. S4C-G). Para explorar si la alteración de la señalización de FXR era fundamental para el aumento del crecimiento tumoral inducido por GCA in vivo, se trató a los ratones con GCA en ausencia o presencia del agonista de FXR GW4064 después de la inoculación de células MC38 o CT26. Como se esperaba, los ratones que recibieron GW4064 mostraron un tamaño tumoral disminuido y una supervivencia global prolongada en comparación con los ratones tratados solo con GCA (Fig. 1k y S4H). En particular, GW4064 revirtió la expresión de los genes diana de FXR I-BABP y SHP que fueron inhibidos por GCA (Fig. S4I, J). En conjunto, estos datos sugirieron que el deterioro de la supresión tumoral mediada por FXR fue fundamental para la tumorigénesis inducida por GCA, y que las respuestas inmunitarias estuvieron involucradas en la regulación del eje GCA-FXR que media el desarrollo tumoral.

El tratamiento con GCA inhibe la infiltración de células CD8+ T y la respuesta antitumoral

Para investigar aún más los efectos de las células inmunitarias infiltradas en el tumor sobre la progresión tumoral mediada por GCA/FXR, se identificaron cinco grupos de células inmunitarias independientes de CD45+, que incluyen células B, células T CD4+ y CD8+, macrófagos y células asesinas naturales, basándose en el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Fig. 2a izquierda). Se observó un aumento del número total de células T CD8+ y macrófagos en los tumores tratados con GW4064 en comparación con los tumores no tratados (Fig. 2a derecha). La expresión de los marcadores de los subtipos inmunitarios se mostró utilizando un panel de 21 marcadores (Fig. S5A). A continuación, se aislaron los tumores de MC38 de ratones que recibieron GCA (i.g.) durante 10 días, y se analizaron los porcentajes de subpoblaciones en las células inmunitarias mediante citometría de flujo. De manera similar, se encontró que las células T CD8+ y los macrófagos, pero no las células T CD4+ o las células T reguladoras CD4+ Foxp3+ (Treg), se redujeron en los tumores tratados con GCA (Fig. 2b). Para explorar si el efecto supresor de FXR sobre los tumores dependía de las células T CD8+ o de los macrófagos, se agotaron las células T CD8+ o los macrófagos en los ratones utilizando sus anticuerpos anti-CD8α o liposomas de clodronato específicos (Fig. S5B), respectivamente, antes de inocular los ratones con células MC38 con o sin tratamiento con GCA o GW4064. En particular, el tratamiento con GCA no aumentó aún más el crecimiento tumoral en los ratones con células T CD8+ agotadas en comparación con los controles no tratados (Fig. 2c). Además, también se encontró que el agonista de FXR no inhibió la progresión del tumor de CCRC en los ratones con células T CD8+ agotadas (Fig. 2d). Sin embargo, el crecimiento tumoral fue comparable tanto en los ratones con macrófagos agotados como en los ratones de control, independientemente del tratamiento con GCA o GW4064 (Fig. 2e, f). Además, se inocularon células de CCRC MC38 o CT26 en ratones Rag1−/− (que son deficientes en células T y B), y se observó que el tratamiento con el antagonista o el agonista de FXR tuvo un efecto limitado en el crecimiento tumoral en los ratones Rag1−/− (Fig. S5C, D). Estos datos sugirieron que las células T CD8+, pero no los macrófagos, en el microambiente tumoral (TME) estuvieron involucradas en el crecimiento tumoral mediado por GCA/FXR.

A continuación, exploramos la vía de señalización enriquecida en la tumorigénesis inducida por GCA. El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula reveló que los genes regulados al alza en los tumores activados por la señalización de FXR se asociaron principalmente con las respuestas inmunitarias, incluidas las respuestas de IFN tipo I/II (Fig. S6A, B). Examinamos la expresión de los genes estimulados por IFN (ISG), incluidos CXCL9, CXCL10, BST2, STAT1 e IFITM3, mediante qPCR. Como se esperaba, los niveles de ARNm de estos ISG se encontraron significativamente aumentados en los tejidos tumorales de MC38 y CT26 derivados de ratones inmunocompetentes tratados con GW4064 (Fig. S6C), mientras que la expresión de los ISG disminuyó en los tumores tratados con GCA (Fig. S6D). Sin embargo, la alteración de los niveles de ARNm de los ISG no se observó en los tejidos tumorales derivados de ratones BALB/c inmunodeficientes cuando se trataron con GW4064 o GCA (Fig. S6E, F). Interesantemente, también se trataron las células MC38 y HCT116 con GW4064 o GCA en cultivo, sin embargo, no se observó un aumento significativo en la expresión transcripcional de estos ISG en las células de CCRC tratadas con GW4064 o GCA (Fig. S6G, H), lo que sugiere una dependencia de las respuestas inmunitarias asociadas a la señalización de IFN in vivo.

Dado que el IFNγ es fundamental para la supresión tumoral mediada por las células T infiltrantes en el tumor CD8+, utilizamos además el análisis por citometría de flujo (FACS) para evaluar las células T CD8+ que expresan IFNγ. Se observó que las células T CD8+ que expresan IFNγ disminuyeron significativamente en los tumores MC38 o CT26 tratados con GCA (Fig. 2g y S6I). Sin embargo, se observó un aumento de la frecuencia de células T CD8+ agotadas PD-1+ TIM3+ en los tumores tratados con GCA en comparación con los controles (Fig. 2g y S6I). Por el contrario, los tumores tratados con el agonista de FXR GW4064 mostraron una mayor población de células T CD8+ IFNγ+, junto con una atenuación de la infiltración de células T CD8+ agotadas (Fig. 2h y S6J). Por lo tanto, los resultados actuales sugieren que el FXR inducido por GCA alteró la actividad antitumoral de las células T CD8+ en el microambiente tumoral (TME).

La mayor expresión de PD-L1 es necesaria para la tumorigénesis mediada por GCA

Para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de la supresión de las respuestas inmunitarias de las células T mediada por GCA, se realizó una proteómica basada en la adquisición independiente de datos mediante espectrometría de masas (MS) en células MC38 tratadas con o sin GCA. El mapa de calor mostró que PD-L1 fue la proteína que mostró el aumento más significativo entre las 20 proteínas expresadas de manera diferente (FC ≥ 2, p ≤ 0,05) y que se anota tanto para la producción de citocinas como para la regulación de las vías de respuesta inmunitaria en las células MC38 tratadas con GCA (Fig. 2i). A continuación, las células CRC se trataron con GCA o GW4064 in vitro, y se evaluaron los cambios en los niveles de ARNm y proteínas de PD-L1. Se encontró que los niveles de proteína y la expresión en la superficie celular de PD-L1, pero no sus niveles de ARNm, se regularon al alza en las células tumorales tratadas con GCA (Fig. 2j y S7A, C). Por el contrario, los niveles de proteína PD-L1 disminuyeron en las células MC38 tratadas con el agonista de FXR GW4064 en comparación con las células no tratadas (Fig. 2j y S7B, C), lo que sugiere que el aumento de PD-L1 mediado por GCA/FXR se reguló de manera postranscripcional. Funcionalmente, las células T CD8+ infiltrantes en el tumor se cocultivaron con células MC38 o CT26 que habían sido pretratadas con GCA en condiciones estimulantes anti-CD3 y anti-CD28, y se encontró que la inactivación de FXR hizo que las células CRC fueran más resistentes a las células T CD8+ en los ensayos de eliminación de células tumorales mediada por células T (Fig. S7D). Además, la capacidad de eliminación de células tumorales aumentó en las células de tipo salvaje (WT), pero no en las células Cd274-KO, de CRC pretratadas con un agonista de FXR (Fig. S7E). Corroboramos aún más los resultados con un modelo de crecimiento tumoral subcutáneo in vivo y encontramos que la eliminación de Cd274 en las células MC38 o CT26 revirtió significativamente la tumorigénesis inducida por GCA (Fig. 2k, l). El análisis de qRT-PCR reveló que la eliminación de CD274 no afectó la supresión de los genes aguas abajo de FXR I-BAPA y SHP inducida por GCA (Fig. S7F, G). Si bien la terapia con anti-PD-L1 a baja dosis (10 mg/kg) tiene un efecto mínimo en la supresión tumoral en ratones tratados con GCA con tumores subcutáneos o en ratones Fxr−/− del modelo de CRC inducido por AOM/DSS, el bloqueo de la señalización PD-L1/PD-1 con una dosis alta de anti-PD-L1 (100 mg/kg) revirtió eficazmente la tumorigénesis inducida por GCA (Fig. S7H–J), lo que sugiere que el aumento de la expresión de PD-L1 en los tumores es fundamental para la disfunción de las células T CD8+ mediada por GCA/FXR durante el crecimiento tumoral.

GCA acelera la palmitoilación de PD-L1 a través de DHHC9 en las células tumorales

Dado que el tratamiento con GCA no alteró los niveles transcripcionales de PD-L1 en las células CRC, a continuación, suprimimos las vías de degradación comunes que están involucradas en la regulación de PD-L1. Se observó que la acumulación total y superficial de PD-L1 mediada por GCA se revirtió con el 2-bromopalmitato, un inhibidor general de la palmitoilación, pero no con el inhibidor de la autofagia 3-MA o el inhibidor del proteasoma MG-132 en las células CRC (Fig. 3a, b). De manera similar, se observó un aumento de la expresión de PD-L1 en las células CRC tratadas con palmostatina B, el inhibidor de la acil proteína tioesterasa 1, que promueve la palmitoilación global, de manera dependiente de la dosis (Fig. 3c). Además, GCA mejoró la modificación de la palmitoilación de PD-L1 en las células CRC según los resultados del ensayo de etiquetado Click-iT, lo que indica que GCA estabilizó la proteína PD-L1 a través de la palmitoilación (Fig. 3d).

Para explorar las palmitoiltransferasas clave para la acumulación de PD-L1 mediada por GCA, se analizaron los niveles transcripcionales de las palmitoiltransferasas mediante análisis de proteómica basado en MS de adquisición independiente de datos, y se encontró que los niveles de expresión de DHHC9, DHHC1, DHHC12, DHHC18 y DHHC24 se encontraban entre los genes expresados de manera diferente más altos en las células tratadas con GCA en comparación con los controles (Fig. 3e). Luego, desactivamos estos candidatos en las células MC38 y HCT116 de CRC mediante el uso de siRNA específicos y encontramos que la acumulación inducida por GCA de la proteína PD-L1 total y de la superficie celular se redujo significativamente en las células CRC con desactivación de DHHC9, pero no en las células CRC con desactivación de otras palmitoiltransferasas (Fig. 3f, g). Además, los niveles transcripcionales de DHHC9 se regularon al alza significativamente en las células CRC tratadas con GCA, lo que se confirmó mediante qPCR (Fig. S8A). Para investigar aún más la función de DHHC9 en la regulación de la modificación de la palmitoilación en PD-L1, se sobreexpresó DHHC9 en las células CRC. Se observó un aumento de la expresión de proteínas, pero no de ARNm, de PD-L1 en las células CRC con sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3h y S8B). En particular, la modificación de la palmitoilación en PD-L1 se acumuló significativamente con la sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3i). A continuación, evaluamos si DHHC9 era fundamental para la expresión de PD-L1 mediada por GCA. Como se esperaba, se observó una disminución de la expresión de proteínas, pero no de la expresión transcripcional, de PD-L1 en las células DHHC9-desactivadas tratadas con GCA (Fig. S8C, D). Funcionalmente, se encontró que la capacidad de eliminación de células tumorales de las células T CD8+ derivadas del tumor aumentó significativamente cuando se cocultivaron con células MC38 o CT26 que habían sido pretratadas con GCA, incluso sin tratamiento con GCA (Fig. 3j). Por el contrario, la sobreexpresión de DHHC9 en las células MC38 o CT26 disminuyó la capacidad de eliminación de las células T CD8+, lo que provocó un aumento del crecimiento tumoral (Fig. 3k). Además, esta capacidad de promoción tumoral no pudo ser revertida mediante el tratamiento con el agonista de FXR GW4064 (Fig. 3k). En conjunto, estos resultados indicaron que la modificación de la palmitoilación mediada por DHHC9 fue fundamental para la estabilización de PD-L1 y el crecimiento tumoral inducidos por GCA/FXR.

El eje SOX14-DHHC9 regula la expresión de PD-L1 en las células CRC

Para identificar el(los) factor(es) de transcripción (TF) que es(son) responsable(s) de la regulación de la expresión de PD-L1 en los tumores mediada por GCA, analizamos todos los factores de transcripción expresados de manera diferente con un cambio de pliegue (FC) ≥ 2 en las células CRC tratadas con GCA, y se observó que SOX14 se encontraba en la parte superior de la lista de los TF candidatos en términos de FC en la expresión (Fig. 4a). Luego, se realizaron pruebas de pérdida de función utilizando siRNA específicos dirigidos a los 5 TF candidatos principales. Los resultados mostraron que la desactivación de SOX14, pero no de otros candidatos, podría disminuir significativamente la expresión de la proteína PD-L1 en las células CRC (Fig. 4b). Además, la expresión de ARNm del gen aguas abajo de FXR IBABP se asoció negativamente con la expresión de SOX14 en los tejidos tumorales derivados de 80 pacientes con CRC (Fig. 4c superior). Posteriormente, exploramos si FXR inhibía directamente la transcripción de SOX14. Se analizó la región promotora de SOX14 humano en busca de un sitio de unión a FXR utilizando la base de datos JASPAR, y se realizó un ensayo de ChIP con un anticuerpo anti-FXR en condiciones de tratamiento con GCA o GW4064. Se observó que FXR se unía directamente al promotor de SOX14 (sitio 2), como lo evidenció el enriquecimiento de la secuencia objetivo (Fig. S9A). Además, GCA inhibió la capacidad de unión al ADN de FXR, mientras que el agonista de FXR GW4064 promovió su unión con el ADN en las células CRC (Fig. S9B). Finalmente, se generaron constructos de reportero de luciferasa para probar la actividad transcripcional de las regiones WT y de deficiencia de la secuencia de unión a FXR para los sitios de unión a FXR (sitio 2). Como se esperaba, la actividad de la luciferasa aumentó significativamente en las células HCT116 y SW620 transfectadas con constructos de la región WT tras la estimulación con GCA (Fig. S9C). Por el contrario, GW4064 disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de las células CRC con constructos de la región WT, pero no de las células transfectadas con constructos de la región mutada (Fig. S6C), lo que sugiere que FXR actúa como un supresor transcripcional de la expresión de SOX14. También se encontró que la desactivación de SOX14 disminuyó la expresión de PD-L1 mediante el uso de shRNA dirigido a SOX14 en múltiples líneas celulares de CRC, incluso cuando se trataron con GCA (Fig. 4d, e y S9D-F). En particular, se observaron niveles de proteína PD-L1 aumentados en las células con sobreexpresión de SOX14 (Fig. 4f, g y S9E), lo que sugiere que el aumento de la expresión de SOX14 puede estar involucrado en la expresión de PD-L1 inducida por GCA. Además, también investigamos si SOX14 participó en la regulación de la función de promoción tumoral mediada por GCA inoculando células SOX14-desactivadas en el tejido subcutáneo o la mucosa del colon de ratones tratados con GCA. Luego, encontramos que la deficiencia de Sox14 inhibió el crecimiento tumoral inducido por GCA, lo que se acompañó de un aumento de la frecuencia de células T CD8+ totales infiltrantes en el tumor, así como del subconjunto de células T CD8+ IFNγ+, pero una disminución del número de células T CD8+ agotadas en ambos modelos de CRC subcutáneo y ortotópico (Fig. 4h, i, S9G, H). Los datos indicaron que SOX14 era un TF clave en la regulación de la expresión de PD-L1 mediada por GCA.

Para identificar si SOX14 regula directamente la expresión de DHHC9, primero analizamos la correlación entre la expresión de ARNm de SOX14 y DHHC9 en 80 muestras humanas de CRC, y encontramos que SOX14 se correlacionó positivamente con la expresión de ARNm de DHHC9 (Fig. 4c inferior). También se validó que GCA aumentó significativamente la transcripción y la expresión de proteínas de SOX14 y DHHC9, así como la expresión de proteínas de PD-L1, en las células murinas MC38 y humanas HCT116 (Fig. 4d, e). Sin embargo, la desactivación de SOX14 disminuyó la expresión transcripcional de DHHC9, así como los niveles de proteínas de DHHC9 y PD-L1 en las células CRC cuando se trataron con GCA (Fig. 4d, e). Por el contrario, se observaron aumentos de la expresión de DHHC9 y PD-L1 en las células CRC con sobreexpresión de SOX14 en comparación con las células de control (Fig. 4f, g). Lo más importante es que la inhibición mediada por FXR de DHHC9 y PD-L1 pudo ser revertida mediante la sobreexpresión de SOX14 en las células incubadas con un agonista de FXR (Fig. 4f, g), lo que sugiere que SOX14 es un potente TF aguas abajo de FXR para inducir la expresión transcripcional de DHHC9. A continuación, analizamos la base de datos JASPAR e identificamos dos secuencias de unión a SOX14 en la región promotora de DHHC9 humano mediante un ensayo de ChIP. Solo la secuencia de unión del sitio 1 predicho se enriqueció en los promotores enriquecidos con ChIP (Fig. 4j, k). Además, se generaron constructos de reportero de luciferasa con regiones de deficiencia de unión a SOX14 para los sitios de unión a SOX14 para evaluar la actividad transcripcional, y se encontró que la actividad de la luciferasa aumentó significativamente en las células MC38 y HCT116 con sobreexpresión de SOX14 transfectadas con constructos de la región DHHC9 WT, pero no en las células transfectadas con constructos de la región DHHC9 mutada (Fig. 4l). Esto indicó que SOX14 fue fundamental para la expresión de DHHC9.

A continuación, examinamos si DHHC9 participó en la progresión tumoral mediada por SOX14 mediante la sobreexpresión de DHHC9 en las células CRC con desactivación de SOX14. Encontramos que la sobreexpresión de DHHC9 aumentó la expresión de PD-L1 en las células CRC que mostraron una expresión reducida de PD-L1 mediante la desactivación de SOX14 (Fig. S9F). Y la sobreexpresión de DHHC9 bloqueó la inhibición tumoral mediada por la deficiencia de SOX14 (Fig. S9I). Además, la sobreexpresión de DHHC9 en las células deficientes en SOX14 condujo a un aumento de la infiltración de células T CD8+ totales y células T CD8+ IFNγ+ efectoras, pero a una disminución de la infiltración de células T CD8+ agotadas PD-1+ TIM3+ (Fig. S9J). En conjunto, estos datos revelaron que DHHC9 fue el objetivo transcripcional y funcional de SOX14.

El eje SOX14-DHHC9 mediado por GCA se correlaciona con una disminución de la eficacia de la inmunoterapia en pacientes con CRC

SPANISH TRANSLATION:
Dado que el tratamiento con GCA no alteró los niveles transcripcionales de PD-L1 en las células CRC, a continuación, suprimimos las vías de degradación comunes que están involucradas en la regulación de PD-L1. Se observó que la acumulación total y superficial de PD-L1 mediada por GCA se revirtió con el 2-bromopalmitato, un inhibidor general de la palmitoilación, pero no con el inhibidor de la autofagia 3-MA o el inhibidor del proteasoma MG-132 en las células CRC (Fig. 3a, b). De manera similar, se observó un aumento de la expresión de PD-L1 en las células CRC tratadas con palmostatina B, el inhibidor de la acil proteína tioesterasa 1, que promueve la palmitoilación global, de manera dependiente de la dosis (Fig. 3c). Además, GCA mejoró la modificación de la palmitoilación de PD-L1 en las células CRC según los resultados del ensayo de etiquetado Click-iT, lo que indica que GCA estabilizó la proteína PD-L1 a través de la palmitoilación (Fig. 3d).

Para explorar las palmitoiltransferasas clave para la acumulación de PD-L1 mediada por GCA, se analizaron los niveles transcripcionales de las palmitoiltransferasas mediante análisis de proteómica basado en MS de adquisición independiente de datos, y se encontró que los niveles de expresión de DHHC9, DHHC1, DHHC12, DHHC18 y DHHC24 se encontraban entre los genes expresados de manera diferente más altos en las células tratadas con GCA en comparación con los controles (Fig. 3e). Luego, desactivamos estos candidatos en las células MC38 y HCT116 de CRC mediante el uso de siRNA específicos y encontramos que la acumulación inducida por GCA de la proteína PD-L1 total y de la superficie celular se redujo significativamente en las células CRC con desactivación de DHHC9, pero no en las células CRC con desactivación de otras palmitoiltransferasas (Fig. 3f, g). Además, los niveles transcripcionales de DHHC9 se regularon al alza significativamente en las células CRC tratadas con GCA, lo que se confirmó mediante qPCR (Fig. S8A). Para investigar aún más la función de DHHC9 en la regulación de la modificación de la palmitoilación en PD-L1, se sobreexpresó DHHC9 en las células CRC. Se observó un aumento de la expresión de proteínas, pero no de ARNm, de PD-L1 en las células CRC con sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3h y S8B). En particular, la modificación de la palmitoilación en PD-L1 se acumuló significativamente con la sobreexpresión de DHHC9 (Fig. 3i). A continuación, evaluamos si DHHC9 era fundamental para la expresión de PD-L1 mediada por GCA. Como se esperaba, se observó una disminución de la expresión de proteínas, pero no de la expresión transcripcional, de PD-L1 en las células DHHC9-desactivadas tratadas con GCA (Fig. S8C, D). Funcionalmente, se encontró que la capacidad de eliminación de células tumorales de las células T CD8+ derivadas del tumor aumentó significativamente cuando se cocultivaron con células MC38 o CT26 que habían sido pretratadas con GCA, incluso sin tratamiento con GCA (Fig. 3j). Por el contrario, la sobreexpresión de DHHC9 en las células MC38 o CT26 disminuyó la capacidad de eliminación de las células T CD8+, lo que provocó un aumento del crecimiento tumoral (Fig. 3k). Además, esta capacidad de promoción tumoral no pudo ser revertida mediante el tratamiento con el agonista de FXR GW4064 (Fig. 3k). En conjunto, estos resultados indicaron que la modificación de la palmitoilación mediada por DHHC9 fue fundamental para la estabilización de PD-L1 y el crecimiento tumoral inducidos por GCA/FXR.

El eje SOX14-DHHC9 regula la expresión de PD-L1 en las células CRC

Para identificar el(los) factor(es) de transcripción (TF) que es(son) responsable(s) de la regulación de la expresión de PD-L1 en los tumores mediada por GCA, analizamos todos los factores de transcripción expresados de manera diferente con un cambio de pliegue (FC) ≥ 2 en las células CRC tratadas con GCA, y se observó que SOX14 se encontraba en la parte superior de la lista de los TF candidatos en términos de FC en la expresión (Fig. 4a). Luego, se realizaron pruebas de pérdida de función utilizando siRNA específicos dirigidos a los 5 TF candidatos principales. Los resultados mostraron que la desactivación de SOX14, pero no de otros candidatos, podría disminuir significativamente la expresión de la proteína PD-L

Para comprender mejor el papel del eje SOX14/DHHC9 regulado por GCA en la inmunoterapia en pacientes con CRC, se realizó un análisis LC-MS en el suero de 41 pacientes con CRC metastásico (mCRC) MSI-H que recibieron bloqueo de PD-1 solo o en combinación con quimioterapia. La mayoría de los pacientes con mCRC (15/20) con altos niveles de GCA presentaban una predicción de falta de respuesta a la inmunoterapia, mientras que los pacientes con mCRC (19/21) con bajas concentraciones de GCA mostraron respuesta a la inmunoterapia (Tabla S2). La resonancia magnética y la tomografía computarizada mostraron que el paciente 27 tenía un nivel relativamente alto de GCA en suero y progresión tumoral después del tratamiento con bloqueo de PD-1 (Fig. 5a, izquierda y c), mientras que el paciente 14, con una baja concentración de GCA en suero, mostró regresión tumoral (Fig. 5a, derecha y c). También examinamos las proteínas SOX14 y DHHC9 mediante inmunofluorescencia (IF) en tejidos tumorales fijados en formalina y embebidos en parafina de pacientes con mCRC que recibieron bloqueo de PD-1. La mayoría de los pacientes con mCRC con altas concentraciones de GCA en suero mostraron una fuerte tinción de SOX14, DHHC9 y PD-L1, acompañada de un bajo número de células T CD8+ y, a menudo, insensibilidad a la terapia anti-PD-1 (Fig. 5b, c). Por el contrario, los pacientes con bajos niveles de GCA en suero mostraron resultados opuestos (Fig. 5b, c). Además, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló una correlación significativa entre los altos niveles de GCA, SOX14, DHHC9 y PD-L1 y tasas más cortas de supervivencia libre de progresión (SLP) en pacientes con mCRC que recibieron terapia anti-PD-1 (Fig. 5d-g). Por el contrario, un mayor número de células T CD8+ infiltradas intratumorales se asoció con tasas de SLP más prolongadas en pacientes con CRC que recibieron terapia anti-PD-1 (Fig. 5h). El análisis de correlación de Spearman mostró que la expresión de la proteína SOX14 se correlacionó positivamente con la expresión de las proteínas DHHC9 y PD-L1 en muestras de tumores de CRC según las puntuaciones de tinción de IF (Fig. 5i, j). La expresión de la proteína DHHC9 también se asoció positivamente con la proteína PD-L1 (Fig. 5k). Confirmamos aún más nuestros resultados de que el nivel de GCA en suero se asoció con la expresión de DHHC9 o SOX14 en tumores de pacientes con CRC en otra cohorte (Fig. S10A, B). Además, la tinción de DHHC9 se correlacionó con la tinción de SOX14 en estos tumores de CRC (Fig. S10C). En conjunto, estos resultados sugirieron que el eje GCA-regulado SOX14/DHHC9/PD-L1 desempeñó un papel importante en la eficacia de la inmunoterapia en mCRC, lo que podría ser útil como posibles marcadores pronósticos para el bloqueo de PD-1 en el futuro.

La inhibición de la expresión de SOX14 y DHHC9 inducida por GCA/FXR sensibiliza al CRC a la terapia anti-PD-1

Para explorar si el eje SOX14-DHHC9-PD-L1 es crítico para la inmunosupresión mediada por GCA/FXR, se planteó la hipótesis de que la eliminación de Sox14 (Sox-KD) podría mejorar el tratamiento con anti-PD-1 en CRC en condiciones de altos niveles de GCA en el microambiente tumoral (MET). Luego, se injertaron ratones inmunocompetentes tratados con GCA con células CRC de control o Sox14-KD y se encontró que la eliminación de Sox14 inhibió el crecimiento del cáncer de colon MC38 en presencia de terapia anti-PD-1 (Fig. 6a). Además, se observó un aumento de la infiltración de células T CD8+ y células T CD8+ IFNγ+ efectoras, mientras que disminuyeron las células T CD8+ agotadas en las células Sox14-KD en comparación con las células de control en ratones con y sin anticuerpo anti-PD-1 (Fig. 6b). De manera similar, la eliminación de Dhhc9 también suprimió significativamente el crecimiento tumoral en ratones sometidos a terapia anti-PD-1 en comparación con los ratones con monoterapia. Además, la deficiencia de Dhhc9 mejoró la función antitumoral de las células T CD8+ en el MET, como lo demuestra la proporción de células T CD8+ y células T IFNγ+ CD8+ enriquecidas en tumores MC38 con eliminación de Dhhc9 con tratamiento anti-PD-1 (Fig. 6c, d). Dado que GCA regulaba negativamente la actividad de FXR, investigamos además si un agonista de FXR podría sinergizar las células de CRC con la terapia anti-PD-1. Como se esperaba, el tratamiento combinado con GW4064 y anti-PD-1 ralentizó significativamente el crecimiento tumoral, lo que se asoció con un mayor número de infiltración de células T CD8+ IFNγ+ efectoras y un menor porcentaje de células T agotadas en los tumores en comparación con aquellos que recibieron monoterapia, lo que sugiere que la activación de FXR promovió suficientemente los efectos antitumorales de la terapia anti-PD-1 (Fig. S11A-D). Además, la terapia anti-PD-1 disminuyó ligeramente la tumorigénesis de CRC mediada por AOM/DSS en ratones C57BL/6 y BALB/c (Fig. S11E, F). Cabe destacar que observamos que los ratones tratados con anti-PD-1 y GW4064 combinados tenían más probabilidades de beneficiarse de la terapia, como lo demuestra un aumento de la longitud del colon con una disminución del número y área de tumores en los ratones que recibieron tratamiento combinado en comparación con la monoterapia (Fig. S11E, F). Para fortalecer las conclusiones actuales, se generó cáncer de colon MC38 resistente al anti-PD-1 (MC38R) mediante tres rondas de selección in vivo/in vitro. El anticuerpo anti-PD-1 tuvo un efecto limitado en el crecimiento de las células MC38R en modelos de CRC subcutáneo y ortotópico (Fig. 6e, f y S11G, H). Sin embargo, GW4064 inhibió el crecimiento tumoral de MC38R y sensibilizó las células MC38R a la terapia anti-PD-1, lo que se acompañó de una respuesta antitumoral significativamente mayor de las células T CD8+, como lo demuestra el aumento de la infiltración de células T CD8+ y células T CD8+ IFNγ+ efectoras, y la disminución de las células T CD8+ agotadas en los tumores en comparación con la monoterapia con GW4064 (Fig. 6e, f y S11G, H). Los datos indicaron que la combinación de un agonista de FXR con la terapia anti-PD-1 mejoró la eficacia del anti-PD-1 en el cáncer de colon resistente.

Discusión

La evidencia acumulada apoya que los ácidos biliares (AB) son críticos para el desarrollo del CRC.^[20],^[21] Sin embargo, los efectos de los AB en la remodelación del MET aún se desconocen. El presente estudio reveló que GCA suprimió la infiltración y la función de las células T CD8+ antitumorales en el CRC experimental y clínico. Mecánicamente, GCA aumentó la expresión de PD-L1 tumoral al promover el eje FXR-SOX14-DHHC9 mediado por la palmitoilación de PD-L1. Además, el bloqueo de la vía de señalización de FXR con el agonista específico de FXR GW4064 sensibilizó al CRC a la terapia anti-PD-1. Estos resultados revelaron un mecanismo molecular subyacente de GCA en la regulación de la evasión inmune tumoral y proporcionaron una base convincente para la terapia combinada en el tratamiento de pacientes con CRC con altos niveles de AB.

Los humanos y los ratones exhiben composiciones de la reserva de ácidos biliares sustancialmente diferentes. Esta diferencia en la composición endógena de los ácidos biliares presenta un desafío al estudiar los efectos fisiológicos de GCA en ratones, ya que su entorno natural de ácidos biliares difiere significativamente del de los humanos^[24],^[25]. Debido a los bajos niveles endógenos de GCA en ratones, que son altamente susceptibles al estudio de los mecanismos, la función o los efectos terapéuticos de GCA mediante la administración exógena de GCA.^[24] Nuestros estudios revelaron que GCA inhibió la función transcripcional del receptor Farnesoid X (FXR) tanto en células humanas como en células de cáncer colorrectal (CRC), promovió el crecimiento tumoral en ratones y actuó como un factor de alto riesgo para la tumorigénesis del CRC. Estos resultados resaltan la relevancia de utilizar modelos de ratón para estudiar los efectos terapéuticos de GCA, a pesar de las diferencias en la composición de los ácidos biliares entre las especies.

La vía de señalización de los AB más importante para regular el desarrollo del cáncer intestinal es a través del receptor nuclear FXR, que suprime la tumorigénesis colorrectal con un mecanismo tumoral intrínseco.^[21],^[26],^[27] Por ejemplo, en modelos de ratón, la pérdida de la expresión de FXR se asoció con un aumento del tamaño y el número de tumores de CRC al promover la señalización de Wnt o aumentar la proliferación de las células madre intestinales Lgr5+.^[21],^[27],^[28] Por el contrario, el agonista de FXR GW4064 contrarrestó la tumorigénesis^[21],^[29]. Sin embargo, la eliminación de FXR (FXR-KO) en células de CRC, como las células HT29, redujo la proliferación y aumentó la apoptosis, dependiendo de la disminución de la proteína MYC^[18]. Además, no observamos una alteración significativa en la proliferación entre las células MC38, CT28, HCT116 y SW620 de CRC con FXR-KO y las células de control, lo que sugiere una función divergente de FXR en la regulación del crecimiento de las células de CRC con diferentes antecedentes genéticos.

Dado la diferencia en el crecimiento de las células tumorales entre el cultivo in vitro y in vivo observada en nuestros estudios anteriores, encontramos que la inactivación de FXR promovió significativamente la tumorigénesis del CRC mediante un mecanismo extracelular al suprimir la infiltración y la función antitumoral de las células T CD8+. El IFNg secretado por las células T CD8+ suprimió las células tumorales al inhibir la proliferación e inducir la apoptosis, la diferenciación, la migración y la expresión de antígenos de la superficie celular, lo que proporciona al menos una explicación parcial de la función supresora de FXR en la regulación de la proliferación celular in vivo.

Además, los ácidos biliares secundarios como el ácido desoxicólico (DCA) y el ácido litocólico (LCA) exacerban el CRC a través de la citotoxicidad y la genotoxicidad, aumentando el estrés oxidativo y el daño al ADN en las células epiteliales del colon^[30]. La microbiota intestinal desempeña un papel fundamental al convertir los AB primarios en secundarios, y la disbiosis se asocia con un mayor riesgo de CRC^[30],^[31]. Los pacientes con CRC a menudo exhiben una mayor desconjugación mediada por la microbiota de los AB y una 7α-deshidroxilación, lo que resulta en una acumulación de AB dañinos^[32]. El tratamiento con GCA por vía oral o intraperitoneal promovió significativamente el crecimiento tumoral en nuestro estudio; el papel de la microbiota intestinal en la tumorigénesis inducida por GCA es, de hecho, un campo de interés crítico para futuras investigaciones. Sin embargo, basándonos en nuestros hallazgos, ejercimos los efectos antitumorales de FXR in vivo en función de las condiciones del huésped. En nuestro estudio, se encontró que la inactivación de FXR suprimió significativamente la infiltración y la función antitumoral de las células T CD8+ al aumentar la expresión de PD-L1 en las células tumorales. Se ha informado que existe una correlación negativa entre la expresión de FXR y PD-L1 en especímenes de carcinoma hepatocelular humano^[34], pero el mecanismo detallado no se ha ilustrado. Los hallazgos actuales revelaron que la palmitoiltransferasa DHHC9 actuó como un objetivo funcional clave de la señalización de los AB para regular postranscripcionalmente PD-L1 al modificar su palmitoilación. La palmitoilación de proteínas es una modificación lipídica que implica principalmente la adición covalente del ácido graso de 16 carbonos, el palmitato, a los tioles de la cisteína.^[14] Se ha informado que DHHC3 palmitoila PD-L1 en el sitio C272 y sensibiliza a las células de CRC a la muerte mediada por células T in vitro^[16]. Sin embargo, nuestro estudio actual observó que la inactivación de FXR tuvo un efecto limitado en la modulación de la expresión de DHHC3. En cambio, demostramos que DHHC9 fue el modulador clave en la regulación del nivel de proteína de CRC tras el tratamiento con GCA. Como se informó anteriormente, DHHC9 participa en la palmitoilación de la expresión de PD-L1 en el cáncer de mama^[14]. El estudio actual identificó que la palmitoilación inducida por DHHC9 actuó como un mecanismo clave que gobierna la estabilidad de PD-L1 mediada por la señalización de los AB en el CRC.

Recientemente, la terapia con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICB) ha revolucionado las opciones de tratamiento para el CRC MSI-H/dMMR. Sin embargo, el 50% de estos pacientes mostraron resultados deficientes.^[35] Cabe destacar que los pacientes con MSS/pMMR (>85%) presentan una tasa de respuesta de solo el 5-10%, aunque el 30% de los casos MSS exhiben un nivel de infiltración de células T CD8+ comparable al de los tumores MSI.^[33] Como la principal forma de heterogeneidad, se observa una remodelación del microambiente inmunosupresor en varios tumores, evidenciada por la acumulación de células T CD8+ agotadas, células Treg y células mieloides inmunosupresoras. Los avances en la investigación del metabolismo sugieren que una variedad de metabolitos en el microambiente tumoral (TME) son necesarios para la evasión inmune de las células tumorales.^[36] El presente estudio identificó que la inactivación de FXR mediada por GCA en el suero, asociada al eje SOX14-DHHC9, promueve la evasión inmune. Además, el agonista de FXR, GW4064, o la inhibición de SOX14 y DHHC9 aumentaron la infiltración y la función antitumoral de las células T CD8+ en el TME, y sensibilizaron el CRC a la terapia anti-PD-1. El estudio actual destaca que un agonista de FXR puede mejorar la respuesta de los tumores resistentes a la terapia ICB inducida por GCA. Los hallazgos del presente estudio pueden proporcionar una base científica para la aplicación clínica en el futuro.

En resumen, el estudio actual reveló que el eje GCA-FXR-SOX14-DHHC9-PD-L1 regulado por GCA es crítico para la progresión del CRC al afectar la infiltración y la función de las células T CD8+. Es importante destacar que la reactivación de la señalización de FXR mediante el uso de GW4064 sensibilizó el CRC resistente a la terapia ICB a la terapia anti-PD-1. Por lo tanto, estos hallazgos proporcionan información para una mejor comprensión de la patogénesis y la edición inmune del CRC humano, y para el desarrollo de estrategias más eficaces para el tratamiento de pacientes con CRC que reciben terapia ICB.

Métodos

Biopsias de pacientes

Se utilizaron un total de 80 pares de tejidos de CRC, tejidos de mucosa normal adyacente y suero, recolectados entre enero de 2018 y septiembre de 2018 de pacientes con CRC diagnosticados en el Centro Oncológico de la Universidad de Fudan en Shanghái (FUSCC), para medir las concentraciones de una serie de ácidos biliares y para la tinción de inmunofluorescencia de tejidos (cohorte Ⅰ). Además, se recolectó el suero de 20 individuos sanos normales en octubre de 2018. Además, se incluyeron en el presente estudio 41 pacientes con MSI-H o dMMR con recurrencia o metástasis a distancia que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 entre febrero de 2019 y septiembre de 2021 en el FUSCC (cohorte Ⅱ). Se incluyó una cohorte de 308 pacientes (cohorte Ⅲ) con cáncer colorrectal (CRC) entre enero de 2008 y septiembre de 2009 en el Centro Oncológico de la Universidad de Fudan en Shanghái. Sus características clinicopatológicas se resumen en los Datos Suplementarios 1-3. Todos los pacientes de estas 3 cohortes no recibieron ningún tratamiento contra el cáncer antes de la cirugía. Se recolectaron muestras de suero humano antes de la resección del tumor, mientras que la mucosa normal y los tejidos tumorales emparejados, así como los tejidos metastásicos, se recolectaron inmediatamente después de la resección quirúrgica. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente, y el protocolo del estudio cumplió con las pautas éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 y fue aprobado por el Comité de Ética del FUSCC (número de aprobación 050432-4-2108).

Líneas celulares, plásmidos, producción y transducción de lentivirus

Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116 y SW620, la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 y la línea celular 293T se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares Americana, mientras que la línea celular de cáncer de colon de ratón MC38 se compró al Banco de Células del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias. Las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en 5% de CO2 en DMEM o en RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 µ/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se analizaron mensualmente y se comprobó que estaban libres de micoplasma mediante un cribado basado en PCR. Los fragmentos de ADN de SOX14 y DHHC9 de longitud completa fusionados con la etiqueta Flag se amplificaron mediante PCR a partir del ADNc de las células HCT116 y luego se recombinaron en el plásmido pLVX (número de catálogo 125839; Addgene, Inc.). Los cebadores utilizados se enumeran en los Datos Suplementarios 4. Las secuencias de ARN de cadena corta (shRNA) dirigidas a SOX14 y DHHC9 se clonaron en el vector pLKO.1 (número de catálogo 10878; Addgene, Inc.), y los cebadores utilizados se enumeran en los Datos Suplementarios 5. Las ARN guía únicas (sgRNA) dirigidas a FXR o CD274 se construyeron en el vector lentiCRISPR v2 (número de catálogo 52961; Addgene, Inc.). Las secuencias de destino de CRISPR/Cas9 se enumeran en los Datos Suplementarios 5. El lentivirus se produjo mediante la transfección transitoria de células 293T con el reactivo de transfección Lipofectamine® 3000 (número de catálogo L3000075; Thermo Fisher Scientific, Inc.) según las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes virales se incubaron luego con 8 µg/ml de polibreno durante 24 h, y los sobrenadantes virales se intercambiaron por medio fresco. Las células se incubaron durante 48 h antes de la selección con puromicina. Para la transfección de ARN de interferencia pequeño (siRNA), las células tumorales se sembraron en placas de 6 pocillos a ~1,5 × 105 células por pocillo y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los siRNA específicos (5 nM; Thermo Fisher Scientific, Inc.) se transfectaron en las células y se incubaron durante 6 h. A continuación, el medio se reemplazó con DMEM completo durante 48 h. Las secuencias de siRNA se enumeran en los Datos Suplementarios 6. Las células tumorales MC38R resistentes a anti-PD1 se desarrollaron como se describió anteriormente.^[37] En resumen, se inyectaron por vía subcutánea 6-semanas de ratones C57BL/6J en el flanco derecho con 1,0 × 106 células MC38 (n = 6). A los 10 días después de la inyección, los ratones se trataron dos veces por semana con 100 µg de anticuerpo anti-PD-1α (Bio X Cell) por ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) durante 1 semana. A continuación, los tumores se seleccionaron y se trasplantaron en el flanco derecho de ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad. Después de 3 ciclos repetidos de selección de tumores, los tumores no respondedores se digirieron en células tumorales individuales, es decir, células tumorales MC38R.

Preparación de muestras y enfoques metabolómicos basados en HPLC-MS/MS

Se añadieron 100 µl de suero con 0,51 ml de MeOH-ACN (1:1, v:v) a hielo. La muestra se agitó y se incubó durante 1 h a -20 °C, seguido de la centrifugación a 14 000 rcf a 4 °C durante 15 min para precipitar las proteínas. El sobrenadante se aspiró, se evaporó utilizando un concentrador de vacío (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los extractos se reconstituyeron en 100 µl de MeOH y agua desionizada (85:15, v:v) y se centrifugaron a 15 000 × g a 4 °C durante 15 min para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante se recogió en viales de muestra UPLC (Thermo Scientific, MA, EE. UU.) y se almacenó a -80 °C antes del análisis UPLC-MS. Las muestras de tumor se homogeneizaron en 100% de acetonitrilo y se centrifugaron dos veces a 15 000 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar las proteínas precipitadas y otros residuos. El sobrenadante se diluyó luego con 0,1% de ácido fórmico. La muestra de control de calidad se obtuvo mezclando 5 µl de la solución extraída de cada muestra.

La separación cromatográfica y la detección por espectrometría de masas se llevaron a cabo utilizando el sistema LC-MS/MS Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher, Palo Alto, CA). La separación cromatográfica se realizó en una columna analítica Poroshell SB-C18 (tamaño de partícula, 1,7 µm; 50 mm (longitud) × 2,1 mm (i.d.)) equipada con una columna pre-VanGuard BEH C18 (5 × 2,1 mm, i.d.; 1,7 µm). La fase móvil consistió en un tampón acuoso que contenía 1 mM de formiato de amonio y ácido fórmico (pH 4,39) (A) y acetonitrilo/isopropanol (1:1 v/v) (B), con una velocidad de flujo total de 0,4 ml/min. El perfil de gradiente para las bombas de LC fue el siguiente: 20-30% B (0-3 min), 30-40% B (3-4 min), 50-70% B (4-5 min), 70-90% B (5-5,2 min), continuando al 90% B hasta los 6 min. El volumen de inyección para todas las muestras fue de 2 µl. La temperatura de la columna se fijó en 55 °C y la temperatura de la bandeja de muestras se mantuvo a 8 °C. Para la detección por espectrometría de masas, la fuente de ionización por electrospray (ESI) se operó en modo de iones negativos para producir espectros MS/MS (Thermo Fisher). Los parámetros fueron los siguientes: voltaje de pulverización 2 kV, voltaje de cono 30 V, temperatura de la fuente 120 °C, temperatura de desolvatación 500 °C, flujo de gas de cono 50 L/h, flujo de gas de desolvatación 900 L/h.

Para la preparación del estándar, se disolvieron 33 ácidos biliares en 1 mg/ml con la cantidad adecuada de metanol como soluciones estándar y luego se diluyeron para obtener soluciones estándar que contenían 0,05, 0,5, 5 y 50 mg/ml de cada ácido biliar. El sobrenadante se recogió y se inyectaron 70 µl en el sistema LC-MS/MS para el análisis. El ácido cólico (CA), el ácido quenodeoxicólico (CDCA), el glicocenodeoxicolato de sodio (GCDCA), el taurocenodeoxicolato de sodio (TCDCA), el ácido glicólico (GCA), el ácido taurolitocólico (TLCA), el taurodeoxicolato de sodio hidratado (TDCA) y el taurocolato de sodio hidratado (TCA) se compraron a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). El ácido ursodeoxicólico (UDCA), el ácido deoxicólico (DCA), el ácido litocólico (LCA) y el ácido glicoursodeoxicólico (GUDCA) se adquirieron de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE. UU.). El ácido glicodeoxicólico (GDCA) y el ácido glicolitocólico (GLCA) se adquirieron de Toronto Research Chemicals (TRC, Canadá).

Espectrometría de masas basada en la adquisición independiente de datos (DIA) para la proteómica

Las células MC38 se trataron con o sin GCA durante 24 h y se procesaron individualmente mediante la adquisición independiente de datos ^[6] para evaluar el proteoma. En resumen, para la preparación de la muestra, las células se lisaron en un tampón de lisis (1% de SDS y 8 M de urea) y se digirieron con el kit de preparación de muestras iST (PreOmics) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos se eluyeron con tampón de elución (2 × 100 µl) y luego se liofilizaron con SpeedVac. Las muestras de proteínas se reconstituyeron en 0,1% de FA y se sometieron a cromatografía líquida UltiMate 3000 (LC) (Thermo Fisher Scientific, Inc.). En total, se separaron 200 ng de péptidos mediante una columna analítica con un gradiente de 60 min que comenzaba con 4% de tampón B (80% de ACN con 0,1% de FA), seguido de un aumento gradual hasta el 28% en 25 min, 44% en 10 min, 90% en 10 min, manteniéndose durante 7 min y luego equilibrándose al 4% durante 8 min. La velocidad de flujo de la columna se mantuvo en 500 nl/min con una temperatura de la columna de 50 °C. Para la detección por espectrometría de masas, la fuente de ionización por electrospray (ESI) se operó en modo de iones negativos para producir espectros MS/MS (Thermo Fisher). Los parámetros fueron los siguientes: voltaje de pulverización 2 kV, voltaje de cono 30 V, temperatura de la fuente 120 °C, temperatura de desolvatación 500 °C, flujo de gas de cono 50 L/h, flujo de gas de desolvatación 900 L/h.

Para la preparación del estándar, se disolvieron 33 ácidos biliares en 1 mg/ml con la cantidad adecuada de metanol como soluciones estándar y luego se diluyeron para obtener soluciones estándar que contenían 0,05, 0,5, 5 y 50 mg/ml de cada ácido biliar. El sobrenadante se recogió y se inyectaron 70 µl en el sistema LC-MS/MS para el análisis. El ácido cólico (CA), el ácido quenodeoxicólico (CDCA), el glicocenodeoxicolato de sodio (GCDCA), el taurocenodeoxicolato de sodio (TCDCA), el ácido glicólico (GCA), el ácido taurolitocólico (TLCA), el taurodeoxicolato de sodio hidratado (TDCA) y el taurocolato de sodio hidratado (TCA) se compraron a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). El ácido ursodeoxicólico (UDCA), el ácido deoxicólico (DCA), el ácido litocólico (LCA) y el ácido glicoursodeoxicólico (GUDCA) se adquirieron de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE. UU.). El ácido glicodeoxicólico (GDCA) y el ácido glicolitocólico (GLCA) se adquirieron de Toronto Research Chemicals (TRC, Canadá).

Ensayo de luciferasa dual

Para medir la actividad de FXR, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a ~1,5 × 104 células por pocillo y se transfectaron con el plásmido reportero de luciferasa de FXR FXRE-Luc (200 ng; número de catálogo 11764ES03; Shanghai Yeasen Biotechnology Co., Ltd) y 20 ng de plásmido Renilla pRL-SV40P (número de catálogo 27163; Addgene, Inc.) por pocillo con Lipofectamine® 3000 según las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se trataron con GCA (100 nM, número de catálogo G2878; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) o GW4064 (5 µM, número de catálogo G5172; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 24 h, y las unidades de luciferasa relativa (RLU) se midieron utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega Corporation) según las instrucciones del fabricante. Para controlar la expresión de SOX9 o DHHC9, las células se sembraron y se transfectaron con 200 ng de pGL3-SOX14, pGL3-SOX14-FXR mutante ^[15], pGL3-DHHC9 o vector pGL3-DHHC9-SOX14 mut, junto con 20 ng de plásmido Renilla pRL-SV40P por pocillo con Lipofectamine® 2000. Después de 24 h, las RLU en las células se midieron utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo. Las RLU de la luciferasa se normalizaron por las RLU del vector que contiene Renilla.

Ratones

Se adquirieron ratones Fxr floxed de Cyagen Biosciences, Inc. (número de catálogo S-CKO-04890). Se adquirieron ratones transgénicos Villin-Cre (#004586) del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) para crear ratones con deleción condicional y silenciar la expresión de Fxr en las células epiteliales intestinales. Brevemente, se inyectaron en los cigotos de ratón dos sgRNAs sintetizados dirigidos a los intrones 3 y 4, el ARNm de Cas9 y un oligonucleótido que contiene LoxP, con brazos de homología de 50 pares de bases, y luego se transfirieron a ratonas pseudogestantes. Se identificaron los ratones Fxr floxed mediante genotipado y secuenciación. A continuación, se cruzaron los ratones Fxr floxed con los ratones transgénicos Villin-Cre para obtener modelos de ratón con deleción de Fxr específica del epitelio intestinal. Los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales. Para los modelos primarios de ratón, se seleccionaron los animales en función de los genotipos correctos y se colocaron en las mismas jaulas y se utilizaron para los estudios. Todos los ratones utilizados en el estudio fueron de la misma edad y sexo. Los investigadores desconocían los tratamientos durante los experimentos. Todos los ratones se alojaron en el bioterio de FUSCC con condiciones libres de patógenos específicos. Se observó a los animales para evaluar su estado general de salud y detectar signos de malestar (pérdida de peso, pelaje erizado o evidencia de ulceración/hemorragia tumoral). Se sacrificaron los ratones cuando la pérdida de peso corporal superó el 20% o cuando el volumen tumoral superó los 1500 mm³. El sacrificio se realizó de acuerdo con las normas institucionales y las directrices mediante inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical para garantizar la muerte. El volumen tumoral máximo permitido por nuestro comité de ética es de 1500 mm³, y este límite no se superó en ningún experimento. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de FUSCC.

Para el injerto tumoral, se inyectaron ratones C57BL/6J o BALB/c de 6 semanas de edad por vía subcutánea en el flanco derecho con 1,0 × 106 células MC38 o CT26, respectivamente. También se utilizaron ratones BALB/c desnudos para establecer un modelo de CRC subcutáneo utilizando células MC38 o CT26. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula "longitud × ancho × ancho/2" en los días indicados. Se registró el peso corporal en el momento de la medición del tumor. Para el análisis de supervivencia, se consideró que los ratones estaban en estado terminal y se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente los 1000 mm³ o cuando se observaron signos graves de malestar. Para el modelo de ratón ortotópico guiado por endoscopia, se examinaron ratones C57BL/6 de tipo salvaje de 10 a 12 semanas de edad mediante endoscopia con el sistema Coloview® (Storz, Tuttlingen, Alemania) con una óptica de cero grados (diámetro de 1,9 mm) para garantizar que la mucosa del colon estuviera sana antes de la implantación, tras la anestesia. Para la implantación de células tumorales, primero se lavó el colon con PBS a 37 °C y se inyectaron 0,5 × 106 células MC38) diluidas en 50 μL de PBS, muy lentamente hacia el lumen del colon medio inferior y distal, aproximadamente a 30 mm del borde anal, para inducir el crecimiento tumoral mediante inyección endoscópica. El volumen tumoral se controló semanalmente por vía endoscópica mediante una puntuación endoscópica. Para el modelo de cáncer asociado a colitis inducido por AOM/DSS, se inyectaron ratones macho de 8 a 10 semanas de edad por vía intraperitoneal con 10 mg/kg de AOM (número de catálogo A5486; Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Después de 5 días, se añadió un 2% de DSS (número de catálogo D8906; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) al agua de beber durante 5 días, seguido de agua de beber normal durante 2 semanas. Se sacrificaron los ratones después de 3 ciclos repetidos de DSS. Para el experimento de depleción de macrófagos, se pretrataron los ratones con liposomas de clodronato (150 μl; Max Scientific) 3 días antes de la inoculación con células tumorales, y luego se administraron a los ratones indicados clodronato y liposomas de control, con o sin GCA [400 μg/kg, administración intragástrica (ig) o GW4064 (50 mg/kg, i.p.)] dos veces por semana durante el transcurso de los experimentos. Para el experimento de depleción de CD8, se trató a los ratones con un anticuerpo anti-CD8 (200 μg por inyección; clon 2.43; Bio X Cell) dos veces por semana durante el transcurso de los experimentos. Para el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1, se trató a los ratones con 100 μg de anticuerpo anti-PD-1α (Bio X Cell) por ratón dos veces por semana o con el control de IgG correspondiente mediante inyección intraperitoneal durante los días indicados. Para el tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, se trató a los ratones con 10 mg/kg o 100 mg/kg de anticuerpo anti-PD-L1 (Bio X Cell) por ratón dos veces por semana o con el control de IgG correspondiente mediante inyección intraperitoneal durante los días indicados. Para el tratamiento con GCA (400 mg/kg, administración intragástrica), GW4064 (50 mg/kg, i.p.) o T-βMCA (400 mg/kg, i.p.), se trató a los ratones con GW4064 o T-βMCA dos veces por semana después de 6 días de la inoculación con las células de CRC indicadas.### Extracción de ARNm y RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células o tumores utilizando el reactivo TRizol® (número de catálogo 15596026CN; Thermo Fisher Scientific, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ARN extraído se transcribió a ADNc utilizando el kit PrimeScript® RT Reagent Kit (número de catálogo RR037B; Takara Bio, Inc.). Se realizó RT-qPCR con un programa de amplificación rápida de dos pasos utilizando el FastStart Universal SYBR Green Master Mix (número de catálogo 04913850001; Roche Diagnostics GmbH). Los datos se normalizaron con GAPDH. Los cebadores utilizados se enumeran en los Datos Suplementarios 7.### Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Las células HCT116 y SW620 que expresan SOX14-Flag, o las células de CRC tratadas con GCA o GW4064 durante 24 h, se sometieron a un ensayo de ChIP con el SimpleCHIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (número de catálogo 9003S; Cell Signaling Technology, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó un anticuerpo monoclonal de ratón específico para FXR (número de catálogo 72105; Cell Signaling Technology, Inc.) y un anticuerpo monoclonal de conejo específico para SOX14 (número de catálogo PA1-28074; Thermo Fisher Scientific, Inc.) para el ensayo de ChIP. Se realizó SYBR Green RT-qPCR utilizando los siguientes cebadores: sitio de unión a FXR 1, sentido: 5'-TTTGTATTTCAAGCCCTAA-3' y reverso: 5'-GACTTCGGTTCCACATTGT-3'; sitio de unión a FXR 2, sentido: 5'-CAGTCTAGAGCTAGCCTCT-3' y reverso: 5'-CGCACCTGCCAACACGCCGG-3'; sitio de unión a SOX14 1, sentido: 5'-AGGGAGATGGGTGGAGGAGT-3' y reverso 5'-CGGCCGCCCCTATC-3'; y sitio de unión a SOX14 2, sentido: 5'-GGAGGCGCCGAGGCC-3' y reverso: 5'-CCCACCACTGGCCAAAT-3'.### Inmunoblotting

Para el inmunoblotting, las muestras obtenidas de las células o tumores se lisaron con tampón RIPA (número de catálogo 89901; Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado con un inhibidor de proteasas (número de catálogo 05892970001; Roche Diagnostics GmbH) y un cóctel de inhibidores de fosfatasas (número de catálogo 04906845001; Roche Diagnostics GmbH) durante 1 h. Los lisados se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 min a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se mezclaron cantidades iguales de lisados celulares (100 μg) con el tampón de carga SDS-PAGE 5X. A continuación, las muestras se separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (MilliporeSigma). Las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios indicados y se visualizaron utilizando el sustrato SuperSignal West Dura Extended Duration (número de catálogo 34076; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los anticuerpos utilizados se enumeran en los Datos Suplementarios 8.### Microscopía de inmunofluorescencia y tinción de inmunofluorescencia multiplex

Para el ensayo de microscopía de inmunofluorescencia, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante 15 min, seguido de permeabilización con un 0,5% de Triton X-100 durante 15 min. Las muestras se bloquearon con un 1% de suero de cabra durante 30 min y luego se incubaron con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante 12 h antes de incubarse a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488/594. Se utilizó DAPI (número de catálogo ab104139; Abcam) para teñir los núcleos durante 30 min antes de someter las muestras a un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert-200 (Zeiss AG).

Para la tinción multiplex, las muestras se trataron siguiendo el método de tinción del protocolo Opal. Los reactivos utilizados fueron los siguientes: Anti-SOX14 (número de catálogo #ab214041; 1:500; Abcam), anti-DHHC9, anti-PD-L1 y anti-CD8 (número de catálogo 98941; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB_2756376, 1:500) se visualizaron utilizando fluoresceína-cianina (Cy) 7 (1:50), fluoresceína-Cy5 (1:50) y fluoresceína-Cy3 (1:50). Además, se utilizó DAPI (1:2000) para la tinción de los núcleos. Todas las secciones se cubrieron con VECTASHIELD Hardset Antifade Mounting Medium (número de catálogo #H-1400; Vector Laboratories). Las láminas se escanearon y se analizó la intensidad media de fluorescencia de los marcadores indicados con un escáner de láminas Vectra (PerkinElmer, Inc.) en condiciones de fluorescencia.### Ensayo de cocultivo

Se inyectaron células MC38 o CT26 (1,0 × 106 células) por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6 o BALB/c durante 2 semanas. A continuación, las células CD8+ T de los tumores MC38 o CT26 se aislaron mediante citometría de flujo (FACs). Se contó el número de células MC38 o CT26 indicadas después de 3 días de cocultivo con células CD8+ T (1,0 × 104 células) en presencia de anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (5 μg/ml).### Digestión tumoral, aislamiento celular y análisis de citometría de flujo

Los tumores derivados de los ratones indicados se trituraron y digirieron utilizando un tampón de digestión [medio RPMI suplementado con un 5% de FBS, colagenasa I intravenosa (0,5 mg/mL, número de catálogo C1-22; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y DNasa (1 μg/ml; número de catálogo D5025; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 30 min a 37 °C. A continuación, la mezcla se filtró y se lisaron los glóbulos rojos (GR) utilizando un tampón de lisis de GR (número de catálogo 00-4300-54; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los precipitados se lavaron con el tampón II (PBS con un 2% de FBS) y se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 durante 30 min. Las suspensiones celulares simples se lavaron y se incubaron con los anticuerpos indicados antes de someterlas a un LSRII (BD Biosciences) para su análisis. Los datos se analizaron utilizando FlowJo. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S8. Las poblaciones celulares se identificaron en función de los siguientes marcadores de expresión: células T CD4: CD45+/CD4+; células T CD8: CD45+/CD8+; células MDSC: CD45+/CD11b+/Gr-1+; y macrófagos: CD45+/CD11b+/F4/80+. Para la tinción intracelular, las células se estimularon con miristato de forbol 12 (20 ng/ml; número de catálogo p8139; Sigma-Aldrich; Merck KGaA), ionóforo (1 μg/ml; número de catálogo 13909; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y brefeldina A (5 ng/ml; número de catálogo B5936; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 4 h y luego se tiñeron según el procedimiento de tinción intracelular de citocinas. La estrategia de selección (Fig. S12) y la imagen representativa de los tumores (Fig. S13) se muestran en las Figuras Suplementarias.### Clasificación de células individuales, preparación de bibliotecas y secuenciación y preprocesamiento de datos

Se prepararon suspensiones de células tumorales individuales y se filtraron a través de tamices celulares de 40 µm. A continuación, se evaluó la concentración y la viabilidad celular mediante tinción con azul de trypan. Las células aisladas se sometieron a análisis de ARN de célula única. En resumen, las células se cargaron para preparar cuentas de gel de célula única en emulsiones (GEM) utilizando el instrumento Chromium Single Cell Controller (10× Genomics). Las GEM se encapsularon utilizando el kit Single Cell 3′ Library & Cell Bead Kit (10x Genomics). Las bibliotecas completadas se secuenciaron mediante Illumina NovaSeq 6000 utilizando kits de alto rendimiento de 75 ciclos con lecturas emparejadas de 150 pb. Los archivos de datos se analizaron con el paquete R SingleR. El recuento de transcritos de genes por célula se determinó mediante el identificador molecular único (UMI; paquete R Seurat, versión 3.1.1). Después de eliminar las células de baja calidad y las posibles capturas de múltiples células, se utilizó Seurat (función normalizeData) para normalizar los valores de expresión de cada célula mediante la expresión total y se transformaron los resultados mediante logaritmo. Se realizó la función FindVariableGenes en Seurat para identificar los genes altamente variables. A continuación, estos genes se sometieron a la función RunPCA y a la función FindClusters de Seurat para calcular los componentes principales significativos. Los grupos se visualizaron en un algoritmo t-SNE bidimensional utilizando la función RunTSNE en Seurat y los genes marcadores de cada grupo se identificaron mediante la función FindAllMarkers en Seurat. Además, los genes expresados diferencialmente (DEG, P < 0,05 y |log2 (cambio de expresión)| > 0,58) se filtraron mediante la función FindMarkers. A continuación, se utilizó SingleR para el reconocimiento imparcial del tipo celular de scRNA-seq, con los conjuntos de datos transcriptómicos de referencia ‘Human Primary Cell Atlas’ para inferir el origen de cada célula individual y para identificar los tipos celulares.^[38] Se llevaron a cabo análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology de los DEG utilizando la distribución hipergeométrica del software R. Para las células inmunitarias, se seleccionaron las células CD45+ y se identificaron cinco grupos principales de células inmunitarias, que incluyen las células T CD4+, las células T CD8+, los macrófagos, las células B, los neutrófilos y las células NK, utilizando marcadores para inferir las poblaciones de células inmunitarias en el análisis de citometría de masas (CyTOF) como en un estudio previo^[39]. El secuenciamiento y el análisis bioinformático fueron realizados por Shanghai OE Biotech Co., Ltd.### Palmitoilación de PD-L1

Las células tumorales se cocultivaron con un medio completo que contenía 100 µM de ácido palmítico-azida Click-iT (núm. de catálogo C10265; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C y 5 % de CO2 durante 6 h. A continuación, las células se recogieron y se lisaron con un tampón de lisis (1 % de SDS en 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) suplementado con un cóctel de inhibidor de proteasas e inhibidor de fosfatasas sobre hielo durante 0,5 h. Después de la sonicación, el lisado celular se centrifugó a 12.000 × g a 4 °C durante 10 min. Se recogieron los sobrenadantes de los lisados celulares y se sometieron a un ensayo Click-iT utilizando el kit de tampón de reacción de proteínas Click-iT (núm. de catálogo C10276; Thermo Fisher Scientific, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El complejo de proteínas palmíticas biotin-alquino (núm. de catálogo 901995; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) se unió a la estreptavidina (núm. de catálogo 3419; Cell Signaling Technology, Inc.) para realizar un ensayo de inmunoblotting de PD-L1.### Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software; Dotmatics). No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Para los datos que muestran una distribución normal, las diferencias estadísticamente significativas entre 2 grupos de muestras se estimaron aplicando una prueba t de Student de dos colas no pareada. Se utilizó una prueba ANOVA de una vía y la prueba post hoc de Dunnett para la comparación entre ≥ 3 grupos. También se aplicó la prueba de log-rank para evaluar la significación estadística en los datos de supervivencia. La significación estadística (p-valores) se definió como no significativa (ns): p > 0,05; *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente 3 veces, y cada uno arrojó resultados similares; los datos de un experimento independiente representativo se presentan como la media ± DE.### Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Biopsias de pacientes

Se utilizaron un total de 80 pares de tejidos de CRC, tejidos de mucosa normal adyacente y suero recogidos entre enero de 2018 y septiembre de 2018 de pacientes con CRC diagnosticados en el Fudan University Shanghai Cancer Center (FUSCC) para medir las concentraciones de una serie de ácidos biliares y para la tinción de inmunofluorescencia de tejidos (cohorte Ⅰ). Además, se recogió el suero de 20 individuos sanos normales en octubre de 2018. Además, 41 pacientes con MSI-H o dMMR con recurrencia o metástasis a distancia que recibieron inmunoterapia anti-PD-1 entre febrero de 2019 y septiembre de 2021 en FUSCC se incluyeron en el presente estudio (cohorte Ⅱ). Se incluyó una cohorte de 308 pacientes (cohorte Ⅲ) con cáncer colorrectal (CRC) entre enero de 2008 y septiembre de 2009 en el Fudan University Shanghai Cancer Center. Sus características clinicopatológicas se resumen en los datos suplementarios 1-3. Todos los pacientes de estas 3 cohortes no recibieron ningún tratamiento contra el cáncer antes de la cirugía. Las muestras de suero humano se recogieron antes de la resección del tumor, mientras que la mucosa normal y los tejidos cancerosos emparejados, así como los tejidos metastásicos, se recogieron inmediatamente después de la resección quirúrgica. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente, y el protocolo del estudio cumplió con las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 y fue aprobado por el Comité de Ética del FUSCC (núm. de aprobación 050432-4-2108).

Líneas celulares, plásmidos, producción y transducción de lentivirus

Las líneas celulares de cáncer de colon humano HCT116 y SW620, la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 y la línea celular 293T se obtuvieron del American Type Culture Collection, mientras que la línea celular de cáncer de colon de ratón MC38 se compró al Banco de Células del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias. Las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en 5 % de CO2 en DMEM o en RPMI1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 100 µ/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se analizaron mensualmente y se comprobó que estaban libres de micoplasma mediante un cribado basado en PCR. Los genes SOX14 y DHHC9 de longitud completa fusionados con la etiqueta Flag se amplificaron mediante PCR a partir del ADNc de las células HCT116 y, a continuación, se recombinaron en el plásmido pLVX (núm. de catálogo 125839; Addgene, Inc.). Los cebadores utilizados se enumeran en los datos suplementarios 4. Las secuencias de ARN de interferencia de cadena corta (shRNA) dirigidas a SOX14 y DHHC9 se clonaron en el vector pLKO.1 (núm. de catálogo 10878; Addgene, Inc.), y los cebadores utilizados se enumeran en los datos suplementarios 5. Las ARN guía únicas (sgRNA) dirigidas a FXR o CD274 se construyeron en el vector lentiCRISPR v2 (núm. de catálogo 52961; Addgene, Inc.). Las secuencias de orientación de CRISPR/Cas9 se enumeran en los datos suplementarios 5. El lentivirus se produjo mediante la transfección transitoria de células 293T con el reactivo de transfección Lipofectamine® 3000 (núm. de catálogo L3000075; Thermo Fisher Scientific, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, los sobrenadantes virales se incubaron con 8 µg/ml de polibreno durante 24 h, y los sobrenadantes virales se intercambiaron por medio fresco. Las células se incubaron durante 48 h antes de la selección con puromicina. Para la transfección de ARN de interferencia pequeño (siRNA), las células tumorales se sembraron en placas de 6 pocillos a ~1,5 × 105 células por pocillo y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los siRNA específicos (5 nM; Thermo Fisher Scientific, Inc.) se transfectaron en las células y se incubaron durante 6 h. A continuación, el medio se reemplazó por DMEM completo durante 48 h. Las secuencias de siRNA se enumeran en los datos suplementarios 6. Las células tumorales MC38R resistentes a anti-PD1 se desarrollaron según lo descrito anteriormente.^[37] En resumen, se inyectaron por vía subcutánea 6-semanas de ratones C57BL/6J en el flanco derecho con 1,0 × 106 células MC38 (n = 6). A los 10 días después de la inyección, los ratones se trataron dos veces por semana con 100 µg de anticuerpo anti-PD-1α (Bio X Cell) por ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) durante 1 semana. A continuación, los tumores se seleccionaron y se trasplantaron en el flanco derecho de ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad. Después de 3 ciclos repetidos de selección de tumores, los tumores no responsivos se digirieron en células tumorales individuales, es decir, células tumorales MC38R.

Preparación de muestras y enfoques metabolómicos basados en la espectrometría de masas de adquisición independiente de datos (MS)

Se añadieron 100 µl de suero con 0,51 ml de MeOH-ACN (1:1, v:v) a hielo. La muestra se agitó y se incubó durante 1 h a -20 °C, y luego se centrifugó a 14.000 rcf a 4 °C durante 15 min para precipitar las proteínas. Se aspiró el sobrenadante, se evaporó utilizando un concentrador de vacío (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los extractos se reconstituyeron en 100 µl de MeOH y agua desionizada (85:15, v:v), y se centrifugaron a 15.000 × g a 4 °C durante 15 min para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante se recogió en viales de muestra UPLC (Thermo Scientific, MA, EE. UU.) y se almacenó a -80 °C antes del análisis UPLC-MS. Las muestras de tumor se homogeneizaron en 100 % de acetonitrilo y se centrifugaron dos veces a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar las proteínas precipitadas y otros residuos. A continuación, el sobrenadante se diluyó con ácido fórmico al 0,1 %. La muestra de control de calidad se obtuvo mezclando 5 µl de la solución extraída de cada muestra.

La separación cromatográfica y la detección por espectrometría de masas se llevaron a cabo utilizando el sistema LC-MS/MS Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher, Palo Alto, CA). La separación cromatográfica se realizó en una columna analítica Poroshell SB-C18 (tamaño de partícula, 1,7 µm; 50 mm (longitud) × 2,1 mm (i.d.)) equipada con una columna pre-columna BEH C18 VanGuard (5 × 2,1 mm, i.d.; 1,7 µm). La fase móvil consistió en un tampón acuoso que contenía 1 mM de formiato de amonio y ácido fórmico (pH 4,39) (A) y acetonitrilo/isopropanol (1:1 v/v) (B), con una velocidad de flujo total de 0,4 ml/min. El perfil de gradiente para las bombas de LC fue el siguiente: 20-30 % B (0-3 min), 30-40 % B (3-4 min), 50-70 % B (4-5 min), 70-90 % B (5-5,2 min), continuando al 90 % B hasta los 6 min. El volumen de inyección para todas las muestras fue de 2 µl. La temperatura de la columna se fijó en 55 °C y la temperatura de la bandeja de muestras se mantuvo a 8 °C. Para la detección por espectrometría de masas, la fuente de ionización por electrospray (ESI) se operó en modo de iones negativos para producir espectros MS/MS (Thermo Fisher). Los parámetros fueron los siguientes: voltaje de pulverización 2 kV, voltaje de cono 30 V, temperatura de la fuente 120 °C, temperatura de desolvatación 500 °C, flujo de gas de cono 50 L/h, flujo de gas de desolvatación 900 L/h.

Para la preparación del estándar, se disolvieron 33 ácidos biliares en 1 mg/ml en la cantidad adecuada de metanol como soluciones estándar y, a continuación, se diluyeron para obtener soluciones estándar que contenían 0,05, 0,5, 5 y 50 mg/ml de cada ácido biliar. Se recogió el sobrenadante y se inyectaron 70 µl en el sistema LC-MS/MS para su análisis. El ácido cólico (CA), el ácido quenodeoxicólico (CDCA), el glicocenodeoxicolato de sodio (GCDCA), el taurocenodeoxicolato de sodio (TCDCA), el ácido glicocólico (GCA), el ácido taurolitocólico (TLCA), el taurodeoxicolato de sodio hidratado (TDCA) y el taurocolato de sodio hidratado (TCA) se compraron a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). El ácido ursodeoxicólico (UDCA), el ácido deoxicólico (DCA), el ácido litocólico (LCA) y el ácido glicoursodeoxicólico (GUDCA) se adquirieron de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE. UU.). El ácido glicodeoxicólico (GDCA) y el ácido glicolitocólico (GLCA) se adquirieron de Toronto Research Chemicals (TRC, Canadá).

Espectrometría de masas de adquisición independiente de datos (MS) basada en la proteómica

SPANISH TRANSLATION:

Las células MC38 se trataron con o sin GCA durante 24 horas y se procesaron mediante adquisición independiente de datos ^[6] individualmente para evaluar el proteoma. En resumen, para la preparación de la muestra, las células se lisaron en tampón de lisis (1% SDS y 8 M de urea) y se digirieron con el kit de preparación de muestras iST (PreOmics) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los péptidos se eluyeron con tampón de elución (2 × 100 µl) y luego se liofilizaron con SpeedVac. Las muestras de proteínas se reconstituieron en 0,1% de FA y se sometieron a cromatografía líquida UltiMate 3000 (LC) (Thermo Fisher Scientific, Inc.). En total, se separaron 200 ng de péptidos mediante una columna analítica con un gradiente de 60 minutos que comenzaba al 4% de tampón B (80% de ACN con 0,1% de FA), seguido de un aumento gradual al 28% en 25 minutos, 44% en 10 minutos, 90% en 10 minutos, se mantuvo durante 7 minutos y luego se equilibró al 4% durante 8 minutos. El caudal de la columna se mantuvo en 500 nl/min con una temperatura de la columna de 50 °C. Los datos DIA se adquirieron en el modo diaPASEF. Los datos brutos de DIA se analizaron con Spectronaut 17 (Biognosys AG) con la configuración predeterminada. La estrategia de normalización se estableció en la normalización local. Los péptidos que superaron el umbral de Q-valor del 1% se utilizaron para calcular las cantidades del grupo principal con el método MaxLFQ. Las proteínas expresadas de forma diferencial se seleccionaron en función de P < 0,05, cambio de pliegue (FC) > 1,5 o FC < 1/1,5.

Ensayo de reportero de luciferasa dual

Para la medición de la actividad de FXR, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a ~1,5 × 104 células por pocillo y se transfectaron con el plásmido reportero de luciferasa de FXR, FXRE-Luc (200 ng; n.º de catálogo 11764ES03; Shanghai Yeasen Biotechnology Co., Ltd.) y 20 ng de plásmido Renilla pRL-SV40P (n.º de catálogo 27163; Addgene, Inc.) por pocillo con Lipofectamine® 3000 según las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se trataron con GCA (100 nM, n.º de catálogo G2878; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) o GW4064 (5 μM, n.º de catálogo G5172; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 24 horas, y se midieron las unidades de luciferasa relativas (RLU) utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega Corporation) según las instrucciones del fabricante. Para el seguimiento de la expresión de SOX9 o DHHC9, las células se sembraron y se transfectaron con 200 ng de pGL3-SOX14, pGL3-SOX14-FXR mutante ^[15], pGL3-DHHC9 o vector mutante pGL3-DHHC9-SOX14, junto con 20 ng de plásmido Renilla pRL-SV40P por pocillo con Lipofectamine® 2000. Después de 24 horas, se midieron las RLU en las células utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo. Las RLU de la luciferasa firefly se normalizaron con las RLU del vector que contenía Renilla.

Ratones

Los ratones Fxr floxed se compraron a Cyagen Biosciences, Inc. (n.º de catálogo S-CKO-04890). Los ratones transgénicos Villin-Cre (#004586) se compraron al Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) para crear ratones con knockout condicional y silenciar la expresión de Fxr en las células epiteliales intestinales. Brevemente, se inyectaron en los cigotos de ratón dos sgRNA sintetizados que se dirigían a los intrones 3 y 4, el ARNm de Cas9 y un oligonucleótido que contenía LoxP y que tenía brazos de homología de 50 pares de bases, y luego se transfirieron a ratonas pseudogestantes. Los ratones Fxr floxed se identificaron mediante genotipado y secuenciación. A continuación, se cruzaron los ratones Fxr floxed con los ratones transgénicos Villin-Cre para obtener modelos de ratón con knockout específico de Fxr en el epitelio intestinal. Los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos experimentales. Para los modelos primarios de ratón, los animales se seleccionaron en función de los genotipos correctos y se colocaron en las mismas jaulas y se utilizaron para los estudios. Todos los ratones utilizados en el estudio fueron de la misma edad y sexo. Los investigadores desconocían los tratamientos durante los experimentos. Todos los ratones se alojaron en las instalaciones de animales libres de patógenos específicos de FUSCC. Se observó a los animales para evaluar su estado general de salud y detectar signos de malestar (pérdida de peso, pelo erizado o evidencia de ulceración/hemorragia tumoral). Los ratones se sacrificaron cuando la pérdida de peso corporal superó el 20% o cuando el volumen tumoral superó los 1500 mm³. La eutanasia se realizó de acuerdo con las normas institucionales mediante inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical para garantizar la muerte. El máximo volumen tumoral permitido por nuestro comité de ética es de 1500 mm³, y este límite no se superó en ningún experimento. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de FUSCC.

Para el injerto tumoral, se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho ratones C57BL/6J o BALB/c de 6 semanas de edad con 1,0 × 106 células MC38 o CT26, respectivamente. También se utilizaron ratones BALB/c nude para establecer un modelo de CRC subcutáneo utilizando células MC38 o CT26. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula "longitud × ancho × ancho/2" en los días indicados. Se registró el peso corporal en el momento de la medición del tumor. Para el análisis de supervivencia, se consideró que los ratones estaban en estado terminal y se sacrificaron cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente los 1000 mm³ o cuando se observaron signos graves de malestar. Para el modelo de ratón ortotópico guiado por endoscopia, se examinaron ratones C57BL/6 de tipo salvaje de 10 a 12 semanas de edad mediante el sistema de endoscopia Coloview® (Storz, Tuttlingen, Alemania) con una óptica de cero grados (diámetro de 1,9 mm) para garantizar que la mucosa del colon estuviera sana antes de la implantación tras la anestesia. Para la implantación de células tumorales, primero se lavó el colon con PBS a 37 °C y se inyectaron lentamente hacia el lumen del colon inferior y distal, a unos 30 mm del borde anal, 0,5 × 106 células MC38) diluidas en 50 μL de PBS para inducir el crecimiento tumoral mediante la inyección endoscópica. El volumen tumoral se controló endoscópicamente semanalmente mediante una puntuación endoscópica. Para el modelo de cáncer asociado a colitis inducido por AOM/DSS, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones macho de 8 a 10 semanas de edad con 10 mg/kg de AOM (n.º de catálogo A5486; Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Después de 5 días, se añadió un 2% de DSS (n.º de catálogo D8906; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) al agua de beber durante 5 días, seguido de agua de beber normal durante 2 semanas. Los ratones se sacrificaron después de 3 ciclos repetidos de DSS. Para el experimento de depleción de macrófagos, los ratones se pretrataron con liposomas de clodronato (150 μl; Max Scientific) 3 días antes de la inoculación con células tumorales, y luego se administraron a los ratones indicados clodronato y liposomas de control, con o sin GCA [400 μg/kg, gavage intragástrico (ig) o GW4064 (50 mg/kg, i.p.)] dos veces por semana durante el curso de los experimentos. Para el experimento de depleción de CD8, se trató a los ratones con un anticuerpo anti-CD8 (200 μg por inyección; clon 2.43; Bio X Cell) dos veces por semana durante el curso de los experimentos. Para el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1, se trató a los ratones con 100 μg de anticuerpo anti-PD-1α (Bio X Cell) por ratón dos veces por semana o con el control de IgG correspondiente mediante inyección intraperitoneal durante los días indicados. Para el tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1, se trató a los ratones con 10 mg/kg o 100 mg/kg de anticuerpo anti-PD-L1 (Bio X Cell) por ratón dos veces por semana o con el control de IgG correspondiente mediante inyección intraperitoneal durante los días indicados. Para el tratamiento con GCA (400 mg/kg, gavage intragástrico), GW4064 (50 mg/kg, i.p.) o T-βMCA (400 mg/kg, i.p.), se trató a los ratones con GW4064 o T-βMCA dos veces por semana después de 6 días de la inoculación con las células de CRC indicadas.

Extracción de ARNm y RT-qPCR

Se extrajo el ARN total de las células o tumores utilizando el reactivo TRizol® (n.º de catálogo 15596026CN; Thermo Fisher Scientific, Inc.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ARN extraído se transcribió a ADNc utilizando el kit de reactivo RT PrimeScript® (n.º de catálogo RR037B; Takara Bio, Inc.). Se realizó RT-qPCR con un programa de amplificación rápida de dos pasos utilizando el FastStart Universal SYBR Green Master Mix (n.º de catálogo 04913850001; Roche Diagnostics GmbH). Los datos se normalizaron con GAPDH. Los cebadores utilizados se enumeran en los Datos suplementarios 7.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Las células HCT116 y SW620 que expresaban SOX14-Flag CRC, o las células CRC tratadas con GCA o GW4064 durante 24 horas, se sometieron a un ensayo de ChIP con el kit SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (n.º de catálogo 9003S; Cell Signaling Technology, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón específicos para FXR (n.º de catálogo 72105; Cell Signaling Technology, Inc.) y anticuerpos monoclonales de conejo específicos para SOX14 (n.º de catálogo PA1-28074; Thermo Fisher Scientific, Inc.) para el ensayo de ChIP. Se realizó SYBR Green RT-qPCR utilizando los siguientes cebadores: sitio de unión a FXR 1, sentido: 5'-TTTGTATTTCAAGCCCTAA-3' y reverso: 5'-GACTTCGGTTCCACATTGT-3'; sitio de unión a FXR 2, sentido: 5'-CAGTCTAGAGCTAGCCTCT-3' y reverso: 5'-CGCACCTGCCAACACGCCGG-3'; sitio de unión a SOX14 1, sentido: 5'-AGGGAGATGGGTGGAGGAGT-3' y reverso 5'-CGGCCGCCCCTATC-3'; y sitio de unión a SOX14 2, sentido: 5'-GGAGGCGCCGAGGCC-3' y reverso: 5'-CCCACCACTGGCCAAAT-3'.

Inmunoblotting

Para el inmunoblotting, las muestras obtenidas de las células o tumores se lisaron con tampón RIPA (n.º de catálogo 89901; Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado con un inhibidor de proteasas (n.º de catálogo 05892970001; Roche Diagnostics GmbH) y un cóctel de inhibidores de fosfatasas (n.º de catálogo 04906845001; Roche Diagnostics GmbH) durante 1 hora. Los lisados se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Se recogieron los sobrenadantes y se mezclaron cantidades iguales de lisados celulares (100 μg) con el tampón de carga SDS-PAGE 5X. A continuación, las muestras se separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (MilliporeSigma). A continuación, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios y secundarios indicados y se visualizaron utilizando el sustrato SuperSignal West Dura Extended Duration (n.º de catálogo 34076; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los anticuerpos utilizados se enumeran en los Datos suplementarios 8.

Microscopía de inmunofluorescencia y tinción de inmunofluorescencia multiplex

Para el ensayo de microscopía de inmunofluorescencia, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante 15 minutos, seguido de la permeabilización con un 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos. Las muestras se bloquearon con un 1% de suero de cabra durante 30 minutos y, a continuación, se incubaron con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante 12 horas antes de incubarse a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488/594. Se utilizó DAPI (n.º de catálogo ab104139; Abcam) para teñir los núcleos durante 30 minutos antes de someter las muestras a un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert-200 (Zeiss AG).

Para la tinción multiplex, las muestras se trataron siguiendo el método de tinción del protocolo Opal. Los reactivos utilizados fueron los siguientes: anti-SOX14 (n.º de catálogo #ab214041; 1:500; Abcam), anti-DHHC9, anti-PD-L1 y anti-CD8 (n.º de catálogo 98941; Cell Signaling Technology, Inc.; RRID: AB_2756376, 1:500) se visualizaron utilizando fluoresceína-cianina (Cy) 7 (1:50), fluoresceína-Cy5 (1:50) y fluoresceína-Cy3 (1:50). Además, se utilizó DAPI (1:2000) para la tinción de los núcleos. Todas las secciones se cubrieron con VECTASHIELD Hardset Antifade Mounting Medium (n.º de catálogo #H-1400; Vector Laboratories). Las láminas se escanearon y se analizó la intensidad media de fluorescencia de los marcadores indicados con un escáner de láminas Vectra (PerkinElmer, Inc.) en condiciones de fluorescencia.

Ensayo de cocultivo

Se inyectaron células MC38 o CT26 (1,0 × 106 células) por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6 o BALB/c durante 2 semanas. A continuación, las células CD8+ de los tumores MC38 o CT26 se aislaron mediante FACs. Se contó el número de células MC38 o CT26 indicadas después de 3 días de cocultivo con células CD8+ (1,0 × 104 células) en presencia de anticuerpo anti-CD3 (5 μg/ml) y anticuerpo anti-CD28 (5 μg/ml).

Digestión tumoral, aislamiento celular y análisis por citometría de flujo

Se procesaron por trituración y digestión los tumores derivados de los ratones indicados, utilizando un tampón de digestión [medio RPMI suplementado con un 5 % de FBS, colagenasa I intravenosa (0,5 mg/mL, n.º de catálogo C1-22; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y DNasa (1 μg/ml; n.º de catálogo D5025; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 30 minutos a 37 °C. A continuación, la mezcla se filtró y las células sanguíneas rojas (RBC) se lisaron utilizando un tampón de lisis de RBC (n.º de catálogo 00-4300-54; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los precipitados se lavaron con el tampón II (PBS con un 2 % de FBS) y se bloquearon con anticuerpo anti-CD16/32 durante 30 minutos. Las suspensiones de células individuales se lavaron e incubaron con los anticuerpos indicados antes de ser sometidas al análisis con LSRII (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando FlowJo. Los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla S8. Las poblaciones celulares se identificaron en función de los siguientes marcadores de expresión: células T CD4: CD45+/CD4+; células T CD8: CD45+/CD8+; células MDSC: CD45+/CD11b+/Gr-1+; y macrófagos: CD45+/CD11b+/F4/80+. Para la tinción intracelular, las células se estimularon con 12-miristoil-13-acetato de forbol (20 ng/ml; n.º de catálogo p8139; Sigma-Aldrich; Merck KGaA), ionóforo (1 μg/ml; n.º de catálogo 13909; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y brefeldina A (5 ng/ml; n.º de catálogo B5936; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 4 horas y, a continuación, se tiñeron según el procedimiento de tinción de citocinas intracelulares. La estrategia de selección (Fig. S12) y la imagen representativa de los tumores (Fig. S13) se muestran en las Figuras Suplementarias.

Selección de células individuales, preparación y secuenciación de bibliotecas y preprocesamiento de datos

Se prepararon suspensiones de células tumorales individuales y se filtraron a través de tamices celulares de 40 μm. A continuación, se evaluó la concentración y la viabilidad celular mediante la tinción con azul de trypan. Las células aisladas se sometieron a análisis de ARN de células individuales. En resumen, las células se cargaron para preparar cuentas de gel de células individuales en emulsiones (GEM) utilizando el instrumento de control de células individuales Chromium (10× Genomics). Las GEM se encapsularon utilizando el kit de biblioteca y cuentas de células de cadena única 3′ (10x Genomics). Las bibliotecas completas se secuenciaron mediante Illumina NovaSeq 6000 utilizando kits de alto rendimiento de 75 ciclos con lecturas emparejadas de 150 pb. Los archivos de datos se analizaron con el paquete R SingleR. El recuento de transcritos de genes por célula se determinó mediante el identificador molecular único (UMI; paquete R Seurat, versión 3.1.1). Tras eliminar las células de baja calidad y las posibles capturas de múltiples células, se utilizó Seurat (función normalizeData) para normalizar los valores de expresión de cada célula mediante la expresión total y transformar los resultados logarítmicamente. Se realizó la función FindVariableGenes en Seurat para identificar los genes altamente variables. A continuación, estos genes se sometieron a las funciones RunPCA y FindClusters de Seurat para calcular los componentes principales significativos. Los grupos se visualizaron en un algoritmo t-SNE bidimensional utilizando la función RunTSNE en Seurat y los genes marcadores de cada grupo se identificaron mediante la función FindAllMarkers en Seurat. Además, los genes expresados diferencialmente (DEG, P < 0,05 y |log2 (cambio de pliegue)| > 0,58) se filtraron mediante la función FindMarkers. A continuación, se utilizó SingleR para el reconocimiento imparcial del tipo celular de scRNA-seq, con los conjuntos de datos transcriptómicos de referencia ‘Human Primary Cell Atlas’ para inferir el origen de cada célula individual de forma independiente y para identificar los tipos celulares.^[38] Se llevaron a cabo análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology de los DEG utilizando la distribución hipergeométrica del software R. Para las células inmunitarias, se seleccionaron las células CD45+ y se identificaron cinco grupos principales de células inmunitarias, incluidos las células T CD4+, las células T CD8+, los macrófagos, las células B, los neutrófilos y las células NK, utilizando marcadores para inferir las poblaciones de células inmunitarias en el análisis de tiempo de vuelo (CyTOF), como en un estudio previo^[39]. El secuenciamiento y el análisis bioinformático fueron realizados por Shanghai OE Biotech Co., Ltd.

Palmitoilación de PD-L1

Las células tumorales se cocultivaron con un medio completo que contenía 100 μM de ácido palmítico-azida Click-iT (n.º de catálogo C10265; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C y 5 % de CO2 durante 6 horas. A continuación, las células se recogieron y se lisaron con un tampón de lisis (1 % de SDS en 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) suplementado con un cóctel de inhibidor de proteasas e inhibidor de fosfatasas sobre hielo durante 0,5 horas. Tras la sonicación, el lisado celular se centrifugó a 12.000 × g a 4 °C durante 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes de los lisados celulares y se sometieron a un ensayo Click-iT utilizando el kit de tampón de reacción de proteínas Click-iT (n.º de catálogo C10276; Thermo Fisher Scientific, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El complejo de proteína-palmitato biotin-alquino (n.º de catálogo 901995; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) se unió a la estreptavidina (n.º de catálogo 3419; Cell Signaling Technology, Inc.) para realizar un ensayo de inmunoblot para PD-L1.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software; Dotmatics). No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Para los datos que muestran una distribución normal, las diferencias estadísticamente significativas entre 2 grupos de muestras se estimaron aplicando pruebas t de Student de dos colas no pareadas. Se utilizó ANOVA de una vía y la prueba post hoc de Dunnett para la comparación entre ≥ 3 grupos. También se aplicó la prueba de log-rank para evaluar la significación estadística en los datos de supervivencia. La significación estadística (valores p) se definió como no significativa (ns): p > 0,05; *p < 0,05; p < 0,01; *p < 0,001. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente 3 veces, y cada uno arrojó resultados similares; se presentan los datos de un experimento independiente representativo como la media ± DE.

Resumen del informe

Se proporciona información adicional sobre el diseño de la investigación en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.