Análisis de variantes de un solo nucleótido en biopsia líquida mediante RECO-Cas.

La biopsia líquida basada en sangre es un enfoque mínimamente invasivo para la detección temprana del cáncer, la clasificación del tejido de origen y el seguimiento del tratamiento. Mediante el análisis de biomarcadores tumorales circulantes, como el ADN tumoral circulante (ctDNA), las células tumorales circulantes (CTCs) y las vesículas extracelulares, a partir de muestras de sangre, este enfoque proporciona información en tiempo real sobre la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento (^[1]–^[5]). A pesar de los desafíos, como la baja abundancia de biomarcadores y la sensibilidad limitada, los continuos avances tecnológicos siguen ampliando su utilidad clínica, especialmente para la detección temprana y para el seguimiento de la heterogeneidad y la dinámica evolutiva de los cánceres (^[6]–^[8]).

El ADN libre de células circulante (cfDNA) comprende ADN fragmentado que se libera en el torrente sanguíneo durante la apoptosis y la necrosis de células normales y tumorales (^[9], ^[10]). En pacientes con cáncer, un subconjunto conocido como ctDNA se origina en células malignas y alberga alteraciones genéticas y epigenéticas específicas del tumor, incluidas mutaciones puntuales (por ejemplo, KRASG12D y PIK3CAE545K), inserciones y deleciones, cambios en el número de copias y variantes estructurales (^[11]–^[13]). Dado que el ctDNA refleja el perfil genómico del tumor, su análisis permite la caracterización no invasiva del cáncer. La detección de ctDNA en la biopsia líquida ha demostrado su utilidad clínica en la detección temprana del cáncer, el seguimiento en tiempo real de la carga tumoral y la respuesta al tratamiento, la identificación de mutaciones que pueden ser objeto de terapia (por ejemplo, EGFRL858R) y la detección de enfermedad residual mínima o recurrencia (^[14], ^[15]). A diferencia de las biopsias de tejido, que están limitadas por las restricciones de muestreo, el análisis de cfDNA captura la heterogeneidad tumoral y permite la evaluación longitudinal a partir de pequeños volúmenes de sangre.

A pesar de su amplia adopción, el análisis de mutaciones de cfDNA aún enfrenta importantes barreras técnicas y prácticas. En las etapas tempranas de la enfermedad o en las enfermedades con baja carga tumoral, el ctDNA a menudo representa menos del 1% del cfDNA total, lo que lleva los ensayos existentes a sus límites de sensibilidad (^[16]–^[19]). Para superar esto, la mayoría de los protocolos de los ensayos incorporan uno o más de los siguientes enfoques: reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo (PCR) (^[20]), enriquecimiento de amplicones basado en bloqueadores o mediado por pinzas (^[21]), códigos de barras moleculares (^[22]) y secuenciación de captura híbrida (^[23]), lo que aumenta el costo, el tiempo de respuesta y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, la secuenciación de última generación (NGS) de amplia cobertura exige una preparación de bibliotecas en varias etapas, una gran cantidad de ADN y un análisis bioinformático intensivo, mientras que la PCR digital de gota (ddPCR) solo proporciona una sensibilidad subporcentual para loci predefinidos y no se escala bien (^[6], ^[24], ^[25]). Además, la manipulación extensa de las muestras, la instrumentación especializada y la susceptibilidad a las variables preanalíticas (por ejemplo, la fragmentación del cfDNA, la contaminación con ADN genómico y la degradación) restringen su uso rutinario o descentralizado. Estas limitaciones subrayan la necesidad de una plataforma simplificada y sin necesidad de enriquecimiento, capaz de cuantificar mutaciones raras directamente a partir de cfDNA a escala de microlitros con alta sensibilidad y especificidad, utilizando una instrumentación mínima, para permitir aplicaciones de diagnóstico en el punto de atención (POC) simples y asequibles en entornos con recursos limitados.

Las endonucleasas programables, como CRISPR-Cas9/12a y las proteínas Argonaute (por ejemplo, TtAgo), han demostrado su utilidad potencial en la detección de mutaciones de cfDNA debido a su actividad de escisión específica de la secuencia. Los ensayos basados en Cas9 [por ejemplo, el enriquecimiento de alelos menores basado en dCas9 (^[26]) y CRISPR-CPPC (^[27])] combinan la escisión del ADN con PCR o capturan específicamente el ctDNA mutante para amplificar las fracciones de alelos mutantes, lo que permite la detección sensible de variantes conocidas. Sin embargo, dado que la actividad de escisión transversal de Cas12a no es específica, no es adecuada para el enriquecimiento directo de mutaciones; además, su tolerancia a las incompatibilidades dificulta la discriminación de variantes de un solo nucleótido (SNV), lo que lleva a falsos positivos en la detección directa de secuencias mutantes (^[28]). Por el contrario, las proteínas Argonaute escinden las incompatibilidades de una sola base con alta fidelidad y se han aplicado a la detección de mutaciones de ADN mediante la eliminación de los alelos de tipo salvaje para enriquecer las variantes raras, como en A-Star (^[29]) y NAVIGATER (^[30]). Sin embargo, dado que las proteínas Argonaute carecen de una amplificación de señal inherente, aún requieren instrumentos avanzados, como sistemas ddPCR o plataformas NGS, para la detección de secuencias mutantes.

Aquí, presentamos un ensayo RECO-Cas (ensayo de construcción de ADN recombinado activado por Cas12a) para perfilar las mutaciones de cfDNA, lo que permite una detección simple, sensible y precisa de SNV en la biopsia líquida. RECO-Cas integra la amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA), la escisión precisa de ADN mutante mediada por TtAgo y la amplificación de señal habilitada por CRISPR. Para simplificar el flujo de trabajo, combinamos la amplificación del ADN diana con el reconocimiento y la escisión mediados por TtAgo en un formato de un solo tubo. En el ensayo, el alelo mutante se amplifica y se escinde primero, mientras que el ADN de tipo salvaje permanece intacto. El alelo mutante resultante, que presenta una hendidura, se hibrida con el complejo activador de Cas12a/ARN guía CRISPR (crRNA)/ADN monocatenario (ssDNA), lo que activa específicamente la actividad de escisión transversal de Cas12a y amplifica la señal de detección. RECO-Cas alcanza una sensibilidad de hasta el 0,01% de frecuencia de alelos variantes (VAF). Utilizando el ensayo, detectamos simultáneamente múltiples mutaciones en el cfDNA extraído de una sola muestra de plasma de un paciente debido a su amplificación de señal específica de la secuencia, lo que permite el perfilado de SNV para la detección temprana del cáncer. Además, incorporamos RECO-Cas en una plataforma de diagnóstico compacta y alimentada de forma inalámbrica y detectamos las señales de fluorescencia utilizando un teléfono inteligente con inteligencia artificial (IA), lo que destaca su potencial para pruebas de POC con instrumentación mínima en entornos con recursos limitados. En resumen, el ensayo RECO-Cas permite la detección simple, rápida y sin necesidad de enriquecimiento de mutaciones de cfDNA de baja frecuencia, lo que proporciona una solución robusta y escalable para la biopsia líquida, que es adecuada para entornos con recursos limitados.

RESULTADOS

Flujo de trabajo general de RECO-Cas

El ensayo RECO-Cas combina la amplificación isotérmica de cfDNA, la escisión específica de la secuencia de TtAgo y la detección de amplificación de señal habilitada por CRISPR-Cas12a. Consiste principalmente en dos pasos: (a) una reacción RPA-TtAgo en un solo recipiente, en la que un sistema de reacción multifásico combina la amplificación de RPA con la escisión de TtAgo para permitir la escisión selectiva de amplicones de cfDNA mutantes, dejando intactos los amplicones de tipo salvaje [Fig. 1A (a)], y (b) la detección de CRISPR específica de mutantes utilizando una construcción de ADN recombinado de ADN mutante con hendidura y ssDNA artificial (denominado "activador de ssDNA"). En presencia de cfDNA mutante, el complejo Cas12a-crRNA reconoce la construcción de ADN recombinado, lo que induce la activación conformacional de Cas12a y la posterior escisión transversal, amplificando así la señal de fluorescencia del cfDNA mutante. Por el contrario, incluso en presencia de activadores de ssDNA, el ADN de tipo salvaje permanece de doble cadena y no se desenrolla para el reconocimiento de crRNA, lo que impide la activación de Cas12a y la posterior escisión del reportero [Fig. 1A (ii)]. Si bien los pasos preanalíticos, como la separación del plasma y la extracción del ADN, requieren una instrumentación de laboratorio mínima, simplificamos el flujo de trabajo de detección de SNV para que el análisis de cfDNA sea más compatible con las pruebas de detección temprana del cáncer en el punto de atención (Fig. 1B). Para eliminar la necesidad de instrumentación costosa, integramos el ensayo en una plataforma de diagnóstico compacta y alimentada de forma inalámbrica, donde las señales de fluorescencia se detectan mediante un teléfono inteligente con IA, lo que permite las pruebas de POC en entornos con recursos limitados.

El ensayo RECO-Cas ofrece ventajas técnicas clave para la detección de SNV. En primer lugar, proporciona una detección de mutaciones altamente específica al aprovechar la actividad de escisión altamente selectiva del complejo TtAgo-ADN guía (^[30]). Al introducir estratégicamente una incompatibilidad de una sola base dentro del ADN guía, permitimos que TtAgo distinga y escinda el ADN mutante con una resolución de un solo nucleótido, incluso en un fondo complejo de secuencias de tipo salvaje o no relacionadas. Esta estrategia introduce selectivamente hendiduras en el ADN mutante. Además, la fosforilación en el extremo 3' del ADN guía mejora aún más la especificidad de la escisión e inhibe la extensión del ADN por la ADN polimerasa en la solución de reacción de RPA. En segundo lugar, RECO-Cas logra una alta sensibilidad de detección [bajo límite de detección (LoD)] con un mínimo de fondo a través de dos mecanismos clave: (i) la ausencia de una hendidura hace que el ADN de tipo salvaje conserve su estructura de doble cadena, lo que impide el desenrollamiento espontáneo de la región de reconocimiento de crRNA y, por lo tanto, bloquea la unión de crRNA y la activación posterior, y (ii) Cas12a tolera activadores de ssDNA cortos y su actividad de escisión transversal no se activa (^[31]). Solo en presencia de ADN mutante con hendidura, el activador de ssDNA puede formar una estructura de ADN recombinado y unirse específicamente al complejo Cas12a-crRNA, lo que activa la actividad de DNasa de Cas12a para la amplificación de la señal de fluorescencia. Debido a estas características únicas, RECO-Cas es capaz de perfilar con precisión múltiples mutaciones del cáncer y, al mismo tiempo, lograr una detección de SNV altamente precisa.

Validación y optimización del ensayo RECO-Cas

El ensayo RECO-Cas utiliza ADN mutante de TtAgo recombinado con hendidura junto con un activador de ssDNA para activar específicamente CRISPR-Cas12a para la detección de mutaciones de cfDNA. Para evaluar la base del diseño, primero probamos nucleótidos sintéticos correspondientes a KRASG12D y KRAS de tipo salvaje (KRASWT). Cuando se utilizó ssDNA como entrada, RECO-Cas no pudo discriminar entre los alelos mutantes y de tipo salvaje, ya que las señales de fluorescencia al final del proceso no mostraron una diferencia sustancial (fig. S1). Por el contrario, el ADN de doble cadena logró una detección específica de alelos del mutante. Mecánicamente, RECO-Cas se basa en el desenrollamiento espontáneo del alelo mutante en la región de reconocimiento de crRNA cerca de la hendidura, lo que facilita la hibridación de crRNA. Además, hipotetizamos que el uso de dos ADN guía que se dirijan a ambas hebras de la secuencia mutante podría mejorar el rendimiento del ensayo. Para probar esto, introdujimos un ADN guía adicional que se dirija a la hebra antisentido del alelo mutante para la escisión selectiva. En comparación con la configuración de un solo ADN guía, las señales de fluorescencia aumentaron; sin embargo, el ensayo no pudo distinguir el alelo mutante (Fig. 2, A a E). Una explicación probable es que el ADN guía que se dirige a la hebra antisentido formó un complejo cuaternario con el activador y Cas12a-crRNA, lo que interrumpió el reconocimiento específico. A continuación, comparamos y optimizamos las concentraciones de los reporteros de ssDNA de fluorescencia y los activadores. Descubrimos que el uso de una concentración más alta de reporteros y una concentración más baja de activadores produjo la señal de fluorescencia más fuerte, caracterizada por un aumento con el tiempo (fig. S2 y S3). Además, evaluamos el ensayo optimizado controlando sistemáticamente la composición de la reacción (fig. S4). Observamos la señal analítica más alta solo cuando estaban presentes todos los componentes (ADN diana con hendidura, Cas12a, crRNA y activador), mientras que la omisión de cualquier componente único abolió la señal, lo que confirmó la especificidad del ensayo.

Después de validar el diseño del ensayo, procedimos a optimizar la reacción RECO-Cas en un solo tubo (TtAgo), (Fig. 2F), en la que la amplificación RECO y el corte de TtAgo se producen en el mismo tubo, pero están espacialmente separados mediante la regulación de la densidad con glicerol. Primero, evaluamos la fidelidad de la amplificación RECO para garantizar que no se introdujeran errores de amplificación. El secuenciamiento de Sanger confirmó la alta fidelidad de RECO en la preservación de la secuencia de la mutación diana (fig. S5). Luego, optimizamos la concentración de TtAgo para maximizar la intensidad de la señal (Fig. 2, G y H). En la Fig. 2G, monitoreamos la fluorescencia en tiempo real de la reacción RECO-Cas en un solo tubo utilizando una sola molécula de ADN guía, variando las concentraciones de TtAgo. Concentraciones más altas de TtAgo produjeron consistentemente señales de fluorescencia más fuertes (P < 0,001). En la Fig. 2H, para generar una secuencia de ADN analizable para el secuenciamiento de Sanger, utilizamos moléculas de ADN guía dobles que se dirigían a ambas hebras del alelo mutante, con la cantidad de enzima TtAgo duplicada en consecuencia. Los resultados fueron consistentes con los datos de fluorescencia, mostrando que casi todos los alelos mutantes fueron cortados. Además, el corte discriminatorio de la secuencia mutante no se vio afectado en el sistema de reacción en un solo tubo (Fig. 2I). Dado que el glicerol de alta viscosidad puede afectar potencialmente la amplificación RECO (^[32]), determinamos a continuación el efecto de la concentración de glicerol en la reacción RECO-Cas en un solo tubo. Como se muestra en la Fig. 2J, las lecturas de fluorescencia difirieron significativamente entre las condiciones (P < 0,001). Una capa de glicerol al 10% produjo la señal más fuerte, mientras que el 5% de glicerol no mejoró la fluorescencia y el 20% de glicerol inhibió sustancialmente la reacción RECO. La explicación más probable es que las soluciones de menor viscosidad permiten que los componentes de RECO se difundan rápidamente hacia la capa de TtAgo, inhibiendo parcialmente el corte. Coherente con esta hipótesis, el secuenciamiento de Sanger en la Fig. 2K confirmó la reducción de la actividad de TtAgo en las reacciones que contenían 5% de glicerol. En general, estas optimizaciones establecieron las condiciones óptimas para RECO-Cas, asegurando un rendimiento robusto en la detección de mutaciones en el ADN libre en plasma (cfDNA).

Caracterización del ensayo RECO-Cas

RECO-Cas logró una alta selectividad a través del reconocimiento específico de crRNA, activador y alelos mutantes cortados, lo que permitió un análisis confiable de las muestras de cfDNA con bajos niveles de fracción alélica mutante (VAF). Utilizando el protocolo optimizado, evaluamos el rendimiento analítico del ensayo en un rango de VAF. Detectamos el alelo mutante KRASG12D tanto en oligonucleótidos sintéticos como en estándares de referencia de cfDNA diluidos a un VAF tan bajo como 0,01% (Fig. 3A y figs. S6 y S7), lo que demuestra un rendimiento comparable al de la PCR digital y el secuenciamiento (^[17], ^[33]). RECO-Cas logró una sensibilidad a nivel de attomoles para KRASG12D sintético, con un rendimiento comparable a la PCR TaqMan (Fig. 3B). Dado que los dos ensayos utilizan diferentes fluoróforos y, por lo tanto, tienen distintos niveles de fondo, cuantificamos Δfluorescencia (punto final menos línea de base) como una lectura normalizada para permitir una comparación justa. Esta alta sensibilidad analítica permite la detección confiable de mutaciones raras en muestras de bajo volumen, como el cfDNA derivado del plasma.

Cabe destacar que RECO-Cas también demostró una excelente especificidad de secuencia, lo que permitió una clasificación precisa de las mutaciones puntuales de cambio de sentido. Dado que KRAS es uno de los controladores oncogénicos más estudiados en el cáncer, lo seleccionamos como un objetivo modelo para evaluar la especificidad de detección de RECO-Cas. Para evaluar su capacidad para discriminar entre secuencias que difieren en un solo nucleótido, diseñamos específicamente moléculas de ADN guía y crRNA para KRASWT y tres subtipos mutantes clínicamente relevantes, incluidos KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A (figs. S8 a S10). RECO-Cas produjo consistentemente altas relaciones señal-ruido, distinguiendo eficazmente las muestras diana de las muestras no diana, incluso a VAF tan bajos como el 1% con concentraciones diana de 50 nM (Fig. 3C). Para demostrar su versatilidad, también diseñamos y validamos moléculas de ADN guía que se dirigían a EGFRL858R y PIK3CAE545K, demostrando una excelente especificidad de corte (figs. S11 y S12). Aprovechando la tolerancia de Cas12a a los activadores de ssDNA cortos y la excepcional especificidad de crRNA, desarrollamos una plataforma RECO-Cas multiplexada que permite la identificación simultánea de diversos alelos mutantes. Para crear un ensayo RECO-Cas multiplexado, realizamos el corte de TtAgo en los tres alelos mutantes diana en un solo tubo y luego distribuimos la reacción en tres tubos separados para la posterior detección CRISPR. Cada alelo mutante estaba presente a una concentración de 50 nM (Fig. 3D y fig. S13). En conjunto, estos resultados resaltan el potencial de RECO-Cas para la detección y clasificación precisas de mutaciones SNV con alta sensibilidad y especificidad.

Detección temprana de múltiples cánceres

La biopsia líquida de cfDNA circulante ha surgido como un prometedor enfoque no invasivo para la detección temprana del cáncer en múltiples tipos de tumores; sin embargo, su utilidad clínica se ve limitada por los bajos niveles de ctDNA en las etapas iniciales de la enfermedad, la reducción de la sensibilidad en los tumores de baja excreción y los desafíos para distinguir las señales malignas de las benignas (^[6], ^[34]–^[36]). Por lo tanto, hipotetizamos que la alta sensibilidad de RECO-Cas podría permitir la detección temprana del cáncer a través de la biopsia líquida de cfDNA. Para probar esto, aplicamos RECO-Cas para detectar muestras de cfDNA de pacientes con cáncer con mutaciones puntuales de cambio de sentido confirmadas en KRAS/PIK3CA/EGFR (KRASG12D, KRASG12V KRASG12A, PIK3CAE545K y EGFRL858R; tabla S1) y de donantes sanos.

Primero, validamos el rendimiento de detección de RECO-Cas utilizando un estándar de referencia comercial de ctDNA de cáncer de pulmón no microcítico y un control negativo de tipo salvaje. Evaluamos tres conjuntos de cebadores que generaron amplicones de diferentes longitudes y encontramos que los amplicones de 94 pares de bases produjeron señales de fluorescencia más fuertes en el ensayo RECO-Cas (fig. S14), lo que es consistente con la distribución del tamaño de mononucleosomas de ~167 pares de bases del cfDNA plasmático, que favorece los objetivos más cortos (^[37]–^[40]). Monitoreamos las señales de fluorescencia resueltas en el tiempo (Δfluorescencia) tanto para el fragmento KRASG12D como para el fragmento KRASWT (fig. S15). RECO-Cas produjo consistentemente una fluorescencia más alta para el fragmento KRASG12D, con una relación variante/tipo salvaje de 0,14, en comparación con 0,05 en el control negativo. Estos datos muestran que el cfDNA del estándar de referencia produjo una señal RECO-Cas robusta para la detección de KRASG12D, lo que confirma la detección confiable de esta mutación de cambio de sentido.

Luego, aplicamos RECO-Cas para analizar el cfDNA extraído de muestras de plasma de pacientes con cáncer. Recolectamos y probamos muestras con mutaciones de cambio de sentido confirmadas en KRAS (KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A; n = 18). Como control, evaluamos muestras de cfDNA extraídas de donantes sanos (n = 10). Para establecer el umbral de negatividad de la relación para determinar si el ensayo identificó una muestra como positiva para una mutación KRAS, calculamos la relación variante/tipo salvaje en pacientes con cáncer con KRASWT (n = 10). Agrupamos los datos de las muestras de cfDNA sin mutaciones KRAS y de los donantes sanos en un gráfico de barras (fig. S16). Luego, establecimos el umbral para la negatividad de la mutación KRAS como la media + 3 × desviación estándar (DE) (umbral, 0,098). Al aplicar este umbral, clasificamos eficazmente las muestras según el estado de la mutación KRAS, identificando 16 de 18 muestras como positivas para la mutación KRAS (Fig. 4A) y resolviendo aún más los tipos específicos de mutación KRAS presentes en cada muestra (Fig. 4B). Además, validamos RECO-Cas en pacientes con cáncer que presentaban EGFRL858R y PIK3CAE545K (Fig. 4A). Por lo tanto, el ensayo RECO-Cas demostró una sensibilidad del 90,48% [intervalo de confianza (IC) del 95%: 69,62%, 98,83%] y una especificidad del 100% (IC del 95%: 69,15%, 100%) en muestras clínicas. El análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) mostró un alto rendimiento diagnóstico, con un área bajo la curva de 0,972 (Fig. 4C). En general, estos hallazgos resaltan el potencial de RECO-Cas para detectar tumores en etapas tempranas, enfermedad residual mínima y recurrencia, particularmente en casos con mutaciones conocidas.

Detección de SNV en cfDNA

Las mutaciones de KRAS se encuentran entre las alteraciones oncogénicas más comunes que se encuentran en varios cánceres, incluidos el colorrectal (^[41]), el de pulmón (^[42]) y el de páncreas (^[43]). Las mutaciones de KRAS promueven el crecimiento tumoral al activar vías de señalización clave, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (^[44]) y la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (^[45]). La identificación de las mutaciones de KRAS es esencial para guiar el tratamiento, ya que los cánceres con mutaciones en KRAS a menudo son resistentes a las terapias dirigidas a EGFR (^[46]). Con el auge de las terapias dirigidas y los ensayos clínicos, la identificación de las mutaciones de KRAS mediante la genotipificación es esencial para la atención personalizada del cáncer. RECO-Cas ofrece un enfoque mínimamente invasivo, accesible y preciso para la simplificación del perfilado de KRAS. Para determinar la viabilidad de la detección de SNV, aplicamos RECO-Cas para analizar las mutaciones de KRAS, centrándonos en las sustituciones de nucleótidos en la posición c.35 que dan lugar a diferentes variantes de cambio de sentido (KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A) a través de diferentes cambios de base.

Primero, validamos el ADN guía y el crRNA para RECO-Cas KRAS con nucleótidos sintéticos (Fig. 3C y fig. S17). Luego, aplicamos RECO-Cas a un estudio clínico según lo indicado en la Fig. 4D. Recolectamos muestras de plasma de pacientes con cáncer y extrajimos el cfDNA utilizando un método de columna de centrifugación. El cfDNA extraído se sometió luego al ensayo RECO-Cas utilizando cuatro pares de ADN guía y crRNA que se dirigían a KRASWT, KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A. La Fig. 4 (E y F) muestra la identificación de variantes de cambio de sentido KRAS en el estándar de referencia de ctDNA utilizando el ensayo RECO-Cas. Las relaciones variante/tipo salvaje para KRASG12D y KRASG12V fueron 0,264 y 0,124, respectivamente, ambas superiores al umbral de detección. Estos resultados confirmaron la detección exitosa de las mutaciones KRASG12D y KRASG12V, lo que es consistente con los tipos de mutación documentados en el manual del estándar de referencia. En contraste, los ensayos que utilizaban ADN guía + crRNA que se dirigía a KRASG12A o ADN no guía + crRNA KRASWT produjeron relaciones variante/tipo salvaje por debajo del umbral, lo que es consistente con el estado negativo para KRASG12A del material de referencia. Estas observaciones respaldan la razón de ser de la evaluación de las variantes de cambio de sentido de KRAS utilizando el perfilado RECO-Cas.

Hemos validado adicionalmente la clasificación de variantes puntuales en tumores en 18 pacientes con cáncer con mutaciones de KRAS (KRASG12D, n = 9; KRASG12V, n = 5; KRASG12A, n = 4) utilizando RECO-Cas. Las muestras de cfDNA se sometieron a análisis RECO-Cas con cuatro pares de ADN guía y crRNAs, cada uno dirigido a una variante puntual específica de KRAS así como a la secuencia de tipo salvaje. La figura 4G muestra el rendimiento de RECO-Cas en la clasificación de variantes puntuales de KRAS. En el grupo de tratamiento con ADN guía y crRNA KRASG12D, ocho de los nueve pacientes confirmados con KRASG12D fueron diagnosticados correctamente, con uno dando falso negativo pero sin clasificaciones erróneas de otros grupos de mutación. Para el tratamiento con ADN guía y crRNA KRASG12V, cuatro de los cinco pacientes con KRASG12V fueron identificados correctamente, mientras que uno fue diagnosticado erróneamente; además, un paciente mostró una relación variante/tipo salvaje por encima del umbral tanto para KRASG12D como para KRASG12V, lo que resultó en señales dualmente positivas. Todos los pacientes con mutaciones KRASG12A fueron clasificados con precisión, y ningún paciente con KRASG12D o KRASG12V fue clasificado erróneamente como KRASG12A. Los resultados de varios casos resaltan el valor del perfilado de mutaciones de cfDNA para el diagnóstico del cáncer y la guía de las decisiones terapéuticas clínicas. Por ejemplo, una mujer de 65 años diagnosticada con cáncer colorrectal mostró señales dualmente positivas de KRASG12D y KRASG12V mediante RECO-Cas (fig. S18), lo que es consistente con un informe de caso que describe la coexistencia de subclones que portan KRASG12D y KRASG12V dentro del mismo tumor (^[47]), lo que indica heterogeneidad intratumoral. La clasificación de variantes puntuales utilizando RECO-Cas en pacientes con cáncer podría guiar la terapia dirigida, por ejemplo, identificando candidatos para inhibidores de KRASG12D como MRTX113 (^[48], ^[49]), actualmente en ensayos clínicos de fase 1/2 (NCT05737706) (^[50]), ahorrando así a los pacientes de tratamientos ineficaces como cetuximab o panitumumab (^[51]) y apoyando la selección de regímenes alternativos o combinados después de la cirugía. Además, estos resultados de detección de SNV resaltan el potencial del ensayo RECO-Cas para desarrollar una métrica pronóstica basada en cfDNA para guiar la selección del tratamiento, la inclusión en ensayos clínicos, la selección de fármacos y la duración de la terapia adyuvante.

Integración del ensayo RECO-Cas en una plataforma de diagnóstico POC de bajo consumo

Debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo (tabla S2), RECO-Cas es altamente adecuado para aplicaciones POC con instrumentación mínima en entornos con recursos limitados mediante la integración con una plataforma de diagnóstico simple y compacta. Para demostrar su viabilidad en tales entornos, diseñamos y desarrollamos una plataforma de diagnóstico compacta, impresa en 3D, integrada con un teléfono inteligente con tecnología de inteligencia artificial (fig. 5A). La plataforma integra un calentador en miniatura para la incubación y un diodo emisor de luz (LED) con filtros de fluorescencia para la detección de señales. Para permitir un funcionamiento cómodo y continuo, la plataforma de diagnóstico POC se puede cargar de forma inalámbrica. Para eliminar la necesidad de equipos de detección óptica costosos, programamos un teléfono inteligente con una aplicación con tecnología de inteligencia artificial para la grabación de fluorescencia, el procesamiento de imágenes y la detección cuantitativa de fluorescencia (fig. 5A). Para mejorar la señal de fluorescencia y minimizar el ruido de fondo manteniendo un diseño de plataforma compacta, colocamos el filtro de excitación debajo de los tubos de reacción y capturamos imágenes de fluorescencia desde un lado a través de un filtro de emisión (fig. 5B). La aplicación de teléfono inteligente con tecnología de inteligencia artificial utiliza un algoritmo que identifica la región de interés (ROI) trazando el contorno de cada tubo de tira de PCR, minimizando así la interferencia de fondo. Para mejorar aún más la especificidad de la señal, la aplicación refina la ROI para excluir las regiones periféricas con intensidades medias de píxeles indistinguibles del ruido de fondo. Las ROI finalizadas se digitalizan luego para el análisis cuantitativo de fluorescencia (fig. 5C). Luego, evaluamos la plataforma POC basada en teléfonos inteligentes para su límite de detección (LoD) utilizando reacciones RECO-Cas. Registramos las señales de fluorescencia en diluciones seriadas de secuencias sintéticas de KRASG12D, con la cuantificación de la señal correspondiente que se muestra en la fig. 5D. Para cada muestra clínica, medimos dos señales de fluorescencia utilizando la plataforma: una correspondiente al alelo de tipo salvaje y la otra a la secuencia variante. Aplicamos la relación de fluorescencia variante a tipo salvaje para determinar el estado del paciente como sano o diagnosticado con cáncer. Utilizando este protocolo, analizamos una serie de diluciones de KRASG12D en un fondo de KRASWT y observamos un amplio rango de detección no lineal de 0,01 a 100% de KRASG12D, lo que muestra un buen rendimiento de la plataforma prototipo para la detección de nucleótidos mutantes. En particular, detectamos diferencias significativas entre los grupos de 0,01 y 0%, incluso cuando las señales de fluorescencia no eran visualmente discernibles en las imágenes capturadas (fig. 5E).

Como prueba de concepto para aplicaciones clínicas, primero evaluamos la plataforma POC para detectar mutaciones de KRAS en cfDNA extraído de muestras de plasma de tres donantes sanos y nueve pacientes con cáncer con mutaciones puntuales de KRAS (KRASG12D, n = 3; KRASG12V, n = 3; KRASG12A, n = 3). Probamos muestras de cfDNA de donantes sanos utilizando ADN guía y crRNA KRASWT y KRASG12D, y tratamos el cfDNA de pacientes con cáncer con ADN guía y crRNA que coinciden con la mutación dirigidos a sus respectivas variantes de KRAS. Como se muestra en la fig. 5 (F y G), la plataforma detectó con éxito las mutaciones en las imágenes capturadas y distinguió a los pacientes con cáncer de los donantes sanos, lo que es consistente con los resultados del diagnóstico obtenidos de los ensayos RECO-Cas realizados en una máquina de PCR cuantitativa (qPCR). Además de detectar mutaciones conocidas, validamos aún más la capacidad de la plataforma para clasificar mutaciones puntuales. Tratamos un estándar de referencia de ctDNA con cuatro pares de ADN guía y crRNA, y las imágenes de fluorescencia resultantes (fig. S19) confirmaron la clasificación precisa de los nucleótidos mutantes por la plataforma de diagnóstico, lo que es consistente con los resultados obtenidos del análisis de la máquina qPCR. Para evaluar la aplicabilidad clínica, aplicamos la plataforma para detectar muestras de cfDNA extraídas de donantes sanos y pacientes con cáncer con mutaciones de KRAS conocidas. La plataforma de diagnóstico compacta clasificó con éxito a todos los pacientes con cáncer (fig. 5, H e I, y fig. S20), lo que demuestra una discriminación de mutaciones confiable en un contexto clínico. En resumen, este estudio de prueba de concepto demuestra el potencial de la plataforma de diagnóstico POC compacta como una solución simple, de bajo costo y escalable para desarrollar herramientas de diagnóstico molecular de última generación para el cáncer, particularmente en entornos de atención médica con recursos limitados o descentralizados.

Flujo de trabajo general de RECO-Cas

El ensayo RECO-Cas combina la amplificación isotérmica de cfDNA, la escisión específica de la secuencia de TtAgo y la detección de amplificación de señal habilitada por CRISPR-Cas12a. Consiste principalmente en dos pasos: (a) una reacción RPA-TtAgo en un solo recipiente, en la que un sistema de reacción multifásico acopla la amplificación de RPA con la escisión de TtAgo para permitir el corte selectivo de amplicones de cfDNA mutantes mientras se dejan intactos los amplicones de tipo salvaje [fig. 1A (a)], y (b) detección CRISPR específica de mutantes utilizando un constructo de ADN recombinado de ADN mutante cortado y ssDNA artificial (denominado "activador de ssDNA"). En presencia de cfDNA mutante, el complejo Cas12a-crRNA reconoce el constructo de ADN recombinado, lo que induce la activación conformacional de Cas12a y la posterior escisión trans, amplificando así la señal de fluorescencia de cfDNA mutante. Por el contrario, incluso en presencia de activadores de ssDNA, el ADN de tipo salvaje intacto permanece de doble cadena y no se desenrolla para el reconocimiento de crRNA, lo que impide la activación de Cas12a y la posterior escisión del reportero [fig. 1A (ii)]. Si bien los pasos preanalíticos, como la separación de plasma y la extracción de ADN, requieren una instrumentación de laboratorio mínima, simplificamos el flujo de trabajo de detección de SNV para que el análisis de cfDNA sea más compatible con la detección temprana del cáncer en el punto de atención (POC) (fig. 1B). Para eliminar la necesidad de equipos de instrumentación costosos, integramos el ensayo en una plataforma de diagnóstico compacta y de bajo consumo, donde las señales de fluorescencia se detectan utilizando un teléfono inteligente con tecnología de inteligencia artificial, lo que permite el diagnóstico en el punto de atención en entornos con recursos limitados.

El ensayo RECO-Cas ofrece ventajas técnicas clave para la detección de SNV. En primer lugar, proporciona una detección de mutaciones altamente específica al aprovechar la actividad de escisión altamente selectiva del complejo TtAgo-ADN guía (^[30]). Al introducir estratégicamente una sola desadaptación de base dentro del ADN guía, permitimos que TtAgo distinga y corte los mutantes de ADN con una resolución de un solo nucleótido, incluso dentro de un complejo fondo de secuencias de tipo salvaje o no relacionadas. Esta estrategia introduce selectivamente cortes en el ADN mutante. Además, la fosforilación en el extremo 3' del ADN guía mejora aún más la especificidad de la escisión e inhibe la extensión del ADN por la ADN polimerasa en la solución de reacción de RPA. En segundo lugar, RECO-Cas logra una alta sensibilidad de detección [bajo límite de detección (LoD)] con un mínimo de fondo a través de dos mecanismos clave: (i) la ausencia de un corte hace que el ADN de tipo salvaje conserve su estructura de doble cadena, evitando el desenrollamiento espontáneo de la región de reconocimiento de crRNA y, por lo tanto, bloqueando la unión de crRNA y la activación posterior, y (ii) Cas12a tolera activadores de ssDNA cortos, y su actividad de escisión trans no se activa (^[31]). Solo en presencia de ADN mutante cortado, el activador de ssDNA puede formar una estructura de ADN recombinado y unirse específicamente al complejo Cas12a-crRNA, lo que desencadena la actividad de la DNasa de Cas12a para la amplificación de la señal de fluorescencia. Debido a estas características únicas, RECO-Cas es capaz de perfilar con precisión múltiples mutaciones del cáncer al tiempo que logra una detección de SNV altamente precisa.

Validación y optimización del ensayo RECO-Cas

El ensayo RECO-Cas utiliza ADN mutante de TtAgo recombinado cortado junto con un activador de ssDNA para activar específicamente CRISPR-Cas12a para la detección de mutaciones de cfDNA. Para evaluar la base del diseño, primero probamos nucleótidos sintéticos correspondientes a KRASG12D y KRAS de tipo salvaje (KRASWT). Cuando se utilizó ssDNA como entrada, RECO-Cas no pudo discriminar entre los alelos mutante y de tipo salvaje, ya que las señales de fluorescencia al final del proceso no mostraron una diferencia sustancial (fig. S1). Por el contrario, el ADN de doble cadena logró una detección específica de alelos del mutante. Mecánicamente, RECO-Cas se basa en el desenrollamiento espontáneo del alelo mutante en la región de reconocimiento de crRNA cerca del corte, lo que facilita la hibridación de crRNA. Hipotetizamos además que el uso de dos ADN guía que se dirigen a ambas hebras de la secuencia mutante podría mejorar el rendimiento del ensayo. Para probar esto, introdujimos un ADN guía adicional dirigido a la hebra antisentido del alelo mutante para el corte selectivo. En comparación con la configuración de un solo ADN guía, las señales de fluorescencia aumentaron; sin embargo, el ensayo no pudo distinguir el alelo mutante (fig. 2, A a E). Una explicación probable es que el ADN guía dirigido a la hebra antisentido formó un complejo cuaternario con el activador y Cas12a-crRNA, lo que interrumpió el reconocimiento específico. A continuación, comparamos y optimizamos las concentraciones de los reporteros de ssDNA de fluorescencia y los activadores. Descubrimos que el uso de una concentración más alta de reporteros y una concentración más baja de activadores produjo la señal de fluorescencia más fuerte, caracterizada por un aumento con el tiempo (fig. S2 y S3). Evaluamos aún más el ensayo optimizado controlando sistemáticamente la composición de la reacción (fig. S4). Observamos la señal analítica más alta solo cuando estaban presentes todos los componentes (ADN objetivo cortado, Cas12a, crRNA y activador), mientras que la omisión de cualquier componente único abolió la señal, lo que confirmó la especificidad del ensayo.

Después de validar el diseño del ensayo, procedimos a optimizar la reacción de RPA-TtAgo en un solo tubo (Fig. 2F), en la que la amplificación de RPA y el corte de TtAgo se producen en el mismo tubo, pero están espacialmente separados mediante la regulación de la densidad con glicerol. Primero, evaluamos la fidelidad de la amplificación de RPA para garantizar que no se introdujeran errores de amplificación. La secuenciación de Sanger confirmó la alta fidelidad de RPA en la preservación de la secuencia de la mutación diana (fig. S5). Luego, optimizamos la concentración de TtAgo para maximizar la intensidad de la señal (Fig. 2, G y H). En la Fig. 2G, monitoreamos la fluorescencia en tiempo real de la reacción de RPA-TtAgo en un solo tubo utilizando una sola molécula de ADN guía, variando las concentraciones de TtAgo. Concentraciones más altas de TtAgo produjeron consistentemente señales de fluorescencia más fuertes (P < 0,001). En la Fig. 2H, para generar una secuencia de ADN analizable para la secuenciación de Sanger, utilizamos moléculas de ADN guía dobles que se dirigían a ambas hebras del alelo mutante, con la cantidad de enzima TtAgo duplicada en consecuencia. Los resultados fueron consistentes con los datos de fluorescencia, lo que demostró que casi todos los alelos mutantes fueron cortados. Además, el corte discriminatorio de la secuencia mutante no se vio afectado en el sistema de reacción en un solo tubo (Fig. 2I). Dado que el glicerol de alta viscosidad puede afectar potencialmente la amplificación de RPA (^[32]), determinamos a continuación el efecto de la concentración de glicerol en la reacción de RPA-TtAgo en un solo tubo. Como se muestra en la Fig. 2J, las lecturas de fluorescencia difirieron significativamente entre las condiciones (P < 0,001). Una capa de glicerol al 10% produjo la señal más fuerte, mientras que el 5% de glicerol no mejoró la fluorescencia y el 20% de glicerol inhibió sustancialmente la reacción de RPA. La explicación más probable es que las soluciones de menor viscosidad permiten que los componentes de RPA se difundan rápidamente hacia la capa de TtAgo, inhibiendo parcialmente el corte. Coherente con esta hipótesis, la secuenciación de Sanger en la Fig. 2K confirmó la reducción de la actividad de TtAgo en las reacciones que contenían 5% de glicerol. En general, estas optimizaciones establecieron las condiciones óptimas para RECO-Cas, lo que garantiza un rendimiento sólido en la detección de mutaciones de ADNcf.

Caracterización del ensayo RECO-Cas

RECO-Cas logró una alta selectividad a través del reconocimiento específico de crRNA, activador y alelos mutantes cortados, lo que permitió un análisis confiable de las muestras de ADNcf con bajos niveles de VAF. Utilizando el protocolo optimizado, evaluamos el rendimiento analítico del ensayo en un rango de VAF. Detectamos el alelo mutante KRASG12D tanto en oligonucleótidos sintéticos como en estándares de referencia de ADNcf diluidos a un VAF tan bajo como 0,01% (Fig. 3A y figs. S6 y S7), lo que demuestra un rendimiento comparable al de la PCR digital y la secuenciación (^[17], ^[33]). RECO-Cas logró una sensibilidad a nivel de attomoles para KRASG12D sintético con un rendimiento comparable a la PCR de TaqMan (Fig. 3B). Dado que los dos ensayos utilizan diferentes fluoróforos y, por lo tanto, tienen distintos niveles de fondo, cuantificamos Δfluorescencia (punto final menos línea de base) como una lectura normalizada para permitir una comparación justa. Esta alta sensibilidad analítica permite la detección confiable de mutaciones raras en muestras de bajo volumen, como el ADNcf derivado del plasma.

Cabe destacar que RECO-Cas también demostró una excelente especificidad de secuencia, lo que permitió una clasificación precisa de las mutaciones puntuales de cambio de sentido. Dado que KRAS es uno de los controladores oncogénicos más estudiados en el cáncer, lo seleccionamos como un objetivo modelo para evaluar la especificidad de detección de RECO-Cas. Para evaluar su capacidad para discriminar entre secuencias que difieren en un solo nucleótido, diseñamos específicamente moléculas de ADN guía y crRNA para KRASWT y tres subtipos mutantes clínicamente relevantes, incluidos KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A (figs. S8 a S10). RECO-Cas produjo consistentemente altas relaciones señal-ruido, distinguiendo eficazmente las muestras objetivo de las muestras fuera del objetivo, incluso a VAF tan bajos como el 1% con concentraciones objetivo de 50 nM (Fig. 3C). Para demostrar su versatilidad, también diseñamos y validamos moléculas de ADN guía que se dirigían a EGFRL858R y PIK3CAE545K, lo que demostró una excelente especificidad de corte (figs. S11 y S12). Aprovechando la tolerancia de Cas12a a los activadores de ADNss cortos y la excepcional especificidad de crRNA, desarrollamos una plataforma RECO-Cas multiplexada que permite la identificación simultánea de diversos alelos mutantes. Para crear un ensayo RECO-Cas multiplexado, realizamos el corte de TtAgo en los tres alelos mutantes objetivo en un solo tubo y luego distribuimos la reacción en tres tubos separados para la posterior detección de CRISPR. Cada alelo mutante estaba presente a una concentración de 50 nM (Fig. 3D y fig. S13). En conjunto, estos resultados resaltan el potencial de RECO-Cas para la detección y clasificación precisas de mutaciones SNV con alta sensibilidad y especificidad.

Detección temprana en múltiples tipos de cáncer

La biopsia líquida de ADNcf circulante ha surgido como un prometedor enfoque no invasivo para la detección temprana del cáncer en múltiples tipos de tumores; sin embargo, su utilidad clínica se ve limitada por los bajos niveles de ctDNA en las etapas iniciales de la enfermedad, la reducción de la sensibilidad en los tumores de baja excreción y los desafíos para distinguir las señales malignas de las benignas (^[6], ^[34]–^[36]). Por lo tanto, hipotetizamos que la alta sensibilidad de RECO-Cas podría permitir la detección temprana del cáncer a través de la biopsia líquida de ADNcf. Para probar esto, aplicamos RECO-Cas para detectar muestras de ADNcf de pacientes con cáncer con mutaciones puntuales de cambio de sentido confirmadas de KRAS/PIK3CA/EGFR (KRASG12D, KRASG12V KRASG12A, PIK3CAE545K y EGFRL858R; tabla S1) y de donantes sanos.

Primero, validamos el rendimiento de detección de RECO-Cas utilizando un estándar de referencia comercial de ctDNA de cáncer de pulmón no microcítico y un control negativo de tipo salvaje. Evaluamos tres conjuntos de cebadores que generaron amplicones de diferentes longitudes y descubrimos que los amplicones de 94 pares de bases produjeron señales de fluorescencia más fuertes en el ensayo RECO-Cas (fig. S14), lo que es consistente con la distribución del tamaño de mononucleosomas de aproximadamente 167 pares de bases del ADNcf plasmático, que favorece los objetivos más cortos (^[37]–^[40]). Monitoreamos las señales de fluorescencia resueltas en el tiempo (Δfluorescencia) tanto para el fragmento KRASG12D como para el fragmento KRASWT (fig. S15). RECO-Cas produjo consistentemente una fluorescencia más alta para el fragmento KRASG12D, con una relación variante/tipo salvaje de 0,14, en comparación con 0,05 en el control negativo. Estos datos muestran que el ADNcf del estándar de referencia produjo una señal RECO-Cas robusta para la detección de KRASG12D, lo que confirma la detección confiable de esta mutación de cambio de sentido.

Luego, aplicamos RECO-Cas para analizar el ADNcf extraído de muestras de plasma de pacientes con cáncer. Recolectamos y probamos muestras con mutaciones de cambio de sentido confirmadas de KRAS (KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A; n = 18). Como control, evaluamos muestras de ADNcf extraídas de donantes sanos (n = 10). Para establecer el umbral de negatividad de la relación para determinar si el ensayo identificaba una muestra como positiva para una mutación de KRAS, calculamos la relación variante/tipo salvaje en pacientes con cáncer con KRASWT (n = 10). Agrupamos los datos de las muestras de ADNcf sin mutaciones de KRAS y de los donantes sanos en un gráfico de barras (fig. S16). Luego, establecimos el umbral para la negatividad de la mutación de KRAS como la media + 3 × desviación estándar (DE) (umbral, 0,098). Al aplicar este umbral, clasificamos eficazmente las muestras por estado de mutación de KRAS, identificando 16 de 18 muestras como positivas para la mutación de KRAS (Fig. 4A) y resolviendo aún más los tipos específicos de mutación de KRAS presentes en cada muestra (Fig. 4B). Además, validamos RECO-Cas en pacientes con cáncer que presentaban EGFRL858R y PIK3CAE545K (Fig. 4A). Por lo tanto, el ensayo RECO-Cas demostró una sensibilidad del 90,48% [intervalo de confianza (IC) del 95%: 69,62%, 98,83%] y una especificidad del 100% (IC del 95%: 69,15%, 100%) en muestras clínicas. El análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) mostró un alto rendimiento diagnóstico, con un área bajo la curva de 0,972 (Fig. 4C). En general, estos hallazgos resaltan el potencial de RECO-Cas para detectar tumores en etapas tempranas, enfermedad residual mínima y recurrencia, particularmente en casos con mutaciones conocidas.

Detección de SNV de ADNcf

Las mutaciones de KRAS se encuentran entre las alteraciones oncogénicas más comunes que se encuentran en varios cánceres, incluidos el colorrectal (^[41]), el de pulmón (^[42]) y el de páncreas (^[43]). Las mutaciones de KRAS promueven el crecimiento tumoral al activar vías de señalización clave, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (^[44]) y la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (^[45]). La identificación de las mutaciones de KRAS es esencial para guiar el tratamiento, ya que los cánceres con mutaciones de KRAS a menudo son resistentes a las terapias dirigidas a EGFR (^[46]). Con el auge de las terapias dirigidas y los ensayos clínicos, la identificación de las mutaciones de KRAS mediante la genotipificación es esencial para la atención personalizada del cáncer. RECO-Cas ofrece un enfoque mínimamente invasivo, accesible y preciso para la simplificación del perfilado de KRAS. Para determinar la viabilidad de la detección de SNV, aplicamos RECO-Cas para analizar las mutaciones de KRAS, centrándonos en las sustituciones de nucleótidos en la posición c.35 que dan lugar a diferentes variantes de cambio de sentido (KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A) a través de diferentes cambios de base.

Primero, validamos el ADN guía y el crRNA para RECO-Cas de KRAS con nucleótidos sintéticos (Fig. 3C y fig. S17). Luego, aplicamos RECO-Cas a un estudio clínico como se describe en la Fig. 4D. Recolectamos muestras de plasma de pacientes con cáncer y extrajimos el ADNcf utilizando un método de columna de centrifugación. El ADNcf extraído se sometió luego al ensayo RECO-Cas utilizando cuatro pares de ADN guía y crRNA que se dirigían a KRASWT, KRASG12D, KRASG12V y KRASG12A. La Fig. 4 (E y F) muestra la identificación de variantes de cambio de sentido de KRAS en el estándar de referencia de ctDNA utilizando el ensayo RECO-Cas. Las relaciones variante/tipo salvaje para KRASG12D y KRASG12V fueron 0,264 y 0,124, respectivamente, ambas superiores al umbral de detección. Estos resultados confirmaron la detección exitosa de las mutaciones KRASG12D y KRASG12V, lo que es consistente con los tipos de mutación documentados en el manual del estándar de referencia. En contraste, los ensayos que utilizaban ADN guía + crRNA que se dirigía a KRASG12A o ADN no guía + crRNA KRASWT produjeron relaciones variante/tipo salvaje por debajo del umbral, lo que es consistente con el estado negativo de KRASG12A del material de referencia. Estas observaciones respaldan la razón de ser de la evaluación de las variantes de cambio de sentido de KRAS utilizando el perfilado de RECO-Cas.

Hemos validado adicionalmente la clasificación de variantes puntuales tumorales en 18 pacientes con cáncer que presentan mutaciones en el gen KRAS (KRASG12D, n = 9; KRASG12V, n = 5; KRASG12A, n = 4) utilizando RECO-Cas. Las muestras de cfDNA se sometieron a análisis RECO-Cas con cuatro pares de ADN guía y crARN, cada uno dirigido a una variante puntual específica de KRAS así como a la secuencia de tipo salvaje. La figura 4G muestra el rendimiento de RECO-Cas en la clasificación de variantes puntuales de KRAS. En el grupo de tratamiento con ADN guía y crARN KRASG12D, ocho de los nueve pacientes confirmados con KRASG12D fueron diagnosticados correctamente, con uno dando un resultado falso negativo, pero sin clasificaciones erróneas de otros grupos de mutaciones. Para el tratamiento con ADN guía y crARN KRASG12V, cuatro de los cinco pacientes con KRASG12V fueron identificados correctamente, mientras que uno fue diagnosticado erróneamente; además, un paciente mostró una relación variante/tipo salvaje por encima del umbral tanto para KRASG12D como para KRASG12V, lo que resultó en señales dualmente positivas. Todos los pacientes con mutaciones KRASG12A fueron clasificados con precisión, y ningún paciente con KRASG12D o KRASG12V fue clasificado erróneamente como KRASG12A. Los resultados de varios casos resaltan el valor del perfilado de mutaciones de cfDNA para el diagnóstico del cáncer y para guiar las decisiones de terapia clínica. Por ejemplo, una mujer de 65 años diagnosticada con cáncer colorrectal mostró señales dualmente positivas de KRASG12D y KRASG12V mediante RECO-Cas (fig. S18), lo que coincide con un informe de caso que describe la coexistencia de subclones que portan KRASG12D y KRASG12V dentro del mismo tumor (^[47]), lo que indica heterogeneidad intratumoral. La clasificación de variantes puntuales utilizando RECO-Cas en pacientes con cáncer podría guiar la terapia dirigida, por ejemplo, identificando candidatos para inhibidores de KRASG12D como MRTX113 (^[48], ^[49]), que se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase 1/2 (NCT05737706) (^[50]), ahorrando así a los pacientes de tratamientos ineficaces como cetuximab o panitumumab (^[51]) y apoyando la selección de regímenes alternativos o combinados después de la cirugía. Además, estos resultados de detección de SNV resaltan el potencial del ensayo RECO-Cas para desarrollar una métrica pronóstica basada en cfDNA para guiar la selección del tratamiento, la inclusión en ensayos clínicos, la selección de fármacos y la duración de la terapia adyuvante.

Integración del ensayo RECO-Cas en una plataforma de diagnóstico POC de bajo consumo alimentada de forma inalámbrica

Debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo (tabla S2), RECO-Cas es altamente adecuado para aplicaciones POC mínimamente instrumentadas en entornos con recursos limitados mediante la integración con una plataforma de diagnóstico simple y compacta. Para demostrar su viabilidad en tales entornos, diseñamos y desarrollamos una plataforma de diagnóstico compacta e impresa en 3D integrada con un teléfono inteligente con tecnología de inteligencia artificial (fig. 5A). La plataforma integra un calentador en miniatura para la incubación y un diodo emisor de luz (LED) con filtros de fluorescencia para la detección de señales. Para permitir un funcionamiento cómodo y continuo, la plataforma de diagnóstico POC se puede cargar de forma inalámbrica. Para eliminar la necesidad de equipos de detección óptica costosos, programamos un teléfono inteligente con una aplicación con tecnología de inteligencia artificial para la grabación de fluorescencia, el procesamiento de imágenes y la detección cuantitativa de fluorescencia (fig. 5A). Para mejorar la señal de fluorescencia y minimizar el ruido de fondo manteniendo un diseño de plataforma compacta, colocamos el filtro de excitación debajo de los tubos de reacción y capturamos imágenes de fluorescencia desde un lado a través de un filtro de emisión (fig. 5B). La aplicación de teléfono inteligente con tecnología de inteligencia artificial utiliza un algoritmo que identifica la región de interés (ROI) trazando el contorno de cada tubo de tira de PCR, minimizando así la interferencia de fondo. Para mejorar aún más la especificidad de la señal, la aplicación refina la ROI para excluir las regiones periféricas con intensidades medias de píxeles indistinguibles del ruido de fondo. Las ROI finalizadas se digitalizan luego para el análisis cuantitativo de fluorescencia (fig. 5C). Luego, evaluamos la plataforma POC basada en teléfonos inteligentes para su límite de detección (LoD) utilizando reacciones RECO-Cas. Registramos las señales de fluorescencia en diluciones seriadas de secuencias sintéticas de KRASG12D, con la cuantificación de la señal correspondiente que se muestra en la fig. 5D. Para cada muestra clínica, medimos dos señales de fluorescencia utilizando la plataforma: una correspondiente al alelo de tipo salvaje y la otra a la secuencia variante. Aplicamos la relación de fluorescencia variante a tipo salvaje para determinar el estado del paciente como sano o diagnosticado con cáncer. Utilizando este protocolo, analizamos una serie de diluciones de KRASG12D en un fondo de KRASWT y observamos un amplio rango de detección no lineal del 0,01% al 100% de KRASG12D, lo que demuestra un buen rendimiento de la plataforma prototipo para la detección de nucleótidos mutantes. En particular, detectamos diferencias significativas entre los grupos del 0,01% y 0%, incluso cuando las señales de fluorescencia no eran visualmente discernibles en las imágenes capturadas (fig. 5E).

Como prueba de concepto para aplicaciones clínicas, primero evaluamos la plataforma POC para detectar mutaciones de KRAS en cfDNA extraído de muestras de plasma de tres donantes sanos y nueve pacientes con cáncer que presentan mutaciones puntuales de un solo nucleótido en el gen KRAS (KRASG12D, n = 3; KRASG12V, n = 3; KRASG12A, n = 3). Probamos muestras de cfDNA de donantes sanos utilizando ADN guía y crARN KRASWT y KRASG12D, y tratamos el cfDNA de los pacientes con cáncer con ADN guía y crARN que coinciden con la mutación, dirigidos a sus respectivas variantes de KRAS. Como se muestra en la fig. 5 (F y G), la plataforma detectó con éxito las mutaciones en las imágenes capturadas y distinguió a los pacientes con cáncer de los donantes sanos, lo que coincide con los resultados del diagnóstico obtenidos de los ensayos RECO-Cas realizados en una máquina de PCR cuantitativa (qPCR). Además de detectar mutaciones conocidas, validamos aún más la capacidad de la plataforma para clasificar mutaciones puntuales de un solo nucleótido. Tratamos un estándar de referencia de ctDNA con cuatro pares de ADN guía y crARN, y las imágenes de fluorescencia resultantes (fig. S19) confirmaron la clasificación precisa de los nucleótidos mutantes por parte de la plataforma de diagnóstico, lo que coincide con los resultados obtenidos del análisis de la máquina qPCR. Para evaluar la aplicabilidad clínica, aplicamos la plataforma para detectar muestras de cfDNA extraídas de donantes sanos y pacientes con cáncer que presentan mutaciones KRAS conocidas. La plataforma de diagnóstico compacta clasificó con éxito a todos los pacientes con cáncer (fig. 5, H e I, y fig. S20), lo que demuestra una discriminación de mutaciones confiable en un contexto clínico. En resumen, este estudio de prueba de concepto demuestra el potencial de la plataforma de diagnóstico POC compacta como una solución simple, de bajo costo y escalable para desarrollar herramientas de diagnóstico molecular de última generación para el cáncer, particularmente en entornos de atención médica con recursos limitados o descentralizados.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados indican el potencial de la plataforma de diagnóstico RECO-Cas como una plataforma fácil de usar y altamente específica para detectar SNV asociadas con el cáncer de cfDNA en biopsias líquidas, superando las limitaciones de la tolerancia a la falta de coincidencia en Cas12a y la falta de amplificación de la señal en los sistemas basados en TtAgo. Evaluamos el rendimiento clínico de RECO-Cas utilizando muestras de plasma de pacientes con cáncer y donantes sanos. La plataforma detectó con éxito alelos mutantes al 0,01% de VAF, lo que demuestra capacidades de detección ultrasensibles. En un estudio de prueba de concepto que involucró 21 muestras de pacientes con cáncer y 10 donantes sanos, RECO-Cas detectó cfDNA mutante en 19 muestras y logró una sensibilidad clínica del 90,48% (IC del 95%: 69,62 al 98,83%) y una especificidad del 100% (IC del 95%: 69,15 al 100%). En particular, validamos el rendimiento de RECO-Cas en la discriminación de mutaciones puntuales de un solo nucleótido en el locus KRAS utilizando 18 muestras de plasma clínicas. Entre estas, 16 muestras fueron clasificadas con precisión según su estado de mutación conocido. Una muestra fue identificada como dualmente positiva para KRASG12D y KRASG12V.

Los enfoques anteriores han aplicado la amplificación de señales basada en Cas12a o la discriminación de mutaciones mediada por Argonaute, pero cada uno por sí solo sufre de limitaciones clave: tolerancia a la falta de coincidencia y falta de amplificación de la señal (^[26], ^[27], ^[29], ^[30], ^[52]). La mayoría de estos métodos requieren un paso de degradación del ADN separado o implican procedimientos adicionales para identificar la secuencia mutante, lo que limita su aplicabilidad en entornos con recursos limitados. Por ejemplo, el ensayo NAVIGATER logra una detección ultrasensible de alelos mutantes (~1 copia) para el diagnóstico del cáncer, pero se basa en dos pasos distintos, la amplificación de cfDNA y la degradación de la secuencia de tipo salvaje, y requiere PCR de ácidos nucleicos exógenos para la identificación de mutaciones, lo que limita su practicidad para entornos clínicos (^[30]). Un sistema de PCR de un solo tubo integrado con Argonaute permite la detección ultrasensible de mutaciones raras al combinar la preamplificación y la degradación de la secuencia de tipo salvaje en una sola reacción. Sin embargo, la dependencia del ciclo térmico y la instrumentación compleja para la identificación de mutaciones limita su aplicabilidad en entornos POC (^[29]). Por último, un ensayo ID-CRISPR basado en RPA detectó la mutación EGFRL858R con un LoD del 0,1% de VAF, que sigue siendo menos sensible que los métodos establecidos. La especificidad reducida proviene de la alta tolerancia a la falta de coincidencia de Cas12a, lo que permite la escisión de secuencias casi objetivo y limita efectivamente el LoD para la detección de SNV (^[53], ^[54]). En comparación con la plataforma ddPCR ampliamente utilizada, RECO-Cas difiere en múltiples dimensiones críticas de los recursos, incluido el flujo de trabajo general, los requisitos de mano de obra, los reactivos clave, el costo de los reactivos por muestra, el equipo requerido, el rendimiento de la muestra, el tiempo de ejecución, la sensibilidad y la capacidad de cuantificación (tabla S3). En contraste, en el ensayo RECO-Cas descrito aquí, integramos la reacción de un solo paso RPA-TtAgo con la amplificación de la señal de trans-escisión mediante CRISPR-Cas12a, lo que permite que esta plataforma proporcione un enfoque simple, altamente sensible y específico para el perfilado de mutaciones directamente a partir de cfDNA, lo que mejora su utilidad en la oncología de precisión y la biopsia líquida.

El cfDNA es una rica fuente de información molecular derivada del tumor y permite un diagnóstico preciso del cáncer en varias etapas (^[55]). Los niveles de cfDNA mutante generalmente disminuyen después del inicio del tratamiento y permanecen estables o aumentan durante la resistencia o la progresión de la enfermedad, lo que respalda su utilidad para el monitoreo de la respuesta terapéutica y la dinámica de la enfermedad (^[56], ^[57]). A pesar de su valor, el cfDNA plasmático a menudo está presente en concentraciones muy bajas y se diluye con abundante cfDNA de tipo salvaje, lo que plantea desafíos para una detección sensible (^[58]). Dadas estas características, los ensayos basados en cfDNA se consideran muy prometedores para el diagnóstico no invasivo del cáncer a pesar de su dependencia de pasos complejos de procesamiento de muestras, como el enriquecimiento de mutaciones y la secuenciación de alto rendimiento (^[18], ^[23], ^[59]). La tecnología RECO-Cas puede superar estas limitaciones al combinar la reacción RPA-TtAgo de un solo paso con la detección de CRISPR. (i) RECO-Cas logra una especificidad de un solo nucleótido a través de la escisión enzimática insensible a la falta de coincidencia por parte de TtAgo. (ii) RECO-Cas integra la amplificación de RPA con la escisión de TtAgo en un formato de un solo paso para optimizar el flujo de trabajo. (iii) Las condiciones de reacción isotérmica y la lectura de fluorescencia basada en Cas12a hacen que la plataforma sea adecuada para aplicaciones POC. Estas ventajas respaldan la integración de RECO-Cas en los flujos de trabajo preclínicos y clínicos de rutina.

Los resultados de la validación clínica resaltan el potencial clínico de RECO-Cas como una herramienta de diagnóstico de precisión para guiar las terapias dirigidas contra el cáncer mediante un perfilado preciso de mutaciones basado en cfDNA. RECO-Cas logra una resolución de un solo nucleótido en el locus de KRAS y satisface una necesidad crítica para la selección y el seguimiento de pacientes elegibles para tratamientos específicos de mutaciones, como MRTX1133 y QTX3034 para tumores sólidos avanzados que albergan KRASG12D (^[50], ^[60]), o terapias combinadas como vebreltinib y osimertinib en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico mutado en EGFRL858R (^[61]). RECO-Cas distingue directamente las mutaciones con sentido estrechamente relacionadas a partir del cfDNA plasmático y mejora su utilidad en la optimización de la toma de decisiones terapéuticas, particularmente en cánceres donde el subtipo de mutación dicta la sensibilidad o resistencia a los fármacos. Además, la detección de muestras doblemente positivas sugiere que RECO-Cas también puede capturar la heterogeneidad intratumoral y la variación subclonal, factores que se reconocen cada vez más como determinantes críticos de la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad (^[62]). Con su alta sensibilidad, especificidad de un solo nucleótido y simplicidad operativa, RECO-Cas ofrece una solución prometedora para la implementación clínica de rutina en el diagnóstico temprano, la selección de la terapia y el seguimiento longitudinal de la enfermedad residual mínima.

El futuro del diagnóstico del cáncer reside en sistemas que puedan resolver mutaciones clínicamente relevantes a partir de cantidades mínimas de cfDNA con instrumentación mínima, lo que permite la toma de decisiones en tiempo real en diversos entornos de atención médica. Por lo tanto, desarrollamos una plataforma de diagnóstico POC (punto de atención) compacta, alimentada de forma inalámbrica y basada en teléfonos inteligentes para demostrar un ensayo RECO-Cas con instrumentación mínima. El desarrollo de la plataforma POC demuestra la versatilidad de la ingeniería y el potencial de traslación del ensayo RECO-Cas. Al integrar un receptor de energía inalámbrica, una incubadora en miniatura, excitación de fluorescencia basada en LED, filtrado óptico y una aplicación para teléfonos inteligentes para el análisis automatizado de imágenes, la plataforma minimiza la necesidad de instrumentación y permite un funcionamiento fácil de usar adecuado para entornos clínicos descentralizados. Esta plataforma detectó y clasificó con éxito las variantes de un solo nucleótido (SNV) de KRAS en un amplio rango dinámico, desde 0,01 hasta el 100% de la fracción alélica de variantes (VAF) y en niveles de entrada de attomoles, lo que ilustra tanto una alta sensibilidad analítica como una amplia aplicabilidad clínica. Los resultados del ensayo obtenidos de la plataforma compacta fueron consistentes con los de un equipo de qPCR estándar, lo que valida su precisión diagnóstica. Esta plataforma POC integrada reduce sustancialmente la barrera para la implementación de pruebas de mutación de cfDNA en entornos con pocos recursos, lo que la hace adecuada para su uso en la detección temprana del cáncer, el seguimiento del tratamiento y las aplicaciones de oncología personalizada.

Estudios previos que analizan ácidos nucleicos mutantes, incluido el ARNm, sugieren que los niveles de mutación pueden correlacionarse con los resultados clínicos posterapia (estado libre de tumores) (^[63]). Debido a la falta de muestras postratamiento de pacientes con cáncer, como las recogidas después de la cirugía o la quimioterapia, no pudimos evaluar la utilidad de RECO-Cas para el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Aunque RECO-Cas identifica de forma fiable los alelos mutantes de baja frecuencia, la cuantificación precisa de la VAF está fuera del alcance de este ensayo y debe determinarse utilizando métodos cuantitativos establecidos (por ejemplo, ddPCR o NGS) cuando sea clínicamente necesario. Además, el cfDNA se encuentra enrollado alrededor de proteínas de histonas en forma de mononucleosomas, dinucleosomas o tronucleosomas, lo que introduce una complejidad adicional en el proceso de extracción (^[37], ^[64]). Más allá de este desafío bioquímico, la propia separación del plasma requiere un manejo cuidadoso, ya que el procesamiento rápido de la sangre total a través de pasos de centrifugación secuencial a baja y alta velocidad es necesario para evitar la lisis celular y la contaminación con ADN genómico. Esto presenta un desafío importante para la integración de la extracción y la detección de cfDNA en un sistema unificado. El establecimiento de conjuntos de datos clínicos que incluyan puntos de tiempo postratamiento y métodos optimizados para liberar y purificar el cfDNA de su estructura de nucleosomas aclarará aún más cómo se puede aplicar RECO-Cas en todo el continuo de la atención del cáncer, desde el diagnóstico hasta el seguimiento longitudinal. Por último, nuestro enfoque tiene implicaciones diagnósticas, ya que permite la detección y la clasificación de mutaciones con sentido de un solo nucleótido a través de un flujo de trabajo optimizado que es compatible con la integración en el punto de atención.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio es desarrollar y validar una plataforma de diagnóstico rápida y sensible de RECO-Cas para el perfilado de SNV de cfDNA del plasma de pacientes con cáncer, con el objetivo de permitir resultados del mismo día para apoyar la toma de decisiones clínicas. Hipotetizamos que un constructo de ADN recombinado generado a partir de ADN mutante y un activador de ADN monocatenario (ssDNA) que ha sido "cortado" por Argonaute podría activar selectivamente CRISPR-Cas12a, amplificando así las señales de fluorescencia. Se espera que este ensayo mejore la velocidad del ensayo y reduzca los costos en comparación con las tecnologías convencionales, como ddPCR y NGS. Un objetivo secundario de este estudio es evaluar el rendimiento del ensayo RECO-Cas cuando se integra en una plataforma de diagnóstico POC rentable. Las muestras provienen de un grupo de pacientes con cáncer (n = 21) y un grupo de control. El grupo de control consistió en donantes sanos sin antecedentes de cáncer. Con la cohorte de este estudio, la sensibilidad y la especificidad observadas fueron del 90,48% (IC del 95%: 69,62%, 98,83%) y del 100% (IC del 95%: 69,15%, 100%), respectivamente. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado. Todas las muestras se midieron al menos tres veces (réplicas técnicas), y se utilizaron los valores medios para los análisis. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut (IRB# 08-310-1), y todos los procedimientos siguieron las directrices institucionales.

Reactivos

Betaina, glicerol, Tween 20 y urea de grado de reactivo ACS se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El kit TwistAmp Basic RPA se obtuvo de TwistDx (Maidenhead, Reino Unido). Tampón Tris-borato EDTA (TBE) (10×), solución de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1), tetrametiletilendiamina y persulfato de amonio se compraron a Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). EnGen Lba Cas12a (Cpf1) se compró a New England Biolabs (Ipswich, MA).

Preparación de la muestra de VAF

Las secuencias de ADN objetivo de 100 nucleótidos, el ADN guía y el crARN se compraron a Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA). Los ADN de sentido y antisentido se incubaron en un tampón de hibridación y se recocieron gradualmente enfriando de 95 °C a 37 °C en incrementos de 0,5 °C cada 2 minutos. Los fragmentos de ADN de variantes y de tipo salvaje se mezclaron para generar varias VAF para cada alelo con el fin de evaluar el rendimiento de detección de RECO-Cas.

Reacción de cadena de la polimerasa TaqMan

Los cebadores y la sonda de PCR se enumeran en la tabla S4. Todas las reacciones de PCR se prepararon utilizando Luna Universal Probe qPCR Master Mix (New England Biolabs, M3004X). Cada reacción contenía 5 μl de 2X Master Mix, 0,5 μl de cebador directo, 0,5 μl de cebador inverso, 0,5 μl de sonda de ADN (cada uno a una concentración de trabajo de 10 μM en agua libre de nucleasas) y 1 μl de plantilla con concentración confirmada, y 2,5 μl de agua libre de nucleasas. El protocolo de termociclado incluyó los siguientes pasos: 95 °C durante 2 min, 45 ciclos de 95 °C durante 30 s y 60 °C durante 30 s.

RPA estándar y reacción de corte de TtAgo en un solo paso

Los cócteles de reacción de RPA se generaron añadiendo 10,5 μl de agua libre de nucleasas, 2,5 μl de cebador directo de 10 μM, 2,5 μl de cebador inverso de 10 μM y 29,5 μl de tampón de rehidratación sin cebador a una pastilla de RPA y, a continuación, añadiendo 2,5 μl de acetato de magnesio de 280 mM para iniciar la amplificación del ADN. El sistema de un solo paso se preparó por separado como componentes A y B. El componente A contenía 500 nM de cada cebador, 14 mM de MgSO4, 4 μl de 50% de glicerol y 2,5 μl de cfDNA en un volumen total de reacción de 20 μl. El componente B contenía 20 mM de tris-HCl, 10 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KCl, 8 mM de MgSO4, 0,1% de Triton X-100, 0,1% de Tween 20, 0,8 M de betaina, de 50 a 200 nM de TtAgo y de 0,5 a 2 μM de ADN guía en un volumen total de reacción de 20 μl. En el ensayo de un solo paso, primero se añadieron 20 μl del componente B al tubo y se centrifugó brevemente, luego se añadieron 19 μl del componente A en el fondo del tubo y, por último, se añadió 1 μl de acetato de magnesio de 280 mM. La reacción se llevó a cabo a 39 °C durante 10 min y a 83 °C durante 10 a 30 min, y la mezcla de reacción se enfrió a 4 °C. La fase superior de la mezcla de reacción se recogió para el ensayo CRISPR-Cas12a.

Electroforesis en gel

Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y nativa al 12% para evaluar la eficiencia de corte discriminatorio de TtAgo en el reconocimiento de nucleótidos de tipo salvaje y mutantes. Esto incluyó el análisis de los ADN guía que contienen desajustes de un solo nucleótido, los alelos mutantes dirigidos por los ADN guía y los productos de RPA. Para preparar el gel desnaturalizante, se disolvieron 12 g de urea en una solución que contenía 7,5 ml de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1), 2,5 ml de tampón TBE 10× y se añadió agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 ml. La polimerización se inició añadiendo 10 μl de tetrametiletilendiamina y 80 μl de persulfato de amonio al 40%. El gel se almacenó a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de su uso. Los geles nativos se prepararon utilizando el mismo protocolo, omitiendo la urea. Para el análisis de los productos de corte, se mezclaron 5 μl de la mezcla de reacción con 10 μl de tampón de carga para gel II 2× (desnaturalizante) y se calentaron a 95 °C durante 10 min. A continuación, se cargó un volumen de 10 μl de la mezcla en el gel. Como referencia de tamaño, se mezcló 1 a 2 μl de escalera de ADN ss10 con 10 μl de tampón de carga para gel II 2× y se cargó en el primer carril. La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 300 V y una corriente inicial de 25 mA durante 1 hora. Los geles se tiñeron con SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain en tampón TBE 1× durante 10 min, y los ácidos nucleicos se visualizaron utilizando un sistema de imagen Bio-Rad ChemiDoc MP.

Recogida, procesamiento y extracción de cfDNA de muestras clínicas

Las muestras clínicas de pacientes con cáncer de pulmón, colon y vejiga se recogieron en el Centro de Salud de la Universidad de Connecticut. Las muestras de sangre periférica se recogieron de pacientes con cáncer y donantes sanos de acuerdo con las directrices de consenso publicadas para las variables preanalíticas de la biopsia líquida y la presentación de informes (^[65]–^[67]). Se extrajeron aproximadamente 3 ml de sangre total en tubos EDTA no estabilizadores de células. Las muestras de sangre se procesaron en un corto período de tiempo después de la recogida para minimizar la lisis de los leucocitos. El plasma se aisló mediante un paso de centrifugación inicial para separar los componentes celulares, seguido de una segunda centrifugación a alta velocidad durante 10 min para eliminar los restos celulares. El plasma clarificado se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta el análisis posterior. Se aplicaron los mismos procedimientos de recogida, procesamiento y almacenamiento tanto a los pacientes con cáncer como a los donantes sanos, sin diferencias en el tipo de tubo, el volumen de sangre o las condiciones de centrifugación. El cfDNA se aisló con el kit QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (formato de 50 preparaciones; Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se diluyeron 100 μl de plasma de cada paciente con cáncer o donante sano con 400 μl de tampón fosfato y se mezclaron con 50 μl de proteinasa K del kit y 400 μl de tampón ACL, y luego se incubó a 60 °C durante 30 min. El lisado se combinó con 900 μl de tampón ACB, se cargó en una columna QIAamp y se centrifugó. Las columnas se lavaron secuencialmente con 600 μl de tampón ACW1, 750 μl de tampón ACW2 y 750 μl de etanol al 99%. El cfDNA se eluyó en 20 μl de tampón AVE y se cuantificó espectrofotométricamente [A260 (absorbancia a 260 nm)/A280]. Los eluatos se almacenaron a −80 °C hasta el análisis.

ddPCR

Para cada reacción, se añadieron 1,5 μl de ADNc libre en plasma a 20 μl de la mezcla de ddPCR, que contenía 1× de Supermix para sondas ddPCR, 1,9 μM de primers y 250 nM de cada una de las sondas de tipo salvaje y mutante (tabla S4). El ciclo térmico se realizó a 25 °C durante 3 minutos y a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 °C durante 30 segundos y 60 °C durante 1 minuto, con una desactivación final de la enzima a 98 °C durante 10 minutos y una pausa a 4 °C durante 3 minutos. Después de la amplificación, las gotas se leyeron en el sistema QX200 y los datos se analizaron según las instrucciones del fabricante.

Secuenciación de Sanger

El ADN sintético se amplificó utilizando RPA estándar o una reacción de escisión de RPA-TtAgo en un solo paso, como se describió anteriormente. Una alícuota de 1 μl del producto amplificado diluido 103 veces se amplificó posteriormente utilizando un protocolo de PCR de inicio rápido. Los productos de PCR (10 μl) se purificaron y se eluyeron en 30 μl utilizando un kit de limpieza de ADN. Por último, se enviaron 10 μl de los productos de PCR purificados para la secuenciación de Sanger a Genewiz (EE. UU.).

Plataforma de diagnóstico POC con alimentación inalámbrica integrada con un teléfono inteligente con tecnología de IA

La plataforma (32 mm x 35 mm x 70 mm) se diseñó utilizando SolidWorks y se fabricó con una impresora 3D Form 3 con resina negra (RS-F2-GPBK-04, Formlabs, MA). La plataforma tiene dos pocillos para tubos de reacción en la incubadora en miniatura para la detección simultánea de las variantes y la secuencia de tipo salvaje. En la incubadora en miniatura, se fijó un calentador flexible de película delgada (HK5572R26.5L23A, Minco, MN) y un cable de termopar en su pared exterior para calentar los tubos de reacción y controlar la temperatura, respectivamente (figura 5B). La energía se suministró a través de un receptor de cargador inalámbrico (MyMAX M1300, Amazon) conectado a la parte inferior de la plataforma. Para la imagen de fluorescencia, el LED, el filtro de excitación y el filtro de emisión se seleccionaron para que coincidan con las propiedades espectrales de Cy5.

También desarrollamos una aplicación para teléfonos inteligentes para la adquisición de imágenes, el procesamiento de imágenes y la cuantificación de la fluorescencia. Para el análisis de imágenes de fluorescencia, la aplicación para teléfonos inteligentes reconoció y definió automáticamente dos ROI (regiones de interés) en una imagen RGB (rojo, verde y azul): una ROI para la detección de la secuencia de tipo salvaje y otra ROI para la detección de la variante. OpenCV detectó el contorno de cada tubo de reacción y calculó los valores medios de píxeles dentro del contorno, excluyendo las áreas periféricas indistinguibles como ruido de fondo. Para cada prueba, la aplicación presentó imágenes sin procesar, información de la ROI y datos cuantitativos de intensidad de fluorescencia. El front-end de la aplicación se desarrolló en JavaScript/TypeScript en React Native (a través de Expo), y el back-end de la aplicación se escribió en Python con una API REST de Django.

Estadísticas

El análisis estadístico se realizó utilizando OriginLab 2024 y MedCalc (https://www.medcalc.org/en/calc/diagnostictest.php). Los datos se presentan como medias ± DE, a menos que se indique lo contrario. Los valores de fluorescencia corregidos por el fondo (fluorescencia menos el valor en el tiempo cero) se informan para todos los experimentos, excepto para los datos de optimización del ensayo, que se presentan como valores totales de fluorescencia. La fluorescencia basada en imágenes se cuantificó a partir de imágenes de fluorescencia al final del punto. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunn. Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias con un valor de P_ < 0,05 (n.s., no significativo). La sensibilidad y la especificidad diagnósticas, junto con sus IC del 95 %, se calcularon utilizando el método exacto de Clopper-Pearson en MedCalc, mientras que las medias y las DE para las distribuciones de datos se obtuvieron de la muestra utilizando las funciones correspondientes en Excel.

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio es desarrollar y validar una plataforma de diagnóstico rápida y sensible de RECO-Cas para el perfilado de SNV de ADNc libre en plasma del plasma de pacientes con cáncer, con el objetivo de permitir resultados en el mismo día para apoyar la toma de decisiones clínicas. Hipotetizamos que un constructo de ADN recombinado generado a partir de ADN mutante con escisión de Argonaute y un activador de ADN monocatenario podría activar selectivamente CRISPR-Cas12a, amplificando así las señales de fluorescencia. Se espera que este ensayo mejore la velocidad del ensayo y reduzca los costos en comparación con las tecnologías convencionales, como ddPCR y NGS. Un objetivo secundario de este estudio es evaluar el rendimiento del ensayo RECO-Cas cuando se integra en una plataforma de diagnóstico POC rentable. Las muestras provienen del grupo de pacientes con cáncer (n = 21) y un grupo de control. El grupo de control consistió en donantes sanos sin antecedentes de cáncer. Con la cohorte de este estudio, la sensibilidad y la especificidad observadas fueron del 90,48 % (IC del 95 %: 69,62 %, 98,83 %) y del 100 % (IC del 95 %: 69,15 %, 100 %). Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado. Todas las muestras se midieron al menos tres veces (réplicas técnicas) y se utilizaron los valores medios para los análisis. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut (IRB# 08-310-1), y todos los procedimientos siguieron las pautas institucionales.

Reactivos

Betaina, glicerol, Tween 20 y urea de grado de reactivo ACS se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El kit TwistAmp Basic RPA se obtuvo de TwistDx (Maidenhead, Reino Unido). Tampón Tris-borato EDTA (TBE) (10×), solución de acrilamida/bis-acrilamida al 40 % (19:1), tetrametiletilendiamina y persulfato de amonio se compraron a Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). EnGen Lba Cas12a (Cpf1) se compró a New England Biolabs (Ipswich, MA).

Preparación de la muestra de VAF

Las secuencias de ADN de 100 nucleótidos, el ADN guía y el ARNcr se compraron a Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA). Los ADN de cadena sencilla de sentido y antisentido se incubaron en un tampón de hibridación y se recocieron gradualmente enfriando de 95 ° a 37 °C en incrementos de 0,5 °C cada 2 minutos. Los fragmentos de ADN de tipo salvaje y mutante se mezclaron para generar varios VAF para cada alelo con el fin de evaluar el rendimiento de detección de RECO-Cas.

Reacción de cadena de la polimerasa de TaqMan

Los primers de PCR y la sonda se enumeran en la tabla S4. Todas las reacciones de PCR se realizaron utilizando Luna Universal Probe qPCR Master Mix (New England Biolabs, M3004X). Cada reacción contenía 5 μl de 2X Master Mix, 0,5 μl de primer directo, 0,5 μl de primer inverso, 0,5 μl de sonda de ADN (cada uno a una concentración de trabajo de 10 μM en agua libre de nucleasas) y 1 μl de plantilla con concentración confirmada, y 2,5 μl de agua libre de nucleasas. El protocolo de ciclo térmico incluyó los siguientes pasos: 95 °C durante 2 minutos, 45 ciclos de 95 °C durante 30 segundos y 60 °C durante 30 segundos.

RPA estándar y reacción de escisión de RPA-TtAgo en un solo paso

Los cócteles de reacción de RPA se generaron añadiendo 10,5 μl de agua libre de nucleasas, 2,5 μl de primer directo de 10 μM, 2,5 μl de primer inverso de 10 μM y 29,5 μl de tampón de rehidratación sin primers a una pastilla de RPA y, a continuación, añadiendo 2,5 μl de acetato de magnesio de 280 mM para iniciar la amplificación del ADN. El sistema de un solo paso se preparó por separado como componentes A y B. El componente A contenía 500 nM de cada primer, 14 mM de MgSO4, 4 μl de 50 % de glicerol y 2,5 μl de ADNc libre en plasma en un sistema de reacción total de 20 μl. El componente B contenía 20 mM de tris-HCl, 10 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KCl, 8 mM de MgSO4, 0,1 % de Triton X-100, 0,1 % de Tween 20, 0,8 M de betaina, 50 a 200 nM de TtAgo y 0,5 a 2 μM de ADN guía en un sistema de reacción total de 20 μl. En el ensayo de un solo paso, primero se añadieron 20 μl del componente B al tubo y se centrifugó brevemente, luego se añadieron 19 μl del componente A a la parte inferior del tubo y, por último, se añadió 1 μl de acetato de magnesio de 280 mM. La reacción se llevó a cabo a 39 °C durante 10 minutos y a 83 °C durante 10 a 30 minutos, y la mezcla de reacción se enfrió a 4 °C. La fase superior de la mezcla de reacción se recogió para el ensayo de CRISPR-Cas12a.

Electroforesis en gel

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y nativa al 12 % para evaluar la eficiencia de escisión discriminatoria de TtAgo en el reconocimiento de nucleótidos mutantes frente a nucleótidos de tipo salvaje. Esto incluyó el análisis de ADN guía que contiene desajustes de un solo nucleótido, alelos mutantes dirigidos por ADN guía y productos de RPA. Para preparar el gel desnaturalizante, se disolvieron 12 g de urea en una solución que contenía 7,5 ml de acrilamida/bis-acrilamida al 40 % (19:1), 2,5 ml de tampón TBE 10× y se añadió agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 ml. La polimerización se inició añadiendo 10 μl de tetrametiletilendiamina y 80 μl de persulfato de amonio al 40 %. El gel se almacenó a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de su uso. Los geles nativos se prepararon utilizando el mismo protocolo, omitiendo la urea. Para el análisis de los productos de escisión, se mezclaron 5 μl de la mezcla de reacción con 10 μl de 2× Gel Loading Buffer II (desnaturalizante) y se calentaron a 95 °C durante 10 minutos. Luego, se cargaron 10 μl de la mezcla en el gel. Como referencia de tamaño, se mezcló 1 a 2 μl de la escalera de ADN ss10 con 10 μl de 2× Gel Loading Buffer II y se cargó en el primer carril. La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 300 V y una corriente inicial de 25 mA durante 1 hora. Los geles se tiñeron con SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain en tampón TBE 1× durante 10 minutos y los ácidos nucleicos se visualizaron utilizando un sistema de imagen Bio-Rad ChemiDoc MP.

Recolección, procesamiento y extracción de ADNc libre en plasma de muestras clínicas

Las muestras clínicas de pacientes con cáncer de pulmón, colon y vejiga se recogieron en el Centro de Salud de la Universidad de Connecticut. Las muestras de sangre periférica se recogieron de pacientes con cáncer y donantes sanos de acuerdo con las pautas de consenso publicadas para las variables preanalíticas de la biopsia líquida y la presentación de informes (^[65]–^[67]). Se extrajeron aproximadamente 3 ml de sangre total en tubos EDTA no estabilizadores de células. Las muestras de sangre se procesaron en un corto período de tiempo después de la recolección para minimizar la lisis de los leucocitos. El plasma se aisló mediante un paso de centrifugación inicial para separar los componentes celulares, seguido de una segunda centrifugación a alta velocidad durante 10 minutos para eliminar los restos celulares. El plasma clarificado se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C hasta el análisis posterior. Se aplicaron los mismos procedimientos de recolección, procesamiento y almacenamiento tanto a los pacientes con cáncer como a los donantes sanos, sin diferencias en el tipo de tubo, el volumen de sangre o las condiciones de centrifugación. El ADNc libre en plasma se aisló con el kit QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (formato de 50 preparaciones; Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se diluyeron 100 μl de plasma de cada paciente con cáncer o donante sano en 400 μl de solución salina tamponada con fosfato y se mezclaron con 50 μl de proteinasa K del kit y 400 μl de tampón ACL, seguido de incubación a 60 °C durante 30 minutos. El lisado se combinó con 900 μl de tampón ACB, se cargó en una columna QIAamp y se centrifugó. Las columnas se lavaron secuencialmente con 600 μl de tampón ACW1, 750 μl de tampón ACW2 y 750 μl de etanol al 99 %. El ADNc libre en plasma se eluyó en 20 μl de tampón AVE y se cuantificó espectrofotométricamente [A260 (absorbancia a 260 nm)/A280]. Los eluatos se almacenaron a −80 °C hasta el análisis.

ddPCR

Para cada reacción, se añadieron 1,5 μl de ADNc libre en plasma a 20 μl de la mezcla de ddPCR, que contenía 1× de Supermix para sondas ddPCR, 1,9 μM de primers y 250 nM de cada una de las sondas de tipo salvaje y mutante (tabla S4). El ciclo térmico se realizó a 25 °C durante 3 minutos y a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 °C durante 30 segundos y 60 °C durante 1 minuto, con una desactivación final de la enzima a 98 °C durante 10 minutos y una pausa a 4 °C durante 3 minutos. Después de la amplificación, las gotas se leyeron en el sistema QX200 y los datos se analizaron según las instrucciones del fabricante.

Secuenciación de Sanger

El ADN sintético se amplificó utilizando RPA estándar o una reacción de escisión de RPA-TtAgo en un solo paso, como se describió anteriormente. Una alícuota de 1 μl del producto amplificado diluido 103 veces se amplificó posteriormente utilizando un protocolo de PCR de inicio rápido. Los productos de PCR (10 μl) se purificaron y se eluyeron en 30 μl utilizando un kit de limpieza de ADN. Por último, se enviaron 10 μl de los productos de PCR purificados para la secuenciación de Sanger a Genewiz (EE. UU.).

Plataforma de diagnóstico POC con alimentación inalámbrica integrada con un teléfono inteligente con tecnología de IA

La plataforma (32 mm x 35 mm x 70 mm) se diseñó utilizando SolidWorks y se fabricó con una impresora 3D Form 3 con resina negra (RS-F2-GPBK-04, Formlabs, MA). La plataforma tiene dos orificios para tubos de reacción en la minincubadora para la detección simultánea de las variantes y la secuencia de tipo salvaje. En la minincubadora, se fijó un calentador flexible de película delgada (HK5572R26.5L23A, Minco, MN) y un cable de termopar en su pared exterior para calentar los tubos de reacción y controlar la temperatura, respectivamente (Fig. 5B). La energía se suministró a través de un receptor de cargador inalámbrico (MyMAX M1300, Amazon) conectado a la parte inferior de la plataforma. Para la imagen de fluorescencia, el LED, el filtro de excitación y el filtro de emisión se seleccionaron para que coincidieran con las propiedades espectrales de Cy5.

También desarrollamos una aplicación para teléfonos inteligentes para la adquisición de imágenes, el procesamiento de imágenes y la cuantificación de la fluorescencia. Para el análisis de la imagen de fluorescencia, la aplicación para teléfonos inteligentes reconoció y definió automáticamente dos ROI (regiones de interés) en una imagen RGB (rojo, verde y azul): una ROI para la detección de la secuencia de tipo salvaje y otra ROI para la detección de la variante. OpenCV detectó el contorno de cada tubo de reacción y calculó los valores medios de píxeles dentro del contorno, excluyendo las áreas periféricas indistinguibles como ruido de fondo. Para cada prueba, la aplicación presentó imágenes sin procesar, información de la ROI y datos cuantitativos de intensidad de fluorescencia. El front-end de la aplicación se desarrolló en JavaScript/TypeScript en React Native (a través de Expo), y el back-end de la aplicación se escribió en Python con una API REST de Django.

Estadística

El análisis estadístico se realizó utilizando OriginLab 2024 y MedCalc (https://www.medcalc.org/en/calc/diagnostictest.php). Los datos se presentan como medias ± DE, a menos que se indique lo contrario. Se informan los valores de fluorescencia corregidos por el fondo (fluorescencia menos el valor en el tiempo cero) para todos los experimentos, excepto para los datos de optimización del ensayo, que se presentan como valores totales de fluorescencia. La fluorescencia basada en imágenes se cuantificó a partir de imágenes de fluorescencia al final del punto. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias con un valor de P_ < 0,05 (n.s., no significativo). La sensibilidad y la especificidad diagnósticas, junto con sus IC del 95%, se calcularon utilizando el método exacto de Clopper-Pearson en MedCalc, mientras que las medias y las DE para las distribuciones de datos se obtuvieron de la muestra utilizando las funciones correspondientes en Excel.