La β-catenina palmitoilada, un objetivo farmacológico, regula la evasión inmune mediante la resistencia a la ferroptosis inmunogénica y la inmunosupresión mediada por PD-L1.

La evasión inmune en el cáncer colorrectal (CCR) presenta un desafío clínico importante, especialmente porque los mecanismos subyacentes a las vías inmunosupresoras concurrentes no se comprenden adecuadamente. Identificar los principales nodos reguladores que integran las diversas estrategias de evasión inmune empleadas por las células tumorales es crucial para mejorar la eficacia terapéutica.

La vía Wnt/β-catenina ha surgido como un actor central en este contexto, sirviendo no solo como un impulsor oncogénico, sino también como un regulador de la evasión inmune.^[1] Esta vía está hiperactivada en más del 90% de los casos de CCR, promoviendo la proliferación de las células tumorales, la capacidad de auto-renovación y la resistencia a las terapias.^[2],^[3] Es importante destacar que existen pruebas convincentes que vinculan la hiperactivación de la vía Wnt/β-catenina tanto con la resistencia a la ferroptosis^[4] como con la evasión inmune^[1], dos barreras importantes que dificultan la inmunoterapia eficaz.

La diversidad funcional de la β-catenina en el cáncer está profundamente influenciada por las modificaciones postraduccionales (PTM).^[5],^[6],^[7],^[8],^[9] Nuestro trabajo anterior identificó la palmitoilación en la cisteína 466 de la β-catenina (C466) como un regulador oncogénico crítico que estabiliza la β-catenina y mejora su actividad transcripcional en el CCR,^[10], lo que se confirma con análisis de espectrometría de masas (MS) realizados por otros que confirman la presencia de palmitoilación en este sitio.^[11],^[12] Curiosamente, C466 también es un objetivo para la S-nitrosilación, que inhibe la función transcripcional de la β-catenina.^[13] La interacción entre estas PTM competitivas puede contribuir a la patogénesis del cáncer, desafiando la comprensión convencional de las PTM como eventos aislados.

A pesar de estos avances, persisten dos lagunas críticas. (1) La palmitoiltransferasa específica responsable de modular la β-catenina en C466 aún no se ha identificado. Aunque se ha demostrado que ZDHHC9 palmitoila la β-catenina en C300 y promueve su degradación en el contexto de la fibrosis renal,^[14] este mecanismo parece inconsistente con el papel oncogénico establecido de ZDHHC9 en varios cánceres,^[15],^[16],^[17],^[18],^[19],^[20], incluido el CCR.^[15] Esta discrepancia sugiere que la palmitoilación de la β-catenina mediada por ZDHHC9 en C300 puede no ser el mecanismo principal que impulsa sus funciones pro-tumorales en el cáncer. En consecuencia, identificar la enzima que cataliza la palmitoilación oncogénica de la β-catenina en C466 en el CCR es de suma importancia. (2) Las consecuencias biológicas específicas de la palmitoilación de la β-catenina en C466, particularmente su papel en la coordinación de las respuestas inmunosupresoras, aún deben definirse. Dada la asociación de la señalización hiperactivada de Wnt/β-catenina con la resistencia a la ferroptosis^[4] y la evasión inmune,^[1], hipotetizamos que la palmitoilación en C466 de la β-catenina podría integrar estos mecanismos de resistencia.

La evidencia emergente sugiere que la resistencia a la ferroptosis inhibe la muerte celular inmunogénica, previniendo así la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP), como la proteína de unión al ADN de alta movilidad 1 (HMGB1). HMGB1 es una alarma crucial que activa las células dendríticas (DC) y promueve la presentación de antígenos, lo cual es esencial para iniciar las respuestas antitumorales mediadas por las células T CD8+.^[21] Además, los factores de transcripción oncogénicos de la β-catenina pueden mejorar la expresión de los puntos de control inmunitarios como PD-L1.^[22] Por lo tanto, hipotetizamos que la palmitoilación de la β-catenina en C466 puede obstruir simultáneamente la ferroptosis inmunogénica (por ejemplo, a través de la inhibición de la liberación de DAMP) e impulsar la evasión inmune mediada por PD-L1. Validar esta hipótesis podría revelar un valioso objetivo terapéutico.

Nuestro estudio tiene como objetivo (1) identificar la enzima responsable de dirigir la palmitoilación de la β-catenina en C466 en el CCR, (2) determinar si la palmitoilación de la β-catenina en C466 facilita la supresión inmune al coordinar la resistencia a la ferroptosis inmunogénica y la activación de los puntos de control inmunitarios, y (3) validar su capacidad para ser un objetivo farmacológico mediante la inhibición selectiva. Si se confirma, la palmitoilación competitiva en C466 podría reemplazar la S-nitrosilación, posicionando a la β-catenina como un mediador crítico que suprime simultáneamente la ferroptosis inmunogénica y promueve la evasión inmune mediada por PD-L1, revelando así una vulnerabilidad terapéutica relevante.

Resultados

ZDHHC5 interactúa con la β-catenina

Nuestro trabajo anterior estableció que la palmitoilación en C466 de la β-catenina impulsa la progresión del CCR,^[10], un hallazgo respaldado por el aumento de la palmitoilación de la β-catenina en el CCR en comparación con los tejidos normales (Figuras 1A y 1B). Para identificar la enzima responsable, realizamos inmunoprecipitación de la β-catenina marcada con FLAG de las células HEK293T, seguida de MS, que identificó a ZDHHC5 como un posible interactor (Figuras 1C, 1D y S1A). La MS recíproca con la ZDHHC5 marcada con FLAG confirmó la unión de la β-catenina (Figuras 1C, 1E y S1B).

A continuación, buscamos validar experimentalmente esta interacción en modelos de CCR. La inmunofluorescencia mostró una marcada colocalización de ZDHHC5 y β-catenina en las líneas celulares HCT116 y DLD1 (Figuras 1F y S1C) y en muestras clínicas, con una mayor colocalización en los tumores que en los tejidos normales correspondientes (Figuras 1G y 1H). La co-inmunoprecipitación (coIP) en las células HEK293T confirmó aún más la interacción física (Figura 1I).

Para definir la interfaz de interacción a nivel molecular, generamos una estructura compleja predicha utilizando AlphaFold3, que sugirió interfaces complementarias entre ZDHHC5 y β-catenina (Figuras S1D y S1E). Luego, empleamos una estrategia de mutagénesis guiada por la estructura para probar la relevancia funcional de esta interfaz predicha. La simulación de dinámica molecular indicó que este complejo predicho permaneció estable durante más de 20 ns (convergencia de la desviación cuadrática media; Figura S1F). El análisis de descomposición de residuos de esta simulación identificó posibles residuos de contacto en ambas proteínas, incluidos los residuos de ZDHHC5 (por ejemplo, Ile198 y Phe206) y β-catenina (por ejemplo, Val349 y Phe560) (Figuras S2A y S2B). En esencia, la mutación de estos residuos clave predichos abolió por completo la interacción ZDHHC5-β-catenina en los ensayos de coIP (Figura 1J). En conjunto, estos resultados establecen una interacción entre ZDHHC5 y β-catenina.

ZDHHC5 palmitoila la β-catenina en C466

Para explorar si ZDHHC5 palmitoila la β-catenina, coexpresamos ZDHHC5 con β-catenina de tipo salvaje (WT) o el mutante C466A en las células HEK293T. Los ensayos de intercambio de acil-biotina revelaron que la sobreexpresión de ZDHHC5 aumentó el nivel de palmitoilación de la β-catenina WT, pero no del mutante C466A (Figura 2A), confirmando así la especificidad de la palmitoilación mediada por ZDHHC5 en el sitio C466. El mutante ZDHHC5 C134S inactivo catalíticamente^[23] abolió por completo la palmitoilación de la β-catenina WT (Figura 2B), estableciendo el requisito de la función enzimática de ZDHHC5. Además, el silenciamiento estable de ZDHHC5 en las líneas celulares HCT116 y DLD1 de CCR (Figuras 2C y 2D) redujo significativamente la palmitoilación endógena de la β-catenina (Figura 2E). Estos experimentos demuestran que ZDHHC5 es necesario y suficiente para la palmitoilación específica del sitio de la β-catenina en C466.

Para evaluar la plausibilidad estructural de esta relación catalítica, dado que la palmitoilación normalmente implica la transferencia de un resto palmitoílo desde el residuo de cisteína auto-acilado del sitio activo de una enzima ZDHHC al residuo de cisteína diana^[24],^[25],^[26], analizamos un modelo complejo predicho. Este análisis in silico sugirió que la distancia entre el carbono carbonílico de la C134 acilada en ZDHHC5 y el azufre de la C466 en la β-catenina es de aproximadamente 6,12 Å (Figura 2F). Esta proximidad predicha es consistente con una transferencia catalítica espacialmente factible, considerando el bucle flexible que a menudo alberga el sitio activo de ZDHHC.^[27] Enfatizamos que este modelo proporciona una hipótesis mecanicista consistente con nuestros datos funcionales.

En conjunto, la combinación de evidencia genética, bioquímica y basada en células establece a ZDHHC5 como la enzima responsable de la palmitoilación específica del sitio de la β-catenina en C466, con el modelado computacional que ofrece un contexto estructural plausible para esta interacción.

La palmitoilación competitiva en C466 desplaza la S-nitrosilación para mejorar la actividad transcripcional de la β-catenina

Nuestro trabajo anterior identificó la palmitoilación en C466 como un regulador positivo de la actividad transcripcional de la β-catenina.^[10] Para evaluar la función de la palmitoilación en C466, primero expresamos el mutante C466A en las células HEK293T y observamos su acumulación nuclear deteriorada en relación con la β-catenina WT (Figura S3A), lo que implica que esta modificación está involucrada en el tráfico de la β-catenina. Para probar esto definitivamente en un fondo genético limpio, recurrimos a las células HCT116 con deleción de CTNNB1 (Figura S3B). La reconstitución con el mutante C466A nuevamente resultó en una reducción marcada de la β-catenina nuclear en comparación con las células reconstituidas con WT (Figura 3A). Además, los análisis transcriptómicos revelaron una regulación a la baja significativa de la señalización de Wnt/β-catenina tras el silenciamiento de ZDHHC5 en las células DLD1 (Figura S3C). Esto se acompañó de una supresión consistente de los genes diana de la β-catenina tanto en las células DLD1 como en las HCT116 (Figura S3D), lo que apoya la conclusión de que la palmitoilación en C466 es fundamental para la función nuclear de la β-catenina.

Curiosamente, C466 también sirve como un sitio para la S-nitrosilación inhibitoria, que interrumpe la formación del complejo β-catenina/TCF4 y disminuye la producción transcripcional.^[13] Hipotetizamos que la palmitoilación en este residuo podría desplazar competitivamente la S-nitrosilación (Figura 3B). Apoyando esta hipótesis, observamos que el silenciamiento de ZDHHC5 resultó en un aumento de la S-nitrosilación de la β-catenina en las células HEK293T (Figura 3C). Por el contrario, la sobreexpresión de ZDHHC5 condujo a una reducción de los niveles de S-nitrosilación; este efecto se abolió cuando se expresó la β-catenina C466A (Figura 3D), lo que indica una competencia directa entre estas PTM en C466.

Para investigar un posible mecanismo por el cual la palmitoilación en C466 podría mejorar la actividad transcripcional de la β-catenina, generamos una hipótesis estructural. Basado en la estructura de co-cristal de β-catenina/TCF4, el modelado in silico de un resto palmitoílo en C466 sugirió un modelo en el que el palmitato ocupa un bolsillo hidrofóbico (Figura 3E). Se predice que esta ocupación de palmitato estabiliza alostéricamente una conformación que permite las interacciones intermoleculares, notablemente un puente de sal entre la lisina 508 de la β-catenina y el glutamato 17 de TCF4, y nuevos enlaces de hidrógeno que involucran la aspartato 390/lisina 354 de la β-catenina y la fenilalanina 21 de TCF4 (Figuras S4A y S4B). Este modelo proporcionó una hipótesis mecanicista comprobable para una mayor afinidad.

Para probar experimentalmente la predicción clave de esta hipótesis, que la palmitoilación en C466 fortalece la interacción β-catenina/TCF4, realizamos ensayos de co-inmunoprecipitación. Como se predijo, el silenciamiento de ZDHHC5 debilitó significativamente la interacción β-catenina-TCF4 en las células HEK293T (Figura 3F). Para descartar la posibilidad de que este efecto resultara de una interrupción no específica del complejo, empleamos iCRT14, un inhibidor de molécula pequeña que ocupa competitivamente la interfaz de unión a TCF4 en la β-catenina.^[28] En presencia de iCRT14, que casi abolió la interacción de referencia, el silenciamiento de ZDHHC5 ya no produjo un efecto inhibitorio adicional (Figura 3F). Esto confirma que ZDHHC5 modula la afinidad de unión intrínseca en la interfaz canónica, en lugar de causar una desestabilización no específica del complejo. En conjunto, estos hallazgos establecen un paradigma de competencia de PTM en el que la palmitoilación en C466 desplaza la S-nitrosilación inhibitoria, estabilizando así el complejo β-catenina-TCF4 y amplificando su producción transcripcional.

La palmitoilación de la β-catenina en C466 confiere resistencia a la ferroptosis inmunogénica a través de la activación transcripcional de SLC7A11

SPANISH TRANSLATION:

La señalización de β-catenina es fundamental para la supervivencia de las células tumorales.^[29],^[30] Para investigar si la palmitoilación en C466 modula la sensibilidad a la muerte celular, manipulamos la expresión de ZDHHC5 en líneas celulares de CCRC. La inhibición de ZDHHC5 resultó en un aumento de la mortalidad celular, que se rescató específicamente mediante el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1,^[31], pero no mediante inhibidores de la apoptosis (Z-VAD-FMK^[32]), la necroptosis (necrostatina-1^[33]) o la autofagia (3-MA^[34]) (Figuras S5A y S5B). Por el contrario, la sobreexpresión de ZDHHC5 redujo la ferroptosis inducida por RSL3^[35] y disminuyó la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lípidos ROS y 4-hidroxinoneno (4-HNE) (Figuras S5C–S5F). La inhibición de ZDHHC5 resultó en niveles elevados de ROS y 4-HNE tanto en las células HCT116 como en las DLD1 (Figuras S5G y S5H). En particular, en las células HCT116 con CTNNB1 desactivado, la manipulación de ZDHHC5 no alteró estos marcadores de la ferroptosis (Figuras S6A–S6G), lo que indica que la β-catenina es necesaria para el efecto de ZDHHC5. A continuación, probamos directamente el requisito funcional de la palmitoilación en el sitio C466. La reconstitución de células HCT116 con CTNNB1 desactivado con β-catenina de tipo salvaje (WT) rescató completamente la muerte celular, lo que es consistente con la restauración de la resistencia a la ferroptosis (Figura 4A). En contraste, la reconstitución con la mutante C466A deficiente en palmitoilación proporcionó solo un rescate parcial (Figura 4A). Este fenotipo parcial sugirió que las células que expresan la mutante C466A retienen una mayor sensibilidad intrínseca a la ferroptosis. Para probar esto, evaluamos la eficacia protectora de la ferrostatin-1. Como se predijo, la ferrostatin-1 confirió una protección significativamente mayor en las células reconstituidas con C466A en comparación con los controles reconstituidos con WT (Figura 4B). Además, las células reconstituidas con C466A exhibieron consistentemente niveles más altos de ROS, lípidos ROS y 4-HNE que sus contrapartes reconstituidas con WT (Figura 4C). En conjunto, estos datos demuestran que la palmitoilación en C466 es esencial para que la β-catenina confiera resistencia a la ferroptosis.

Habiendo establecido que la palmitoilación de la β-catenina en C466 confiere resistencia a la ferroptosis, a continuación investigamos su mecanismo aguas abajo. Se sabe que la ferroptosis desencadena la liberación de la proteína de unión al cromo HMGB1, un importante DAMP y mediador inmunitario.^[36] De manera consistente, encontramos que las células HCT116 reconstituidas con la β-catenina C466A deficiente en palmitoilación liberaron significativamente más HMGB1 extracelular en comparación con las células reconstituidas con WT (Figura 4D). Esta mayor liberación se bloqueó mediante el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1 (Figura 4D), lo que confirma su dependencia de la muerte celular ferroptótica. Para identificar el objetivo transcripcional que media este efecto, realizamos análisis transcriptómicos integrados en múltiples modelos, incluidos los ratones con Zdhhc5 desactivado de forma específica en el epitelio intestinal, las células HCT116 con CTNNB1 desactivado y las células DLD1 con ZDHHC5 desactivado. La referencia cruzada con un conjunto de genes relacionados con la ferroptosis^[37] identificó consistentemente a SLC7A11, un inhibidor central de la ferroptosis, como el objetivo regulado a la baja (Figura 4E). Clínicamente, los niveles de proteína SLC7A11 se correlacionaron positivamente tanto con la β-catenina como con ZDHHC5 en microarreglos de tejido de CCRC humano (TMA) (Figura 4F), un hallazgo corroborado por datos de transcriptómica espacial públicos^[38] (Figuras S7A–S7C). Funcionalmente, la inhibición de ZDHHC5 disminuyó la expresión de SLC7A11 de forma dependiente de la β-catenina, y las células reconstituidas con C466A exhibieron niveles más bajos de SLC7A11 que las células reconstituidas con WT (Figuras S7D–S7F). El inhibidor transcripcional de β-catenina/TCF4, iCRT14, suprimió la expresión de SLC7A11 en las células reconstituidas con WT, pero no en las células reconstituidas con C466A (Figuras 4G y S7G), lo que vincula directamente la palmitoilación de C466 con la transactivación de SLC7A11 dependiente de la β-catenina.

Mecanísticamente, identificamos dos elementos de unión a β-catenina/TCF4 conservados en el promotor de SLC7A11 (Figura 4H). Los ensayos de reportero de luciferasa y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina confirmaron que la β-catenina de tipo salvaje, pero no la mutante C466A, se une a estos sitios (Figuras 4I, 4J y S7H), lo que demuestra que la palmitoilación de C466 es necesaria para la ocupación del promotor. Para probar la relevancia in vivo y la necesidad de este mecanismo dependiente de SLC7A11, establecimos modelos de xenoinjerto derivados de HCT116. La inhibición de SLC7A11 inhibióPotentemente el crecimiento tumoral y aumentó los niveles de HMGB1 en el plasma en los tumores reconstituidos con WT, pero tuvo un efecto mínimo en los tumores reconstituidos con C466A (Figuras 4K–4N). En conjunto, estos datos demuestran que la palmitoilación de la β-catenina en C466 impulsa la transcripción de SLC7A11 al facilitar su unión al promotor, estableciendo así una vía molecular que confiere resistencia a la ferroptosis inmunogénica y promueve el crecimiento tumoral.

La palmitoilación de la β-catenina en C466 coordina un programa inmunosupresor al conferir resistencia a la ferroptosis inmunogénica y aumentar la expresión de PD-L1

Para definir la función inmunosupresora del eje ZDHHC5-β-catenina, nos centramos en PD-L1 como un candidato efector principal. Este enfoque se basó en informes establecidos de que el complejo β-catenina/TCF puede regular al alza la expresión de PD-L1 a nivel transcripcional,^[22],^[39], junto con nuestro hallazgo de que la palmitoilación de C466 amplifica la actividad transcripcional de la β-catenina. Por lo tanto, primero examinamos la asociación de este eje con PD-L1 y el contexto inmunitario. El análisis de los datos de colon adenocarcinoma del Proyecto del Genoma del Cáncer reveló correlaciones positivas significativas entre la expresión de ZDHHC5 y PD-L1, así como entre CTNNB1 y PD-L1 (Figura S8A). Validamos y ampliamos estos hallazgos utilizando un conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de CCRC, GSE132465. Este análisis confirmó una correlación positiva entre ZDHHC5 y PD-L1 e identificó además una correlación negativa significativa entre los niveles de ZDHHC5 y la infiltración de células T CD8+ (Figuras 5A–5C). Dada la función crítica de HMGB1, que se libera durante la ferroptosis, en la activación de las células dendríticas (DC) y la presentación de antígenos,^[21], hipotetizamos que ZDHHC5 elevado podría estar relacionado con una función alterada de las DC. De manera consistente con esto, la expresión de ZDHHC5 mostró una fuerte correlación negativa con los niveles de HLA-A en las DC asociadas al tumor, con una tendencia similar para otros genes HLA (Figuras 5D y S8B). Estos datos correlativos sitúan el eje ZDHHC5-β-catenina dentro de un contexto inmunosupresor que presenta una presentación de antígenos alterada y células T agotadas.

Para establecer una relación causal directa, realizamos experimentos de rescate funcional. La reconstitución de células HCT116 con CTNNB1 desactivado con β-catenina de tipo salvaje indujo significativamente la expresión de PD-L1 e inhibió la liberación extracelular de HMGB1 (Figura 5E). En contraste, la reconstitución con la mutante C466A deficiente en palmitoilación no logró provocar ninguna de estas respuestas (Figura 5E). La inhibición farmacológica de la señalización de β-catenina/TCF4 suprimió la transcripción de PD-L1 en las células reconstituidas con WT, pero no tuvo ningún efecto en las células reconstituidas con C466A (Figura 5F). Esto demuestra que la palmitoilación de C466 es esencial para la transactivación dependiente de β-catenina/TCF4 de PD-L1.

Nuestro modelo postula que la palmitoilación de la β-catenina C466 confiere resistencia al suprimir simultáneamente la ferroptosis inmunogénica (limitando la liberación de HMGB1) y aumentar la expresión de PD-L1. Por lo tanto, preguntamos si estos dos brazos están funcionalmente integrados para conferir resistencia a la inmunoterapia in vivo. Implantamos células MC38 con Ctnnb1 desactivado, reconstituidas con β-catenina de tipo salvaje o C466A, con o sin la inhibición concurrente de Hmgb1, en ratones inmunocompetentes y los tratamos con anticuerpo anti-PD-L1. Los tumores que expresaban la mutante C466A (que libera HMGB1) exhibieron una sensibilidad significativamente mayor a la terapia anti-PD-L1 (Figuras 5G y 5H). Esta sensibilidad se asoció con niveles elevados de HMGB1 en el plasma (Figura 5I). Fundamentalmente, el beneficio terapéutico del anti-PD-L1 se abolió por completo en los tumores con deficiencia combinada de palmitoilación de β-catenina C466 y inhibición de Hmgb1 (Figuras 5G y 5H). Este experimento de epistasis genética demuestra que la señal inmunogénica de la ferroptosis (liberación de HMGB1) es necesaria para liberar la eficacia del bloqueo de puntos de control (anti-PD-L1).

En conjunto, estos resultados demuestran que la palmitoilación de ZDHHC5 de la β-catenina en C466 impulsa la evasión inmune a través de un mecanismo unificado. Coordina la supresión de la ferroptosis inmunogénica (limitando la liberación de HMGB1) al tiempo que mejora la inhibición de las células T mediada por PD-L1. Nuestro hallazgo de una correlación negativa entre ZDHHC5 y la expresión de los genes HLA en las DC, junto con el papel establecido de HMGB1 en la activación de las DC, apoya un modelo por el cual este eje también puede comprometer la presentación de antígenos. Fundamentalmente, nuestro experimento de epistasis in vivo confirma que estos dos brazos inmunosupresores son funcionalmente interdependientes; la señal inmunogénica HMGB1 es necesaria para liberar la eficacia del bloqueo de puntos de control, estableciendo así una formidable barrera a la inmunoterapia.

La deficiencia de ZDHHC5 revierte la inmunosupresión e inhibe la tumorigénesis colorrectal

Habiendo establecido mecánicamente que la palmitoilación de ZDHHC5 de la β-catenina en C466 impulsa la transactivación de SLC7A11 y PD-L1, a continuación evaluamos la relevancia traslacional de este eje y validamos su función patogénica en modelos fisiológicos. Primero examinamos su asociación clínica. El ARNm de ZDHHC5 se sobreexpresó en los tejidos de CCRC, con los niveles más altos en los tumores de etapa avanzada (III/IV) (Figuras S9A y S9B). El análisis de TMA y los experimentos de Western blot confirmaron la sobreexpresión de la proteína ZDHHC5 en CCRC (Figuras 6A, S9C y S9D), que se correlacionó con un mayor volumen tumoral (Figura 6B). Los niveles elevados de ZDHHC5 predijeron una peor supervivencia general (OS) y una supervivencia libre de recurrencia y libre de enfermedad en múltiples cohortes de CCRC (Figuras S9E–S9J). En particular, en una cohorte de pacientes tratados con inmunoterapia anti-PD-L1, los niveles elevados de ZDHHC5 se asociaron con una peor OS (Figura S9K). Esta observación clínica apoya nuestra hipótesis mecanicista de que ZDHHC5 impulsa un amplio programa inmunosupresor, que se extiende más allá de la regulación al alza de PD-L1 para incluir la supresión de la ferroptosis inmunogénica.

Para probar esto funcionalmente, inhibimos ZDHHC5 en las células de CCRC. Esto suprimió la proliferación e indujo los marcadores de ferroptosis: aumento de los lípidos ROS, la acumulación de 4-HNE y la liberación de HMGB1, fenotipos que se rescataron mediante la sobreexpresión de SLC7A11 (Figuras S10A–S10E), lo que confirma que SLC7A11 es un efector clave. En los organoides derivados de pacientes, la inhibición de ZDHHC5 redujo el tamaño del organoide y aumentó el HMGB1 extracelular (Figuras 6C y 6D). De manera similar, en los xenoinjertos derivados de HCT116, la inhibición de ZDHHC5 inhibió el crecimiento tumoral y promovió los marcadores de ferroptosis inmunogénica, y estos efectos se invirtieron mediante la sobreexpresión de SLC7A11 (Figuras S10F–S10J).

Luego preguntamos si el efecto terapéutico de la pérdida de ZDHHC5 depende de SLC7A11. En los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) (Figura 6E), la inhibición de ZDHHC5 suprimió significativamente el crecimiento tumoral y elevó los niveles de HMGB1 en el plasma. Es importante destacar que este efecto fue específico de los PDX que exhibieron una alta expresión intrínseca de SLC7A11 y fue ausente en los modelos con baja expresión de este (Figuras 6F y S10K–S10N). Esto demuestra que la actividad de SLC7A11 es necesaria para el efecto antitumoral de la ablación de ZDHHC5.

Para evaluar el impacto patofisiológico de la pérdida de ZDHHC5 en un contexto relevante para la enfermedad y inmunocompetente, utilizamos el modelo de CCRC asociado a colitis inducido por AOM/DSS. Tanto los ratones con eliminación condicional específica del epitelio intestinal (Zdhhc5flox/flox; VillinCre+) como los ratones con eliminación total desarrollaron significativamente menos tumores y tumores más pequeños (Figuras 6G–6M y S11A–S11C). La lipidómica no dirigida reveló la acumulación de fosfolípidos de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) proferroptóticos^[40] en los tejidos del colon de los ratones CKO (Figura 6N), y los tumores exhibieron niveles elevados de lípidos ROS y 4-HNE, junto con una disminución de SLC7A11 (Figuras S11D y S11E). Sorprendentemente, la ablación de Zdhhc5 remodeló profundamente el microambiente inmunitario tumoral, reduciendo la expresión de PD-L1_ al tiempo que aumentaba la infiltración de células T CD8+ y el HMGB1 en el plasma (Figuras S11E–S11G).

En conjunto, los estudios genéticos de pérdida de función en diversos modelos demuestran que el eje ZDHHC5-β-catenina es un impulsor crítico del CRC. Funciona al suprimir simultáneamente la fase de iniciación de la inmunidad antitumoral mediante la inhibición de la señal DAMP HMGB1, lo que perjudica la presentación de antígenos, e inhibiendo directamente la fase efectora a través de la supresión mediada por PD-L1 de las células T citotóxicas.### β-cat-oxazol, un inhibidor de primera clase de la interacción ZDHHC5-β-catenina, suprime la tumorigénesis colorrectal.

Tras establecer el eje ZDHHC5-β-catenina como un impulsor crítico del CRC, exploramos a continuación su potencial terapéutico. En ausencia de inhibidores específicos de ZDHHC5, nuestro objetivo fue inhibir directamente la palmitoilación patogénica de β-catenina en C466 mediante la interrupción de la interacción ZDHHC5-β-catenina. Realizamos un cribado virtual basado en la estructura de 1,6 millones de compuestos, dirigido a la interfaz de interacción proteína-proteína ZDHHC5-β-catenina predicha que rodea C466 (Figura 7A). De los 30 candidatos mejor clasificados, se adquirieron 26 análogos disponibles comercialmente para la validación biológica. Entre estos, β-cat-oxazol (denominado así por su estructura y novedad) potenció con mayor eficacia la sensibilidad de las células HCT116 a un inductor de la ferroptosis (Figuras 7B y 7C).

La caracterización biológica confirmó que β-cat-oxazol inducía la muerte celular de forma dependiente de β-catenina (Figura 7D), y esta muerte se revirtió con el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1 (Figura 7E). El tratamiento también desencadenó la liberación extracelular de HMGB1, que también se bloqueó con ferrostatin-1 (Figura 7F), lo que confirma la naturaleza inmunogénica de la muerte celular. Las simulaciones de dinámica molecular y el análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) revelaron que β-cat-oxazol se une de forma estable a β-catenina con alta afinidad (KD = 2,74 μM), formando interacciones críticas con residuos que incluyen Arg469, Lys508, Arg515, Glu568 y Glu571 (Figuras 7G y S12A-S12I). Es importante destacar que la mutación de estos residuos clave de β-catenina abolió la capacidad de β-cat-oxazol para inducir sus efectos pro-ferroptóticos, incluida la muerte celular y la elevación de 4-HNE, ROS lipídicos y HMGB1 extracelular (Figuras S12J-S12M). Funcionalmente, β-cat-oxazol interrumpió la interacción ZDHHC5-β-catenina de forma dependiente de la dosis y redujo los niveles de palmitoilación de β-catenina celular (Figuras 7H e 7I).

Una evaluación de seguridad exhaustiva mostró que β-cat-oxazol redujo selectivamente la viabilidad de las líneas celulares de CRC, pero no de la línea celular epitelial normal del colon NCM460 in vitro (Figuras S13A y S13B). En un estudio in vivo de administración repetida de 28 días, β-cat-oxazol (20 mg/kg) fue bien tolerado, sin cambios significativos en el peso corporal, la bioquímica sérica o la histopatología de los órganos principales (Figuras S13C-S13F).

A continuación, evaluamos la eficacia terapéutica de β-cat-oxazol in vivo. La evaluación inicial en un modelo tumoral subcutáneo MC38 en ratones inmunocompetentes demostró que el tratamiento con β-cat-oxazol inhibió eficazmente el crecimiento tumoral (Figuras S14A y S14B). Mecánicamente, los tumores de los ratones tratados mostraron una modulación de la vía objetivo, incluida la disminución de SLC7A11 y PD-L1, el aumento de los marcadores de ferroptosis (ROS lipídicos, 4-HNE) y la inmunogenicidad (HMGB1) (Figuras S14C-S14G). Validamos aún más su eficacia en un modelo de CRC asociado a colitis inducido por AOM/DSS, más relevante para la enfermedad y en ratones inmunocompetentes. El tratamiento con β-cat-oxazol iniciado después del establecimiento del tumor redujo significativamente la carga tumoral (Figuras 7J-7M). De forma consistente, los tumores de los ratones tratados recapitularon el mismo patrón de disminución concurrente de SLC7A11 y PD-L1, aumento de la ferroptosis (4-HNE) y el marcador inmunogénico (HMGB1), y aumento de la infiltración de células T CD8+ (Figuras 7N y S14H-S14K).

En conjunto, estos datos identifican β-cat-oxazol como un inhibidor de primera clase y de prueba de concepto que se dirige directamente al interruptor de palmitoilación de β-catenina. Al interrumpir la interacción ZDHHC5-β-catenina, β-cat-oxazol imita la ablación genética de este eje, reactivando sincrónicamente la ferroptosis inmunogénica y aboliendo la evasión inmune mediada por PD-L1 para suprimir la progresión del CRC.

ZDHHC5 interactúa con β-catenina

Nuestro trabajo anterior estableció que la palmitoilación en C466 de β-catenina impulsa la progresión del CRC,^[10], un hallazgo respaldado por el aumento de la palmitoilación de β-catenina en el CRC en comparación con los tejidos normales (Figuras 1A y 1B). Para identificar la enzima responsable, realizamos una inmunoprecipitación de FLAG-β-catenina de células HEK293T, seguida de MS, que identificó ZDHHC5 como un posible interactor (Figuras 1C, 1D y S1A). La MS recíproca con FLAG-ZDHHC5 confirmó la unión de β-catenina (Figuras 1C, 1E y S1B).

A continuación, buscamos validar experimentalmente esta interacción en modelos de CRC. La inmunofluorescencia mostró una marcada colocalización de ZDHHC5 y β-catenina en las líneas celulares HCT116 y DLD1 (Figuras 1F y S1C) y en muestras clínicas, con una mayor colocalización en los tumores que en los tejidos normales correspondientes (Figuras 1G y 1H). La co-inmunoprecipitación (coIP) en células HEK293T confirmó aún más la interacción física (Figura 1I).

Para definir la interfaz de interacción a nivel molecular, generamos una estructura compleja predicha utilizando AlphaFold3, que sugirió interfaces complementarias entre ZDHHC5 y β-catenina (Figuras S1D y S1E). A continuación, empleamos una estrategia de mutagénesis guiada por la estructura para probar la relevancia funcional de esta interfaz predicha. La simulación de dinámica molecular indicó que este complejo predicho permaneció estable durante más de 20 ns (convergencia de la desviación cuadrática media; Figura S1F). El análisis de descomposición de residuos de esta simulación identificó posibles residuos de contacto en ambas proteínas, incluidos los residuos de ZDHHC5 (por ejemplo, Ile198 y Phe206) y β-catenina (por ejemplo, Val349 y Phe560) (Figuras S2A y S2B). Es importante destacar que la mutación de estos residuos clave de β-catenina abolió la capacidad de β-cat-oxazol para inducir sus efectos pro-ferroptóticos, incluida la muerte celular y la elevación de 4-HNE, ROS lipídicos y HMGB1 extracelular (Figuras S12J-S12M). Funcionalmente, β-cat-oxazol interrumpió la interacción ZDHHC5-β-catenina de forma dependiente de la dosis y redujo los niveles de palmitoilación de β-catenina celular (Figuras 7H e 7I).

En conjunto, estos resultados establecen una interacción entre ZDHHC5 y β-catenina.

ZDHHC5 palmitoila β-catenina en C466

Para explorar si ZDHHC5 palmitoila β-catenina, coexpresamos ZDHHC5 con β-catenina de tipo salvaje (WT) o el mutante C466A en células HEK293T. Los ensayos de intercambio de acil-biotina revelaron que la sobreexpresión de ZDHHC5 aumentó el nivel de palmitoilación de β-catenina WT, pero no del mutante C466A (Figura 2A), lo que confirma la especificidad de la palmitoilación mediada por ZDHHC5 en el sitio C466. El mutante ZDHHC5 C134S inactivo catalíticamente^[23] abolió por completo la palmitoilación de β-catenina WT (Figura 2B), lo que establece la necesidad de la función enzimática de ZDHHC5. Además, el silenciamiento estable de ZDHHC5 en las líneas celulares de CRC HCT116 y DLD1 (Figuras 2C y 2D) redujo significativamente la palmitoilación endógena de β-catenina (Figura 2E). Estos experimentos demuestran que ZDHHC5 es necesario y suficiente para la palmitoilación específica del sitio de β-catenina en C466.

Para evaluar la plausibilidad estructural de esta relación catalítica, dado que la palmitoilación normalmente implica la transferencia de una fracción de palmitoilo desde el sitio activo de la enzima ZDHHC autoacilada al residuo de cisteína diana^[24],^[25],^[26], analizamos un modelo complejo predicho. Este análisis in silico sugirió que la distancia entre el carbono carbonílico de C134 acilado en ZDHHC5 y el azufre de C466 en β-catenina es de aproximadamente 6,12 Å (Figura 2F). Esta proximidad predicha es consistente con una transferencia catalítica espacialmente factible, teniendo en cuenta el bucle flexible que a menudo alberga el sitio activo de ZDHHC.^[27] Enfatizamos que este modelo proporciona una hipótesis mecanicista consistente con nuestros datos funcionales.

En conjunto, la combinación de evidencia genética, bioquímica y basada en células establece que ZDHHC5 es la enzima responsable de la palmitoilación específica del sitio de β-catenina en C466, con el modelado computacional que ofrece un contexto estructural plausible para esta interacción.

La palmitoilación competitiva en C466 desplaza la S-nitrosilación para mejorar la actividad transcripcional de β-catenina

Nuestro trabajo anterior identificó la palmitoilación en C466 como un regulador positivo de la actividad transcripcional de β-catenina.^[10] Para evaluar la función de la palmitoilación en C466, primero expresamos el mutante C466A en células HEK293T y observamos su acumulación nuclear alterada en relación con β-catenina WT (Figura S3A), lo que implica que esta modificación está implicada en el tráfico de β-catenina. Para probar esto definitivamente en un fondo genético limpio, recurrimos a las células HCT116 con deleción de CTNNB1 (Figura S3B). La reconstitución con el mutante C466A produjo nuevamente una reducción marcada de β-catenina nuclear en comparación con las células reconstituidas con WT (Figura 3A). Además, los análisis transcripómicos revelaron una disminución significativa de la señalización de Wnt/β-catenina tras el silenciamiento de ZDHHC5 en las células DLD1 (Figura S3C). Esto se acompañó de una supresión consistente de los genes diana de β-catenina tanto en las células DLD1 como en las HCT116 (Figura S3D), lo que apoya la conclusión de que la palmitoilación en C466 es fundamental para la función nuclear de β-catenina.

Es interesante destacar que C466 también sirve como sitio para la S-nitrosilación inhibidora, que interrumpe la formación del complejo β-catenina/TCF4 y disminuye la producción transcripcional.^[13] Hipotetizamos que la palmitoilación en este residuo podría desplazar competitivamente la S-nitrosilación (Figura 3B). En apoyo de esta hipótesis, observamos que el silenciamiento de ZDHHC5 resultó en un aumento de la S-nitrosilación de β-catenina en las células HEK293T (Figura 3C). Por el contrario, la sobreexpresión de ZDHHC5 condujo a una reducción de los niveles de S-nitrosilación; este efecto se abolió cuando se expresó β-catenina C466A (Figura 3D), lo que indica una competencia directa entre estas PTM en C466.

Para investigar un posible mecanismo por el cual la palmitoilación en C466 podría mejorar la actividad transcripcional de β-catenina, generamos una hipótesis estructural. Basándonos en la estructura del co-cristal de β-catenina/TCF4, el modelado in silico de una fracción de palmitoilo en C466 sugirió un modelo en el que el palmitato ocupa un bolsillo hidrofóbico (Figura 3E). Se predice que esta ocupación de palmitoilo estabiliza alostéricamente una conformación que permite las interacciones intermoleculares, en particular un puente de sal entre β-catenina Lys508 y TCF4 Glu17, y nuevos enlaces de hidrógeno que involucran β-catenina Asp390/Lys354 y TCF4 Phe21 (Figuras S4A y S4B). Este modelo proporcionó una hipótesis mecanicista comprobable para una mayor afinidad.

Para probar experimentalmente la predicción clave de esta hipótesis, que la palmitoilación en C466 fortalece la interacción β-catenina/TCF4, realizamos ensayos de co-inmunoprecipitación. Como se predijo, el silenciamiento de ZDHHC5 debilitó significativamente la interacción β-catenina-TCF4 en las células HEK293T (Figura 3F). Para descartar la posibilidad de que este efecto se debiera a una interrupción no específica del complejo, utilizamos iCRT14, un inhibidor de molécula pequeña que ocupa competitivamente la interfaz de unión a TCF4 en β-catenina.^[28]. En presencia de iCRT14, que abolió casi por completo la interacción de referencia, el silenciamiento de ZDHHC5 ya no produjo un efecto inhibidor adicional (Figura 3F). Esto confirma que ZDHHC5 modula la afinidad de unión intrínseca en la interfaz canónica, en lugar de causar una desestabilización no específica del complejo. En conjunto, estos hallazgos establecen un paradigma de competencia de PTM en el que la palmitoilación en C466 desplaza la S-nitrosilación inhibidora, estabilizando así el complejo β-catenina-TCF4 y amplificando su producción transcripcional.

La palmitoilación de β-catenina en C466 confiere resistencia a la ferroptosis inmunogénica a través de la activación transcripcional de SLC7A11

SPANISH TRANSLATION:

La señalización de β-catenina es fundamental para la supervivencia de las células tumorales.^[29],^[30] Para investigar si la palmitoilación en C466 modula la sensibilidad a la muerte celular, manipulamos la expresión de ZDHHC5 en líneas celulares de CCRC. La inhibición de ZDHHC5 resultó en un aumento de la mortalidad celular, que se rescató específicamente mediante el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1,^[31], pero no mediante inhibidores de la apoptosis (Z-VAD-FMK^[32]), la necroptosis (necrostatina-1^[33]) o la autofagia (3-MA^[34]) (Figuras S5A y S5B). Por el contrario, la sobreexpresión de ZDHHC5 redujo la ferroptosis inducida por RSL3^[35] y disminuyó la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lípidos ROS y 4-hidroxinoneno (4-HNE) (Figuras S5C–S5F). La inhibición de ZDHHC5 resultó en niveles elevados de ROS y 4-HNE tanto en las células HCT116 como en las DLD1 (Figuras S5G y S5H). En particular, en las células HCT116 con CTNNB1 desactivado, la manipulación de ZDHHC5 no alteró estos marcadores de ferroptosis (Figuras S6A–S6G), lo que indica que β-catenina es necesaria para el efecto de ZDHHC5. A continuación, probamos directamente el requisito funcional de la palmitoilación en el sitio C466. La reconstitución de células HCT116 con CTNNB1 desactivado con β-catenina WT rescató completamente la muerte celular, lo que es consistente con la restauración de la resistencia a la ferroptosis (Figura 4A). En contraste, la reconstitución con la mutante C466A deficiente en palmitoilación proporcionó solo un rescate parcial (Figura 4A). Este fenotipo parcial sugirió que las células que expresan la mutante C466A retienen una mayor sensibilidad intrínseca a la ferroptosis. Para probar esto, evaluamos la eficacia protectora de la ferrostatin-1. Como se predijo, la ferrostatin-1 confirió una protección significativamente mayor en las células reconstituidas con C466A en comparación con los controles reconstituidos con WT (Figura 4B). Además, las células reconstituidas con C466A exhibieron consistentemente niveles más altos de ROS, lípidos ROS y 4-HNE que sus contrapartes reconstituidas con WT (Figura 4C). En conjunto, estos datos demuestran que la palmitoilación en C466 es esencial para que β-catenina confiera resistencia a la ferroptosis.

Habiendo establecido que la palmitoilación de β-catenina en C466 confiere resistencia a la ferroptosis, a continuación investigamos su mecanismo aguas abajo. Se sabe que la ferroptosis desencadena la liberación de la proteína de unión al cromo HMGB1, un importante DAMP y mediador inmunitario.^[36] De manera consistente, encontramos que las células HCT116 reconstituidas con la β-catenina C466A deficiente en palmitoilación liberaron significativamente más HMGB1 extracelular en comparación con las células reconstituidas con WT (Figura 4D). Esta mayor liberación se bloqueó mediante el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1 (Figura 4D), lo que confirma su dependencia de la muerte celular ferroptótica. Para identificar el objetivo transcripcional que media este efecto, realizamos análisis transcriptómicos integrados en múltiples modelos, incluidos los ratones con Zdhhc5 desactivado de forma específica en el epitelio intestinal, las células HCT116 con CTNNB1 desactivado y las células DLD1 con ZDHHC5 desactivado. La referencia cruzada con un conjunto de genes relacionados con la ferroptosis^[37] identificó consistentemente a SLC7A11, un inhibidor central de la ferroptosis, como el objetivo regulado a la baja (Figura 4E). Clínicamente, los niveles de proteína SLC7A11 se correlacionaron positivamente tanto con β-catenina como con ZDHHC5 en microarreglos de tejido de CCRC humano (TMA) (Figura 4F), un hallazgo corroborado por datos de transcriptómica espacial públicos^[38] (Figuras S7A–S7C). Funcionalmente, la inhibición de ZDHHC5 disminuyó la expresión de SLC7A11 de manera dependiente de β-catenina, y las células reconstituidas con C466A exhibieron niveles más bajos de SLC7A11 que las células reconstituidas con WT (Figuras S7D–S7F). El inhibidor transcripcional de β-catenina/TCF4, iCRT14, suprimió la expresión de SLC7A11 en las células reconstituidas con WT, pero no en las células reconstituidas con C466A (Figuras 4G y S7G), lo que vincula directamente la palmitoilación de C466 con la transactivación de SLC7A11 dependiente de β-catenina.

Mecanísticamente, identificamos dos elementos de unión a β-catenina/TCF4 conservados en el promotor de SLC7A11 (Figura 4H). Los ensayos de reportero de luciferasa y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina confirmaron que la β-catenina WT, pero no la mutante C466A, se une a estos sitios (Figuras 4I, 4J y S7H), lo que demuestra que la palmitoilación de C466 es necesaria para la ocupación del promotor. Para probar la relevancia in vivo y la necesidad de este mecanismo dependiente de SLC7A11, establecimos modelos de xenoinjerto derivados de HCT116. La inhibición de SLC7A11 inhibióPotentemente el crecimiento tumoral y aumentó los niveles de HMGB1 en plasma en los tumores reconstituidos con WT, pero tuvo un efecto mínimo en los tumores reconstituidos con C466A (Figuras 4K–4N). En conjunto, estos datos demuestran que la palmitoilación de β-catenina en C466 impulsa la transcripción de SLC7A11 al facilitar su unión al promotor, estableciendo así una vía molecular que confiere resistencia a la ferroptosis inmunogénica y promueve el crecimiento tumoral.

La palmitoilación de β-catenina en C466 coordina un programa inmunosupresor al conferir resistencia a la ferroptosis inmunogénica y aumentar la expresión de PD-L1

Para definir la función inmunosupresora del eje ZDHHC5-β-catenina, nos centramos en PD-L1 como un candidato efector principal. Este enfoque se basó en informes establecidos de que el complejo β-catenina/TCF puede regular al alza la expresión de PD-L1 a nivel transcripcional,^[22],^[39], junto con nuestro hallazgo de que la palmitoilación de C466 amplifica la actividad transcripcional de β-catenina. Por lo tanto, primero examinamos la asociación de este eje con PD-L1 y el contexto inmunitario. El análisis de los datos de The Cancer Genome Atlas de adenocarcinoma de colon reveló correlaciones positivas significativas entre la expresión de ZDHHC5 y PD-L1, así como entre CTNNB1 y PD-L1 (Figura S8A). Validamos y ampliamos estos hallazgos utilizando un conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula de CCRC, GSE132465. Este análisis confirmó una correlación positiva entre ZDHHC5 y PD-L1 e identificó además una correlación negativa significativa entre los niveles de ZDHHC5 y la infiltración de células T CD8+ (Figuras 5A–5C). Dada la función crítica de HMGB1, que se libera durante la ferroptosis, en la activación de las células dendríticas (DC) y la presentación de antígenos,^[21], hipotetizamos que ZDHHC5 elevado podría estar relacionado con una función alterada de las DC. De manera consistente con esto, la expresión de ZDHHC5 mostró una fuerte correlación negativa con los niveles de HLA-A en las DC asociadas al tumor, con una tendencia similar para otros genes HLA (Figuras 5D y S8B). Estos datos correlativos sitúan el eje ZDHHC5-β-catenina dentro de un contexto inmunosupresor que presenta una presentación de antígenos alterada y células T agotadas.

Para establecer una relación causal directa, realizamos experimentos de rescate funcional. La reconstitución de células HCT116 con CTNNB1 desactivado con β-catenina WT indujo significativamente la expresión de PD-L1 e inhibió la liberación extracelular de HMGB1 (Figura 5E). En contraste, la reconstitución con la mutante C466A deficiente en palmitoilación no logró provocar ninguna de estas respuestas (Figura 5E). La inhibición farmacológica de la señalización de β-catenina/TCF4 suprimió la transcripción de PD-L1 en las células reconstituidas con WT, pero no tuvo ningún efecto en las células reconstituidas con C466A (Figura 5F). Esto demuestra que la palmitoilación de C466 es esencial para la transactivación dependiente de β-catenina/TCF4 de PD-L1.

Nuestro modelo postula que la palmitoilación de β-catenina C466 confiere resistencia al suprimir simultáneamente la ferroptosis inmunogénica (limitando la liberación de HMGB1) y aumentar la expresión de PD-L1. Por lo tanto, preguntamos si estos dos brazos están funcionalmente integrados para conferir resistencia a la inmunoterapia in vivo. Implantamos células MC38 con Ctnnb1 desactivado, reconstituidas con β-catenina WT o C466A, con o sin la desactivación concurrente de Hmgb1, en ratones inmunocompetentes y los tratamos con anticuerpo anti-PD-L1. Los tumores que expresaban la mutante C466A (que libera HMGB1) exhibieron una sensibilidad significativamente mayor a la terapia anti-PD-L1 (Figuras 5G y 5H). Esta sensibilidad se asoció con niveles elevados de HMGB1 en plasma (Figura 5I). Fundamentalmente, el beneficio terapéutico del anti-PD-L1 se abolió por completo en los tumores con una deficiencia combinada de palmitoilación de β-catenina C466 y la desactivación de Hmgb1 (Figuras 5G y 5H). Este experimento de epistasis genética demuestra que la señal inmunogénica de la ferroptosis (liberación de HMGB1) es necesaria para liberar la eficacia del bloqueo de puntos de control (anti-PD-L1).

En conjunto, estos resultados demuestran que la palmitoilación de ZDHHC5-β-catenina en C466 impulsa la evasión inmune a través de un mecanismo unificado. Coordina la supresión de la ferroptosis inmunogénica (limitando la liberación de HMGB1) al tiempo que mejora la inhibición de las células T mediada por PD-L1. Nuestro hallazgo de una correlación negativa entre ZDHHC5 y la expresión de genes HLA en las DC, junto con el papel establecido de HMGB1 en la activación de las DC, apoya un modelo por el cual este eje también puede comprometer la presentación de antígenos. Fundamentalmente, nuestro experimento de epistasis in vivo confirma que estos dos brazos inmunosupresores son funcionalmente interdependientes; la señal inmunogénica HMGB1 es necesaria para liberar la eficacia del bloqueo de puntos de control, estableciendo así una formidable barrera para la inmunoterapia.

La deficiencia de ZDHHC5 revierte la inmunosupresión e inhibe la tumorigénesis colorrectal

Habiendo establecido mecánicamente que la palmitoilación de β-catenina C466 mediada por ZDHHC5 está relacionada con la transactivación de SLC7A11 y PD-L1, a continuación evaluamos la relevancia traslacional de este eje y validamos su función patogénica en modelos fisiológicos. Primero examinamos su asociación clínica. El ARNm de ZDHHC5 se sobreexpresó en los tejidos de CCRC, con los niveles más altos en los tumores de etapa avanzada (III/IV) (Figuras S9A y S9B). El análisis de TMA y los experimentos de Western blot confirmaron la sobreexpresión de la proteína ZDHHC5 en CCRC (Figuras 6A, S9C y S9D), lo que se correlacionó con un mayor volumen tumoral (Figura 6B). La alta expresión de ZDHHC5 predijo una peor supervivencia general (OS) y una supervivencia libre de recurrencia y libre de enfermedad en múltiples cohortes de CCRC (Figuras S9E–S9J). En particular, en una cohorte de pacientes tratados con inmunoterapia anti-PD-L1, la alta expresión de ZDHHC5 siguió asociada con una peor OS (Figura S9K). Esta observación clínica apoya nuestra hipótesis mecanicista de que ZDHHC5 impulsa un amplio programa inmunosupresor, que se extiende más allá de la regulación al alza de PD-L1 para incluir la supresión de la ferroptosis inmunogénica.

Para probar esto funcionalmente, desactivamos ZDHHC5 en las células de CCRC. Esto suprimió la proliferación e indujo los marcadores de ferroptosis: aumento de los lípidos ROS, la acumulación de 4-HNE y la liberación de HMGB1, fenotipos que se rescataron mediante la sobreexpresión de SLC7A11 (Figuras S10A–S10E), lo que confirma que SLC7A11 es un efector clave. En organoides derivados de pacientes, la desactivación de ZDHHC5 redujo el tamaño del organoide y aumentó el HMGB1 extracelular (Figuras 6C y 6D). De manera similar, en xenoinjertos derivados de HCT116, la desactivación de ZDHHC5 inhibió el crecimiento tumoral y promovió los marcadores de ferroptosis inmunogénica, y estos efectos se invirtieron mediante la sobreexpresión de SLC7A11 (Figuras S10F–S10J).

Luego preguntamos si el efecto terapéutico de la pérdida de ZDHHC5 depende de SLC7A11. En xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) (Figura 6E), la desactivación de ZDHHC5 suprimió significativamente el crecimiento tumoral y elevó los niveles de HMGB1 en plasma. Es importante destacar que este efecto fue específico de los PDX que exhibieron una alta expresión intrínseca de SLC7A11 y fue ausente en los modelos con baja expresión de este (Figuras 6F y S10K–S10N). Esto demuestra que la actividad de SLC7A11 es necesaria para el efecto antitumoral de la ablación de ZDHHC5.

Para evaluar el impacto fisiopatológico de la pérdida de ZDHHC5 en un contexto relevante para la enfermedad y inmunocompetente, utilizamos el modelo de CCRC asociado a colitis inducido por AOM/DSS. Tanto los ratones con desactivación condicional específica del epitelio intestinal (CKO) (Zdhhc5flox/flox; VillinCre+) como los ratones con desactivación de todo el cuerpo desarrollaron significativamente menos tumores y tumores más pequeños (Figuras 6G–6M y S11A–S11C). La lipidómica no dirigida reveló la acumulación de fosfolípidos de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) proferroptóticos^[40] en los tejidos del colon de los ratones CKO (Figura 6N), y los tumores exhibieron niveles elevados de lípidos ROS y 4-HNE, junto con una disminución de SLC7A11 (Figuras S11D y S11E). Sorprendentemente, la ablación de Zdhhc5 remodeló profundamente el microambiente inmunitario tumoral, reduciendo la expresión de PD-L1_ al tiempo que aumentaba la infiltración de células T CD8+ y el HMGB1 en plasma (Figuras S11E–S11G).

En conjunto, los estudios genéticos de pérdida de función en diversos modelos demuestran que el eje ZDHHC5-β-catenina es un impulsor crítico del CRC. Funciona al suprimir simultáneamente la fase de iniciación de la inmunidad antitumoral mediante la inhibición de la señal DAMP HMGB1, lo que perjudica la presentación de antígenos, e inhibiendo directamente la fase efectora a través de la supresión mediada por PD-L1 de las células T citotóxicas.

β-cat-oxazol, un inhibidor de primera clase de la interacción ZDHHC5-β-catenina, suprime la tumorigénesis colorrectal

Tras establecer el eje ZDHHC5-β-catenina como un impulsor crítico del CRC, exploramos a continuación su potencial terapéutico. En ausencia de inhibidores específicos de ZDHHC5, nuestro objetivo fue inhibir directamente la palmitoilación patogénica de β-catenina en C466 mediante la interrupción de la interacción ZDHHC5-β-catenina. Realizamos un cribado virtual basado en la estructura de 1,6 millones de compuestos, dirigido a la interfaz de interacción proteína-proteína ZDHHC5-β-catenina predicha que rodea a C466 (Figura 7A). De los 30 candidatos mejor clasificados, se adquirieron 26 análogos disponibles comercialmente para la validación biológica. Entre estos, β-cat-oxazol (denominado así por su estructura y novedad) potenció con mayor eficacia la sensibilidad de las células HCT116 a un inductor de la ferroptosis (Figuras 7B y 7C).

La caracterización biológica confirmó que β-cat-oxazol inducía la muerte celular de forma dependiente de β-catenina (Figura 7D), y esta muerte se revirtió mediante el inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1 (Figura 7E). El tratamiento también desencadenó la liberación extracelular de HMGB1, que también se bloqueó con ferrostatin-1 (Figura 7F), lo que confirmó la naturaleza inmunogénica de la muerte celular. Las simulaciones de dinámica molecular y el análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) revelaron que β-cat-oxazol se une de forma estable a β-catenina con alta afinidad (KD = 2,74 μM), formando interacciones críticas con residuos que incluyen Arg469, Lys508, Arg515, Glu568 y Glu571 (Figuras 7G y S12A-S12I). Es importante destacar que la mutación de estos residuos clave de β-catenina abolió la capacidad de β-cat-oxazol para inducir sus efectos pro-ferroptóticos, incluida la muerte celular y la elevación de 4-HNE, ROS lipídicos y HMGB1 extracelular (Figuras S12J-S12M). Funcionalmente, β-cat-oxazol interrumpió la interacción ZDHHC5-β-catenina de forma dependiente de la dosis y redujo los niveles de palmitoilación de β-catenina celular (Figuras 7H e 7I).

Una evaluación de seguridad exhaustiva mostró que β-cat-oxazol redujo selectivamente la viabilidad de las líneas celulares de CRC, pero no de la línea celular epitelial normal del colon NCM460 in vitro (Figuras S13A y S13B). En un estudio in vivo de dosis repetidas de 28 días, β-cat-oxazol (20 mg/kg) fue bien tolerado, sin cambios significativos en el peso corporal, la bioquímica sérica o la histopatología de los órganos principales (Figuras S13C-S13F).

A continuación, evaluamos la eficacia terapéutica de β-cat-oxazol in vivo. La evaluación inicial en un modelo tumoral MC38 subcutáneo en ratones inmunocompetentes demostró que el tratamiento con β-cat-oxazol inhibió eficazmente el crecimiento tumoral (Figuras S14A y S14B). Mecánicamente, los tumores de los ratones tratados mostraron una modulación de la vía objetivo, incluida la disminución de SLC7A11 y PD-L1, el aumento de los marcadores de ferroptosis (ROS lipídicos, 4-HNE) y la inmunogenicidad (HMGB1) (Figuras S14C-S14G). Validamos aún más su eficacia en un modelo de CRC asociado a colitis inducido por AOM/DSS, más relevante para la enfermedad y en ratones inmunocompetentes. El tratamiento con β-cat-oxazol iniciado después del establecimiento del tumor redujo significativamente la carga tumoral (Figuras 7J-7M). De forma consistente, los tumores de los ratones tratados recapitularon el mismo patrón de disminución concurrente de SLC7A11 y PD-L1, aumento de la ferroptosis (4-HNE) y el marcador inmunogénico (HMGB1), y aumento de la infiltración de células T CD8+ (Figuras 7N y S14H-S14K).

En conjunto, estos datos identifican a β-cat-oxazol como un inhibidor de primera clase y de prueba de concepto que se dirige directamente al interruptor de palmitoilación de β-catenina. Al interrumpir la interacción ZDHHC5-β-catenina, β-cat-oxazol imita la ablación genética de este eje, reactivando sincrónicamente la ferroptosis inmunogénica y aboliendo la evasión inmune mediada por PD-L1 para suprimir la progresión del CRC.

Discusión

Este estudio identifica a ZDHHC5 como la palmitoiltransferasa de β-catenina en C466 en el CRC y describe el programa inmunosupresor coordinado gobernado por esta modificación. Demostramos que la palmitoilación de β-catenina en C466 catalizada por ZDHHC5 establece un nodo regulador central, que integra las principales vías de resistencia de la ferroptosis inmunogénica y la evasión inmune.

Nuestros hallazgos revelan una interacción competitiva entre las modificaciones postraduccionales (PTM) en β-catenina C466, donde la palmitoilación actúa como un interruptor molecular determinante al desplazar la S-nitrosilación inhibidora. Esto mejora la formación y la actividad transcripcional del complejo β-catenina/TCF4. Este trabajo cambia el paradigma de considerar las PTM como eventos aislados a comprender su competencia dinámica como un interruptor binario que reprograma a β-catenina de un impulsor proliferativo canónico a un factor de transcripción inmunomodulador.

Es importante destacar que este interruptor de palmitoilación dirige a β-catenina hacia un programa transcripcional, que regula de forma coordinada SLC7A11 para suprimir la ferroptosis inmunogénica y PD-L1 para inhibir las células T citotóxicas. Nuestro experimento de epistasis in vivo confirma que estos dos brazos están funcionalmente integrados; la liberación de HMGB1 es necesaria para desbloquear la eficacia del bloqueo de PD-L1. Por lo tanto, el eje ZDHHC5-β-catenina orquesta una estrategia inmunosupresora de doble impacto, que perjudica tanto la fase de iniciación como la fase efectora del ciclo de inmunidad contra el cáncer.

Nuestra descripción del papel patogénico del eje ZDHHC5-β-catenina sugiere la consideración de sus funciones fisiológicas. ZDHHC5 se expresa ampliamente y regula procesos fundamentales como la plasticidad sináptica.^[41],^[42],^[43],^[44] La ausencia de defectos graves en el desarrollo en nuestros modelos de Zdhhc5-knockout probablemente refleja la redundancia funcional dentro de la familia ZDHHC en condiciones fisiológicas. En marcado contraste, dentro del entorno patológico y hiperactivo de la señalización Wnt/β-catenina del CRC, la palmitoilación de β-catenina en C466 mediada por ZDHHC5 se convierte en una dependencia crítica y no redundante para la evasión inmune. Esta divergencia entre la redundancia fisiológica y la esencialidad patológica subraya una ventana terapéutica potencialmente amplia para la intervención dirigida.

La conservación evolutiva de este interruptor regulador implica una función homeostática fundamental, probablemente implicada durante la reparación de tejidos y la resolución de la inflamación para establecer transitoriamente un nicho protector. Las células tumorales colorrectales parecen haber secuestrado y activado constitutivamente este programa transitorio, reutilizándolo para una evasión inmune sostenida.

El desarrollo de β-cat-oxazol, un inhibidor de primera clase que interrumpe la interacción ZDHHC5-β-catenina, proporciona una prueba de concepto para dirigir las interfaces de proteínas que gobiernan las PTM. A diferencia de los inhibidores catalíticos amplios,^[45],^[46] esta estrategia selectiva para el sustrato puede minimizar los efectos fuera del objetivo. Clínicamente, una alta expresión de ZDHHC5 predice una mala supervivencia y resistencia a la terapia anti-PD-L1. Nuestros modelos PDX indican además que los tumores con alta SLC7A11 (indicativo de una señalización activa del interruptor de palmitoilación) son los más vulnerables a la inhibición de este eje, lo que proporciona una base mecánica para la estratificación de pacientes.

En resumen, al dilucidar un interruptor de palmitoilación de β-catenina que se puede administrar y que regula de forma coordinada la supresión de la señalización inmunogénica de la ferroptosis (en particular, la liberación de HMGB1) al tiempo que modula el punto de control inmunitario adaptativo PD-L1, nuestros hallazgos proponen que la focalización de las interfaces de PTM es una estrategia transformadora en la oncología de precisión.

Limitaciones del estudio

Si bien nuestros estudios de pérdida de función y el fenotipo específico inducido por β-cat-oxazol establecen de forma sólida que la palmitoilación de β-catenina C466 es la vía predominante que media en los fenotipos descritos, varias limitaciones señalan futuras direcciones. Primero, aunque nuestros datos funcionales respaldan firmemente la interacción ZDHHC5-β-catenina, ZDHHC5 es una proteína integral de la membrana. Nuestro modelado computacional, aunque predictivo, no tiene en cuenta completamente la posible influencia del entorno lipídico nativo de la membrana en la geometría de la interacción. En segundo lugar, una comprensión exhaustiva de la red reguladora ascendente que controla la actividad de ZDHHC5 y su repertorio completo de sustratos en el CRC sigue siendo un área importante para futuras investigaciones. En tercer lugar, la elaboración de perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos definitivos de β-cat-oxazol será crucial para su desarrollo traslacional. En cuarto lugar, si bien nuestras cohortes incluyeron ambos sexos, el estudio no fue diseñado para analizar la influencia del sexo (atributo biológico) o el género (constructo sociocultural) en la vía del interruptor de palmitoilación y su papel en la evasión inmune. Se necesitan estudios dedicados en el futuro para abordar esto. Por último, los estudios futuros también deberían explorar la generalidad de este mecanismo en otros cánceres impulsados por β-catenina y evaluar las terapias de combinación con inhibidores de PD-1/PD-L1.

Limitaciones del estudio

Si bien nuestros estudios de pérdida de función y el fenotipo específico inducido por β-cat-oxazol establecen de forma sólida que la palmitoilación de β-catenina C466 es la vía predominante que media en los fenotipos descritos, varias limitaciones señalan futuras direcciones. Primero, aunque nuestros datos funcionales respaldan firmemente la interacción ZDHHC5-β-catenina, ZDHHC5 es una proteína integral de la membrana. Nuestro modelado computacional, aunque predictivo, no tiene en cuenta completamente la posible influencia del entorno lipídico nativo de la membrana en la geometría de la interacción. En segundo lugar, una comprensión exhaustiva de la red reguladora ascendente que controla la actividad de ZDHHC5 y su repertorio completo de sustratos en el CRC sigue siendo un área importante para futuras investigaciones. En tercer lugar, la elaboración de perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos definitivos de β-cat-oxazol será crucial para su desarrollo traslacional. En cuarto lugar, si bien nuestras cohortes incluyeron ambos sexos, el estudio no fue diseñado para analizar la influencia del sexo (atributo biológico) o el género (constructo sociocultural) en la vía del interruptor de palmitoilación y su papel en la evasión inmune. Se necesitan estudios dedicados en el futuro para abordar esto. Por último, los estudios futuros también deberían explorar la generalidad de este mecanismo en otros cánceres impulsados por β-catenina y evaluar las terapias de combinación con inhibidores de PD-1/PD-L1.

Disponibilidad de recursos

Contacto principal

Se puede solicitar información adicional y recursos y reactivos a través del contacto principal, Ping Lan (lanping@mail.sysu.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó materiales o reactivos nuevos y únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio están disponibles públicamente en el Archivo de secuencias de la base de datos del NCBI (SRA) bajo el número de acceso del proyecto BioProject PRJNA1348236. Los datos transcriptómicos y clínicos utilizados en este estudio están disponibles públicamente en los siguientes recursos: los casos de CRC en el sitio web de TIMER (https://compbio.cn/timer1/), TNMplot (https://tnmplot.com/analysis/) y el sitio web de GENT (http://gent2.appex.kr/gent2/). Se puede acceder a datos adicionales desde la base de datos GEO bajo los números de acceso GSE17537, GSE29623 y GSE132465. Los datos de transcriptómica espacial públicos están disponibles en el estudio de Wu et al.^[38]•Este artículo no informa sobre código original.•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos que se informan en este artículo está disponible a través del contacto principal a petición.

Contacto principal

Se puede solicitar información adicional y recursos y reactivos a través del contacto principal, Ping Lan (lanping@mail.sysu.edu.cn).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó materiales o reactivos nuevos y únicos.

Disponibilidad de datos y código

•Los datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) generados en este estudio están disponibles públicamente en el NCBI Sequence Read Archive (SRA) bajo el número de acceso BioProject PRJNA1348236. Los datos transcriptómicos y clínicos utilizados en este estudio están disponibles públicamente en los siguientes recursos: los casos de CRC en el sitio web de TIMER (https://compbio.cn/timer1/), TNMplot (https://tnmplot.com/analysis/) y el sitio web de GENT (http://gent2.appex.kr/gent2/). Se pueden acceder a datos adicionales desde la base de datos GEO bajo los números de acceso GSE17537, GSE29623 y GSE132465. Los datos de transcriptómica espacial públicos están disponibles en el estudio de Wu et al.^[38]•Este artículo no presenta código original.•Cualquier información adicional necesaria para volver a analizar los datos presentados en este artículo está disponible a petición del investigador principal.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82573793), la Fundación de Investigación Médica de Shenzhen (A2503028), el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JCYJ20240813151114019 y szbo202313) y la Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (2024A1515013221).

Contribuciones de los autores

Q.Z. inició todo el estudio. P.L., Z.H., G.T. y Q.Z. supervisaron el proyecto. Q.Z. diseñó y realizó todos los experimentos y análisis relacionados, y redactó el manuscrito. Y.K. y Y.L. realizaron la mayoría de los experimentos y análisis relacionados. X.L., L.W., Z.L., X.Y., Y.X., D.L., W.Y., X.C. y Y.S. diseñaron y realizaron la construcción de plásmidos y la mayoría de los experimentos con animales, y recopilaron y analizaron los datos. Q.Y. realizó el análisis de la estructura de las proteínas, el cribado virtual y el análisis de la dinámica molecular. K.C. diseñó y realizó los análisis de scRNA-seq y transcriptómica espacial, y contribuyó a la finalización de la figura resumen. J.Y. proporcionó la matriz de tejidos de CRC y asistencia técnica con los experimentos con animales. Todos los autores discutieron los resultados.

Declaración de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Métodos STAR

Tabla de recursos clave

Detalles del modelo experimental y de los participantes del estudio

Sujetos humanos

Diez pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes se seleccionaron consecutivamente de nuestro biobanco en función de la disponibilidad de las muestras y la integridad del ARN, y se asignaron como una única cohorte para la comparación del nivel de palmitoilación entre los tejidos tumorales y normales. Se construyó una matriz de tejidos a partir de 237 pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes. Esta cohorte se utilizó en su conjunto para evaluar las correlaciones de la expresión de proteínas y las asociaciones clínicas. Se seleccionaron cinco pares de muestras frescas de CRC en función de la disponibilidad y viabilidad del tejido para la implantación. Primero, se analizaron mediante Western blot para la expresión de SLC7A11. En función de los resultados, se asignaron a dos grupos experimentales: un grupo con alta expresión de SLC7A11 y un grupo con baja expresión de SLC7A11, para el posterior establecimiento del modelo PDX y los estudios in vivo. Todas las muestras se obtuvieron del Sexto Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen. Se proporcionan características clínicas detalladas para cada cohorte en las tablas S1, S2 y S3.

Estudios con animales

Los ratones Zdhhc5flox/flox y VillinCre se compraron a Cyagen (Suzhou, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd. Los ratones se alojaron en grupos de 4 a 5 en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) dentro de jaulas de microaislamiento en el Centro de Animales Experimentales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd.

Los ratones Zdhhc5flox/flox se cruzaron con ratones VillinCre para generar ratones con knockout específico de intestino (Zdhhc5 CKO; Zdhhc5flox/flox;VillinCre+), con sus hermanos de camada Zdhhc5flox/flox;VillinCre- sirviendo como controles WT. Para el modelo de knockout global de Zdhhc5, se logró la cría sostenida de la colonia cruzando ratones Zdhhc5+/−. Se empleó esta estrategia porque el knockout homocigoto global da como resultado infertilidad masculina,^[47] lo que impide el establecimiento de una pareja de cría entre individuos homocigotos. Se observó herencia mendeliana en la descendencia de los cruces heterocigotos, lo que dio como resultado hermanos de camada Zdhhc5−/−, Zdhhc5+/− y WT para los experimentos. El genotipado se realizó mediante análisis de PCR del ADN de la cola utilizando cebadores específicos para los alelos Zdhhc5 floxed y Villin-Cre.

Para el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se inyectaron seis ratones hembra BALB/c nude de seis semanas de edad por vía subcutánea con 5×106 células HCT116 resuspendidas en 100 μL de PBS. Los tumores se recolectaron 30 días después de la inyección para los experimentos posteriores. Además, se inyectaron 1 × 106 células MC38 resuspendidas en 100 μL de PBS por vía subcutánea en ratones C57BL/6 WT. Para el tratamiento anti-PD-L1, los tumores recibieron 100 μg de anti-PD-L1 en los días 14 y 18. Para el tratamiento con β-cat-Oxazole, se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal con 20 mg/kg de β-cat-Oxazole cada 3 días, durante un total de 5 dosis. Los volúmenes tumorales se midieron utilizando la fórmula: V (mm3) = a×b2/2, donde a representa la longitud y b representa el ancho.

Para los modelos PDX, los tejidos tumorales de pacientes con CRC se trasplantaron por vía subcutánea en ratones hembra BALB/c nude de seis semanas de edad. Tras el crecimiento del tumor, los tumores subcutáneos se extirparon, se disociaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm y se reimplantaron en nuevos ratones BALB/c nude. Una semana después del trasplante, los ratones con tumores de tamaño comparable (que oscilan entre 50 y 100 mm3) se asignaron aleatoriamente a dos grupos. Para mantener el silenciamiento génico mediado por lentivirus durante todo el experimento, los ratones recibieron inyecciones intratumorales, administradas en múltiples sitios para mejorar la distribución, de lentivirus que expresaban un control o shZDHHC5 cada dos días, durante un total de 10 inyecciones. Se empleó este protocolo de múltiples inyecciones para contrarrestar la naturaleza transitoria de la transducción lentiviral in vivo y garantizar una supresión persistente del objetivo. Los volúmenes tumorales y el análisis inmunohistoquímico se realizaron en el día 28. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la misma fórmula que se describió anteriormente.

Para el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad con 10 mg/kg de AOM (Sigma-Aldrich). Después de 7 días, se administró a los ratones agua para beber que contenía un 2,5% de DSS (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) durante una semana, seguida de agua para beber normal durante 2 semanas. Este ciclo se repitió con un 2,5% de DSS durante otra semana, y los ratones se sacrificaron en el día 120. Para el tratamiento con β-cat-Oxazole, después de la tercera ronda de administración de DSS, se inyectaron los ratones por vía intraperitoneal con 20 mg/kg de β-cat-Oxazole cada 3 días, durante un total de 8 dosis. Luego, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tejidos tumorales del colon para el análisis posterior.

Cultivo celular

Las líneas celulares humanas (HCT116, DLD1, HEK293T) se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC) y se autenticaron mediante el perfilado STR. Todas las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma. Estas células se cultivaron en medio DMEM (Gibco, NY, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (Gibco, NY, EE. UU.) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, CA, EE. UU.), mantenidas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.

Cultivo de organoides

Los organoides se cultivaron siguiendo un protocolo establecido previamente.^[48] Brevemente, las células epiteliales tumorales intestinales humanas se mantuvieron en medio DMEM/F12 avanzado suplementado con factores de crecimiento, incluido 100 ng/mL de Noggin (Peprotech), 500 ng/mL de R-spondin (Peprotech), 50 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (Peprotech) y 10 μM de Y-27632 (Abmole). Los PDO se infectaron posteriormente con lentivirus que expresaban shZDHHC5. Después de la infección, se fotografiaron los PDO y se midieron sus diámetros.

Detalles del método

Análisis de MS

Las células HEK293T transfectadas con plásmidos Flag-β-catenina o Flag-ZDHHC5 se lisaron y se inmunoprecipitaron utilizando agarosa anti-Flag. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y la tinción con azul de Coomassie, las bandas de proteínas se excindieron, se sometieron a digestión de tripsina en gel y se secaron. La composición de las proteínas se analizó posteriormente mediante MS según se describió anteriormente.^[49]

Líneas celulares estables

La producción y transducción de lentivirus se realizaron según se describió anteriormente.^[50] Brevemente, los vectores lentivirales que contenían los constructos objetivo se empaquetaron en células HEK293T. Las células tumorales se infectaron posteriormente con los lentivirus en presencia de polibreno. Las células infectadas se seleccionaron con 1 μg/mL de puromicina durante dos semanas para establecer clones estables. La expresión de las proteínas objetivo en estos clones se confirmó mediante análisis de Western blot.

Inmunoprecipitación y análisis de inmunoblot

La inmunoprecipitación y los análisis de inmunoblot se realizaron según se describió anteriormente.^[50] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos deseados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis. Para la inmunoprecipitación, las cuentas de agarosa anti-Flag o anti-HA se lavaron tres veces con 1 mL de tampón de lisis antes de incubarse con 1 mL de lisado celular durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se centrifugaron las cuentas y se descartó el sobrenadante. Las cuentas se lavaron tres veces, se resuspendieron en 2× tampón de muestra SDS y se hirvieron durante 10 minutos. Las muestras resultantes se analizaron mediante inmunoblot utilizando los anticuerpos apropiados.

RT-qPCR cuantitativa en tiempo real

La RT-qPCR se realizó según se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se extrajo el ARN total de las células o tejidos, seguido de la transcripción inversa para generar ADN complementario (cDNA). El cDNA se sometió posteriormente a qPCR utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) y protocolos estándar. Las secuencias de los cebadores para qPCR se proporcionan en la tabla S4. Se utilizó GAPDH como control interno para normalizar los datos.

Análisis del promotor

La secuencia del promotor del gen humano SLC7A11 se obtuvo del Navegador del Genoma UCSC. Específicamente, nos centramos en aproximadamente 2000 pares de bases aguas arriba de la región codificante ATG. Utilizando herramientas bioinformáticas, realizamos una alineación de secuencias del promotor de SLC7A11 recuperado con motivos de unión conocidos de β-catenina/TCF4 documentados en la literatura. La secuencia de consenso para el complejo β-catenina/TCF4 se describe como (-CTTTGA/TA/T-).^[48]

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó según un protocolo establecido previamente.^[10] Brevemente, las células se reticularon in situ con formaldehído al 1% durante 10 minutos, seguido de la desactivación con 0,125 M de glicina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se lisaron en tampón de lisis SDS y el ADN de la cromatina se fragmentó mediante sonicación a un tamaño de entre 200 y 1000 pares de bases. El sobrenadante se diluyó 10 veces en tampón de dilución de ChIP y se preclarificó con 50 μL de cuentas de agarosa durante 2 horas a 4 °C. Al día siguiente, se centrifugó para recoger el sobrenadante y se descartó. Se añadieron anticuerpos específicos (3 μg) y la mezcla se rotó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 50 μL de cuentas de agarosa y se incubó durante otras 2 horas a 4 °C. Finalmente, el ADN desreticulado se analizó mediante qPCR utilizando cebadores específicos enumerados en la tabla S4.

Ensayo de reportero de luciferasa

El ensayo de reportero de luciferasa se realizó según se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se transfectaron en triplicado 0,3 μg del vector pGL3 que expresaba TRE o el mutante indicado, junto con 50 ng del reportero de luciferasa Renilla, en células HEK293T. Después de 36 horas, se midió la actividad de la luciferasa utilizando el sistema de ensayo de reportero de luciferasa dual. La actividad de Renilla se utilizó como control interno para la normalización.

Análisis inmunohistoquímico (IHC)

Las muestras de CRC se fijaron y se incluyeron en parafina según los protocolos estándar. Se realizó el análisis de inmunohistoquímica (IHQ) utilizando anticuerpos contra la proteína indicada. Los resultados de la tinción se evaluaron en función tanto de la intensidad como de la proporción de células tumorales que mostraban una reacción positiva. La intensidad de la tinción se puntuó de la siguiente manera: 0 para negativo, 1 para débil, 2 para moderado y 3 para fuerte. La frecuencia de células positivas se puntuó como: 0 para 75 %. La puntuación total, que oscila entre 0 y 12, se calculó multiplicando la puntuación de intensidad por la puntuación del porcentaje de células positivas.

Análisis de inmunofluorescencia

El análisis de inmunofluorescencia se realizó según el protocolo del fabricante (PANOVUE, Pekín, China). Brevemente, las células sembradas en portaobjetos de vidrio se fijaron con un 4 % de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA), se permeabilizaron con un 0,5 % de Triton X-100 durante 15 minutos a TA y se bloquearon con un 5 % de suero bovino fetal. Los anticuerpos primarios, diluidos en el tampón de bloqueo, se aplicaron durante la noche a 4 °C. Después del lavado con el tampón TBST, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 10 minutos a TA. Tras lavados adicionales con el tampón TBST, se realizó la amplificación de la señal de tiramida (TSA) utilizando colorantes fluorescentes (PPD570 y PPD650) según las instrucciones del fabricante (Panorama, China). Los núcleos se contrateñeron con DAPI y se adquirieron las imágenes utilizando un microscopio confocal de barrido láser.

Medición de los niveles de ROS y de lípidos ROS

Los lípidos ROS, un subconjunto de los ROS, son características bien establecidas de la ferroptosis.^[51] Los niveles de ROS se midieron utilizando un kit ELISA para ROS adquirido de AIDISHENG (Jiangsu, China), siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, la sonda DCFH-DA se diluyó 1:1000 en un medio libre de suero hasta una concentración final de 10 μM. Después de retirar el medio de cultivo celular, se añadió la sonda DCFH-DA diluida para garantizar una cobertura suficiente de las células, con al menos 1 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las células se incubaron con el donante de hidrógeno durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, se aspiró el medio y las células se lavaron suavemente con un medio libre de suero hasta que casi toda la capa celular se desprendiera. La suspensión celular se recogió en un tubo de centrífuga de 1,5 mL, se lavó dos veces para eliminar la sonda que no había penetrado y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en PBS. Los niveles de ROS se midieron utilizando un lector de microplacas con excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. Para la detección de lípidos ROS, las células de CRC se sembraron en una placa de 6 pocillos, se lavaron dos veces con solución salina tamponada de Hank (Gibco) y se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 30 minutos con 10 μmol/L de sonda BODIPY C11 (Thermo Fisher Scientific). Después de la tinción, las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Detección de 4-HNE

Los niveles de 4-HNE se midieron utilizando un kit ELISA para 4-HNE adquirido de Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd., siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, se recogieron 1 × 106 células, se resuspendieron en PBS (pH 7,2–7,4) y se rompieron mediante sonicación para liberar el contenido intracelular. Los lisados celulares se centrifugaron a 3000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, se añadieron 50 μL del sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4-HNE y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación con el anticuerpo anti-4-HNE y el anticuerpo secundario-HRP, se añadió la solución de sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm.

Determinación de la liberación de HMGB1 en sobrenadantes de cultivos celulares

La concentración de HMGB1 en los sobrenadantes de los cultivos celulares se midió utilizando un kit ELISA comercial. Brevemente, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 1000 × g durante 20 minutos a 2–8 °C para eliminar los residuos. Los sobrenadantes clarificados se analizaron inmediatamente o se almacenaron a −80 °C. Se realizó un ELISA tipo sándwich añadiendo 50 μL de estándares o muestras a la microplaca recubierta con anticuerpos. Después de añadir 100 μL del anticuerpo de detección conjugado con HRP, la placa se incubó durante 60 minutos a 37 °C. Tras cuatro lavados con el tampón de lavado, se añadieron 50 μL de los sustratos A y B, seguido de una incubación de 15 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo con 50 μL de la solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm. La concentración de HMGB1 se calculó a partir de la curva estándar.

Medición de los niveles de HMGB1 en plasma

Se recogió sangre de ratones experimentales en tubos con EDTA o heparina, se centrifugó a 1000 × g durante 15 minutos a 4 °C en un plazo de 30 minutos tras la recolección. El plasma se recogió cuidadosamente, se dividió en alícuotas y se almacenó a −80 °C, evitando ciclos repetidos de congelación y descongelación. Para el modelo de xenoinjerto derivado de HCT116, el HMGB1 plasmático se midió utilizando un kit ELISA para HMGB1 humano; para el xenoinjerto derivado de MC38 y el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se utilizó un kit ELISA para HMGB1 de ratón. El ensayo se realizó de la siguiente manera: los componentes del kit ELISA se equilibraron a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 50 μL de solución estándar (pocillos estándar), muestras de plasma (pocillos de muestra) y diluyente de muestra (pocillos en blanco) a la placa. A continuación, se añadió 100 μL de anticuerpo conjugado con enzimas a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 60 minutos. Tras la incubación, se descartó el líquido y los pocillos se lavaron cinco veces con tampón de lavado y se secaron sobre papel absorbente. Se añadieron sustratos A y B (50 μL cada uno) a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C en la oscuridad durante 15 minutos para el desarrollo del color. La reacción se detuvo añadiendo 50 μL de solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm en un plazo de 15 minutos utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de HMGB1 se calcularon trazando el logaritmo de las concentraciones estándar (eje X) frente a los valores de OD correspondientes (eje Y) y utilizando la curva estándar resultante.

Secuenciación de ARN

Se aisló ARN total de 1 × 107 células DLD1, HCT116 o de 200 mg de tejido de colon de ratón utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (TransGen Biotech). Se construyeron bibliotecas de ARN por Majorbio (Shanghái, China) y se secuenciaron en la plataforma Illumina NovaSeq. Los datos brutos de la secuenciación de ARN se evaluaron y se controló la calidad utilizando el software FASTQC (v0.11.9). A continuación, los datos se alinearon con el genoma GRCm39 o GRCh38 utilizando HISAT2 (v2.2.1) y se calcularon los recuentos de genes con FeatureCounts (v1.28.1).

Lipidómica no dirigida

METWARE (Wuhan, China) realizó una lipidómica no dirigida utilizando ocho muestras de tejido de colon de tres ratones WT y cinco ratones CKO. Brevemente, las muestras se homogeneizaron con un molino de bolas (MM400, Retsch) y se analizaron en un sistema de espectrometría de masas UPLC–QTRAP 6500+ ExionLC AD (SCIEX) acoplado a una columna Thermo Accucore C30. Se realizó una elución en gradiente utilizando mezclas de acetonitrilo/agua y acetonitrilo/isopropanol que contenían un 0,1 % de ácido fórmico y 10 mM de formiato de amonio. La espectrometría de masas se realizó con una fuente de ionización por electrospray (ESI) a 500 °C; el voltaje de pulverización de iones se fijó en 5500 V en modo positivo y en −4500 V en modo negativo. Los gases de la fuente se fijaron de la siguiente manera: GS1 45 psi, GS2 55 psi, gas de cortina (CUR) 35 psi; la disociación activada por colisión (CAD) se fijó en Medio. En el triple cuádrupolo, cada par de iones se monitorizó utilizando un potencial de desactivación (DP) y una energía de colisión (CE) optimizados. La identificación de lípidos se basó en una base de datos MWDB personalizada y la cuantificación se realizó en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM) utilizando el espectrómetro de masas de triple cuádrupolo.

Ensayos de palmitoilación

La palmitoilación de proteínas se detectó utilizando el método ABE.^[52] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos indicados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis que contenía 50 mM de NEM, seguido de la centrifugación (20 min, 12 000 rpm, 4 °C) y la inmunoprecipitación durante la noche con perlas de agarosa anti-Flag o específicas para β-catenina. Después de tres lavados, los precipitados se dividieron en dos porciones iguales: una para el control –HAM y la otra para el tratamiento +HAM, que se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los precipitados se lavaron una vez con tampón de lavado (1 M de Tris-HCl, pH 6,5) y se incubaron con tampón BMCC-biotina (50 mM de Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 % de Triton X-100 y 5 μM de BMCC-biotina) durante 1 h a 4 °C. Las muestras se lavaron dos veces con tampón de lavado, seguido de SDS-PAGE y tinción. La β-catenina palmitoilada se detectó utilizando estreptavidina conjugada con HRP (Sangon Biotech; 1:200 en 0,5 % de BSA).

Ensayo de S-nitrosilación

La S-nitrosilación se detectó utilizando el ensayo de conmutación de biotina.^[13],^[53] Brevemente, los lisados de las células HCT116 o HEK293T transfectadas se incubaron en tampón HENS (250 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 0,1 mM de neocuprina, 2 % de SDS, pH 7,7) con 20 mM de S-metilmetanotiosulfonato (MMTS) a 50 °C durante 20 minutos para bloquear las cisteínas libres. Las proteínas se precipitaron con acetona fría, se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón HENS (1 % de SDS) y se incubaron con 0,4 mM de biotina-HPDP y 5 mM de ascorbato de sodio a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. Las proteínas biotiniladas se purificaron utilizando perlas de estreptavidina-agarosa, se separaron por SDS-PAGE y se detectaron mediante inmunoblot.

Análisis SPR

El análisis SPR se realizó utilizando el sistema Biacore 8K (Cytiva) para evaluar la afinidad de unión de β-cat-Oxazol a la β-catenina. Los chips CM5 se activaron con N-hidroxisuccinimida y 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida metyoduro (EDC), seguido de la inmovilización de β-catenina purificada (50 μg/mL en acetato de sodio, pH 5,0). La superficie se bloqueó con etanolamina para evitar la unión inespecífica. Se inyectaron concentraciones graduadas de β-cat-Oxazol sobre la proteína inmovilizada a un caudal de 30 μL/min en un tampón de funcionamiento que contenía un 0,05 % de Tween 20 en PBS. Los datos SPR se recogieron y se analizaron utilizando el software de evaluación Biacore Insight (Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.).

Análisis transcriptómico integrado

Los datos de secuenciación de ARN de ratones con deleción específica de Zdhhc5 en el epitelio intestinal, células HCT116 con deleción de CTNNB1 y células DLD1 con reducción de ZDHHC5 se analizaron por separado. Se identificaron los genes expresados diferencialmente (DEG) con un umbral de |log2 fold change (FC)| > 1 y p < 0,05. A continuación, se cruzaron las listas de DEG significativamente reducidos de cada modelo con un conjunto de genes relacionados con la ferroptosis publicado^[37] para identificar los posibles objetivos comunes.

Análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) y análisis de transcriptómica espacial

Se recuperó el conjunto de datos de scRNA-seq de CRC GSE132465 y los metadatos de las células de un estudio anterior.^[54] El conjunto de datos de transcriptómica espacial de CRC se obtuvo de otro estudio.^[38] El procesamiento y la visualización de los datos de scRNA-seq y transcriptómica espacial se realizaron siguiendo las metodologías descritas en nuestra publicación anterior.^[55]

Análisis de modelado atómico

(i) Predicción de la estructura proteica 3D: Las complejas estructuras de ZDHHC5 y β-catenina se predijeron utilizando el programa multímero AlphaFold3.^[56] Se seleccionó la conformación con la puntuación de confianza más alta para la posterior simulación y análisis de dinámica molecular. (ii) Simulaciones de dinámica molecular: Se utilizó el paquete GROMACS (versión 2023.03; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352711015000059) para realizar simulaciones de dinámica molecular convencionales, con el objetivo de investigar los cambios conformacionales en el complejo ZDHHC5-β-catenina. Se empleó el campo de fuerza Amber14sb^[57] para la parametrización de proteínas, y el modelo de agua TIP3P (https://www.scopus.com/pages/publications/0004016501) se utilizó para la representación del disolvente. El complejo ZDHHC5-β-catenina se solvató en una caja de agua octaédrica, y la carga del sistema se neutralizó añadiendo 0,150 M de NaCl. Inicialmente, se realizó la minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado durante 50.000 pasos para aliviar las colisiones estéricas. Posteriormente, se aplicaron restricciones posicionales a los átomos pesados durante 50.000 pasos de las fases de equilibrio NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura). La temperatura del sistema se mantuvo a 300 K, y la presión se mantuvo a 1 bar. Tras el equilibrio, se realizó una simulación de producción sin restricciones de 100 ns, con coordenadas de trayectoria y parámetros de energía guardados cada 20 ps. Los patrones de interacción y las trayectorias dinámicas se visualizaron y analizaron utilizando ChimeraX.^[58] (iii) Cálculos de energía libre y descomposición de residuos: El método MM-GBSA^[59] se utiliza ampliamente para estimar las energías libres de unión en la investigación de descubrimiento de fármacos. En este estudio, se realizaron cálculos de MM-GBSA utilizando gmxMMPBSA,^[60], una herramienta compatible con GROMACS para los análisis MM-PBSA/MM-GBSA. Para dilucidar la base molecular de las interacciones ZDHHC5-β-catenina, se utilizó además gmxMMPBSA para descomponer la energía libre de unión en contribuciones individuales de residuos.

Cribado virtual de alto rendimiento para inhibidores de ZDHHC5/β-catenina utilizando estructuras de complejos dinámicas y acoplamiento en cascada. (i) Preparación y preprocesamiento de la estructura de la proteína: Las estructuras proteicas iniciales se preprocesaron utilizando el Asistente de preparación de proteínas (Schrödinger). Este procedimiento incluyó la asignación de órdenes de enlace, la adición de átomos de hidrógeno faltantes y la optimización de las redes de enlaces de hidrógeno con PROPKArot a pH fisiológico de 7,0. Los posibles sitios de unión en la interfaz entre ZDHHC5 y β-catenina se predijeron utilizando el módulo SiteMap. Posteriormente, se generaron rejillas de acoplamiento con la herramienta de generación de rejillas de receptor en Glide. Se definió una caja cúbica delimitadora de 20 × 20 × 20 Å, centrada en el sitio de unión identificado, para servir como el marco espacial preciso para todos los cálculos de acoplamiento molecular posteriores. (ii) Preparación de la base de datos de moléculas pequeñas: La base de datos de cribado se obtuvo de ChemDiv (https://www.chemdiv.com/) y se procesó utilizando el módulo LigPrep de Schrödinger. Los pasos de preprocesamiento incluyeron la desalación, la adición de átomos de hidrógeno, la generación de posibles estados de ionización a un pH objetivo de 7,0 ± 2,0 utilizando Epik, la enumeración de tautómeros y estereoisómeros, y la minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS4. (iii) Cribado virtual: Se aplicó un filtro ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) inicial a las moléculas de la base de datos utilizando el módulo QuickProp de Schrödinger, reteniendo solo los compuestos que cumplían la regla de los cinco de Lipinski y no contenían grupos funcionales reactivos. A continuación, se realizó un cribado virtual de alto rendimiento (HTVS) utilizando Glide retain, con GlideScore (GScore) como función de puntuación principal. El 10% superior de los compuestos clasificados por la puntuación HTVS se retuvo para el posterior acoplamiento de precisión estándar (SP). A continuación, el 10% superior de los compuestos de la etapa de acoplamiento SP, que empleó la función de puntuación Glide SP más rigurosa, se sometió a un acoplamiento de precisión extra (XP). La etapa de acoplamiento XP aplicó la función de puntuación Glide XP, que impone penalizaciones más estrictas por la desolvatación y las colisiones estéricas. El 10% superior de los compuestos del acoplamiento XP se analizó aún más utilizando el módulo Prime MM-GBSA y el modelo de solvatación VSGB 2.0 para calcular las energías libres de unión. Basándose en las puntuaciones MM-GBSA, los 30 compuestos superiores se priorizaron para su adquisición y posterior validación experimental. (iiii) Análisis de la simulación de dinámica molecular: Para refinar la pose de unión del compuesto principal, β-cat-Oxazole, en complejo con β-catenina, se realizaron simulaciones de dinámica molecular utilizando Desmond. Se utilizó el campo de fuerza OPLS4 para la proteína y el ligando, con las moléculas de agua modeladas explícitamente utilizando el modelo TIP3P. El complejo proteína-ligando se solvató en una caja de agua cúbica, manteniendo una distancia mínima de 10 Å desde la superficie de la proteína hasta el borde de la caja. El sistema se neutralizó con 0,150 M de sodio y iones cloruro. Se realizó la minimización de energía durante 50.000 pasos utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado. A continuación, se realizó una fase de equilibrio de 50.000 pasos bajo los conjuntos NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura), con restricciones armónicas aplicadas a los átomos pesados de la proteína. La temperatura y la presión del sistema se mantuvieron a 300 K y 1 bar utilizando el termostato de cadena de Nosé-Hoover y el barostato de Martyna-Tobias-Klein, respectivamente. Finalmente, se realizó una simulación de producción de 100 ns sin restricciones, con fotogramas de trayectoria guardados cada 10 ps para su análisis.

Cuantificación y análisis estadístico

El análisis de datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism 9 y R. El análisis de supervivencia se realizó utilizando curvas de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico. El coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para evaluar la relación entre las variables. La significación estadística se estableció en p < 0,05 y se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE).

Modelo experimental y detalles del participante del estudio

Sujetos humanos

Se seleccionaron consecutivamente diez pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes de nuestro biobanco en función de la disponibilidad de las muestras y la integridad del ARN, y se asignaron como un único grupo para la comparación del nivel de palmitoilación entre los tejidos tumorales y normales. Se construyó una matriz de tejidos a partir de 237 pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes. Este grupo se utilizó en su conjunto para evaluar las correlaciones de expresión de proteínas y las asociaciones clínicas. Se seleccionaron cinco pares de muestras frescas de CRC en función de la disponibilidad y viabilidad del tejido para la implantación. Primero, se analizaron mediante Western blot para la expresión de SLC7A11. En función de los resultados, se asignaron a dos grupos experimentales: un grupo de alta expresión de SLC7A11 y un grupo de baja expresión de SLC7A11, para el posterior establecimiento del modelo PDX y los estudios in vivo. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra para los grupos de descubrimiento (N = 10, N = 237). El tamaño de la muestra para el grupo PDX (N = 5) se determinó por la disponibilidad de recursos y la viabilidad para el experimento de prueba de concepto in vivo. Todas las muestras se obtuvieron del Sexto Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen. Se proporcionan características clínicas detalladas para cada grupo en las tablas S1, S2 y S3.

Estudios con animales

Los ratones Zdhhc5flox/flox y VillinCre se compraron a Cyagen (Suzhou, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd. Los ratones se alojaron en grupos de 4 a 5 en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) dentro de jaulas microaisladas en el Centro de Animales Experimentales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd.

Los ratones Zdhhc5flox/flox se cruzaron con ratones VillinCre para generar ratones con knockout específico del intestino (Zdhhc5 CKO; Zdhhc5flox/flox;VillinCre+), con sus hermanos de camada Zdhhc5flox/flox;VillinCre- sirviendo como controles WT. Para el modelo de knockout global de Zdhhc5, se logró la cría sostenida de la colonia cruzando ratones Zdhhc5+/−. Se empleó esta estrategia porque el knockout homocigoto global da como resultado infertilidad masculina,^[47] lo que impide el establecimiento de un par de cría entre individuos homocigotos. Se observó la herencia mendélica en la descendencia de los cruces heterocigotos, lo que dio como resultado hermanos de camada Zdhhc5−/−, Zdhhc5+/− y WT para los experimentos. El genotipado se realizó mediante análisis de PCR del ADN de la cola utilizando cebadores específicos para los alelos Zdhhc5 floxed y Villin-Cre.

Para el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se inyectaron seis ratones hembra BALB/c nude de seis semanas de edad por vía subcutánea con 5 × 106 células HCT116 resuspendidas en 100 μL de PBS. Los tumores se cosecharon 30 días después de la inyección para experimentos posteriores. Además, se inyectaron 1 × 106 células MC38 resuspendidas en 100 μL de PBS por vía subcutánea en ratones C57BL/6 WT. Para el tratamiento anti-PD-L1, los tumores recibieron 100 μg de anti-PD-L1 en los días 14 y 18. Para el tratamiento con β-cat-Oxazole, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 20 mg/kg de β-cat-Oxazole cada 3 días, para un total de 5 dosis. Los volúmenes tumorales se midieron utilizando la fórmula: V (mm3) = a × b2/2, donde a representa la longitud y b representa el ancho.

Para los modelos PDX, los tejidos tumorales de pacientes con CRC se trasplantaron por vía subcutánea en ratones hembra BALB/c nude de seis semanas de edad. Tras el crecimiento del tumor, los tumores subcutáneos se extirparon, se disociaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm y se reimplantaron en nuevos ratones BALB/c nude. Una semana después del trasplante, los ratones con tumores de tamaño comparable (que oscilaban entre 50 y 100 mm3) se asignaron aleatoriamente a dos grupos. Para mantener el silenciamiento génico mediado por lentivirus durante todo el experimento, los ratones recibieron inyecciones intratumorales, administradas en múltiples sitios para mejorar la distribución, de lentivirus que expresaban un control o shZDHHC5 cada dos días, para un total de 10 inyecciones. Se empleó este protocolo de múltiples inyecciones para contrarrestar la naturaleza transitoria de la transducción lentiviral in vivo y garantizar una supresión persistente del objetivo. Los volúmenes tumorales y el análisis inmunohistoquímico se realizaron en el día 28. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la misma fórmula que se describió anteriormente.

Para el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad con 10 mg/kg de AOM (Sigma-Aldrich). Después de 7 días, se administró a los ratones agua para beber que contenía un 2,5% de DSS (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) durante una semana, seguida de agua normal durante 2 semanas. Este ciclo se repitió con un 2,5% de DSS durante otra semana, y los ratones se sacrificaron en el día 120. Para el tratamiento con β-cat-Oxazole, después de la tercera ronda de administración de DSS, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones con 20 mg/kg de β-cat-Oxazole cada 3 días, para un total de 8 dosis. A continuación, se sacrificaron los ratones y se cosecharon los tejidos tumorales del colon para su posterior análisis.

Cultivo celular

Las líneas celulares humanas (HCT116, DLD1, HEK293T) se obtuvieron del Banco de Cultivos de Células Americano (ATCC) y se autenticaron mediante el perfilado STR. Todas las células dieron negativo en las pruebas de contaminación por micoplasma. Estas células se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Nueva York, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (Gibco, Nueva York, EE. UU.) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, California, EE. UU.), mantenido a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2.

Cultivo de organoides

Los organoides se cultivaron siguiendo un protocolo establecido previamente.^[48] Brevemente, las células epiteliales tumorales intestinales humanas se mantuvieron en un medio DMEM/F12 avanzado suplementado con factores de crecimiento, incluido 100 ng/mL de Noggin (Peprotech), 500 ng/mL de R-spondin (Peprotech), 50 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (Peprotech) y 10 μM de Y-27632 (Abmole). Los PDO se infectaron posteriormente con lentivirus que expresaba shZDHHC5. Después de la infección, los PDO se fotografiaron y se midieron sus diámetros.

Sujetos humanos

Se seleccionaron consecutivamente diez pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes de nuestro biobanco, basándose en la disponibilidad de las muestras y la integridad del ARN, y se asignaron como una única cohorte para la comparación de los niveles de palmitoilación entre los tejidos tumorales y normales. Se construyó una matriz de tejidos a partir de 237 pares de tejidos tumorales y tejidos normales adyacentes. Esta cohorte se utilizó en su conjunto para evaluar las correlaciones de la expresión de proteínas y las asociaciones clínicas. Se seleccionaron cinco pares de muestras frescas de CRC, basándose en la disponibilidad y viabilidad del tejido para la implantación. Primero, se analizaron mediante Western blot para determinar la expresión de SLC7A11. En función de los resultados, se asignaron a dos grupos experimentales: un grupo con alta expresión de SLC7A11 y un grupo con baja expresión de SLC7A11, para el posterior establecimiento de modelos PDX y estudios in vivo. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra para las cohortes de descubrimiento (N = 10, N = 237). El tamaño de la muestra para la cohorte PDX (N = 5) se determinó en función de la disponibilidad de recursos y la viabilidad para el experimento de prueba de concepto in vivo. Todas las muestras se obtuvieron del Sexto Hospital Afiliado de la Universidad de Sun Yat-sen. Se proporcionan las características clínicas detalladas de cada cohorte en las tablas S1, S2 y S3.

Estudios en animales

Los ratones Zdhhc5flox/flox y VillinCre se adquirieron de Cyagen (Suzhou, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd. Los ratones se alojaron en grupos de 4 a 5 en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) dentro de jaulas de microaislamiento en el Centro de Animales Experimentales de Guangzhou Ruige Biological Technology Co., Ltd.

Los ratones Zdhhc5flox/flox se cruzaron con ratones VillinCre para generar ratones con deleción génica específica del intestino (Zdhhc5 CKO; Zdhhc5flox/flox;VillinCre+), y sus hermanos de camada Zdhhc5flox/flox;VillinCre - sirvieron como controles WT. Para el modelo de deleción global de Zdhhc5, se logró la cría sostenida de la colonia mediante el cruce de ratones Zdhhc5+/−. Se empleó esta estrategia porque la deleción homozigótica global produce infertilidad masculina,^[47] lo que impide el establecimiento de una pareja reproductora entre individuos homocigotos. Se observó herencia mendeliana en la descendencia de los cruces heterocigotos, lo que dio como resultado hermanos de camada Zdhhc5−/−, Zdhhc5+/− y WT para los experimentos. Se realizó la genotipificación mediante análisis de PCR del ADN de la cola utilizando cebadores específicos para los alelos Zdhhc5 floxed y Villin-Cre.

Para el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se inyectaron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad con 5 × 106 células HCT116 resuspendidas en 100 μL de PBS, por vía subcutánea. Los tumores se recolectaron 30 días después de la inyección para experimentos posteriores. Además, se inyectaron 1 × 106 células MC38 resuspendidas en 100 μL de PBS, por vía subcutánea, en ratones C57BL/6J WT. Para el tratamiento anti-PD-L1, los tumores recibieron 100 μg de anti-PD-L1 en los días 14 y 18. Para el tratamiento con β-cat-Oxazol, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 20 mg/kg de β-cat-Oxazol cada 3 días, para un total de 5 dosis. Los volúmenes tumorales se midieron utilizando la fórmula: V (mm3) = a × b2/2, donde a representa la longitud y b representa el ancho.

Para los modelos PDX, los tejidos tumorales de pacientes con CRC se trasplantaron por vía subcutánea en ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad. Tras el crecimiento del tumor, los tumores subcutáneos se extirparon, se disociaron en fragmentos de aproximadamente 1 mm y se reimplantaron en nuevos ratones BALB/c. Una semana después del trasplante, los ratones que presentaban tumores de tamaño comparable (que oscilaba entre 50 y 100 mm3) se asignaron aleatoriamente a dos grupos. Para mantener la supresión génica mediada por lentivirus durante todo el experimento, se administraron inyecciones intratumorales a los ratones, en múltiples sitios para mejorar la distribución, de lentivirus que expresaban un control o shZDHHC5 cada dos días, para un total de 10 inyecciones. Se empleó este protocolo de múltiples inyecciones para contrarrestar la naturaleza transitoria de la transducción lentiviral in vivo y garantizar una supresión persistente del objetivo. Los volúmenes tumorales y el análisis inmunohistoquímico se realizaron en el día 28. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la misma fórmula descrita anteriormente.

Para el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se inyectaron ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad con 10 mg/kg de AOM (Sigma-Aldrich) por vía intraperitoneal. Después de 7 días, se administró a los ratones agua para beber que contenía un 2,5% de DSS (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.) durante una semana, seguida de agua para beber normal durante 2 semanas. Este ciclo se repitió con un 2,5% de DSS durante otra semana, y los ratones se sacrificaron en el día 120. Para el tratamiento con β-cat-Oxazol, después de la tercera ronda de administración de DSS, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 20 mg/kg de β-cat-Oxazol cada 3 días, para un total de 8 dosis. Luego, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tejidos tumorales del colon para su posterior análisis.

Cultivo celular

Las líneas celulares humanas (HCT116, DLD1, HEK293T) se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC) y se autenticaron mediante el perfilado STR. Todas las células resultaron negativas para la contaminación por micoplasma. Estas células se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Nueva York, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Gibco, Nueva York, EE. UU.) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, California, EE. UU.), a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.

Cultivo de organoides

Los organoides se cultivaron siguiendo un protocolo previamente establecido.^[48] Brevemente, las células epiteliales tumorales intestinales humanas se mantuvieron en un medio DMEM/F12 avanzado suplementado con factores de crecimiento, que incluyen 100 ng/mL de Noggin (Peprotech), 500 ng/mL de R-spondin (Peprotech), 50 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (Peprotech) y 10 μM de Y-27632 (Abmole). Los PDO se infectaron posteriormente con lentivirus que expresaba shZDHHC5. Después de la infección, se fotografiaron los PDO y se midieron sus diámetros.

Detalles del método

Análisis de MS

Las células HEK293T transfectadas con plásmidos Flag-β-catenina o Flag-ZDHHC5 se lisaron y se immunoprecipitaron utilizando agarosa anti-Flag. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y la tinción con azul de Coomassie, las bandas de proteínas se excindieron, se sometieron a la digestión de tripsina en gel y se secaron. A continuación, se analizó la composición de las proteínas mediante MS, como se describió anteriormente.^[49]

Líneas celulares estables

La producción y transducción de lentivirus se realizaron como se describió anteriormente.^[50] Brevemente, los vectores lentivirales que contenían los constructos objetivo se empaquetaron en células HEK293T. A continuación, se infectaron las células tumorales con los lentivirus en presencia de polibren. Las células infectadas se seleccionaron con 1 μg/mL de puromicina durante dos semanas para establecer clones estables. Se confirmó la expresión de las proteínas objetivo en estos clones mediante análisis de Western blot.

Inmunoprecipitación y análisis de inmunoblot

La inmunoprecipitación y los análisis de inmunoblot se realizaron como se describió anteriormente.^[50] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos deseados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis. Para la inmunoprecipitación, las cuentas de agarosa anti-Flag o anti-HA se lavaron tres veces con 1 mL de tampón de lisis antes de incubarlas con 1 mL de lisado celular durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se centrifugaron las cuentas y se descartó el sobrenadante. Las cuentas se lavaron tres veces, se resuspendieron en 2 × tampón de muestra SDS y se hirvieron durante 10 minutos. A continuación, se analizaron las muestras resultantes mediante inmunoblot utilizando los anticuerpos apropiados.

PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

La RT-qPCR se realizó como se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se extrajo el ARN total de las células o tejidos, seguido de la transcripción inversa para generar ADN complementario (ADNc). A continuación, el ADNc se sometió a qPCR utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) y protocolos estándar. Las secuencias de los cebadores para la qPCR se proporcionan en la tabla S4. Se utilizó GAPDH como control interno para normalizar los datos.

Análisis del promotor

La secuencia del promotor del gen humano SLC7A11 se obtuvo del Navegador del Genoma UCSC. Específicamente, nos centramos en aproximadamente 2000 pares de bases aguas arriba de la región codificante ATG. Utilizando herramientas bioinformáticas, realizamos una alineación de secuencias del promotor de SLC7A11 recuperado con los motivos de unión conocidos de β-catenina/TCF4 documentados en la literatura. La secuencia de consenso para el complejo β-catenina/TCF4 se describe como (-CTTTGA/TA/T-).^[48]

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó según un protocolo previamente establecido.^[10] Brevemente, las células se cruzaron in situ con formaldehído al 1% durante 10 minutos, seguido de la desactivación con 0,125 M de glicina durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lisaron en tampón de lisis SDS y el ADN de la cromatina se fragmentó mediante sonicación hasta un tamaño de entre 200 y 1000 pares de bases. El sobrenadante se diluyó 10 veces en tampón de dilución de ChIP y se preclarificó con 50 μL de cuentas de agarosa durante 2 horas a 4 °C. Después de la centrifugación para recoger el sobrenadante, se añadieron anticuerpos específicos (3 μg) y la mezcla se agitó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 50 μL de cuentas de agarosa y se incubó durante otras 2 horas a 4 °C. Por último, el ADN des-entrelazado se analizó mediante qPCR utilizando cebadores específicos que se indican en la tabla S4.

Ensayo de reportero de luciferasa

El ensayo de reportero de luciferasa se realizó como se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se transfectaron 0,3 μg del vector pGL3 que expresaba TRE o el mutante indicado, junto con 50 ng del reportero de luciferasa Renilla, en triplicado en células HEK293T. Después de 36 horas, se midió la actividad de la luciferasa utilizando el sistema de ensayo de reportero de luciferasa dual. La actividad de Renilla se utilizó como control interno para la normalización.

Análisis inmunohistoquímico (IHC)

Las muestras de CRC se fijaron y se incluyeron en parafina según los protocolos estándar. El análisis de IHC se realizó utilizando anticuerpos contra la proteína indicada. Los resultados de la tinción se evaluaron en función de la intensidad y la proporción de células tumorales que mostraban una reacción positiva. La intensidad de la tinción se puntuó de la siguiente manera: 0 para negativo, 1 para débil, 2 para moderado y 3 para fuerte. La frecuencia de las células positivas se puntuó de la siguiente manera: 0 para 75%. La puntuación total, que oscila entre 0 y 12, se calculó multiplicando la puntuación de intensidad por la puntuación del porcentaje de células positivas.

Análisis de inmunofluorescencia

El análisis de inmunofluorescencia se realizó según el protocolo del fabricante (PANOVUE, Beijing, China). Brevemente, las células sembradas en portaobjetos de vidrio se fijaron con un 4% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA), se permeabilizaron con un 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos a TA y se bloquearon con un 5% de suero bovino fetal. Los anticuerpos primarios, diluidos en tampón de bloqueo, se aplicaron durante la noche a 4 °C. Después de lavar con tampón TBST, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 10 minutos a TA. Tras lavados adicionales con tampón TBST, se realizó la amplificación de la señal de tiiramida (TSA) utilizando colorantes fluorescentes (PPD570 y PPD650) según las instrucciones del fabricante (Panorama, China). Los núcleos se contrateñeron con DAPI y se adquirieron imágenes utilizando un microscopio confocal de escaneo láser.

Medición de los niveles de ROS y de lípidos ROS

Los lípidos ROS, un subconjunto de los ROS, son características bien establecidas de la ferroptosis.^[51] Los niveles de ROS se midieron utilizando un kit ELISA para ROS adquirido de AIDISHENG (Jiangsu, China), siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, la sonda DCFH-DA se diluyó 1:1000 en un medio libre de suero hasta una concentración final de 10 μM. Después de retirar el medio de cultivo celular, se añadió la sonda DCFH-DA diluida para asegurar una cobertura suficiente de las células, con al menos 1 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las células se incubaron con el donante de hidrógeno durante 30 minutos a 37°C. Después de la incubación, el medio se aspiró y las células se lavaron suavemente con medio libre de suero hasta que casi toda la capa celular se desprendiera. La suspensión celular se recogió en un tubo de centrífuga de 1,5 mL, se lavó dos veces para eliminar la sonda no penetrada y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en PBS. Los niveles de ROS se midieron utilizando un lector de microplacas con excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. Para la detección de lípidos ROS, las células de CRC se sembraron en una placa de 6 pocillos, se lavaron dos veces con solución salina tamponada de Hank (Gibco) y se incubaron en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos con 10 μmol/L de sonda BODIPY C11 (Thermo Fisher Scientific). Después de la tinción, las células se analizaron mediante citometría de flujo.### Detección de 4-HNE

Los niveles de 4-HNE se midieron utilizando un kit ELISA para 4-HNE adquirido de Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd., siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, se recogieron 1×106 células, se resuspendieron en PBS (pH 7,2-7,4) y se rompieron mediante sonicación para liberar el contenido intracelular. Los lisados celulares se centrifugaron a 3000 rpm durante 20 minutos a 4°C. A continuación, se añadieron 50 μL del sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4-HNE y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación con el anticuerpo anti-4-HNE y el anticuerpo secundario-HRP, se añadió la solución sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm.### Determinación de la liberación de HMGB1 en sobrenadantes de cultivos celulares

La concentración de HMGB1 en los sobrenadantes de cultivos celulares se midió utilizando un kit ELISA comercial. Brevemente, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 1000 × g durante 20 minutos a 2-8°C para eliminar los residuos. Los sobrenadantes clarificados se analizaron inmediatamente o se almacenaron a −80°C. Se realizó un ELISA tipo sándwich añadiendo 50 μL de estándares o muestras a la microplaca recubierta con anticuerpos. Después de añadir 100 μL de anticuerpo de detección conjugado con HRP, la placa se incubó durante 60 minutos a 37°C. Después de cuatro lavados con tampón de lavado, se añadieron 50 μL de sustrato A y B, seguido de una incubación de 15 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo con 50 μL de solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm. La concentración de HMGB1 se calculó a partir de la curva estándar.### Medición de los niveles de HMGB1 en plasma

Se recogió sangre de ratones experimentales en tubos con EDTA o heparina, se centrifugó a 1000×g durante 15 minutos a 4°C en un plazo de 30 minutos después de la recolección. El plasma se recogió cuidadosamente, se dividió en alícuotas y se almacenó a −80°C, evitando ciclos repetidos de congelación y descongelación. Para el modelo de xenoinjerto derivado de HCT116, el HMGB1 plasmático se midió utilizando un kit ELISA para HMGB1 humano; para el xenoinjerto derivado de MC38 y el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se utilizó un kit ELISA para HMGB1 de ratón. El ensayo se realizó de la siguiente manera: los componentes del kit ELISA se equilibraron a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 50 μL de solución estándar (pocillos estándar), muestras de plasma (pocillos de muestra) y diluyente de muestra (pocillos en blanco) a la placa. A continuación, se añadió 100 μL de anticuerpo conjugado con enzima a cada pocillo y la placa se incubó a 37°C durante 60 minutos. Después de la incubación, se descartó el líquido y los pocillos se lavaron cinco veces con tampón de lavado y se secaron sobre papel absorbente. Se añadieron sustratos A y B (50 μL cada uno) a cada pocillo y la placa se incubó a 37°C en la oscuridad durante 15 minutos para el desarrollo del color. La reacción se detuvo añadiendo 50 μL de solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm en un plazo de 15 minutos utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de HMGB1 se calcularon trazando el logaritmo de las concentraciones estándar (eje X) frente a los valores de OD correspondientes (eje Y) y utilizando la curva estándar resultante.### Secuenciación de ARN

Se aisló ARN total de 1×107 células DLD1, HCT116 o 200 mg de tejido de colon de ratón utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (TransGen Biotech). Se construyeron bibliotecas de ARN por Majorbio (Shanghái, China) y se secuenciaron en la plataforma Illumina NovaSeq. Los datos brutos de la secuenciación de ARN se evaluaron y se controló la calidad utilizando el software FASTQC (v0.11.9). A continuación, los datos se alinearon al genoma GRCm39 o GRCh38 utilizando HISAT2 (v2.2.1) y se calcularon los recuentos de genes con FeatureCounts (v1.28.1).### Lipidómica no dirigida

METWARE (Wuhan, China) realizó una lipidómica no dirigida utilizando ocho muestras de tejido de colon de tres ratones WT y cinco ratones CKO. Brevemente, las muestras se homogeneizaron con un molino de bolas (MM400, Retsch) y se analizaron en un sistema de espectrometría de masas UPLC–QTRAP 6500+ ExionLC AD (SCIEX) acoplado a una columna Thermo Accucore C30. Se realizó una elución en gradiente utilizando mezclas de acetonitrilo/agua y acetonitrilo/isopropanol que contenían 0,1% de ácido fórmico y 10 mM de formiato de amonio. La espectrometría de masas se realizó con una fuente de ionización por electrospray (ESI) a 500°C; el voltaje de pulverización de iones se fijó en 5500 V en modo positivo y −4500 V en modo negativo. Los gases de la fuente se fijaron de la siguiente manera: GS1 45 psi, GS2 55 psi, gas de cortina (CUR) 35 psi; la disociación activada por colisión (CAD) se fijó en Medio. En el triple cuádrupolo, cada par de iones se monitorizó utilizando un potencial de desfragmentación (DP) y una energía de colisión (CE) optimizados. La identificación de lípidos se basó en una base de datos MWDB personalizada y la cuantificación se realizó en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM) utilizando el espectrómetro de masas de triple cuádrupolo.### Ensayos de palmitoilación

La palmitoilación de proteínas se detectó utilizando el método ABE.^[52] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos indicados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis que contenía 50 mM de NEM, seguido de centrifugación (20 min, 12.000 rpm, 4°C) e inmunoprecipitación nocturna con perlas de agarosa anti-Flag o específicas para β-catenina. Después de tres lavados, los precipitados se dividieron en dos porciones iguales: una para el control –HAM y la otra para el tratamiento +HAM, que se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los precipitados se lavaron una vez con tampón de lavado (1 M de Tris-HCl, pH 6,5) y se incubaron con tampón BMCC-biotina (50 mM de Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100 y 5 μM de BMCC-biotina) durante 1 h a 4°C. Las muestras se lavaron dos veces con tampón de lavado, seguido de SDS-PAGE y Western blot. La β-catenina palmitoilada se detectó utilizando estreptavidina conjugada con HRP (Sangon Biotech; 1:200 en 0,5% de BSA).### Ensayo de S-nitrosilación

La S-nitrosilación se detectó utilizando el ensayo de conmutación de biotina.^[13],^[53] Brevemente, los lisados de células HCT116 o HEK293T transfectadas se incubaron en tampón HENS (250 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 0,1 mM de neocuprina, 2% de SDS, pH 7,7) con 20 mM de S-metilmetanotiosulfonato (MMTS) a 50°C durante 20 minutos para bloquear las cisteínas libres. Las proteínas se precipitaron con acetona fría, se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón HENS (1% de SDS) y se incubaron con 0,4 mM de biotina-HPDP y 5 mM de ascorbato de sodio a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. Las proteínas biotiniladas se purificaron utilizando perlas de estreptavidina-agarosa, se separaron por SDS-PAGE y se detectaron mediante inmunoblot.### Análisis SPR

El análisis SPR se realizó utilizando el sistema Biacore 8K (Cytiva) para evaluar la afinidad de unión de β-cat-Oxazol a la β-catenina. Los chips CM5 se activaron con N-hidroxisuccinimida y 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida metil yoduro (EDC), seguido de la inmovilización de β-catenina purificada (50 μg/mL en acetato de sodio, pH 5,0). La superficie se bloqueó con etanolamina para evitar la unión inespecífica. Se inyectaron concentraciones graduadas de β-cat-Oxazol sobre la proteína inmovilizada a un caudal de 30 μL/min en un tampón de funcionamiento que contenía 0,05% de Tween 20 en PBS. Los datos SPR se recogieron y se analizaron utilizando el software de evaluación Biacore Insight (Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.).### Análisis transcriptómico integrado

Los datos de secuenciación de ARN de ratones con deleción específica de Zdhhc5 en el epitelio intestinal, células HCT116 con deleción de CTNNB1 y células DLD1 con reducción de ZDHHC5 se analizaron por separado. Se identificaron genes expresados diferencialmente (DEG) con un umbral de |log2 fold change (FC)| > 1 y p < 0,05. A continuación, se cruzaron las listas de DEG significativamente reducidas de cada modelo con un conjunto de genes relacionados con la ferroptosis publicado^[37] para identificar posibles objetivos comunes.### Análisis de secuenciación de ARN de célula única y análisis de transcriptómica espacial

Se recuperó el conjunto de datos de secuenciación de ARN de célula única de CRC (GSE132465) y los metadatos de las células de un estudio anterior.^[54] El conjunto de datos de transcriptómica espacial de CRC se obtuvo de otro estudio.^[38] El procesamiento y la visualización de los datos de secuenciación de ARN de célula única y transcriptómica espacial se realizaron siguiendo las metodologías descritas en nuestra publicación anterior.^[55]### Análisis de modelado atómico

(i)Predicción de la estructura proteica 3D: Las estructuras complejas de ZDHHC5 y β-catenina se predijeron utilizando el programa multímero AlphaFold3.^[56] Se seleccionó la conformación con la puntuación de confianza más alta para la simulación y el análisis de dinámica molecular posteriores.(ii)Simulaciones de dinámica molecular: Se utilizó el paquete GROMACS (versión 2023.03; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352711015000059) para realizar simulaciones de dinámica molecular convencionales, con el objetivo de investigar los cambios conformacionales en el complejo ZDHHC5-β-catenina. Se utilizó el campo de fuerza Amber14sb^[57] para la parametrización de proteínas y el modelo de agua TIP3P (https://www.scopus.com/pages/publications/0004016501) se utilizó para la representación del disolvente. El complejo ZDHHC5-β-catenina se solvató en una caja de agua octédrica y la carga del sistema se neutralizó añadiendo 0,150 M de NaCl. Inicialmente, se realizó una minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado durante 50.000 pasos para aliviar las colisiones estéricas. A continuación, se aplicaron restricciones de posición a los átomos pesados durante las fases de equilibrio NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura) de 50.000 pasos. La temperatura del sistema se mantuvo a 300 K y la presión se mantuvo a 1 bar. Tras el equilibrio, se realizó una simulación de producción sin restricciones de 100 ns, con coordenadas de trayectoria y parámetros de energía guardados cada 20 ps. Los patrones de interacción y las trayectorias dinámicas se visualizaron y analizaron utilizando ChimeraX.^[58](iii)Cálculos de energía libre y descomposición de residuos: El método MM-GBSA^[59] se utiliza ampliamente para estimar las energías libres de unión en la investigación de descubrimiento de fármacos. En este estudio, se realizaron cálculos MM-GBSA utilizando gmxMMPBSA,^[60] una herramienta compatible con GROMACS para los análisis MM-PBSA/MM-GBSA. Para dilucidar la base molecular de las interacciones ZDHHC5-β-catenina, se utilizó además gmxMMPBSA para descomponer la energía libre de unión en contribuciones de residuos individuales.

Se realizó un cribado virtual de alto rendimiento para identificar inhibidores de ZDHHC5/β-catenina utilizando estructuras de complejos dinámicos y acoplamiento en cascada. (i) Preparación y preprocesamiento de la estructura de la proteína: Las estructuras proteicas iniciales se preprocesaron utilizando el Asistente de preparación de proteínas (Schrödinger). Este procedimiento incluyó la asignación de órdenes de enlace, la adición de átomos de hidrógeno faltantes y la optimización de las redes de enlaces de hidrógeno con PROPKArot a un pH fisiológico de 7.0. Los posibles sitios de unión en la interfaz entre ZDHHC5 y β-catenina se predijeron utilizando el módulo SiteMap. Posteriormente, se generaron rejillas de acoplamiento con la herramienta de generación de rejillas de receptor en Glide. Se definió una caja cúbica de 20 × 20 × 20 Å, centrada en el sitio de unión identificado, para servir como el marco espacial preciso para todos los cálculos de acoplamiento molecular posteriores. (ii) Preparación de la base de datos de moléculas pequeñas: La base de datos de cribado se obtuvo de ChemDiv (https://www.chemdiv.com/) y se procesó utilizando el módulo LigPrep de Schrödinger. Los pasos de preprocesamiento incluyeron la desalación, la adición de átomos de hidrógeno, la generación de posibles estados de ionización a un pH objetivo de 7.0 ± 2.0 utilizando Epik, la enumeración de tautómeros y estereoisómeros, y la minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS4. (iii) Cribado virtual: Se aplicó un filtro inicial de ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) a las moléculas de la base de datos utilizando el módulo QuickProp de Schrödinger, reteniendo solo los compuestos que cumplían con la regla de los cinco de Lipinski y no contenían grupos funcionales reactivos. Luego, se realizó un cribado virtual de alto rendimiento (HTVS) utilizando Glide retain, con GlideScore (GScore) como la función de puntuación principal. El 10% superior de los compuestos clasificados por la puntuación de HTVS se retuvo para el acoplamiento de precisión estándar (SP) posterior. A continuación, el 10% superior de los compuestos de la etapa de acoplamiento SP, que empleó la función de puntuación Glide SP más rigurosa, se sometió a un acoplamiento de precisión extra (XP). La etapa de acoplamiento XP aplicó la función de puntuación Glide XP, que impone penalizaciones más estrictas por la desolvatación y las colisiones estéricas. El 10% superior de los compuestos del acoplamiento XP se analizó aún más utilizando el módulo Prime MM-GBSA y el modelo de solvatación VSGB 2.0 para calcular las energías libres de unión. Basándose en las puntuaciones de MM-GBSA, los 30 compuestos superiores se priorizaron para su adquisición y posterior validación experimental. (iiii) Análisis de simulación de dinámica molecular: Para refinar la pose de unión del compuesto principal, β-cat-Oxazol, en complejo con β-catenina, se realizaron simulaciones de dinámica molecular utilizando Desmond. Se utilizó el campo de fuerza OPLS4 para la proteína y el ligando, y las moléculas de agua se modelaron explícitamente utilizando el modelo TIP3P. El complejo proteína-ligando se solvató en una caja cúbica de agua, manteniendo una distancia mínima de 10 Å desde la superficie de la proteína hasta el borde de la caja. El sistema se neutralizó con 0.150 M de sodio y iones cloruro. Se realizó la minimización de energía durante 50 000 pasos utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado. Esto fue seguido por una fase de equilibrio de 50 000 pasos bajo los conjuntos NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura), con restricciones armónicas aplicadas a los átomos pesados de la proteína. La temperatura y la presión del sistema se mantuvieron a 300 K y 1 bar utilizando el termostato de cadena de Nosé-Hoover y el barostato de Martyna-Tobias-Klein, respectivamente. Finalmente, se realizó una simulación de producción de 100 ns sin restricciones, con fotogramas de trayectoria guardados cada 10 ps para su análisis.

Análisis por MS

Las células HEK293T transfectadas con plásmidos de Flag-β-catenina o Flag-ZDHHC5 se lisaron e inmunoprecipitaron utilizando agarosa anti-Flag. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y la tinción con azul de Coomassie, las bandas de proteína se excindieron, se sometieron a la digestión con tripsina en el gel y se secaron. La composición de la proteína se analizó posteriormente mediante MS, como se describió anteriormente.^[49]

Líneas celulares estables

La producción y transducción lentiviral se realizaron como se describió anteriormente.^[50] Brevemente, los vectores lentivirales que contenían los constructos objetivo se empaquetaron en células HEK293T. Las células tumorales se infectaron posteriormente con los lentivirus en presencia de polibreno. Las células infectadas se seleccionaron con 1 μg/mL de puromicina durante dos semanas para establecer clones estables. La expresión de las proteínas objetivo en estos clones se confirmó mediante análisis de Western blot.

Inmunoprecipitación y análisis de inmunoblot

La inmunoprecipitación y los análisis de inmunoblot se realizaron como se describió anteriormente.^[50] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos deseados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis. Para la inmunoprecipitación, las cuentas de agarosa anti-Flag o anti-HA se lavaron tres veces con 1 mL de tampón de lisis antes de incubarlas con 1 mL de lisado celular durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las cuentas se centrifugaron y el sobrenadante se descartó. Las cuentas se lavaron tres veces, se resuspendieron en 2× tampón de muestra SDS y se hirvieron durante 10 minutos. Las muestras resultantes se analizaron mediante inmunoblot utilizando los anticuerpos apropiados.

PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

La RT-qPCR se realizó como se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se extrajo el ARN total de las células o tejidos, seguido de la transcripción inversa para generar ADN complementario (ADNc). El ADNc se sometió posteriormente a qPCR utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) y protocolos estándar. Las secuencias de los cebadores para qPCR se proporcionan en la Tabla S4. Se utilizó GAPDH como control interno para normalizar los datos.

Análisis del promotor

La secuencia del promotor del gen humano SLC7A11 se obtuvo del Navegador del genoma UCSC. Específicamente, nos centramos en aproximadamente 2000 pares de bases aguas arriba de la región codificante ATG. Utilizando herramientas bioinformáticas, realizamos una alineación de secuencias del promotor de SLC7A11 recuperado con los motivos de unión de β-catenina/TCF4 conocidos documentados en la literatura. La secuencia de consenso para el complejo β-catenina/TCF4 se describe como (-CTTTGA/TA/T-).^[48]

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

El ensayo de inmunoprecipitación de cromatina se realizó según un protocolo previamente establecido.^[10] Brevemente, las células se reticularon in situ con 1% de formaldehído durante 10 minutos, seguido de la desactivación con 0.125 M de glicina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se lisaron posteriormente en tampón de lisis SDS y el ADN de la cromatina se fragmentó por sonicación a un tamaño de 200 a 1000 pares de bases. El sobrenadante se diluyó 10 veces en tampón de dilución de ChIP y se preclarificó con 50 μL de cuentas de agarosa durante 2 horas a 4 °C. Después de la centrifugación para recoger el sobrenadante, se añadieron anticuerpos específicos (3 μg) y la mezcla se rotó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadieron 50 μL de cuentas de agarosa y se incubó durante 2 horas adicionales a 4 °C. Finalmente, el ADN desreticulado se analizó mediante qPCR utilizando cebadores específicos enumerados en la Tabla S4.

Ensayo de reportero de luciferasa

El ensayo de reportero de luciferasa se realizó como se describió anteriormente.^[10] Brevemente, se transfectaron 0.3 μg del vector pGL3 que expresa TRE o el mutante indicado, junto con 50 ng del reportero de luciferasa Renilla, en triplicado en células HEK293T. Después de 36 horas, se midió la actividad de la luciferasa utilizando el sistema de ensayo de reportero de luciferasa dual. La actividad de Renilla se utilizó como control interno para la normalización.

Análisis inmunohistoquímico (IHC)

Las muestras de CRC se fijaron y se incluyeron en parafina según los protocolos estándar. El análisis de IHC se realizó utilizando anticuerpos contra la proteína indicada. Los resultados de la tinción se evaluaron en función de la intensidad y la proporción de células tumorales que mostraban una reacción positiva. La intensidad de la tinción se puntuó de la siguiente manera: 0 para negativo, 1 para débil, 2 para moderado y 3 para fuerte. La frecuencia de las células positivas se puntuó como: 0 para 75%. La puntuación total, que oscila entre 0 y 12, se calculó multiplicando la puntuación de intensidad por la puntuación del porcentaje de células positivas.

Análisis de inmunofluorescencia

El análisis de inmunofluorescencia se realizó según el protocolo del fabricante (PANOVUE, Beijing, China). Brevemente, las células sembradas en portaobjetos de vidrio se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA), se permeabilizaron con 0.5% de Triton X-100 durante 15 minutos a TA y se bloquearon con 5% de suero fetal bovino. Los anticuerpos primarios, diluidos en tampón de bloqueo, se aplicaron durante la noche a 4 °C. Después de lavar con tampón TBST, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 10 minutos a TA. Después de lavados adicionales con TBST, se realizó la amplificación de la señal de tiol (TSA) utilizando colorantes fluorescentes (PPD570 y PPD650) según las instrucciones del fabricante (Panorama, China). Los núcleos se contrateñeron con DAPI y las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de escaneo láser.

Medición de los niveles de ROS y de lípidos ROS

Los lípidos ROS, un subconjunto de los ROS, son características bien establecidas de la ferroptosis.^[51] Los niveles de ROS se midieron utilizando un kit de ELISA de ROS adquirido de AIDISHENG (Jiangsu, China), siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, la sonda DCFH-DA se diluyó 1:1000 en medio libre de suero hasta una concentración final de 10 μM. Después de retirar el medio de cultivo celular, se añadió la DCFH-DA diluida para asegurar una cobertura suficiente de las células, con al menos 1 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las células se incubaron con el donante de hidrógeno durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, el medio se aspiró y las células se lavaron suavemente con medio libre de suero hasta que casi toda la capa celular se desprendiera. La suspensión celular se recogió en un tubo de centrífuga de 1.5 mL, se lavó dos veces para eliminar la sonda no penetrada y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en PBS. Los niveles de ROS se midieron utilizando un lector de microplacas con excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. Para la detección de lípidos ROS, las células de CRC se sembraron en una placa de 6 pocillos, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con Hank (Gibco) y se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 30 minutos con 10 μmol/L de sonda BODIPY C11 (Thermo Fisher Scientific). Después de la tinción, las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Detección de 4-HNE

Los niveles de 4-HNE se midieron utilizando un kit de ELISA de 4-HNE adquirido de Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd., siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, se recogieron 1×106 células, se resuspendieron en PBS (pH 7.2–7.4) y se rompieron por sonicación para liberar el contenido intracelular. Los lisados celulares se centrifugaron a 3000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. A continuación, se añadieron 50 μL del sobrenadante a una placa de ELISA recubierta con 4-HNE y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación con el anticuerpo anti-4-HNE y el anticuerpo secundario-HRP, se añadió la solución de sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm.

Determinación de la liberación de HMGB1 en sobrenadantes de cultivos celulares

La concentración de HMGB1 en los sobrenadantes de los cultivos celulares se midió utilizando un kit de ELISA comercial. Brevemente, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 1000 × g durante 20 minutos a 2-8 °C para eliminar los residuos. Los sobrenadantes clarificados se analizaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C. Se realizó un ELISA sándwich añadiendo 50 μL de estándares o muestras a la microplaca recubierta con anticuerpos. Después de añadir 100 μL del anticuerpo de detección conjugado con HRP, la placa se incubó durante 60 minutos a 37 °C. Tras cuatro lavados con tampón de lavado, se añadieron 50 μL de la solución de sustrato A y B, seguida de una incubación de 15 minutos en la oscuridad. Se detuvo la reacción con 50 μL de solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm. La concentración de HMGB1 se calculó a partir de la curva estándar.

Medición de los niveles de HMGB1 en plasma

Se recolectó sangre de ratones experimentales en tubos con EDTA o heparina, se centrifugó a 1000×g durante 15 minutos a 4°C en un plazo de 30 minutos después de la recolección. El plasma se recolectó cuidadosamente, se dividió en alícuotas y se almacenó a −80°C, evitando ciclos repetidos de congelación y descongelación. Para el modelo de xenoinjerto derivado de HCT116, se midió el HMGB1 plasmático utilizando un kit ELISA para HMGB1 humano; para el xenoinjerto derivado de MC38 y el modelo de CRC inducido por AOM/DSS, se utilizó un kit ELISA para HMGB1 de ratón. El ensayo se realizó de la siguiente manera: los componentes del kit ELISA se equilibraron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, se añadieron 50 μL de solución estándar (pocillos estándar), muestras de plasma (pocillos de muestra) y diluyente de muestra (pocillos en blanco) a la placa. Posteriormente, se añadieron 100 μL de anticuerpo conjugado con enzima a cada pocillo, y la placa se incubó a 37°C durante 60 minutos. Después de la incubación, se descartó el líquido y los pocillos se lavaron cinco veces con solución de lavado y se secaron sobre papel absorbente. Se añadieron los sustratos A y B (50 μL cada uno) a cada pocillo, y la placa se incubó a 37°C en la oscuridad durante 15 minutos para el desarrollo del color. La reacción se detuvo añadiendo 50 μL de solución de parada, y la absorbancia a 450 nm se midió en un plazo de 15 minutos utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de HMGB1 se calcularon trazando el logaritmo de las concentraciones estándar (eje X) frente a los valores de OD correspondientes (eje Y) y utilizando la curva estándar resultante.

Secuencia de ARN

Se aisló ARN total de 1×107 células DLD1, HCT116 o de 200 mg de tejido de colon de ratón utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (TransGen Biotech). Se construyeron bibliotecas de ARN por Majorbio (Shanghái, China) y se secuenciaron en la plataforma Illumina NovaSeq. Los datos brutos de la secuenciación de ARN se evaluaron y se controló su calidad utilizando el software FASTQC (v0.11.9). Luego, los datos se alinearon al genoma GRCm39 o GRCh38 utilizando HISAT2 (v2.2.1) y se calcularon los recuentos de genes con FeatureCounts (v1.28.1).

Lipidómica no dirigida

METWARE (Wuhan, China) realizó una lipidómica no dirigida utilizando ocho muestras de tejido de colon de tres ratones WT y cinco ratones CKO. Brevemente, las muestras se homogeneizaron con un molino de bolas (MM400, Retsch) y se analizaron en un sistema de espectrometría de masas UPLC–QTRAP 6500+ ExionLC AD (SCIEX) acoplado a una columna Thermo Accucore C30. Se realizó una elución en gradiente utilizando mezclas de acetonitrilo/agua y acetonitrilo/isopropanol que contenían 0,1% de ácido fórmico y 10 mM de formiato de amonio. La espectrometría de masas se realizó con una fuente de ionización por electrospray (ESI) a 500°C; el voltaje de pulverización de iones fue de 5500 V en modo positivo y de −4500 V en modo negativo. Los gases de la fuente se ajustaron de la siguiente manera: GS1 45 psi, GS2 55 psi, gas de cortina (CUR) 35 psi; la disociación activada por colisión (CAD) se ajustó a Medio. En el cuadrupolo triple, cada par de iones se monitorizó utilizando un potencial de declustración (DP) y una energía de colisión (CE) optimizados. La identificación de lípidos se basó en una base de datos MWDB personalizada, y la cuantificación se realizó en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM) utilizando el espectrómetro de masas de cuadrupolo triple.

Ensayos de palmitoilación

La palmitoilación de proteínas se detectó utilizando el método ABE.^[52] Brevemente, las células transfectadas con los plásmidos indicados se lisaron en 1 mL de tampón de lisis que contenía 50 mM de NEM, seguido de centrifugación (20 min, 12.000 rpm, 4°C) e inmunoprecipitación nocturna con perlas de agarosa anti-Flag o específicas para β-catenina. Después de tres lavados, los precipitados se dividieron en dos porciones iguales: una para el control –HAM y la otra para el tratamiento +HAM, que se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, los precipitados se lavaron una vez con tampón de lavado (1 M Tris-HCl, pH 6,5) y se incubaron con tampón BMCC-biotina (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 y 5 μM de BMCC-biotina) durante 1 hora a 4°C. Las muestras se lavaron dos veces con tampón de lavado, seguido de SDS-PAGE y Western blot. La β-catenina palmitoilada se detectó utilizando estreptavidina conjugada con HRP (Sangon Biotech; 1:200 en 0,5% de BSA).

Ensayo de S-nitrosilación

La S-nitrosilación se detectó utilizando el ensayo de conmutación de biotina.^[13],^[53] Brevemente, los lisados de células HCT116 o HEK293T transfectadas se incubaron en tampón HENS (250 mM HEPES, 1 mM EDTA, 0,1 mM Neocuproina, 2% SDS, pH 7,7) con 20 mM de S-metilmetanotiosulfonato (MMTS) a 50°C durante 20 minutos para bloquear las cisteínas libres. Las proteínas se precipitaron con acetona fría, se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón HENS (1% SDS) y se incubaron con 0,4 mM de biotina-HPDP y 5 mM de ascorbato de sodio a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. Las proteínas biotiniladas se purificaron utilizando perlas de estreptavidina-agarosa, se separaron por SDS-PAGE y se detectaron mediante inmunoblot.

Análisis SPR

El análisis SPR se realizó utilizando el sistema Biacore 8K (Cytiva) para evaluar la afinidad de unión de β-cat-Oxazol a la β-catenina. Los chips CM5 se activaron con N-hidroxisuccinimida y 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida metil yoduro (EDC), seguido de la inmovilización de β-catenina purificada (50 μg/mL en acetato de sodio, pH 5,0). La superficie se bloqueó con etanolamina para evitar la unión inespecífica. Se inyectaron concentraciones graduadas de β-cat-Oxazol sobre la proteína inmovilizada a una velocidad de flujo de 30 μL/min en un tampón de funcionamiento que contenía 0,05% de Tween 20 en PBS. Los datos SPR se recopilaron y se analizaron utilizando el software de evaluación Biacore Insight (Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.).

Análisis transcriptómico integrado

Los datos de secuenciación de ARN de ratones con deleción específica de Zdhhc5 en el epitelio intestinal, células HCT116 con deleción de CTNNB1 y células DLD1 con silenciamiento de ZDHHC5 se analizaron por separado. Se identificaron genes expresados diferencialmente (DEG) con un umbral de |log2 fold change (FC)| > 1 y p < 0,05. Las listas de DEG significativamente regulados a la baja de cada modelo se intersectaron con un conjunto de genes relacionados con la ferroptosis publicado^[37] para identificar objetivos candidatos comunes.

Análisis de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) y análisis de transcriptómica espacial

El conjunto de datos de scRNA-Seq de CRC GSE132465 y los metadatos de las células asociados se recuperaron de un estudio anterior.^[54] El conjunto de datos de transcriptómica espacial de CRC se obtuvo de otro estudio.^[38] El procesamiento y la visualización de los datos de scRNA-Seq y transcriptómica espacial se realizaron siguiendo las metodologías descritas en nuestra publicación anterior.^[55]

Análisis de modelado atómico

(i)Predicción de la estructura proteica 3D: Las estructuras complejas de ZDHHC5 y β-catenina se predijeron utilizando el programa multímero AlphaFold3.^[56] Se seleccionó la conformación con la puntuación de confianza más alta para la simulación y el análisis de dinámica molecular posteriores.(ii)Simulaciones de dinámica molecular: El paquete GROMACS (versión 2023.03; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352711015000059) se utilizó para realizar simulaciones de dinámica molecular convencionales, con el objetivo de investigar los cambios conformacionales en el complejo ZDHHC5-β-catenina. Se utilizó el campo de fuerza Amber14sb^[57] para la parametrización de proteínas, y el modelo de agua TIP3P (https://www.scopus.com/pages/publications/0004016501) se utilizó para la representación del disolvente. El complejo ZDHHC5-β-catenina se solvató en una caja de agua octédrica, y la carga del sistema se neutralizó añadiendo 0,150 M de NaCl. Inicialmente, se realizó una minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado durante 50.000 pasos para aliviar las colisiones estéricas. Posteriormente, se aplicaron restricciones de posición a los átomos pesados durante 50.000 pasos de las fases de equilibrio NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura). La temperatura del sistema se mantuvo a 300 K, y la presión se mantuvo a 1 bar. Después del equilibrio, se realizó una simulación de producción sin restricciones de 100 ns, y las coordenadas de la trayectoria y los parámetros de energía se guardaron cada 20 ps. Los patrones de interacción y las trayectorias dinámicas se visualizaron y analizaron utilizando ChimeraX.^[58](iii)Cálculos de energía libre y descomposición de residuos: El método MM-GBSA^[59] se utiliza ampliamente para estimar las energías libres de unión en la investigación de descubrimiento de fármacos. En este estudio, se realizaron cálculos MM-GBSA utilizando gmxMMPBSA,^[60], una herramienta compatible con GROMACS para los análisis MM-PBSA/MM-GBSA. Para dilucidar la base molecular de las interacciones ZDHHC5-β-catenina, se utilizó gmxMMPBSA para descomponer la energía libre de unión en contribuciones de residuos individuales.

Detección de alto rendimiento mediante cribado virtual de inhibidores de ZDHHC5/β-catenina utilizando estructuras de complejos dinámicas y acoplamiento en cascada.(i)Preparación y preprocesamiento de la estructura proteica: Las estructuras proteicas iniciales se preprocesaron utilizando el Asistente de preparación de proteínas (Schrödinger). Este procedimiento incluyó la asignación de órdenes de enlace, la adición de átomos de hidrógeno faltantes y la optimización de las redes de enlaces de hidrógeno con PROPKArot a pH fisiológico de 7,0. Se predijeron los posibles sitios de unión en la interfaz entre ZDHHC5 y β-catenina utilizando el módulo SiteMap. Posteriormente, se generaron rejillas de acoplamiento con la herramienta de generación de rejillas de receptor en Glide. Se definió una caja de delimitación cúbica de 20 × 20 × 20 Å, centrada en el sitio de unión identificado, para servir como el marco espacial preciso para todos los cálculos de acoplamiento molecular posteriores.(ii)Preparación de la base de datos de moléculas pequeñas: La base de datos de cribado se obtuvo de ChemDiv (https://www.chemdiv.com/) y se procesó utilizando el módulo LigPrep de Schrödinger. Los pasos de preprocesamiento incluyeron la desalación, la adición de átomos de hidrógeno, la generación de posibles estados de ionización a un pH objetivo de 7,0 ± 2,0 utilizando Epik, la enumeración de tautómeros y estereoisómeros y la minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS4.(iii)Cribado virtual: Se aplicó un filtro ADMET (absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad) inicial a las moléculas de la base de datos utilizando el módulo QuickProp de Schrödinger, conservando solo los compuestos que cumplían la regla de los cinco de Lipinski y no contenían grupos funcionales reactivos. Luego, se realizó un cribado virtual de alto rendimiento (HTVS) utilizando Glide retain, con GlideScore (GScore) como la función de puntuación principal. El 10% superior de los compuestos clasificados por la puntuación HTVS se conservó para el acoplamiento de precisión estándar (SP) posterior. Después de esto, el 10% superior de los compuestos de la etapa de acoplamiento SP, que empleó la función de puntuación Glide SP más rigurosa, se sometió a un acoplamiento de precisión extra (XP). La etapa de acoplamiento XP aplicó la función de puntuación Glide XP, que impone penalizaciones más estrictas por la desolvatación y las colisiones estéricas. El 10% superior de los compuestos del acoplamiento XP se analizó posteriormente utilizando el módulo Prime MM-GBSA y el modelo de solvatación VSGB 2.0 para calcular las energías libres de unión. Basándose en las puntuaciones MM-GBSA, los 30 compuestos principales se priorizaron para su adquisición y posterior validación experimental.(iiii)Análisis de simulación de dinámica molecular: Para refinar la pose de unión del compuesto principal, β-cat-Oxazol, en el complejo con β-catenina, se realizaron simulaciones de dinámica molecular utilizando Desmond. Se utilizó el campo de fuerza OPLS4 para la proteína y el ligando, y las moléculas de agua se modelaron explícitamente utilizando el modelo TIP3P. El complejo proteína-ligando se solvató en una caja de agua cúbica, manteniendo una distancia mínima de 10 Å desde la superficie de la proteína hasta el borde de la caja. El sistema se neutralizó con 0,150 M de sodio y iones cloruro. Se realizó una minimización de energía durante 50.000 pasos utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado. Esto fue seguido por una fase de equilibrio de 50.000 pasos bajo los conjuntos NVT (número constante de partículas, volumen y temperatura) y NPT (número constante de partículas, presión y temperatura), con restricciones armónicas aplicadas a los átomos pesados de la proteína. La temperatura y la presión del sistema se mantuvieron a 300 K y 1 bar utilizando el termostato de cadena de Nosé-Hoover y el barostato de Martyna-Tobias-Klein, respectivamente. Finalmente, se realizó una simulación de producción de 100 ns sin restricciones, y se guardaron los fotogramas de la trayectoria cada 10 ps para su análisis.

Cuantificación y análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó utilizando GraphPad Prism 9 y el software R. El análisis de supervivencia se llevó a cabo utilizando curvas de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la relación entre las variables. La significación estadística se estableció en p < 0,05 y se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE).