Las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal (CRLM) son un factor clave en la inmunosupresión sistémica y un determinante del mal pronóstico. Si bien la resección quirúrgica sigue siendo el pilar del tratamiento, la dinámica del entorno inmunitario tras la resección no se ha caracterizado suficientemente. El objetivo de este estudio es dilucidar la reprogramación inmunitaria tras la resección hepática en pacientes con CRLM, ofreciendo información sobre posibles estrategias terapéuticas. Se recogieron muestras de sangre periférica de pacientes con CRLM antes y después de la resección hepática.
Las células mononucleares de la sangre periférica se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica con paneles de inmunidad adaptativa e innata, y se procesaron con FlowJo y FlowAI. El microentorno inmunitario tumoral (TIME) se evaluó mediante H&E, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. El análisis postoperatorio reveló una remodelación de la composición de las células T, con un aumento significativo de la proporción de células T CD4+ entre las células T CD3+ circulantes, incluido el subconjunto CD28+ CD4+, mientras que las células T reguladoras y las células T foliculares auxiliares permanecieron sin cambios. La proporción general de células T CD8+ entre las células T CD3+ circulantes disminuyó.
Entre las poblaciones asociadas a los puntos de control inmunitario, el porcentaje de células T CD4+ TIM3+ disminuyó significativamente, mientras que las células T CD4+ PD-1+ y los subconjuntos de células T dobles positivas PD-1+ TIM3+ mostraron tendencias descendentes modestas. Las poblaciones inmunitarias innatas permanecieron en gran medida sin cambios. Los pacientes que experimentaron recurrencia presentaban una mayor proporción postoperatoria de células mieloides supresoras derivadas (M-MDSCs) S100A9+. Los análisis exploratorios sugirieron además que los tumores con mutación KRAS pueden estar asociados a perfiles inmunitarios postoperatorios distintos.
La resección de metástasis hepáticas se asocia a una remodelación inmunitaria sistémica dominada por las células T CD4+ y a cambios en los marcadores asociados al agotamiento, lo que sugiere hipotéticamente una posible ventana postoperatoria para futuras intervenciones inmunoterapéuticas. Aunque estos hallazgos son muy especulativos y requieren una validación funcional adicional, sugieren que el entorno alterado de las células T CD4+ justifica una mayor investigación sobre su posible relevancia para las terapias celulares adoptivas o la inhibición de los puntos de control inmunitario.
El cáncer colorrectal (CCR) se sitúa como el tercer cáncer más común a nivel mundial, con una incidencia global que supera los 1,9 millones de casos y una cifra de mortalidad de 903.859 en 2022 ([1]). El CCR metastásico (mCCR) representa una enfermedad compleja y multifacética, impulsada por diversos factores, y sigue teniendo un pronóstico devastador, con una tasa de supervivencia inferior al 15% ([2]). En las últimas décadas, las estrategias de tratamiento para la mayoría de las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (MCCR) se han basado en gran medida en la quimioterapia. La adición de terapias dirigidas contra el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y las vías de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) solo ha conducido a mejoras en los resultados en subconjuntos específicos de pacientes ([3], [4]). De hecho, la terapia neoadyuvante combinada con la resección quirúrgica R0 sigue siendo la piedra angular del tratamiento potencialmente curativo para las MCCR. Sin embargo, la recurrencia se produce en hasta el 55% al 80% de los pacientes después de la resección metastásica ([5]). En los últimos años, los inhibidores de los puntos de control inmunitario dirigidos a la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) han demostrado beneficios clínicos, pero su eficacia se limita a un pequeño subconjunto de pacientes con inestabilidad de microsatélites (MSI) ([6], [7]). Dada la asociación bien establecida entre la progresión de las MCCR y la inmunidad sistémica ([8]), obtener una comprensión más profunda del panorama inmunitario sistémico en las MCCR es esencial para desarrollar estrategias terapéuticas más eficaces.
El hígado es esencial para mantener la tolerancia inmunitaria, especialmente en enfermedades autoinmunes, trasplantes de órganos y cáncer ([9]–[11]). Los mecanismos subyacentes a la tolerancia inmunitaria hepática implican interacciones entre las células presentadoras de antígenos residentes en el hígado (células de Kupffer, células dendríticas y células endoteliales sinusoidales) y los linfocitos circulantes ([12]). Además, el hígado es el órgano inductor de la tolerancia para el trasplante, lo que permite que algunos receptores a largo plazo interrumpan la terapia inmunosupresora sin experimentar rechazo del injerto ([13]). En el cáncer, la metástasis hepática se asocia con una respuesta inmunoterapéutica reducida y una menor supervivencia libre de progresión en comparación con los pacientes sin metástasis hepática ([14]). En particular, los modelos de ratón preclínicos muestran que ([11]) las metástasis hepáticas dificultan las respuestas inmunoterapéuticas en los tumores subcutáneos y hepáticos. Sin embargo, la radioterapia dirigida al hígado puede restaurar la eficacia de la inmunoterapia contra la enfermedad extrahepática y mejorar la inmunidad antitumoral sistémica.
Las células T CD4+ desempeñan un papel fundamental en la coordinación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas ([15]). Durante la iniciación de las respuestas inmunitarias antitumorales, las células T CD4+ activan las CPA (células presentadoras de antígenos), lo que facilita la activación eficaz de los linfocitos T citotóxicos y apoya su diferenciación en células de memoria duraderas ([16], [17]). Además, las células T CD4+ secretan factor de necrosis tumoral (TNF) e IFNγ, que inducen la polarización de los macrófagos en un fenotipo tumoricida similar a M1, capaz de eliminar las células tumorales mediante la producción de óxido nítrico ([18]). Curiosamente, además de sus funciones de ayuda en la inmunidad antitumoral, la evidencia en humanos ha demostrado que un subconjunto de células T CD4+ puede erradicar directamente las células cancerosas, de forma similar a las células T CD8+ clásicas ([19]). Sin embargo, las células T CD4+ también pueden facilitar la iniciación y la progresión del tumor a través de funciones inmunosupresoras mediadas por las células T reguladoras. En consonancia con este concepto, estudios previos han informado de un aumento de la frecuencia de células T reguladoras circulantes durante la transición de adenoma a carcinoma ([20]).
Tanto en humanos como en ratones, las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) en el sistema inmunitario innato se clasifican ampliamente en dos subconjuntos principales: MDSC granulocíticas (G-MDSC) y MDSC monocíticas (M-MDSC) ([21]). Estos subconjuntos se distinguen por su origen en las ramas granulocíticas o monocíticas de la línea mieloide, respectivamente. La acumulación de M-MDSC desempeña un papel fundamental en la creación de un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) en el hígado ([22]). Al producir CCL7, que se une a CCR2 en las células micrometastásicas, las MDSC activan las células latentes a través de la vía JAK/STAT3 y promueven la progresión de las MCCR ([23]). Además, las MDSC no solo ayudan a evadir la vigilancia inmunitaria, sino que también apoyan la supervivencia de las células cancerosas a través de mecanismos no inmunitarios, como la estimulación de la angiogénesis, la promoción de la remodelación de los tejidos y la facilitación de la metástasis ([24], [25]). Sin embargo, su heterogeneidad plantea un desafío importante para dirigir e inhibir eficazmente sus funciones ([26]). Por lo tanto, investigar los niveles y la dinámica de las MDSC circulantes en los pacientes con MCCR es crucial para desarrollar estrategias terapéuticas dirigidas.
Es importante destacar que se ha demostrado que las firmas inmunitarias periféricas reflejan la carga tumoral y los patrones metastásicos. En las neoplasias gastrointestinales, las alteraciones en los subconjuntos de células mieloides circulantes y los fenotipos de agotamiento de las células T se han asociado con la enfermedad avanzada y la metástasis hepática ([11], [27]). Los análisis integrativos multiómicos recientes destacan aún más que los estados inmunitarios periféricos pueden recapitular los programas transcripcionales intratumorales, lo que subraya la relevancia del perfilamiento inmunitario basado en sangre como sustituto de la inmunología tisular ([28]).
En este estudio, nuestro objetivo es caracterizar los cambios y los patrones del panorama inmunitario sistémico antes y después de la resección hepática y explorar la correlación entre las características inmunitarias clave asociadas con los resultados clínicos y la progresión de la enfermedad.
Materiales y métodos
Recolección de muestras clínicas humanas
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Ética de la Investigación (IRB) del Centro de Salud de la Universidad McGill (MUHC) (protocolo n.º SDR-11-066). Criterios de inclusión: Los pacientes eran elegibles para la inclusión si tenían un diagnóstico confirmado de MCCR resecable con intención curativa y no presentaban evidencia de metástasis distantes más allá del hígado. La mayoría de los pacientes se habían sometido a la resección de su tumor primario antes de la cirugía hepática, lo que permitió una evaluación precisa del estado inmunitario basal, limitado a la enfermedad hepática. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión. Las muestras de sangre se obtuvieron del Biobanco de Enfermedades Hepáticas del MUHC y se recolectaron de pacientes que se sometieron a lobectomía o hepatectomía parcial en el Royal Victoria Hospital en Montreal, QC, Canadá. Las reseciones quirúrgicas se realizaron entre diciembre de 2022 y mayo de 2024. Los datos clínicos se extrajeron de las bases de datos de los hospitales y los registros médicos. Los datos de los pacientes se recopilaron y analizaron hasta el 25 de junio de 2024, lo que sirvió como fecha límite para este estudio.
Inicialmente, un total de 26 pacientes fueron elegibles para nuestro estudio. De estos, nueve fueron excluidos posteriormente en función de los siguientes criterios (Figura Suplementaria 1): uno debido a una resección no R0, uno porque no se detectaron metástasis hepáticas durante la ecografía intraoperatoria y dos después de un diagnóstico patológico de tumor metastásico del intestino delgado. Además, se excluyeron cinco pacientes que experimentaron una recurrencia postoperatoria muy temprana, confirmada en dos meses a través de niveles elevados de antígeno carcinoembrionario (CEA), hallazgos de tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética (RM) con contraste y examen físico. Estos pacientes fueron excluidos porque la recurrencia muy temprana probablemente reflejaba la presencia de enfermedad micrometastásica residual u oculta de rápida progresión en el momento de la cirugía, lo que podría afectar sustancialmente la evaluación del remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio tras una resección R0 con intención curativa. Por lo tanto, el presente análisis se diseñó para evaluar los cambios inmunitarios perioperatorios en pacientes que lograron un curso postoperatorio inicial libre de enfermedad con un mínimo de dos meses. En consecuencia, se recolectaron muestras de sangre de los 17 pacientes restantes con MCCR en el quirófano (OR) antes de la incisión quirúrgica y en el período de seguimiento libre de enfermedad, que osciló entre 3,0 y 16,9 semanas después de la resección hepática. Los cronogramas detallados de muestreo preoperatorio y postoperatorio se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
Citometría de flujo
En resumen, se recolectaron de 4 a 6 ml de muestras de sangre total y se almacenaron en tubos EDTA (tubos de recolección de sangre de plástico BD Vacutainer con K2EDTA: cierre Hemogard de 6 ml; Fischer). Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron de la sangre utilizando el kit de aislamiento de PBMC humanas EasySep Direct (Stem Cell; Cat #19654) y el imán EasySep (Stem Cell; Cat #18001), siguiendo el protocolo del fabricante. Para detectar y excluir las células muertas, se añadió tinte de viabilidad eFluor780 (ThermoFisher Scientific; Cat #65-0865-14) a cada muestra y se incubó sobre hielo, cubierto con papel de aluminio, durante 20 minutos. Después de lavar con tampón de tinción (BD Biosciences; Cat #554656), las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos extracelulares, como se indica a continuación, durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con 1 ml de tampón de tinción y se resuspendieron en 1 ml de tampón de fijación/permeabilización recién preparado (BD Biosciences; Cat #562574) durante 40 a 50 minutos. Después de lavar con tampón de permeabilización/lavado (BD Biosciences; Cat #562574), las células se sometieron a tinción con anticuerpos intracelulares, como se indica a continuación. Se realizaron controles de compensación utilizando cuentas para garantizar la configuración constante del citómetro. Además, se realizaron controles de menos uno de fluorescencia (FMO) para los marcadores con el fin de establecer la delimitación negativa.
Se desarrollaron dos paneles (cada uno utilizando 1 millón de PBMC): un panel de inmunidad innata, diseñado principalmente para caracterizar la población de células derivadas de la médula ósea, y un panel de inmunidad adaptativa, destinado a examinar la expresión de células T y los marcadores de puntos de control inmunitario para explorar el microambiente inmunosupresor sistémico asociado con la metástasis hepática. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: Panel de inmunidad innata: CD45 (Clon HI30, BUV395, BD Biosciences; Cat #563792), CD11b (Clon M1/70, BV650, BioLegend; Cat #101259), CD14 (Clon MφP9, PerCP, BD Biosciences; Cat #340585), CD15 (Clon HI98, PE, BD Biosciences; Cat #555402), HLA-DR (Clon L243, PE-Cy7, BioLegend; Cat #307616), CD20 (Clon 2H7, BUV737, BD Biosciences; Cat #612848), CD3 (Clon UCHT1, BV510, BD Biosciences; Cat #563109), MRP14 (Clon MRP 1H9, APC, BioLegend; Cat #350708). Panel de inmunidad adaptativa: CD45 (el mismo que el panel de inmunidad innata), CD4 (RPA-P4, FITC, BD Biosciences; Cat #555346), CD8 (Clon RPA-T8, APC, BD Biosciences; Cat #555369), CD279 (PD-1) (Clon EH12.1, BV711, BD Biosciences; Cat #564017), CD366 (Clon 344823, BV650, BD Biosciences; Cat #747960), CD178 (Ligando Fas) (Clon NOK-1, BV605, BD Biosciences; Cat #744099), CD185 (Clon RF8B2, BB700, BD Biosciences; Cat #566469), CD25 (Clon M-A251, PE-Cy7, BD Biosciences; Cat #61405), CD28 (Clon CD28.2, PE-CF594, BD Biosciences; Cat #562296), LAG-3 (Clon T47-530, BD Biosciences; Cat #565616), CD138 (Clon MI15, BUV737, BD Biosciences; Cat #612834), CD3 (el mismo que el panel de inmunidad innata), FoxP3 (Clon 259D/C7, R718, BD Biosciences; Cat #566935). La delimitación representativa de la citometría de flujo se muestra en (Figura Suplementaria 2, S4).
Análisis de datos de citometría de flujo
FlowJo_v10.10.0 se utilizó para el análisis posterior, mientras que Flow AI se empleó para el control de calidad de todas las muestras. Esta herramienta elimina eficazmente los eventos no deseados de los datos de citometría de flujo, lo que garantiza un análisis de alta calidad ([29]). Solo se incluyeron en el análisis las poblaciones celulares en las que la proporción de "Eventos buenos" superaba el 70%, según lo determinado por el filtrado de Flow AI. Cabe señalar que los recuentos absolutos de células inmunitarias no estaban disponibles en este estudio.
Tinción con hematoxilina y eosina
Realizamos la tinción de muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) según se describe en publicaciones anteriores ([30]). Brevemente, las muestras de pacientes con CRLM resecadas se fijaron en formalina e incluyeron en parafina (FFPE), y luego se cortaron en secciones de 4 μm para la evaluación histopatológica. Tras la fijación en paraformaldehído y la inclusión, las secciones se colocaron en portaobjetos recubiertos. Las secciones de CRLM se desparafinaron en xileno y se rehidrataron mediante una serie de etanol graduado. Las secciones se lavaron en agua destilada y se tiñeron con hematoxilina, seguida de una breve incubación en un reactivo de azulado. Después del lavado, las láminas se contratiñeron con eosina, se deshidrataron en una serie de etanol graduado, se aclararon en xileno y se montaron con el medio de montaje Permount™. Se permitió que las secciones teñidas se secaran por completo antes de la obtención de imágenes.
Inmunohistoquímica
Se realizaron análisis inmunohistoquímicos en secciones de tumores CRLM FFPE siguiendo protocolos estándar ([31]). La recuperación del antígeno se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra TIM3 (Abcam, ab241332, 1:1000), CD4 (Abcam, ab133616, 1:1200), CTLA4 (Abcam, ab237712, 1:250). La detección se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados (Dako, K4003). Las láminas teñidas se escanearon con un aumento de 20× utilizando el sistema Aperio AT Turbo. Se realizaron análisis cuantitativos de las células positivas para el marcador en regiones de interés definidas.
Inmunofluorescencia
Las secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinaron y rehidrataron utilizando procedimientos estándar. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante tratamiento térmico en tampón Tris/EDTA (10 mM, pH 9.0). La permeabilización del tejido se realizó con tampón PBS (PBS que contiene 0,5% de Triton X-100), seguida de bloqueo con 5% de suero de cabra en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-CD68 conjugado con FITC (ThermoFisher Scientific, MA1-82715, 1:20) y el anticuerpo primario anti-TIM3 (Abcam, ab241332, 1:300). Después del lavado con PBST, las láminas se incubaron con el anticuerpo secundario IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor™ 647 (Invitrogen, A27040) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó la contratinción nuclear utilizando DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248, 1:1000) durante 10 minutos. Finalmente, las secciones se montaron con Fluoromount (Invitrogen, 5018788) y se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Zeiss LSM780.
Análisis estadístico
La comparación estadística entre las regiones de interés se realizó utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.5.1) y SPSS (versión 27). Los datos se presentaron como media ± DE o mediana con IQR, según corresponda. La significación estadística se evaluó utilizando pruebas adecuadas basadas en la distribución de los datos. La comparación entre dos grupos se realizó utilizando una prueba t de dos colas. Los análisis de correlación entre las características clínicas y las frecuencias de las células inmunitarias se evaluaron utilizando el coeficiente de correlación de rango de Spearman. La matriz de correlación por pares se visualizó utilizando un mapa de calor que refleja la fuerza de la correlación. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.
Recolección de muestras clínicas humanas
Este estudio se llevó a cabo en cumplimiento de las directrices del Comité de Ética de la Investigación (IRB) del Centro de Salud de la Universidad McGill (MUHC) (protocolo n.º SDR-11-066). Criterios de inclusión: Los pacientes eran elegibles para la inclusión si tenían un diagnóstico confirmado de CRLM resecable con intención curativa y no presentaban evidencia de metástasis distantes más allá del hígado. La mayoría de los pacientes se habían sometido a la resección de su tumor primario antes de la cirugía hepática, lo que permitió una evaluación precisa del estado inmunitario basal limitado a la enfermedad hepática. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión. Las muestras de sangre se obtuvieron del Biobanco de Enfermedades Hepáticas del MUHC y se recolectaron de pacientes que se sometieron a lobectomía o hepatectomía parcial en el Royal Victoria Hospital en Montreal, QC, Canadá. Las reseciones quirúrgicas se realizaron entre diciembre de 2022 y mayo de 2024. Los datos clínicos se extrajeron de las bases de datos de los hospitales y los registros médicos. Los datos de los pacientes se recopilaron y analizaron hasta el 25 de junio de 2024, lo que sirvió como fecha límite para este estudio.
Un total de 26 pacientes fueron inicialmente elegibles para nuestro estudio. De estos, nueve fueron excluidos posteriormente en función de los siguientes criterios (Figura Suplementaria 1): uno debido a una resección no R0, uno porque no se detectaron metástasis hepáticas durante la ecografía intraoperatoria y dos tras un diagnóstico patológico de tumor metastásico del intestino delgado. Además, se excluyeron cinco pacientes que experimentaron una recurrencia postoperatoria muy temprana, confirmada en dos meses mediante niveles elevados de antígeno carcinoembrionario (CEA), hallazgos de tomografía computarizada o resonancia magnética con contraste y examen físico. Estos pacientes fueron excluidos porque la recurrencia muy temprana probablemente reflejó la presencia de enfermedad micrometastásica residual oculta o de rápida progresión en el momento de la cirugía, lo que podría afectar sustancialmente la evaluación del remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio tras una resección R0 con intención curativa. Por lo tanto, el presente análisis se diseñó para evaluar los cambios inmunitarios perioperatorios en pacientes que lograron un curso postoperatorio inicial libre de enfermedad con un mínimo de dos meses. En consecuencia, se recolectaron muestras de sangre de los 17 pacientes restantes con CRLM en el quirófano (OR) antes de la incisión quirúrgica y en el período de seguimiento libre de enfermedad, que osciló entre 3,0 y 16,9 semanas después de la resección hepática. Los cronogramas detallados de muestreo preoperatorio y postoperatorio se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
Citometría de flujo
En resumen, se recolectaron de 4 a 6 ml de muestras de sangre total y se almacenaron en tubos EDTA (Tubos de recolección de sangre de plástico BD Vacutainer con K2EDTA: cierre Hemogard de 6 ml; Fischer). Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se aislaron de la sangre utilizando el kit de aislamiento de PBMC humanas EasySep Direct (Stem Cell; Cat #19654) y el imán EasySep (Stem Cell; Cat #18001), siguiendo el protocolo del fabricante. Para detectar y excluir las células muertas, se añadió tinte de viabilidad eFluor780 (ThermoFisher Scientific; Cat #65-0865-14) a cada muestra y se incubó sobre hielo, cubierto con papel de aluminio, durante 20 minutos. Después del lavado con tampón de tinción (BD Biosciences; Cat #554656), las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos extracelulares, como se indica a continuación, durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con 1 ml de tampón de tinción y se resuspendieron en 1 ml de tampón de fijación/perm (BD Biosciences; Cat #562574) recién preparado durante 40 a 50 minutos. Después del lavado con tampón de perm/lavado (BD Biosciences; Cat #562574), las células se sometieron a tinción con anticuerpos intracelulares, como se indica a continuación. Se realizaron controles de compensación utilizando cuentas para garantizar la configuración consistente del citómetro. Además, se realizaron controles de menos uno de fluorescencia (FMO) para los marcadores con el fin de establecer la delimitación negativa.
Se desarrollaron dos paneles (cada uno utilizando 1 millón de PBMC): un panel de inmunidad innata, diseñado principalmente para caracterizar la población de células derivadas de mieloides, y un panel de inmunidad adaptativa, destinado a examinar la expresión de las células T y los marcadores de los puntos de control inmunitario para explorar el ambiente inmunosupresor sistémico asociado con la metástasis hepática. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: Panel de inmunidad innata: CD45 (Clon HI30, BUV395, BD Biosciences; Cat #563792), CD11b (Clon M1/70, BV650, BioLegend; Cat #101259), CD14 (Clon MφP9, PerCP, BD Biosciences; Cat #340585), CD15 (Clon HI98, PE, BD Biosciences; Cat #555402), HLA-DR (Clon L243, PE-Cy7, BioLegend; Cat #307616), CD20 (Clon 2H7, BUV737, BD Biosciences; Cat #612848), CD3 (Clon UCHT1, BV510, BD Biosciences; Cat #563109), MRP14 (Clon MRP 1H9, APC, BioLegend; Cat #350708). Panel de inmunidad adaptativa: CD45 (el mismo que el panel de inmunidad innata), CD4 (RPA-P4, FITC, BD Biosciences; Cat #555346), CD8 (Clon RPA-T8, APC, BD Biosciences; Cat #555369), CD279 (PD-1) (Clon EH12.1, BV711, BD Biosciences; Cat #564017), CD366 (Clon 344823, BV650, BD Biosciences; Cat #747960), CD178 (Ligando Fas) (Clon NOK-1, BV605, BD Biosciences; Cat #744099), CD185 (Clon RF8B2, BB700, BD Biosciences; Cat #566469), CD25 (Clon M-A251, PE-Cy7, BD Biosciences; Cat #61405), CD28 (Clon CD28.2, PE-CF594, BD Biosciences; Cat #562296), LAG-3 (Clon T47-530, BD Biosciences; Cat #565616), CD138 (Clon MI15, BUV737, BD Biosciences; Cat #612834), CD3 (el mismo que el panel de inmunidad innata), FoxP3 (Clon 259D/C7, R718, BD Biosciences; Cat #566935). La delimitación representativa de la citometría de flujo se muestra en (Figura Suplementaria 2, S4).
Análisis de datos de citometría de flujo
FlowJo_v10.10.0 se utilizó para el análisis posterior, mientras que Flow AI se empleó para el control de calidad de todas las muestras. Esta herramienta elimina eficazmente los eventos no deseados de los datos de citometría de flujo, lo que garantiza un análisis de alta calidad ([29]). Solo se incluyeron en el análisis las poblaciones celulares en las que la proporción de "Eventos buenos" superaba el 70%, según lo determinado por el filtrado de Flow AI. Cabe señalar que los recuentos absolutos de células inmunitarias no estaban disponibles en este estudio.
Tinción con hematoxilina y eosina
Realizamos la tinción de muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) según se describe en publicaciones anteriores ([30]). Brevemente, las muestras de pacientes con CRLM resecadas se fijaron en formalina e incluyeron en parafina (FFPE), y luego se cortaron en secciones de 4 μm para la evaluación histopatológica. Tras la fijación en paraformaldehído y la inclusión, las secciones se colocaron en portaobjetos recubiertos. Las secciones de CRLM se desparafinaron en xileno y se rehidrataron mediante una serie de etanol graduado. Las secciones se lavaron en agua destilada y se tiñeron con hematoxilina, seguida de una breve incubación en un reactivo de azulado. Después del lavado, las láminas se contratiñeron con eosina, se deshidrataron en una serie de etanol graduado, se aclararon en xileno y se montaron con el medio de montaje Permount™. Se permitió que las secciones teñidas se secaran por completo antes de la obtención de imágenes.
Inmunohistoquímica
Se realizaron análisis inmunohistoquímicos en secciones de tumores CRLM FFPE siguiendo protocolos estándar ([31]). La recuperación del antígeno se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra TIM3 (Abcam, ab241332, 1:1000), CD4 (Abcam, ab133616, 1:1200), CTLA4 (Abcam, ab237712, 1:250). La detección se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados (Dako, K4003). Las láminas teñidas se escanearon con un aumento de 20× utilizando el sistema Aperio AT Turbo. Se realizaron análisis cuantitativos de las células positivas para el marcador en regiones de interés definidas.
Inmunofluorescencia
Las secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinaron y rehidrataron utilizando procedimientos estándar. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante tratamiento térmico en tampón Tris/EDTA (10 mM, pH 9.0). La permeabilización del tejido se realizó con tampón PBS (PBS que contiene 0,5% de Triton X-100), seguida de bloqueo con 5% de suero de cabra en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-CD68 conjugado con FITC (ThermoFisher Scientific, MA1-82715, 1:20) y el anticuerpo primario anti-TIM3 (Abcam, ab241332, 1:300). Después del lavado con PBST, las láminas se incubaron con el anticuerpo secundario IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor™ 647 (Invitrogen, A27040) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó la contratinción nuclear utilizando DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248, 1:1000) durante 10 minutos. Finalmente, las secciones se montaron con Fluoromount (Invitrogen, 5018788) y se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Zeiss LSM780.
Análisis estadístico
Se realizó una comparación estadística entre las regiones de interés utilizando el software GraphPad Prism (versión 9.5.1) y SPSS (versión 27). Los datos se presentaron como media ± DE o mediana con rango intercuartílico (RIC), según corresponda. La significación estadística se evaluó utilizando pruebas adecuadas basadas en la distribución de los datos. La comparación entre dos grupos se realizó utilizando una prueba t de dos colas. Los análisis de correlación entre las características clínicas y las frecuencias de las células inmunitarias se evaluaron utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. La matriz de correlación por pares se visualizó utilizando un mapa de calor que refleja la fuerza de la correlación. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p < 0,05.
Resultados
Características demográficas y clínicas basales
Este estudio incluyó a 17 pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (CRLM), todos los cuales se sometieron a resección hepática y terapia adyuvante en el MUHC. Las características basales de los pacientes, incluido el edad, el sexo, el estado de los genes NGS y el historial de quimioterapia, etc., se resumen en la (Tabla suplementaria 2). La mayoría de los pacientes se habían sometido a una resección del tumor primario antes de la cirugía hepática. Un paciente se sometió a una resección simultánea tanto de la lesión colorrectal primaria como de las metástasis hepáticas, mientras que otro recibió un procedimiento destinado a la preservación anal. Además, el 58,8% de los pacientes presentaba una mutación de KRAS en el tumor primario. Se administró quimioterapia neoadyuvante al 64,7% de los pacientes antes de la resección de las metástasis hepáticas. Cabe destacar que también analizamos las características basales de los pacientes excluidos, y nuestro análisis no demostró diferencias significativas en todos los parámetros clínicos.
Aumento de la frecuencia de células CD4+ y disminución de la frecuencia de células CD8+ después de la resección hepática en pacientes con CRLM
Para investigar los cambios en las poblaciones inmunitarias, establecimos dos paneles: uno centrado en la inmunidad adaptativa y el otro en la inmunidad innata. Los linfocitos T y sus subpoblaciones se analizaron utilizando el panel de inmunidad adaptativa. Para cada panel, se recolectaron entre 10 y 000 eventos utilizando el analizador de células LSRFortessa™. Luego, se aplicó el complemento Flow AI en el software FlowJo para filtrar y retener los "Eventos buenos" para el análisis de subconjuntos (Figura 1A). De los 17 pacientes incluidos inicialmente, 15 (n = 15) se analizaron en el panel adaptativo, ya que dos muestras tenían menos del 70% de "Eventos buenos". La estrategia de clasificación se presenta en la Figura suplementaria 2.
Evaluamos las proporciones relativas de células CD8+ y CD4+ entre las células T CD3+ aisladas de la sangre periférica, estratificadas por puntos de tiempo preoperatorios y postoperatorios utilizando gráficos de columnas o gráficos individuales. La frecuencia de células T CD8+ disminuyó significativamente en el estado libre de enfermedad en comparación con los controles preoperatorios (p = 0,0015), mientras que la frecuencia de células T CD4+ aumentó significativamente después de la resección de las metástasis hepáticas (p = 0,0005). Un análisis del cambio de pliegue (postoperatorio/preoperatorio) reveló valores significativamente diferentes de una relación de 1 para ambas poblaciones, CD8+ y CD4+ (p < 0,0001) (Figuras 1B, C). En conjunto, estos resultados reflejan una remodelación postoperatoria distinta de la composición de las células T sistémicas.
Patrones de expresión de CD28 y CD178 en células CD8+ y CD4+ antes y después de la resección hepática
La unión del receptor CD28 en las células T proporciona una señal coestimuladora esencial que trabaja en conjunto con la activación del receptor de células T (TCR) para iniciar la activación de las células T naive ([32]). Para comprender mejor el estado funcional de las células T en el contexto del CRLM, evaluamos la expresión de CD28+ en los linfocitos T. Nuestros resultados demostraron que no hubo un cambio significativo en el porcentaje de células T CD28+ CD8+ después de la resección hepática, con valores medios del 60,53% y del 63,18% en los grupos preoperatorio y postoperatorio, respectivamente (Figura 2A). Sin embargo, el porcentaje de células T CD28+ CD4+ aumentó significativamente después de la cirugía (p = 0,0382) y el valor medio aumentó hasta el 96,49% en el grupo postoperatorio (Figura 2B). CD178 (FasL, CD95L, TNFSF6), un miembro de la familia de factores de muerte del factor de necrosis tumoral, desempeña un papel en la citotoxicidad de las células T y NK a través de la apoptosis mediada por Fas/FasL ([33]). Para investigar si la resección hepática proporcionó alguna ventaja en el grupo postoperatorio en comparación con el grupo preoperatorio, analizamos la expresión de CD178. Como se muestra en las Figuras 2C y 2D, no se observaron diferencias significativas en la expresión de CD178 en las células T CD8+ y CD4+ después de la resección.
Panorama inmunitario de los subconjuntos de células e inhibidores inmunitarios antes y después de la cirugía
Para dilucidar aún más las alteraciones inmunitarias asociadas con la resección hepática, analizamos las frecuencias de los principales subconjuntos de células inmunitarias y los indicadores de superficie del agotamiento de las células T. La subpoblación Tfh, caracterizada como CD3+CD4+CXCR5+ (Figura suplementaria 2C), no mostró diferencias significativas pre- y postoperatoriamente, con frecuencias medias del 8,044% y del 8,652%, respectivamente (p = 0,6953) (Figura suplementaria 3A). De manera similar, las células Treg, identificadas como CD3+CD4+CD25+FoxP3+ (Figura suplementaria 2C**), mostraron niveles consistentes antes y después de la cirugía, con frecuencias medias del 2,273% y del 1,931% (p = 0,2545) (Figura suplementaria 3B). Las células B (CD45+CD3-CD20+) también se mantuvieron estables, sin cambios significativos observados entre los grupos pre- y postoperatorios (p = 0,8536) (Figuras suplementarias 3C, 4B).
Además, examinamos cuatro marcadores de coinhibición distintos: PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3, que se sabe que están críticamente asociados con el agotamiento de las células T CD8+ y CD4+ en pacientes con CRLM ([34]). Entre estos, la frecuencia de células T CD4+ TIM3+ se redujo significativamente después de la cirugía, disminuyendo de una media del 39,98% preoperatoriamente a 25,70% postoperatoriamente (p = 0,0353) (Figura 3C). Por el contrario, no se observaron cambios significativos en la expresión de PD-1, CTLA4 o LAG3 en las células T CD8+ o CD4+ (Figuras 3A, B, D). Además, se observó una tendencia a la disminución en la frecuencia de células doblemente positivas PD-1+ TIM3+ en los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ después de la resección hepática (Figura suplementaria 5).
En el panel de inmunidad innata, las frecuencias de las células mieloides (CD11b+), los monocitos y las M-MDSC no cambiaron después de la cirugía (p > 0,05) (Figuras suplementarias 3D–F, 4A), lo que indica un perfil de inmunidad innata ampliamente conservado. En general, estos resultados sugieren una remodelación postoperatoria selectiva de las características de agotamiento de las células T, mientras que las poblaciones de inmunidad innata permanecen en gran medida inafectadas.
Para garantizar que estos patrones selectivos de remodelación de las células T postoperatorias y las alteraciones de los puntos de control no se vieran afectados por la ventana de recolección de sangre relativamente amplia (de 3,0 a 16,9 semanas) o la cinética en curso de la curación de la herida quirúrgica, realizamos un análisis de validación exhaustivo (Figura suplementaria 6). Los análisis de correlación demostraron que los intervalos de muestreo postoperatorios no estaban significativamente asociados con las frecuencias de las principales poblaciones de células inmunitarias circulantes, incluidas las células T CD4+, las células T CD8+, las células T CD28+ CD4+, las células T CD4+ TIM3+ y las M-MDSC S100A9+ (Figura suplementaria 6A). Además, cuando la cohorte se estratificó en grupos de muestreo temprano (≤ 5 semanas postoperatorias) y tardío (> 5 semanas postoperatorias), las trayectorias características observadas en la cohorte general, específicamente el aumento postoperatorio significativo en la proporción de células T CD4+, la disminución en la proporción de células T CD8+ y la reducción en la proporción de células T CD4+ TIM3+, siguieron siendo evidentes en el grupo de muestreo temprano y mostraron tendencias similares en el grupo de muestreo tardío. Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles postoperatorios de estos principales subconjuntos inmunitarios entre los grupos de muestreo temprano y tardío (Figuras suplementarias 6B–D).
En conjunto, estos hallazgos respaldan que las alteraciones inmunitarias sistémicas observadas están asociadas principalmente con la eliminación de la masa tumoral en lugar de variaciones en la cinética de recuperación postoperatoria.
Impacto de la quimioterapia neoadyuvante en la expresión de las células inmunitarias sistémicas en pacientes con CRLM
La quimioterapia neoadyuvante es un pilar fundamental en el manejo del cáncer colorrectal metastásico. Planteamos la hipótesis de que dicho tratamiento podría influir en los perfiles inmunitarios sistémicos. Para probar esto, estratificamos toda la cohorte según si los pacientes habían recibido o no quimioterapia neoadyuvante dirigida a las metástasis hepáticas (Tabla suplementaria 2). Todos los pacientes que se sometieron a terapia neoadyuvante recibieron regímenes estándar basados en 5-fluorouracilo (FOLFOX, CAPOX o FOLFIRI). Luego, comparamos las poblaciones de células inmunitarias periféricas entre los dos grupos en los puntos de tiempo preoperatorio y postoperatorio. La estratificación por administración de quimioterapia neoadyuvante no reveló diferencias significativas en ninguno de los compartimentos inmunitarios adaptativos o innatos en ambos puntos de tiempo (p > 0,05; Tabla suplementaria 3). Por el contrario, los pacientes que respondieron a la terapia mostraron niveles preoperatorios significativamente más bajos de M-MDSC circulantes y niveles más altos de monocitos en comparación con los no respondedores (Figura 4A). Estos hallazgos sugieren que los niveles elevados de M-MDSC preoperatorios pueden estar asociados con una menor sensibilidad al tratamiento.
Cabe señalar que la terapia neoadyuvante para las metástasis hepáticas se suspendió 4 semanas antes de la recolección de muestras y la resección quirúrgica.
Análisis exploratorio de las asociaciones entre las células inmunitarias y los parámetros clínicos
Para explorar de manera exploratoria las posibles asociaciones entre los subconjuntos de células inmunitarias circulantes y los parámetros clínicos, realizamos análisis de correlación de Spearman en todas las variables medidas, generando dos matrices de correlación completas correspondientes a los conjuntos de datos preoperatorios y postoperatorios (Figuras 4E, 5D). Las variables que exhibían correlaciones fuertes (|r| ≥ 0,6) y estadísticamente significativas se marcaron con asteriscos.
En el conjunto de datos preoperatorio, el sexo mostró una correlación positiva significativa con los niveles de M-MDSC circulantes (r = 0,666, p < 0,05; Figura 4E). Para validar aún más este hallazgo, comparamos las frecuencias de M-MDSC preoperatorias entre los pacientes masculinos y femeninos, lo que demostró que las pacientes femeninas presentaban niveles significativamente más altos de M-MDSC circulantes antes de la cirugía (Figura 4B), lo que sugiere un estado inmunosupresor mieloide preoperatorio en las pacientes femeninas. Es interesante destacar que los puntos de datos femeninos fueron más consistentes entre los pacientes que en la cohorte masculina, que demostró mucha variabilidad. Aunque el conjunto de datos es pequeño, esta significación justifica más investigaciones.
El estado de la mutación de KRAS se correlacionó significativamente con dos subconjuntos de inmunidad adaptativa, mostrando una correlación positiva con las células Tfh preoperatorias (r = 0,853, p < 0,05) y una correlación negativa con las células T CD4+ CTLA4+ preoperatorias (r = -0,853, p < 0,05; Figura 4E). Coherente con estas correlaciones, la comparación de grupos demostró que los pacientes con mutación de KRAS tenían frecuencias de Tfh preoperatorias significativamente más bajas y porcentajes de células T CD4+ CTLA4+ más altos en comparación con el grupo de tipo salvaje de KRAS (Figura 4C). Además, los niveles de hemoglobina preoperatorios se correlacionaron inversamente con la frecuencia de Treg circulante (Figura 4D). En conjunto, estos hallazgos sugieren que los pacientes con mutación de KRAS exhiben un fenotipo inmunológico agotado e inmunosupresor, y que la hipoxia o la anemia sistémica pueden contribuir a los niveles elevados de Treg circulantes.
En el conjunto de datos postoperatorio (Figura 5), el diámetro máximo de las metástasis hepáticas se correlacionó positivamente con la proporción de células B circulantes postoperatorias (r = 0,557, p = 0,041; Figura 5A), lo que sugiere que los pacientes con una carga tumoral más grande conservan niveles más altos de células B sistémicas después de la cirugía. Los niveles de hemoglobina postoperatorios también se correlacionaron positivamente con las frecuencias de Tfh circulantes (r = 0,639, p = 0,012; Figura 5B). Además, las células T CD4+ PD1+ postoperatorias se asociaron positivamente con los niveles de Treg postoperatorios (r = 0,529, p = 0,045; Figura 5C).
En conjunto, si bien estas asociaciones estadísticas sugieren nuevas conexiones entre la inmunidad sistémica y las características clínicas, reconocemos que estos hallazgos preliminares están limitados por el pequeño tamaño de la cohorte y requieren validación en poblaciones de pacientes más grandes e independientes para confirmar una inferencia estadística sólida.
Análisis exploratorio del remodelamiento inmunitario sistémico y el microambiente tumoral inmunitario, estratificado por el estado de KRAS
Dado que existen características inmunitarias preoperatorias distintas entre los pacientes con mutación de KRAS y los de tipo salvaje, a continuación, evaluamos cómo el estado de KRAS influyó en el remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio mediante el análisis de muestras pre- y postoperatorias emparejadas dentro de cada subgrupo. Coherente con nuestras observaciones previas, las frecuencias de células T CD8+ disminuyeron significativamente después de la resección hepática, mientras que las células T CD4+ aumentaron notablemente después de la resección hepática en el grupo con mutación de KRAS (Figura 6A). En contraste, estos cambios dinámicos no se observaron en el grupo con KRAS de tipo salvaje (Figura suplementaria 7A), y los niveles basales de células T CD8+ y CD4+ no difirieron entre los subgrupos con mutación de KRAS y de tipo salvaje (Figura suplementaria 7B).
En el microambiente tumoral inmunitario (TIME), la tinción con H&E de los especímenes tumorales resecados reveló una arquitectura tumoral preservada con componentes estromales variables entre los pacientes (Figura 6B). Para caracterizar aún más el TIME en relación con el estado de KRAS, realizamos análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes en tejidos tumorales quirúrgicos de siete pacientes con mutación de KRAS y cinco pacientes con KRAS de tipo salvaje. La evaluación cuantitativa de la inmunohistoquímica demostró una expresión significativamente mayor de TIM3 en la periferia del tumor y en el hígado adyacente en los pacientes con mutación de KRAS en comparación con los pacientes con KRAS de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión de CD4 y CTLA4 no difirió significativamente entre las cuatro regiones tumorales de los grupos con mutación de KRAS y de tipo salvaje (Figuras 6C, D). En los análisis de inmunofluorescencia (Figuras suplementarias 8A, B), observamos una expresión significativamente elevada de TIM3 en la región periférica del tumor en el tumor con mutación de KRAS. Además, los macrófagos doblemente positivos para CD68+ y TIM3+ en la interfaz tumor-hígado de los CRLM mostraron una tendencia creciente en los tumores con mutación de KRAS en comparación con los tumores con KRAS de tipo salvaje (porcentaje medio: 22,52% frente a 8,84%) (Figura suplementaria 8C). Estos hallazgos sugieren que la mutación de KRAS puede contribuir al establecimiento de un microambiente mieloide más inmunosupresor en los CRLM. Además, el análisis de correlación demostró que el porcentaje de células T CD4+ TIM3+ periféricas postoperatorias estaba correlacionado positivamente con la infiltración de células TIM3+ en el tejido (r = 0,6970, P = 0,0306; Figura 6F).
Estos hallazgos preliminares demuestran una tendencia hacia un fenotipo inmunitario distinto en los pacientes con mutación de KRAS, aunque el tamaño de nuestra muestra actual impide llegar a una conclusión definitiva sobre una verdadera divergencia impulsada por KRAS en el remodelamiento inmunitario sistémico perioperatorio.
S100A9+ M-MDSCs y recurrencia postoperatoria
Para explorar posibles vínculos entre los perfiles inmunitarios y los resultados clínicos, los pacientes se estratificaron aún más según el estado de recurrencia. En particular, los niveles postoperatorios de S100A9+ M-MDSCs fueron significativamente más altos en los pacientes que experimentaron recurrencia (p = 0,0206), mientras que no se observaron diferencias preoperatorias (Figura 6E). Dado el tamaño limitado de la muestra y el pequeño número de casos de recurrencia, esta observación debe interpretarse con cautela y considerarse exploratoria, lo que sugiere que los S100A9+ M-MDSCs postoperatorios pueden representar una característica inmunitaria preliminar asociada con la recurrencia que requiere validación en cohortes más grandes.
Análisis de sensibilidad que incluye a pacientes con recurrencia postoperatoria muy temprana
Para abordar posibles sesgos de selección y evaluar la solidez de nuestros hallazgos, realizamos un análisis de sensibilidad exploratorio que incluyó a aquellos pacientes que fueron excluidos debido a la recurrencia postoperatoria temprana (definida como recurrencia dentro de los dos meses posteriores a la cirugía; n = 5). En contraste con los patrones de remodelamiento inmunitario observados en la cohorte de enfermedad libre primaria, estos pacientes no mostraron aumentos postoperatorios significativos en la proporción de células T CD4+ circulantes o células T CD28+ CD4+, ni reducciones en la proporción de células T CD4+ o CD8+ TIM3+ (Figuras suplementarias 9A, B). En particular, se observó una tendencia hacia un aumento en la frecuencia de células T CD8+ TIM3+ postoperatorias, aunque esto no alcanzó significación estadística (Figura suplementaria 9C). Por lo tanto, este fue un diseño de estudio que se centró en los pacientes con un curso postoperatorio inicialmente libre de enfermedad, al tiempo que se reconoció que los casos de recurrencia muy temprana pueden representar un subgrupo importante que requiere una investigación separada.
Además, los niveles elevados de S100A9+ M-MDSCs postoperatorios siguieron asociados con la recurrencia incluso después de la inclusión de estos casos de recurrencia temprana (Figura suplementaria 9D). Aunque está limitado por el pequeño tamaño de la muestra, estos hallazgos sugieren que el remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio favorable observado en la cohorte primaria puede atenuarse o estar ausente en los pacientes con progresión de la enfermedad excepcionalmente temprana.
Características demográficas y clínicas basales
Este estudio incluyó a 17 pacientes con CRLM, todos los cuales se sometieron a resección hepática y terapia adyuvante en el MUHC. Las características basales de los pacientes, incluido el edad, el sexo, el estado de NGS y el historial de quimioterapia, etc., se resumen en (Tabla suplementaria 2). La mayoría de los pacientes se habían sometido a una resección del tumor primario antes de la cirugía hepática. Un paciente se sometió a una resección simultánea tanto de la lesión colorrectal primaria como de las metástasis hepáticas, mientras que otro recibió un procedimiento destinado a la preservación anal. Además, el 58,8% de los pacientes presentaban una mutación de KRAS en el tumor primario. El 64,7% de los pacientes recibieron quimioterapia neoadyuvante antes de la resección de las metástasis hepáticas. Cabe destacar que también analizamos las características basales de los pacientes excluidos; nuestro análisis no demostró diferencias significativas en todos los parámetros clínicos.
Aumento de la frecuencia de células T CD4+ y disminución de la frecuencia de células T CD8+ después de la resección hepática en pacientes con CRLM
Para investigar los cambios en las poblaciones inmunitarias, establecimos dos paneles: uno centrado en la inmunidad adaptativa y el otro en la inmunidad innata. Las células T y sus subpoblaciones se analizaron utilizando el panel de inmunidad adaptativa. Para cada panel, se recolectaron entre 10 y 000 eventos utilizando el analizador de células LSRFortessa™. Luego, se aplicó el complemento Flow AI en el software FlowJo para filtrar y retener los "Eventos buenos" para el análisis de subconjuntos (Figura 1A). De los 17 pacientes incluidos inicialmente, 15 (n = 15) se analizaron en el panel adaptativo, ya que dos muestras tenían menos del 70% de "Eventos buenos". La estrategia de clasificación se presenta en la Figura suplementaria 2.
Evaluamos las proporciones relativas de células T CD8+ y CD4+ entre las células T CD3+, aisladas de la sangre periférica, estratificadas por los puntos de tiempo preoperatorio y postoperatorio utilizando gráficos de columnas o gráficos individuales. La frecuencia de células T CD8+ disminuyó significativamente en el estado libre de enfermedad en comparación con los controles preoperatorios (p = 0,0015), mientras que la frecuencia de células T CD4+ aumentó significativamente después de la resección de las metástasis hepáticas (p = 0,0005). Un análisis del cambio de pliegue (postoperatorio/preoperatorio) reveló valores significativamente diferentes de una relación de 1 para ambas poblaciones de CD8+ y CD4+ (p < 0,0001) (Figuras 1B, C). En conjunto, estos resultados reflejan un remodelamiento postoperatorio distinto de la composición de las células T sistémicas.
Patrones de expresión de CD28 y CD178 en las células T CD8+ y CD4+ antes y después de la resección hepática
La unión del receptor CD28 en las células T proporciona una señal coestimuladora esencial que funciona en tándem con la activación del receptor de células T (TCR) para iniciar la activación de las células T naive ([32]). Para comprender mejor el estado funcional de las células T en el contexto de los CRLM, evaluamos la expresión de CD28+ en los linfocitos T. Nuestros resultados demostraron que no hubo un cambio significativo en el porcentaje de células T CD28+ CD8+ después de la resección hepática, con valores medios del 60,53% y del 63,18% en los grupos preoperatorio y postoperatorio, respectivamente (Figura 2A). Sin embargo, el porcentaje de células T CD28+ CD4+ aumentó significativamente después de la cirugía (p = 0,0382) y el valor medio aumentó hasta el 96,49% en el grupo postoperatorio (Figura 2B). CD178 (FasL, CD95L, TNFSF6), un miembro de la familia de factores de muerte del factor de necrosis tumoral, desempeña un papel en la citotoxicidad de las células T y NK a través de la apoptosis mediada por Fas/FasL ([33]). Para investigar si la resección hepática proporcionó alguna ventaja en el grupo postoperatorio en comparación con el grupo preoperatorio, analizamos la expresión de CD178. Como se muestra en las Figuras 2C y 2D, no se observaron diferencias significativas en la expresión de CD178 en las células T CD8+ y CD4+ después de la resección.
Paisaje inmunitario de los subconjuntos de células y los puntos de control inmunitarios antes y después de la cirugía
Para dilucidar aún más las alteraciones inmunitarias asociadas con la resección hepática, analizamos las frecuencias de los principales subconjuntos de células inmunitarias y los indicadores de superficie del agotamiento de las células T. La subpoblación Tfh, caracterizada como CD3+CD4+CXCR5+ (Figura suplementaria 2C), no mostró diferencias significativas pre- y postoperatorias, con frecuencias medias del 8,044% y del 8,652%, respectivamente (p = 0,6953) (Figura suplementaria 3A). De manera similar, las células T reguladoras (Treg), identificadas como CD3+CD4+CD25+FoxP3+ (Figura suplementaria 2C**), mostraron niveles consistentes antes y después de la cirugía, con frecuencias medias del 2,273% y del 1,931% (p = 0,2545) (Figura suplementaria 3B). Las células B (CD45+CD3-CD20+) también permanecieron estables, sin cambios significativos observados entre los grupos pre- y postoperatorios (p = 0,8536) (Figuras suplementarias 3C, 4B).
Además, examinamos cuatro marcadores de coinhibición distintos: PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3, que se sabe que están críticamente asociados con el agotamiento de las células T CD8+ y CD4+ en los pacientes con CRLM ([34]). Entre estos, la frecuencia de células T CD4+ TIM3+ se redujo significativamente después de la cirugía, disminuyendo de una media del 39,98% preoperatoriamente a 25,70% postoperatoriamente (p = 0,0353) (Figura 3C). Por el contrario, no se observaron cambios significativos en la expresión de PD-1, CTLA4 o LAG3 en las células T CD8+ o CD4+ (Figuras 3A, B, D). Además, se observó una tendencia a la disminución de la frecuencia de células doblemente positivas para PD-1+ y TIM3+ en los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ después de la resección hepática (Figura suplementaria 5).
En el panel de inmunidad innata, las frecuencias de células mieloides (CD11b+), monocitos y M-MDSCs no cambiaron después de la cirugía (p > 0,05) (Figuras suplementarias 3D–F, 4A), lo que indica un perfil de inmunidad innata ampliamente preservado. En general, estos resultados sugieren un remodelamiento postoperatorio selectivo de las características de agotamiento de las células T, mientras que las poblaciones de inmunidad innata permanecen en gran medida inafectadas.
Para garantizar que estos patrones de remodelación selectiva de las células T postoperatorias y las alteraciones de los puntos de control inmunitario no se vieran afectados por la ventana de recolección de sangre relativamente amplia (de 3,0 a 16,9 semanas) o por la cinética continua de la cicatrización de la herida quirúrgica, realizamos un análisis de validación exhaustivo (Figura suplementaria 6). Los análisis de correlación demostraron que los intervalos de muestreo postoperatorio no estaban significativamente asociados con las frecuencias de las principales poblaciones inmunitarias circulantes, incluidos los linfocitos T CD4+, los linfocitos T CD8+, los linfocitos T CD28+ CD4+, los linfocitos T TIM3+ CD4+ y los M-MDSC S100A9+ (Figura suplementaria 6A). Además, cuando la cohorte se estratificó en grupos de muestreo temprano (≤ 5 semanas después de la cirugía) y tardío (> 5 semanas después de la cirugía), las características observadas en la cohorte general (específicamente, el aumento significativo postoperatorio en la proporción de linfocitos T CD4+, la disminución en la proporción de linfocitos T CD8+ y la reducción en la proporción de linfocitos T TIM3+ CD4+) siguieron siendo evidentes en el grupo de muestreo temprano y mostraron tendencias similares en el grupo de muestreo tardío. Además, no se observaron diferencias significativas en los niveles postoperatorios de estos principales subconjuntos inmunitarios entre los grupos de muestreo temprano y tardío (Figuras suplementarias 6B–D).
En conjunto, estos hallazgos respaldan la idea de que las alteraciones inmunitarias sistémicas observadas están asociadas principalmente con la eliminación de la masa tumoral, más que con las variaciones en la cinética de la recuperación postoperatoria.
Impacto de la quimioterapia neoadyuvante en la expresión de las células inmunitarias sistémicas en pacientes con CRLM
La quimioterapia neoadyuvante es un pilar fundamental en el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico. Planteamos la hipótesis de que dicho tratamiento podría influir en los perfiles inmunitarios sistémicos. Para probar esto, estratificamos toda la cohorte según si los pacientes habían recibido o no quimioterapia neoadyuvante dirigida a las metástasis hepáticas (Tabla suplementaria 2). Todos los pacientes que recibieron terapia neoadyuvante recibieron regímenes estándar basados en 5-fluorouracilo (FOLFOX, CAPOX o FOLFIRI). Luego, comparamos las poblaciones de células inmunitarias periféricas entre los dos grupos en los momentos preoperatorio y postoperatorio. La estratificación por administración de quimioterapia neoadyuvante no reveló diferencias significativas en ninguno de los compartimentos inmunitarios adaptativos o innatos en ambos momentos (p > 0,05; Tabla suplementaria 3). En cambio, los pacientes que respondieron a la terapia mostraron niveles preoperatorios significativamente más bajos de M-MDSC circulantes y niveles más altos de monocitos en comparación con los no respondedores (Figura 4A). Estos hallazgos sugieren que los niveles elevados de M-MDSC preoperatorios pueden estar asociados con una menor sensibilidad al tratamiento.
Cabe señalar que la terapia neoadyuvante para las metástasis hepáticas se suspendió 4 semanas antes de la recolección de muestras y la resección quirúrgica.
Análisis exploratorio de las asociaciones entre las células inmunitarias y los parámetros clínicos
Para explorar de forma preliminar las posibles asociaciones entre los subconjuntos de células inmunitarias circulantes y los parámetros clínicos, realizamos análisis de correlación de Spearman en todas las variables medidas, generando dos matrices de correlación completas correspondientes a los conjuntos de datos preoperatorios y postoperatorios (Figuras 4E, 5D). Las variables que exhibían correlaciones fuertes (|r| ≥ 0,6) y estadísticamente significativas se marcaron con asteriscos.
En el conjunto de datos preoperatorio, el sexo mostró una correlación positiva significativa con los niveles de M-MDSC circulantes (r = 0,666, p < 0,05; Figura 4E). Para validar aún más este hallazgo, comparamos las frecuencias de M-MDSC preoperatorias entre pacientes masculinos y femeninos, lo que demostró que las pacientes femeninas presentaban niveles significativamente más altos de M-MDSC circulantes antes de la cirugía (Figura 4B), lo que sugiere un estado inmunosupresor derivado de la médula ósea preoperatorio en las pacientes femeninas. Curiosamente, los puntos de datos femeninos fueron más consistentes entre las pacientes que en la cohorte masculina, que demostró mucha variabilidad. Aunque el conjunto de datos es pequeño, esta significación justifica una mayor investigación.
El estado de mutación de KRAS se correlacionó significativamente con dos subconjuntos inmunitarios adaptativos, mostrando una correlación positiva con las células Tfh preoperatorias (r = 0,853, p < 0,05) y una correlación negativa con las células T CD4+ CTLA4+ preoperatorias (r = –0,853, p < 0,05; Figura 4E). En consonancia con estas correlaciones, la comparación de grupos demostró que los pacientes con mutación de KRAS tenían frecuencias preoperatorias significativamente más bajas de células Tfh y porcentajes más altos de células T CD4+ CTLA4+ en comparación con el grupo de tipo salvaje de KRAS (Figura 4C). Además, los niveles de hemoglobina preoperatorios se correlacionaron inversamente con la frecuencia de Treg circulante (Figura 4D). En conjunto, estos hallazgos sugieren que los pacientes con mutación de KRAS exhiben un fenotipo inmunitario agotado e inmunosupresor, y que la hipoxia o la anemia sistémica pueden contribuir a los niveles elevados de Treg circulante.
En el conjunto de datos postoperatorio (Figura 5), el diámetro máximo de las metástasis hepáticas se correlacionó positivamente con la proporción postoperatoria de células B circulantes (r = 0,557, p = 0,041; Figura 5A), lo que sugiere que los pacientes con una mayor carga tumoral conservan niveles más altos de células B sistémicas después de la cirugía. Los niveles de hemoglobina postoperatorios también se correlacionaron positivamente con las frecuencias de células Tfh circulantes (r = 0,639, p = 0,012; Figura 5B). Además, las células T CD4+ PD1+ postoperatorias se asociaron positivamente con los niveles de Treg postoperatorios (r = 0,529, p = 0,045; Figura 5C).
En conjunto, si bien estas asociaciones estadísticas apuntan a nuevos vínculos entre la inmunidad sistémica y las características clínicas, reconocemos que estos hallazgos preliminares están limitados por el pequeño tamaño de la cohorte y requieren validación en poblaciones de pacientes más grandes e independientes para confirmar una inferencia estadística sólida.
Análisis exploratorio del remodelamiento inmunitario sistémico y el microambiente tumoral inmunitario estratificado por el estado de KRAS
Dado que existen características inmunitarias preoperatorias distintas entre los pacientes con mutación de KRAS y los de tipo salvaje, evaluamos a continuación cómo el estado de KRAS influyó en el remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio mediante el análisis de muestras pre y postoperatorias emparejadas dentro de cada subgrupo. En consonancia con nuestras observaciones anteriores, las frecuencias de células T CD8+ disminuyeron significativamente después de la resección hepática, mientras que las células T CD4+ aumentaron notablemente después de la resección hepática en el grupo con mutación de KRAS (Figura 6A). En cambio, estos cambios dinámicos no se observaron en el grupo de tipo salvaje de KRAS (Figura suplementaria 7A), y los niveles basales de células T CD8+ y CD4+ no difirieron entre los subgrupos con mutación de KRAS y de tipo salvaje (Figura suplementaria 7B).
En el microambiente tumoral inmunitario (TIME), la tinción con H&E de los especímenes tumorales resecados reveló una arquitectura tumoral preservada con componentes estromales variables en los pacientes (Figura 6B). Para caracterizar aún más el TIME en relación con el estado de KRAS, realizamos análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes en tejidos tumorales quirúrgicos de siete pacientes con mutación de KRAS y cinco pacientes con mutación de tipo salvaje de KRAS. La evaluación cuantitativa de la inmunohistoquímica demostró una expresión significativamente mayor de TIM3 en la periferia del tumor y en el hígado adyacente en los pacientes con mutación de KRAS en comparación con los pacientes con mutación de tipo salvaje de KRAS. En cambio, la expresión de CD4 y CTLA4 no difirió significativamente entre las cuatro regiones tumorales entre los grupos con mutación de KRAS y de tipo salvaje (Figuras 6C, D). En los análisis de inmunofluorescencia (Figuras suplementarias 8A, B), observamos una expresión significativamente mayor de TIM3 en la región periférica del tumor en el tumor con mutación de KRAS. Además, los macrófagos CD68+ TIM3+ de doble positividad en la interfaz tumor-hígado del CRLM exhibieron una tendencia creciente en los tumores con mutación de KRAS en comparación con los tumores de tipo salvaje de KRAS (porcentaje medio: 22,52% frente a 8,84%) (Figura suplementaria 8C). Estos hallazgos sugieren que la mutación de KRAS puede contribuir al establecimiento de un microambiente mieloide más inmunosupresor en el CRLM. Además, el análisis de correlación demostró que el porcentaje de células T CD4+ TIM3+ periféricas postoperatorias se correlacionó positivamente con la infiltración de células TIM3+ en el tejido (r = 0,6970, P = 0,0306; Figura 6F).
Estos hallazgos preliminares demuestran una tendencia hacia un fenotipo inmunitario distinto en los pacientes con mutación de KRAS, aunque nuestro tamaño de muestra actual impide llegar a una conclusión definitiva con respecto a una verdadera divergencia impulsada por KRAS en el remodelamiento inmunitario sistémico perioperatorio.
M-MDSC S100A9+ postoperatorias y recurrencia
Para explorar posibles vínculos entre los perfiles inmunitarios y los resultados clínicos, los pacientes se estratificaron aún más según el estado de recurrencia. En particular, los niveles postoperatorios de M-MDSC S100A9+ fueron significativamente más altos en los pacientes que experimentaron recurrencia (p = 0,0206), mientras que no se observaron diferencias en el período preoperatorio (Figura 6E). Dado el tamaño limitado de la muestra y el pequeño número de casos de recurrencia, esta observación debe interpretarse con cautela y considerarse exploratoria, lo que sugiere que las M-MDSC S100A9+ postoperatorias pueden representar una característica inmunitaria preliminar asociada con la recurrencia que requiere validación en cohortes más grandes.
Análisis de sensibilidad que incluye a pacientes con recurrencia postoperatoria muy temprana
Para abordar el posible sesgo de selección y evaluar la solidez de nuestros hallazgos, realizamos un análisis de sensibilidad exploratorio que incluyó a aquellos pacientes que fueron excluidos debido a la recurrencia postoperatoria temprana (definida como recurrencia dentro de los dos meses posteriores a la cirugía; n = 5). En contraste con los patrones de remodelamiento inmunitario observados en la cohorte principal sin enfermedad, estos pacientes no demostraron aumentos postoperatorios significativos en la proporción de células T CD4+ circulantes o células T CD28+ CD4+, ni reducciones en la proporción de células T CD4+ TIM3+ o células T CD8+ (Figuras suplementarias 9A, B). En particular, se observó una tendencia hacia un aumento en la frecuencia de células T CD8+ TIM3+ postoperatorias, aunque esto no alcanzó significación estadística (Figura suplementaria 9C). Por lo tanto, esta fue una elección del diseño del estudio que se centró en los pacientes con un curso postoperatorio inicialmente libre de enfermedad, al tiempo que se reconoció que los casos de recurrencia muy temprana pueden representar un subgrupo importante que requiere una investigación separada.
Además, los niveles elevados de M-MDSC S100A9+ postoperatorios siguieron asociados con la recurrencia incluso después de la inclusión de estos casos de recurrencia temprana (Figura suplementaria 9D). Aunque se limita por el pequeño tamaño de la muestra, estos hallazgos sugieren que el remodelamiento inmunitario sistémico postoperatorio favorable observado en la cohorte principal puede atenuarse o estar ausente en los pacientes con progresión de la enfermedad excepcionalmente temprana.
Discusión
El hígado es un sitio común para la diseminación metastásica, estableciendo tanto un microambiente local inmunotolerante como una tolerancia inmunitaria sistémica que promueve la progresión de la metástasis hepática del cáncer colorrectal ([11], [35]). Hasta donde sabemos, este estudio proporciona evidencia de que la resección quirúrgica de las metástasis hepáticas se asocia con un aumento marcado en la proporción de células T CD4+ entre las células T CD3+ circulantes y una disminución relativa en la proporción de células T CD8+. Cabe destacar que las principales líneas celulares T CD4+ implicadas en la actividad pro-tumoral dentro del microambiente tumoral (Treg y Tfh) ([36]) no mostraron cambios significativos en la circulación después de la resección hepática, lo que sugiere que la expansión postoperatoria del compartimento CD4+ se origina a partir de otras poblaciones de CD4+. Un informe reciente sobre un modelo murino de metástasis colorrectales sugiere que las metástasis hepáticas desvían y eliminan las células T CD8+ específicas del antígeno de la circulación, causando inmunosupresión sistémica ([11]). En contraste con ese modelo murino, no se observó un aumento de las células T CD8+ circulantes después de la resección quirúrgica en nuestro estudio. En cambio, el período postoperatorio se caracterizó por un aumento significativo en la frecuencia de células T CD4+, lo que indica un patrón distinto de remodelación inmunitaria sistémica en los pacientes. Es importante destacar que encontramos que las células T CD4+ sistémicas exhibieron un aumento significativo en la expresión de CD28 en el período postoperatorio, mientras que la expresión de CD28 en las células T CD8+ permaneció sin cambios. Esta observación puede reflejar cambios en la expresión del marcador coestimulador de las células T CD4+, lo que es consistente con el papel establecido de CD28 en el apoyo a la inmunidad mediada por células T ([37]). En conjunto, nuestros datos apuntan a un cambio inmunológico sistémico temprano en el período postoperatorio que está dominado por cambios cuantitativos y fenotípicos en el compartimento CD4+. Sin embargo, la disminución postoperatoria observada en la frecuencia de las células T CD8+ circulantes justifica una interpretación cautelosa y equilibrada, ya que no contradice inherentemente el concepto de remodelación inmunitaria sistémica. En lugar de indicar un deterioro de la inmunidad citotóxica, esta contracción periférica podría reflejar potencialmente una redistribución o tráfico dinámico de linfocitos. Es plausible que la resección quirúrgica de la masa tumoral elimine abruptamente la fuente primaria de antígenos derivados del tumor, alterando así los gradientes de quimiocinas sistémicas y provocando que las células T CD8+ circulantes se redistribuyan hacia órganos linfoides secundarios o regresen a los tejidos periféricos. Alternativamente, no se puede descartar por completo el impacto supresor transitorio del estrés quirúrgico y la inflamación de la cicatrización en ciertos subconjuntos de células T. Dadas estas posibilidades fisiológicas, nuestros hallazgos con respecto a la dinámica de las células CD8+ deben interpretarse con prudencia, y se necesitan estudios futuros que incorporen ensayos funcionales para dilucidar si esta reducción periférica influye en la eficacia antitumoral a largo plazo.
En múltiples tumores sólidos, se han detectado receptores inhibitorios canónicos, comúnmente conocidos como puntos de control inmunitarios, incluidos PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3, en las células T CD4+, lo que refleja los fenotipos de agotamiento que se observan típicamente en las células T CD8+ ([34], [38]). Es importante destacar que la regulación al alza de los puntos de control inmunitarios que definen el agotamiento de las células T, en particular TIM3, se ha relacionado con el desarrollo de resistencia tumoral a las terapias de bloqueo de puntos de control ([39]). Nuestro estudio reveló una disminución significativa en la frecuencia de las células T CD4+ TIM3+, junto con una tendencia a la disminución tanto en las células T CD4+ PD-1+ como en los subconjuntos de células T de doble positividad PD-1+ TIM3+ agotadas después de la resección quirúrgica. Además, observamos un patrón de expresión similar de TIM3 y PD-1 en las células T CD8+ después de la cirugía. Nuestros datos muestran que la eliminación de las metástasis hepáticas se asocia con una frecuencia reducida de células T que expresan moléculas de puntos de control inmunitarios, lo que indica que las células tumorales inducen la regulación al alza de estas moléculas, apoyando el crecimiento tumoral y la evasión del sistema inmunitario. En conjunto, nuestros resultados sugieren hipotéticamente el potencial de la terapia adoptiva de células T CD4+, en combinación con inmunoterapia, como una estrategia para reforzar la inmunidad sistémica y atacar la enfermedad residual mínima (ERM) circulatoria, un importante contribuyente a la recurrencia postoperatoria en el cáncer colorrectal con metástasis hepáticas (CCMH). Sin embargo, estas interpretaciones traslacionales deben considerarse con cautela, ya que no se realizaron ensayos inmunitarios funcionales para evaluar la actividad de las células T después de la resección. En consecuencia, la relevancia clínica de estos cambios inmunitarios en términos de eficacia antitumoral y respuesta a la inmunoterapia aún debe validarse. Los estudios futuros deben tener como objetivo validar la eficacia clínica de la terapia adoptiva de células T CD4+ y delinear subconjuntos de células T CD4+ funcionalmente distintos con una potente actividad antitumoral, lo que permitirá informar estrategias de producción optimizadas para la inmunoterapia de tumores sólidos.
La quimioterapia neoadyuvante se utiliza comúnmente en pacientes con CRC avanzado, particularmente aquellos con metástasis hepáticas, para reducir la carga tumoral y evaluar la quimiosensibilidad tumoral ([40]). Un estudio retrospectivo con una puntuación de propensión ha sugerido que la quimioterapia neoadyuvante puede afectar negativamente las respuestas inmunitarias sistémicas antitumorales en pacientes con cáncer de mama que no responden a la quimioterapia, principalmente a través de una reducción en las proporciones de células T CD4+ y células NK ([41]). En contraste, otros informes indican que la quimioterapia neoadyuvante puede inhibir la progresión tumoral y modular el microambiente tumoral (MAT) mediante la remodelación de los fibroblastos asociados al cáncer en el cáncer de recto ([42]). En nuestra cohorte, la quimioterapia neoadyuvante no alteró significativamente los subconjuntos de células inmunitarias sistémicas ni en el momento preoperatorio ni en el postoperatorio. Sin embargo, los respondedores exhibieron frecuencias más bajas de M-MDSC circulantes y proporciones más altas de CPA, como los monocitos, lo que sugiere un perfil inmunitario sistémico potencialmente más favorable asociado con la sensibilidad a la quimioterapia.
Al analizar los parámetros clínicos, observamos que el tamaño del tumor (es decir, la carga tumoral) se correlacionó con un mayor número de células B en la circulación. Esto sugiere un impacto inmunológico prolongado para las masas grandes que debe investigarse más a fondo mediante el análisis de puntos temporales adicionales. Esto no se diseñó en este estudio, pero justifica la investigación.
Se sabe que las mutaciones de KRAS en el CRC confieren peores resultados clínicos en comparación con la enfermedad KRAS-wild-type ([43]). Mecánicamente, el KRAS oncogénico fomenta un microambiente tumoral inmunosupresor a través del eje de señalización KRAS-IRF2 (factor regulador de interferón 2), facilitando así el reclutamiento de células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) y reduciendo la infiltración intratumoral de células T, particularmente células T CD4+ en los tumores primarios ([44]). En nuestra cohorte, sorprendentemente, observamos un aumento marcado en la proporción de células T CD4+ circulantes exclusivamente en pacientes con metástasis hepáticas KRAS-mutadas, lo que sugiere que estos individuos pueden experimentar supresión inmunitaria sistémica antes de la cirugía. En concordancia, TIM3 se enriqueció en los tejidos tumorales, lo que indica un microambiente inmunitario tumoral supresor (MIT). La ausencia de diferencias basales en los niveles de células T CD4+ circulantes entre los grupos KRAS-mutados y wild-type probablemente refleja el tamaño limitado de la muestra. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la remodelación inmunitaria postoperatoria está influenciada por múltiples factores, incluido el trauma quirúrgico y otros mecanismos de regulación inmunitaria, en lugar de estar determinada únicamente por el estado de mutación de KRAS. Esto subraya la interacción entre la señalización oncogénica y la dinámica inmunitaria sistémica en la configuración de la inmunidad postoperatoria específica del paciente.
Interesantemente, observamos además que los pacientes que experimentaron recurrencia exhibieron una frecuencia más alta de M-MDSC S100A9+ después de la resección hepática. Este hallazgo se alinea con nuestro trabajo anterior ([45]), que demostró que los niveles elevados de vesículas extracelulares (VE) asociadas a S100A9 circulantes, que se originan en las MDSC, se relacionaron con el peor pronóstico en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal y recurrencia temprana. Si bien esta observación es consistente con los hallazgos previos, el número limitado de casos de recurrencia impide sacar conclusiones definitivas; por lo tanto, debe considerarse como una señal preliminar que genera hipótesis y que requiere validación en cohortes más grandes e independientes.
A pesar de los hallazgos significativos de este estudio, se deben reconocer ciertas limitaciones. La duración limitada del seguimiento restringió el análisis de supervivencia, lo que limitó la evaluación de los impactos pronósticos a largo plazo de las alteraciones inmunitarias observadas. Además, el tamaño de la muestra es limitado, debido a la combinación de criterios de elegibilidad estrictos para confirmar el estado libre de enfermedad y la rareza inherente de tales casos en entornos clínicos. Debido a esta limitación del tamaño de la muestra, no pudimos realizar ajustes multivariados para controlar otros factores de confusión perioperatorios (por ejemplo, la extensión quirúrgica o las terapias sistémicas), lo que sigue siendo una limitación del estudio actual. En particular, el número muy pequeño de casos de recurrencia (n=3) limita la solidez de los análisis de subgrupos relacionados con la recurrencia. A pesar de estas limitaciones, este estudio destaca de manera única la dinámica inmunitaria que rodea la resección hepática, ofreciendo perspectivas valiosas para futuras investigaciones y el manejo clínico.
Conclusión
En conjunto, nuestros datos indican que la resección de metástasis hepáticas se asocia con una remodelación inmunitaria sistémica, lo que sugiere hipotéticamente una ventana de oportunidad postoperatoria para intervenciones inmunoterapéuticas. En consonancia con un estudio preclínico previo ([11]) que demostró que la eliminación de metástasis hepáticas hizo que las lesiones extrahepáticas fueran sensibles a la inmunoterapia sistémica, observamos cambios en los subconjuntos de células T circulantes después de la metástasis. La remodelación del perfil de células T CD4+ justifica una mayor investigación con respecto a su posible relevancia para las terapias celulares adoptivas o la inhibición de los puntos de control inmunitarios. Si bien es altamente especulativo dado la falta actual de ensayos funcionales, una mayor validación de estos fenotipos podría ayudar a dilucidar nuevas estrategias para mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales y mejorar los resultados en pacientes con metástasis hepáticas de cáncer colorrectal. Se justifican ensayos clínicos prospectivos, adecuadamente diseñados y estudios traslacionales a largo plazo para evaluar aún más las M-MDSC S100A9+ y otros parámetros inmunitarios como posibles biomarcadores asociados con el riesgo de recurrencia y para definir estrategias inmunoterapéuticas perioperatorias óptimas. En conjunto, estos hallazgos indican que el perfilado inmunitario sistémico no solo captura la remodelación inmunitaria inducida por el tumor, sino que también ofrece una utilidad clínica potencial para la estratificación de pacientes y el monitoreo terapéutico.
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