Copanlisib en combinación con nivolumab para el tratamiento del cáncer colorrectal con microsatélites estables: un ensayo de fase 1/2.

Si bien se han logrado avances significativos en el tratamiento del cáncer colorrectal (CCR) en las últimas dos décadas, el CCR sigue siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos^[1],^[2]. La terapia con inhibidores del punto de control inmunitario (ICI) ha mejorado drásticamente los resultados de muchos tipos de tumores, pero la monoterapia anti-PD-1 no se asocia con ningún beneficio en el 95% de los casos de CCR metastásico que son competentes en la reparación del desajuste (MMRp) y estables en microsatélites (MSS)^[3]. De manera similar, los inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/AKT/diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) no han logrado producir tasas de respuesta o beneficios en la supervivencia significativos en pacientes con CCR MSS^[4]. A pesar de estos fracasos, los enfoques combinados presentados recientemente han mostrado resultados prometedores en el tratamiento neoadyuvante y metastásico del CCR MSS y ofrecen la esperanza de cambiar este paradigma^[5],^[6].

Las mutaciones de la subunidad alfa (α) de PI3K (codificada por PIK3CA) conducen a la activación constitutiva de PI3Kα, lo que resulta en una mayor supervivencia y proliferación de las células tumorales y un microambiente tumoral (MET) que promueve la proliferación celular y la evasión inmune^[7],^[8]. Además de PI3Kα, existen otras 3 isoenzimas dentro de la familia de PI3K de clase I (PI3Kbeta, PI3Kγ y PI3Kdelta) que funcionan en la señalización aguas abajo de las quinasas receptoras del factor de crecimiento^[9]. Se considera que PI3Kα y PI3Kbeta son las isoenzimas más activas en las células cancerosas y se cree que su inhibición tiene actividad antitumoral directa. En contraste, la actividad de PI3Kgamma es fundamental para las células de la línea mieloide, siendo las células supresoras derivadas de la médula ósea (MDSC) particularmente dependientes de la señalización a través de esta isoenzima^[10]. Estudios previos han demostrado que la inhibición de PI3Kgamma da como resultado una reducción en el reclutamiento de MDSC y un crecimiento tumoral más lento en modelos murinos^[10].

Basado en la prevalencia del 15% de las mutaciones de PIK3CA en el CCR MSS, ha habido un gran interés en investigar los inhibidores de la vía PI3K/mTOR para el tratamiento de este subconjunto de CCR MSS. Desafortunadamente, los inhibidores de PI3K solos o en combinación con quimioterapia proporcionan un beneficio mínimo en este contexto de la enfermedad^[11]–^[14]. Otras opciones de tercera línea actualmente aprobadas en el CCR también exhiben una eficacia limitada, con supervivencias libres de progresión (SLP) que oscilan entre 1,9 y 5,6 meses y bajas tasas de respuesta del 1,0–6,1% en sus respectivos ensayos de fase 3, lo que destaca la importancia de desarrollar mejores opciones terapéuticas para esta población de pacientes^[15]–^[17].

El trabajo preclínico de Collins y colaboradores identificó las mutaciones de PIK3CA como mediadores de la resistencia a anti-PD-1 en el CCR^[8],^[18]. Utilizando una biblioteca ORF de mutaciones impulsoras del cáncer, los autores examinaron las células de CCR en modelos de ratón inmunocompetentes e inmunodeficientes bajo presión anti-PD-1. Los clones resistentes se enriquecieron fuertemente con alteraciones de PIK3CA. Es importante destacar que el copanlisib (un inhibidor pan-PI3K) restauró la sensibilidad a anti-PD-1, produciendo una marcada regresión tumoral, mientras que ninguno de los dos agentes fue eficaz por sí solo. Los tumores con mutaciones de PIK3CA pueden aumentar los programas pro-mieloides quimiotácticos que impulsan el reclutamiento de MDSC y refuerzan un microambiente inmunosupresor^[19].

El copanlisib es un inhibidor pan de la clase I de PI3K con una potente actividad en las cuatro isoformas (IC50 de 0,5 a 6,4 nM). En los modelos de CCR, es aproximadamente 40 veces más eficaz para suprimir la proliferación en las células con mutaciones de PIK3CA en comparación con las células de tipo salvaje, lo que sugiere una ventana terapéutica^[20]. En modelos de ratón inmunocompetentes, el copanlisib también modula el MET, probablemente a través de la inhibición de PI3Kdelta/γ en las MDSC, y la administración intermitente reduce la función supresora de las células T reguladoras (Treg) al tiempo que mejora la citotoxicidad de las células T CD8+, lo que en conjunto aumenta la inmunidad antitumoral^[10],^[21],^[22].

Aquí presentamos un ensayo de fase 1/2 de copanlisib en combinación con el inhibidor de PD-1 nivolumab para pacientes con CCR metastásico MSS que habían progresado después de al menos dos líneas de terapia previa. Nuestro ensayo evaluó esta estrategia en dos cohortes, una con mutación de PIK3CA y la otra con PIK3CA de tipo salvaje.

Se analizaron biopsias tumorales pretratamiento y durante el tratamiento para determinar el impacto de esta estrategia en el MET. Planteamos la hipótesis de que la inhibición de PIK3CA con copanlisib podría superar la resistencia inherente del CCR MSS al bloqueo del punto de control inmunitario PD-1.

Resultados

Características de los pacientes

Desde febrero de 2019 hasta abril de 2022, se inscribieron 39 pacientes en este ensayo, con 6 pacientes en la parte de fase 1 y 33 pacientes en la parte de fase 2, incluidos 12 pacientes con CCR de tipo salvaje de PIK3CA y 21 pacientes con CCR con mutación de PIK3CA. Las características demográficas de los pacientes inscritos se presentan en la Tabla 1. Todos los pacientes habían recibido al menos 2 líneas de tratamiento previo. En el momento de la censura, 3 pacientes aún estaban recibiendo tratamiento activo (1 en la cohorte de tipo salvaje de PIK3CA y 2 en la cohorte con mutación de PIK3CA).

La terapia combinada con copanlisib y nivolumab fue segura

En la parte de fase 1 de este estudio, los primeros 6 pacientes no mostraron toxicidad limitante de la dosis, por lo que el ensayo pasó a la fase 2. La toxicidad fue evaluable para todos los pacientes que iniciaron el tratamiento y ningún paciente lo interrumpió debido a eventos adversos relacionados con el fármaco (EA). Las toxicidades hematológicas y no hematológicas se muestran en la Tabla S4. Hubo 31 toxicidades de grado 3/4 atribuibles a copanlisib y nivolumab, siendo la más común la hipertensión en 16 (41%) pacientes y el exantema maculopapular en 4 (10%) pacientes. En general, 38 de los 39 pacientes experimentaron al menos un EA relacionado con el tratamiento. Las toxicidades atribuibles más frecuentes fueron diarrea (11 pacientes, 28%), náuseas (26, 67%), vómitos (13, 33%), fatiga (14, 36%), pérdida de peso (8, 21%), hiperglucemia (21, 54%), exantema maculopapular (16, 41%) e hipertensión (23, 59%). Un resumen de los EA atribuibles de grado 3, todos los EA de grado 3/4 y los EA atribuibles se detallan en los Datos suplementarios 2, 3 y la Tabla suplementaria 4, respectivamente.

El copanlisib y el nivolumab produjeron respuestas terapéuticas en el CCR metastásico con alteraciones de PIK3 con una durabilidad notable

Entre los 39 pacientes (incluidos los de la parte de fase 1 tratados con la misma dosis) con datos de respuesta evaluables, 2 de 22 pacientes en la cohorte con mutación de PIK3CA tuvieron respuestas parciales a los 6 meses. Ninguno de los pacientes en el grupo de tipo salvaje de PIK3CA tuvo una respuesta parcial o completa en este punto temporal preespecificado, y por lo tanto, el reclutamiento de esa cohorte se detuvo prematuramente. Sin embargo, dos pacientes con enfermedad estable prolongada, uno en cada cohorte, desarrollaron respuestas parciales después de 6 meses, lo que resultó en una tasa de respuesta objetiva (TRO) final de 4/39 en ambas cohortes. En los pacientes con CCR con mutación de PIK3CA, 3 de 22 pacientes (13,6%, intervalo de confianza del 95% (IC): 4,7–33,3%) respondieron y en los pacientes con CCR de tipo salvaje de PIK3CA, 1 de 17 (5,9%, IC del 95%: 1,0–27,0%) respondieron (Fig. 1, Tabla suplementaria 4). Si bien el brazo experimental en pacientes con mutación de PIK3CA solo tuvo dos respondedores en el punto temporal de 6 meses, lo que impidió alcanzar el punto final primario de tres o más pacientes con respuesta al tratamiento, un tercer paciente tuvo una respuesta tardía después de 6 meses, lo que resultó en tres respondedores en total de los 22 pacientes en el grupo con mutación de PIK3CA. Por lo tanto, el umbral se cumplió en última instancia, aunque esto debe categorizarse como un hallazgo exploratorio. Es interesante destacar que el único respondedor en la cohorte de tipo salvaje de PIK3CA tenía una alteración de PI3K (amplificación del gen PIK3R1 que codifica la subunidad p85α de PI3K) que podría activar potencialmente la señalización de PI3K^[23]. No hubo diferencias estadísticamente significativas en las medianas de los resultados a largo plazo entre los pacientes con tumores de tipo salvaje de PIK3CA y los tumores con mutación de PIK3CA, con una mediana de SLP de 1,6 meses en los pacientes con enfermedad de tipo salvaje de PIK3CA y 1,7 meses en los pacientes con tumores con mutación de PIK3CA. La mediana de la supervivencia global (SG) fue de 8,5 meses y 6,7 meses en estas dos cohortes, respectivamente (Figura suplementaria 2). La duración de la respuesta fue de 13,1 meses en el paciente con tumor de tipo salvaje de PIK3CA que logró una RP y una mediana de 17 meses [9,40, 20,6] en los pacientes con tumores con mutación de PIK3CA. La tasa de control de la enfermedad a los 6 meses fue de 2/17 (11,8%) en los pacientes con tumores de tipo salvaje de PIK3CA y de 3/22 (13,6%) en los pacientes con tumores con mutación de PIK3CA.

Si bien hubo una actividad alentadora con la combinación de copanlisib y nivolumab en la enfermedad con alteración de PI3K, la tasa de respuesta fue modesta. Sin embargo, es importante destacar que todos los pacientes que lograron una respuesta parcial también demostraron una SLP de más de dos años. Los tres pacientes con CCR con mutación de PIK3CA y respuestas parciales tuvieron SLP de 24,2, 26,6 y 29,8 meses, respectivamente. El paciente con una respuesta parcial en la cohorte de tipo salvaje de PIK3CA (que tenía una amplificación de PIK3R1) todavía está recibiendo tratamiento después de 33,7 meses de seguimiento sin progresión de la enfermedad. Esto contrasta con las cohortes anteriores de pacientes con CCR MSS tratados con anti-PD-1 solo, donde las tasas de respuesta fueron del 0% y la SLP a los 6 meses fue inferior al 5%^[24]. Hay datos limitados con copanlisib solo para el CCR, pero en los cuatro pacientes con neoplasias gastrointestinales que recibieron copanlisib en el ensayo NCI Match, ninguno logró una respuesta parcial o completa^[25].

Como análisis exploratorio, evaluamos si el tipo de mutación de PIK3CA influyó en la respuesta al tratamiento comparando las mutaciones del exón 9 de PIK3CA (n = 12, RP: 1, EE: 1, EP: 10) y las mutaciones del exón 20 de PIK3CA (n = 5, RP: 1, EE: 1, EP: 3). Sin embargo, estos subgrupos no mostraron una diferencia estadística en la SLP o la SG en comparación con los demás o con la cohorte de tipo salvaje de PIK3CA (Figura suplementaria 2). Luego, evaluamos si las mutaciones o deleciones inactivadoras de PTEN influyeron en la respuesta al tratamiento. Ninguno de los cuatro pacientes con respuestas clínicas presentaba inactivación genómica de PTEN, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Es importante tener en cuenta que este estudio no tenía suficiente potencia para estos análisis de subgrupos.

Actividad clínica según el sitio de la enfermedad metastásica

La literatura previa ha sugerido que los pacientes con metástasis pulmonares únicamente del CCR responden mejor a los enfoques de modulación inmune que aquellos con otros sitios de enfermedad^[26]–^[28]. La mayoría de los pacientes (n = 23) en este ensayo presentaban metástasis hepáticas según RECIST (como se esperaba para esta población), mientras que 13 pacientes tenían enfermedad en otros sitios anatómicos, incluidos pulmón, peritoneo, ganglios linfáticos no torácicos, etc., sin evidencia de metástasis hepáticas. Los tres pacientes restantes tenían lesiones hepáticas radiográficamente presentes que no eran elegibles para RECIST. No identificamos diferencias estadísticamente significativas en la respuesta y la tasa de beneficio clínico entre estos subgrupos (prueba exacta de Fisher p = 0,59 y p = 0,45 para la respuesta y la tasa de beneficio clínico, respectivamente; n = 36).

Para determinar si los pacientes con metástasis en múltiples órganos presentaban respuestas diferenciales al tratamiento en estas localizaciones, las lesiones medidas mediante RECIST para cada paciente se clasificaron como lesiones hepáticas, pulmonares, peritoneales u otras (predominantemente adenopatías). Evaluamos estas lesiones en su exploración basal y las comparamos con las mediciones obtenidas en la primera exploración RECIST durante el tratamiento para calcular una “respuesta específica del sitio”. Nuestros datos sugieren que las metástasis hepáticas se comportaron de manera diferente a las metástasis en otros sitios. La mayoría de las metástasis hepáticas mostraron enfermedad progresiva (EP) como la mejor respuesta (83 %) en comparación con el pulmón (32 %) y otros sitios de metástasis (19 %; Fig. 2A). En el subgrupo de 14 pacientes con metástasis tanto en el hígado como en el pulmón, las lesiones hepáticas se asociaron generalmente con EP (3 SD, 11 EP), mientras que la mayoría de las lesiones pulmonares fueron estables (11 SD, 3 EP). Esto también fue cierto para el subgrupo de 10 pacientes con metástasis hepáticas y en “otros” sitios: el 90 % presentaba EP en el hígado frente al 10 % de EP (9 SD, 1 EP) en los “otros” sitios (Fig. 2A, C). En conjunto, en los pacientes con enfermedad tanto dentro como fuera del hígado, las metástasis no hepáticas mostraron un mejor control tumoral en comparación con las lesiones hepáticas. Sin embargo, no se sabe si esto refleja diferentes respuestas al tratamiento o si refleja la conocida tendencia de las metástasis pulmonares a crecer más lentamente que las metástasis hepáticas. Las respuestas con este tratamiento se observaron de forma tardía, y ninguno de los pacientes presentó una respuesta general o específica del sitio en la evaluación radiográfica inicial durante el tratamiento.

Investigaciones correlativas

El aumento de las células efectoras CD8± circulantes con la terapia con copanlisib y nivolumab, con una mayor proporción de células activadas en los pacientes que obtuvieron beneficio clínico

Para investigar la influencia de copanlisib y nivolumab en las poblaciones de células inmunitarias circulantes, obtuvimos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la línea de base y en el día 3 del ciclo, y realizamos un perfil inmunológico utilizando un panel de citometría de masas de 34 plex con tiempo de vuelo (CyTOF) (Métodos). Observamos que el tratamiento con 8 semanas de copanlisib/nivolumab condujo a un aumento en el porcentaje de células T efectoras activadas periféricas CD8+ (CD8+, Ki67+, CD137+, GZMB+) (p = 0,026; Fig. 3A). Esto fue más pronunciado en los pacientes que obtuvieron beneficio clínico (RC o SD) con el tratamiento (Fig. 3B): estos pacientes tenían un porcentaje menor de células T CD8+ ingenuas (CD8+, CD45RA+, CD45RO−, GZMB−) en sus muestras durante el tratamiento en comparación con aquellos con EP (p = 0,028; Fig. 3C).

También comparamos las proporciones de células T CD4+ circulantes antes y durante el tratamiento. Estas mostraron una tendencia hacia un fenotipo más efector (CD4+, CD28+, CD137+, PD1+) durante el tratamiento (Fig. S3). La evaluación de otras poblaciones de células inmunitarias identificó una tendencia hacia niveles más altos de células NK después del tratamiento con copanlisib y nivolumab en pacientes con beneficio clínico (Fig. 3D y Fig. S4-S7).

Se observaron niveles más altos de CD163± y células CD3±CD8± en el pretratamiento y una menor expresión de PD-L1 tumoral en los tumores de los respondedores

Para determinar cómo el tratamiento con nivolumab y copanlisib altera el microambiente tumoral (TME), realizamos imágenes de inmunofluorescencia multiplexada Orion (consulte “Métodos”) en muestras de biopsia tumoral obtenidas antes del tratamiento y durante el tratamiento alrededor del día 15 del ciclo 2 (6 semanas después del inicio del tratamiento) ^[29]. Dieciocho pacientes (RC: n = 3; SD: n = 3; EP: n = 12) tenían biopsias de pretratamiento de calidad suficiente para evaluar el estado de infiltración inmune basal (Fig. S7).

Las células T citotóxicas CD3+CD8+ son células inmunitarias efectoras clave de la terapia con ICI, y por lo tanto, preguntamos si la prevalencia de células T citotóxicas en las biopsias de pretratamiento podría servir como un marcador de la respuesta a nivolumab y copanlisib. La comparación de las fracciones de células CD3+CD8+ entre las muestras de biopsia de pretratamiento reveló un enriquecimiento en la fracción de células CD3+CD8+ en los respondedores parciales (prueba de rango de Wilcoxon, p = 0,039; Fig. 4a). El paciente (1887-01) con la fracción de células CD3+CD8+ más alta en el pretratamiento tenía una fracción de células CD3+CD8+ 41 veces mayor que la mediana y luego logró una respuesta parcial (Fig. 4B, C). También encontramos que los tres respondedores clínicos con tejido de pretratamiento suficiente exhibieron una proporción 5 veces mayor de células T CD8+ a células Treg FOXP3+ en comparación con los pacientes sin respuesta clínica (p = 0,10).

Los tumores de pretratamiento con mutaciones de PIK3CA exhibieron significativamente más macrófagos CD163+ (en proporción a todas las células inmunitarias CD45+) en comparación con los tumores de tipo salvaje de PIK3CA (p = 0,0094; prueba de rango de Wilcoxon; Fig. 4d). Dos de los tres tumores con los niveles más altos de células CD163+ infiltrantes lograron respuestas parciales. Los tumores con mutaciones de PIK3CA tendieron a tener una proporción mayor de células CD163+ PD-L1+ positivas que los tumores de tipo salvaje (p = 0,053; Fig. 4e). Los pacientes con una mayor proporción de pretratamiento de macrófagos (CD163+) a expresión de PD-L1 tumoral (PanCK+) también tenían más probabilidades de tener una respuesta parcial al tratamiento (p = 0,039; Fig. 4F, G). No encontramos una diferencia significativa en la proporción de macrófagos CD163+ al comparar los tumores de pretratamiento y durante el tratamiento.

El tratamiento resultó en una remodelación dinámica del microambiente inmunitario con un aumento de la infiltración de CD3+CD8+

Para determinar si el tratamiento con copanlisib y nivolumab aumentaría la infiltración tumoral de CD3+CD8+, comparamos las biopsias de pretratamiento y durante el tratamiento para la infiltración de células T CD3+CD8+ en los ocho pacientes para los que se dispuso de biopsias emparejadas. En los ocho pacientes, la infiltración de CD3+CD8+ aumentó después del tratamiento (p = 0,0006; prueba de rango de Wilcoxon emparejada; Fig. 5A). Este hallazgo está en concordancia con los aumentos en las células T efectoras activadas observadas en la sangre periférica en esta investigación y la expansión de células T observada con la monoterapia anti-PD-1 en otros tipos de tumores ^[30]. Sin embargo, no hubo una asociación entre la respuesta al tratamiento y los cambios en la infiltración inmune de CD3+CD8+ después del tratamiento. Aunque nuestra potencia estadística es limitada, nuestro hallazgo de que el tratamiento aumentó la infiltración intratumoral de CD3+CD8+ independientemente de la respuesta al tratamiento es consistente con la evidencia de que los tumores utilizan mecanismos adicionales además de la exclusión de células T para resistir la muerte inmunitaria ^[31], ^[32].

Dado la importancia de los estados funcionales de las células T en la regulación de la inmunidad antitumoral, aplicamos un panel de inmunofluorescencia de alta complejidad utilizando inmunofluorescencia cíclica (CyCIF) y un panel diseñado para definir los subestados de las células T. Seleccionamos 17 muestras para imágenes CyCIF adicionales (para las que se han validado más marcadores de células T que para Orion) con marcadores inmunitarios clave que incluyen LAG-3, TIM-3, T-bet, CD103, OX40 y granzima B, entre otros (Tabla S3) ^[33]. Después de la obtención de imágenes y la cuantificación, 15 muestras que abarcan 10 pacientes (con cinco que tienen biopsias de pretratamiento y durante el tratamiento emparejadas) pasaron el control de calidad y tenían suficiente tumor para un análisis adicional. Para evaluar la consistencia interna de nuestros resultados, comparamos la fracción de células T CD3+CD8+ infiltrantes en el tumor al comparar los ensayos de inmunofluorescencia CyCIF y Orion en secciones seriadas y observamos un coeficiente de correlación de Pearson de 0,83 (p = 0,0004), lo que respalda la confiabilidad de nuestro enfoque para cuantificar la infiltración de células T a partir de biopsias.

Aunque el recuento limitado de muestras impidió cálculos estadísticos más amplios, observamos evidencia de una remodelación asociada al tratamiento de los fenotipos de células T CD8+ intratumorales. Encontramos que el único respondedor clínico con tejido de pretratamiento y durante el tratamiento disponible (1887-19) demostró un aumento marcado en las células T de memoria residentes en el tejido (TRM; CD3+CD103+), las células T efectoras citotóxicas (CD8+GZMB+), las células T activadas (CD8+OX40+) y las células T agotadas (CD8+TIM3+LAG3+), y las células T residentes en el tejido activadas (CD103+tBET+GZMB+; Fig. 5B). En los cinco pacientes con biopsias emparejadas disponibles para el perfilado de células T, también observamos un aumento de 13 veces en la proporción media de células T agotadas al comparar el pretratamiento con el tratamiento (Fig. 5B). Otro paciente con una respuesta parcial (1887-01) tuvo la mayor infiltración de células T residentes en el tejido activadas en el pretratamiento (Fig. 5C). En el paciente 1887-19 (respuesta clínica parcial), las TRM aumentaron más de 5 veces en la biopsia durante el tratamiento. Una proporción sustancial de estas TRM también fueron positivas para la granzima B (pretratamiento: 30 %, durante el tratamiento: 28 %; Fig. 5D). Aunque es exploratorio, estas observaciones sugieren que la expansión asociada al tratamiento de distintos fenotipos de células T CD8+ contribuye al resultado clínico, una hipótesis que requerirá validación en conjuntos de pacientes ampliados.

La inmunofluorescencia altamente multiplexada revela la farmacodinámica del tratamiento con copanlisib en el CCRC

Además de la señalización PI3K/AKT, los tumores de CCRC a menudo dependen de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)/la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) para lograr una proliferación celular sostenida ^[34]. Hipotetizamos que la inhibición de PI3KCA puede conducir a un cambio en la actividad relativa de estas dos vías después del tratamiento con copanlisib. Para identificar los cambios en las vías ERK/MAPK y PI3K/AKT con el tratamiento, realizamos imágenes de inmunofluorescencia multiplexada CyCIF utilizando 22 anticuerpos diseñados para medir los cambios asociados a la activación en la fosforilación de proteínas asociadas con estas vías. Se evaluó la actividad aguas arriba con pAKT-p473, pERK-p202/p204, la actividad aguas abajo con pS6-235 y pS6-240, y el estado del ciclo celular se evaluó con pRB-807/811, PCNA y Ki-67. Las biopsias de 15 pacientes (RC: n = 3; SD: n = 2; EP: n = 10) tenían suficiente tumor y calidad de imagen para un análisis CyCIF adicional. La cuantificación de los cambios en la fosforilación en las muestras de biopsia no es sencilla, por lo que utilizamos el agrupamiento no supervisado y el análisis visual para examinar los datos en su conjunto en doce marcadores (Fig. S8). Esto reveló una fuerte concordancia entre los dos anticuerpos contra la fosforilación de S6 (coeficiente de correlación de Pearson = 0,71; p < 10−16) y entre los dos marcadores de proliferación celular primaria (Ki-67 y PCNA; coeficiente de correlación de Pearson = 0,45; p < 10−16). En la revisión de la imagen, observamos que los marcadores en múltiples niveles de las vías ERK/MAPK o PI3K/AKT se localizaron en las mismas regiones espaciales de la biopsia (Fig. 6A) y en las mismas células (Fig. 6B), lo que sugiere que CyCIF puede capturar la señalización de la proliferación celular en estas cascadas con alta especificidad.

Cuando comparamos la señalización de ERK/MAPK y PI3K/AKT en las biopsias de pretratamiento en los tumores con mutaciones de PIK3CA y de tipo salvaje, encontramos que las células tumorales con mutaciones de PIK3CA exhibieron una señalización de pAKT significativamente mayor (medida como el porcentaje de células tumorales PanCK+ positivas para pAKT) en comparación con los tumores de tipo salvaje de PIK3CA (p = 0,0044; prueba de rango de Wilcoxon; Fig. 6C). No hubo una diferencia significativa en la actividad de pERK en el pretratamiento entre los tumores con mutaciones de PIK3CA y de tipo salvaje (p = 0,86; prueba de rango de Wilcoxon; Fig. 6D).

A continuación, investigamos cómo el tratamiento con copanlisib/nivolumab afecta las señales de proliferación celular. Nos centramos en siete pacientes (WT: n = 3; mutación PIK3CA: n = 4), con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento, con suficiente cantidad de tumor y calidad de imagen CyCIF para la cuantificación del estado celular. En los cuatro pacientes con tumores con mutación PI3KCA y biopsias pareadas, observamos un aumento en la fracción de células pERK+ después del tratamiento, en comparación con solo un tumor PI3KCA WT, aunque nuestro poder estadístico fue demasiado limitado para extraer conclusiones definitivas (Fig. 6E). No observamos ninguna diferencia consistente al comparar la fracción de células tumorales pAKT+ entre las biopsias pretratamiento y durante el tratamiento (Fig. 6E). Cuando examinamos los marcadores de proliferación celular posteriores, pRB, Ki-67 y p27, observamos una tendencia hacia un aumento de la fosforilación de RB, un aumento de los niveles de Ki-67 y una disminución de la expresión de p27, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas, después del tratamiento (Fig. 6F). Aunque los datos están limitados por el pequeño tamaño de la muestra, estos datos respaldan la idea de que las células tumorales con mutación PIK3CA aumentan su dependencia de la señalización ERK/MAPK después del tratamiento con copanlisib, y que las células tumorales que sobreviven a la terapia y se encuentran en las biopsias durante el tratamiento tienden a ser más proliferativas.

Características de los pacientes

Desde febrero de 2019 hasta abril de 2022, se incluyeron 39 pacientes en este ensayo, con 6 pacientes en la fase 1 y 33 pacientes en la fase 2, incluidos 12 pacientes con CRC de tipo silvestre para PIK3CA y 21 pacientes con CRC con mutación PIK3CA. Las características demográficas de los pacientes incluidos se presentan en la Tabla 1. Todos los pacientes habían recibido al menos 2 líneas de tratamiento previo. En el momento de la censura, 3 pacientes seguían recibiendo tratamiento activo (1 en el grupo de tipo silvestre para PIK3CA y 2 en el grupo con mutación PIK3CA).

La terapia combinada con copanlisib y nivolumab fue segura

En la fase 1 de este estudio, los primeros 6 pacientes no mostraron toxicidad limitante de la dosis, por lo que el ensayo pasó a la fase 2. La toxicidad fue evaluable para todos los pacientes que iniciaron el tratamiento y ningún paciente lo interrumpió debido a eventos adversos relacionados con el fármaco (EA). Las toxicidades hematológicas y no hematológicas se muestran en la Tabla S4. Hubo 31 toxicidades de grado 3/4 atribuibles a copanlisib y nivolumab, siendo la más común la hipertensión en 16 (41%) pacientes y el exantema maculopapular en 4 (10%) pacientes. En general, 38 de los 39 pacientes experimentaron al menos un EA relacionado con el tratamiento. Las toxicidades atribuibles más frecuentes fueron diarrea (11 pacientes, 28%), náuseas (26, 67%), vómitos (13, 33%), fatiga (14, 36%), pérdida de peso (8, 21%), hiperglucemia (21, 54%), exantema maculopapular (16, 41%) e hipertensión (23, 59%). Un resumen de los EA atribuibles de grado 3, todos los EA de grado 3/4 y los EA atribuibles se detallan en los Datos Suplementarios 2, 3 y la Tabla Suplementaria 4, respectivamente.

Copanlisib y nivolumab produjeron respuestas al tratamiento en el CRC metastásico con alteraciones en PIK3 con una durabilidad notable

Entre los 39 pacientes (incluidos los de la fase 1 tratados con la misma dosis) con datos de respuesta evaluables, 2 de 22 pacientes en el grupo con mutación PIK3CA tuvieron respuestas parciales a los 6 meses. Ninguno de los pacientes en el grupo de tipo silvestre para PIK3CA tuvo una respuesta parcial o completa en este punto temporal preespecificado, y por lo tanto, el reclutamiento de ese grupo se detuvo antes de lo previsto. Sin embargo, dos pacientes con enfermedad estable prolongada, uno en cada grupo, desarrollaron respuestas parciales después de 6 meses, lo que resultó en una tasa de respuesta objetiva (ORR) final de 4/39 en ambos grupos. En los pacientes con CRC con mutación PIK3CA, 3 de 22 pacientes (13,6%, intervalo de confianza (IC) del 95%: 4,7–33,3%) respondieron y en los pacientes con CRC de tipo silvestre para PIK3CA, 1 de 17 (5,9%, IC del 95%: 1,0–27,0%) respondieron (Fig. 1, Tabla Suplementaria 4). Si bien el brazo experimental en pacientes con mutación PIK3CA solo tuvo dos respondedores en el punto temporal de 6 meses, lo que impidió alcanzar el punto final primario de tres o más pacientes con respuesta al tratamiento, un tercer paciente tuvo una respuesta tardía después de 6 meses, lo que resultó en tres respondedores en total de los 22 pacientes en el grupo con mutación PIK3CA. Por lo tanto, el umbral se cumplió en última instancia, aunque esto debe categorizarse como un hallazgo exploratorio. Curiosamente, el único respondedor en el grupo de tipo silvestre para PIK3CA tenía una alteración en PI3K (amplificación del gen PIK3R1 que codifica la subunidad p85α de PI3K) que podría activar potencialmente la señalización de PI3K^[23]. No hubo diferencias estadísticamente significativas en los resultados a largo plazo medianos entre los pacientes con tumores de tipo silvestre y mutados para PIK3CA, con una mediana de supervivencia libre de progresión (SLP) de 1,6 meses en los pacientes con enfermedad de tipo silvestre para PIK3CA y 1,7 meses en los pacientes con tumores con mutación PIK3CA. La mediana de supervivencia global (SG) fue de 8,5 meses y 6,7 meses en estos dos grupos, respectivamente (Figura Suplementaria 2). La duración de la respuesta fue de 13,1 meses en el paciente con tumor de tipo silvestre para PIK3CA que logró una RP y una mediana de 17 meses [9,40, 20,6] en los pacientes con tumores con mutación PIK3CA. La tasa de control de la enfermedad a los 6 meses fue de 2/17 (11,8%) en los pacientes con tumores de tipo silvestre para PIK3CA y 3/22 (13,6%) en los pacientes con tumores con mutación PIK3CA.

Si bien hubo una actividad alentadora con la combinación de copanlisib y nivolumab en la enfermedad con alteración de PI3K, la tasa de respuesta fue modesta. Sin embargo, es importante destacar que todos los pacientes que lograron una respuesta parcial también demostraron una SLP de más de dos años. Los tres pacientes con CRC con mutación PIK3CA y respuestas parciales tuvieron una SLP de 24,2, 26,6 y 29,8 meses, respectivamente. El paciente con una respuesta parcial en el grupo de tipo silvestre para PIK3CA (que tenía una amplificación de PIK3R1) sigue recibiendo tratamiento después de 33,7 meses de seguimiento sin progresión de la enfermedad. Esto contrasta con cohortes anteriores de pacientes con CRC MSS tratados con anti-PD-1 solo, donde las tasas de respuesta fueron del 0% y la SLP a los 6 meses fue inferior al 5%^[24]. Hay datos limitados con copanlisib solo para el CRC, pero en los cuatro pacientes con neoplasias gastrointestinales que recibieron copanlisib en el ensayo NCI Match, ninguno logró una respuesta parcial o completa^[25].

Como análisis exploratorio, evaluamos si el tipo de mutación PIK3CA influyó en la respuesta al tratamiento comparando las mutaciones del exón 9 de PIK3CA (n = 12, RP: 1, EE: 1, EP: 10) y las mutaciones del exón 20 de PIK3CA (n = 5, RP: 1, EE: 1, EP: 3). Sin embargo, estos subgrupos no mostraron una diferencia estadística en la SLP o la SG en comparación con el grupo de tipo silvestre para PIK3CA (Figura Suplementaria 2). Luego, evaluamos si las mutaciones o deleciones inactivadoras de PTEN influyeron en la respuesta al tratamiento. Ninguno de los cuatro pacientes con respuestas clínicas presentaba inactivación genómica de PTEN, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Es importante tener en cuenta que este estudio tuvo un tamaño de muestra pequeño para estos análisis de subgrupos.

Actividad clínica según el sitio de la enfermedad metastásica

La literatura previa ha sugerido que los pacientes con metástasis pulmonares únicas del CRC responden mejor a los enfoques inmunomoduladores que aquellos con otros sitios de enfermedad^[26]–^[28]. La mayoría de los pacientes (n = 23) en este ensayo presentaban metástasis hepáticas según RECIST (como se esperaba para esta población), mientras que 13 pacientes tenían enfermedad en otros sitios anatómicos, incluidos pulmón, peritoneo, ganglios linfáticos no torácicos, etc., sin evidencia de metástasis hepáticas. Los tres pacientes restantes presentaban lesiones hepáticas radiográficamente presentes que no eran elegibles para RECIST. No identificamos diferencias estadísticamente significativas en la respuesta y la tasa de beneficio clínico entre estos subgrupos (prueba exacta de Fisher p = 0,59 y p = 0,45 para la respuesta y la tasa de beneficio clínico, respectivamente; n = 36).

Para determinar si los pacientes con múltiples sitios de metástasis en diferentes órganos tenían respuestas diferenciales al tratamiento en estas ubicaciones, las lesiones medidas por RECIST de cada paciente se clasificaron como hígado, pulmón, peritoneo u otros (predominantemente adenopatías). Evaluamos estas lesiones en su exploración basal y las comparamos con las mediciones en su primera exploración RECIST durante el tratamiento para calcular una "respuesta específica del sitio". Nuestros datos sugieren que las metástasis hepáticas se comportaron de manera diferente a las metástasis en otros sitios. La mayoría de las metástasis hepáticas mostraron enfermedad progresiva (EP) como la mejor respuesta (83%) en comparación con el pulmón (32%) y otros sitios de metástasis (19%; Fig. 2A). En el subgrupo de 14 pacientes con metástasis hepáticas y pulmonares, las lesiones hepáticas se asociaron generalmente con EP (3 EP, 11 EP), mientras que la mayoría de la enfermedad pulmonar fue estable (11 EE, 3 EP). Esto también fue cierto para el subgrupo de 10 pacientes con metástasis hepáticas y en "otros" sitios: el 90% tuvo EP en el hígado frente al 10% EP (9 EE, 1 EP) en los "otros" sitios (Fig. 2A, C). En conjunto, en los pacientes con enfermedad tanto dentro como fuera del hígado, las metástasis no hepáticas tuvieron un mejor control tumoral en comparación con las lesiones hepáticas. Sin embargo, no está claro si esto refleja diferentes respuestas al tratamiento o si refleja la conocida tendencia de las metástasis pulmonares a crecer más lentamente que las metástasis hepáticas. Las respuestas con este tratamiento fueron tardías, y ninguno de los pacientes tuvo una respuesta general o específica del sitio en su evaluación radiográfica inicial durante el tratamiento.

Investigaciones correlativas

Las células CD8+ efectoras circulantes aumentan con la terapia con copanlisib y nivolumab, con una mayor proporción de células activadas en los pacientes que lograron un beneficio clínico

Para investigar la influencia de copanlisib y nivolumab en las poblaciones de células inmunitarias circulantes, obtuvimos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la línea de base y en el día 1 del ciclo 3 y realizamos un perfil inmunológico utilizando un panel de citometría de masas de 34 plex con tiempo de vuelo (CyTOF) (Métodos). Observamos que el tratamiento con 8 semanas de copanlisib/nivolumab condujo a un aumento en el porcentaje de células T CD8+ efectoras periféricas activadas (CD8+, Ki67+, CD137+, GZMB+) (p = 0,026; Fig. 3A). Esto fue más pronunciado en los pacientes que tuvieron un beneficio clínico (RP o EE) con el tratamiento (Fig. 3B): estos pacientes tuvieron un porcentaje menor de células T CD8+ ingenuas (CD8+, CD45RA+, CD45RO−, GZMB−) en sus muestras durante el tratamiento en comparación con aquellos con EP (p = 0,028; Fig. 3C).

También comparamos las proporciones de células T CD4+ circulantes antes y durante el tratamiento. Estas mostraron una tendencia hacia un fenotipo más efector (CD4+, CD28+, CD137+, PD1+) durante el tratamiento (Figura Suplementaria 3). La evaluación de otras poblaciones de células inmunitarias identificó una tendencia hacia niveles más altos de células NK después del tratamiento con copanlisib y nivolumab en pacientes con beneficio clínico (Fig. 3D y Figuras Suplementarias 4–7).

Se observaron niveles más altos de CD163+ y células CD3+CD8+ en el pretratamiento y una menor expresión de PD-L1 tumoral en los tumores de los respondedores

Para determinar cómo el tratamiento con nivolumab y copanlisib altera el microambiente tumoral (TME), realizamos imágenes de inmunofluorescencia multiplexada de Orion (ver "Métodos") en muestras de biopsia tumoral obtenidas antes del tratamiento y durante el tratamiento alrededor del día 15 del ciclo 2 (6 semanas en el tratamiento)^[29]. Dieciocho pacientes (RP: n = 3; EE: n = 3; EP: n = 12) tenían biopsias pretratamiento de calidad suficiente para evaluar el estado de infiltración inmune basal (Figura Suplementaria 7).

Las células T CD3+CD8+ citotóxicas son células inmunitarias efectoras clave de la terapia con ICI, y por lo tanto, preguntamos si la prevalencia de células T citotóxicas en las biopsias pretratamiento podría servir como un marcador de la respuesta a nivolumab y copanlisib. La comparación de las fracciones de células CD3+CD8+ entre las muestras de biopsia pretratamiento reveló un enriquecimiento en la fracción de células CD3+CD8+ en los respondedores parciales (prueba de rango de Wilcoxon, p = 0,039; Fig. 4a). El paciente (1887-01) con la fracción de células CD3+CD8+ pretratamiento más alta tuvo una fracción de células CD3+CD8+ pretratamiento 41 veces mayor que la mediana y logró una respuesta parcial (Fig. 4B, C). También encontramos que los tres respondedores clínicos con tejido pretratamiento suficiente exhibieron una proporción 5 veces mayor de células T CD8+ a células Treg FOXP3+ en comparación con los pacientes sin respuesta clínica (p = 0,10).

Los tumores pretratamiento con mutaciones en PIK3CA mostraron significativamente más macrófagos CD163+ (en proporción al total de células inmunitarias CD45+) en comparación con los tumores de tipo salvaje PIK3CA (p = 0,0094; prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Fig. 4d). Dos de los tres tumores con los niveles más altos de células CD163+ infiltrantes lograron respuestas parciales. Los tumores con mutaciones en PIK3CA tendieron a tener una mayor proporción de células CD163+ PD-L1+ positivas que los tumores de tipo salvaje (p = 0,053; Fig. 4e). Los pacientes con una mayor proporción pretratamiento de macrófagos (CD163+) a tumores (PanCK+) con expresión de PD-L1+ también tuvieron más probabilidades de tener una respuesta parcial al tratamiento (p = 0,039; Fig. 4F, G). No encontramos una diferencia significativa en la proporción de macrófagos CD163+ al comparar los tumores pretratamiento y durante el tratamiento.

El tratamiento resultó en una remodelación dinámica del microambiente inmunitario con un aumento de la infiltración de CD3+CD8+

Para determinar si el tratamiento con copanlisib y nivolumab aumentaría la infiltración de tumores CD3+CD8+, comparamos las biopsias pretratamiento y durante el tratamiento para la infiltración de células T CD3+CD8+ en los ocho pacientes para los que se dispuso de biopsias emparejadas. En los ocho pacientes, la infiltración de CD3+CD8+ aumentó después del tratamiento (p = 0,0006; prueba de suma de rangos pareados de Wilcoxon; Fig. 5A). Este hallazgo concuerda con el aumento de las células T CD8+ efectoras activadas observadas en la sangre periférica en esta investigación y la expansión de células T observada con la monoterapia anti-PD-1 en otros tipos de tumores ^[30]. Sin embargo, no hubo una asociación entre la respuesta al tratamiento y los cambios en la infiltración inmunitaria CD3+CD8+ después del tratamiento. Aunque nuestra potencia estadística es limitada, nuestro hallazgo de que el tratamiento aumentó la infiltración intratumoral de CD3+CD8+ independientemente de la respuesta al tratamiento es consistente con la evidencia de que los tumores utilizan mecanismos adicionales además de la exclusión de células T para resistir la eliminación inmunitaria ^[31], ^[32].

Dado la importancia de los estados funcionales de las células T en la regulación de la inmunidad antitumoral, aplicamos un panel de inmunofluorescencia de alto plexo utilizando inmunofluorescencia cíclica (CyCIF) y un panel diseñado para definir los subestados de las células T. Seleccionamos 17 muestras para una imagen CyCIF adicional (para las que se han validado más marcadores de células T que para Orion) con marcadores clave de células inmunitarias que incluyen LAG-3, TIM-3, T-bet, CD103, OX40 y granzima B, entre otros (Tabla suplementaria 3) ^[33]. Después de la imagen y la cuantificación, 15 muestras que abarcan 10 pacientes (con cinco que tienen biopsias pretratamiento y durante el tratamiento emparejadas) pasaron el control de calidad y tenían suficiente tumor para un análisis adicional. Para evaluar la consistencia interna de nuestros resultados, comparamos la fracción de células CD3+CD8+ infiltrantes en el tumor comparando los ensayos de inmunofluorescencia CyCIF y Orion en secciones seriadas y observamos un coeficiente de correlación de Pearson de 0,83 (p = 0,0004), lo que respalda la fiabilidad de nuestro enfoque para cuantificar la infiltración de células T a partir de biopsias.

Aunque el número limitado de muestras impidió cálculos estadísticos más amplios, observamos evidencia de una remodelación asociada al tratamiento de los fenotipos de células T CD8+ intratumorales. Encontramos que el único paciente con respuesta clínica con tejido pretratamiento y durante el tratamiento disponible (1887-19) demostró un aumento marcado en las células T de memoria residentes en el tejido (TRM; CD3+CD103+), las células T efectoras citotóxicas (CD8+GZMB+), las células T CD8+ activadas (CD8+OX40+) y las células T agotadas (CD8+TIM3+LAG3+), y las células T residentes en el tejido activadas (CD103+tBET+GZMB+; Fig. 5B). En los cinco pacientes con biopsias emparejadas disponibles para el perfilado de células T, también observamos un aumento de 13 veces en la proporción media de células T agotadas al comparar el pretratamiento con el tratamiento (Fig. 5B). Otro paciente con una respuesta parcial (1887-01) tuvo la mayor infiltración de células T residentes en el tejido activadas en el pretratamiento (Fig. 5C). En el paciente 1887-19 (respuesta clínica parcial), las TRM aumentaron más de 5 veces en la biopsia durante el tratamiento. Una proporción sustancial de estas TRM también fueron positivas para la granzima B (pretratamiento: 30%, durante el tratamiento: 28%; Fig. 5D). Aunque es exploratorio, estas observaciones sugieren la posibilidad de que la expansión asociada al tratamiento de fenotipos distintos de células T CD8+ contribuya al resultado clínico, una hipótesis que requerirá validación en conjuntos de pacientes ampliados.

La inmunofluorescencia altamente multiplexada revela la farmacodinámica del tratamiento con copanlisib en el CRC metastásico

Además de la señalización PI3K/AKT, los tumores de CRC a menudo dependen de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)/la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) para lograr una proliferación celular sostenida ^[34]. Hipotetizamos que la inhibición de PI3KCA puede conducir a un cambio en la actividad relativa de estas dos vías después del tratamiento con copanlisib. Para identificar los cambios en las vías ERK/MAPK y PI3K/AKT con el tratamiento, realizamos una imagen CyCIF multiplexada utilizando 22 anticuerpos diseñados para medir los cambios asociados a la activación en la fosforilación de proteínas asociados con estas vías. La actividad aguas arriba se evaluó con pAKT-p473, pERK-p202/p204, la actividad aguas abajo con pS6-235 y pS6-240, y el estado del ciclo celular se evaluó con pRB-807/811, PCNA y Ki-67. Las biopsias de 15 pacientes (RP: n = 3; EM: n = 2; EP: n = 10) tuvieron suficiente tumor y calidad de imagen para un análisis CyCIF adicional. Cuantificar los cambios en la fosforilación en las muestras de biopsia no es sencillo, por lo que utilizamos el agrupamiento no supervisado y el análisis visual para examinar los datos en su conjunto en doce marcadores (Fig. S8). Esto reveló una fuerte concordancia entre los dos anticuerpos contra la fosforilación de S6 (coeficiente de correlación de Pearson = 0,71; p < 10−16) y entre los dos marcadores primarios de proliferación celular (Ki-67 y PCNA; coeficiente de correlación de Pearson = 0,45; p < 10−16). En la revisión de la imagen, observamos que los marcadores en múltiples niveles de las vías ERK/MAPK o PI3K/AKT se localizaron en las mismas regiones espaciales de la biopsia (Fig. 6A) y en las mismas células (Fig. 6B), lo que sugiere que CyCIF puede capturar la señalización de proliferación celular en estas cascadas con alta especificidad.

Cuando comparamos la señalización de ERK/MAPK y PI3K/AKT en las biopsias pretratamiento en los tumores con mutaciones en PIK3CA y de tipo salvaje, encontramos que las células tumorales con mutaciones en PIK3CA exhibieron una señalización de pAKT significativamente mayor (medida como el porcentaje de células tumorales PanCK+ positivas para pAKT) en comparación con los tumores de tipo salvaje PIK3CA (p = 0,0044; prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Fig. 6C). No hubo una diferencia significativa en la actividad de pERK en el pretratamiento entre los tumores con mutaciones en PIK3CA y de tipo salvaje (p = 0,86; prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Fig. 6D).

Luego, investigamos cómo se ven afectados los signos de proliferación celular por el tratamiento con copanlisib/nivolumab. Nos centramos en siete pacientes (tipo salvaje: n = 3; mutación en PIK3CA: n = 4), con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento con suficiente tumor y calidad de imagen CyCIF para la cuantificación del estado celular. En los cuatro pacientes con tumores con mutaciones en PIK3CA y biopsias emparejadas, observamos un aumento en la fracción de células pERK+ después del tratamiento, en comparación con solo un tumor de tipo salvaje PIK3CA, aunque nuestra potencia estadística fue demasiado limitada para sacar conclusiones definitivas (Fig. 6E). No observamos una diferencia consistente al comparar la fracción de células tumorales pAKT+ entre las biopsias pretratamiento y durante el tratamiento (Fig. 6E). Cuando examinamos los marcadores de proliferación celular aguas abajo pRB, Ki-67 y p27, hubo una tendencia hacia un aumento de la fosforilación de RB, un aumento de los niveles de Ki-67 y una disminución de la expresión de p27, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas, después del tratamiento (Fig. 6F). Aunque está limitado por un tamaño de muestra pequeño, estos datos respaldan la noción de que las células tumorales con mutaciones en PIK3CA aumentan la dependencia de la señalización de ERK/MAPK después del tratamiento con copanlisib, y que las células tumorales que sobreviven a la terapia y se encuentran en las biopsias durante el tratamiento tienden a ser más proliferativas.

Las células T CD8+ efectoras circulantes aumentan con el tratamiento con copanlisib y nivolumab, con una mayor proporción de células activadas en los pacientes que obtuvieron beneficio clínico

Para investigar la influencia de copanlisib y nivolumab en las poblaciones de células inmunitarias circulantes, obtuvimos células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la línea de base y en el día 1 del ciclo 3 y realizamos un perfil inmunológico utilizando un panel de citometría de masas de 34 plexos (métodos). Observamos que el tratamiento con 8 semanas de copanlisib/nivolumab condujo a un aumento en el porcentaje de células T CD8+ efectoras periféricas activadas (CD8+, Ki67+, CD137+, GZMB+) (p = 0,026; Fig. 3A). Esto fue más pronunciado en los pacientes que tuvieron un beneficio clínico (RP o EM) con el tratamiento (Fig. 3B): estos pacientes tuvieron un porcentaje menor de células T CD8+ ingenuas (CD8+, CD45RA+, CD45RO−, GZMB−) en sus muestras durante el tratamiento en comparación con aquellos con EP (p = 0,028; Fig. 3C).

También comparamos las proporciones de células T CD4+ circulantes antes y durante el tratamiento. Estos demostraron una tendencia hacia un fenotipo más efector (CD4+, CD28+, CD137+, PD1+) durante el tratamiento (Fig. S3). La evaluación de otras poblaciones de células inmunitarias identificó una tendencia hacia niveles más altos de células NK después del tratamiento con copanlisib y nivolumab en pacientes con beneficio clínico (Fig. 3D y Fig. S4–S7).

Se observaron niveles más altos de CD163+ y células CD3+CD8+ en el pretratamiento y una menor expresión de PD-L1 en el tumor en los tumores de los respondedores

Para determinar cómo el tratamiento con nivolumab y copanlisib altera el TME, realizamos imágenes de inmunofluorescencia multiplexada de Orion (ver "Métodos") en muestras de biopsia tumoral obtenidas en el pretratamiento y durante el tratamiento alrededor del día 15 del ciclo 2 (6 semanas en el tratamiento) ^[29]. Dieciocho pacientes (RP: n = 3; EM: n = 3; EP: n = 12) tuvieron biopsias de pretratamiento de calidad suficiente para evaluar el estado de infiltración inmunitaria de la línea de base (Fig. S7).

Las células T CD3+CD8+ citotóxicas son células inmunitarias efectoras clave de la terapia de ICI, y por lo tanto, preguntamos si la prevalencia de células T citotóxicas en las muestras de biopsia de pretratamiento podría servir como un marcador de la respuesta a nivolumab y copanlisib. La comparación de las fracciones de células CD3+CD8+ entre las muestras de biopsia de pretratamiento reveló un enriquecimiento en la fracción de células CD3+CD8+ en los respondedores parciales (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p = 0,039; Fig. 4a). El paciente (1887-01) con la fracción de células CD3+CD8+ más alta en el pretratamiento tuvo 41 veces más la fracción de células CD3+CD8+ en el pretratamiento que la mediana y luego logró una respuesta parcial (Fig. 4B, C). También encontramos que los tres respondedores clínicos con suficiente tejido de pretratamiento exhibieron una proporción 5 veces mayor de células T CD8+ a células T reguladoras FOXP3+ en el tumor que los pacientes sin una respuesta clínica (p = 0,10).

Los tumores pretratamiento con mutaciones en PIK3CA mostraron significativamente más macrófagos CD163+ (en proporción al total de células inmunitarias CD45+) en comparación con los tumores de tipo salvaje PIK3CA (p = 0,0094; prueba de suma de rangos de Wilcoxon; Fig. 4d). Dos de los tres tumores con los niveles más altos de células CD163+ infiltrantes lograron respuestas parciales. Los tumores con mutaciones en PIK3CA tendieron a tener una mayor proporción de células CD163+ PD-L1+ positivas que los tumores de tipo salvaje (p = 0,053; Fig. 4e). Los pacientes con una mayor proporción de pretratamiento de macrófagos (CD163+) a tumores (PanCK+) con expresión de PD-L1+ también tuvieron más probabilidades de tener una respuesta parcial al tratamiento (p = 0,039; Fig. 4F, G). No encontramos una diferencia significativa en la proporción de macrófagos CD163+ al comparar los tumores pretratamiento y durante el tratamiento.

El tratamiento resultó en una remodelación dinámica del microambiente inmunitario con un aumento de la infiltración de CD3+CD8+

Para determinar si el tratamiento con copanlisib y nivolumab aumentaría la infiltración de células CD3+CD8+ en el tumor, comparamos las biopsias pretratamiento y durante el tratamiento para evaluar la infiltración de células T CD3+CD8+ en los ocho pacientes para los que se dispuso de biopsias emparejadas. En los ocho pacientes, la infiltración de células CD3+CD8+ aumentó tras el tratamiento (p = 0,0006; prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejada; Fig. 5A). Este hallazgo concuerda con el aumento de las células T CD8+ efectoras activadas observadas en la sangre periférica en esta investigación y la expansión de células T observada con la monoterapia anti-PD-1 en otros tipos de tumores^[30]. Sin embargo, no hubo asociación entre la respuesta al tratamiento y los cambios en la infiltración inmune de células CD3+CD8+ tras el tratamiento. Aunque nuestra capacidad estadística es limitada, nuestro hallazgo de que el tratamiento aumentó la infiltración intratumoral de células CD3+CD8+ independientemente de la respuesta al tratamiento es consistente con la evidencia de que los tumores utilizan mecanismos adicionales, además de la exclusión de células T, para resistir la destrucción inmune^[31],^[32].

Dado la importancia de los estados funcionales de las células T en la regulación de la inmunidad antitumoral, aplicamos un panel de inmunofluorescencia de alta complejidad utilizando inmunofluorescencia cíclica (CyCIF) y un panel diseñado para definir los subestados de las células T. Seleccionamos 17 muestras para obtener imágenes adicionales con CyCIF (para las que se han validado más marcadores de células T que para Orion) con marcadores clave de células inmunitarias, incluidos LAG-3, TIM-3, T-bet, CD103, OX40 y granzima B, entre otros (Tabla suplementaria 3)^[33]. Después de la obtención de imágenes y la cuantificación, 15 muestras que abarcaron 10 pacientes (cinco de los cuales tenían biopsias emparejadas pretratamiento y durante el tratamiento) superaron el control de calidad y contuvieron suficiente tumor para un análisis posterior. Para evaluar la consistencia interna de nuestros resultados, comparamos la fracción de células CD3+CD8+ infiltrantes en el tumor comparando los ensayos de inmunofluorescencia CyCIF y Orion en secciones seriadas y observamos un coeficiente de correlación de Pearson de 0,83 (p = 0,0004), lo que respalda la fiabilidad de nuestro enfoque para cuantificar la infiltración de células T a partir de biopsias.

Aunque el número limitado de muestras impidió realizar cálculos estadísticos más amplios, observamos evidencia de una remodelación asociada al tratamiento de los fenotipos de células T CD8+ intratumorales. Encontramos que el único paciente con respuesta clínica con tejido disponible antes y durante el tratamiento (1887-19) demostró un aumento marcado en las células T de memoria residentes en el tejido (TRM; CD3+CD103+), las células T efectoras citotóxicas (CD8+GZMB+), las células T CD8+ activadas (CD8+OX40+) y las células T agotadas (CD8+TIM3+LAG3+), así como las células T residentes en el tejido activadas (CD103+tBET+GZMB+; Fig. 5B). En los cinco pacientes con biopsias emparejadas disponibles para el perfilado de células T, también observamos un aumento de 13 veces en la proporción media de células T agotadas al comparar el período pretratamiento con el período durante el tratamiento (Fig. 5B). Otro paciente con una respuesta parcial (1887-01) presentaba la mayor infiltración de células T residentes en el tejido activadas en la biopsia pretratamiento (Fig. 5C). En el paciente 1887-19 (respuesta clínica parcial), las TRM aumentaron más de 5 veces en la biopsia durante el tratamiento. Una proporción sustancial de estas TRM también fueron positivas para la granzima B (pretratamiento: 30%, durante el tratamiento: 28%; Fig. 5D). Aunque son observaciones preliminares, sugieren la posibilidad de que la expansión asociada al tratamiento de fenotipos distintos de células T CD8+ contribuya al resultado clínico, una hipótesis que requerirá validación en conjuntos de pacientes ampliados.

La inmunofluorescencia altamente multiplexada revela la farmacodinámica del tratamiento con copanlisib en el CRC metastásico

Además de la señalización PI3K/AKT, los tumores de CRC a menudo dependen de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)/la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) para lograr una proliferación celular sostenida^[34]. Hipotetizamos que la inhibición de PI3KCA podría conducir a un cambio en la actividad relativa de estas dos vías tras el tratamiento con copanlisib. Para identificar los cambios en las vías ERK/MAPK y PI3K/AKT con el tratamiento, realizamos una imagen CyCIF multiplexada utilizando 22 anticuerpos diseñados para medir los cambios asociados a la activación en la fosforilación de proteínas asociados con estas vías. La actividad ascendente se evaluó con pAKT-p473, pERK-p202/p204, la actividad descendente con pS6-235 y pS6-240, y el estado del ciclo celular se evaluó con pRB-807/811, PCNA y Ki-67. Las biopsias de 15 pacientes (RP: n = 3; EM: n = 2; EP: n = 10) contenían suficiente tumor y calidad de imagen para un análisis posterior de CyCIF. Cuantificar los cambios en la fosforilación en las muestras de biopsia no es sencillo, por lo que utilizamos el agrupamiento no supervisado y el análisis visual para examinar los datos en su conjunto en doce marcadores (Fig. suplementaria 8). Esto reveló una fuerte concordancia entre los dos anticuerpos contra la fosforilación de S6 (coeficiente de correlación de Pearson = 0,71; p < 10−16) y entre los dos marcadores primarios de proliferación celular (Ki-67 y PCNA; coeficiente de correlación de Pearson = 0,45; p < 10−16). En la revisión de la imagen, observamos que los marcadores en múltiples niveles de las vías ERK/MAPK o PI3K/AKT se localizaron en las mismas regiones espaciales de la biopsia (Fig. 6A) y en las mismas células (Fig. 6B), lo que sugiere que CyCIF puede capturar la señalización de proliferación celular en estas cascadas con alta especificidad.

Cuando comparamos la señalización de ERK/MAPK y PI3K/AKT en las biopsias pretratamiento en tumores con mutación PIK3CA y tumores de tipo salvaje, encontramos que las células tumorales con mutación PI3KCA exhibieron una fosforilación de AKT significativamente mayor (medida como el porcentaje de células tumorales PanCK+ positivas para pAKT) en comparación con los tumores de tipo salvaje de PIK3CA (p = 0,0044; prueba de rango de Wilcoxon; Fig. 6C). No hubo una diferencia significativa en la actividad de pERK pretratamiento entre los tumores con mutación PI3KCA y los tumores de tipo salvaje (p = 0,86; prueba de rango de Wilcoxon; Fig. 6D).

Luego, investigamos cómo el tratamiento con copanlisib/nivolumab afecta las señales de proliferación celular. Nos centramos en siete pacientes (tipo salvaje: n = 3; mutación PIK3CA: n = 4), con biopsias pretratamiento y durante el tratamiento con suficiente tumor y calidad de imagen CyCIF para la cuantificación del estado celular. En los cuatro pacientes con tumores con mutación PI3KCA y biopsias emparejadas, observamos un aumento en la fracción de células pERK+ después del tratamiento, en comparación con solo un tumor de tipo salvaje de PIK3CA, aunque nuestra capacidad estadística fue demasiado limitada para extraer conclusiones definitivas (Fig. 6E). No observamos ninguna diferencia consistente al comparar la fracción de células tumorales pAKT+ entre las biopsias pretratamiento y durante el tratamiento (Fig. 6E). Cuando examinamos los marcadores de proliferación celular descendentes pRB, Ki-67 y p27, hubo una tendencia hacia un aumento de la fosforilación de RB, un aumento de los niveles de Ki-67 y una disminución de la expresión de p27, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclinas, después del tratamiento (Fig. 6F). Aunque está limitado por el pequeño tamaño de la muestra, estos datos respaldan la idea de que las células tumorales con mutación PIK3CA aumentan su dependencia de la señalización de ERK/MAPK después del tratamiento con copanlisib, y que las células tumorales que sobreviven a la terapia y se encuentran en las biopsias durante el tratamiento tienden a ser más proliferativas.

Discusión

Los esfuerzos previos para tratar el CRC MSS con mutación PIK3CA con inhibidores de PI3K o bloqueo de puntos de control inmunitarios han producido beneficios clínicos limitados, lo que subraya la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas.^[11]–^[14] Hipotetizamos que la inhibición de PI3K podría remodelar favorablemente el microambiente tumoral (TME) y mejorar la susceptibilidad al bloqueo del PD-1, particularmente en tumores con mutaciones activadoras de PIK3CA. Para probar esto, realizamos un ensayo de fase 1/2 de copanlisib más nivolumab en pacientes con CRC MSS, inscribiendo cohortes separadas de enfermedad con mutación PIK3CA y de tipo salvaje. Las cuatro respuestas parciales se produjeron en pacientes con alteraciones de la vía PI3K (tres con tumores con mutación PIK3CA y uno con una amplificación de PIK3R1), y tres pacientes adicionales con mutación PIK3CA lograron una enfermedad estable. Aunque no se cumplió el punto final primario, estos hallazgos son notables dado el mal pronóstico de esta población. Debido al pequeño tamaño de la muestra y la asignación de cohortes no aleatorizada, sin embargo, cualquier interpretación comparativa debe hacerse con cautela.

El tratamiento se toleró generalmente bien, sin señales de seguridad inesperadas a pesar de los efectos inmunomoduladores de ambos agentes. La hipertensión fue la toxicidad más común de grado 3/4 (41%), similar a las tasas observadas con la monoterapia con copanlisib en CHRONOS-1, mientras que la erupción de grado 3/4 (10%) ocurrió con más frecuencia de lo que se informó con cualquiera de los dos fármacos solos, lo que sugiere una posible toxicidad cutánea relacionada con la combinación^[35],^[36].

Hipotetizamos que la capacidad de respuesta de los tumores con mutación PIK3CA refleja las contribuciones tanto de la biología intrínseca del tumor como del TME. En particular, los tres pacientes con mutación PIK3CA que lograron una respuesta parcial experimentaron una supervivencia libre de progresión (SLP) que superó los dos años, un resultado que es muy inusual en pacientes con CRC MSS muy pretratados. Aunque el número de respondedores fue pequeño, la durabilidad de estas respuestas es sorprendente dado la actividad mínima de la inmunoterapia o las terapias de tercera línea estándar en el CRC MSS. La observación de que un paciente con amplificación de PIK3R1 logró una respuesta parcial de >24 meses sugiere aún más que las alteraciones más allá de PIK3CA también pueden conferir susceptibilidad a esta estrategia terapéutica. Además, observamos retrasos significativos entre el inicio del tratamiento y la respuesta clínica. Hipotetizamos que estos representan ya sea respuestas retrasadas relacionadas con el ICI o que la remodelación del TME mediada por la inhibición de PI3KCA es un proceso más lento que los efectos antitumorales directos asociados con la quimioterapia.

Se cree que el TME de las metástasis hepáticas es inmunosupresor, y las metástasis hepáticas se asocian con peores resultados en la terapia con ICI^[28],^[37]–^[39]. Coherente con estos datos, encontramos que los pacientes sin afectación hepática tenían el doble de probabilidades de lograr una RP que aquellos con metástasis hepáticas, aunque el pequeño tamaño de la muestra limita las conclusiones definitivas. Los mecanismos subyacentes a estas respuestas deficientes de la ICI en las metástasis hepáticas aún no se comprenden completamente. En nuestro ensayo de fase 2 separado de nivolumab y relatlimab en pacientes con CRC MSS, el análisis de la citometría de masas de imágenes encontró que las metástasis pulmonares se asociaron con niveles más altos de células dendríticas y una tendencia hacia una mayor proporción de células B en comparación con las metástasis hepáticas, que estaban relativamente enriquecidas con Tregs^[40]. En un modelo de ratón preclínico, el tratamiento con copanlisib aumentó la relación de células T CD8+ intratumorales a Tregs, lo que respalda un modelo en el que el bloqueo de PI3K puede aliviar la inmunosupresión mediada por Tregs^[22].

Los análisis correlativos proporcionaron varias ideas sobre cómo la inhibición de PI3K puede moldear la inmunidad antitumoral en el CRC MSS. La imagen de alta complejidad demostró que la actividad de la vía (fosforilación de ERK, AKT, S6) se puede cuantificar de manera confiable incluso en pequeñas biopsias metastásicas, lo que respalda la incorporación de ensayos de señalización celular basados en imágenes, como Orion y CyCIF, en estudios futuros. La imagen de alta complejidad confirmó además las diferencias de señalización objetivo esperadas entre los tumores con mutación PIK3CA y de tipo salvaje, incluido un aumento de la activación de AKT en la línea de base y una tendencia hacia una regulación ascendente compensatoria de ERK con el tratamiento. Sin embargo, no observamos ninguna otra tendencia consistente en cómo las muestras durante el tratamiento alteran la señalización de PI3K/AKT o ERK/MAPK. Aunque esto puede atribuirse a un pequeño tamaño de la muestra, la dinámica compleja de retroalimentación y los ciclos de activación pulsátil dificultan la interpretación de las señales de ERK y AKT^[41],^[42]. Dado los resultados generalmente deficientes con los inhibidores de KRAS G12C y BRAF como monoterapia en el CRC en comparación con otros tipos de tejidos tumorales debido a la regulación ascendente de vías de crecimiento paralelas y el beneficio mejorado con los enfoques de inhibidores de combinación, estos datos pueden sugerir que un enfoque racional para mejorar la actividad de la inhibición de PIK3CA en combinación con la ICI en el CRC MSS puede ser la adición de inhibidores de la vía MAPK^[43],^[44].

Nuestros hallazgos, que indican que los pacientes con mayor infiltración de CD3+CD8+ antes del tratamiento tienen más probabilidades de responder, son consistentes con las observaciones de larga data que sugieren que la inmunidad preexistente de las células T citotóxicas predice el beneficio de la inmunoterapia de inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI)^[6],^[45],^[46]. Los pacientes que respondieron también mostraron niveles elevados de macrófagos CD163+PD-L1+ al inicio, lo que apoya los modelos preclínicos que sugieren que la inhibición de PI3K puede aliviar la supresión mediada por células mieloides lo suficiente como para permitir un bloqueo eficaz de PD-1 en un subconjunto de pacientes^[8],^[19]. Descubrimos que, si bien las células CD3+CD8+ aumentaron universalmente después del tratamiento, esto no se correlacionó con la respuesta clínica. Esto sugiere que, si bien copanlisib/nivolumab puede mejorar el tráfico de las células T hacia el microambiente tumoral (TME), esto no es suficiente en la mayoría de los pacientes para superar otras barreras a una respuesta inmune antitumoral eficaz. La infiltración de células inmunes CD8+ también aumenta en los tumores de melanoma después de la inmunoterapia, pero el grado en que copanlisib o nivolumab contribuyeron a este efecto en nuestra cohorte sigue siendo desconocido^[47]. También identificamos aumentos asociados al tratamiento en las células T residentes de memoria y efectoras en los tejidos, así como una expansión de los subconjuntos agotados de TIM3/LAG3, lo que es consistente con la remodelación fenotípica esperada inducida por la inmunoterapia^[48].

El uso combinado de copanlisib/nivolumab en esta población de pacientes limita nuestra capacidad para discernir la contribución de cada uno de estos componentes a las respuestas observadas al tratamiento. Sin embargo, la observación de que todas las respuestas al tratamiento se limitaron a los pacientes con enfermedad alterada en PI3K y las bajas tasas de respuesta a nivolumab previamente informadas en esta población de pacientes sugieren una contribución importante de copanlisib a estas respuestas favorables. El perfilado espacial reveló además que los tumores con mutación en PIK3CA presentaban la activación esperada de la señalización PI3K-AKT antes del tratamiento y una tendencia hacia la activación compensatoria de MAPK-ERK después del tratamiento, lo que sugiere aún más los efectos dirigidos de copanlisib. Sin embargo, no pudimos determinar si la alteración de la señalización intrínseca del tumor o la modulación inmune impulsaron principalmente la respuesta terapéutica de copanlisib.

Aunque un subconjunto de pacientes con alteraciones en la vía de PI3K obtuvo un beneficio duradero, la mayoría experimentó una progresión primaria, lo que subraya la complejidad de dirigir terapéuticamente esta vía. Una posibilidad es que la amplia inhibición de PI3K de copanlisib mejoró la activación de las células T CD8+ y, al mismo tiempo, restringió la función efectora a través de la inhibición dirigida de PI3Kδ/γ en las células T^[21]. Los inhibidores de PI3Kα más selectivos, como alpelisib o inavolisib, que ya se utilizan clínicamente en el cáncer de mama, pueden explotar mejor la activación intrínseca del tumor de PIK3CA al tiempo que minimizan la supresión no deseada de la inmunidad antitumoral. Copanlisib ha sido retirado del mercado estadounidense después de no demostrar un beneficio en la supervivencia global (OS) en el linfoma folicular. Por lo tanto, hasta donde sabemos, no hay ensayos activos en la actualidad que evalúen aún más copanlisib y nivolumab en el cáncer colorrectal (CRC). Sin embargo, anticipamos una discusión continua sobre cómo aprovechar mejor los efectos inmunomoduladores de la inhibición de PI3K en el CRC y otros tumores con mutación en PIK3CA.

Resumen de los resultados

La combinación de copanlisib y nivolumab condujo a respuestas notables y duraderas de más de 2 años en un subconjunto de pacientes con CRC metastásico MSS enriquecido para aquellos con alteraciones en la vía de PI3K. Descubrimos que la presencia de niveles basales más altos de células CD3+CD8+ y CD163+ se asoció con respuestas favorables al tratamiento, lo que puede proporcionar biomarcadores adicionales para seleccionar a los pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse de este enfoque de tratamiento. El perfilado farmacodinámico de biopsias emparejadas identificó un aumento dinámico de las células T CD3+CD8+ infiltrantes después del tratamiento con copanlisib/nivolumab, y niveles basales altos de pAKT en los tumores con mutación en PIK3CA y un aumento posterior en la actividad de pERK después del tratamiento. Esto sugiere la necesidad de explorar más a fondo los enfoques combinatorios que involucren inhibidores de la vía MAPK e inmunoterapia en enfermedades con alteración de PI3K.

Estos conocimientos biológicos críticos ayudarán a guiar el diseño futuro de los ensayos e informarán sobre qué pacientes tienen más probabilidades de beneficiarse de este enfoque de tratamiento. Además, esperamos que este marco de ensayo, con un enfoque en la obtención de muestras correlativas para investigaciones traslacionales, se utilice cada vez más como parte del diseño de ensayos clínicos para acelerar nuestra comprensión de los efectos farmacodinámicos y los mecanismos de resistencia a los nuevos tratamientos.

Limitaciones

Este ensayo de fase 1/2, abierto y multicéntrico, tiene varias limitaciones que deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados. En primer lugar, se trata de un estudio pequeño con un número limitado de pacientes que respondieron (n= 4) y un número total de pacientes con mutación en PIK3CA (n= 22) y enfermedad de tipo salvaje (n= 17), lo que hace que este estudio no tenga suficiente potencia para extraer conclusiones definitivas sobre la actividad general o los biomarcadores predictivos. Esto es particularmente cierto con el análisis de subgrupos, como los pacientes con diferentes subtipos de mutación en PIK3CA. Para analizar cómo este enfoque de tratamiento influye en el TME, obtuvimos biopsias basales y durante el tratamiento. Si bien obtuvimos biopsias de la misma lesión en los dos puntos temporales, estas biopsias solo muestrean una parte de la lesión del paciente, lo que introduce la posibilidad de un sesgo de muestreo. Además, las biopsias durante el tratamiento de algunos pacientes, particularmente aquellos con respuestas favorables al tratamiento, tenían muy pocas células neoplásicas para la investigación de la actividad de señalización de MAPK-AKT.

Resumen de los resultados

La combinación de copanlisib y nivolumab condujo a respuestas notables y duraderas de más de 2 años en un subconjunto de pacientes con CRC metastásico MSS enriquecido para aquellos con alteraciones en la vía de PI3K. Descubrimos que la presencia de niveles basales más altos de células CD3+CD8+ y CD163+ se asoció con respuestas favorables al tratamiento, lo que puede proporcionar biomarcadores adicionales para seleccionar a los pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse de este enfoque de tratamiento. El perfilado farmacodinámico de biopsias emparejadas identificó un aumento dinámico de las células T CD3+CD8+ infiltrantes después del tratamiento con copanlisib/nivolumab, y niveles basales altos de pAKT en los tumores con mutación en PIK3CA y un aumento posterior en la actividad de pERK después del tratamiento. Esto sugiere la necesidad de explorar más a fondo los enfoques combinatorios que involucren inhibidores de la vía MAPK e inmunoterapia en enfermedades con alteración de PI3K.

Estos conocimientos biológicos críticos ayudarán a guiar el diseño futuro de los ensayos e informarán sobre qué pacientes tienen más probabilidades de beneficiarse de este enfoque de tratamiento. Además, esperamos que este marco de ensayo, con un enfoque en la obtención de muestras correlativas para investigaciones traslacionales, se utilice cada vez más como parte del diseño de ensayos clínicos para acelerar nuestra comprensión de los efectos farmacodinámicos y los mecanismos de resistencia a los nuevos tratamientos.

Limitaciones

Este ensayo de fase 1/2, abierto y multicéntrico, tiene varias limitaciones que deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados. En primer lugar, se trata de un estudio pequeño con un número limitado de pacientes que respondieron (n= 4) y un número total de pacientes con mutación en PIK3CA (n= 22) y enfermedad de tipo salvaje (n= 17), lo que hace que este estudio no tenga suficiente potencia para extraer conclusiones definitivas sobre la actividad general o los biomarcadores predictivos. Esto es particularmente cierto con el análisis de subgrupos, como los pacientes con diferentes subtipos de mutación en PIK3CA. Para analizar cómo este enfoque de tratamiento influye en el TME, obtuvimos biopsias basales y durante el tratamiento. Si bien obtuvimos biopsias de la misma lesión en los dos puntos temporales, estas biopsias solo muestrean una parte de la lesión del paciente, lo que introduce la posibilidad de un sesgo de muestreo. Además, las biopsias durante el tratamiento de algunos pacientes, particularmente aquellos con respuestas favorables al tratamiento, tenían muy pocas células neoplásicas para la investigación de la actividad de señalización de MAPK-AKT.

Métodos

Diseño del estudio

Este ensayo fue una investigación de fase 1/2, abierta y multicéntrica, con dos brazos, en el Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center (SKCCC) de la Universidad Johns Hopkins (JHU), el Massachusetts General Hospital (MGH) y el Dana-Farber Cancer Institute (DFCI), que evaluó la eficacia de la combinación de copanlisib y nivolumab en CRC metastásico MSS (NCT03711058) que había progresado después de al menos 2 líneas de terapia previa, incluidos regímenes que contenían fluoropirimidina, oxaliplatino e irinotecán. Los pacientes fueron incluidos mediante derivación de su médico tratante o por auto-derivación. Esto puede conducir a cierto sesgo de autoselección de los pacientes que están ansiosos por participar en los estudios. Se requirió que los pacientes con enfermedad de tipo salvaje de KRAS/NRAS/BRAF hubieran recibido o rechazado la terapia anti-EGFR. Después de una fase 1 inicial para establecer la seguridad de copanlisib en combinación con nivolumab y determinar una dosis recomendada para la fase 2, la fase 2 de esta investigación dividió a los pacientes con CRC en dos cohortes, una para pacientes con tumores de tipo salvaje de PIK3CA y otra para pacientes con tumores con mutación en PIK3CA. El objetivo primario de la fase 2 fue determinar la tasa de respuesta objetiva (ORR) a los 6 meses de los pacientes tratados con copanlisib y nivolumab en cada cohorte. Esto se define como el número de pacientes con respuesta completa o parcial en su evaluación a los 6 meses después del día 1 del ciclo 1. Los objetivos secundarios incluyeron la determinación de la tasa de control de la enfermedad (DCR) a los 6 meses, la duración de la respuesta (DoR), la supervivencia libre de progresión (PFS) y la supervivencia global (OS) tanto en las cohortes generales como en las cohortes con mutación en PIK3CA. También evaluamos los cambios en la señalización de PI3K en las células tumorales, la composición del TME y los estados de las poblaciones de células inmunes circulantes durante el tratamiento con esta combinación. Una copia del protocolo del estudio y el plan de análisis estadístico está disponible en: https://clinicaltrials.gov/study/NCT03711058#more-information. No hubo desviaciones importantes de los análisis planificados originalmente.

Los pacientes incluidos fueron tratados con nivolumab 480 mg IV el día 1 y copanlisib IV los días 1, 8 y 15 de un ciclo de 28 días. Para la fase 1, los pacientes fueron tratados con copanlisib a 60 mg IV durante 60 minutos o a la dosis de nivel 1, con planes de realizar reducciones de dosis si se observaban toxicidades dosis limitantes (DLT) excesivas utilizando un diseño estándar de 3+3. Esta dosis de copanlisib se determinó en base a los datos de monoterapia en neoplasias hematológicas. Los pacientes fueron tratados hasta la progresión de la enfermedad (permitiendo el tratamiento más allá de la progresión si se sospecha de pseudoprogresión), eventos adversos inaceptables o la retirada del consentimiento. El protocolo fue aprobado por las juntas de revisión institucional (IRB) de JHU, MGH y DCFI y cumplió con las Directrices Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica que Involucra a Seres Humanos y la Declaración de Helsinki. Los pacientes elegibles fueron incluidos de forma central en el SKCCC de JHU. Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito para este estudio. El ensayo fue registrado en ClinicalTrials.gov como (NCT03711058).

Pacientes

Los pacientes eran elegibles para este ensayo si tenían 18 años o más y presentaban un CRC metastásico confirmado histológicamente, con un índice de rendimiento del Grupo de Oncología Cooperativa del Este (ECOG) ≤1 y una función orgánica adecuada, según lo definido por un recuento absoluto de neutrófilos ≥1500/µL, plaquetas ≥75.000/µL, hemoglobina ≥8,0 g/dL, creatinina sérica ≤1,5 x LSN, relación proteína/creatinina en orina