El estado de p53 y p21 influye en la respuesta celular a la metformina en las células de cáncer colorrectal HCT116 con mutación en el gen KRAS.

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más diagnosticado a nivel mundial, representando el 10% de todos los diagnósticos de cáncer, con aproximadamente 1,9 millones de nuevos casos notificados anualmente [^[1]]. También es la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer, con aproximadamente 900.000 muertes (9,3% de todas las muertes relacionadas con el cáncer) notificadas en 2022 [^[1]]. Se espera que la carga global del CCR aumente, con proyecciones que estiman 3,2 millones de nuevos casos y 1,6 millones de muertes relacionadas con el CCR para 2040 [^[2]]. El cáncer colorrectal se origina a partir de mutaciones esporádicas en la mucosa colorrectal, lo que conduce a la formación de tumores en el intestino grueso y el recto [^[3],^[4],^[5]]. Su carcinogénesis es un proceso multietapa impulsado por mutaciones en genes supresores de tumores, oncogenes y alteraciones epigenéticas como la metilación del ADN [^[6],^[7]]. El inicio del CCR se caracteriza por un aumento de las alteraciones genéticas en el gen supresor de tumores APC (adenomatous polyposis coli), lo que conduce a la hiperproliferación epitelial y, posteriormente, a la formación de pólipos [^[8]]. Las mutaciones en el proto-oncogén KRAS (Kirsten rat sarcoma) y en el gen supresor de tumores TP53 (tumor protein 53), impulsan la progresión hacia el CCR en etapas avanzadas [^[8]]. La etapa del CCR influye posteriormente en las opciones de tratamiento disponibles [^[9]].

La metformina es un fármaco antidiabético ampliamente utilizado que ha ganado considerable atención por sus posibles propiedades anticancerígenas. Aunque se prescribe principalmente para reducir los niveles de glucosa en pacientes con diabetes, las investigaciones acumuladas sugieren que la metformina también puede afectar las vías relacionadas con el cáncer [^[10]]. Al reducir los niveles de insulina y mejorar el control glucémico, la metformina puede disminuir la disponibilidad del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), un impulsor clave de la progresión del cáncer [^[11]], al tiempo que induce simultáneamente estrés energético en las células. Además, la metformina activa la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), un regulador metabólico que suprime los procesos anabólicos e inhibe la vía del objetivo de la rapamicina en los mamíferos (mTOR) asociada con el crecimiento tumoral [^[12]]. La actividad elevada de mTOR es común en muchos cánceres, y la capacidad de la metformina para activar AMPK contribuye a sus efectos supresores de tumores [^[12]].

Los estudios indican que el IGF-1, el daño del ADN, la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la obesidad y los factores inflamatorios pueden contribuir al aumento del riesgo de cáncer asociado con la diabetes [^[13]]. Esta asociación está respaldada aún más por el hecho de que la diabetes y el cáncer comparten factores de riesgo comunes, que incluyen la dieta, el sexo, la edad y el tabaquismo, así como la desregulación de la vía del IGF, que desempeña un papel crucial en el desarrollo de ambas afecciones [^[14]]. En consonancia con estas observaciones, los estudios epidemiológicos han informado de una tasa de mortalidad por cáncer 1,41 veces mayor entre los pacientes diabéticos que entre los individuos no diabéticos [^[15]]. La evidencia clínica y epidemiológica también sugiere que el uso de metformina se asocia con una reducción del 30-50% en la incidencia de cáncer, particularmente en el carcinoma hepatocelular [^[16]], el cáncer de páncreas [^[17]] y el cáncer de colon [^[18]]. Además, los ensayos clínicos aleatorizados revelaron una reducción del 40% en los pólipos colorrectales anormales entre los usuarios de metformina [^[19]]. A nivel molecular, se ha informado que la metformina influye en múltiples características del cáncer [^[20]], incluidas las células madre cancerosas (CSCs) [^[21],^[22]], la regulación del ciclo celular [^[23],^[24],^[25],^[26]], la migración [^[27]], la invasión [^[27]], la metástasis [^[28]], la apoptosis [^[29],^[30]], el metabolismo [^[31],^[32],^[33]] y la modulación de la respuesta inmune [^[34],^[35]]. A pesar de estos hallazgos prometedores, los mecanismos moleculares subyacentes a la actividad anticancerígena de la metformina aún no se comprenden por completo, lo que destaca la necesidad de una mayor investigación para optimizar su aplicación en oncología [^[20]]. Se espera que estos estudios mejoren nuestra comprensión del posible papel de la metformina en el tratamiento del cáncer.

KRAS se encuentra entre los proto-oncogenes más frecuentemente mutados en el CCR, con aproximadamente el 40% de los pacientes con CCR que presentan una mutación activadora en este gen [^[36]]. Los pacientes con CCR que presentan mutaciones en KRAS suelen tener un peor pronóstico que aquellos con KRAS de tipo salvaje, particularmente en casos de enfermedad metastásica [^[37],^[38]]. La activación anormal de la vía KRAS interrumpe la regulación de la señalización ascendente, lo que conduce a la resistencia contra los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor (RTK), como el cetuximab y el panitumumab, que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), en individuos con CCR mutado en KRAS [^[39],^[40]]. La alta afinidad de KRAS por el GTP, junto con la ausencia de un bolsillo de unión ideal para moléculas pequeñas, complica el desarrollo de inhibidores competitivos específicos para inhibir la oncogénesis impulsada por KRAS [^[36]]. En consecuencia, históricamente se consideró que KRAS era "no tratable" [^[36]]. Sin embargo, los avances recientes han llevado a la aprobación por parte de la FDA de inhibidores específicos de KRAS G12C, sotorasib y adagrasib, para el CCR metastásico [^[41],^[42]]. Estos agentes se limitan a la variante G12C, que representa solo un pequeño subconjunto de casos de CCR mutado en KRAS con una prevalencia del 3-4% [^[42]]. La mayoría de los casos de CCR mutado en KRAS, incluidos aquellos que albergan la mutación G13D, siguen sin tener terapias dirigidas aprobadas, lo que destaca la necesidad continua de estrategias terapéuticas alternativas.

Estudios previos han demostrado que la metformina ejerce efectos antitumorales selectivos en las células de CCR deficientes en p53 al inducir la apoptosis, perjudicando su capacidad para adaptarse metabólicamente al estrés energético [^[43]]. Sin embargo, otros estudios indican que las acciones antiproliferativas de la metformina en las células de CCR pueden ser en gran medida citostáticas, impulsadas por la activación de AMPK, el aumento de la producción de ROS y el arresto del ciclo celular sin inducir la apoptosis [^[44]]. Más recientemente, los análisis transcriptómicos integrados han revelado que la metformina altera las redes de microARN para dirigirse a los genes dentro de las vías PI3K-Akt y MAPK/ERK, regulando así la proliferación de las células de CCR a nivel postranscripcional [^[45]]. A pesar de estos conocimientos, el papel de los supresores de tumores críticos, como p21, en la mediación o modulación de los efectos de la metformina sigue sin explorarse, particularmente en el CCR mutado en KRAS. Para abordar esta laguna, evaluamos las respuestas fenotípicas y transcriptómicas de las células HCT116-p53−/− y p21−/− a la metformina. Nuestros hallazgos sugieren que la pérdida de TP53 o CDKN1A se asocia con una menor respuesta a la metformina. Estas observaciones proporcionan una base para futuros estudios que investiguen la estratificación basada en el genotipo en los ensayos de reutilización de la metformina para el CCR. Por lo tanto, en este estudio, la línea celular de cáncer colorrectal HCT116, que alberga una mutación KRAS G13D, junto con sus derivados de knockout de p53 (HCT116-p53−/−) y p21 (HCT116-p21−/−), se utilizó para investigar el efecto del estado del supresor de tumores en la respuesta a la metformina.

2. Materiales y Métodos

2.1. Cultivo Celular

La línea celular de carcinoma colorrectal humano HCT116 se compró originalmente al American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Johan Ericsson (Universidad Hamad Bin Khalifa). Las líneas celulares derivadas de HCT116 con knockout de p53 y p21 se obtuvieron del laboratorio de la Dra. Nadine Darwiche, y fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Carlos Maria Galmarini (PharmaMar, Madrid, España). Estas líneas celulares con knockout se generaron y caracterizaron mediante recombinación homóloga dirigida en las células HCT116 por el Dr. Bert Vogelstein y sus colegas [^[46],^[47]]. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina y 1% de piruvato de sodio (todos obtenidos de Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con 5% de dióxido de carbono (CO2).

2.2. Validación por Western Blot del Knockout

Para confirmar el estado de knockout de TP53 y CDKN1A en las líneas celulares derivadas de HCT116, se evaluó la expresión de proteínas mediante análisis de Western blot. Las células HCT116 de tipo salvaje, HCT116-p53−/− y HCT116-p21−/− se cultivaron en condiciones estándar durante 24 horas y se recolectaron cuando alcanzaron aproximadamente el 80% de la confluencia. Todos los pasos para la extracción de proteínas se realizaron sobre hielo o a 4 °C utilizando tampones preenfriados. La proteína total se extrajo utilizando el tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), que se suplementó antes de su uso con 1 µL de 1 M de ditiotreitol (DTT), 1 µL de 0,5 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 10 µL de cóctel de inhibidores de proteasas, por cada 1 mL de tampón RIPA para preparar una solución de tampón de lisis completa (todos obtenidos de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La preparación de la muestra para la electroforesis en gel implicó la mezcla de 20 µL del lisado con 10 µL de tampón de carga 5× Laemmli (4% de SDS, 20% de glicerol, 125 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% de β-mercaptoetanol y 0,1% de azul de bromofenol). Antes de realizar la electroforesis, los lisados (20 µL por muestra) se calentaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron 15 µL por pozo de cada muestra de proteína en el gel de poliacrilamida prefabricado de 10 pocillos (gel de Tris-glicina de Novex WedgeWell, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

La electroforesis se realizó en tampón de ejecución 1× compuesto por 25 mM de base de Tris, 190 mM de glicina y 0,1% de SDS. El marcador de peso molecular de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) se cargó (5 µL) junto con las muestras como referencia de tamaño. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando el método de transferencia húmeda. Las membranas se bloquearon en 5% de albúmina sérica bovina (BSA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) preparada en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente sobre una plataforma de agitación. Los anticuerpos primarios se diluyeron en leche al 5% preparada en TBST y las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C en bolsas de incubación selladas sobre una plataforma de rodillo para garantizar una exposición uniforme de los anticuerpos. Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron el anticuerpo monoclonal de conejo anti-p53 fosforilada (Ser15) #9282 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:1000, el anticuerpo monoclonal de conejo anti-p21 Waf1/Cip1 (12D1) #2947 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:2000 y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (AC-15) A5441 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a una dilución de 1:3000.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron cinco veces durante 5 minutos cada una, con TBST sobre una plataforma de agitación. Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos en leche al 5% en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente, seguidos de cinco lavados de 5 minutos con TBST. Las bandas de proteínas se detectaron luego utilizando el sustrato de quimioluminiscencia mejorada SuperSignal West Pico PLUS (ECL) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante la mezcla de los reactivos en una proporción de 1:1. Las membranas se incubaron brevemente en el sustrato ECL, se eliminó el exceso de reactivo y las señales se visualizaron utilizando un sistema de imagen iBright CL1500 de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Después de la obtención de imágenes, las membranas se lavaron (cinco veces durante 5 minutos) y se almacenaron sumergidas en TBST para su uso posterior.

2.3. Tratamiento con dosis de fármaco y durante un período de tiempo

SPANISH TRANSLATION:

Se llevó a cabo un experimento de dosis y tiempo para determinar la concentración óptima y la duración del tratamiento con clorhidrato de metformina, activador de AMPK (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se seleccionó un rango de concentraciones de metformina (0,5, 1, 2, 4 y 8 mM) para el estudio, en consonancia con los rangos de concentración utilizados previamente para evaluar los efectos dependientes de la dosis y el tiempo de la metformina en HCT116 [^[44],^[48]]. Aunque estas concentraciones superan la concentración plasmática terapéutica mediana de metformina en pacientes (aproximadamente 330 µM a una dosis estándar de 1 g/día), los estudios in vitro que utilizan células HCT116 y su derivado isogénico p53−/− también han utilizado concentraciones molares (por ejemplo, 5 mM) para observar una respuesta celular medible [^[44]]. Esta diferencia refleja la distinción entre la exposición aguda in vitro y la farmacocinética de la administración crónica in vivo, que implica la acumulación de tejido en sitios como la mucosa intestinal y el hígado [^[44]]. Se eligieron dos duraciones de tratamiento diferentes para el análisis de la serie temporal: 24 y 48 h. Si no se observó ninguna respuesta a las 24 o 48 h, se extendió la duración del tratamiento a 72 h. Se utilizó la tinción con azul de tripano (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) para evaluar el efecto preliminar del fármaco mediante el recuento de células viables. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

2.4. Ensayo de viabilidad celular MTT

El ensayo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) es un método colorimétrico que se utiliza para evaluar la actividad metabólica celular como un indicador de la viabilidad celular. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de aproximadamente 5000 células por pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con varias concentraciones de metformina (1, 2, 5 y 10 mM), con seis réplicas por condición. Este ensayo se realizó junto con el análisis del ciclo celular para identificar las condiciones de tratamiento con metformina adecuadas para los análisis transcriptómicos posteriores. Por lo tanto, se evaluó un rango de concentración ligeramente más amplio (1–10 mM), en consonancia con estudios previos en células HCT116, por las razones expuestas anteriormente [^[44],^[48]]. Se evaluaron tres condiciones de tratamiento: 24 h de exposición a metformina, 48 h de exposición continua y una condición de reposición en la que, después de 24 h de tratamiento con el fármaco, el medio que contenía metformina se reemplazó con medio fresco que contenía metformina, seguido de 24 h adicionales de incubación, lo que totalizó un período de incubación de 48 h. Después del tratamiento, las células se incubaron con la solución MTT (catálogo# ab211091 de Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración final de 0,5 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) durante 3 h a 37 °C. Para detener la reacción, se añadieron 100 µL de solución de parada de MTT (catálogo# ab211091 de Abcam, Cambridge, Reino Unido) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 h adicional. La absorbancia se midió a 595 nm utilizando un lector Multiskan EX (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). La viabilidad celular se calculó utilizando la fórmula: viabilidad celular (%) = (absorbancia experimental media/absorbancia de control media) × 100%.

2.5. Citometría de flujo para el análisis del ciclo celular

Se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar los cambios asociados a la metformina en la distribución del ciclo celular y para apoyar la selección de las condiciones de tratamiento para el análisis posterior. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 500.000 células por pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con concentraciones variables de metformina (0,5, 1, 2, 4 y 8 mM) durante 24, 48 o 72 h. Cada condición experimental se realizó con dos réplicas biológicas independientes. El medio de cada pocillo se recogió en un tubo separado de 50 mL después de los tratamientos. Las células adheridas se recogieron con tripsina y se mezclaron con su suspensión de medio correspondiente antes de centrifugarlas durante 2 min a 900 rpm. Las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en etanol al 70% frío y se almacenaron a −20 °C durante la noche para la fijación. Las células fijadas se tiñeron con solución de yoduro de propidio (PI) (50 µg/mL de PI diluido en PBS y 25 µg/mL de RNasa A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Las células se incubaron en la oscuridad con PI durante 2 h a temperatura ambiente. Se utilizó un citómetro de flujo BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) con estrategias de selección adecuadas para excluir restos celulares, dobletes, con un mínimo de 10.000 eventos recogidos por muestra para el análisis, y se optimizaron los ajustes del instrumento utilizando controles no teñidos para establecer la fluorescencia de fondo y garantizar una detección precisa de la señal de PI. Dado que se observaron cambios mínimos en la distribución del ciclo celular en HCT116-p21−/− después de 24 y 48 h de tratamiento, se incluyó una condición de tratamiento adicional de 72 h para esta línea celular. Los gráficos se trazaron utilizando R, se realizaron pruebas t de Student en Excel y se realizó ANOVA utilizando GraphPad Prism (11.0.2).

2.6. Extracción de ARN

Basándose en los análisis MTT y del ciclo celular, 4 mM de metformina provocaron respuestas celulares sustanciales que fueron comparables a las observadas en las concentraciones más altas probadas (8, 10 mM) y mayores que las observadas en las concentraciones más bajas. Por lo tanto, el tratamiento con 4 mM de metformina durante 48 h se seleccionó para el perfilado transcriptómico. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 500.000 células por pocillo, con tres réplicas biológicas de las muestras no tratadas y tratadas con metformina. El ARN se extrajo utilizando TRIzol según las instrucciones de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Los gránulos de ARN se mantuvieron en etanol al 75% para preservar la estabilidad de la muestra durante el envío a Macrogen (Seúl, República de Corea) para el secuenciamiento del transcriptoma completo.

2.7. Secuenciamiento de ARN y análisis de enriquecimiento de vías

El ARN total aislado de las líneas celulares HCT116 de tipo salvaje, HCT116-p53−/− y HCT116-p21−/− tratadas con metformina (4 mM durante 48 h) y no tratadas (n = 2 por condición) se sometió a secuenciamiento de apareamiento final en la plataforma Illumina NovaSeq (San Diego, CA, USA) después de la preparación de la biblioteca utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN total estándar TruSeq (Illumina, San Diego, CA, USA). Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron utilizando CLC Genomics Workbench versión 20.0.4 (QIAGEN Digital Insights, Aarhus, Dinamarca), incluido el control de calidad (FastQC), el recorte de adaptadores y la alineación de las lecturas al genoma de referencia (hg19) para generar datos de recuento de lecturas. El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando iDEP.96 (análisis integrado de expresión diferencial y vías), una aplicación basada en la web que proporciona una lista de genes expresados diferencialmente (DEG) como datos de salida [^[49]]. Los genes expresados diferencialmente se definieron utilizando el umbral de significación predeterminado de iDEP.96 de una tasa de descubrimiento falso (FDR) ajustada de p < 0,05 y un cambio de log2 absoluto ≥ 1. La visualización de los datos transcriptómicos incluyó la agrupación k-medias para generar mapas de calor de los DEG, así como el análisis de componentes principales (PCA) y la agrupación jerárquica para evaluar las relaciones de las muestras y los efectos del tratamiento. Los DEG superpuestos entre las líneas celulares se identificaron utilizando Venny 2.1.0. El análisis de enriquecimiento funcional de los DEG se realizó utilizando ShinyGO 0.80 para identificar procesos biológicos y vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) significativamente enriquecidos (una base de datos que proporciona información funcional para el análisis de la función génica sistémica). La visualización de datos y las representaciones gráficas se generaron utilizando GraphPad Prism (11.0.2) y ShinyGO (0.85.1).

2.8. Validación cuantitativa de PCR en tiempo real

Para validar los genes expresados diferencialmente seleccionados identificados por el secuenciamiento de ARN, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando la tercera réplica biológica de ARN aislado de las células HCT116 de tipo salvaje, p53−/− y p21−/− después del tratamiento con 4 mM de metformina durante 48 h y sus controles no tratados correspondientes. El ADNc se sintetizó a partir de 2 µg de ARN utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (catálogo# 4374966, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de RT-qPCR se realizaron utilizando PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Se utilizaron cebadores específicos del gen para evaluar la expresión de DUSP5, FGD6 y FAM111A, mientras que ACTB se utilizó como gen de referencia endógeno. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método comparativo Ct (2−ΔΔCt). Para cada genotipo, los niveles de expresión en las células tratadas con metformina se normalizaron a las muestras de control no tratadas correspondientes. Todas las muestras se analizaron en duplicado técnico, y los datos se presentan como media ± DE.

2.9. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para evaluar las diferencias entre las concentraciones de tratamiento y los tiempos de incubación. Se utilizaron pruebas t de Student para las comparaciones por pares cuando fue apropiado. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo. Tanto R (4.4.2) como GraphPad Prism se utilizaron para la visualización de datos.

2.1. Cultivo celular

La línea celular de carcinoma de colon humano HCT116 se compró originalmente al Banco de Cultivos Celulares Americano (ATCC, Manassas, VA, USA) y fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Johan Ericsson (Universidad Hamad Bin Khalifa). Las líneas celulares derivadas de HCT116 con knockout de p53−/− y p21−/− se obtuvieron del laboratorio de la Dra. Nadine Darwiche, que las había recibido amablemente del Dr. Carlos Maria Galmarini (PharmaMar, Madrid, España). Estas líneas celulares con knockout se generaron y caracterizaron mediante recombinación homóloga dirigida en células HCT116 por el Dr. Bert Vogelstein y sus colegas [^[46],^[47]]. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de L-glutamina y 1% de piruvato de sodio (todos obtenidos de Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y se mantuvieron a 37 °C en una incubadora con 5% de dióxido de carbono (CO2).

2.2. Validación de Western blot de los knockouts

Para confirmar el estado de knockout de TP53 y CDKN1A en las líneas celulares derivadas de HCT116, se evaluó la expresión de proteínas mediante análisis de Western blot. Las células HCT116 de tipo salvaje, HCT116-p53−/− y HCT116-p21−/− se cultivaron en condiciones estándar durante 24 h y se recogieron cuando alcanzaron aproximadamente el 80% de la confluencia. Todos los pasos para la extracción de proteínas se realizaron sobre hielo o a 4 °C utilizando tampones preenfriados. Se extrajo la proteína total utilizando tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), al que se añadió antes de su uso 1 µL de 1 M de ditioeritritol (DTT), 1 µL de 0,5 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 10 µL de cóctel de inhibidores de proteasas, por cada 1 mL de tampón RIPA para preparar una solución de tampón de lisis completa (todo obtenido de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La preparación de la muestra para la electroforesis en gel implicó la mezcla de 20 µL del lisado con 10 µL de tampón de carga 5× Laemmli (4% de SDS, 20% de glicerol, 125 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% de β-mercaptoetanol y 0,1% de azul de bromofenol). Antes de realizar la electroforesis, los lisados (20 µL por muestra) se calentaron a 95 °C durante 5 min y se cargaron 15 µL por carril de cada muestra de proteína en el gel de poliacrilamida prefundido de 10 pocillos (gel de Tris-glicina WedgeWell Novex, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Se realizó electroforesis en un tampón de corrida 1× compuesto por 25 mM de Tris base, 190 mM de glicina y 0,1% de SDS. Se cargó un marcador de peso molecular de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) (5 µL) junto con las muestras como referencia de tamaño. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando el método de transferencia en húmedo. Las membranas se bloquearon en un 5% de albúmina sérica bovina (BSA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) preparada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Los anticuerpos primarios se diluyeron en un 5% de leche preparada en TBST y las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C en bolsas de incubación selladas sobre una plataforma de agitación para garantizar una exposición uniforme de los anticuerpos. Los anticuerpos primarios utilizados incluyeron el anticuerpo monoclonal de conejo anti-fosfo-p53 (Ser15) #9282 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:1000, el anticuerpo monoclonal de conejo anti-p21 Waf1/Cip1 (12D1) #2947 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:2000 y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (AC-15) A5441 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a una dilución de 1:3000.

Después de la incubación con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron cinco veces durante 5 minutos cada una, con TBST en una plataforma de agitación. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos en un 5% de leche-TBST durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de cinco lavados de 5 minutos con TBST. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando el sustrato SuperSignal West Pico PLUS para quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), preparado según las instrucciones del fabricante mediante la mezcla de los reactivos en una proporción de 1:1. Las membranas se incubaron brevemente en el sustrato ECL, se eliminó el exceso de reactivo y las señales se visualizaron utilizando un sistema de imagen iBright CL1500 de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Después de la obtención de imágenes, las membranas se lavaron (cinco veces durante 5 minutos) y se almacenaron sumergidas en TBST para su uso posterior.

2.3. Experimento de dosis y tiempo de administración de fármacos

Se realizó un experimento de dosis y tiempo para determinar la concentración óptima y la duración del tratamiento con clorhidrato de metformina, activador de AMPK (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se seleccionó un rango de concentraciones de metformina (0,5, 1, 2, 4 y 8 mM) para el estudio, de acuerdo con los rangos de concentración utilizados previamente para evaluar los efectos dependientes de la dosis y el tiempo de la metformina en HCT116 [^[44],^[48]]. Aunque estas concentraciones superan la concentración plasmática terapéutica mediana de metformina en pacientes (aproximadamente 330 µM a una dosis estándar de 1 g/día), los estudios in vitro que utilizan células HCT116 y su derivado isogénico p53−/− también han utilizado concentraciones molares (por ejemplo, 5 mM) para observar una respuesta celular medible [^[44]]. Esta diferencia refleja la distinción entre la exposición in vitro aguda y la farmacocinética de la administración crónica in vivo, que implica la acumulación de tejido en sitios como la mucosa intestinal y el hígado [^[44]]. Se eligieron dos duraciones de tratamiento diferentes para el análisis del curso temporal: 24 y 48 h. Si no se observó ninguna respuesta a las 24 o 48 h, se prolongó la duración del tratamiento a 72 h. Se utilizó la tinción con azul de tripano (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar el efecto preliminar del fármaco mediante el recuento de células viables. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

2.4. Ensayo de viabilidad celular MTT

El ensayo MTT (3-(4,5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) es un método colorimétrico que se utiliza para evaluar la actividad metabólica celular como un indicador de la viabilidad celular. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de aproximadamente 5000 células por pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con varias concentraciones de metformina (1, 2, 5 y 10 mM), con seis réplicas por condición. Este ensayo se realizó junto con el análisis del ciclo celular para identificar las condiciones de tratamiento con metformina adecuadas para los análisis transcripómicos posteriores. Por lo tanto, se evaluó un rango de concentración ligeramente más amplio (1-10 mM), de acuerdo con estudios previos en células HCT116, por las razones expuestas anteriormente [^[44],^[48]]. Se evaluaron tres condiciones de tratamiento: 24 h de exposición a metformina, 48 h de exposición continua y una condición de reposición en la que, después de 24 h de tratamiento con el fármaco, el medio que contenía metformina se reemplazó por medio fresco que contenía metformina, seguido de 24 h adicionales de incubación, lo que totalizó un período de incubación de 48 h. Después del tratamiento, las células se incubaron con la solución MTT (catálogo# ab211091 de Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración final de 0,5 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante 3 h a 37 °C. Para detener la reacción, se añadieron 100 µL de solución de parada de MTT (catálogo# ab211091 de Abcam, Cambridge, Reino Unido) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 h adicional. La absorbancia se midió a 595 nm utilizando un lector Multiskan EX (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La viabilidad celular se calculó utilizando la fórmula: viabilidad celular (%) = (absorbancia experimental media/absorbancia de control media) × 100%.

2.5. Citometría de flujo para el análisis del ciclo celular

Se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar los cambios asociados con la metformina en la distribución del ciclo celular y para apoyar la selección de las condiciones de tratamiento para el análisis posterior. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 500.000 células por pocillo. Después de 24 h de incubación, las células se trataron con diferentes concentraciones de metformina (0,5, 1, 2, 4 y 8 mM) durante 24, 48 o 72 h. Cada condición experimental se realizó con dos réplicas biológicas independientes. El medio de cada pocillo se recogió en un tubo de 50 mL separado después de los tratamientos. Las células adheridas se recogieron con tripsina y se mezclaron con su suspensión de medio correspondiente antes de ser centrifugadas durante 2 min a 900 rpm. Las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en etanol al 70% frío y se almacenaron a -20 °C durante la noche para la fijación. Las células fijadas se tiñeron con solución de yoduro de propidio (PI) (50 µg/mL de PI diluido en PBS y 25 µg/mL de RNasa A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las células se incubaron en la oscuridad con PI durante 2 h a temperatura ambiente. Se utilizó un citómetro de flujo BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) con estrategias de selección adecuadas para excluir los desechos, los dobletes, con un mínimo de 10.000 eventos recogidos por muestra para el análisis, y los ajustes del instrumento se optimizaron utilizando controles no teñidos para establecer la fluorescencia de fondo y garantizar una detección precisa de la señal de PI. Dado que se observaron cambios mínimos en la distribución del ciclo celular en HCT116-p21−/− después de 24 y 48 h de tratamiento, se incluyó una condición de tratamiento adicional de 72 h para esta línea celular. Los gráficos se trazaron utilizando R, se realizaron pruebas t de Student en Excel y se realizó ANOVA utilizando GraphPad Prism (11.0.2).

2.6. Extracción de ARN

Basándose en los análisis MTT y del ciclo celular, 4 mM de metformina provocaron respuestas celulares sustanciales que fueron comparables a las observadas en las concentraciones más altas probadas (8, 10 mM) y mayores que las observadas en las concentraciones más bajas. Por lo tanto, el tratamiento con 4 mM de metformina durante 48 h se seleccionó para el perfilado transcripcional. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 500.000 células por pocillo, con tres réplicas biológicas de las muestras no tratadas y tratadas con metformina. El ARN se extrajo utilizando TRIzol según las instrucciones de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Los gránulos de ARN se mantuvieron en etanol al 75% para preservar la estabilidad de la muestra durante el envío a Macrogen (Seúl, República de Corea) para el secuenciamiento del transcriptoma completo.

2.7. Secuenciamiento de ARN y análisis de enriquecimiento de vías

El ARN total aislado de las líneas celulares HCT116 de tipo salvaje, HCT116-p53−/− y HCT116-p21−/− tratadas con metformina (4 mM durante 48 h) y no tratadas (n = 2 por condición) se sometió a secuenciamiento de apareamiento de extremos en la plataforma Illumina NovaSeq (San Diego, CA, EE. UU.) tras la preparación de la biblioteca utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN total estándar TruSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron utilizando CLC Genomics Workbench versión 20.0.4 (QIAGEN Digital Insights, Aarhus, Dinamarca), que incluye la evaluación del control de calidad (FastQC), el recorte de adaptadores y la alineación de las lecturas al genoma de referencia (hg19) para generar datos de recuento de lecturas. El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando iDEP.96 (análisis integrado de expresión diferencial y vías), una aplicación basada en la web que proporciona una lista de genes expresados diferencialmente (DEG) como datos de salida [^[49]]. Los genes expresados diferencialmente se definieron utilizando el umbral de significación predeterminado de iDEP.96 de un valor p ajustado por la tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,05 y un valor absoluto de cambio de pliegue log2 ≥ 1. La visualización de los datos transcripómicos incluyó la agrupación k-medias para generar mapas de calor de los DEG, así como el análisis de componentes principales (PCA) y la agrupación jerárquica para evaluar las relaciones de las muestras y los efectos del tratamiento. Los DEG superpuestos entre las líneas celulares se identificaron utilizando Venny 2.1.0. El análisis de enriquecimiento funcional de los DEG se realizó utilizando ShinyGO 0.80 para identificar procesos biológicos y vías de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) significativamente enriquecidos (una base de datos que proporciona información funcional para el análisis de la función génica sistémica). La visualización de los datos y las representaciones gráficas se generaron utilizando GraphPad Prism (11.0.2) y ShinyGO (0.85.1).

2.8. Validación cuantitativa de PCR en tiempo real

Para validar los genes expresados diferencialmente seleccionados identificados por el secuenciamiento de ARN, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando la tercera réplica biológica de ARN aislado de las células HCT116 de tipo salvaje, p53−/− y p21−/− tras el tratamiento con 4 mM de metformina durante 48 h y sus controles no tratados correspondientes. El ADNc se sintetizó a partir de 2 µg de ARN utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (catálogo# 4374966, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de RT-qPCR se realizaron utilizando PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizaron cebadores específicos de los genes para evaluar la expresión de DUSP5, FGD6 y FAM111A, mientras que ACTB se utilizó como gen de referencia endógeno. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método de comparación de Ct (2−ΔΔCt). Para cada genotipo, los niveles de expresión en las células tratadas con metformina se normalizaron a las muestras de control no tratadas correspondientes. Todas las muestras se analizaron en duplicado técnico, y los datos se presentan como media ± DE.

2.9. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para evaluar las diferencias entre las concentraciones de tratamiento y los tiempos de incubación. Se utilizaron pruebas t de Student para las comparaciones por pares cuando fue apropiado. Se consideró que un valor p < 0,05 era estadísticamente significativo. Tanto R (4.4.2) como GraphPad Prism se utilizaron para la visualización de datos.

3. Resultados

3.1. La metformina afecta a la viabilidad celular en la línea celular de CCRC HCT116: un análisis dependiente del tiempo y la dosis

Para dilucidar los efectos de la metformina sobre la viabilidad de las células de CRC, se realizaron ensayos MTT en células HCT116 de tipo salvaje. Nuestros datos demostraron una reducción dependiente de la dosis y del tiempo en la viabilidad de las células HCT116 tras la exposición a metformina, evidenciada por una disminución progresiva de la viabilidad celular con el aumento de las concentraciones de metformina y los períodos de incubación prolongados (24 h y 48 h, Figura 1). No se observaron diferencias significativas entre las condiciones de exposición continua de 48 h y las condiciones de reposición de metformina (Figura 1). El ANOVA de dos vías confirmó los efectos estadísticamente significativos tanto de la concentración de metformina como de la duración del tratamiento (p < 0,0001), así como una interacción significativa entre estos factores, lo que indica que el efecto de la metformina sobre la viabilidad celular varió según la duración del tratamiento. Estos hallazgos sugieren que la exposición prolongada se asoció con mayores reducciones en la viabilidad, mientras que la reposición de metformina después de 24 h no produjo reducciones sustanciales adicionales en la viabilidad en las células HCT116-WT (Figura 1).

3.2. La metformina se asocia con cambios en las distribuciones del ciclo celular en las células HCT116-WT

Examinamos los efectos de la metformina sobre la distribución del ciclo celular utilizando citometría de flujo con tinción de yoduro de propidio (Tabla S1, Figura 2). En el punto temporal de 24 h, tanto las células de tipo salvaje como las células p53−/− mostraron un aumento dependiente de la concentración en la proporción de células en G0/G1, acompañado de una disminución correspondiente en las fases S y G2/M (Figura 2a, c, e). En consonancia con estas observaciones, el ANOVA de dos vías indicó que, a las 24 h, tanto la concentración de metformina como la línea celular (Figura 2a; Tabla S1) afectaron significativamente las distribuciones de G0/G1, S y G2/M (que oscilan entre p = 0,03 y p < 0,0001; Tabla S1), mientras que los términos de interacción no fueron significativos. Curiosamente, las células p21−/− no tratadas mostraron una mayor proporción de células en la fase G2/M en comparación con otras líneas celulares (Figura 2a, c, e, g), lo que sugiere diferencias en la distribución basal del ciclo celular asociadas con la deficiencia de p21. En el punto temporal de 48 h, un alto porcentaje de células de tipo salvaje permaneció en G0/G1, con variaciones mínimas entre las concentraciones de metformina (Figura 2b, d; Tabla S1). Las células HCT116-p53−/− exhibieron un modesto aumento en la proporción de células en G0/G1 tras el tratamiento (Figura 2b, f). Aproximadamente el 50% de las células p21−/− se encontraban en G0/G1 a las 48 h, y esta proporción disminuyó en respuesta al aumento de las concentraciones de metformina (Figura 2b, h). En este punto, el ANOVA de dos vías indicó que solo el factor de la línea celular siguió siendo significativo en todas las fases del ciclo celular (p < 0,0001; Tabla S1), mientras que la concentración de metformina ya no fue significativa (Figura 2b), lo que sugiere que las diferencias entre las líneas celulares contribuyeron más fuertemente a las distribuciones del ciclo celular que la concentración del tratamiento después de una incubación prolongada.

Dado que el impacto de la metformina en el ciclo celular de las células p21−/− fue relativamente limitado a las 24 y 48 h, el tratamiento se extendió a 72 h (Tabla S1). Como se muestra en la Figura S1, el porcentaje de células en G0/G1 disminuyó significativamente en respuesta al aumento de las concentraciones de metformina (p = 0,0332; 2 mM, p < 0,0001; 4 mM y p = 0,0002; 8 mM; Tabla S1). En consecuencia, la proporción de células en G2/M aumentó significativamente (p = 0,0021; 2 mM, p = 0,0002; 4 mM y p = 0,0021; 8 mM; Tabla S1) a las 72 h (Figura S1d; Tabla S1). El ANOVA de dos vías en las condiciones de 24 h, 48 h y 72 h identificó efectos de interacción significativos para G0/G1 y G2/M (Figura 2a, b y Figura S1; Tabla S1), lo que indica que el efecto de la metformina sobre la distribución del ciclo celular de las células HCT116-p21−/− varió según la duración del tratamiento.

En resumen, el tratamiento con metformina se asoció con cambios en las distribuciones del ciclo celular, y las células de tipo salvaje mostraron un mayor aumento en la proporción de células en G0/G1 que los derivados p53−/− y p21−/−. En contraste, los cambios en las distribuciones del ciclo celular en las células deficientes en p21 se hicieron más evidentes tras un tratamiento prolongado, incluido un aumento en la proporción de células en la fase G2/M. Estas observaciones indican alteraciones en las distribuciones del ciclo celular en ausencia de p21, que se sabe que es un mediador clave del arresto de G1/G2 dependiente de p53 tras el daño del ADN [^[50], ^[51]]. Sin embargo, dado la variabilidad en las respuestas de las células knockout y el tamaño limitado de la muestra, estas observaciones deben interpretarse con cautela y requieren una validación adicional.

3.3. Validación por Western blot de los fenotipos knockout de p53 y p21 en las líneas celulares derivadas

Para confirmar la estabilidad de los modelos celulares utilizados en este estudio, se evaluó la expresión de la proteína p53 fosforilada (Ser15) y p21 mediante análisis de Western blot en condiciones no tratadas (Figura S2). La expresión de p53 fosforilada (Ser15) se detectó en las células HCT116 de tipo salvaje y HCT116-p21−/−, pero no en las células HCT116-p53−/− (Figura S2a). De manera similar, se observó la expresión de p21 en las células de tipo salvaje y p53−/−, pero no en las células p21−/− (Figura S2b). Estos resultados son coherentes con las características informadas de las líneas celulares knockout [^[46], ^[47]] y respaldan el mantenimiento y la validez de los fenotipos knockout esperados a lo largo del estudio.

3.4. El perfilado transcriptómico revela respuestas de expresión génica atenuadas en los knockouts de p53 y p21 en comparación con HCT116 de tipo salvaje

3.4.1. Análisis de componentes principales (PCA)

En consonancia con los hallazgos preliminares, los cambios transcriptómicos generales mostraron un patrón similar. El PCA de las células HCT116 de tipo salvaje y sus derivados knockout tratadas con metformina (4 mM durante 48 h) y no tratadas indicó que las tres líneas celulares exhibieron un perfil transcripcional distinto entre sí (Figura 3a). Cada línea celular formó un grupo separado, lo que indica patrones de expresión génica únicos impulsados por sus alteraciones genéticas específicas. Las células de tipo salvaje mostraron la separación más distinta entre sus grupos tratados y no tratados, lo que indica una mayor respuesta transcripcional a la metformina en comparación con sus derivados knockout (Figura 3a).

3.4.2. Análisis de expresión diferencial

La agrupación distinta observada en el PCA fue coherente con las diferencias en los perfiles de expresión génica basal entre HCT116-WT y las líneas celulares knockout. El análisis de expresión diferencial de las células no tratadas en relación con el tipo salvaje (Figura S3) identificó 1112 genes regulados a la baja y 384 genes regulados al alza en las células p53−/−, mientras que las células p21−/− exhibieron 1288 genes regulados a la baja y 1011 genes regulados al alza (Figura S3). El mayor número de genes expresados diferencialmente observados en las células p21−/− sugiere un mayor grado de divergencia transcripcional del la línea celular parental. Estos resultados sugieren que la pérdida de p53 y p21 se asocia con alteraciones sustanciales en la expresión génica basal, lo que puede contribuir a las diferencias en las respuestas celulares a la metformina observadas en los tres genotipos. El análisis de expresión diferencial (Figura 3b, c; Figura S5) tras un tratamiento de 48 h (4 mM) reveló que las células HCT116-WT exhibieron la mayor respuesta transcripcional, con 902 genes regulados a la baja y 497 genes regulados al alza en relación con el control no tratado (Figura 3b, c). En particular, CDKN1A, un regulador clave del punto de control G1 y un objetivo transcripcional de p53, se reguló modestamente pero significativamente al alza en las células de tipo salvaje tratadas con metformina (cambio de pliegue log2 = 1,24, p ajustada = 1,17 × 10−21), mientras que no se observó una regulación significativa en las células deficientes en p53 o p21 (Tabla S2). En contraste, la línea celular HCT116-p53−/− mostró 112 genes regulados a la baja y 158 genes regulados al alza tras el tratamiento, mientras que la línea celular HCT116-p21−/− exhibió la respuesta transcripcional más pequeña, con solo 15 genes regulados a la baja y 17 genes regulados al alza (Figura 3c). Dado el número limitado de réplicas biológicas (n = 2), estos hallazgos deben interpretarse como exploratorios y requieren una validación independiente.

3.4.3. Genes regulados diferencialmente superpuestos entre HCT116 de tipo salvaje y sus derivados knockout

El diagrama de Venn (Figura 3d, e) ilustra los genes regulados diferencialmente superpuestos (DEG), tanto regulados al alza (Figura 3d) como regulados a la baja (Figura 3e), tras el tratamiento con metformina de las tres líneas celulares. Estos genes compartidos pueden representar genes candidatos involucrados en la respuesta celular a la metformina, ya que su expresión se alteró de manera consistente en los tres genotipos tras el tratamiento. En particular, cuatro genes (DUSP5, FGD6, PLAUR y TNFAIP3) se regularon consistentemente al alza en las tres líneas celulares tras 48 h de tratamiento con metformina a una dosis de 4 mM (Figura 3d). En contraste, solo un gen, FAM111A, se reguló comúnmente a la baja (Figura 3e). Para respaldar los hallazgos de RNA-seq, se realizó RT-qPCR para los DEG compartidos seleccionados. Coherente con el análisis transcriptómico, DUSP5 y FGD6 mostraron un aumento en la expresión tras el tratamiento con metformina en las células de tipo salvaje, p53−/− y p21−/−, mientras que la expresión de FAM111A se redujo en los tres genotipos (Figura S4). Estos resultados respaldan los datos de RNA-seq y sugieren una respuesta molecular compartida a la metformina en las tres líneas celulares.

3.5. El análisis de la vía KEGG de los DEG reveló un enriquecimiento de las vías relacionadas con la senescencia celular y la apoptosis en las células de tipo salvaje y p53 deficientes tratadas con metformina

Las células HCT116 de tipo salvaje tratadas con metformina (Figura 4a) mostraron un enriquecimiento de las vías KEGG relacionadas con la senescencia celular y la señalización apoptótica. De manera similar, la línea celular HCT116-p53−/− tratada con metformina (Figura 4b) exhibió un enriquecimiento de la vía de la senescencia celular, aunque menos DEG (Figura 4a, b) contribuyeron a esta vía en la línea celular knockout que en el tipo salvaje (6 frente a 10 DEG; Figura 4a, b). A pesar del menor número total de DEG regulados a la baja en las células p53−/− (112 frente a 902 DEG en WT; Figura 3c), se identificaron varias vías enriquecidas significativas entre los genes regulados a la baja (Figura 4c, d). En contraste, el análisis de enriquecimiento de vías utilizando ShinyGO indicó que los DEG de la línea celular HCT116-p21−/− tratada con metformina no mostraron un enriquecimiento estadísticamente significativo en las vías KEGG.

Las vías enriquecidas comúnmente en las células de tipo salvaje y p53−/− incluyeron vías en el cáncer, la vía de señalización MAPK, la senescencia celular, la vía de señalización AGE-RAGE en las complicaciones diabéticas y la vía de señalización PI3K-Akt (Figura 4a, b). Sin embargo, el grado de enriquecimiento varió entre los dos genotipos (Figura 4a, b). La vía de formación de trampas extracelulares de neutrófilos fue la única vía regulada a la baja en común en ambas líneas celulares (Figura 4c, d).

3.6. El análisis de la ontología génica destacó el enriquecimiento diferencial de los procesos apoptóticos y relacionados con la cromatina en las líneas celulares HCT116 tratadas con metformina

Análisis de ontología génica de los genes regulados al alza (DEGs) en HCT116-WT tratados con metformina, que identificó un enriquecimiento significativo de procesos biológicos relacionados con la regulación de la muerte celular, la muerte celular programada y los procesos apoptóticos (Figura 4e). La línea celular HCT116-p53−/− tratada con metformina demostró un enriquecimiento de procesos biológicos asociados con la locomoción, la regulación positiva de la migración celular, la motilidad celular y la localización celular (Figura 4f). La línea celular HCT116-p21−/− tratada con metformina exhibió un enriquecimiento de procesos biológicos, similar a los observados en el tipo salvaje, aunque con una significancia estadística menor (Figura 4g). Algunos de los procesos biológicos superpuestos en las dos líneas celulares incluyeron la regulación del proceso apoptótico y la muerte celular programada (Figura 4e, g). El término GO más enriquecido identificado en las células p21−/− fue el “proceso apoptótico de células T alfa-beta CD8 positivas” (Figura 4g). Dado el pequeño número de DEGs identificados en las células p21−/−, estos resultados de enriquecimiento deben interpretarse como exploratorios. En contraste, el análisis de ontología génica de los genes regulados a la baja en p21−/− no reveló asociaciones significativas. El análisis GO reveló que solo la línea celular HCT116-p53−/− exhibió un enriquecimiento significativo de DEGs regulados a la baja, específicamente para los procesos biológicos relacionados con la cromatina, incluyendo el ensamblaje de nucleosomas, el ensamblaje de cromatina dependiente de la replicación del ADN, la organización de la cromatina dependiente de la replicación del ADN, la organización de subunidades de complejos proteína-ADN, el ensamblaje de cromatina, el remodelamiento de la cromatina y la organización de telómeros y cromatina (Figura 4h y Tabla 1). Estos procesos relacionados con la cromatina enriquecidos no se observaron en las líneas celulares de tipo salvaje o p21−/−.

El enriquecimiento observado de los procesos biológicos relacionados con la cromatina en las células deficientes en p53 es consistente con el papel establecido de p53 en el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la regulación de las vías de reparación del ADN y la organización de la cromatina [^[52]]. Además, la senescencia celular fue una de las vías KEGG significativamente enriquecidas después del tratamiento con metformina (Figura 4b). En conjunto, estas observaciones transcriptómicas son consistentes con el perfil transcriptómico asociado a la senescencia, incluyendo cambios relacionados con la cromatina y una actividad metabólica reducida del ADN, características comúnmente asociadas con estados transcripcionalmente represivos [^[53]].

3.1. La metformina afecta la viabilidad celular en la línea celular de CCRC HCT116: un análisis dependiente del tiempo y la dosis

Para dilucidar los efectos de la metformina en la viabilidad celular de CCRC, se realizaron ensayos MTT en células HCT116 de tipo salvaje. Nuestros datos demostraron una reducción dependiente de la dosis y el tiempo en la viabilidad celular de HCT116 tras la exposición a metformina, evidenciada por una disminución progresiva en la viabilidad celular con el aumento de las concentraciones de metformina y los períodos de incubación prolongados (24 h y 48 h, Figura 1). No se observaron diferencias significativas entre la exposición continua de 48 h y las condiciones de reposición de metformina (Figura 1). El ANOVA de dos vías confirmó efectos estadísticamente significativos tanto de la concentración de metformina como de la duración del tratamiento (p < 0,0001), así como una interacción significativa entre estos factores, lo que indica que el efecto de la metformina en la viabilidad celular varió según la duración del tratamiento. Estos hallazgos sugieren que la exposición prolongada se asoció con mayores reducciones en la viabilidad, mientras que la reposición de metformina después de 24 h no produjo reducciones sustanciales adicionales en la viabilidad en las células HCT116-WT (Figura 1).

3.2. La metformina se asocia con cambios en las distribuciones del ciclo celular en las células HCT116-WT

Examinamos los efectos de la metformina en la distribución del ciclo celular utilizando citometría de flujo con tinción de yoduro de propidio (Tabla S1, Figura 2). En el punto de tiempo de 24 h, tanto las células de tipo salvaje como las p53−/− mostraron un aumento dependiente de la concentración en la proporción de células en G0/G1 acompañado de una disminución correspondiente en las fases S y G2/M (Figura 2a, c, e). Coherente con estas observaciones, el ANOVA de dos vías indicó que a las 24 h, tanto la concentración de metformina como la línea celular (Figura 2a; Tabla S1) afectaron significativamente las distribuciones de G0/G1, S y G2/M (que van desde p = 0,03 hasta p < 0,0001; Tabla S1), mientras que los términos de interacción no fueron significativos. Es interesante destacar que las células p21−/− no tratadas mostraron una mayor proporción de células en la fase G2/M en comparación con otras líneas celulares (Figura 2a, c, e, g), lo que sugiere diferencias en la distribución del ciclo celular basal asociadas con la deficiencia de p21. En el punto de tiempo de 48 h, un alto porcentaje de células de tipo salvaje permaneció en G0/G1, con variaciones mínimas entre las concentraciones de metformina (Figura 2b, d; Tabla S1). Las células HCT116-p53−/− exhibieron un modesto aumento en la proporción de células en G0/G1 después del tratamiento (Figura 2b, f). Aproximadamente el 50% de las células p21−/− se encontraban en G0/G1 a las 48 h, y esta proporción disminuyó en respuesta al aumento de las concentraciones de metformina (Figura 2b, h). En este punto, el ANOVA de dos vías indicó que solo el factor de línea celular permaneció significativo en todas las fases del ciclo celular (p < 0,0001; Tabla S1), mientras que la concentración de metformina ya no fue significativa (Figura 2b), lo que sugiere que las diferencias entre las líneas celulares contribuyeron más fuertemente a las distribuciones del ciclo celular que la concentración del tratamiento después de una incubación prolongada.

Dado que el impacto de la metformina en el ciclo celular de las células p21−/− fue relativamente limitado a las 24 y 48 h, el tratamiento se extendió a 72 h (Tabla S1). Como se muestra en la Figura S1, el porcentaje de células en G0/G1 disminuyó significativamente en respuesta al aumento de las concentraciones de metformina (p = 0,0332; 2 mM, p < 0,0001; 4 mM y p = 0,0002; 8 mM; Tabla S1). En consecuencia, la proporción de células en G2/M aumentó significativamente (p = 0,0021; 2 mM, p = 0,0002; 4 mM y p = 0,0021; 8 mM; Tabla S1) a las 72 h (Figura S1d; Tabla S1). El ANOVA de dos vías en las condiciones de 24 h, 48 h y 72 h identificó efectos de interacción significativos para G0/G1 y G2/M (Figura 2a, b y Figura S1; Tabla S1), lo que indica que el efecto de la metformina en la distribución del ciclo celular de las células HCT116-p21−/− varió según la duración del tratamiento.

En resumen, el tratamiento con metformina se asoció con cambios en las distribuciones del ciclo celular, con las células de tipo salvaje que mostraron un mayor aumento en la proporción de células en G0/G1 que los derivados p53−/− y p21−/−. En contraste, los cambios en las distribuciones del ciclo celular en las células deficientes en p21 se hicieron más evidentes después de un tratamiento prolongado, incluido un aumento en la proporción de células en la fase G2/M. Estas observaciones indican alteraciones en las distribuciones del ciclo celular en ausencia de p21, que se sabe que es un mediador clave del arresto G1/G2 dependiente de p53 después del daño al ADN [^[50], ^[51]]. Sin embargo, dada la variabilidad en las respuestas de las células knockout y el tamaño de muestra limitado, estas observaciones deben interpretarse con cautela y requieren una validación adicional.

3.3. Validación por Western blot de los fenotipos de knockout de p53 y p21 en las líneas celulares derivadas

Para confirmar la estabilidad de los modelos celulares utilizados en este estudio, se evaluó la expresión de la proteína p53 fosforilada (Ser15) y p21 mediante análisis de Western blot en condiciones no tratadas (Figura S2). La expresión de p53 fosforilada (Ser15) se detectó en las células HCT116 de tipo salvaje y HCT116-p21−/−, pero no en las células HCT116-p53−/− (Figura S2a). De manera similar, se observó la expresión de p21 en las células de tipo salvaje y p53−/−, pero no en las células p21−/− (Figura S2b). Estos resultados son consistentes con las características reportadas de las líneas celulares knockout [^[46], ^[47]] y respaldan el mantenimiento y la validez de los fenotipos de knockout esperados durante todo el estudio.

3.4. El perfilado transcriptómico revela respuestas de expresión génica atenuadas en los knockouts de p53 y p21 en comparación con el HCT116 de tipo salvaje

3.4.1. Análisis de componentes principales (PCA)

Coherente con los hallazgos preliminares, los cambios transcriptómicos generales mostraron un patrón similar. El PCA de las células HCT116 de tipo salvaje y sus derivados knockout tratadas con metformina (4 mM durante 48 h) e no tratadas indicó que las tres líneas celulares exhibieron un perfil transcriptómico distinto entre sí (Figura 3a). Cada línea celular formó un grupo separado, lo que indica patrones de expresión génica únicos impulsados por sus alteraciones genéticas específicas. Las células de tipo salvaje mostraron la separación más distinta entre sus grupos tratados y no tratados, lo que indica una respuesta transcriptómica más grande a la metformina en comparación con sus derivados knockout (Figura 3a).

3.4.2. Análisis de expresión diferencial

El agrupamiento distinto observado en el PCA fue consistente con las diferencias en los perfiles de expresión génica basal entre HCT116-WT y las líneas celulares knockout. El análisis de expresión diferencial de las células no tratadas en relación con el tipo salvaje (Figura S3) identificó 1112 genes regulados a la baja y 384 genes regulados al alza en las células p53−/−, mientras que las células p21−/− exhibieron 1288 genes regulados a la baja y 1011 genes regulados al alza (Figura S3). El mayor número de genes expresados diferencialmente observados en las células p21−/− sugiere un mayor grado de divergencia transcriptómica del la línea celular parental. Estos resultados sugieren que la pérdida de p53 y p21 se asocia con alteraciones sustanciales en la expresión génica basal, lo que puede contribuir a las diferencias en las respuestas celulares a la metformina observadas en los tres genotipos. El análisis de expresión diferencial (Figura 3b, c; Figura S5) después de un tratamiento de 48 h (4 mM) reveló que las células HCT116-WT exhibieron la respuesta transcriptómica más grande, con 902 genes regulados a la baja y 497 genes regulados al alza en relación con el control no tratado (Figura 3b, c). Es notable que CDKN1A, un regulador clave del punto de control G1 y un objetivo transcripcional de p53, se reguló al alza de manera modesta pero significativa en las células de tipo salvaje tratadas con metformina (cambio de pliegue log2 = 1,24, p ajustada = 1,17 × 10−21), mientras que no se observó una regulación significativa en las células deficientes en p53 o p21 (Tabla S2). En contraste, la línea celular HCT116-p53−/− mostró 112 genes regulados a la baja y 158 genes regulados al alza después del tratamiento, mientras que la línea celular HCT116-p21−/− exhibió la respuesta transcriptómica más pequeña, con solo 15 genes regulados a la baja y 17 genes regulados al alza (Figura 3c). Dado el número limitado de réplicas biológicas (n = 2), estos hallazgos deben interpretarse como exploratorios y requieren una validación independiente.

3.4.3. DEGs superpuestos entre el HCT116 de tipo salvaje y sus derivados knockout

El diagrama de Venn (Figura 3d, e) ilustra los genes expresados diferencialmente (DEGs) superpuestos, tanto regulados al alza (Figura 3d) como regulados a la baja (Figura 3e), después del tratamiento con metformina de las tres líneas celulares. Estos genes compartidos pueden representar genes candidatos involucrados en la respuesta celular a la metformina, ya que su expresión se alteró de manera consistente en los tres genotipos después del tratamiento. Es notable que cuatro genes (DUSP5, FGD6, PLAUR y TNFAIP3) se regularon al alza de manera consistente en las tres líneas celulares después de 48 h de tratamiento con metformina a una dosis de 4 mM (Figura 3d). En contraste, solo un gen, FAM111A, se reguló a la baja de manera común (Figura 3e). Para respaldar los hallazgos de RNA-seq, se realizó RT-qPCR para genes DE compartidos seleccionados. Coherente con el análisis transcriptómico, DUSP5 y FGD6 mostraron un aumento en la expresión después del tratamiento con metformina en las células de tipo salvaje, p53−/− y p21−/−, mientras que la expresión de FAM111A se redujo en los tres genotipos (Figura S4). Estos resultados respaldan los datos de RNA-seq y sugieren una respuesta molecular compartida a la metformina en las tres líneas celulares.

3.4.1. Análisis de componentes principales (PCA)

De acuerdo con los resultados preliminares, los cambios transcripómicos generales mostraron un patrón similar. El análisis de componentes principales (PCA) de las células HCT116 de tipo salvaje (tratadas con 4 mM durante 48 h) y no tratadas, así como de sus derivados con deleción génica, indicó que las tres líneas celulares exhibieron perfiles transcripcionales distintos entre sí (Figura 3a). Cada línea celular formó un grupo separado, lo que indica patrones de expresión génica únicos impulsados por sus alteraciones genéticas específicas. Las células de tipo salvaje mostraron la separación más marcada entre sus grupos tratados y no tratados, lo que indica una mayor respuesta transcripcional a la metformina en comparación con sus derivados con deleción génica (Figura 3a).

3.4.2. Análisis de Expresión Diferencial

La agrupación distinta observada en el PCA fue consistente con las diferencias en los perfiles de expresión génica basal entre HCT116-WT y las líneas celulares con deleción génica. El análisis de expresión diferencial de las células no tratadas en relación con el tipo salvaje (Figura S3) identificó 1112 genes regulados a la baja y 384 genes regulados a la alza en las células p53−/−, mientras que las células p21−/− exhibieron 1288 genes regulados a la baja y 1011 genes regulados a la alza (Figura S3). El mayor número de genes con expresión diferencial observados en las células p21−/− sugiere un mayor grado de divergencia transcripcional con respecto a la línea celular parental. Estos resultados sugieren que la pérdida de p53 y p21 está asociada con alteraciones sustanciales en la expresión génica basal, lo que puede contribuir a las diferencias en las respuestas celulares a la metformina observadas en los tres genotipos. El análisis de expresión diferencial (Figura 3b, c; Figura S5) después de un tratamiento de 48 h (4 mM) reveló que las células HCT116-WT exhibieron la mayor respuesta transcripcional, con 902 genes regulados a la baja y 497 genes regulados a la alza en relación con el control no tratado (Figura 3b, c). En particular, CDKN1A, un regulador clave del punto de control G1 y un objetivo transcripcional de p53, se reguló ligeramente pero significativamente al alza en las células de tipo salvaje tratadas con metformina (cambio de pliegue log2 = 1,24, p ajustada = 1,17 × 10−21), mientras que no se observó una regulación significativa en las células deficientes en p53 o p21 (Tabla S2). En contraste, la línea celular HCT116-p53−/− mostró 112 genes regulados a la baja y 158 genes regulados a la alza después del tratamiento, mientras que la línea celular HCT116-p21−/− exhibió la respuesta transcripcional más pequeña, con solo 15 genes regulados a la baja y 17 genes regulados a la alza (Figura 3c). Dado el número limitado de réplicas biológicas (n = 2), estos hallazgos deben interpretarse como exploratorios y requieren una validación independiente.

3.4.3. Genes Regulados Diferencialmente Superpuestos entre el Tipo Salvaje HCT116 y sus Derivados con Deleción Génica

El diagrama de Venn (Figura 3d, e) ilustra los genes regulados diferencialmente superpuestos (DEG), tanto regulados a la alza (Figura 3d) como regulados a la baja (Figura 3e), después del tratamiento con metformina de las tres líneas celulares. Estos genes compartidos pueden representar genes candidatos involucrados en la respuesta celular a la metformina, ya que su expresión se alteró de manera consistente en los tres genotipos después del tratamiento. En particular, cuatro genes (DUSP5, FGD6, PLAUR y TNFAIP3) se regularon consistentemente al alza en las tres líneas celulares después de 48 h de tratamiento con metformina a una dosis de 4 mM (Figura 3d). En contraste, solo un gen, FAM111A, se reguló comúnmente a la baja (Figura 3e). Para respaldar los hallazgos de la secuenciación de ARN (RNA-seq), se realizó RT-qPCR para los DEG compartidos seleccionados. De acuerdo con el análisis transcripcional, DUSP5 y FGD6 mostraron un aumento de la expresión después del tratamiento con metformina en las células de tipo salvaje, p53−/− y p21−/−, mientras que la expresión de FAM111A se redujo en los tres genotipos (Figura S4). Estos resultados respaldan los datos de la secuenciación de ARN y sugieren una respuesta molecular compartida a la metformina en las tres líneas celulares.

3.5. El Análisis de la Vía KEGG de los DEG Reveló un Enriquecimiento de las Vías Relacionadas con la Senescencia Celular y la Apoptosis en las Células de Tipo Salvaje y Deficientes en p53 Tratadas con Metformina

Las células HCT116 de tipo salvaje tratadas con metformina (Figura 4a) mostraron un enriquecimiento de las vías KEGG relacionadas con la senescencia celular y la señalización apoptótica. De manera similar, la línea celular HCT116-p53−/− tratada con metformina (Figura 4b) exhibió un enriquecimiento de la vía de la senescencia celular, aunque menos DEG (Figura 4a, b) contribuyeron a esta vía en la línea celular con deleción génica que en la de tipo salvaje (6 frente a 10 DEG; Figura 4a, b). A pesar del menor número total de DEG regulados a la baja en las células p53−/− (112 frente a 902 DEG en WT; Figura 3c), se identificaron varias vías enriquecidas significativas entre los genes regulados a la baja (Figura 4c, d). En contraste, el análisis de enriquecimiento de vías utilizando ShinyGO indicó que los DEG de la línea celular HCT116-p21−/− tratada con metformina no mostraron un enriquecimiento estadísticamente significativo en las vías KEGG.

Las vías enriquecidas comúnmente tanto en las células de tipo salvaje como en las p53−/− incluyeron vías en el cáncer, la vía de señalización MAPK, la senescencia celular, la vía de señalización AGE-RAGE en las complicaciones diabéticas y la vía de señalización PI3K-Akt (Figura 4a, b). Sin embargo, el grado de enriquecimiento varió entre los dos genotipos (Figura 4a, b). La vía de formación de trampas extracelulares de neutrófilos fue la única vía regulada a la baja en ambas líneas celulares (Figura 4c, d).

3.6. El Análisis de la Ontología Génica Destacó el Enriquecimiento Diferencial de los Procesos Relacionados con la Apoptosis y la Cromatina en las Líneas Celulares HCT116 Tratadas con Metformina

El análisis de la ontología génica de los DEG regulados a la alza en las células HCT116-WT tratadas con metformina identificó un enriquecimiento significativo de los procesos biológicos relacionados con la regulación de la muerte celular, la muerte celular programada y los procesos apoptóticos (Figura 4e). La línea celular HCT116-p53−/− tratada con metformina demostró un enriquecimiento de los procesos biológicos asociados con la locomoción, la regulación positiva de la migración celular, la motilidad celular y la localización celular (Figura 4f). La línea celular HCT116-p21−/− tratada con metformina exhibió un enriquecimiento de los procesos biológicos, similar a los observados en el tipo salvaje, aunque con una menor significación estadística (Figura 4g). Algunos de los procesos biológicos superpuestos en las dos líneas celulares incluyeron la regulación del proceso apoptótico y la muerte celular programada (Figura 4e, g). El término GO más enriquecido identificado en las células p21−/− fue el "proceso apoptótico de células T alfa-beta CD8 positivas activadas" (Figura 4g). Dado el pequeño número de DEG identificados en las células p21−/−, estos resultados de enriquecimiento deben interpretarse como exploratorios. En contraste, el análisis de la ontología génica de los genes regulados a la baja en p21−/− no reveló asociaciones significativas. El análisis GO reveló que solo la línea celular HCT116-p53−/− exhibió un enriquecimiento significativo de los DEG regulados a la baja, específicamente para los procesos biológicos relacionados con la cromatina, que incluyen el ensamblaje de nucleosomas, el ensamblaje de cromatina dependiente de la replicación del ADN, la organización de la cromatina dependiente de la replicación del ADN, la organización de subunidades de complejos proteína-ADN, el ensamblaje de la cromatina, la remodelación de la cromatina y la organización de los telómeros y la cromatina (Figura 4h y Tabla 1). Estos procesos relacionados con la cromatina enriquecidos no se observaron en las líneas celulares de tipo salvaje o p21−/−.

El enriquecimiento observado de los procesos biológicos relacionados con la cromatina en las células deficientes en p53 es consistente con el papel establecido de p53 en el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la regulación de las vías de reparación del ADN y la organización de la cromatina [^[52]]. Además, la senescencia celular fue una de las vías KEGG significativamente enriquecidas después del tratamiento con metformina (Figura 4b). En conjunto, estas observaciones transcripcionales son consistentes con un perfil transcripcional asociado con la senescencia, que incluye cambios relacionados con la cromatina y una actividad metabólica del ADN reducida, características comúnmente asociadas con estados transcripcionalmente represivos [^[53]].

4. Discusión

La metformina ha surgido en la última década como un fármaco prometedor para su uso en oncología, con numerosos estudios que demuestran su capacidad para inhibir el crecimiento de las células cancerosas [^[13], ^[54], ^[55], ^[56]]. Sin embargo, como ilustran nuestros resultados, su eficacia no es consistente en todos los contextos genéticos. En este estudio, examinamos cómo la presencia o ausencia de dos genes supresores de tumores críticos, TP53 y CDKN1A/p21, influye en los efectos anticancerígenos de la metformina en una línea celular de CRC con mutación KRAS. La presencia de esta mutación convierte a HCT116 en un valioso modelo in vitro para investigar la biología de los tumores impulsados por KRAS, que a menudo exhiben una respuesta limitada a las terapias dirigidas disponibles actualmente y, por lo tanto, requieren enfoques terapéuticos alternativos [^[57]]. Nuestros hallazgos brindan información sobre las respuestas dependientes del genotipo a la metformina en el CRC con mutación KRAS G13D, un subtipo molecular para el cual las opciones terapéuticas dirigidas siguen siendo limitadas, destacando las diferencias en las respuestas fenotípicas y transcripcionales asociadas con el estado de p53 y p21.

4.1. Estado de p53 y p21 en relación con la respuesta a la metformina

Observamos que las células HCT116 de tipo salvaje con p53 funcional mostraron un enriquecimiento de células en la fase G0/G1 (Figura 2a-d) y una regulación al alza de los procesos biológicos relacionados con la apoptosis (Figura 4a) después del tratamiento con metformina. Las células isogénicas deficientes en p53 también pudieron haber tenido un arresto en G1 (Figura 2a-f), aunque esto requirió una mayor validación debido a la alta variabilidad observada en los datos. Estas observaciones sugieren que el estado de p53 puede influir en las respuestas celulares a la metformina, lo que es consistente con el papel establecido de p53 como el "guardián del genoma" en la mediación del arresto del ciclo celular y la muerte celular en condiciones de estrés metabólico [^[52]]. Existe evidencia en la literatura de que los efectos antitumorales de la metformina a menudo dependen del estado de p53 [^[58], ^[59], ^[60]]. Nuestros resultados se alinean con esas observaciones y sugieren que p21 puede contribuir a la respuesta celular a la metformina, lo que es consistente con su papel establecido como un efector aguas abajo de p53. Observamos que en ausencia de p21, la respuesta de arresto en G1 a la metformina se redujo (Figura 2), lo que refleja su papel establecido como un inhibidor de ciclina-CDK requerido para la aplicación del punto de control G1 [^[61]]. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el estado de p53 y p21 puede influir en la respuesta del ciclo celular a la metformina. Para respaldar esta interpretación, el análisis transcripcional reveló una regulación al alza modesta pero estadísticamente significativa de CDKN1A, un objetivo transcripcional canónico de p53, en las células de tipo salvaje tratadas con metformina (Tabla S2), lo que sugiere la participación de la vía p53-p21 en la respuesta transcripcional a la metformina.

Estudios previos también han demostrado que la metformina aún puede ejercer efectos anticancerígenos en células p53-null y puede sensibilizarlas a terapias adicionales [^[62]]. Por ejemplo, se ha informado que la metformina radiosensibiliza las células de cáncer colorrectal deficientes en p53 al inducir un arresto en G2/M e impedir los mecanismos de reparación del ADN [^[63]]. Si bien nuestros datos no mostraron una acumulación consistente en G2/M en las células HCT116-p53−/−, observamos variabilidad en su respuesta al ciclo celular y una tendencia modesta hacia un enriquecimiento en G0/G1 a las 24 horas (Figura 2a,e), acompañado de una regulación a la baja de los genes involucrados en la organización de la cromatina y los procesos asociados a la replicación del ADN (Figura 4h). Estos hallazgos sugieren que la regulación alterada de los puntos de control en las células deficientes en p53 puede influir en las respuestas celulares al daño del ADN y al estrés terapéutico. En contraste, las células deficientes en p21 mostraron un fenotipo distinto del ciclo celular, caracterizado por un aumento de la acumulación en la fase G2/M después de una exposición prolongada a la metformina (Figura S1d). Este patrón puede reflejar una mayor dependencia del punto de control G2/M después de la pérdida del control del punto de control G1/S mediado por p21. Se sabe que los cánceres con una función comprometida del punto de control G1 dependen más del punto de control G2/M para mantener la estabilidad genómica bajo estrés de replicación, lo que convierte a los reguladores de este punto de control en posibles objetivos terapéuticos [^[64]]. WEE1 es un regulador clave del punto de control G2/M que retrasa la entrada en la mitosis para permitir la reparación del ADN [^[59]]. Los estudios in vitro que utilizan células HCT116-p21−/− han demostrado que la inhibición de WEE1 con adavosertib (AZD1775) aumenta el daño del ADN asociado a la replicación y la muerte celular, lo que indica que la pérdida de p21 aumenta la vulnerabilidad a la interrupción del punto de control [^[65]]. La evaluación clínica de adavosertib en un ensayo aleatorizado de fase II FOCUS4-C demostró una mejora significativa de la supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer colorrectal metastásico con mutaciones en TP53 y RAS, lo que respalda la relevancia terapéutica de dirigir WEE1 en contextos de cáncer colorrectal definidos genéticamente [^[66]], aunque su relevancia para nuestro modelo experimental requiere una validación directa.

4.2. Interpretación funcional de los genes y vías comunes que responden a la metformina

Entre los DEG comunes identificados en las tres líneas celulares (Figura 3d,e), un gen, FAM111A (Figura 3e), se reguló a la baja de forma consistente, mientras que cuatro genes, DUSP5, FGD6, PLAUR y TNFAIP3 (Figura 3d), se regularon al alza de forma consistente. Las funciones conocidas de estos genes proporcionan un contexto para interpretar sus respuestas compartidas a la metformina. FAM111 tripsin-like peptidase A (FAM111A) es una serina proteasa que desempeña un papel importante en la replicación del ADN al facilitar la unión estable de la ADN polimerasa, cargar el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) en la cromatina y proteger las horquillas de replicación de los enlaces cruzados entre el ADN y las proteínas, manteniendo así la integridad genómica [^[67],^[68]]. En consecuencia, la regulación a la baja de FAM111A después del tratamiento con metformina puede reflejar procesos alterados asociados a la replicación del ADN. Entre los cuatro genes regulados al alza, la fosfatasa de especificidad dual-5 (DUSP-5), una enzima de la familia de fosfatasas específicas, regula las quinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2) dentro de la vía MAPK [^[69]]. La regulación al alza de DUSP5 tiene el potencial de influir en la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y en las respuestas proliferativas asociadas. Estudios previos han informado de la regulación al alza de DUSP5 después del tratamiento con metformina [^[70]] y de una asociación entre su expresión y la CI50 de la metformina [^[71]], lo que sugiere que DUSP5 puede contribuir a la respuesta celular a la metformina. La regulación consistente al alza de FGD6 [^[72]] y PLAUR [^[73]], genes relacionados con la migración celular y la tumorigénesis, sugiere que también pueden contribuir a los cambios transcripcionales asociados al tratamiento con metformina. TNFAIP3, un regulador crítico de la inflamación y un inhibidor de la proliferación y la invasión de las células de CRC, mostró una regulación al alza significativa, lo que coincide con los informes de su inducción por la metformina en otros cánceres [^[74]].

La regulación al alza de DUSP5 y la regulación a la baja de FAM111A son particularmente notables. La regulación al alza de DUSP5 puede reflejar una respuesta de retroalimentación negativa dentro de la vía MAPK [^[69]]. Dado que las mutaciones de KRAS activan fuertemente la cascada MAPK/ERK, la regulación al alza de DUSP5 puede representar una respuesta de retroalimentación negativa que contrarreste parcialmente las señales pro-crecimiento en las células con mutaciones en KRAS. Mientras tanto, la regulación a la baja de FAM111A es consistente con procesos alterados asociados a la replicación del ADN. Esto puede reflejar una reducción de la actividad proliferativa y perturbaciones de la replicación del ADN. Si estos cambios contribuyen al estrés de replicación o a la inestabilidad genómica, es necesario investigar más a fondo. Además, en las células de tipo salvaje, los procesos biológicos relacionados con la apoptosis se encontraban entre las vías enriquecidas identificadas después del tratamiento con metformina (Figura 4a), lo que coincide con una respuesta transcripcional asociada al estrés celular.

En las células p53−/−, la regulación alterada de los puntos de control puede influir en las respuestas celulares al estrés de replicación. Estudios previos han sugerido que la interrupción de los puntos de control del ciclo celular puede aumentar la sensibilidad a las terapias dirigidas a la progresión mitótica, incluida la inhibición de WEE1 [^[64]], lo que destaca un área potencial para futuras investigaciones. La regulación consistente al alza de TNFAIP3 en todas las líneas celulares sugiere que la señalización inflamatoria puede contribuir a la respuesta transcripcional a la metformina. TNFAIP3 se pierde con frecuencia en ciertos linfomas, lo que provoca una actividad descontrolada del factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de las células B activadas (NF-κB), que es una familia de factores de transcripción que desempeñan un papel central en la regulación de las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la supervivencia, la proliferación celular y la apoptosis [^[75]]. En nuestro estudio, la metformina se asoció con un aumento de la expresión de TNFAIP3, lo que puede ser consistente con una reducción de la señalización de NF-κB. Se sabe que la inflamación crónica es un promotor de la tumorigénesis colorrectal, y NF-κB impulsa la expresión de genes que inhiben la apoptosis. El aumento de la expresión de TNFAIP3 puede estar asociado con la modulación de las vías de señalización inflamatorias. Esta observación es de interés a la luz de un estudio reciente en pacientes con cáncer de páncreas sometidos a resección inicial y tratamiento con metformina [^[76]]. El estudio informó de alteraciones significativas en los perfiles inmunitarios, específicamente la reducción de la expresión de genes relacionados con la inflamación pro-tumoral y la disminución de la infiltración de macrófagos en comparación con los no usuarios de metformina [^[76]]. Estos cambios inmunitarios se acompañaron de una mejora del resultado de la supervivencia general, lo que destaca el posible papel de la metformina en la modulación del microambiente tumoral y la mejora del pronóstico [^[76]]. En el cáncer colorrectal, es plausible que la metformina pueda influir en la vigilancia inmunitaria a través de la modulación de la señalización inflamatoria, lo que podría implicar a TNFAIP3, una posibilidad que justifica una investigación in vivo futura.

Otro hallazgo notable fue la regulación a la baja compartida de la vía de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en las células de tipo salvaje y p53−/− tratadas con metformina (Figura 4c,d). Esta observación es potencialmente relevante porque se ha demostrado que las NET, complejos de ADN desplegado decorados con proteasas, histonas, proteínas citosólicas y granulares, están implicadas en la progresión del cáncer y el comportamiento metastásico [^[77]]. Los mecanismos propuestos incluyen la captura de células tumorales circulantes [^[78]], la promoción de la transición epitelio-mesenquimal [^[79]] y la contribución a un microambiente inflamatorio de apoyo tumoral [^[80]]. En el cáncer colorrectal, se ha informado que la metformina suprime la formación de NET y se asocia con una reducción de los neutrófilos y las NET asociadas al tumor, junto con un aumento de los linfocitos T infiltrantes del tumor CD3+ y CD8+ [^[80]]. Estas observaciones respaldan la relevancia biológica de la vía de formación de NET como una posible respuesta posterior a la exposición a la metformina [^[80]]. Dado que nuestro estudio evaluó el enriquecimiento de vías transcripcionales en lugar de la formación de NET directamente, estos hallazgos deben interpretarse con cautela.

4.1. Estado de p53 y p21 en relación con la respuesta a la metformina

Observamos que las células HCT116 de tipo salvaje con p53 funcional mostraron un enriquecimiento de células en la fase G0/G1 (Figura 2a–d) y una regulación al alza de los procesos biológicos relacionados con la apoptosis (Figura 4a) después del tratamiento con metformina. Las células isogénicas deficientes en p53 también pudieron tener un arresto en G1 (Figura 2a–f), aunque esto requirió una validación adicional debido a la alta variabilidad observada en los datos. Estas observaciones sugieren que el estado de p53 puede influir en las respuestas celulares a la metformina, lo que coincide con el papel establecido de p53 como el "guardián del genoma" en la mediación del arresto del ciclo celular y la muerte celular en condiciones de estrés metabólico [^[52]]. Existe evidencia en la literatura de que los efectos antitumorales de la metformina a menudo dependen del estado de p53 [^[58],^[59],^[60]]. Nuestros resultados se alinean con esas observaciones y sugieren que p21 puede contribuir a la respuesta celular a la metformina, lo que coincide con su papel establecido como un efector posterior de p53. Observamos que en ausencia de p21, la respuesta de arresto en G1 a la metformina se redujo (Figura 2), lo que refleja su papel establecido como un inhibidor de ciclina-CDK necesario para la aplicación del punto de control G1 [^[61]]. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el estado de p53 y p21 puede influir en la respuesta del ciclo celular a la metformina. En apoyo de esta interpretación, el análisis transcripcional reveló una regulación al alza modesta pero estadísticamente significativa de CDKN1A, un objetivo transcripcional canónico de p53, en las células de tipo salvaje tratadas con metformina (Tabla S2), lo que sugiere la participación de la vía p53-p21 en la respuesta transcripcional a la metformina.

Estudios previos también han demostrado que la metformina aún puede ejercer efectos anticancerígenos en células p53-null y puede sensibilizarlas a terapias adicionales [^[62]]. Por ejemplo, se ha informado que la metformina radiosensibiliza las células de cáncer colorrectal deficientes en p53 al inducir un arresto en G2/M e impedir los mecanismos de reparación del ADN [^[63]]. Si bien nuestros datos no mostraron una acumulación consistente en G2/M en las células HCT116-p53−/−, observamos variabilidad en su respuesta al ciclo celular y una tendencia modesta hacia un enriquecimiento en G0/G1 a las 24 horas (Figura 2a,e), acompañado de una regulación a la baja de los genes involucrados en la organización de la cromatina y los procesos asociados a la replicación del ADN (Figura 4h). Estos hallazgos sugieren que la regulación alterada de los puntos de control en las células deficientes en p53 puede influir en las respuestas celulares al daño del ADN y al estrés terapéutico. En contraste, las células deficientes en p21 mostraron un fenotipo distinto del ciclo celular, caracterizado por un aumento de la acumulación en la fase G2/M después de una exposición prolongada a la metformina (Figura S1d). Este patrón puede reflejar una mayor dependencia del punto de control G2/M después de la pérdida del control del punto de control G1/S mediado por p21. Se sabe que los cánceres con una función comprometida del punto de control G1 dependen más del punto de control G2/M para mantener la estabilidad genómica bajo estrés de replicación, lo que convierte a los reguladores de este punto de control en posibles objetivos terapéuticos [^[64]]. WEE1 es un regulador clave del punto de control G2/M que retrasa la entrada en la mitosis para permitir la reparación del ADN [^[59]]. Los estudios in vitro que utilizan células HCT116-p21−/− han demostrado que la inhibición de WEE1 con adavosertib (AZD1775) aumenta el daño del ADN asociado a la replicación y la muerte celular, lo que indica que la pérdida de p21 aumenta la vulnerabilidad a la interrupción del punto de control [^[65]]. La evaluación clínica de adavosertib en un ensayo aleatorizado de fase II FOCUS4-C demostró una mejora significativa de la supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer colorrectal metastásico con mutaciones en TP53 y RAS, lo que respalda la relevancia terapéutica de dirigir WEE1 en contextos de cáncer colorrectal definidos genéticamente [^[66]], aunque su relevancia para nuestro modelo experimental requiere una validación directa.

Entre los genes diferencialmente expresados (DEGs) comunes identificados en las tres líneas celulares (Figura 3d, e), un gen, FAM111A (Figura 3e), se encontraba consistentemente regulado a la baja, mientras que cuatro genes, DUSP5, FGD6, PLAUR y TNFAIP3 (Figura 3d), se encontraban consistentemente regulados al alza. Las funciones conocidas de estos genes proporcionan un contexto para interpretar sus respuestas compartidas a la metformina. FAM111 tripsina-like peptidase A (FAM111A) es una serina proteasa que desempeña un papel importante en la replicación del ADN al facilitar la unión estable de la ADN polimerasa, la carga del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en la cromatina y la protección de los orígenes de replicación frente a enlaces cruzados de ADN-proteínas, manteniendo así la integridad genómica [^[67], ^[68]]. En consecuencia, la regulación a la baja de FAM111A tras el tratamiento con metformina puede reflejar alteraciones en los procesos asociados a la replicación del ADN. De los cuatro genes regulados al alza, la fosfatasa de doble especificidad-5 (DUSP-5), una enzima de la familia de fosfatasas específicas, regula las quinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2) dentro de la vía MAPK [^[69]]. La regulación al alza de DUSP5 tiene el potencial de influir en la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y en las respuestas proliferativas asociadas. Estudios previos han informado sobre la regulación al alza de DUSP5 tras el tratamiento con metformina [^[70]] y una asociación entre su expresión y la CI50 de la metformina [^[71]], lo que sugiere que DUSP5 puede contribuir a la respuesta celular a la metformina. La regulación al alza consistente de FGD6 [^[72]] y PLAUR [^[73]], genes relacionados con la migración celular y la tumorigénesis, sugiere que también pueden contribuir a los cambios transcripcionales asociados con el tratamiento con metformina. TNFAIP3, un regulador crítico de la inflamación y un inhibidor de la proliferación y la invasión de las células de CRC, mostró una regulación al alza significativa, lo que coincide con los informes de su inducción por la metformina en otros cánceres [^[74]].

La regulación al alza de DUSP5 y la regulación a la baja de FAM111A son particularmente notables. La regulación al alza de DUSP5 puede reflejar una respuesta de retroalimentación negativa dentro de la vía MAPK [^[69]]. Dado que las mutaciones de KRAS activan fuertemente la cascada MAPK/ERK, la regulación al alza de DUSP5 puede representar una respuesta de retroalimentación negativa que contrarreste parcialmente las señales pro-crecimiento en las células con mutaciones de KRAS. Mientras tanto, la regulación a la baja de FAM111A es consistente con las alteraciones en los procesos asociados a la replicación del ADN. Esto puede reflejar una reducción de la actividad proliferativa y perturbaciones en la replicación del ADN. Si estos cambios contribuyen al estrés de replicación o a la inestabilidad genómica requiere una mayor investigación. Además, en las células de tipo salvaje, los procesos biológicos relacionados con la apoptosis se encontraban entre las vías enriquecidas identificadas tras el tratamiento con metformina (Figura 4a), lo que coincide con una respuesta transcripcional asociada con el estrés celular.

En las células p53−/−, la regulación alterada de los puntos de control puede influir en las respuestas celulares al estrés de replicación. Estudios previos han sugerido que la interrupción de los puntos de control del ciclo celular puede aumentar la sensibilidad a las terapias dirigidas a la progresión mitótica, incluida la inhibición de WEE1 [^[64]], lo que destaca un área potencial para futuras investigaciones. La regulación al alza consistente de TNFAIP3 en todas las líneas celulares sugiere que la señalización inflamatoria puede contribuir a la respuesta transcripcional a la metformina. TNFAIP3 se pierde con frecuencia en ciertos linfomas, lo que provoca una actividad descontrolada del factor de transcripción nuclear kappa-light-chain-enhancer de las células B activadas (NF-κB), que es una familia de factores de transcripción que desempeñan un papel central en la regulación de las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la supervivencia, la proliferación celular y la apoptosis [^[75]]. En nuestro estudio, la metformina se asoció con un aumento de la expresión de TNFAIP3, lo que puede ser consistente con una reducción de la señalización de NF-κB. La inflamación crónica es un promotor conocido de la tumorigénesis colorrectal, y NF-κB impulsa la expresión de genes que inhiben la apoptosis. El aumento de la expresión de TNFAIP3 puede estar asociado con la modulación de las vías de señalización inflamatorias. Esta observación es de interés a la luz de un estudio reciente en pacientes con cáncer de páncreas sometidos a resección inicial y tratamiento con metformina [^[76]]. El estudio informó sobre alteraciones significativas en los perfiles inmunitarios, específicamente la reducción de la expresión de genes relacionados con la inflamación pro-tumoral y la disminución de la infiltración de macrófagos en comparación con los no usuarios de metformina [^[76]]. Estos cambios inmunitarios se acompañaron de una mejora del resultado de la supervivencia general, lo que destaca el posible papel de la metformina en la modulación del microambiente tumoral y la mejora del pronóstico [^[76]]. En el cáncer colorrectal, es plausible que la metformina pueda influir en la vigilancia inmunitaria a través de la modulación de la señalización inflamatoria, lo que podría implicar a TNFAIP3, una posibilidad que justifica una mayor investigación in vivo.

Otro hallazgo notable fue la regulación a la baja compartida de la vía de formación de la trampa extracelular de neutrófilos (NET) en las células de tipo salvaje y p53−/− tratadas con metformina (Figura 4c, d). Esta observación es potencialmente relevante porque se ha implicado a las NET, complejos de ADN desplegado decorados con proteasas, histonas, proteínas citosólicas y granulares, en la progresión del cáncer y el comportamiento metastásico [^[77]]. Los mecanismos propuestos incluyen la captura de células tumorales circulantes [^[78]], la promoción de la transición epitelio-mesenquimal [^[79]] y la contribución a un microambiente inflamatorio de apoyo tumoral [^[80]]. En el cáncer colorrectal, se ha informado que la metformina suprime la formación de NET y se asocia con una reducción de los neutrófilos y las NET asociadas al tumor, junto con un aumento de los linfocitos T infiltrantes del tumor CD3+ y CD8+ [^[80]]. Estas observaciones respaldan la relevancia biológica de la vía de formación de NET como una posible respuesta posterior a la exposición a la metformina [^[80]]. Dado que nuestro estudio evaluó el enriquecimiento de las vías transcripcionales en lugar de la formación de NET directamente, estos hallazgos deben interpretarse con cautela.

5. Conclusiones

El tratamiento con metformina se asoció con una reducción de la viabilidad celular y cambios en la distribución del ciclo celular en las células de cáncer colorrectal HCT116 con mutaciones de KRAS, y estos efectos variaron según el estado de los genes supresores tumorales p53 y p21. Las células de tipo salvaje exhibieron la respuesta transcripcional más fuerte tras el tratamiento con metformina, incluido el enriquecimiento de los procesos biológicos relacionados con la regulación del ciclo celular y la apoptosis, mientras que las células deficientes en p53 y p21 mostraron alteraciones más limitadas en el ciclo celular y a nivel transcripcional. Estos hallazgos sugieren que las respuestas fenotípicas y transcripcionales a la metformina pueden diferir en los diferentes contextos genéticos, y que el estado de los genes supresores tumorales puede influir en la respuesta al tratamiento. Aunque estos hallazgos se obtuvieron a partir de un modelo in vitro, proporcionan una base para una mayor investigación de las respuestas dependientes del genotipo a la metformina en el cáncer colorrectal. Dada la seguridad establecida y el uso clínico generalizado de la metformina, una mayor validación funcional y evaluación en modelos in vivo adicionales y estudios estratificados por genotipo pueden ayudar a aclarar su posible papel como agente terapéutico reutilizado en el cáncer colorrectal.