Nanopartículas de ácido hialurónico activadas por enzimas y especies reactivas de oxígeno permiten la administración de celastrol para una terapia dirigida a sitios específicos en las enfermedades inflamatorias intestinales y el cáncer colorrectal.

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria crónica y con tendencia a las recaídas, asociada con diarrea hemorrágica, úlceras mucosas y pérdida de peso.[1–3] La alta tasa de recurrencia de la CU no solo afecta a 7 millones de personas en todo el mundo, sino que también consume muchos recursos médicos.^[4] Además, la inflamación prolongada y repetida puede desencadenar la aparición y progresión del cáncer colorrectal asociado a la colitis (CCAC). Según los informes, el riesgo de por vida de CCAC en pacientes con CU es de 2 a 4 veces mayor que en la población general.^[5] Además, el CCAC subraya la estimulación perpetua de la proliferación de células epiteliales en el entorno inflamatorio. En consecuencia, el CCAC a menudo se identifica en etapas avanzadas, lo que destaca la necesidad de estrategias de detección temprana para prevenir la progresión neoplásica.^[6] Actualmente, existe una variedad de opciones terapéuticas disponibles para las enfermedades del colon en varias etapas, siendo la mesalamina y la sulfasalazina el tratamiento principal para la CU leve a moderada, los neuroesteroides se administran con frecuencia para la CU moderada a grave,^[7] y los regímenes de quimioterapia combinados que incorporan bevacizumab o cetuximab sirven como el enfoque estándar para el cáncer colorrectal (CCR) grave.^[8] Aunque estos fármacos tienen efectos terapéuticos evidentes en diferentes etapas de las enfermedades intestinales, los métodos de dosificación inconvenientes y las frecuentes modificaciones de los fármacos plantean desafíos para los pacientes.^[9]

Los investigadores están trabajando activamente en la extracción de compuestos bioactivos de plantas naturales para el tratamiento de la inflamación y el cáncer. El celastrol (Cel) es un compuesto triterpénico pentacíclico extraído de Tripterygium wilfordii Hook F, que tiene diversas actividades farmacológicas y se considera uno de los cinco compuestos bioactivos más prometedores en la naturaleza.^[10],^[11] Los estudios han demostrado que las bajas concentraciones de Cel ejercen efectos antiinflamatorios y anticancerígenos, lo que permite su aplicación en un amplio espectro de enfermedades intestinales (incluida la CU, el CCAC y el CCR).^[5],^[10] Específicamente, Cel revierte el desequilibrio de los subconjuntos Treg/Th17 y Treg/Th1 en la mucosa intestinal, al tiempo que suprime la producción de citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β) en monocitos y macrófagos humanos.^[12] También previene la progresión de la CU a CCR al inhibir la inflamación, intervenir en la transición epitelio-mesenquimal (TEM) y reducir la expresión de p53 mutante y p53 fosforilada (p-p53).^[13] Además, Cel inhibe el crecimiento de las células de CCR a través de múltiples vías: promoviendo la degradación de β-catenina a través del eje HSF1-LKB1-AMPKα-YAP,^[14] y suprimiendo el crecimiento/migración celular al inhibir la actividad de la NOS y la angiogénesis.^[15] A pesar de estas prometedoras propiedades farmacológicas, el potencial terapéutico de Cel se ve gravemente limitado por su escasa solubilidad en agua, su rápida eliminación sistémica y su extremadamente baja biodisponibilidad oral, lo que en conjunto resulta en concentraciones locales de fármaco insuficientes en las lesiones cólicas después de la administración oral convencional.^[16] Para lograr una terapia eficaz para las enfermedades intestinales, es esencial no solo mejorar la biodisponibilidad oral sistémica de Cel, sino también, y lo que es más importante, mejorar su disponibilidad local dentro del tejido cólico afectado a través de estrategias de administración específicas de la lesión que superen las barreras gastrointestinales y logren una acumulación dirigida en los sitios inflamatorios/malignos.

Actualmente, las nanopartículas (NP) han ganado una amplia aplicación en los sistemas de administración oral de fármacos para el tratamiento de las enfermedades intestinales y han demostrado ser prometedoras para mejorar la eficacia terapéutica de Cel.^[7],^[17],^[18] Sin embargo, la administración oral dirigida al colon enfrenta varios desafíos inherentes que aún no se han resuelto por completo. En primer lugar, el duro entorno gastrointestinal (incluida la acidez gástrica, las enzimas digestivas extensas y la barrera mucosa) compromete gravemente la estabilidad y la penetración de la mucosa de los nanocargadores convencionales, lo que lleva a la liberación prematura del fármaco y a una mala biodisponibilidad.^[19] En segundo lugar, la falta de capacidad de direccionamiento específico de la lesión a menudo resulta en una biodistribución no específica, lo que limita las concentraciones terapéuticas locales en los sitios de la enfermedad y aumenta el riesgo de efectos secundarios sistémicos.^[20] En tercer lugar, la heterogeneidad patológica en las diferentes etapas de las enfermedades intestinales (desde la inflamación aguda hasta la malignidad) exige una plataforma de administración versátil capaz de adaptarse al microentorno en constante cambio, sin embargo, la mayoría de los sistemas actuales están diseñados para un solo estado patológico.^[21] Por ejemplo, se desarrolló un sistema de administración oral flexible dirigido al colon mediante la deposición electrostática capa por capa alternada de pectina-trimetil quitosano (TMC) sobre liposomas cargados con celastrol (Cel/PT-LbL Lipo) para mejorar su eficacia anti-CU.^[22] Sin embargo, los problemas prácticos, como la toxicidad de los materiales poliméricos, la respuesta insuficiente a los estímulos específicos de la enfermedad y la precisión de direccionamiento inadecuada para las lesiones cólicas, aún deben abordarse por completo. La β-ciclodextrina (β-CD, un cicloheptaglucósido cíclico) y el ácido hialurónico (HA, un polisacárido aniónico natural) son portadores dirigidos al colon biocompatibles.^[23] La β-CD, un cicloheptasacárido cíclico de unidades de glucopiranosa, ofrece una biocompatibilidad y degradabilidad enzimática excepcionales, lo que permite la liberación específica del fármaco en el colon a través de la fermentación microbiana.[24–26] El HA, un polisacárido aniónico resistente a las variaciones del pH gastrointestinal, se une a los receptores CD44 en los macrófagos y las células tumorales inflamadas, lo que facilita la captación celular dirigida.[27–31] Por lo tanto, proponemos el uso de HA y β-CD como portadores de fármacos para la administración dirigida de Cel, lo que permite la liberación específica del sitio en el sitio de la lesión cólica en respuesta a los estímulos locales.

Basándonos en las hipótesis anteriores, desarrollamos y fabricamos nanoplattaformas versátiles que emplean HA para el direccionamiento activo e incorporan β-CD y ácido 4-(hidroximetil)fenilborónico (PAPE) para la sensibilidad múltiple (enzima/ROS) para encapsular Cel (HA@Cel/NP). En primer lugar, el material sensible a ROS/enzimas (PAPE-SA-CD) se formó mediante la unión covalente de PAPE con β-CD, y la naturaleza anfífila encapsuló Cel. Posteriormente, con la interacción huésped-huésped de β-CD y el ácido 1-adamantanocarboxílico (AD), el HA se envolvió uniformemente en el exterior de esta sustancia, formando finalmente un sistema de administración de fármacos (HA@Cel/NP). Aprovechando la sobreexpresión de CD44 en las células diana, HA@Cel/NP se internaliza en los macrófagos a través de la endocitosis mediada por CD44 para el tratamiento de la CU y se dirige activamente a las células cancerosas del colon para la terapia del CCR. Los niveles elevados del microentorno cólico de ROS intracelular y enzimas intestinales conducen a la rápida degradación de las NP. Para validar este diseño, desarrollamos tres modelos de enfermedad intestinal (CU, CCAC y CCR) y realizamos una investigación exhaustiva de la eficacia farmacológica de HA@Cel/NP tanto in vitro como in vivo. En particular, Cel induce la muerte celular inmunogénica (DCI) al promover la liberación prematura de calreticulina (CRT) y la proteína de la caja de movilidad alta 1 (HMGB1), ejerciendo efectos anticancerígenos directos y robustas respuestas inmunitarias antitumorales. Por lo tanto, combinamos la terapia de DCI mediada por HA@Cel/NP con anti-PD-L1 para remodelar el microentorno inmunosupresor del tumor, inhibir la proliferación de las células cancerosas del colon y mejorar la eficacia terapéutica. En resumen, nuestros hallazgos sugieren que HA@Cel/NP son prometedores como un nuevo sistema de administración de fármacos para la administración de fármacos para tratar una variedad de enfermedades relacionadas con el colon.

Métodos

Materiales

El celastrol (Cel) se adquirió de Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). El ácido 4-(hidroximetil)fenilborónico (PAPE), el anhídrido succínico (SA) y la cumarina-6 (C6) se compraron a Aladdin Reagent Co., Ltd (Shanghái, China). El ácido 1-adamantanocarboxílico (AD) fue proporcionado por Adamas (Shanghái, China). El ácido hialurónico (HA, PM 8 kDa) se compró a Freda Biochem Co., Ltd. (Shandong, China). La mono-(6-amino-6-desoxi)-β-ciclodextrina (6-NH2-β-CD) se obtuvo de Shandong Binzhou Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd. (Shandong, China). El colorante lipofílico de infrarrojo cercano, 1,10-dioctadecil tetrametil indotricarbo cianina yoduro (DiR), fue suministrado por Mellon, Biological Technology Co., Ltd. (Dalian, China). El sulfato de dextrano sódico (DSS, grado para colitis, PM 36-50 kDa) fue proporcionado por MP Biomedicals Inc. (Irvine, CA, EE. UU.). El azoximetano (AOM) se compró a FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japón). El anti-ratón PD-L1 (anti-PD-L1) se compró a Bio X Cell. FITC anti-ratón CD4, APC anti-ratón CD3, PE/cianina7 anti-ratón CD8a y PE anti-ratón FOXP3 se compraron a BioLegend (San Diego, EE. UU.). Los anticuerpos contra los marcadores de superficie celular (proteína de la caja de movilidad alta 1 (HMGB1) y calreticulina (CRT)) se obtuvieron de Boster Biological Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Las células CT26, las células NCM460 y las células Raw264.7 se obtuvieron de Boster Biological Technology Co., Ltd. (Wuhan, China).

Los ratones ICR, los ratones C57BL/6 y los ratones Balb/c fueron proporcionados por SPF (Pekín) Biotechnology Co., Ltd. (Pekín, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Chengdu Medical College (Permiso No. 2023-044) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio, así como con la norma nacional para el entorno y las instalaciones de animales de laboratorio (GB 14925-2023). Los ratones fueron sacrificados por inhalación de 40% de CO2.

Preparación y caracterización de HA@Cel/NP

El PAPE-SA-CD se sintetizó siguiendo nuestro método establecido.^[7] Los procedimientos detallados se pueden encontrar en los Materiales Suplementarios. La síntesis de HA-AD se detalla en los Materiales Suplementarios.

Disuelva 2 mg de Cel y 20 mg de PAPE-SA-CD en 2 mL de DMSO con sonicación con agitación. Disuelva 10 mg de HA-AD en 10 mL de agua de ósmosis inversa (RO). Luego, agregue lentamente la solución de DMSO por goteo a la solución de agua y agite durante 2 horas. Transfiera la solución a una bolsa de diálisis (MWCO 3000, Millipore) y dialice para eliminar el DMSO. Filtre a través de un filtro de 0,45 μm para obtener el producto.

Utilizamos la dispersión de luz dinámica (DLS) con un Nanosizer ZS90 (Malvern, Reino Unido) para determinar los diámetros hidrodinámicos (nm), el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta (mV) de HA@Cel/NP. La morfología de HA@Cel/NP se evaluó utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM 1200X, JEOL, Japón). Además, realizamos análisis de difracción de rayos X (XRD) en todos los polímeros utilizando un difractómetro de rayos X (D8 Advance, BRUKER, Alemania) en el rango de 5 ° a 90 °. Además, monitoreamos la estabilidad de HA@Cel/NP durante un período de almacenamiento de 14 días midiendo sus diámetros hidrodinámicos, PDI y potenciales zeta.

El análisis HPLC se llevó a cabo para evaluar la eficiencia de encapsulación (EE) y la eficiencia de carga (LE) de HA@Cel/NP para Cel. Las condiciones HPLC para la cuantificación de Cel se establecieron siguiendo nuestro método informado anteriormente.^[32] Los detalles se proporcionan en los Materiales Suplementarios (Figura S1). Se utilizó la siguiente fórmula para calcular EE y LE:

La sensibilidad dual a ROS/enzimas de HA@Cel/NP

La sensibilidad de HA@Cel/NP a la oxidación o las enzimas se investigó en diversas condiciones.^[26] HA@Cel/NP se expuso a soluciones de 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa, seguido de agitación a 100 rpm a 37 °C durante 24 horas. Posteriormente, los diámetros promedio de partículas de HA@Cel/NP se midieron utilizando DLS, y sus morfologías se examinaron utilizando TEM después del período de incubación.

Liberación in vitro de fármacos

Para evaluar el perfil de liberación de HA@Cel/NPs, utilizamos la técnica de diálisis.^[33] Cel libre y HA@Cel/NPs (la concentración de Cel fue de 0,2 mg/mL) se dispersaron secuencialmente en varios fluidos digestivos simulados para imitar el proceso completo de digestión. Este proceso implicó la liberación durante un período de 0 a 2 h en fluido gástrico simulado (SGF, pH 1,2), de 2 a 6 h en fluido intestinal simulado (SIF, pH 6,8) y de 6 a 48 h en fluido cólico simulado (SCF, pH 7,4) con Tween-80 incorporado (0,5% p/v) en el medio de liberación (30 mL). Además, se introdujeron individualmente 3 mL de cada muestra en bolsas de diálisis con un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 3000. En intervalos especificados, retiramos 1 mL de la solución simulada y lo reponemos con un volumen igual de solución fresca. La concentración de Cel se midió mediante HPLC.

Adicionalmente, se introdujeron 3 mL de HA@Cel/NPs en las bolsas de diálisis con un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 3000. Posteriormente, se incubaron en PBS a pH 7,4 (que contiene 0,5% (p/v) de Tween-80) a 37°C durante 48 h, con o sin la presencia de 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa, para investigar las propiedades de liberación de Cel en HA-AD/PAPE-SA-CD-NPs en el colon.

Actividad antiinflamatoria in vitro, polarización de macrófagos y perfiles de captación celular

Para investigar los efectos antiinflamatorios in vitro y la polarización de macrófagos de HA@Cel/NPs, se utilizaron células Raw264.7 inducidas por LPS como modelo celular. Brevemente, los macrófagos Raw264.7 se sembraron en placas de 12 pocillos e incubaron durante la noche. Posteriormente, se cocultivaron durante 12 h con varias preparaciones de Cel (Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, todas conteniendo 0,5 µg/mL de Cel). Después de esto, las células se lavaron con PBS y se expusieron a LPS (1 µg/mL) durante 3 h. Finalmente, se evaluaron los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-1β) en el sobrenadante utilizando los kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) correspondientes, según las instrucciones del fabricante.

Para investigar el potencial de HA@Cel/NPs para inducir un cambio de macrófagos hacia el fenotipo M2, se realizó un análisis de inmunofluorescencia (IF).^[34] Se utilizaron anticuerpos primarios dirigidos contra CD206 (M2) y CD86 (M1), y DAPI para la tinción nuclear. Los niveles de expresión de proteínas se evaluaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser (CLSM; Nikon A1R+SIM; Nikon, Tokio, Japón).

La captación celular de NPs cargadas con fármacos se determinó utilizando C6 encapsulado, C6 libre, C6/NPs y HA@C6/NPs. Se utilizaron células Raw264.7 como células modelo, y se realizó un análisis cuantitativo y cualitativo de la captación celular de fármacos. Se utilizó CLSM para analizar cualitativamente la captación celular. Las células Raw264.7 se cultivaron en un plato confocal durante la noche y se añadieron Cel libre, C6/NPs, HA@C6/NPs y HA@C6/NPs+HA (HA incubada durante 2 h por adelantado) durante 4 h. Se retiró el medio de cultivo y se lavó tres veces con PBS. Posteriormente, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min y se tiñeron con DAPI durante 15 min. Finalmente, se analizaron las células mediante CLSM.

Además, se utilizó citometría de flujo (FCM; NovoCyte; ACEA, San Diego, CA) para analizar cuantitativamente la captación celular. Las células Raw264.7 se cultivaron durante 24 h en placas de 6 pocillos. En el estudio dependiente del tiempo, se añadió HA@C6/NPs (concentraciones de Cel de 100 ng/mL) a las placas de 6 pocillos y se incubó durante diferentes tiempos (0,25, 0,5, 1, 2, 4 h), respectivamente. En el estudio dependiente de la concentración, se añadieron varias concentraciones de HA@C6/NPs (25, 50, 100, 150, 200 ng/mL) y se incubó durante 4 h. Además, las células Raw264.7 también se trataron con diferentes formulaciones (Cel libre, C6/NPs, HA@C6/NPs y HA@C6/NPs+HA (incubado durante 2 h por adelantado)) durante 4 h. Por último, se midió el contenido de fluorescencia mediante FCM.

Actividad antitumoral in vitro y perfiles de captación celular

Para evaluar la biocompatibilidad del material, realizamos un ensayo CCK8 en células CT26. Se tomaron células CT26 y se inocularon en placas de 96 pocillos durante la noche. Se cocultivaron diferentes concentraciones de PAPE-SA-CD o PAPE-SA-CD/HA-AD con las células. Para evaluar la seguridad y selectividad de las formulaciones, se evaluó la citotoxicidad de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs contra células epiteliales colónicas humanas normales (NCM460) utilizando el ensayo CCK-8. Brevemente, se sembraron células NCM460 en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. Luego, se trataron las células con varias concentraciones (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 µg/mL, en función de la concentración de Cel) de las formulaciones indicadas durante 24 h. Además, en el estudio de la citotoxicidad del fármaco, se incubaron células CT26 con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs a diferentes concentraciones de Cel (0,45, 0,90, 1,80, 3,60, 5,40, 7,20 µg/mL) durante 48 h, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó utilizando un kit de ensayo CCK8 estándar.

Se inocularon uniformemente células CT26 en placas de doce pocillos a 2×105 células por pocillo y se cultivaron con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs (el contenido de Cel es de 1 µg/mL) durante 24 h. Posteriormente, las células se disociaron en suspensiones de células individuales y se etiquetaron con Annexin V-Alexa Fluor488/PI. Finalmente, se recogieron las células para el análisis FCM utilizando un instrumento NovoCyte (ACEA, San Diego, CA).

Se utilizaron células CT26 como modelo de células de carcinoma de colon y el proceso de captación celular es consistente en las células Raw264.7.

Imagen in vivo y ex vivo

Se formularon NPs cargadas con DiR para permitir el seguimiento de fluorescencia en tiempo real in vivo y ex vivo, incluyendo DiR libre, DiR/NPs y HA@DiR/NPs.^[35] Los ratones con modelo CAC inducido por AOM/DSS (AOM, 10 mg/kg; DSS, 2,5%, p/v) se dividieron aleatoriamente en tres grupos, incluyendo DiR libre, DiR/NPs y HA@DiR/NPs (la concentración de DiR fue de 3 mg/kg). Se fotografiaron los ratones en diferentes momentos (6, 12 y 24 h) con el sistema IVIS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). Después de administrar los fármacos durante 24 h, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron imágenes del intestino delgado, el ciego, los segmentos del colon y los órganos principales. La cuantificación de la imagen de fluorescencia se realizó utilizando el software IVIS Living Image, y los resultados se informaron como radiancia media (p/s/cm2/sr).

Propiedades objetivo in vivo

Los ratones con modelo CAC se dividieron aleatoriamente en tres grupos, incluyendo Cel libre, C6/NPs y HA@C6/NPs (la concentración de C6 fue de 5 mg/kg). Después de 12 h, se recogieron los colones y se sumergieron en 4% de paraformaldehído durante 20 min y se cortaron en secciones de 8 µm de grosor. Se lavaron con PBS durante 5 min y se tiñeron con DAPI durante 15 min. Finalmente, se observó la fluorescencia en el colon mediante CLSM.

Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra la CU

Los ratones ICR macho se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (n=6), con un grupo sirviendo como control (salina) y los cuatro grupos restantes recibiendo 3% (p/v) de DSS durante 7 días para inducir el modelo de ratón con CU. Desde el día 3 hasta el día 10, se administraron por vía oral diferentes preparaciones diariamente a los ratones, incluyendo Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, a una dosis de Cel de 2 mg/kg por día. Estas formulaciones se prepararon dispersando el polvo de HA@Cel/NPs y Cel/NPs liofilizado en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4), seguida de una suave sonicación para obtener una suspensión homogénea. Para el grupo de control de Cel libre, primero se disolvió Cel en una cantidad mínima de DMSO y luego se diluyó con PBS estéril que contenía 10% de PEG400 para alcanzar la concentración de inyección final, manteniendo el contenido de disolvente orgánico final por debajo del 5% para evitar la toxicidad sistémica. El grupo de control recibió agua potable normal, mientras que el grupo modelo recibió la misma cantidad de solución salina. Se pesaron los ratones diariamente y se registraron el índice de masa corporal, la forma de las heces y el sangrado para evaluar el índice de actividad de la enfermedad (DAI) (los criterios de puntuación se detallan en la Tabla S1). Al final del experimento (día 10), se sacrificaron los ratones y se recogieron el colon y los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón). Además, se midió la longitud del colon y el peso del bazo. Finalmente, se tiñeron las secciones de colon con hematoxilina/eosina (H&E) y ácido periódico de Schiff (PAS), respectivamente.

Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra el CAC

Los ratones C57BL/6 se dividieron en 5 grupos: el grupo de control, el grupo modelo, el grupo de Cel libre, el grupo de Cel/NPs y el grupo de HA@Cel/NPs. Los detalles de la preparación de la formulación se describen en la sección "Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra la CU". Se estableció un modelo de ratón CAC in vivo en ratones C57BL/6 utilizando el método AOM y DSS.^[36] En detalle, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con AOM a una dosis de 10 mg/kg y se mantuvo durante 7 días. Posteriormente, los ratones recibieron tres ciclos de tratamiento con DSS, cada uno de los cuales consistió en 7 días de DSS al 2,5% (p/v) en agua potable, seguido de un período de recuperación de 14 días con agua normal. Después del tercer ciclo de DSS, los ratones se cambiaron a agua potable normal y recibieron la administración oral de diferentes formulaciones (Cel libre, Cel/NPs o HA@Cel/NPs) a una dosis de Cel de 2 mg/kg cada dos días durante 21 días consecutivos (es decir, en los días 1, 3, 5, 21 después de la suspensión de DSS). Se documentaron los pesos corporales semanalmente durante toda la duración del experimento. Al final del tratamiento (día 70), se recogieron los colones y los órganos principales para el análisis histológico, y las cantidades y los tamaños de los tumores en cada grupo experimental se sometieron a un examen estadístico. Para la evaluación histológica, se tiñeron las secciones de colon con H&E para evaluar la morfología general, la infiltración de células inflamatorias y el daño tisular. Además, se realizó una tinción inmunohistoquímica (IHC) para Ki-67 (un marcador de la proliferación celular) en las secciones de colon para evaluar la actividad proliferativa de las células epiteliales. Los órganos principales también se procesaron para la tinción con H&E para evaluar la bioseguridad sistémica de los tratamientos.

Terapia combinada in vivo de HA@Cel/NPs con anti-PD-L1

Los ratones Balb/c recibieron una inyección subcutánea de 100 µL de suspensión celular que contenía 1×107 células CT26 en la región de la ingle derecha. Después de 7-10 días después de la inyección, los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3. Posteriormente, los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6): (i) salina (control), (ii) Cel libre, (iii) Cel/NPs, (iv) HA@Cel/NPs y (v) HA@Cel/NPs + anti-PD-L1. Para los grupos de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, las formulaciones correspondientes se administraron por vía intravenosa cada dos días a una dosis de Cel de 3 mg/kg, para un total de siete inyecciones (en los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13). Para el grupo de combinación (HA@Cel/NPs + anti-PD-L1), se administró HA@Cel/NPs por vía intravenosa a la misma dosis y según el mismo programa que se describió anteriormente, mientras que se administró anti-PD-L1 por vía intraperitoneal a 5 mg/kg en los días 3, 6 y 9 (tres dosis en total).^[28],^[37] El grupo de control recibió el mismo volumen de salina. Se monitorizó el volumen tumoral cada dos días durante el período de tratamiento, y se sacrificaron todos los ratones en el día 14 para un análisis posterior. Los detalles de la preparación de la formulación se describen en la sección 2.9. Se evaluó el volumen tumoral cada 2 días durante el tratamiento utilizando un calibrador y, posteriormente, se calculó. También se registró el cambio de peso corporal. Después de un período de tratamiento de 14 días, se sacrificaron los ratones y se retiraron los tumores y los órganos principales para un análisis posterior. Los tumores recolectados se fotografiaron y pesaron inmediatamente. Se realizó una tinción con H&E para evaluar la morfología tumoral general y las áreas necróticas. Además, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) contra HMGB1 (proteína de unión al ADN de alta movilidad del grupo 1) y CRT (calreticulina) en las secciones tumorales para evaluar la expresión de los marcadores relacionados con la muerte celular inmunogénica (ICD). Los órganos principales también se procesaron para la tinción con H&E para evaluar la bioseguridad sistémica de los tratamientos.

Para evaluar la respuesta inmune antitumoral, se recolectaron tejidos tumorales y de bazo y se procesaron para preparar suspensiones de células individuales. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo (FCM) y los datos se procesaron con el software FlowJo. Se calcularon los porcentajes de células T CD8⁺ y CD4⁺, y se determinó la proporción de células Foxp3⁺ dentro de la población de células T CD4⁺ para evaluar la respuesta de las células T reguladoras.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10. Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t de Student de dos colas no pareada. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey para las comparaciones en un único punto temporal, mientras que se aplicó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni para los datos de medidas repetidas. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05, con niveles de significación indicados como *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001.

Materiales

Celastrol (Cel) se adquirió de Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). 4-(hidroximetil) ácido fenilborónico (PAPE), anhídrido succínico (SA) y cumarina-6 (C6) se compraron a Aladdin Reagent Co., Ltd. (Shanghái, China). Ácido 1-adamantanocarboxílico (AD) fue proporcionado por Adamas (Shanghái, China). Ácido hialurónico (HA, PM 8 kDa) se compró a Freda Biochem Co., Ltd. (Shandong, China). Mono-(6-amino-6-desoxi)-beta-ciclodextrina (6-NH2-β-CD) se obtuvo de Shandong Binzhou Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd. (Shandong, China). El colorante carbocianina lipofílica de infrarrojo cercano 1,10-dioctadeciltetrametil indotricarboianina yoduro (DiR) fue suministrado por Mellon, Biological Technology Co., Ltd. (Dalian, China). Sulfato de dextrano sódico (DSS, grado para colitis, PM 36–50 kDa) fue proporcionado por MP Biomedicals Inc. (Irvine, CA, EE. UU.). Azoximetano (AOM) se compró a FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japón). Anti-ratón PD-L1 (anti-PD-L1) se compró a Bio X Cell. FITC anti-ratón CD4, APC anti-ratón CD3, PE/Cianina7 anti-ratón CD8a y PE anti-ratón FOXP3 se compraron a BioLegend (San Diego, EE. UU.). Anticuerpos contra marcadores de superficie celular (proteína de la caja de movilidad alta 1 (HMGB1) y calreticulina (CRT)) se obtuvieron de Boster Biological Technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Las células CT26, las células NCM460 y las células Raw264.7 se obtuvieron de Boster Biological Technology Co., Ltd. (Wuhan, China).

Los ratones ICR, los ratones C57BL/6 y los ratones Balb/c fueron proporcionados por SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. (Pekín, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Colegio de Medicina de Chengdu (Permiso n.º 2023–044) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio, así como con la norma nacional para el entorno y las instalaciones de animales de laboratorio (GB 14925–2023). Los ratones fueron sacrificados por inhalación de 40% de CO2.

Preparación y caracterización de HA@Cel/NPs

El PAPE-SA-CD se sintetizó siguiendo nuestro método establecido.^[7] Los procedimientos detallados se pueden encontrar en los Materiales Suplementarios. La síntesis de HA-AD se describe en los Materiales Suplementarios.

Disolver 2 mg de Cel y 20 mg de PAPE-SA-CD en 2 mL de DMSO con sonicación en vórtice. Disolver 10 mg de HA-AD en 10 mL de agua de ósmosis inversa (RO). Luego, agregar lentamente la solución de DMSO por goteo a la solución de agua y agitar durante 2 horas. Transferir la solución a una bolsa de diálisis (MWCO 3000, Millipore) y dializar para eliminar el DMSO. Filtrar a través de un filtro de 0,45 μm para obtener el producto.

Utilizamos dispersión de luz dinámica (DLS) con un Nanosizer ZS90 (Malvern, Reino Unido) para determinar los diámetros hidrodinámicos (nm), el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta (mV) de HA@Cel/NPs. La morfología de HA@Cel/NPs se evaluó utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM 1200X, JEOL, Japón). Además, realizamos un análisis de difracción de rayos X (XRD) en todos los polímeros utilizando un difractómetro de rayos X (D8 Advance, BRUKER, Alemania) en el rango de 5 ° a 90 °. Además, monitoreamos la estabilidad de HA@Cel/NPs durante un período de almacenamiento de 14 días midiendo sus diámetros hidrodinámicos, PDI y potenciales zeta.

El análisis HPLC se realizó para evaluar la eficiencia de encapsulación (EE) y la eficiencia de carga (LE) de HA@Cel/NPs para Cel. Las condiciones HPLC para la cuantificación de Cel se establecieron siguiendo nuestro método previamente publicado.^[32] Los detalles se proporcionan en los Materiales Suplementarios (Figura S1). Se utilizó la siguiente fórmula para calcular EE y LE:

La sensibilidad dual de HA@Cel/NPs a ROS/enzimas

Se investigó la sensibilidad de HA@Cel/NPs a la oxidación o enzimas en diversas condiciones.^[26] HA@Cel/NPs se expusieron a soluciones de 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa, seguidas de agitación a 100 rpm a 37 °C durante 24 horas. Posteriormente, se midieron los diámetros promedio de partículas de HA@Cel/NPs utilizando DLS y se examinaron sus morfologías utilizando TEM después del período de incubación.

Liberación in vitro de fármacos

Para evaluar el perfil de liberación de HA@Cel/NPs, utilizamos la técnica de diálisis.^[33] Cel libre y HA@Cel/NPs (concentración de Cel de 0,2 mg/mL) se dispersaron secuencialmente en varios fluidos digestivos simulados para imitar el proceso de digestión completo. Este proceso implicó la liberación de 0 a 2 horas en fluido gástrico simulado (SGF, pH 1,2), de 2 a 6 horas en fluido intestinal simulado (SIF, pH 6,8) y de 6 a 48 horas en fluido cólico simulado (SCF, pH 7,4) con Tween-80 incorporado (0,5% p/v) en el medio de liberación (30 mL). Además, se introdujeron individualmente 3 mL de cada muestra en bolsas de diálisis (MWCO 3000) y se dializaron. A intervalos especificados, retiramos 1 mL de la solución simulada y lo rellenamos con un volumen igual de solución fresca. La concentración de Cel se midió mediante HPLC.

Además, se introdujeron 3 mL de HA@Cel/NPs en las bolsas de diálisis con un corte molecular (MWCO) de 3000. Posteriormente, se incubaron en PBS a pH 7,4 (que contiene 0,5% (p/v) de Tween-80) a 37 °C durante 48 horas, ya sea con o sin la presencia de 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa, para investigar las propiedades de liberación de Cel en HA-AD/PAPE-SA-CD-NPs en el colon.

Actividad antiinflamatoria in vitro, polarización de macrófagos y perfiles de captación celular

Con el fin de investigar los efectos antiinflamatorios y de polarización de macrófagos in vitro de HA@Cel/NPs, se utilizaron células Raw264.7 inducidas por LPS como modelo celular. Brevemente, se sembraron macrófagos Raw264.7 en placas de 12 pocillos e incubaron durante la noche. Posteriormente, se cocultivaron durante 12 horas con diversas preparaciones de Cel (Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, todas que contienen 0,5 µg/mL de Cel). Después de esto, las células se lavaron con PBS y se expusieron a LPS (1 µg/mL) durante 3 horas. Finalmente, se evaluaron los niveles de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-1β) en el sobrenadante utilizando los kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) correspondientes según las instrucciones del fabricante.

Para investigar el potencial de HA@Cel/NPs para inducir un cambio de macrófagos hacia el fenotipo M2, se realizó un análisis de inmunofluorescencia (IF).^[34] Se utilizaron anticuerpos primarios dirigidos a CD206 (M2) y CD86 (M1) y DAPI para la tinción nuclear. Se evaluaron los niveles de expresión de proteínas utilizando un microscopio confocal de escaneo láser (CLSM; Nikon A1R+SIM; Nikon, Tokio, Japón).

La captación celular de nanopartículas cargadas con fármacos se determinó utilizando C6 encapsulado, C6 libre, C6/NPs y HA@C6/NPs. Se utilizaron células Raw264.7 como células modelo y se realizó un análisis cuantitativo y cualitativo de la captación celular de fármacos. Se utilizó CLSM para analizar cualitativamente la captación celular. Se cultivaron células Raw264.7 en un plato confocal durante la noche y se añadieron C6 libre, C6/NPs y HA@C6/NPs y HA@C6/NPs+HA (HA incubada durante 2 horas por adelantado) durante 4 horas. Se retiró el medio de cultivo y se lavó tres veces con PBS. Posteriormente, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos y se tiñeron con DAPI durante 15 minutos. Finalmente, se analizaron las células mediante CLSM.

Además, se utilizó citometría de flujo (FCM; NovoCyte; ACEA, San Diego, CA) para analizar cuantitativamente la captación celular. Se cultivaron células Raw264.7 durante 24 horas en placas de 6 pocillos. En el estudio dependiente del tiempo, se añadió HA@C6/NPs (concentraciones de C6 de 100 ng/mL) a las placas de 6 pocillos e incubó durante diferentes tiempos (0,25, 0,5, 1, 2, 4 horas), respectivamente. En el estudio dependiente de la concentración, se añadieron varias concentraciones de HA@C6/NPs (25, 50, 100, 150, 200 ng/mL) e incubó durante 4 horas. Además, las células Raw264.7 también se trataron con diferentes formulaciones (C6 libre, C6/NPs, HA@C6/NPs y HA@C6/NPs+HA (incubadas durante 2 horas por adelantado)) durante 4 horas. Por último, se midió el contenido de fluorescencia mediante FCM.

Actividad antitumoral in vitro y perfiles de captación celular

Para evaluar la biocompatibilidad del material, realizamos un ensayo CCK8 en células CT26. Se tomaron células CT26 y se sembraron en placas de 96 pocillos durante la noche. Se cocultivaron diferentes concentraciones de PAPE-SA-CD o PAPE-SA-CD/HA-AD con las células. Para evaluar la seguridad y la selectividad de las formulaciones, se evaluó la citotoxicidad de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs contra células epiteliales normales del colon humano (NCM460) utilizando el ensayo CCK-8. Brevemente, se sembraron células NCM460 en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. Luego, las células se trataron con varias concentraciones (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 µg/mL, según la concentración de Cel) de las formulaciones indicadas durante 24 horas. Además, en el estudio de citotoxicidad de fármacos, se incubaron células CT26 con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs a diferentes concentraciones de Cel (0,45, 0,90, 1,80, 3,60, 5,40, 7,20 µg/mL) durante 48 horas, respectivamente. La viabilidad celular se evaluó utilizando un kit de ensayo CCK8 estándar.

Se sembraron uniformemente células CT26 en placas de doce pocillos a 2×105 células en cada pocillo y se cultivaron con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs (contenido de Cel de 1 µg/mL) durante 24 horas. Posteriormente, las células se disociaron en suspensiones de células individuales y se etiquetaron con Annexin V-Alexa Fluor488/PI. Finalmente, se recolectaron las células para el análisis FCM utilizando un instrumento NovoCyte (ACEA, San Diego, CA).

Se utilizaron células CT26 como células modelo de carcinoma de colon y el proceso de captación celular es consistente en las células Raw264.7.

Imagen in vivo y ex vivo

Se formularon nanopartículas cargadas con DiR para permitir el seguimiento de fluorescencia en tiempo real in vivo y ex vivo, que incluyen DiR libre, DiR/NPs y HA@DiR/NPs.^[35] Los ratones con modelo de CAC inducido por AOM/DSS (AOM, 10 mg/kg; DSS, 2,5%, p/v) se dividieron aleatoriamente en tres grupos, que incluyen DiR libre, DiR/NPs y HA@DiR/NPs (la concentración de DiR fue de 3 mg/kg). Se fotografiaron los ratones en diferentes momentos (6, 12 y 24 horas) con el sistema IVIS (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.). Los ratones se sacrificaron después de administrar los fármacos durante 24 horas y luego se obtuvieron imágenes del intestino delgado, el ciego, los segmentos del colon y los órganos principales. La cuantificación de la imagen de fluorescencia se realizó utilizando el software IVIS Living Image, y los resultados se informaron como radiancia media (p/s/cm2/sr).

Propiedades de orientación in vivo

Los ratones con modelo de CAC se dividieron aleatoriamente en tres grupos, que incluyen C6 libre, C6/NPs, HA@C6/NPs (la concentración de C6 fue de 5 mg/kg). Después de 12 horas, se recolectaron los colones y se sumergieron en 4% de paraformaldehído durante 20 minutos y se cortaron en secciones de 8 µm de grosor. Se lavaron con PBS durante 5 minutos y se tiñeron con DAPI durante 15 minutos. Finalmente, se observó la fluorescencia en el colon mediante CLSM.

Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra la CU

Se asignaron aleatoriamente ratones ICR machos a cinco grupos (n=6), siendo un grupo el control (solución salina) y los cuatro grupos restantes recibieron un 3% (p/v) de DSS durante 7 días para inducir el modelo de colitis ulcerosa en ratones. Desde el día 3 hasta el día 10, se administraron por vía oral diferentes preparaciones diariamente a los ratones, incluyendo Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, a una dosis de Cel de 2 mg/kg por día. Estas formulaciones se prepararon dispersando el polvo liofilizado de HA@Cel/NPs y Cel/NPs en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7.4), seguido de una suave sonicación para obtener una suspensión homogénea. Para el grupo control de Cel libre, primero se disolvió Cel en una cantidad mínima de DMSO y luego se diluyó con PBS estéril que contenía un 10% de PEG400 para alcanzar la concentración final de inyección, manteniendo el contenido final de disolvente orgánico por debajo del 5% para evitar la toxicidad sistémica. El grupo control recibió agua potable normal, mientras que el grupo modelo fue tratado con la misma cantidad de solución salina. Se pesaron los ratones diariamente y se registraron el índice de masa corporal, la forma de las heces y la presencia de sangrado para evaluar el índice de actividad de la enfermedad (DAI) (los criterios de puntuación se detallan en la Tabla S1). Al final del experimento (día 10), se sacrificaron los ratones y se recolectaron el colon, así como los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón). Además, se midió la longitud del colon y el peso del bazo. Finalmente, se tiñó el tejido del colon con hematoxilina/eosina (H&E) y ácido periódico de Schiff (PAS), respectivamente.

Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra la colitis asociada a cáncer

Los ratones C57BL/6 se dividieron en 5 grupos: el grupo control, el grupo modelo, el grupo de Cel libre, el grupo de Cel/NPs y el grupo de HA@Cel/NPs. Los detalles de la preparación de la formulación se describen en la sección "Efecto terapéutico in vivo de HA@Cel/NPs contra la colitis ulcerosa". Se estableció un modelo de ratón con colitis asociada a cáncer en ratones C57BL/6 utilizando el método AOM y DSS.^[36] En detalle, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con AOM a una dosis de 10 mg/kg y se mantuvo durante 7 días. Posteriormente, los ratones recibieron tres ciclos de tratamiento con DSS, cada uno de los cuales consistió en 7 días de DSS al 2,5% (p/v) en agua potable, seguido de un período de recuperación de 14 días con agua normal. Después del tercer ciclo de DSS, los ratones se cambiaron a agua potable normal y recibieron administración oral de diferentes formulaciones (Cel libre, Cel/NPs o HA@Cel/NPs) a una dosis de Cel de 2 mg/kg cada dos días durante 21 días consecutivos (es decir, en los días 1, 3, 5, 21 después de la suspensión del DSS). Los pesos corporales se documentaron semanalmente durante toda la duración del experimento. Al finalizar el tratamiento (día 70), se recolectaron los colones y los principales órganos para el análisis histológico, y las cantidades y distribuciones de tamaño de los tumores en cada grupo experimental se sometieron a un examen estadístico. Para la evaluación histológica, se tiñeron secciones de colon con H&E para evaluar la morfología general, la infiltración de células inflamatorias y el daño tisular. Además, se realizó una tinción inmunohistoquímica (IHC) para Ki-67 (un marcador de proliferación celular) en secciones de colon para evaluar la actividad proliferativa de las células epiteliales. Los principales órganos también se procesaron para la tinción con H&E para evaluar la bioseguridad sistémica de los tratamientos.

Terapia combinada in vivo de HA@Cel/NPs con anti-PD-L1

Los ratones Balb/c recibieron una inyección subcutánea de 100 μL de suspensión celular que contenía 1 × 107 células CT26 en la región de la ingle derecha. Después de 7 a 10 días posteriores a la inyección, los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm3. Posteriormente, los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 6): (i) solución salina (control), (ii) Cel libre, (iii) Cel/NPs, (iv) HA@Cel/NPs y (v) HA@Cel/NPs + anti-PD-L1. Para los grupos de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, las formulaciones correspondientes se administraron por vía intravenosa cada dos días a una dosis de Cel de 3 mg/kg, para un total de siete inyecciones (en los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13). Para el grupo de combinación (HA@Cel/NPs + anti-PD-L1), HA@Cel/NPs se administró por vía intravenosa a la misma dosis y según el mismo programa que se describió anteriormente, mientras que anti-PD-L1 se administró por vía intraperitoneal a 5 mg/kg en los días 3, 6 y 9 (tres dosis en total).^[28],^[37] El grupo control recibió el mismo volumen de solución salina. El volumen tumoral se controló cada dos días durante todo el período de tratamiento, y todos los ratones fueron sacrificados en el día 14 para un análisis posterior. Los detalles de la preparación de la formulación se describen en la Sección 2.9. El volumen tumoral se evaluó cada 2 días durante el tratamiento utilizando un calibrador y, posteriormente, se calculó. También se registró el cambio de peso corporal. Después de un período de tratamiento de 14 días, se sacrificaron los ratones y se retiraron los tumores y los principales órganos para un análisis posterior. Los tumores recolectados se fotografiaron y pesaron inmediatamente. Se realizó una tinción con H&E para evaluar la morfología general del tumor y las áreas necróticas. Además, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) contra HMGB1 (proteína de unión al ADN de alta movilidad del grupo 1) y CRT (calreticulina) en secciones de tumor para evaluar la expresión de los marcadores relacionados con la muerte celular inmunogénica (ICD). Los principales órganos también se procesaron para la tinción con H&E para evaluar la bioseguridad sistémica de los tratamientos.

Para evaluar la respuesta inmune antitumoral, se recolectaron y procesaron los tejidos tumorales y del bazo para preparar suspensiones de células individuales. Las células teñidas se analizaron utilizando FCM, y los datos se procesaron con el software FlowJo. Se calcularon los porcentajes de células T CD8⁺ y CD4⁺, y se determinó la proporción de células Foxp3⁺ dentro de la población de células T CD4⁺ para evaluar la respuesta de las células T reguladoras.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10. Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t de Student de dos colas no pareada. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey para las comparaciones en un solo punto temporal, mientras que se aplicó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni para los datos de medidas repetidas. Se consideró que un valor de P < 0,05 era estadísticamente significativo, y los niveles de significación se denotaron como *P < 0,05, P < 0,01 y *P < 0,001.

Resultados

Caracterización de HA@Cel/NPs

Los espectros de hidrógeno sintéticos de PAPE-SA-CD y HA-AD se presentan en las Figuras S2 y S3, respectivamente. Los HA@Cel/NPs se prepararon según un método de nanoprecipitación.^[38] Los resultados experimentales muestran que el tamaño promedio de partícula de HA@Cel/NPs es de aproximadamente 76,87 ± 2,65 nm, y el PDI es de aproximadamente 0,166 ± 0,012 (Figura 1A). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que los HA@Cel/NPs exhibían una morfología esférica con superficies lisas (Figura S4). Además, en comparación con Cel/NPs, los HA@Cel/NPs exhibieron una eficiencia de encapsulación (EE) ligeramente mayor (90,85 ± 3,69% frente a 88,37 ± 4,36%) (Tabla S2), lo que podría atribuirse a la formación de la capa de HA que minimizó la pérdida de fármaco durante la purificación. El recubrimiento exitoso de HA se confirmó mediante el aumento del tamaño de partícula y el cambio del potencial zeta de -15,5 mV a -24,7 mV (Figura 1B). Se realizó un análisis de difracción de rayos X (XRD) para estudiar el efecto de la interacción fármaco-soporte sobre las características de liberación del fármaco. Hay múltiples picos entre 5° y 90° en Cel libre, lo que indica que su cristalinidad es alta. Pero estos picos no se observan en HA@Cel/NPs, lo que indica que no hay un complejo cristalino entre Cel y la matriz (Figura 1C). Por lo tanto, Cel existe en forma de cristales amorfos o desordenados.

La estabilidad de HA@Cel/NPs

Los resultados de la evaluación de estabilidad después de 14 días de almacenamiento a 4 °C se muestran en la Figura 1D y E. Se pudo observar que el tamaño de partícula, el PDI y el potencial zeta de HA@Cel/NPs no cambiaron mucho. Esto sugiere que HA@Cel/NPs puede mantener propiedades estables durante un período de 14 días.

Evaluación de la sensibilidad a los ROS y a las enzimas de HA@Cel/NPs

La sensibilidad de HA@Cel/NPs a los ROS o a la α-amilasa se verificó utilizando DLS y TEM. Como se muestra en la Figura 1F, la distribución del tamaño y la morfología de HA@Cel/NPs no cambiaron mucho en la solución de PBS. Sin embargo, se observó un aumento del tamaño y la aparición de picos heterogéneos cuando los HA@Cel/NPs se incubaron con 1 mM de H2O2 o 10 UI/mL de α-amilasa durante 24 h. Además, los resultados de TEM mostraron que la presencia de H2O2 o α-amilasa condujo a la fractura de HA@Cel/NPs (Figura 1F), lo que puede deberse a la sensibilidad a los ROS causada por la destrucción de H2O2 o a la sensibilidad a las enzimas bajo la α-amilasa. En consecuencia, se anticipa que HA@Cel/NPs exhibirán monosensibilidad a los ROS o a la α-amilasa.

Perfiles de liberación de HA@Cel/NPs

La liberación de contenidos de Cel libre o HA@Cel/NPs se evaluó a lo largo de todo el tracto gastrointestinal (colocados continuamente en un medio alternativo). La Figura 1G mostró que Cel libre se liberó rápidamente en SGF y SIF con una tasa de liberación acumulativa del 57,73% en 6 h, por lo que se absorbió en gran medida en el estómago y el intestino delgado y se liberó menos en el tejido del colon. En contraste, HA@Cel/NPs exhibió propiedades de liberación más lentas, lo que permitió que el fármaco llegara a su sitio objetivo de manera más completa. Además, la tasa de liberación acumulativa fue del 39,95% después de 48 h. Como resultado de la protección proporcionada por PAPE-SA-CD y HA-AD, HA@Cel/NPs puede transitar eficazmente desde el estómago y el intestino delgado hasta el tejido del colon.

Además, se utilizó la acción sinérgica de los estimuladores de ROS y enzimas para simular el comportamiento de liberación del fármaco en el sitio del colon. El medio de liberación incluyó un tampón de pH 7,4, un tampón de pH 7,4 que contenía 1 mM de H2O2, un tampón de pH 7,4 que contenía 10 UI/mL de α-amilasa y un tampón de pH 7,4 que contenía 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa (Figura 1H). En comparación con el tampón de pH 7,4, la tasa de liberación acumulativa se aceleró significativamente en presencia de H2O2 o α-amilasa, lo que alcanzó el 55,89% y el 68,77% en 6 h, respectivamente. Además, la acción combinada de H2O2 y α-amilasa resultó en una tasa de liberación acumulativa del 71,87% para HA@Cel/NPs en 8 h, lo que representa el nivel más alto. Esto sugiere que la liberación del fármaco de HA@Cel/NPs puede controlarse mediante la estimulación interna de los ROS/enzimas.

Actividad antiinflamatoria in vitro, polarización de macrófagos y perfiles de captación celular de HA@Cel/NPs

Actividad antiinflamatoria de HA@Cel/NPs

El estudio farmacológico de HA@Cel/NPs in vitro se llevó a cabo utilizando macrófagos Raw264.7 inducidos por LPS, como se muestra en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 2A y B, la secreción de las citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β aumentó significativamente en las células tratadas con LPS (control positivo) en comparación con las células de control negativo (P < 0,001). Tanto Cel/NPs como HA@Cel/NPs redujeron significativamente la secreción de TNF-α e IL-1β en comparación con las células de control positivo, lo que indica su actividad antiinflamatoria. Además, el tratamiento con HA@Cel/NPs resultó en concentraciones más bajas de citocinas proinflamatorias que el tratamiento con Cel/NPs, lo que sugiere que HA@Cel/NPs pueden inhibir eficazmente la inflamación a través de macrófagos activados.

Polarización de macrófagos in vitro

Dado que se descubrió que Cel induce la polarización M2 en los macrófagos, el estudio investigó la polarización de HA@Cel/NPs.^[39],^[40] En esta investigación, se evaluaron los niveles de expresión de los marcadores de macrófagos M1 CD86 y los marcadores de macrófagos M2 CD206, como se muestra en la Figura 2C. Los controles positivos exhibieron niveles más altos de CD86 en comparación con los controles negativos, mientras que se observó la tendencia opuesta para CD206. Además, el tratamiento con HA@Cel/NPs aumentó significativamente la expresión de CD206 y redujo la expresión de CD86, lo que indica una facilitación del cambio de macrófagos hacia la polarización M2. Estos resultados sugieren que HA@Cel/NPs podrían inhibir la polarización de macrófagos hacia el tipo M1 y facilitar su transformación en el tipo M2.

Captación celular de HA@Cel/NPs en células Raw264.7

La captación de macrófagos inflamatorios por los fármacos es un aspecto clave del tratamiento de la colitis ulcerosa (CU). En esta investigación, la captación de HA@C6/NPs en células Raw264.7 se analizó cualitativamente mediante microscopía confocal láser (CLSM). Como se muestra en la Figura 2D, la fluorescencia verde del grupo C6/NPs y del grupo HA@C6/NPs fue más intensa que la del grupo C6 libre, lo que sugiere que la captación de fármacos en el sistema de administración es mayor que la del fármaco solo en las células Raw264.7. La fluorescencia del grupo HA@C6/NPs fue más intensa en comparación con el grupo C6/NPs. En consecuencia, se concluyó que el HA es capaz de promover el aumento de la captación celular debido a su fuerte capacidad de direccionamiento activo hacia el CD44. Posteriormente, al comparar los resultados de fluorescencia de HA@C6/NPs con y sin preincubación con HA durante 2 horas, se observó que el grupo con preincubación con HA mostró una intensidad de fluorescencia disminuida. Por lo tanto, el análisis comparativo confirmó que la captación de HA@C6/NPs en las células depende principalmente de la interacción del HA con el receptor CD44, que está altamente expresado en las células Raw264.7.

Además, los resultados del análisis cuantitativo de la captación intracelular de HA@C6/NPs mediante citometría de flujo (FCM) se muestran en la Figura 2E-G. Se observó que la intensidad de fluorescencia en las células Raw264.7 aumentó con el tiempo, lo que indica una captación dependiente del tiempo de HA@C6/NPs in vitro (Figura 2E). Además, a medida que la concentración de HA@C6/NPs aumentó gradualmente de 25 ng/mL a 200 ng/mL, los resultados indicaron una tendencia creciente en la fluorescencia en las células Raw264.7 (Figura 2F). En última instancia, según la Figura 2G, la intensidad de fluorescencia de HA@C6/NPs exhibió el nivel más alto entre todos los grupos. Sin embargo, después de la pre-saturación con HA, la captación de HA@C6/NPs por las células Raw264.7 mostró una tendencia a la disminución, lo que coincidió con los hallazgos de la CLSM. En consecuencia, los hallazgos del análisis de datos de FCM y CLSM indican una robusta capacidad de captación celular in vitro del sistema de administración de fármacos.

Actividad antitumoral in vitro y perfiles de captación celular

Citotoxicidad de HA@Cel/NPs

Para investigar el efecto de los materiales poliméricos y los fármacos sobre la viabilidad celular, se utilizó un ensayo CCK8 para medir la citotoxicidad de las células CT26. Según la Figura 3A, se observó que, en el rango de concentración de 1 µg/mL a 1000 µg/mL probado, las células CT26 mostraron aproximadamente un 100% de actividad, lo que podría demostrar que los materiales de encapsulación elegidos para el experimento tienen una alta seguridad en el rango experimental. La seguridad de las formulaciones se evaluó además en las células NCM460 utilizando el ensayo CCK-8 después de un tratamiento de 24 horas. Como se muestra en la Figura S5, la viabilidad celular de las células NCM460 disminuyó de manera dependiente de la concentración tras el tratamiento con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs. Los valores de CI50 de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs frente a las células NCM460 se determinaron en 0,989, 1,474 y 2,720 µg/mL, respectivamente. Cabe destacar que HA@Cel/NPs exhibió la menor citotoxicidad hacia las células NCM460 entre todas las formulaciones probadas, mientras que Cel libre mostró la mayor citotoxicidad, lo que indica que el recubrimiento de HA redujo eficazmente la toxicidad de los nanocargadores hacia las células epiteliales intestinales normales. Además, en el estudio del fármaco sobre la citotoxicidad, los resultados se muestran en la Figura 3B. Entre todas las formulaciones, Cel libre exhibió la mayor viabilidad celular (es decir, la menor citotoxicidad), mientras que HA@Cel/NPs mostró la menor viabilidad celular (es decir, la mayor citotoxicidad) frente a las células CT26 a concentraciones equivalentes. Las concentraciones inhibitorias medias (CI50) de Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs se determinaron en 5,202, 3,043 y 1,790 µg/mL, respectivamente, lo que indica que HA@Cel/NPs poseía el efecto antiproliferativo más potente sobre las células CT26. Esta mayor citotoxicidad puede atribuirse al direccionamiento activo mediado por HA y a la liberación dual del fármaco, dependiente de enzimas/ROS, lo que facilitó una captación celular eficiente y una liberación intracelular del fármaco bajo demanda.

Cabe señalar que los ensayos de citotoxicidad contra las células NCM460 y CT26 se realizaron con diferentes duraciones de tratamiento (24 horas para NCM460 frente a 48 horas para CT26) en función de las distintas características de crecimiento y los requisitos experimentales de las dos líneas celulares. Por lo tanto, la comparación directa de los valores de CI50 entre las células NCM460 y CT26 debe interpretarse con precaución. No obstante, la tendencia relativa entre las tres formulaciones dentro de cada línea celular demostró de manera consistente que HA@Cel/NPs exhibió la menor citotoxicidad en las células NCM460, al tiempo que mantuvo una potente actividad antitumoral en las células CT26, lo que respalda el perfil de seguridad favorable de nuestro sistema.

Efectos sobre la apoptosis de las células CT26

La apoptosis se detectó utilizando Annexin V-Alexa Fluor488/PI. Como se muestra en la Figura 3C y D, la tasa de apoptosis de las células del grupo de control fue de solo el 0,9%, mientras que la tasa de apoptosis de las células del grupo HA@Cel/NPs fue tan alta como el 54,47%, lo que fue mayor que la del grupo Cel/NPs (37,74%) y el grupo Cel libre (31,92%), en ese orden, lo que indica que el sistema de administración de HA@Cel/NPs tiene una buena capacidad de administración de fármacos y puede aumentar eficazmente la tasa de apoptosis de las células CT26. Además, la tasa de apoptosis del grupo HA@Cel/NPs fue significativamente mayor que la de los otros tres grupos. Por lo tanto, se puede concluir que, en comparación con los otros tres grupos, HA@Cel/NPs exhibe el efecto terapéutico más eficaz sobre los tumores.

Patrones de internalización celular in vitro de HA@C6/NPs en células CT26

La absorción celular de HA@C6/NPs in vitro es la condición de demostración primaria para la curación del cáncer de colon. En este estudio, la captación de HA@C6/NPs en las células CT26 se analizó mediante CLSM y FCM. Los resultados de la captación celular son consistentes con los de las células Raw264.7 (Figura 3E-H). Debido a los altos niveles de expresión del receptor CD44 en las células CT26, la captación de HA@C6/NPs es extensa y sigue un patrón dependiente del tiempo y de la concentración.

Biodistribución de HA@DiR/NPs en ratones con modelo de CAC

La capacidad del sistema de administración para llegar con precisión a las lesiones cólicas en ratones con modelo de CAC fue una base importante para determinar si el sistema de administración puede ejercer su eficacia. En esta investigación, se seleccionó DiR para reemplazar a Cel en el sistema de administración de fármacos, y la intensidad de fluorescencia podría reflejar la capacidad de administración del fármaco. Según la Figura 4A, en comparación con DiR libre, la fluorescencia de DiR/NPs y HA@DiR/NPs fue mucho más fuerte después de 24 horas, lo que podría argumentar que el sistema de administración de fármacos puede prolongar el tiempo de retención del fármaco en el cuerpo. Un análisis semicuantitativo de fluorescencia adicional reveló que la intensidad de fluorescencia de HA@DiR/NPs fue mayor que la del grupo DiR/NPs y significativamente mayor que la del grupo DiR libre (Figura 4B).

Además, según las imágenes de fluorescencia del intestino delgado, el ciego y el colon de los ratones, la intensidad de fluorescencia intestinal fue débil en el grupo DiR libre, lo que significó una rápida eliminación del fármaco libre. Pero la fluorescencia intestinal de DiR/NPs y HA@DiR/NPs fue más fuerte en comparación con el grupo DiR libre, lo que indica que se retuvo más fármaco (Figura 4C y D). Y, además, se observó en la Figura 4D que había la mayor fluorescencia en el grupo HA@DiR/NPs. En el análisis de órganos, el colon exhibió una intensidad de fluorescencia promedio aproximadamente dos órdenes de magnitud mayor que la observada en los principales órganos de los ratones experimentales (Figura 4E y F), lo que demuestra la acumulación dirigida de HA@DiR/NPs en el colon tras la administración oral. Por lo tanto, HA@DiR/NPs puede administrar eficazmente fármacos al sitio tumoral del colon y aumentar la concentración de fármacos en el sitio tumoral de los ratones con CAC.

Dirigimiento al colon de HA@C6/NPs en ratones con modelo de CAC

Para determinar aún más la liberación y la absorción de HA@C6/NPs en ratones con modelo de CAC, se llevó a cabo un experimento de sección congelada del colon murino. Al utilizar CLSM (Figura 4G), la fluorescencia verde del grupo C6 libre fue menos pronunciada en comparación con la del grupo C6/NPs y el grupo HA@C6/NPs; este último exhibió la intensidad de fluorescencia más prominente. Los hallazgos anteriores indican que HA@C6/NPs puede mejorar eficazmente la permeación de C6 a través de la barrera intestinal hacia el tejido del colon y aumentar la probabilidad de su captación por los macrófagos o las células CT26.

Eficacia terapéutica y seguridad de HA@Cel/NPs en un modelo de ratón de CU

Considerando las características fisicoquímicas favorables y el potencial de acumulación en el colon, examinamos la capacidad de la HA@Cel/NPs administrada por vía oral para mitigar los efectos adversos de la colitis ulcerosa aguda inducida por DSS.^[41]

La figura 5A ilustra el proceso de administración en un modelo animal. Las características distintivas de la colitis ulcerosa incluyen un acortamiento del colon y la consiguiente pérdida de peso. Como se muestra en la figura 5B, el peso de los ratones del grupo modelo disminuyó significativamente en comparación con el grupo control a partir del quinto día, y el peso se redujo al 78% al final del experimento. En contraste, la administración oral de formulaciones de Cel atenuó significativamente esta pérdida de peso. En particular, el grupo HA@Cel/NPs mostró una pérdida de peso corporal significativamente menor en comparación con el grupo de Cel libre (P < 0,01), lo que indica que la HA@Cel/NPs ofreció una protección superior contra la pérdida de peso inducida por DSS. Como se muestra en la figura 5C, las puntuaciones DAI de todos los grupos de tratamiento fueron significativamente más bajas que las del grupo modelo. En particular, el grupo Cel/NPs exhibió una puntuación DAI significativamente más baja en comparación con el grupo de Cel libre (P < 0,001), mientras que el grupo HA@Cel/NPs mostró una reducción adicional en comparación con el grupo Cel/NPs (P < 0,05). Estos resultados demuestran que la HA@Cel/NPs ejerció el efecto antiinflamatorio más potente entre todas las formulaciones probadas. Como se muestra en la figura 5D, las fotografías de los colones del grupo HA@Cel/NPs se asemejaron a las de los ratones sanos. El acortamiento del colon es una característica distintiva de la gravedad de la colitis inducida por DSS. Como se muestra en la figura 5E, la longitud del colon en el grupo modelo se redujo significativamente a 5,4 cm en comparación con los 10,0 cm del grupo normal (P < 0,001), lo que indica una grave atrofia del colon. El tratamiento con Cel libre (7,7 cm) y Cel/NPs (7,8 cm) restauró significativamente la longitud del colon en comparación con el grupo modelo (P < 0,001), mientras que el tratamiento con HA@Cel/NPs resultó en una longitud del colon notablemente mayor de 9,0 cm, que fue significativamente más larga que la de los grupos de Cel libre y Cel/NPs (P < 0,001). Estos resultados demuestran que la HA@Cel/NPs previno de manera más efectiva la atrofia del colon inducida por DSS entre todas las formulaciones probadas. El peso del bazo sirve como un indicador confiable de la respuesta inflamatoria sistémica. Como se presenta en la figura 5F, el peso del bazo en el grupo modelo se elevó significativamente a 212,3 mg en comparación con los 149,6 mg del grupo normal (P < 0,001), lo que indica un estado inflamatorio sistémico grave. El tratamiento con Cel libre (180,0 mg) no mostró una diferencia significativa en comparación con el grupo modelo (P > 0,05), mientras que Cel/NPs (160,3 mg) y HA@Cel/NPs (152,5 mg) redujeron significativamente el peso del bazo en comparación con el grupo modelo (P < 0,01). Se utilizó la tinción con H&E para evaluar los cambios patológicos del tejido del colon después de la intervención farmacológica (figura 5G). El tejido del colon del grupo modelo mostró que la estructura de las criptas estaba obviamente destruida, las células caliciformes estaban obviamente reducidas y las células inflamatorias estaban obviamente infiltradas. En comparación con el grupo modelo, los grupos que recibieron diferentes preparaciones de Cel mostraron que la estructura de las criptas estaba protegida y las células caliciformes se restauraron. Además, de acuerdo con la tinción PAS de las células caliciformes del colon en el grupo modelo, las células caliciformes en la estructura de las criptas estaban gravemente dañadas, y las células caliciformes en el grupo de Cel libre, el grupo Cel/NPs y el grupo HA@Cel/NPs mostraron diferentes grados de protección (figura 5H). Sorprendentemente, el grupo HA@Cel/NPs tiene el mejor efecto protector. En general, los hallazgos indican que el efecto terapéutico del grupo HA@Cel/NPs sobre la colitis ulcerosa es superior al de los grupos de Cel libre y Cel/NPs. Por lo tanto, nuestros resultados demostraron que la HA@Cel/NPs tuvo un efecto significativo en la atenuación de la colitis ulcerosa inducida por DSS en ratones. Además, el examen de las secciones de H&E de los órganos primarios no reveló ninguna anomalía o lesión patológica significativa en los órganos principales (figura S6), lo que indica que la HA@Cel/NPs posee una biocompatibilidad sobresaliente y una toxicidad mínima.

Eficacia y seguridad terapéuticas de la HA@Cel/NPs en el modelo de ratón de CAC

El estudio utilizó un modelo murino de CAC inducido por AOM/DSS para evaluar el potencial de la HA@Cel/NPs administrada por vía oral para inhibir la progresión del CAC (figura 6). El modelo animal y el curso de la administración de fármacos se ilustran en la figura 6A. Como se muestra en la figura 6B, al observar la tendencia del cambio de peso corporal de los ratones, se encontró que el peso corporal de los ratones en todos los grupos disminuyó hasta cierto punto en comparación con el del grupo control. Los ratones en el grupo modelo exhibieron una pérdida de peso significativa al final del experimento, alcanzando el 86% de su peso inicial. Después de ser tratados con diferentes preparaciones de Cel, la pérdida de peso de los ratones en los grupos HA@Cel/NPs, Cel/NPs y Cel libre se atenuó significativamente, lo que indica que los tres grupos tuvieron cierto grado de atenuación de la pérdida de peso inducida por AOM/DSS. Además, la imagen en la figura 6C representa una fotografía representativa de los colones, y podemos observar que la mucosa del colon de los ratones en el grupo control estaba libre de congestión y edema, y no mostraba las características de los nódulos tumorales. Sin embargo, la superficie del colon y su interior en el grupo modelo mostraron una congestión mucosa difusa obvia, edema en todo el cuerpo, acompañado del agrandamiento de los nódulos tumorales prominentes. El grupo de Cel libre, el grupo Cel/NPs y el grupo HA@Cel/NPs mostraron diferentes grados de mejora en comparación con el grupo modelo. Lo que fue realmente notable fue que el colon del grupo HA@Cel/NPs no exhibió diferencias discernibles con el del grupo normal, frustrando efectivamente la progresión de la inflamación hacia el cáncer de colon. Además, dado que el grado de atrofia del colon del ratón es uno de los indicadores importantes para observar el grado de transformación de la colitis a cáncer de colon, observamos y registramos el grado de atrofia del colon de cada grupo de ratones. Como se muestra en la figura 6D, la longitud del colon en el grupo modelo (5,2 cm) se redujo significativamente en comparación con el grupo control (8,8 cm, P < 0,001), lo que indica una grave atrofia del colon en el modelo de CAC. El tratamiento con Cel libre (6,5 cm), Cel/NPs (7,3 cm) y HA@Cel/NPs (8,2 cm) atenuó significativamente el acortamiento del colon inducido por AOM/DSS en diferentes grados. En particular, la HA@Cel/NPs exhibió el efecto protector más fuerte entre todos los grupos de tratamiento, restaurando la longitud del colon a niveles casi normales, lo que fue significativamente más largo que el de los grupos de Cel libre y Cel/NPs (P < 0,05). Además, el bazo es el órgano inmunitario periférico más grande del cuerpo, y el índice del bazo del ratón puede reflejar la gravedad de la inflamación como un marcador de los cambios en el estado del sistema inmunitario. Como se muestra en la figura 6E, en comparación con el grupo control, el índice del bazo del grupo modelo fue significativamente mayor (P < 0,001). Sin embargo, después de ser tratados con Cel libre, Cel/NPs y HA@Cel/NPs, el índice del bazo de los ratones mostró diferentes grados de reducción, lo que indicó que nuestros fármacos podrían reducir la inflamación, previniendo aún más la progresión hacia el cáncer de colon.

Además, también observamos y registramos el número total de nódulos tumorales en cada grupo de ratones, y los resultados estadísticos se muestran en la figura 6F. El número total promedio de nódulos tumorales en el grupo modelo alcanzó los 10, mientras que hubo una reducción diferente en cada uno de los grupos de administración de Cel, entre los cuales el número total promedio de nódulos tumorales en el grupo HA@Cel/NPs fue el más pequeño, e incluso se redujo a 2, lo que inhibió mejor la aparición de la transformación de colitis a carcinoma. Analizamos estadísticamente el tamaño de los nódulos tumorales del colon, y los resultados se muestran en la figura 6G. En comparación con el grupo modelo, el número promedio de tumores con tamaños de 3 mm en el grupo HA@Cel/NPs se redujo (P < 0,05), y el número de tumores >3 mm se acercó a 0, lo que indica que el grupo HA@Cel/NPs tuvo el efecto inhibidor sobre la transformación inflamatoria-canceroso del colon de los ratones, y podría inhibir la aparición de la transformación inflamatoria-canceroso del colon.

Además, se evaluó la eficacia de la HA@Cel/NPs utilizando técnicas de tinción con H&E y tinción con Ki67. Como se muestra en la figura 6H, podemos observar que la mucosa del colon de los ratones en el grupo control estaba estructuralmente intacta, con glándulas, criptas y células caliciformes bien dispuestas, y la submucosa no estaba congestionada ni edematosa, sin lesiones ni inflamación. En comparación con el grupo control, el grupo modelo mostró un epitelio mucoso parcialmente defectuoso, infiltración de un gran número de células tumorales, edema mucoso y necrosis extensa de las criptas. El grupo HA@Cel/NPs tuvo el efecto protector más obvio sobre las células epiteliales del colon, con casi ninguna acumulación de células tumorales en la mucosa del colon, ninguna anomalía obvia en la mucosa epitelial y la estructura glandular, un lumen de cripta más intacto, células caliciformes obvias y una reducción en el grado de inflamación y malignidad de los tumores, y una morfología similar a la del grupo control. Los resultados anteriores mostraron que la HA@Cel/NPs tuvo efectos inhibitorios sobre la transformación de colitis a cáncer. Realizamos evaluaciones adicionales de los patrones de proliferación en relación con el CAC utilizando la tinción con Ki67. Los resultados ilustrados en la figura 6H indican que el grupo de ratones tratados con HA@Cel/NPs exhibió un menor número de células Ki67 positivas en comparación con los otros grupos. Además, los resultados de H&E de los órganos principales indicaron la ausencia de irregularidades o daños patológicos notables (figura S7), lo que sugiere que la HA@Cel/NPs exhibe una excelente biocompatibilidad y una toxicidad mínima en los ratones del modelo de CAC.

Terapia combinada de HA@Cel/NPs con anti-PD-L1 en el modelo de ratón de cáncer colorrectal CT26

El uso de bloqueos de puntos de control inmunitarios (anti-PD-L1) puede mejorar la capacidad de los linfocitos T citotóxicos para eliminar los tumores, ofreciendo un tratamiento potencial para varios tipos de cáncer. Investigaciones recientes han demostrado que, cuando se combinan con otras terapias, los bloqueos de PD-1/PD-L1 pueden aumentar significativamente sus efectos inmunoterapéuticos.^[42] Por lo tanto, se anticipa que la combinación de anti-PD-L1 con HA@Cel/NPs podría conducir a resultados positivos en el tratamiento antitumoral. Para verificar esto, evaluamos la eficacia de la HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 en un modelo tumoral CT26, y el procedimiento experimental se ilustra en la figura 7A. Como se muestra en la figura 7B, en el grupo de tratamiento que recibió Cel libre, se observó una ligera disminución del peso del ratón dentro de los 14 días, mientras que el peso de los ratones en los otros grupos se mantuvo estable. Los hallazgos indican que las nanopartículas proporcionadas exhiben una biocompatibilidad específica y no inducen una reducción de peso en los ratones. Como se muestra en la figura 7C, el volumen tumoral en el grupo de solución salina exhibió un aumento rápido y sostenido, alcanzando los 1478 mm3 al final del experimento. En contraste, todos los grupos de tratamiento inhibieron el crecimiento tumoral en diferentes grados. Los volúmenes tumorales medios al final del estudio fueron de 1152 mm3 para el grupo de Cel libre, 998 mm3 para el grupo Cel/NPs, 814 mm3 para el grupo HA@Cel/NPs y 412 mm3 para el grupo de combinación de HA@Cel/NPs y anti-PD-L1. En particular, la terapia de combinación con HA@Cel/NPs y anti-PD-L1 exhibió la eficacia antitumoral más potente. El día 14, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores (figura 7D). Como se muestra en la figura 7E, la tendencia del peso tumoral estuvo de acuerdo con los resultados del volumen tumoral.

Mientras tanto, se utilizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de tejidos tumorales para explorar más a fondo la eficacia antitumoral in vivo. Como se muestra en la Figura 7F, las células tumorales se acumularon densamente en el grupo de solución salina, mientras que en los otros grupos de tratamiento, las células tumorales mostraron estructuras más dispersas y destruidas, y se pudo observar necrosis, especialmente en los grupos HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs + anti-PD-L1. Además, como factores clave para mediar la inmunidad antitumoral específica, se midieron HMGB1 y CRT mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 7G).^[28] En comparación con el grupo de solución salina, los tratamientos con Cel/NPs, HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 aumentaron significativamente los niveles de HMGB1 y CRT en los tumores CT26, lo que indica que desencadenaron las respuestas inmunitarias antitumorales específicas del organismo. Además, el grupo HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 obtuvo los mejores resultados, lo que podría potenciar la capacidad de Cel para inhibir los tumores de manera efectiva y estimular las respuestas inmunitarias antitumorales del organismo para lograr una mayor supresión tumoral. Además, en comparación con el grupo de solución salina, los ratones tratados con Cel libre mostraron alteraciones histopatológicas en el tejido hepático, caracterizadas por la infiltración de células inflamatorias. Sin embargo, los ratones tratados con HA@Cel/NPs + anti-PD-L1, HA@Cel/NPs y Cel/NPs no mostraron cambios patológicos notables en los órganos principales en comparación con el grupo de solución salina, lo que indica una buena biocompatibilidad (Figura S8).

Posteriormente, evaluamos la alteración del microambiente tumoral inmunosupresor en ratones con tumores mediante el examen de los cambios en las células inmunitarias que infiltran el tumor después de un tratamiento de 14 días. Como se muestra en las Figuras S9A-C, se examinó la proporción de CD8+, CD4+ y Tregs en los tejidos del bazo en los diferentes grupos de tratamiento. Las proporciones en el grupo de solución salina fueron 3,04%, 3,32% y 18,7%, respectivamente. En contraste, el grupo de Cel libre mostró 6,23% de CD8+, 10,9% de CD4+ y 10,5% de Tregs. El grupo Cel/NPs mostró un aumento a 8,39% de CD8+, 15,2% de CD4+ y una disminución a 6,94% de Tregs. Cabe destacar que el grupo HA@Cel/NPs demostró una elevación marcada con 14,2% de CD8+, 23,6% de CD4+ y una reducción de Tregs a 4,8%. Además, la combinación de HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 produjo la inmunomodulación más significativa, con 22,6% de CD8+, 31,4% de CD4+ y una disminución drástica de Tregs a 1,70%. Estos resultados indican que, en comparación con los grupos de Cel libre y Cel/NPs, los grupos HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 mejoraron significativamente la expresión de CD8+ y CD4+ en los tejidos del bazo, al tiempo que redujeron las proporciones de Tregs, siendo el último grupo el que mostró los efectos más pronunciados. El análisis de los tejidos tumorales reveló tendencias similares (Figuras S9D-F). En conclusión, el grupo HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 fue capaz de mejorar significativamente el estado inmunosupresor del microambiente tumoral y ejercer una respuesta inmunitaria antitumoral mejorada.

Caracterización de HA@Cel/NPs

Los espectros de hidrógeno sintéticos de PAPE-SA-CD y HA-AD se presentan en las Figuras S2 y S3, respectivamente. Los HA@Cel/NPs se prepararon según un método de nanoprecipitación.^[38] Los resultados experimentales muestran que el tamaño promedio de partícula de HA@Cel/NPs es de aproximadamente 76,87 ± 2,65 nm, y el PDI es de aproximadamente 0,166 ± 0,012 (Figura 1A). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que HA@Cel/NPs exhibió una morfología esférica con superficies lisas (Figura S4). Además, en comparación con Cel/NPs, HA@Cel/NPs exhibió una EE ligeramente mayor (90,85 ± 3,69% frente a 88,37 ± 4,36%) (Tabla S2), lo que podría atribuirse a la formación de la capa de HA que minimizó la pérdida de fármaco durante la purificación. El recubrimiento exitoso de HA se confirmó mediante el aumento del tamaño de partícula y el cambio del potencial zeta de -15,5 mV a -24,7 mV (Figura 1B). Se realizó un análisis de difracción de rayos X (XRD) para estudiar el efecto de la interacción fármaco-soporte sobre las características de liberación del fármaco. Hay múltiples picos entre 5° y 90° en Cel libre, lo que indica que su cristalinidad es alta. Pero estos picos no se observan en HA@Cel/NPs, lo que indica que no hay un complejo cristalino entre Cel y la matriz (Figura 1C). Por lo tanto, Cel existe en forma amorfa o de cristales desordenados.

La estabilidad de HA@Cel/NPs

Los resultados de la evaluación de estabilidad después de 14 días de almacenamiento a 4 °C se muestran en las Figuras 1D y 1E. Se pudo observar que el tamaño de partícula, el PDI y el potencial zeta de HA@Cel/NPs no cambiaron mucho. Esto sugiere que HA@Cel/NPs puede mantener propiedades estables durante un período de 14 días.

Evaluación de la sensibilidad a los ROS y a las enzimas de HA@Cel/NPs

La sensibilidad de HA@Cel/NPs a los ROS o a la α-amilasa se verificó mediante el uso de DLS y TEM. Como se muestra en la Figura 1F, la distribución del tamaño y la morfología de HA@Cel/NPs no cambiaron mucho en la solución PBS. Sin embargo, se observó un aumento en el tamaño y la aparición de picos heterogéneos cuando HA@Cel/NPs se incubó con 1 mM de H2O2 o 10 UI/mL de α-amilasa durante 24 horas. Además, los resultados de TEM mostraron que la presencia de H2O2 o α-amilasa condujo a la fractura de HA@Cel/NPs (Figura 1F), lo que puede deberse a la sensibilidad a los ROS causada por la destrucción de H2O2 o a la sensibilidad a las enzimas bajo la α-amilasa. En consecuencia, se anticipa que HA@Cel/NPs exhibirá monosensibilidad a los ROS o a la α-amilasa.

Perfiles de liberación de HA@Cel/NPs

La liberación de contenido de Cel libre o HA@Cel/NPs se evaluó a lo largo de todo el tracto gastrointestinal (colocado continuamente en un medio alternativo). La Figura 1G mostró que Cel libre se liberó rápidamente en SGF y SIF con una tasa de liberación acumulativa del 57,73% en 6 horas, por lo que se absorbió en gran medida en el estómago y el intestino delgado y se liberó menos en el tejido del colon. En contraste, HA@Cel/NPs exhibió propiedades de liberación más lentas, lo que permitió que el fármaco llegara a su ubicación objetivo de manera más completa. Además, la tasa de liberación acumulativa fue del 39,95% después de 48 horas. Como resultado de la protección proporcionada por PAPE-SA-CD y HA-AD, HA@Cel/NPs puede transitar eficazmente desde el estómago y el intestino delgado hasta el tejido del colon.

Además, se utilizó la acción sinérgica de los estimuladores de ROS y enzimas para simular el comportamiento de liberación del fármaco en el sitio del colon. El medio de liberación incluyó un tampón de pH 7,4, un tampón de pH 7,4 que contiene 1 mM de H2O2, un tampón de pH 7,4 que contiene 10 UI/mL de α-amilasa, un tampón de pH 7,4 que contiene 1 mM de H2O2 y 10 UI/mL de α-amilasa (Figura 1H). En comparación con el tampón de pH 7,4, la tasa de liberación acumulativa se aceleró significativamente en presencia de H2O2 o α-amilasa, lo que alcanzó el 55,89% y el 68,77% en 6 horas, respectivamente. Además, la acción combinada de H2O2 y α-amilasa resultó en una tasa de liberación acumulativa del 71,87% para HA@Cel/NPs en 8 horas, lo que representa el nivel más alto. Esto sugiere que la liberación del fármaco de HA@Cel/NPs puede controlarse mediante la estimulación interna de los ROS/enzimas.

Actividad antiinflamatoria in vitro, polarización de macrófagos y perfiles de captación celular de HA@Cel/NPs

Actividad antiinflamatoria de HA@Cel/NPs

El estudio farmacológico de HA@Cel/NPs in vitro se llevó a cabo utilizando macrófagos Raw264.7 inducidos por LPS, como se muestra en la Figura 2. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, la secreción de citocinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β aumentó significativamente en las células tratadas con LPS (control positivo) en comparación con las células de control negativo (P 3 mm se acercó a 0, lo que indica que el grupo HA@Cel/NPs tuvo el efecto inhibidor sobre la transformación inflamatoria-canceroso del colon de los ratones, y podría inhibir la aparición de la transformación inflamatoria-canceroso del colon.

Además, se evaluó la eficacia de HA@Cel/NPs utilizando técnicas de tinción con H&E y tinción con Ki67. Como se muestra en la Figura 6H, podemos observar que la mucosa del colon de los ratones en el grupo control estaba estructuralmente intacta, con glándulas, criptas y células caliciformes bien dispuestas, y la submucosa no estaba congestionada ni edematosa, sin lesiones ni inflamación. En comparación con el grupo control, el grupo modelo mostró un epitelio mucoso parcialmente defectuoso, infiltración de un gran número de células tumorales, edema mucoso y necrosis extensa de las criptas. El grupo HA@Cel/NPs tuvo el efecto protector más obvio sobre las células epiteliales del colon, con casi ninguna acumulación de células tumorales en la mucosa del colon, ninguna anomalía obvia en la mucosa epitelial y la estructura glandular, un lumen de cripta más intacto, células caliciformes obvias y una reducción en el grado de inflamación y malignidad de los tumores, y una morfología similar a la del grupo control. Los resultados anteriores mostraron que HA@Cel/NPs tuvo los efectos inhibidores sobre la transformación de colitis a cáncer. Realizamos evaluaciones adicionales de los patrones de proliferación en relación con el CAC utilizando la tinción con Ki67. Los resultados ilustrados en la Figura 6H indican que el grupo de ratones tratados con HA@Cel/NPs exhibió un menor número de células Ki67 positivas en comparación con los otros grupos. Además, los resultados de H&E para los órganos principales indicaron la ausencia de irregularidades o daños patológicos notables (Figura S7), lo que sugiere que HA@Cel/NPs exhibe una excelente biocompatibilidad y una toxicidad mínima en ratones con un modelo de CAC.

Terapia combinada de HA@Cel/NPs con anti-PD-L1 en el modelo murino CT26 de cáncer colorrectal

La utilización de bloqueos de puntos de control inmunitario (anti-PD-L1) puede mejorar la capacidad de los linfocitos T citotóxicos para eliminar los tumores, ofreciendo un tratamiento potencial para varios tipos de cáncer. Investigaciones recientes han demostrado que, cuando se combinan con otras terapias, los bloqueos de PD-1/PD-L1 pueden aumentar significativamente sus efectos inmunoterapéuticos.^[42] Por lo tanto, se espera que la combinación de anti-PD-L1 con HA@Cel/NPs pueda conducir a resultados positivos en el tratamiento antitumoral. Para verificar esto, evaluamos la eficacia de HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 en un modelo tumoral CT26, y el procedimiento experimental se ilustra en la Figura 7A. Como se muestra en la Figura 7B, en el grupo de tratamiento que recibió Cel libre, se observó una ligera disminución del peso del ratón en 14 días, mientras que el peso de los ratones en los otros grupos se mantuvo estable. Los hallazgos indican que las NPs proporcionadas exhiben una biocompatibilidad específica y no inducen una reducción de peso en los ratones. Como se muestra en la Figura 7C, el volumen tumoral en el grupo de solución salina exhibió un aumento rápido y sostenido, alcanzando los 1478 mm3 al final del experimento. En contraste, todos los grupos de tratamiento inhibieron el crecimiento tumoral en diversos grados. Los volúmenes tumorales medios al final del estudio fueron de 1152 mm3 para el grupo de Cel libre, 998 mm3 para el grupo de Cel/NPs, 814 mm3 para el grupo de HA@Cel/NPs y 412 mm3 para el grupo de combinación de HA@Cel/NPs + anti-PD-L1. Cabe destacar que la terapia de combinación con HA@Cel/NPs y anti-PD-L1 exhibió la eficacia antitumoral más potente. En el día 14, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores (Figura 7D). Como se muestra en la Figura 7E, la tendencia del peso tumoral fue coherente con los resultados del volumen tumoral.

Mientras tanto, se utilizó la tinción con H&E de tejidos tumorales para explorar aún más la eficacia antitumoral in vivo. Como se muestra en la Figura 7F, las células tumorales se acumularon densamente en el grupo de solución salina, mientras que en los otros grupos de tratamiento, las células tumorales mostraron estructuras más dispersas y destruidas, y se pudo observar necrosis, especialmente en HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs + anti-PD-L1. Además, como factores clave para mediar la inmunidad antitumoral específica, se midieron HMGB1 y CRT mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 7G).^[28] En comparación con el grupo de solución salina, el tratamiento con Cel/NPs, HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs+anti-PD-L1 aumentó significativamente los niveles de HMGB1 y CRT en los tumores CT26, lo que indica que desencadenaron las respuestas inmunitarias antitumorales específicas del organismo. Además, HA@Cel/NPs+anti-PD-L1 logró los mejores resultados, lo que podría motivar a Cel para inhibir los tumores de manera efectiva y estimular las respuestas inmunitarias antitumorales del organismo para lograr una mayor supresión tumoral. Además, en comparación con el grupo de solución salina, los ratones tratados con Cel libre exhibieron alteraciones histopatológicas en el tejido hepático, marcadas por la infiltración de células inflamatorias. Sin embargo, los ratones tratados con HA@Cel/NPs+anti-PD-L1, HA@Cel/NPs y Cel/NPs no mostraron cambios patológicos notables en los órganos principales en comparación con el grupo de solución salina, lo que indica una buena biocompatibilidad (Figura S8).

Posteriormente, evaluamos la alteración del microambiente tumoral inmunosupresor en ratones con tumores examinando los cambios en las células inmunitarias que infiltran el tumor después de un tratamiento de 14 días. Como se muestra en las Figuras S9A-C, se examinó la proporción de CD8+, CD4+ y Tregs en los tejidos del bazo en los diferentes grupos de tratamiento. Las proporciones en el grupo de solución salina fueron del 3,04%, 3,32% y 18,7%, respectivamente. En contraste, el grupo de Cel libre mostró un 6,23% de CD8+, un 10,9% de CD4+ y un 10,5% de Tregs. El grupo de Cel/NPs mostró un aumento al 8,39% de CD8+, un 15,2% de CD4+ y una disminución al 6,94% de Tregs. Cabe destacar que el grupo de HA@Cel/NPs demostró una marcada elevación con un 14,2% de CD8+, un 23,6% de CD4+ y una reducción de Tregs al 4,8%. Además, la combinación de HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 produjo la inmunomodulación más significativa, con un 22,6% de CD8+, un 31,4% de CD4+ y una disminución drástica de Tregs al 1,70%. Estos resultados indican que, en comparación con los grupos de Cel libre y Cel/NPs, los grupos de HA@Cel/NPs y HA@Cel/NPs + anti-PD-L1 mejoraron significativamente la expresión de CD8+ y CD4+ en los tejidos del bazo, al tiempo que redujeron simultáneamente las proporciones de Tregs, siendo este último grupo el que mostró los efectos más pronunciados. El análisis de los tejidos tumorales reveló tendencias similares (Figuras S9D-F). En conclusión, el grupo de HA@Cel/NPs+anti-PD-L1 fue capaz de mejorar significativamente el estado inmunosupresor del microambiente tumoral y ejercer una mayor respuesta inmunitaria antitumoral.

Discusión

En este estudio, desarrollamos una nanoplattaforma multifuncional funcionalizada con HA (HA@Cel/NPs) que presenta una liberación dual sensible a enzimas/ROS y una orientación activa mediada por CD44 para el tratamiento específico del sitio de la colitis ulcerosa (CU), la carcinomatosis colónica (CAC) y el cáncer de colon. Nuestros resultados demostraron que HA@Cel/NPs logró una acumulación eficiente y específica de la lesión en los tejidos cólicos inflamados y malignos, lo que se confirmó tanto mediante ensayos de captación celular in vitro como mediante imágenes de fluorescencia in vivo. Al llegar al microambiente patológico del colon, caracterizado por niveles elevados de ROS y enzimas, las NPs se degradaron rápidamente, lo que desencadenó la liberación a demanda del Cel encapsulado. La administración oral de HA@Cel/NPs no solo alivió eficazmente la inflamación intestinal aguda en el modelo de CU al suprimir la producción de citocinas proinflamatorias y promover la polarización de macrófagos de M1 a M2, sino que también retrasó significativamente la progresión tumoral en el modelo de CAC. En el entorno del cáncer de colon, la administración intravenosa de HA@Cel/NPs en combinación con el bloqueo de puntos de control anti-PD-L1 intraperitoneal potenció significativamente la inmunidad antitumoral sistémica, como lo demuestra el aumento de la infiltración de linfocitos T CD8+ y CD4+, lo que condujo a la eliminación eficaz de los tumores establecidos en comparación con la monoterapia con HA@Cel/NPs. En conjunto, estos hallazgos establecen HA@Cel/NPs como una plataforma nanoterapéutica versátil y de doble vía que une el manejo de la inflamación, la supresión del cáncer y la inmunoterapia, una capacidad que distingue a nuestro sistema de los nanotransportadores convencionales de un solo mecanismo o de una sola enfermedad.^[43]

Los estudios in vitro e in vivo confirmaron que HA@Cel/NPs lograron una acumulación eficiente y específica de la lesión en los tejidos del colon, como lo demostraron el aumento de la captación celular en las células Raw264.7 y CT26 positivas para CD44, así como la prominente retención de la señal de fluorescencia en los sitios de la enfermedad en los ratones con el modelo de CAC inducido por AOM/DSS. Al exponerse a los niveles elevados de ROS y enzimas en el microambiente patológico del colon, las NPs se degradaron rápidamente, liberando el Cel encapsulado de manera bajo demanda. Este diseño de respuesta dual garantiza que la carga terapéutica se libere precisamente en los sitios objetivo, maximizando así la concentración local del fármaco y minimizando la exposición sistémica y la toxicidad fuera del objetivo. Durante el curso del tratamiento, no se observaron efectos adversos significativos en el peso corporal ni en la histología de los órganos principales en todos los modelos de enfermedad, lo que confirmó el excelente perfil de bioseguridad de HA@Cel/NPs. La naturaleza biocompatible de HA, combinada con los enlazadores biodegradables de respuesta dual, garantiza que el nanotransportador se elimine finalmente del organismo sin provocar toxicidad crónica.^[44],^[45]

Los estudios in vitro confirmaron que HA@Cel/NPs suprimieron eficazmente la producción de citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β) y promovieron la polarización de macrófagos de M1 a M2, lo que indica su capacidad para modificar el entorno inflamatorio a nivel celular. En los modelos de colitis aguda inducida por DSS, la administración oral de HA@Cel/NPs mejoró significativamente la gravedad de la enfermedad, como lo demuestra la atenuación de la pérdida de peso, la reducción del índice de actividad de la enfermedad, la restauración de la longitud del colon y la atenuación del daño histológico. Estos hallazgos sugieren colectivamente que HA@Cel/NPs reprograman el microambiente inflamatorio intestinal, una característica que distingue fundamentalmente a nuestro sistema de los agentes antiinflamatorios convencionales que simplemente alivian los síntomas sin corregir el desequilibrio inmunológico subyacente. En el modelo de CAC inducido por AOM/DSS, HA@Cel/NPs retrasó drásticamente la tumorigénesis, como lo refleja la disminución de la multiplicidad y la carga tumoral, junto con la reducción de la expresión del marcador de proliferación Ki-67 en los tejidos del colon. Esta eficacia terapéutica de amplio espectro, que abarca desde la inflamación aguda hasta la malignidad, subraya el potencial de traslación de nuestra plataforma en el manejo de todo el continuo inflamación-carcinoma, una capacidad que rara vez se logra con los nanomedicamentos existentes que normalmente se limitan a una sola etapa patológica. Además, en un modelo de cáncer de colon CT26 subcutáneo, la administración intravenosa de HA@Cel/NPs en combinación con el bloqueo de puntos de control anti-PD-L1 intraperitoneal provocó una inmunidad antitumoral sistémica significativamente mejorada en comparación con la monoterapia con HA@Cel/NPs, como lo demuestra el aumento de la infiltración de linfocitos T CD8+ y CD4+ y la regulación al alza de los marcadores de muerte celular inmunogénica HMGB1 y CRT. Cabe señalar que, debido a la ausencia de un grupo de monoterapia anti-PD-L1, los datos actuales respaldan un beneficio de la combinación en lugar de una interacción sinérgica formal entre HA@Cel/NPs y anti-PD-L1. No obstante, la eficacia antitumoral significativamente mejorada y el aumento de la infiltración de células T en el grupo de combinación en comparación con HA@Cel/NPs solo sugieren fuertemente que la adición de anti-PD-L1 potencia el efecto terapéutico de nuestro nanotransportador. Esta estrategia de combinación inmunocuemoterapéutica no solo amplía el repertorio terapéutico de Cel más allá de sus funciones antiinflamatorias y citotóxicas convencionales, sino que también posiciona a HA@Cel/NPs como un puente versátil que une la quimioterapia convencional y la inmunoterapia, ofreciendo un paradigma prometedor para el manejo integral de las malignidades intestinales.

Si bien los resultados actuales demuestran una promesa preclínica convincente, varias limitaciones metodológicas y de traslación requieren un reconocimiento transparente. Primero, aunque HA@Cel/NPs exhibió una eficacia terapéutica consistente en tres modelos de enfermedad mecanísticamente diversos, los determinantes moleculares que rigen su liberación de respuesta dual a estímulos, en particular la coordinación espacio-temporal entre la descomposición de las nanopartículas, la liberación de la carga útil y los cambios dinámicos en el pH del colon, el potencial redox y la actividad proteolítica, siguen estando insuficientemente caracterizados y exigen una validación mecanicista rigurosa y basada en hipótesis. En segundo lugar, nuestra evaluación de seguridad se limitó a los puntos finales agudos; la evaluación definitiva de la traslación clínica requiere estudios de toxicología longitudinal, incluidos regímenes de dosis repetidas durante períodos clínicamente relevantes, para evaluar la toxicidad orgánica acumulativa, la inmunogenicidad y las alteraciones del microbioma. En tercer lugar, la sinergia observada entre HA@Cel/NPs y el bloqueo de anti-PD-L1 en tumores subcutáneos no se ha corroborado en modelos de cáncer de colon ortotópicos o en modelos de xenoinjerto de pacientes inmunocompetentes, que preservan las interacciones tumor-estroma, la infiltración de células inmunitarias y la microarquitectura anatómica esenciales para predecir los resultados inmunomoduladores clínicos. Los esfuerzos futuros dirigidos a la disección mecanicista, la caracterización toxicológica extendida y la validación en modelos de tumores clínicamente relevantes serán fundamentales para cerrar la brecha entre la innovación preclínica y la aplicación clínica de HA@Cel/NPs.

Conclusión

En este estudio, desarrollamos una nanoplattaforma oral para la administración de Cel, basada en el núcleo de PAPE-SA-CD combinado con la cubierta de HA-AD. El nanosistema resultante (HA@Cel/NPs) mantuvo la estabilidad durante su paso por el tracto gastrointestinal, exhibió una excelente capacidad de direccionamiento al colon, atribuida a las propiedades de HA, y demostró un comportamiento de liberación rápida y precisa de Cel debido a la doble sensibilidad a enzimas/ROS de PAPE-SA-CD. Los experimentos in vitro indicaron que HA@Cel/NPs exhibió potentes capacidades antiinflamatorias e inductoras de apoptosis. Además, HA-AD/PAPE-SA-CD mostró una mínima citotoxicidad in vitro e indicó una biosseguridad favorable in vivo, lo que confirma la biocompatibilidad del nanosistema para la administración. Finalmente, los experimentos in vivo demostraron que HA@Cel/NPs inhibió significativamente la progresión de la colitis ulcerosa (CU), el cáncer colorrectal avanzado (CAC) y el cáncer colorrectal (CRC). Además, cuando se combinó con un inhibidor del punto de control inmunitario (anti-PD-L1), HA@Cel/NPs demostró la capacidad de eliminar el CRC y mejorar la inmunidad antitumoral general. En conclusión, parece que esta innovadora nanoplattaforma con versátiles propiedades farmacológicas podría utilizarse para el tratamiento eficaz de las enfermedades relacionadas con el colon.