El registro de imágenes seriadas en secciones preserva una coordenada de profundidad que una sola imagen planar no puede representar. Introducimos ISPat-3D (Patrones espacialmente conscientes e informados en tres dimensiones), un marco de trabajo que combina el ajuste del proceso gaussiano anisotrópico con el análisis factorial multiestudio para separar la variación espacial suave de la covarianza compartida entre las zonas de densidad tumoral y la covarianza específica de cada zona. Las matrices de precisión resumen la estructura ajustada como correlaciones parciales con signo, interpretadas como colocalización o exclusión condicional en lugar de contacto físico, señalización o causalidad. Analizamos las asociaciones condicionales entre las variables de densidad de vecindad de tipos celulares en cinco estratos de carga tumoral relativa en un espécimen de cáncer colorrectal CyCIF y un espécimen de carcinoma de mama HER2-positivo IMC.
El flujo de trabajo ajusta la variación espacial suave modelada con un proceso gaussiano anisotrópico de tres coordenadas, ajusta la covarianza factorial compartida y específica de la zona a los residuos y convierte cada covarianza completa de la zona en correlaciones parciales con signo. Para que los presupuestos celulares informados sean factibles, el análisis utiliza una función de verosimilitud Vecchia GP de 15 vecinos en anclajes espacialmente equilibrados y un ajuste de función de verosimilitud gaussiana de la misma forma de covarianza factorial a partir de resúmenes completos de la covarianza residual. Simulaciones controladas, una comparación planar por secciones emparejadas y una comprobación directa de sensibilidad del estimador mediante lasso gráfico. En el CRC, las asociaciones positivas entre la densidad de células T y macrófagos y el estroma muestran un acuerdo relativamente alto en tres presupuestos de muestreo.
Los signos del par de mama son mucho menos estables entre los presupuestos y siguen siendo exploratorios, aunque el lasso gráfico coincide en los mismos residuos ajustados por GP. Un GP separa los patrones por escala espacial supuesta; un campo suave puede contener biología significativa y las asociaciones residuales pueden contener ruido o efectos no medidos. Los dos análisis de un solo espécimen identifican asociaciones condicionales resueltas por zona biológicamente plausibles para la replicación, sin establecer el contacto celular, el mecanismo o la reproducibilidad a nivel de cohorte. Código disponible en: https://github.com/sagnikbhadury/ISPAT-3D.
El microambiente tumoral (MAT) es un ecosistema espacialmente organizado en el que las células malignas, inmunitarias y estromales interactúan de una manera intrínsecamente ligada a la progresión tumoral, la evasión inmune y la respuesta terapéutica ([Hanahan y Weinberg, 2011]). Una característica definitoria de los tumores sólidos es que estas interacciones no son uniformes en todo el tejido. En cambio, varían sistemáticamente a lo largo de gradientes espaciales definidos por la densidad de las células tumorales, la proximidad al borde invasor y el estado de infiltración inmune local. Caracterizar estos patrones de interacción espacialmente variables a nivel de tipos de células individuales, en lugar de promediarlos en todo el tumor, se reconoce cada vez más como esencial para comprender los mecanismos de inmunosupresión y para identificar biomarcadores de pronóstico y respuesta al tratamiento resueltos espacialmente ([de Souza et al., 2024]).
Las tecnologías de imagen de tejidos altamente multiplexadas han hecho que este objetivo sea factible. Las plataformas que incluyen la inmunofluorescencia cíclica (CyCIF) ([Lin et al., 2018]), la citometría de masas por imagen (IMC) ([Giesen et al., 2014]), la imagen multiplexada de haz de iones (MIBI) ([Keren et al., 2018]) y la codetección por indexación (CODEX) ([Goltsev et al., 2018]) ahora permiten la cuantificación simultánea de decenas a más de cien marcadores proteicos a resolución de célula única en secciones de tejido intactas, al tiempo que se preserva el contexto espacial. Aplicadas a especímenes de cáncer, estas tecnologías han cambiado fundamentalmente el alcance de la biología espacial. En el cáncer de mama triple negativo, la imagen MIBI de 36 proteínas reveló que la organización espacial de la interfaz tumor-inmune (ya sea que las células inmunitarias estuvieran mezcladas dentro o compartimentadas lejos de las células tumorales) estratificó a los pacientes por supervivencia independientemente de la abundancia de células inmunitarias ([Keren et al., 2018]). En el cáncer colorrectal, el perfilado CODEX de metástasis de ganglios linfáticos identificó vecindarios multicelulares que coordinan la inmunidad antitumoral en el frente invasor ([Schürch et al., 2020]). En el cáncer de páncreas, [Bhadury et al. (2026)] identificaron que, espacialmente, múltiples interacciones ligando-receptor relacionadas con la inmunidad difieren entre las lesiones precancerosas y los grupos de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático, dado el trayecto tumoral. En todos los tipos de tumores, estos estudios establecieron que la arquitectura espacial, y no solo la composición celular, determina la función inmune.
Hasta la fecha, el análisis de los datos de imagen multiplexada ha sido casi por completo bidimensional, tratando cada sección de tejido como un dominio espacial independiente. Sin embargo, los tumores sólidos son inherentemente objetos tridimensionales, y las secciones de tejido representan cortes planos delgados a través de una estructura volumétrica cuya arquitectura celular varía sustancialmente a lo largo del eje de profundidad. La relevancia de esta limitación se ha demostrado directamente: [Kuett et al. (2022)] desarrollaron la citometría de masas por imagen 3D apilando secciones FFPE seriadas y demostraron que las mediciones de la proximidad celular y la composición del vecindario espacial diferían materialmente entre las representaciones 3D y 2D del mismo tumor, y que la imagen 2D sobreestimaba la distancia entre los grupos de células y los vasos sanguíneos. [Lin et al. (2023)] extendieron este enfoque al cáncer colorrectal a una escala de 2 × 108 células en 25 secciones seriadas, generando lo que sigue siendo el atlas de células únicas 3D más detallado de un tumor humano, y demostraron que las características tumorales a mesoescala, que incluyen los gradientes de expresión de oncogenes a largo alcance y la arquitectura del punto de control inmune PD1:PDL1, solo se pueden detectar en datos tridimensionales. [Kiemen et al. (2026)] utilizaron el mapeo 3D en el cáncer de páncreas y revelaron que la inflamación alrededor de los precánceres individuales es muy heterogénea, con puntos calientes y fríos inmunitarios que se intercambian a lo largo de decenas de micrómetros. En conjunto, estos hallazgos establecen que la imagen multiplexada 3D no es simplemente un incremento técnico, sino una ventana cualitativamente diferente a la biología tumoral.
A pesar de estos avances en la adquisición de datos, la metodología estadística para analizar los datos de imagen multiplexada 3D sigue estando poco desarrollada. Las herramientas de análisis espacial existentes, que incluyen las estadísticas de coocurrencia, las funciones de correlación cruzada, las puntuaciones de enriquecimiento de vecinos más cercanos y los métodos de vecindad celular, se diseñaron para datos de proceso puntual bidimensionales y no utilizan el eje de profundidad. Tampoco tienen en cuenta la autocorrelación espacial al estimar las asociaciones de tipo celular, que es un factor de confusión importante en los tejidos donde la variación espacial globalmente estructurada en la densidad celular infla las medidas de coocurrencia por pares. De manera más fundamental, los métodos existentes producen una única red de resumen para cada región espacial, descartando la heterogeneidad espacial que motiva el análisis 3D en primer lugar. No pueden recuperar cómo la estructura de dependencia condicional entre los tipos de células cambia a lo largo del gradiente de densidad tumoral, que es precisamente la pregunta de interés biológico.
Los métodos estadísticos para la genómica espacial han logrado avances considerables en el manejo de la autocorrelación espacial, principalmente en el contexto de la transcriptómica espacial. La regresión de proceso gaussiano (GP) se ha utilizado para identificar genes espacialmente variables mediante la descomposición de la variación de la expresión en un componente espacialmente estructurado y un residuo ([Svensson et al., 2018]; [Sun et al., 2020]; [Bhadury et al., 2026]). Estos enfoques modelan la tendencia espacial suave como un factor de confusión y extraen la señal de interés del residuo. Este es el precedente conceptual para la etapa de desconfusión GP en ISPat-3D, aunque nuestro entorno difiere sustancialmente: no estamos identificando marcadores espacialmente variables de forma aislada, sino que estamos recuperando la estructura de covarianza residual conjunta en múltiples tipos de células simultáneamente, en tres dimensiones y estratificada por zonas tumorales. Para la inferencia de interacción célula-célula a partir de la transcriptómica espacial, se han propuesto métodos basados en bases de datos de ligandos y receptores ([Efremova et al., 2020]) y transporte óptimo ([Cang et al., 2023]), pero estos operan sobre la proximidad categórica y no modelan superficies de intensidad espacial continua o redes de correlación parcial.
El marco de análisis factorial multiestudio (MSFA) de [De Vito et al. (2019)], extendido al entorno bayesiano de alta dimensión por [De Vito et al. (2021)], proporciona el segundo componente estadístico clave de ISPat-3D. MSFA descompone una colección de matrices de covarianza de múltiples estudios en un componente compartido en todos los estudios y componentes residuales específicos del estudio, utilizando una estructura de factores latentes. En nuestro entorno, las cinco zonas de densidad tumoral definidas por la densidad local de células tumorales desempeñan el papel de estudios, y las matrices de carga compartidas y específicas de la zona recuperan las redes de interacción de tipo celular globales y específicas de la zona, respectivamente. Recientemente se han desarrollado algoritmos de inferencia variacional para MSFA que reducen sustancialmente el costo computacional en relación con el muestreo de cadenas de Markov Monte Carlo ([Hansen et al., 2025]), y confiamos en estos para que la inferencia sea factible a la escala de los datos multiplexados 3D. Por otro lado, Informed Spatially Aware Patterns for Multiplexed Immunofluorescence Data ([Bhadury et al., 2026]) es el componente básico de este manuscrito. ISPAT modela el perfil de interacción célula-célula que varía a lo largo de la trayectoria tumoral utilizando un modelo de efectos mixtos de proceso gaussiano a través de una estructura de independencia condicional a través de una forma de análisis factorial multiestudio y se aplica a datos de cáncer de páncreas multiplexados 2D.
En este manuscrito, presentamos una extensión de ISPAT y proponemos ISPat-3D (Informed Spatially Aware Patterns in Three Dimensions), un marco bayesiano jerárquico que opera directamente sobre los datos de imagen multiplexada tridimensional para producir redes de interacción de tipo celular espacialmente variables y específicas de la zona. El método se lleva a cabo en tres etapas. Primero, se ajusta un proceso gaussiano anisotrópico a cada superficie de intensidad de tipo celular dentro de cada zona de densidad tumoral, utilizando parámetros de longitud de escala separados para el plano del tejido y el eje de profundidad para tener en cuenta la estructura de resolución anisotrópica del escaneo de secciones seriadas. Los residuos espacialmente ajustados de esta etapa se pasan luego a MSFA, que descompone la covarianza entre tipos de células en un componente de red compartido en todas las zonas y perturbaciones de red específicas de la zona. A partir de las estructuras de red no dirigidas, podemos centrarnos en patrones de interacción bidireccionales individuales de dos tipos de células, teniendo en cuenta el resto de los tipos de células, para comprender las interacciones espaciales entre los tipos de células. Finalmente, se extraen redes de correlación parcial de las matrices de precisión resultantes para representar la estructura de colocalización condicional entre los tipos de células en cada nivel de densidad tumoral. Nuestro manuscrito actual difiere metodológicamente de [Bhadury et al. (2026)] en muchos aspectos. En primer lugar, aquí desarrollamos el modelo para datos 3D en lugar de datos multiplexados 2D. En segundo lugar, utilizamos una regresión de proceso gaussiano anisotrópico más rigurosa que tiene en cuenta el eje de la sección 3D en lugar de la isotropía. En tercer lugar, nuestro paso de optimización es diferente de ISPAT, utilizamos un tipo de objetivo de máxima verosimilitud de tipo II sofisticado y riguroso utilizando el algoritmo [Byrd et al. (1995)]; [Zhu et al. (1997)]. Aunque se conserva el paso de desconfusión GP, la estimación del campo latente difiere. Por último, la interpretación de los patrones de interacción obtenidos mediante el análisis es volumétrica, condicional, bidireccional y la literatura que aborda este problema es escasa.
Primero aplicamos ISPat-3D al espécimen CRC1 del atlas de cáncer colorrectal 3D de [Lin et al., 2023], un adenocarcinoma poco diferenciado en etapa IIIB BRAFV600E con alta inestabilidad de microsatélites y histomorfología compleja del borde invasor. Para fines de generalización, luego lo aplicamos al espécimen principal de datos de citometría de masas por imagen 3D de cáncer de mama de [Kuett et al., 2022]. Hasta donde sabemos, ISPat-3D es el primer método estadístico diseñado para recuperar redes de interacción espacialmente variables y específicas de la zona a partir de datos de imagen de cáncer tridimensional. Evaluamos su rendimiento a través de un estudio de simulación en múltiples especificaciones de kernel, configuraciones de conteo y configuraciones de tamaño de zona, y demostramos que el método recupera tanto la estructura de red compartida como la específica de la zona con alta precisión y un costo computacional práctico. En la aplicación CRC1, ISPat-3D revela una señal de colocalización compartida entre macrófagos y estroma y un módulo de células T coordinado que se intensifica a lo largo del gradiente de densidad tumoral, con un cambio hacia la proximidad de células T citotóxicas y células T reguladoras en la densidad tumoral máxima, lo que es consistente con la inmunosupresión activa en el núcleo del tumor. En la aplicación de cáncer de mama, ISPat-3D descubre un acoplamiento condicional casi perfecto entre los fibroblastos asociados al cáncer y la capa mioepitelial a baja densidad tumoral, una colocalización CAF-endotelial que surge específicamente en densidades tumorales intermedias y altas y que refleja el remodelado angiogénico dependiente de la densidad. También se observa una asociación B-cell-CAF confinada a zonas de alta densidad, lo que es consistente con la formación de estructuras linfoides terciarias en regiones de alta carga de antígenos. También demostramos que, en ambos tumores, las redes específicas de la zona revelan una estructura de interacción que es invisible para cualquier sección transversal bidimensional y que no se puede recuperar mediante los métodos espaciales 2D existentes.
Métodos
ISPat-3D: Informed Spatially Aware Patterns in Three Dimensions
Descripción general del marco de modelado
ISPat-3D es un marco bayesiano jerárquico diseñado para caracterizar cómo varían los patrones de interacción célula-célula a lo largo del gradiente de intensidad tumoral dentro de una imagen de tejido. El modelo opera en tres etapas secuenciales dentro de cada imagen: (i) regresión de procesos gaussianos específica de la zona para recuperar superficies de expresión espacial latentes a partir de intensidades de marcadores brutos o estimaciones de densidad de kernel específicas del tipo celular, (ii) análisis factorial multiestudio (MSFA) en las cinco zonas tumorales para descomponer la covarianza en componentes compartidos y específicos de la zona, y (iii) construcción de redes a partir de las matrices de precisión resultantes para representar la estructura de colocalización condicional entre los tipos celulares. Estas tres etapas constituyen conjuntamente la inferencia dentro de la imagen.
Notación y estructura de datos
Sea denotar el número de expresiones de tipo celular, y sea el número total de células en la imagen . Los datos para una sola imagen consisten en una matriz de intensidad de tipo celular y una matriz de coordenadas , donde las tres columnas dan las coordenadas espaciales y la anotación específica de la zona que indica la etiqueta de la zona tumoral. Para la zona , sea denotar el conjunto de índices de las células asignadas a , de modo que .
Distribución conjunta de las intensidades de tipo celular en las regiones espaciales
Caracterizamos la estructura de colocalización espacial entre las intensidades de tipos celulares modelando su distribución de intensidad conjunta dentro de cada una de las regiones definidas por la intensidad tumoral. Para una imagen de tejido dada , el perfil de intensidad celular en la ubicación espacial es el vector -dimensional , donde denota la intensidad latente de la célula en la ubicación dentro de la región , correspondiente a la -ésima fila de restringida a las células . La distribución conjunta de estas intensidades se modela como una gaussiana multivariante:
donde es el vector de intensidad media específico de la región y es la matriz de covarianza específica de la región que codifica las relaciones de colocalización por pares entre todas las células dentro de . El número total de células satisface , donde .
La matriz de covarianza es el principal objetivo inferencial en esta etapa. Su entrada cuantifica el grado en que las intensidades de las células y covarían en las ubicaciones espaciales dentro de la región , capturando la colocalización espacial cuando es positiva y la exclusión espacial cuando es negativa. La matriz de precisión correspondiente codifica la estructura de independencia condicional: una entrada cero implica que las células y son condicionalmente independientes dadas las intensidades de todas las demás células dentro de , es decir, . Por el contrario, una entrada distinta de cero indica una asociación condicional directa entre las células y que no se explica por sus relaciones mutuas con otras células, y corresponde a una arista en el grafo de interacción no dirigido con el conjunto de vértices .
Esta representación gráfica basada en la precisión es preferible a una red de correlación marginal para caracterizar la colocalización celular en conjuntos de datos CyCIF e IMC porque filtra las asociaciones espurias impulsadas por la variación espacial compartida, reteniendo solo las dependencias por pares directas. La estructura del campo aleatorio de Markov gaussiano (GMRF) implícita por proporciona así un resumen conciso e interpretable de la arquitectura de interacción celular local dentro de cada zona tumoral. No estimamos directamente a partir de la submatriz de restringida a , ya que la estimación directa sería poco fiable cuando la autocorrelación espacial infla el tamaño de la muestra efectivo y cuando es moderado en relación con . En cambio, se recupera implícitamente a través de la eliminación específica de la zona en la Etapa 1 y la descomposición MSFA en la Etapa 2, que tienen en cuenta conjuntamente la dependencia espacial y aprovechan la información de las zonas a través de la estructura de carga compartida.
Etapa 1: Regresión gaussiana anisotrópica específica de la zona
Dentro de cada zona y para cada célula , modelamos la intensidad observada en la célula como la suma de tres componentes:
donde es un intercepto global para la célula , es un campo de molestia correlacionado espacialmente que codifica la variación de intensidad local dentro de la zona , es una señal no estructurada espacialmente extraída de una covarianza entre células que captura los patrones de interacción célula-célula y es el objetivo del MSFA de la Etapa 2, y es un término de "nugget" independiente que codifica el ruido de medición. La etapa de GP estima y elimina ; el residual se pasa entonces al MSFA.
Especificación del kernel.
ISPat-3D admite dos kernels de covarianza anisotrópicos que tratan el plano del tejido y el eje - con longitudes de escala separadas y , respectivamente. Para las células y en la zona , la distancia anisotrópica es
El kernel de Matérn-3/2 es entonces
y el kernel exponencial cuadrado (RBF) es
El Matérn-3/2 se prefiere en la práctica porque impone trayectorias de muestra diferenciables una vez, lo cual es una suposición de suavidad más realista para los procesos espaciales a nivel celular que el RBF infinitamente diferenciable. La positividad definida de la matriz del kernel se verifica en tiempo de ejecución y se aplica mediante la proyección positiva definida más cercana cuando es necesario. Cabe señalar que esta elección particular de la longitud de escala en el kernel nos permite capturar la noción volumétrica de los datos 3D. Dado que estas imágenes 3D son secciones seriadas de un tumor volumétrico real, la elección de tal extensión a través de la anisotropía tiene en cuenta la dirección de variación axial geométrica en cada regresión espacial.
Estimación de hiperparámetros.
El vector de hiperparámetros se estima conjuntamente maximizando la función de verosimilitud marginal del GP, obtenida integrando el campo latente analíticamente. Sea , la función de verosimilitud marginal es
Este objetivo de máxima verosimilitud de tipo II se optimiza mediante L-BFGS-B ([Byrd et al., 1995]; [Zhu et al., 1997]) con parámetros reparametrizados en la escala logarítmica para garantizar la positividad. Los límites de la longitud de escala se anclan al rango espacial empírico de la zona : el límite inferior se establece en un décimo de la distancia mediana por pares y el límite superior en diez veces la mediana, por separado para el plano y el eje -. Este ajuste adaptativo de los datos evita soluciones degeneradas en longitudes de escala cercanas a cero, que corresponden a la interpolación exacta, o en longitudes de escala que exceden la extensión del dominio, que no se pueden identificar a partir de los datos ([Rasmussen y Williams, 2006]). El enfoque de verosimilitud marginal elimina la necesidad de validación cruzada a nivel de zona y célula y es una práctica estándar en la transcriptómica espacial ([Sun et al., 2020]).
Estimación del campo latente.
La intensidad observada para la célula en la zona se descompone como
donde es la molestia espacial estimada y es el residual ajustado espacialmente que contiene la estructura de red entre células analizada posteriormente por el MSFA. Dados los hiperparámetros optimizados , la media posterior del campo de molestia espacial se recupera mediante la identidad gaussiana condicional estándar ([Rasmussen y Williams, 2006]):
donde . La entrada del MSFA es entonces el residual ajustado espacialmente
que retiene solo la variación no espacial estructurada entre las células. Al apilar a través de células, se obtiene la matriz ajustada espacialmente , que se pasa al MSFA como la entrada observada para la zona . La solución se implementa mediante descomposición de Cholesky para la estabilidad numérica. La estimación a través de las células dentro de cada zona se paraleliza en los núcleos disponibles.
Etapa 2: Análisis factorial multiestudio en las zonas tumorales
Después de la Etapa 1, cada imagen produce cinco matrices latentes específicas de la zona , cada una de dimensión . Estas matrices se tratan como las entradas de datos para un modelo de análisis factorial multiestudio (MSFA) que descompone la covarianza entre tipos celulares en un componente compartido en las cinco zonas de CK y cinco componentes residuales específicos de la zona. La motivación biológica es directa: los patrones de interacción célula-célula que persisten independientemente de la densidad tumoral local reflejan características estructurales constitutivas del microambiente tumoral, mientras que los patrones específicos de la zona capturan cómo las interacciones se reconfiguran a lo largo del gradiente tumoral.
El modelo MSFA para la zona en la célula es
donde es la matriz de carga compartida con factores latentes comunes a todas las zonas, son las puntuaciones de los factores compartidos, con es la matriz de carga específica de la zona, son las puntuaciones específicas de la zona y con . La matriz de covarianza a nivel de zona implícita es
La inferencia se realiza mediante MCMC típico o inferencia variacional de ascenso de coordenadas (CAVI) o inferencia variacional estocástica (SVI), todos los cuales producen medias posteriores y como los principales objetivos inferenciales. Para nuestra tarea de inferencia, empleamos MSFA utilizando CAVI.
Etapa 3: Construcción de redes
La red de interacción compartida y las cinco redes de interacción específicas de la zona se construyen a partir de las matrices de carga del MSFA de la siguiente manera. La red compartida captura los patrones de colocalización de tipo celular que son consistentes en todas las zonas de CK:
La red específica de la zona para la zona aumenta el componente compartido con la desviación específica de la zona:
En ambos casos, la entrada de codifica la fuerza de la relación de colocalización funcional entre los tipos celulares y , con entradas distintas de cero que corresponden a aristas en el grafo no dirigido donde . La interpretación de independencia condicional se sigue directamente del marco del campo aleatorio de Markov gaussiano: , que bajo el modelo gaussiano multivariante es equivalente a un cero en la matriz de precisión .
Construcción de covarianza basada en referencias a partir de la estructura de adyacencia: facilitando la integración de datos multimodales
Una decisión de modelado clave en ISPat-3D concierne a la representación de la estructura de interacción célula-célula o marcador-célula. Si bien las matrices de adyacencia son resúmenes naturales de la topología del grafo, no se pueden utilizar directamente como matrices de covarianza dentro de un marco probabilístico gaussiano porque no se garantiza que sean semidefinidas positivas y no codifican la magnitud de las relaciones de coexpresión más allá de la conectividad binaria. Por lo tanto, adoptamos una representación basada en la covarianza en todo el proceso, construyendo matrices semidefinidas positivas válidas a partir del MSFA como se describe en la Sección 2.1.5. Sin embargo, cuando se dispone de conocimientos biológicos previos sobre la interacción célula-célula o marcador-célula, por ejemplo, a partir de bases de datos de receptor-ligando o grafos de proximidad espacial derivados del tejido, es natural preguntarse si esta información de adyacencia se puede incorporar para regularizar o informar los patrones de covarianza estimados. Describimos una transformación sistemática que logra esto.
Sea denotar una matriz de adyacencia simétrica que codifica las interacciones conocidas o hipotéticas entre tipos celulares, con o más generalmente . Para convertir A en una matriz de covarianza de referencia válida , aprovechamos la descomposición aditiva de las funciones de covarianza de los procesos gaussianos. Una función definida sobre un dominio de producto se puede escribir en forma aditiva como , donde cada componente es una función univariante de una sola dimensión de entrada ([Hastie y Tibshirani, 1990]). Bajo un prior de proceso gaussiano, las funciones aditivas de este tipo corresponden a kernels de covarianza aditivos, y la suma de kernels de covarianza válidos es en sí misma un kernel de covarianza válido ([Bishop, 2006]; [Rasmussen y Williams, 2006]). Esta estructura aditiva justifica la construcción de una covarianza de referencia tratando la matriz de adyacencia como una combinación lineal de componentes semidefinidos positivos de rango uno, cada uno de los cuales corresponde a un término de interacción por pares.
Formalmente, la matriz de covarianza de referencia se obtiene proyectando sobre el cono de matrices simétricas semidefinidas positivas. Una opción natural es establecer para una pequeña constante de regularización elegida para garantizar la positividad definida, siempre que la matriz resultante tenga valores propios no negativos después de la regularización. Una alternativa más sistemática, particularmente cuando puede tener valores propios negativos debido a su estructura de Laplaciano de grafo, es tomar la matriz semidefinida positiva más cercana a en el sentido de la norma de Frobenius ([Higham, 1988]), o construir directamente a partir de la descomposición espectral de reteniéndose solo los valores propios positivos.
Dada una covarianza de referencia válida , el patrón de interacción específico de la zona de referencia para la región se define como
donde denota la raíz cuadrada simétrica de la matriz , obtenida mediante descomposición en autovalores como , con . La construcción en la Ecuación (14) tiene una interpretación directa: reescala el producto externo de carga específico de la zona multiplicándolo por la estructura de covarianza de referencia, de modo que los pares de tipos de células con una fuerte adyacencia previa contribuyan más significativamente al patrón específico de la zona que los pares con una adyacencia débil o ausente. Esto actúa como un sesgo estructural suave en la red, preservando la variación específica de la zona impulsada por los datos codificada en , al tiempo que ancla la magnitud de la interacción a una escala de referencia informada biológicamente.
Tenga en cuenta que es semidefinida positiva por construcción, ya que para cualquier vector . Esto asegura que siga siendo una matriz de covarianza válida que puede utilizarse en procedimientos posteriores de estimación de la matriz de precisión o inferencia de grafos. La red compartida basada en la referencia análoga es
que regulariza la estructura de interacción compartida mediante la misma covarianza de referencia. En situaciones en las que no se disponga de información previa sobre la adyacencia, se establece , recuperando los estimadores no regularizados y ya descritos en la sección anterior.
Por lo tanto, la salida de ISPat-3D para una sola imagen es una red compartida y cinco redes específicas de la zona, que en conjunto proporcionan una caracterización completa de cómo varía la estructura de interacción celular desde una baja hasta una alta densidad tumoral dentro del tejido. Estos patrones de interacción se obtienen como estructuras de independencia condicional que varían a lo largo de la trayectoria tumoral, teniendo en cuenta la característica volumétrica de los datos 3D. Dada la formulación de ISPAT 3D, ahora podemos descubrir los grafos de interacción ligando-receptor que no se capturan mediante ningún método diseñado para el análisis de imágenes 2D, como ISPAT ([Bhadury et al., 2026]). Presentamos la descripción general esquemática de la canalización en la Figura 1.
ISPat-3D: Patrones espacialmente informados en tres dimensiones
Descripción general del marco de modelado
ISPat-3D es un marco bayesiano jerárquico diseñado para caracterizar cómo varían los patrones de interacción entre células a lo largo del gradiente de intensidad tumoral dentro de una imagen de tejido. El modelo opera en tres etapas secuenciales dentro de cada imagen: (i) regresión de proceso gaussiano específica de la zona para recuperar superficies de expresión espacial latentes a partir de intensidades de marcadores brutos o estimaciones de densidad de kernel específicas del tipo de célula, (ii) análisis factorial multiestudio (MSFA) en las cinco zonas tumorales para descomponer la covarianza en componentes compartidos y específicos de la zona, y (iii) construcción de redes a partir de las matrices de precisión resultantes para representar la estructura de colocalización condicional entre los tipos de células. Estas tres etapas constituyen conjuntamente la inferencia dentro de la imagen.
Notación y estructura de datos
Sea denota el número de expresiones de tipo celular, y sea el número total de células en la imagen . Los datos para una sola imagen consisten en una matriz de intensidad de tipo celular y una matriz de coordenadas , donde las tres columnas dan las coordenadas espaciales y la anotación específica de la zona que indica la etiqueta de la zona tumoral. Para la zona , sea denota el conjunto de índices de las células asignadas a , de modo que .
Distribución conjunta de las intensidades de tipo celular en las regiones espaciales
Caracterizamos la estructura de colocalización espacial entre las intensidades de los tipos de células modelando su distribución de intensidad conjunta dentro de cada una de las muchas regiones definidas por la intensidad tumoral. Para una imagen de tejido dada , el perfil de intensidad celular en la ubicación espacial es el vector -dimensional , donde denota la intensidad latente de la célula en la ubicación dentro de la región , correspondiente a la -ésima fila de restringida a las células . La distribución conjunta de estas intensidades se modela como una gaussiana multivariante:
donde es el vector de intensidad media específico de la región y es la matriz de covarianza específica de la región que codifica las relaciones de colocalización por pares entre todas las células dentro de . El número total de células satisface , donde .
La matriz de covarianza es el objetivo inferencial principal en esta etapa. Su entrada cuantifica el grado en que las intensidades de las células y covarián espacialmente en las ubicaciones espaciales dentro de la región , capturando la colocalización espacial cuando es positiva y la exclusión espacial cuando es negativa. La matriz de precisión correspondiente codifica la estructura de independencia condicional: una entrada cero implica que las células y son condicionalmente independientes dadas las intensidades de todas las demás células dentro de , es decir, . Por el contrario, una entrada distinta de cero indica una asociación condicional directa entre las células y que no se explica por sus relaciones mutuas con otras células, y corresponde a una arista en el grafo de interacción no dirigido con conjunto de vértices .
Esta representación gráfica basada en la precisión es preferible a una red de correlación marginal para caracterizar la colocalización celular en conjuntos de datos CyCIF, IMC, porque filtra las asociaciones espurias impulsadas por la variación espacial compartida, reteniendo solo las dependencias por pares directas. La estructura del campo aleatorio de Markov gaussiano (GMRF) implícita por lo tanto proporciona un resumen conciso e interpretable de la arquitectura de interacción celular local dentro de cada zona tumoral. No estimamos directamente a partir de la submatriz de restringida a , ya que la estimación directa sería poco fiable cuando la autocorrelación espacial influye en el tamaño efectivo de la muestra y cuando es moderada en relación con . En cambio, se recupera implícitamente a través de la eliminación específica de la zona en la etapa 1 y la descomposición MSFA en la etapa 2, que tienen en cuenta conjuntamente la dependencia espacial y aprovechan la información de las zonas a través de la estructura de carga compartida.
Etapa 1: Regresión gaussiana anisotrópica específica de la zona
Dentro de cada zona y para cada célula , modelamos la intensidad observada en la célula como la suma de tres componentes:
donde es un intercepto global para la célula, es un campo de molestia correlacionado espacialmente que codifica la variación de intensidad local dentro de la zona, es una señal no estructurada espacialmente extraída de una covarianza entre células que captura los patrones de interacción entre células y es el objetivo del MSFA de la etapa 2, y es un término de efecto independiente que codifica el ruido de medición. La etapa GP estima y elimina ; el residual se pasa entonces al MSFA.
Especificación del kernel.
ISPat-3D admite dos kernels de covarianza anisotrópicos que tratan el plano del tejido y el eje con escalas de longitud separadas y , respectivamente. Para las células y en la zona , la distancia anisotrópica es
El kernel de Matérn-3/2 es entonces
y el kernel exponencial cuadrado (RBF) es
El Matérn-3/2 se prefiere en la práctica porque impone trayectorias de muestra diferenciables una vez, lo que es una suposición de suavidad más realista para los procesos espaciales a nivel de célula que el RBF infinitamente diferenciable. La positividad del kernel se verifica en tiempo de ejecución y se aplica mediante la proyección positiva definida más cercana cuando es necesario. Cabe señalar que esta elección particular de la escala de longitud en el kernel nos permite capturar la noción volumétrica de los datos 3D. Dado que estas imágenes 3D son secciones seriadas de un tumor volumétrico real, la elección de tal extensión a través de la anisotropía tendría en cuenta la dirección de variación axial geométrica en cada regresión espacial.
Estimación de hiperparámetros.
El vector de hiperparámetros se estima conjuntamente maximizando la verosimilitud marginal del GP, que se obtiene integrando el campo latente analíticamente. Sea , la verosimilitud marginal del GP es
Este objetivo de máxima verosimilitud de tipo II se optimiza mediante L-BFGS-B ([Byrd et al., 1995]; [Zhu et al., 1997]) con parámetros reparametrizados en la escala logarítmica para garantizar la positividad. Los límites de la escala de longitud se anclan al rango espacial empírico de la zona : el límite inferior se establece en un décimo de la distancia mediana por pares y el límite superior en diez veces la mediana, por separado para el plano y el eje . Este límite adaptativo de datos evita soluciones degeneradas en escalas de longitud cercanas a cero, que corresponden a la interpolación exacta, o en escalas de longitud que exceden la extensión del dominio, que son inidentificables a partir de los datos ([Rasmussen and Williams, 2006]). El enfoque de verosimilitud marginal elimina la necesidad de validación cruzada a nivel de zona y de célula y es una práctica estándar en la transcriptómica espacial ([Sun et al., 2020]).
Estimación del campo latente.
La intensidad observada para la célula en la zona se descompone como
donde es la molestia espacial estimada y es el residual ajustado espacialmente que contiene la estructura de red entre células analizada posteriormente por el MSFA. Dados los hiperparámetros optimizados , la media posterior del campo de molestia espacial se recupera mediante la identidad gaussiana condicional estándar ([Rasmussen and Williams, 2006]):
donde . La entrada del MSFA es entonces el residual ajustado espacialmente
que retiene solo la variación estructurada no espacial entre las células. Al apilar en las células, se obtiene la matriz ajustada espacialmente , que se pasa al MSFA como la entrada observada para la zona . La solución se implementa mediante descomposición de Cholesky para la estabilidad numérica. La estimación en las células dentro de cada zona se paraleliza en los núcleos disponibles.
Etapa 2: Análisis factorial multiestudio en las zonas tumorales
Después de la etapa 1, cada imagen produce cinco matrices latentes específicas de la zona, cada una de dimensión . Estas matrices se tratan como los datos de entrada para un modelo de análisis factorial multiestudio (MSFA) que descompone la covarianza entre los tipos de células en un componente compartido en las cinco zonas de CK y cinco componentes residuales específicos de la zona. La motivación biológica es directa: los patrones de interacción entre células que persisten independientemente de la densidad tumoral local reflejan características estructurales constitutivas del microentorno tumoral, mientras que los patrones específicos de la zona capturan cómo las interacciones se reconfiguran a lo largo del gradiente tumoral.
El modelo MSFA para la zona en la célula es
donde es la matriz de carga compartida con factores latentes comunes a todas las zonas, son las puntuaciones de los factores compartidos, con es la matriz de carga específica de la zona, son las puntuaciones específicas de la zona, y con . La matriz de covarianza a nivel de zona implícita es
La inferencia se realiza mediante MCMC típico o inferencia variacional de ascenso de coordenadas (CAVI) o inferencia variacional estocástica (SVI), todos los cuales producen medias posteriores y como los principales objetivos inferenciales. Para nuestra tarea de inferencia, empleamos MSFA utilizando CAVI.
Etapa 3: Construcción de redes
La red de interacción compartida y las cinco redes de interacción específicas de la zona se construyen a partir de las matrices de carga MSFA de la siguiente manera. La red compartida captura los patrones de colocalización de los tipos de células que son consistentes en todas las zonas de CK:
La red específica de la zona para la zona aumenta el componente compartido con la desviación específica de la zona:
En ambos casos, la entrada de codifica la fuerza de la relación de colocalización funcional entre los tipos de células y , con entradas distintas de cero que corresponden a aristas en el grafo no dirigido donde . La interpretación de la independencia condicional se sigue directamente del marco del campo aleatorio de Markov gaussiano: , que en el modelo gaussiano multivariante es equivalente a un cero en la matriz de precisión .
Esta representación gráfica basada en la precisión es preferible a una red de correlación marginal para caracterizar la colocalización celular en conjuntos de datos CyCIF, IMC, porque filtra las asociaciones espurias impulsadas por la variación espacial compartida, reteniendo solo las dependencias por pares directas. La estructura del campo aleatorio de Markov gaussiano (GMRF) implícita por lo tanto proporciona un resumen conciso e interpretable de la arquitectura de interacción celular local dentro de cada zona tumoral. No estimamos directamente a partir de la submatriz de restringida a , ya que la estimación directa sería poco fiable cuando la autocorrelación espacial influye en el tamaño efectivo de la muestra y cuando es moderada en relación con . En cambio, se recupera implícitamente a través de la eliminación específica de la zona en la etapa 1 y la descomposición MSFA en la etapa 2, que tienen en cuenta conjuntamente la dependencia espacial y aprovechan la información de las zonas a través de la estructura de carga compartida.
Construcción de covarianza basada en la referencia a partir de la estructura de adyacencia: facilitando la integración de datos multimodales
Una decisión clave en el modelado de ISPat-3D concierne a la representación de la estructura de interacción célula-célula o marcador-célula. Si bien las matrices de adyacencia son resúmenes naturales de la topología del grafo, no se pueden utilizar directamente como matrices de covarianza dentro de un marco probabilístico gaussiano, ya que no se garantiza que sean semidefinidas positivas y no codifican la magnitud de las relaciones de coexpresión más allá de la conectividad binaria. Por lo tanto, adoptamos una representación basada en la covarianza en todo el proceso, construyendo matrices semidefinidas positivas válidas a partir del MSFA, como se describe en la Sección 2.1.5. Sin embargo, cuando se dispone de conocimientos biológicos previos sobre la adyacencia célula-célula o marcador-célula, por ejemplo, a partir de bases de datos de receptor-ligando o gráficos de proximidad espacial derivados del tejido, es lógico preguntarse si dicha información de adyacencia puede incorporarse para regularizar o informar los patrones de covarianza estimados. Describimos una transformación sistemática que logra esto.
Sea denotar una matriz de adyacencia simétrica que codifica las interacciones conocidas o hipotéticas entre tipos de células, con o, más generalmente, . Para convertir A en una matriz de covarianza de referencia válida , aprovechamos la descomposición aditiva de las funciones de covarianza del proceso gaussiano. Una función definida sobre un dominio de producto se puede escribir en forma aditiva como , donde cada componente es una función univariada de una única dimensión de entrada ([Hastie y Tibshirani, 1990]). Bajo un prior de proceso gaussiano, las funciones aditivas de esta forma corresponden a kernels de covarianza aditivos, y la suma de kernels de covarianza válidos es en sí misma un kernel de covarianza válido ([Bishop, 2006]; [Rasmussen y Williams, 2006]). Esta estructura aditiva justifica la construcción de una covarianza de referencia tratando la matriz de adyacencia como una combinación lineal de componentes semidefinidos positivos de rango uno, cada uno de los cuales corresponde a un término de interacción por pares.
Formalmente, la matriz de covarianza de referencia se obtiene proyectando sobre el cono de matrices simétricas semidefinidas positivas. Una opción natural es establecer para una pequeña constante de regularización elegida para garantizar la definitud positiva, siempre que la matriz resultante tenga valores propios no negativos después de la regularización. Una alternativa más sistemática, particularmente cuando puede tener valores propios negativos debido a su estructura de Laplaciano de grafo, es tomar la matriz positiva definida más cercana a en el sentido de la norma de Frobenius ([Higham, 1988]), o construir directamente a partir de la descomposición espectral de reteniéndose solo los valores propios positivos.
Dado una covarianza de referencia válida , el patrón de interacción específico de la zona basado en la referencia para la región se define como
donde denota la raíz cuadrada simétrica de , obtenida mediante descomposición en autovalores y autovectores como con . La construcción en la Ecuación (14) tiene una interpretación directa: reescala el producto externo de carga específico de la zona por la estructura de covarianza de referencia, de modo que los pares de tipos de células con una fuerte adyacencia previa contribuyan más al patrón específico de la zona que los pares con una adyacencia débil o ausente. Esto actúa como un prior estructural suave sobre la red, preservando la variación específica de la zona impulsada por los datos codificada en al tiempo que ancla la magnitud de la interacción a una escala de referencia informada biológicamente.
Tenga en cuenta que es semidefinida positiva por construcción, ya que para cualquier vector . Esto asegura que siga siendo una matriz de covarianza válida que se puede pasar a los procedimientos de estimación de la matriz de precisión o inferencia de grafos posteriores. La red compartida basada en la referencia análoga es
que regulariza la estructura de interacción compartida mediante la misma covarianza de referencia. En entornos donde no hay información previa de adyacencia disponible, se establece , recuperando los estimadores no regularizados y ya descritos en la Sección anterior.
La salida de ISPat-3D para una sola imagen es, por lo tanto, una red compartida y cinco redes específicas de la zona, que en conjunto proporcionan una caracterización completa de cómo varía la estructura de interacción celular desde una baja hasta una alta densidad tumoral dentro del tejido. Estos patrones de interacción se obtienen como estructuras de independencia condicional que varían a lo largo de la trayectoria tumoral, teniendo en cuenta la característica volumétrica de los datos 3D. Dada la formulación de ISPAT 3D, ahora podemos descubrir los gráficos de interacción receptor-ligando que no se capturan mediante ningún método diseñado para el análisis de imágenes 2D, como ISPAT ([Bhadury et al., 2026]). Presentamos la descripción general esquemática de la canalización en la Figura 1.
Descripción general del marco de modelado
ISPat-3D es un marco bayesiano jerárquico diseñado para caracterizar cómo varían los patrones de interacción célula-célula a lo largo del gradiente de intensidad tumoral dentro de una imagen de tejido. El modelo opera en tres etapas secuenciales dentro de cada imagen: (i) regresión de proceso gaussiano específico de la zona para recuperar superficies de expresión espacial latentes a partir de intensidades de marcadores brutos o estimaciones de densidad de kernel específicas del tipo de célula, (ii) análisis factorial multiestudio (MSFA) en las cinco zonas tumorales para descomponer la covarianza en componentes compartidos y específicos de la zona, y (iii) construcción de red a partir de las matrices de precisión resultantes para representar la estructura de colocalización condicional entre los tipos de células. Estas tres etapas constituyen conjuntamente la inferencia dentro de la imagen.
Notación y estructura de datos
Sea denotar el número de expresiones de tipo celular, y sea el número total de células en la imagen . Los datos para una sola imagen consisten en una matriz de intensidad de tipo celular y una matriz de coordenadas , donde las tres columnas dan las coordenadas espaciales y la anotación específica de la zona que da la etiqueta de la zona tumoral. Para la zona , sea denotar el conjunto de índices de las células asignadas a , de modo que .
Distribución conjunta de las intensidades de tipo celular en las regiones espaciales
Caracterizamos la estructura de colocalización espacial entre intensidades de tipo celular modelando su distribución de intensidad conjunta dentro de cada una de las regiones definidas por la intensidad tumoral. Para una imagen de tejido dada , el perfil de intensidad celular en la ubicación espacial es el vector -dimensional , donde denota la intensidad latente de la célula en la ubicación dentro de la región , correspondiente a la -ésima fila de restringida a las células . La distribución conjunta de estas intensidades se modela como una gaussiana multivariada:
donde es el vector de intensidad media específico de la región y es la matriz de covarianza específica de la región que codifica las relaciones de colocalización por pares entre todas las células dentro de . El número total de células satisface donde .
La matriz de covarianza es el objetivo inferencial principal en esta etapa. Su entrada cuantifica el grado en que las intensidades de las células y covarían en las ubicaciones espaciales dentro de la región , capturando la colocalización espacial cuando es positiva y la exclusión espacial cuando es negativa. La matriz de precisión correspondiente codifica la estructura de independencia condicional: una entrada cero implica que las células y son condicionalmente independientes dadas las intensidades de todas las demás células dentro de , es decir, . Por el contrario, una entrada distinta de cero indica una asociación condicional directa entre las células y que no se explica por sus relaciones mutuas con otras células, y corresponde a una arista en el grafo de interacción no dirigido con conjunto de vértices .
Esta representación de grafo basada en la precisión es preferible a una red de correlación marginal para caracterizar la colocalización celular en conjuntos de datos CyCIF, IMC porque filtra las asociaciones espurias impulsadas por la variación espacial compartida, reteniendo solo las dependencias por pares directas. La estructura del campo aleatorio de Markov gaussiano (GMRF) implícita por proporciona así un resumen parsimonioso e interpretable de la arquitectura de interacción celular local dentro de cada zona tumoral. No estimamos directamente a partir de la submatriz de restringida a , ya que la estimación directa sería poco confiable cuando la autocorrelación espacial infla el tamaño de muestra efectivo y cuando es moderado en relación con . En cambio, se recupera implícitamente a través de la eliminación de ruido específico de la zona en la Etapa 1 y la descomposición MSFA en la Etapa 2, que tienen en cuenta conjuntamente la dependencia espacial y aprovechan la información de las zonas a través de la estructura de carga compartida.
Etapa 1: Regresión gaussiana anisotrópica específica de la zona
Dentro de cada zona y para cada célula , modelamos la intensidad observada en la célula como la suma de tres componentes:
donde es un intercepto global para la célula , es un campo de molestia correlacionado espacialmente que codifica la variación de intensidad local dentro de la zona , es una señal no estructurada espacialmente extraída de una covarianza entre células que captura los patrones de interacción célula-célula y es el objetivo del MSFA de la Etapa 2, y es un término de ruido independiente que codifica el ruido de medición. La etapa del GP estima y elimina ; el residual se pasa luego al MSFA.
Especificación del kernel.
ISPat-3D admite dos kernels de covarianza anisotrópicos que tratan el plano del tejido y el eje - con diferentes longitudes de escala y , respectivamente. Para las células y en la zona , la distancia anisotrópica es
El kernel Matérn-3/2 es entonces
y el kernel exponencial cuadrado (RBF) es
El Matérn-3/2 se prefiere en la práctica porque impone trayectorias de muestra diferenciables una vez, lo cual es una suposición de suavidad más realista para los procesos espaciales a nivel celular que el RBF infinitamente diferenciable. La positividad de la matriz del kernel se verifica en tiempo de ejecución y se aplica mediante la proyección positiva definida más cercana cuando es necesario. Se debe observar que esta elección particular de la longitud de escala en el kernel nos permite capturar la noción volumétrica de los datos 3D. Dado que estas imágenes 3D son secciones seriadas de un tumor volumétrico real, la elección de tal extensión a través de la anisotropía tendría en cuenta la dirección de variación axial geométrica en cada regresión espacial.
Estimación de hiperparámetros.
El vector de hiperparámetros se estima conjuntamente maximizando la verosimilitud marginal del GP, obtenida integrando el campo latente analíticamente. Dejando , la verosimilitud marginal es
Este objetivo de máxima verosimilitud de tipo II se optimiza mediante L-BFGS-B ([Byrd et al., 1995]; [Zhu et al., 1997]) con parámetros reparametrizados en la escala logarítmica para hacer cumplir la positividad. Los límites de la longitud de escala se anclan al rango espacial empírico de la zona : el límite inferior se establece en un décimo de la distancia mediana por pares y el límite superior en diez veces la mediana, por separado para el plano y el eje -. Este límite adaptativo de datos evita soluciones degeneradas en longitudes de escala cercanas a cero, que corresponden a la interpolación exacta, o en longitudes de escala que exceden la extensión del dominio, que no se pueden identificar a partir de los datos ([Rasmussen y Williams, 2006]). El enfoque de verosimilitud marginal elimina la necesidad de validación cruzada a nivel de zona y célula y es una práctica estándar en la transcriptómica espacial ([Sun et al., 2020]).
Estimación del campo latente.
La intensidad observada para la célula en la zona se descompone como
donde es la molestia espacial estimada y es el residual ajustado espacialmente que lleva la estructura de red entre células analizada posteriormente por MSFA. Dados los hiperparámetros optimizados , la media posterior del campo de molestia espacial se recupera mediante la identidad gaussiana condicional estándar ([Rasmussen y Williams, 2006]):
donde . La entrada de MSFA es entonces el residual ajustado espacialmente
que retiene solo la variación estructurada no espacial entre las células. Al apilar a través de células, se obtiene la matriz ajustada espacialmente , que se pasa a MSFA como la entrada observada para la zona . La solución se implementa mediante descomposición de Cholesky para la estabilidad numérica. La estimación a través de las células dentro de cada zona se paraleliza en los núcleos disponibles.
Especificación del kernel.
ISPat-3D admite dos kernels de covarianza anisotrópicos que tratan el plano del tejido y el eje - con diferentes longitudes de escala y , respectivamente. Para las células y en la zona , la distancia anisotrópica es
El kernel Matérn-3/2 es entonces
y el kernel exponencial cuadrado (RBF) es
En la práctica, se prefiere el modelo Matérn-3/2 porque impone trayectorias de muestra con una sola derivada continua, lo cual representa una suposición de suavidad más realista para los procesos espaciales a nivel celular que el modelo RBF con infinitas derivadas continuas. La positividad definida de la matriz del kernel se verifica en tiempo de ejecución y se aplica mediante la proyección positiva definida más cercana cuando sea necesario. Cabe destacar que esta elección particular de la escala de longitud en el kernel nos permite capturar la noción volumétrica de los datos 3D. Dado que estas imágenes 3D son secciones seriadas de un tumor volumétrico real, la elección de una extensión a través de la anisotropía tiene en cuenta la dirección axial geométrica de la variación en cada regresión espacial.
Estimación de hiperparámetros.
El vector de hiperparámetros se estima conjuntamente maximizando la función de verosimilitud marginal del GP (proceso gaussiano), obtenida integrando el campo latente analíticamente. Denotando , la función de verosimilitud marginal es
Este objetivo de máxima verosimilitud de tipo II se optimiza mediante L-BFGS-B ([Byrd et al., 1995]; [Zhu et al., 1997]) con parámetros reparametrizados en la escala logarítmica para garantizar la positividad. Los límites de la escala de longitud se anclan al rango espacial empírico de la zona: el límite inferior se establece en un décimo de la distancia mediana por pares y el límite superior en diez veces la mediana, por separado para el plano y el eje . Este ajuste de límites adaptativo a los datos evita soluciones degeneradas en escalas de longitud cercanas a cero, que corresponden a la interpolación exacta, o en escalas de longitud que exceden la extensión del dominio, que no se pueden identificar a partir de los datos ([Rasmussen y Williams, 2006]). El enfoque de la verosimilitud marginal elimina la necesidad de validación cruzada a nivel de zona y célula, y es una práctica estándar en la transcriptómica espacial ([Sun et al., 2020]).
Estimación del campo latente.
La intensidad observada para la célula en la zona se descompone como
donde es el término de confusión espacial estimado y es el residuo espacialmente ajustado que contiene la estructura de red entre células, que se analiza posteriormente mediante MSFA (análisis factorial multiestudio). Dados los hiperparámetros optimizados , la media posterior del campo de confusión espacial se recupera mediante la identidad gaussiana condicional estándar ([Rasmussen y Williams, 2006]):
donde . La entrada de MSFA es entonces el residuo espacialmente ajustado
que conserva solo la variación estructurada no espacial entre las células. Al apilar las células, se obtiene la matriz espacialmente ajustada , que se pasa a MSFA como la entrada observada para la zona . La solución se implementa mediante la descomposición de Cholesky para garantizar la estabilidad numérica. La estimación de las células dentro de cada zona se paraleliza en los núcleos disponibles.
Etapa 2: Análisis factorial multiestudio en las zonas del tumor
Después de la etapa 1, cada imagen produce cinco matrices latentes específicas de la zona , cada una con una dimensión de . Estas matrices se tratan como las entradas de datos para un modelo de análisis factorial multiestudio (MSFA) que descompone la covarianza entre los tipos de células en un componente compartido en las cinco zonas de CK y cinco componentes de residuo específicos de la zona. La motivación biológica es directa: los patrones de interacción célula-célula que persisten independientemente de la densidad tumoral local reflejan características estructurales constitutivas del microambiente tumoral, mientras que los patrones específicos de la zona capturan cómo las interacciones se reconfiguran a lo largo del gradiente tumoral.
El modelo MSFA para la zona en la célula es
donde es la matriz de carga compartida con factores latentes comunes a todas las zonas, son las puntuaciones de los factores compartidos, con es la matriz de carga específica de la zona, son las puntuaciones específicas de la zona y con . La matriz de covarianza implícita a nivel de zona es
La inferencia se realiza mediante MCMC típico o inferencia variacional de ascenso de coordenadas (CAVI) o inferencia variacional estocástica (SVI), todos los cuales producen medias posteriores y como los principales objetivos inferenciales. Para nuestra tarea de inferencia, empleamos MSFA utilizando CAVI.
Etapa 3: Construcción de la red
La red de interacción compartida y las cinco redes de interacción específicas de la zona se construyen a partir de las matrices de carga de MSFA de la siguiente manera. La red compartida captura los patrones de colocalización de los tipos de células que son consistentes en todas las zonas de CK:
La red específica de la zona para la zona aumenta el componente compartido con la desviación específica de la zona:
En ambos casos, la entrada de de codifica la fuerza de la relación de colocalización funcional entre los tipos de células y , con entradas distintas de cero que corresponden a los bordes en el grafo no dirigido donde . La interpretación de independencia condicional se deriva directamente del marco de campo aleatorio gaussiano: , que bajo el modelo gaussiano multivariado es equivalente a un cero en la matriz de precisión .
Construcción de la covarianza basada en referencias a partir de la estructura de adyacencia: facilitando la integración de datos multimodales
Una decisión de modelado clave en ISPat-3D concierne a la representación de la estructura de interacción célula-célula o célula-marcador-célula-marcador. Si bien las matrices de adyacencia son resúmenes naturales de la topología del grafo, no se pueden utilizar directamente como matrices de covarianza dentro de un marco probabilístico gaussiano porque no se garantiza que sean semidefinidas positivas y no codifican la magnitud de las relaciones de coexpresión más allá de la conectividad binaria. Por lo tanto, adoptamos una representación basada en la covarianza en todo el proceso, construyendo matrices semidefinidas positivas válidas a partir de MSFA, como se describe en la sección 2.1.5. Sin embargo, cuando se dispone de conocimientos biológicos previos sobre la adyacencia célula-célula o célula-marcador-célula-marcador, por ejemplo, a partir de bases de datos de receptor-ligando o grafos de proximidad espacial derivados del tejido, surge la pregunta de si esta información de adyacencia se puede incorporar para regularizar o informar los patrones de covarianza estimados. Describimos una transformación sistemática que logra esto.
Sea denota una matriz de adyacencia simétrica que codifica las interacciones conocidas o hipotéticas entre tipos de células, con o más generalmente. Para convertir A en una matriz de covarianza de referencia válida , aprovechamos la descomposición aditiva de las funciones de covarianza del proceso gaussiano. Una función definida sobre un dominio de producto se puede escribir en forma aditiva como , donde cada componente es una función univariada de una sola dimensión de entrada ([Hastie y Tibshirani, 1990]). Bajo un prior de proceso gaussiano, las funciones aditivas de este tipo corresponden a kernels de covarianza aditivos, y la suma de kernels de covarianza válidos es en sí misma un kernel de covarianza válido ([Bishop, 2006]; [Rasmussen y Williams, 2006]). Esta estructura aditiva justifica la construcción de una covarianza de referencia tratando la matriz de adyacencia como una combinación lineal de componentes semidefinidos positivos de rango uno, cada uno de los cuales corresponde a un término de interacción por pares.
Formalmente, la matriz de covarianza de referencia se obtiene proyectando en el cono de matrices simétricas semidefinidas positivas. Una opción natural es establecer para una pequeña constante de regularización elegida para garantizar la positividad definida, siempre que la matriz resultante tenga valores propios no negativos después de la regularización. Una alternativa más sistemática, particularmente cuando puede tener valores propios negativos debido a su estructura de Laplaciano de grafo, es tomar la matriz semidefinida positiva más cercana a en el sentido de la norma de Frobenius ([Higham, 1988]), o construir directamente a partir de la descomposición espectral de reteniendo solo los valores propios positivos.
Dada una covarianza de referencia válida , el patrón de interacción específico de la zona basado en referencias para la región se define como
donde denota la raíz cuadrada de la matriz simétrica , obtenida mediante la descomposición en autovalores como . La construcción en la ecuación (14) tiene una interpretación directa: reescala el producto externo de carga específico de la zona por la estructura de covarianza de referencia, de modo que los pares de tipos de células con una fuerte adyacencia previa contribuyan más al patrón específico de la zona que los pares con una adyacencia débil o ausente. Esto actúa como un prior estructural suave en la red, preservando la variación específica de la zona impulsada por los datos codificada en mientras ancla la magnitud de la interacción a una escala de referencia informada biológicamente.
Tenga en cuenta que es semidefinida positiva por construcción, ya que para cualquier vector . Esto garantiza que siga siendo una matriz de covarianza válida que se puede pasar a los procedimientos de estimación de la matriz de precisión o inferencia de grafos posteriores. La red compartida basada en referencias análoga es
que regulariza la estructura de interacción compartida mediante la misma covarianza de referencia. En los entornos en los que no hay información de adyacencia previa disponible, se establece , recuperando los estimadores no regularizados y ya descritos en la sección anterior.
La salida de ISPat-3D para una sola imagen es, por lo tanto, una red compartida y cinco redes específicas de la zona, que en conjunto proporcionan una caracterización completa de cómo varía la estructura de interacción celular desde una baja hasta una alta densidad tumoral dentro del tejido. Estos patrones de interacción se obtienen como estructuras de independencia condicional que varían a lo largo de la trayectoria del tumor, teniendo en cuenta la característica volumétrica de los datos 3D. Dada la formulación de ISPAT 3D, ahora podemos descubrir los grafos de interacción receptor-ligando que no se capturan mediante ningún método diseñado para el análisis de imágenes 2D, como ISPAT ([Bhadury et al., 2026]). Presentamos la descripción general esquemática del flujo de trabajo en la figura 1.
Estudio de simulación
Mecanismo de generación de datos
Diseñamos un estudio de simulación para evaluar la capacidad de ISPat-3D para recuperar redes de interacción compartidas y específicas de la zona en condiciones controladas. Los datos sintéticos se generaron utilizando un modelo jerárquico que refleja la estructura asumida del flujo de trabajo de ISPat-3D, incorporando la dependencia espacial tridimensional anisotrópica, la estructura factorial multiestudio en las zonas y configuraciones de tamaño de clúster realistas.
Para cada replicación, las ubicaciones espaciales para zonas se extrajeron de la siguiente manera. Las coordenadas para las células en la zona se muestrearon a partir de una gaussiana bivariada centrada en con una desviación estándar de 1,5, y la coordenada se extrajo de forma independiente de Uniform(0, 1). Por lo tanto, las zonas están espacialmente separadas en el plano del tejido y comparten un rango común, lo que refleja la estructura de sección confocal de los datos multiplexados.
La estructura factorial multiestudio se especificó con factores latentes compartidos, lo que coincide con el recuento de factores utilizado en el momento de la estimación. Las cargas compartidas se extrajeron entrada por entrada de . Las cargas específicas de la zona se extrajeron de manera similar, con el número de factores específicos de la zona muestreados uniformemente de con reemplazo en las zonas. Las varianzas idiosincrásicas se extrajeron de Uniform(0,1). Las verdaderas matrices de covarianza a nivel de zona se obtuvieron a partir de las cuales se muestrearon perfiles celulares multivariados fila por fila, con cada fila que representa la señal de red para una célula.
Los efectos aleatorios espaciales anisotrópicos se extrajeron por célula por zona de una gaussiana multivariada de media cero con covarianza , donde y es la matriz de correlación bajo el kernel Matérn-3/2 o RBF. Ambos kernels utilizan escalas de longitud separadas y para el plano y el eje , respectivamente, calculadas como la distancia mediana por pares entre las células dentro de la zona a lo largo de cada eje. La matriz de células observada final se generó como
donde son los interceptos específicos de la célula y la zona, es el -ésimo elemento de la -ésima fila y . Por lo tanto, la confusión espacial y la señal de red son aditivas e independientes por construcción, lo que proporciona una base de verdad limpia contra la cual evaluar la desconfusión espacial de la etapa 1 y la recuperación de la red de la etapa 2.
Diseño de la simulación
Evaluamos ISPat-3D en una combinación factorial de configuraciones. El número de células varió de . Se consideraron seis configuraciones de tamaño de clúster, que abarcan asignaciones equilibradas y no equilibradas en las tres zonas: (300, 300, 300), (250, 250, 250), (250, 300, 300), (250, 250, 300), (300, 250, 250) y (300, 300, 250). Se evaluaron ambas opciones de kernel (Matérn-3/2 y RBF). Todos los resultados se promediaron en 10 replicaciones independientes.
La red compartida "ground truth" se definió como , con el objetivo de recuperar la matriz de covarianza compartida de bajo rango mediante la capa MSFA. Las redes específicas de zona se definieron como , donde es la varianza idiosincrásica específica de la zona, lo cual es consistente con la estructura de covarianza generativa en la Sección 2.1.6. Las matrices "ground truth" se extrajeron dentro de cada réplica de forma independiente para garantizar la alineación entre las simulaciones y las redes estimadas correspondientes.
Métricas de evaluación
Se utilizaron tres métricas complementarias para evaluar el rendimiento de la recuperación. El coeficiente RV ([Robert y Escoufier, 1976]) mide la similitud entre dos matrices semidefinidas positivas y toma valores en [0, 1], donde RV = 1 indica un acuerdo estructural perfecto. Se calculó entre las matrices de red verdaderas y estimadas, tanto para la red compartida como para cada una de las tres redes específicas de zona. Para la detección de aristas, tanto las redes verdaderas como las estimadas se binarizaron utilizando un umbral absoluto de 0.1: se declaró una arista verdadera donde la red verdadera tenía una entrada no nula fuera de la diagonal, y una arista estimada donde . A continuación, se calcularon la potencia estadística (tasa de verdaderos positivos) y la tasa de falsos descubrimientos (FDR) a partir de la matriz de confusión resultante. El tiempo de cálculo en segundos se registró como una métrica práctica de escalabilidad.
Resultados
Precisión de la recuperación de la red (coeficiente RV).
La Figura 2 muestra los coeficientes RV medios en todas las configuraciones de tamaño de clúster, recuentos de células y kernels. ISPat-3D logra valores de RV consistentemente altos, con un RV medio que oscila entre aproximadamente 0.65 y 1.0 en todos los entornos. La red compartida se recupera con la mayor fidelidad, lo cual es de esperar, ya que el componente compartido agrupa información de las tres zonas. Las redes específicas de zona se recuperan con valores de RV ligeramente más bajos, pero aún así fuertes, lo que refleja la dificultad adicional de diferenciar las desviaciones a nivel de zona de la estructura compartida. El rendimiento es en gran medida estable en las seis configuraciones de tamaño de clúster, lo que indica robustez frente a desequilibrios moderados en los tamaños de las zonas. Los kernels Matérn-3/2 y RBF tienen un rendimiento comparable en términos de RV medio, aunque Matérn-3/2 presenta una variabilidad ligeramente menor entre las réplicas. Aumentar de 15 a 25 no degrada sistemáticamente la recuperación, lo que sugiere que la capa MSFA se escala adecuadamente con el número de células. La desviación estándar del coeficiente RV se mantiene por debajo de 0.10 en todos los entornos, lo que confirma una estimación estable en todas las réplicas.
Detección de aristas: potencia y tasa de falsos descubrimientos.
La Figura 3 presenta la potencia estadística y la FDR para la detección de aristas en todos los entornos. ISPat-3D logra una alta potencia, consistentemente por encima de 0.85 en todas las configuraciones y kernels, con una potencia media que se acerca a 1.0 en configuraciones equilibradas y de mayor tamaño. La potencia es uniformemente alta tanto para las redes compartidas como para las específicas de zona, sin una degradación sistemática a medida que aumenta. El comportamiento de la FDR es más variable entre los dos tipos de red. La red compartida mantiene una FDR baja (cercana a cero) en todos los entornos, mientras que las redes específicas de zona presentan una FDR moderada que oscila hasta aproximadamente 0.1 en los tamaños de clúster más pequeños, con valores que disminuyen a medida que aumenta, lo cual es consistente con una mayor precisión de la estimación en tamaños de muestra más grandes. Este patrón refleja la característica operativa esperada de un umbral fijo en condiciones variables de señal a ruido: el umbral de 0.1 es lo suficientemente conservador para controlar las declaraciones espurias de aristas en la red compartida, donde la agrupación entre zonas produce un tamaño de muestra efectivo alto, pero es algo liberal para las redes específicas de zona cuando es pequeño.
Tiempo de cálculo.
La Figura 4 muestra el tiempo de cálculo medio en función de la configuración del tamaño del clúster y el recuento de células, desglosado por kernel. El tiempo de cálculo se escala aproximadamente de forma lineal con el recuento total de células y con , lo cual es consistente con el ajuste paralelo de GP por célula que subyace al paso de desconfusión espacial. El kernel Matérn-3/2 incurre en un costo adicional modesto en relación con RBF, atribuible a la verificación de la positividad definida y la proyección al punto PD más cercano aplicada a la matriz de covarianza Matérn-3/2. En todos los entornos, los tiempos de cálculo oscilan entre aproximadamente 40 y 120 segundos, lo que confirma que ISPat-3D es computacionalmente viable. Pero enfatizamos que el tiempo de cálculo aumenta especialmente debido al paso de optimización involucrado, pero al mismo tiempo aumenta la precisión de la estimación de la red, con el número de puntos espaciales considerados para el análisis. Aunque hemos ejecutado este método utilizando clústeres de alto rendimiento con gran capacidad de memoria a la escala de los conjuntos de datos CyCIF e IMC considerados en este manuscrito.
Mecanismo de generación de datos
Diseñamos un estudio de simulación para evaluar la capacidad de ISPat-3D para recuperar redes de interacción compartidas y específicas de zona en condiciones controladas. Se generaron datos sintéticos utilizando un modelo jerárquico que refleja la estructura asumida de la canalización ISPat-3D, incorporando dependencia espacial tridimensional anisotrópica, estructura factorial multiestudio en las zonas y configuraciones realistas del tamaño del clúster.
Para cada réplica, las ubicaciones espaciales de zonas se dibujaron de la siguiente manera. Las coordenadas de las células en la zona se muestrearon a partir de una distribución gaussiana bivariada centrada en con una desviación estándar de 1.5, y la coordenada se dibujó de forma independiente a partir de una distribución uniforme (0, 1). Por lo tanto, las zonas están espacialmente separadas en el plano del tejido, al tiempo que comparten un rango común, lo que refleja la estructura de la sección confocal de los datos multiplexados.
La estructura factorial multiestudio se especificó con factores latentes compartidos, lo que coincide con el recuento de factores utilizado en el momento de la estimación. Los factores compartidos se dibujaron entrada por entrada a partir de . Los factores específicos de zona se dibujaron de forma similar, con el número de factores específicos de zona muestreado uniformemente a partir de con reemplazo en todas las zonas. Las varianzas idiosincrásicas se dibujaron a partir de una distribución uniforme (0.1, 1). Las matrices de covarianza a nivel de zona verdaderas se obtuvieron a partir de las cuales se muestrearon perfiles celulares multivariados gaussianos fila por fila, con cada fila representando la señal de la red para una célula.
Los efectos aleatorios espaciales anisotrópicos se dibujaron por célula por zona a partir de una distribución gaussiana multivariada de media cero con covarianza , donde y es la matriz de correlación bajo el kernel Matérn-3/2 o RBF. Ambos kernels utilizan longitudes de escala separadas y para el plano y el eje respectivamente, calculadas como la distancia media por pares entre las células dentro de la zona a lo largo de cada eje. La matriz de células observada final se generó como
donde son los interceptos específicos de la célula y la zona, es el -ésimo elemento de la -ésima fila de , y . Por lo tanto, el ruido espacial y la señal de la red son aditivos e independientes por construcción, lo que proporciona una base sólida para evaluar la desconfusión espacial del Paso 1 y la recuperación de la red del Paso 2.
Diseño de la simulación
Evaluamos ISPat-3D en una combinación factorial de entornos. El número de células varió entre . Se consideraron seis configuraciones de tamaño de clúster, que abarcan asignaciones equilibradas y desequilibradas en las tres zonas: (300, 300, 300), (250, 250, 250), (250, 300, 300), (250, 250, 300), (300, 250, 250) y (300, 300, 250). Se evaluaron ambas opciones de kernel (Matérn-3/2 y RBF). Todos los resultados se promediaron en 10 réplicas independientes.
La red compartida "ground truth" se definió como , con el objetivo de recuperar la matriz de covarianza compartida de bajo rango mediante la capa MSFA. Las redes específicas de zona se definieron como , donde es la varianza idiosincrásica específica de la zona, lo cual es consistente con la estructura de covarianza generativa en la Sección 2.1.6. Las matrices "ground truth" se extrajeron dentro de cada réplica de forma independiente para garantizar la alineación entre las simulaciones y las redes estimadas correspondientes.
Precisión de la recuperación de la red (coeficiente RV).
La Figura 2 muestra los coeficientes RV medios en todas las configuraciones de tamaño de clúster, recuentos de células y kernels. ISPat-3D logra valores de RV consistentemente altos, con un RV medio que oscila entre aproximadamente 0.65 y 1.0 en todos los entornos. La red compartida se recupera con la mayor fidelidad, lo cual es de esperar, ya que el componente compartido agrupa información de las tres zonas. Las redes específicas de zona se recuperan con valores de RV ligeramente más bajos, pero aún así fuertes, lo que refleja la dificultad adicional de diferenciar las desviaciones a nivel de zona de la estructura compartida. El rendimiento es en gran medida estable en las seis configuraciones de tamaño de clúster, lo que indica robustez frente a desequilibrios moderados en los tamaños de las zonas. Los kernels Matérn-3/2 y RBF tienen un rendimiento comparable en términos de RV medio, aunque Matérn-3/2 presenta una variabilidad ligeramente menor entre las réplicas. Aumentar de 15 a 25 no degrada sistemáticamente la recuperación, lo que sugiere que la capa MSFA se escala adecuadamente con el número de células. La desviación estándar del coeficiente RV se mantiene por debajo de 0.10 en todos los entornos, lo que confirma una estimación estable en todas las réplicas.
La figura 2 muestra los coeficientes RV medios en todas las configuraciones de tamaño de clúster, recuentos de células y kernels. ISPat-3D logra de manera consistente valores RV altos, con un RV medio que oscila entre aproximadamente 0,65 y 1,0 en todos los entornos. La red compartida se recupera con la mayor fidelidad, lo cual es de esperar, ya que el componente compartido agrupa información de las tres zonas. Las redes específicas de cada zona se recuperan con valores RV ligeramente más bajos, pero aún así fuertes, lo que refleja la dificultad adicional de separar las desviaciones a nivel de zona de la estructura compartida. El rendimiento es en gran medida estable en las seis configuraciones de tamaño de clúster, lo que indica robustez frente a desequilibrios moderados en los tamaños de las zonas. Los kernels Matérn-3/2 y RBF tienen un rendimiento comparable en términos de RV medio, aunque Matérn-3/2 presenta una variabilidad ligeramente menor entre las réplicas. El aumento de de 15 a 25 no degrada sistemáticamente la recuperación, lo que sugiere que la capa MSFA se adapta adecuadamente al número de células. La desviación estándar del coeficiente RV se mantiene por debajo de 0,10 en todos los entornos, lo que confirma una estimación estable en todas las réplicas.
Detección de bordes: potencia y tasa de falsos descubrimientos.
La figura 3 presenta la potencia estadística y la FDR para la detección de bordes en todos los entornos. ISPat-3D logra una alta potencia, consistentemente por encima de 0,85 en todas las configuraciones y kernels, con una potencia media que se acerca a 1,0 en las configuraciones equilibradas y de mayor tamaño de clúster. La potencia es uniformemente alta tanto para las redes compartidas como para las específicas de cada zona, sin una degradación sistemática a medida que aumenta. El comportamiento de la FDR es más variable entre los dos tipos de red. La red compartida mantiene una FDR baja (cercana a cero) en todos los entornos, mientras que las redes específicas de cada zona presentan una FDR moderada que alcanza aproximadamente 0,1 en los tamaños de clúster más pequeños, con valores que disminuyen a medida que aumenta, lo que es consistente con una mayor precisión de la estimación en tamaños de muestra más grandes. Este patrón refleja la característica operativa esperada de un umbral fijo en condiciones variables de señal a ruido: el umbral de 0,1 es lo suficientemente conservador para controlar las declaraciones espurias de bordes en la red compartida, donde la agrupación entre zonas produce un tamaño de muestra efectivo alto, pero es algo más permisivo para las redes específicas de cada zona cuando es pequeño.
Tiempo de computación.
La figura 4 muestra el tiempo de computación medio en función de la configuración del tamaño del clúster y el recuento de células, desglosado por kernel. El tiempo de computación aumenta aproximadamente de forma lineal con el recuento total de células y con , lo que es consistente con el ajuste paralelo por célula del GP subyacente al paso de desambiguación espacial. El kernel Matérn-3/2 incurre en un costo adicional modesto en relación con RBF, atribuible a la verificación de la positividad definida y la proyección de la matriz PD más cercana aplicada a la matriz de covarianza Matérn-3/2. En todos los entornos, los tiempos de computación oscilan entre aproximadamente 40 y 120 segundos, lo que confirma que ISPat-3D es computacionalmente viable. Pero enfatizamos que el tiempo de computación aumenta especialmente debido al paso de optimización involucrado, pero al mismo tiempo aumenta la precisión de la estimación de la red, con el número de puntos espaciales considerados para el análisis. Aunque hemos ejecutado este método utilizando clústeres de alto rendimiento con gran capacidad de memoria a la escala de los conjuntos de datos CyCIF e IMC considerados en este manuscrito.
Descripción de los datos de cáncer colorrectal
Aplicamos ISPat-3D al conjunto de datos de inmunofluorescencia cíclica (CyCIF) de cáncer colorrectal (CRC) publicado por [Lin et al. (2023)]. El conjunto de datos comprende una única muestra sometida a una imagen tridimensional completa de secciones seriadas (CRC1). Dado que ISPat-3D requiere una estructura espacial tridimensional real, es decir, coordenadas globales XY consistentes en las secciones seriadas registradas y un eje Z físico, CRC1 satisface los requisitos estructurales del método.
CRC1 es un adenocarcinoma colorrectal poco diferenciado en etapa IIIB con alta inestabilidad de microsatélites e histomorfología compleja. La muestra se seccionó en serie en 106 cortes de parafina con un grosor de , de los cuales se seleccionaron 25 secciones CyCIF en índices físicos no consecutivos para maximizar la profundidad total reconstruida a lo largo del eje Z, al tiempo que se omitían las secciones de H&E intercaladas. A cada sección se le asignó una coordenada de profundidad física , donde es el índice de la sección, lo que da como resultado una profundidad reconstruida total que abarca de 8 a . Se realizó una imagen CyCIF de toda la lámina utilizando 102 anticuerpos que cubren marcadores de linaje epitelial, inmunitario y estromal, así como marcadores del estado del ciclo celular, la actividad de señalización y la expresión de puntos de control inmunitario ([Lin et al., 2023]). Las imágenes se unieron, se registraron en las secciones seriadas y se segmentaron utilizando la canalización MCMICRO ([Schapiro et al., 2022]), lo que dio como resultado coordenadas XY a nivel de tejido globalmente consistentes para cada célula segmentada que son directamente comparables en las 25 secciones Z.
Análisis de datos de cáncer colorrectal CyCIF 3D
Muestreo espacial y estimación de la densidad del kernel
Con este fin, las células de la imagen 3D de toda la lámina se estratificaron por zona de intensidad tumoral, definida como cinco categorías ordenadas de densidad local de células tumorales: muy baja, baja, intermedia, alta y muy alta, que capturan con precisión el gradiente de heterogeneidad de las células tumorales. Debido al volumen de los datos con miles de millones de células presentes, por limitaciones computacionales y límites metodológicos, dentro de cada zona, extrajimos tres submuestras espacialmente estratificadas independientes de 50.000, 100.000 y 150.000 células, donde la estratificación se realizó en una cuadrícula de las coordenadas xyz para preservar la cobertura espacial en toda la sección del tejido. Para cada submuestra y cada tipo de célula, estimamos una superficie de intensidad espacial continua utilizando la estimación de la densidad del kernel (KDE), evaluada en las ubicaciones de las células observadas. Las superficies KDE resultantes se transformaron logarítmicamente para estabilizar el rango dinámico antes del modelado posterior.
Canalización ISPat-3D
Se aplicó la canalización ISPat-3D para modelar conjuntamente la codistribución espacial de nueve tipos de células: tumor, células T CD8+ (CD8T), células T CD4+ (CD4T), células T reguladoras (Treg), células T pan (T_cell), células B, macrófagos, otras células inmunitarias y estroma. Para cada tipo de célula y cada zona, se ajustó una regresión de proceso gaussiano (GP) a la superficie KDE transformada logarítmicamente utilizando un kernel Matérn con parámetros de longitud de escala espacial y axial separados, ambos optimizados mediante la función de verosimilitud marginal L-BFGS-B. El residuo espacial ajustado para cada tipo de célula se obtuvo restando la tendencia espacial estimada de la superficie observada.
MSFA descompuso la matriz de residuos entre las zonas en una matriz de carga de factores compartidos y matrices de carga específicas de la zona , estimadas mediante inferencia variacional de ascenso de coordenadas, como se describió anteriormente. A partir de estos, se construyó una red de covarianza compartida y redes de covarianza específicas de la zona , cada una de dimensión , donde .
Agregación entre réplicas de submuestreo
Para reducir la dependencia de cualquier submuestra, se estimaron las redes de correlación parcial por separado para cada una de las tres réplicas de submuestreo (50.000, 100.000 y 150.000 células por zona) y luego se combinaron. Para cada réplica, las correlaciones parciales se obtuvieron de la red de covarianza mediante la inversión de la matriz de precisión: dado , la correlación parcial entre los tipos de células y es
Las tres matrices de correlación parcial de réplica se agregaron utilizando la transformación de Fisher . Cada elemento se asignó a , se promedió entre las réplicas y se transformó de nuevo: . Este enfoque es estadísticamente preferible al promedio directo porque las correlaciones parciales están acotadas en [−1, 1] y su distribución de muestreo está sesgada cerca del límite, mientras que la transformación de Fisher las asigna a una escala aproximadamente normal y no acotada en la que el promedio es válido. Los bordes con por debajo del percentil 30 de todas las correlaciones parciales absolutas fuera de la diagonal se suprimieron para facilitar la claridad visual. Las seis redes resultantes, una compartida y cinco específicas de la zona, se muestran en la figura 5.
Redes de interacción entre tipos de células en las zonas de densidad tumoral
Se aplicó ISPat-3D a la muestra CRC1 para recuperar una red de interacción compartida y cinco redes específicas de la zona, estratificadas por la densidad local de células tumorales. Las asociaciones condicionales por red se muestran como redes de correlación parcial en la figura 5. Describimos cada red a su vez, teniendo en cuenta que estos patrones de interacción se recuperan como estructuras de independencia condicional que varían a lo largo de la trayectoria tumoral, teniendo en cuenta la característica volumétrica de los datos 3D. Dada la formulación de ISPAT 3D, ahora podemos descubrir los gráficos de interacción ligando-receptor que no se capturan mediante ningún método diseñado para el análisis de imágenes 2D.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales que son consistentes en las cinco zonas de densidad tumoral y, por lo tanto, refleja las características estructurales del microambiente tumoral que no son específicas de ningún régimen de carga tumoral local. El borde dominante es una fuerte correlación parcial positiva entre Macrófago y Estroma , lo que indica que la densidad espacial de los macrófagos covaría con la densidad del estroma, incluso después de tener en cuenta todos los demás tipos de células y eliminar las tendencias espaciales a gran escala mediante la etapa del proceso gaussiano. Este patrón es consistente con la localización bien establecida de los macrófagos asociados al tumor dentro de los compartimentos del estroma en el cáncer colorrectal ([Lin et al., 2023]), pero la magnitud y la independencia de la zona de esta asociación condicional no se habían cuantificado previamente como una característica de red en los datos de imagen tridimensional. Los segundo y tercer bordes más fuertes son negativos: las células inmunitarias se asocian negativamente tanto con Treg como con Tcell , y Tcell se asocia negativamente con Treg . Estas grandes correlaciones parciales negativas sugieren una exclusión espacial entre el compartimento de células T convencionales y las poblaciones inmunitarias reguladoras después de condicionar sobre la composición completa de los tipos de células, un patrón que no se captura mediante el simple análisis de coocurrencia o proximidad del vecino más cercano. En particular, [Lin et al. (2023)] describieron la colocalización de Treg con las células T citotóxicas CD8+ en el borde invasor como una característica de la supresión inmunitaria en este tumor, pero ese análisis se basó en la proximidad espacial marginal en lugar de en la estimación de la red condicional. Las correlaciones parciales negativas que observamos aquí sugieren que, cuando se mantiene fijo el contexto inmunológico completo de cada región, Treg y las células T convencionales ocupan nichos espaciales mutuamente excluyentes a nivel de todo el tejido, lo que no se puede recuperar a partir del análisis de proximidad por pares 2D y se ve oscurecido en cualquier sección histológica individual por la variabilidad de sección a sección en la infiltración inmunitaria en profundidad.
Dos bordes compartidos adicionales se extienden más allá de lo que [Lin et al. (2023)] caracterizó: una asociación positiva entre Bcell y Estroma y una asociación negativa entre Bcell y Macrófago . El compartimento de células B en CRC1 se señaló en el estudio original principalmente en el contexto de las estructuras linfoides terciarias (TLS), pero el acoplamiento espacial condicional de las células B con el andamiaje del estroma y su exclusión condicional de las regiones densas en macrófagos no se modelaron. Estos bordes sugieren que la arquitectura del estroma sirve como el sustrato organizador para el posicionamiento de las células B en este tumor, al tiempo que es el entorno del que los macrófagos excluyen a las células B, posiblemente porque los nichos del estroma densos en macrófagos están polarizados hacia una función inmunosupresora en lugar de una función organizadora del linaje.
Zona de densidad tumoral muy baja.
En las regiones con una carga tumoral mínima, el módulo de células T ya está presente estructuralmente: las células CD4T y CD8T están asociadas positivamente, y tanto las células CD4T como las CD8T están asociadas positivamente con las células Treg. La dirección de las interacciones CD4T↔Treg y CD8T↔Treg en esta zona es positiva, en contraste con las interacciones Treg negativas observadas en la red compartida. Esto no es una contradicción, sino una desviación específica de la zona con respecto al patrón global: en las regiones de muy baja densidad, el infiltrado inmunitario es escaso y heterogéneo, y las pocas células Treg presentes tienden a colocalizarse con otras células T en lugar de excluirlas, lo que es consistente con la activación inmunitaria temprana en un entorno de baja antigenicidad. El estroma está asociado negativamente con el Tumor, y las células Treg también están asociadas negativamente con el Tumor, lo que sugiere que en las regiones de baja carga tumoral, las células tumorales y tanto las células estromales como las células inmunitarias reguladoras ocupan compartimentos espacialmente distintos. Esta correlación parcial negativa entre estroma y tumor es una observación tridimensional: en cualquier sección 2D individual en una densidad tumoral muy baja, los nidos tumorales están dispersos y el límite entre el estroma y el tumor está mal definido, lo que hace que la exclusión condicional direccional sea invisible sin integrar la información a lo largo del eje z.### Zona de baja densidad tumoral.
La red de la zona de baja densidad está dominada por el eje regulador de las células T. Las interacciones CD4T↔Treg y CD4T↔CD8T son los dos bordes más fuertes, y la interacción CD8T↔Treg le sigue de cerca. La asociación positiva entre las células B y las células CD4_T aparece aquí por primera vez y persistirá en todas las zonas posteriores, lo que sugiere un vínculo estructural estable entre los compartimentos de células B y células T CD4 que es independiente de la carga tumoral local. [Lin et al. (2023)] caracterizaron las células B principalmente en el contexto de la composición de los TLS, pero no cuantificaron ni modelaron la dependencia espacial condicional entre las células B y las células T CD4 como una característica recurrente de la red. El borde positivo entre Macrófago y Estroma reaparece a nivel de zona, reforzando el hallazgo de la red compartida. También aparece una asociación negativa modesta entre las células B y el Estroma, y entre las células B y los Macrófagos, lo que también es consistente con la estructura de la red compartida.### Zona de densidad tumoral intermedia.
La red de la zona intermedia conserva los tres bordes principales de la zona de baja densidad (CD4T↔Treg, CD4T↔CD8T, CD8T↔Treg), con la magnitud del borde CD4T↔Treg aumentando en relación con la zona de baja densidad, lo que indica que el acoplamiento espacial de las células T reguladoras al compartimento de células T colaboradoras se fortalece a medida que aumenta la carga tumoral. Las interacciones Bcell↔CD4T y Bcell↔Treg mantienen tamaños de efecto similares, lo que es consistente con un compartimento de células B que está estructuralmente vinculado al nicho inmunitario regulador en las regiones de densidad intermedia. En esta zona aparecen dos bordes adicionales de interés biológico: una asociación negativa entre Treg y Tumor, y una asociación positiva entre Macrófago y Tumor. Estos signos opuestos sugieren que en la densidad tumoral intermedia, los macrófagos se integran más en el espacio adyacente al tumor, mientras que las células Treg permanecen espacialmente separadas de los nidos tumorales, una divergencia en la organización espacial de la maquinaria inmunosupresora que no sería visible en un análisis 2D restringido a una sola sección, ya que cualquier sección dada muestrea la interfaz tumor-inmunitaria en un plano z arbitrario.### Zona de alta densidad tumoral.
La red de la zona de alta densidad muestra una consolidación del eje regulador de las células T junto con la aparición de nuevas interacciones entre las células B y los macrófagos. La interacción CD4T↔Treg sigue siendo el borde dominante, y la interacción CD8T↔Treg es ahora mayor que la interacción CD4T↔CD8T, lo que indica un cambio relativo en el que la proximidad de las células T citotóxicas a las células Treg se vuelve más prominente a medida que aumenta la carga tumoral. Las interacciones Bcell↔CD4T y Bcell↔Treg permanecen estables. El borde positivo CD8T↔Macrophage aparece en esta zona y en la zona de muy alta densidad, pero está ausente en las zonas de menor carga tumoral, lo que es consistente con el reclutamiento de macrófagos en las regiones densas en tumor, donde también están presentes las células T citotóxicas, una yuxtaposición espacial que se ha relacionado con el agotamiento de las células T a través de la expresión de ligandos de puntos de control mieloides ([Lin et al., 2023]). El borde negativo Bcell↔Macrophage y el borde Bcell↔Stroma persisten, lo que apoya la interpretación de que los nichos estromales densos en macrófagos en las regiones de alta carga tumoral son estructuralmente incompatibles con la localización de las células B.### Zona de muy alta densidad tumoral.
La red de la zona de muy alta densidad invierte la dominancia relativa de los dos bordes Treg que caracterizaron las zonas anteriores: CD8T↔Treg es ahora la asociación más fuerte, superando a CD4T↔Treg. Este cambio en el orden de clasificación de la conectividad de las células Treg, desde el dominio de las células CD4 en las zonas de baja carga tumoral hasta el dominio de las células CD8 en la zona de mayor carga tumoral, es una observación resuelta en gradiente que solo es accesible a través del enfoque de zonificación de densidad 3D. En los datos bidimensionales, la colocalización de las células Treg con las células T CD8 es detectable en el margen invasor ([Lin et al., 2023]), pero el fortalecimiento sistemático de este borde con el aumento de la densidad tumoral no se puede establecer a partir de una sola sección o incluso de unas pocas secciones 2D, porque la estimación de la densidad tumoral local a partir de una imagen plana no refleja de forma fiable la carga tumoral volumétrica. El borde positivo CD4T↔Macrophage también aparece exclusivamente en esta zona y no está presente en ningún nivel de densidad inferior, lo que sugiere que la colocalización de las células T colaboradoras y los macrófagos es una característica del microambiente tumoral más denso en lugar de una propiedad general del microambiente tumoral. El borde Stroma↔Tcell persiste desde las zonas de baja hasta muy alta densidad, un borde consistente pero secundario que probablemente refleja la organización espacial de las células a lo largo de los canales estromales que atraviesan la masa tumoral.### Interacciones volumétricas 3D específicas en CRC1
Para evaluar la contribución del desajuste espacial tridimensional a la recuperación de la red, aplicamos una variante de línea de base 2D de ISPat-3D al conjunto de datos CRC1. Esta línea de base 2D se ajustó en cada sección serial a través de las zonas de densidad tumoral y luego se combinó con el enfoque de transformación Z de Fisher descrito anteriormente. Las redes de correlación parcial de los análisis 3D y 2D se compararon a nivel de borde a través de las puntuaciones delta definidas como para cada par de tipos de células. Los bordes se marcaron como específicos de 3D cuando superaron el percentil 30 de todos los deltas por pares agrupados en las redes. Un delta positivo indica que el modelo 3D recupera una colocalización condicional más fuerte entre dos tipos de células en relación con la línea de base 2D, lo que significa que tener en cuenta el eje tisular vertical revela una afinidad espacial que de otro modo estaría oscurecida por el sesgo a nivel de sección. Por el contrario, un delta negativo indica que el modelo 3D recupera una exclusión espacial condicional más fuerte, lo que significa que dos tipos de células que parecen coexistir o estar distribuidos de forma neutra en una sección transversal 2D están en realidad espacialmente segregados a lo largo del eje de profundidad del tejido. Las redes de interacción específicas de 3D resultantes se muestran en todas las cinco zonas de densidad tumoral y en la red compartida en la Figura 6.
En la red compartida que abarca todas las zonas, los tres bordes específicos de 3D dominantes fueron Célula B ↔ Célula T, lo que refleja una fuerte exclusión condicional recuperada exclusivamente bajo el desajuste 3D que está completamente enmascarada en el análisis 2D; Célula B ↔ Otro inmune, lo que indica un patrón similar de aparente coexistencia en 2D que se resuelve en segregación espacial una vez que se modela el eje tisular vertical; y Célula T CD8+ ↔ Estroma, donde el modelo 3D revela una señal de colocalización que se suprime a casi cero en el análisis 2D. Además, la colocalización Macrófago ↔ Estroma y la colocalización Célula T CD4+ ↔ Otro inmune se recuperaron solo bajo el modelo 3D, al igual que las exclusiones condicionales entre Otro inmune ↔ Célula Treg y Célula B ↔ Célula Treg. La magnitud de estos deltas de la red compartida es notablemente mayor que en cualquier zona individual, lo que es consistente con el hecho de que los factores compartidos en MSFA agregan una señal espacial global que se acumula en todas las zonas simultáneamente.
En la zona de muy baja densidad tumoral, los bordes específicos de 3D más importantes fueron Estroma ↔ Tumor, Célula Treg ↔ Tumor y Célula T CD8+ ↔ Estroma. Las exclusiones Estroma ↔ Tumor y Célula Treg ↔ Tumor sugieren que en las regiones de carga tumoral mínima, la separación espacial entre las células tumorales y los compartimentos estromales e inmunosupresores circundantes es un fenómeno volumétrico que no se puede recuperar a partir de secciones de tejido individuales. La colocalización Célula T CD8+ ↔ Estroma recuperada en 3D es consistente con las células T citotóxicas que se desplazan a lo largo del andamiaje estromal en el margen peri-tumoral, un patrón que se subestimaría cuando se ignora la profundidad de la sección.
En la zona de baja densidad tumoral, las tres interacciones específicas de 3D más importantes fueron Célula T CD4+ ↔ Tumor, Célula T ↔ Tumor y Célula T CD8+ ↔ Estroma. La inversión de signo entre Célula T CD4+ ↔ Tumor y Célula T ↔ Tumor dentro de la misma zona es notable: el modelo 3D separa una exclusión específica de CD4+ de una señal de colocalización más amplia de las células T con el tumor, una distinción que se colapsa por completo en el análisis 2D. Esta disociación entre los subtipos de células T solo es resoluble cuando se modela la estructura espacial a lo largo de toda la profundidad del tejido.
En la zona de densidad tumoral intermedia, los bordes específicos de 3D dominantes fueron Célula T ↔ Célula Treg, Otro inmune ↔ Célula T y Célula T ↔ Tumor. Los tres son señales de colocalización amplificadas por el desajuste 3D, lo que sugiere que en las regiones de infiltración tumoral moderada, la agrupación espacial de las células T con los compartimentos inmunosupresores y tumorales está organizada a lo largo del eje de profundidad del tejido. En particular, la colocalización Célula T ↔ Célula Treg es consistente con la formación activa de un nicho inmunosupresor que no es aparente a partir de los patrones de coexistencia a nivel de sección.
En la zona de alta densidad tumoral, los bordes específicos de 3D más importantes fueron Célula T ↔ Célula Treg, Célula T ↔ Tumor y Célula T CD4+ ↔ Célula T. La colocalización Célula T ↔ Célula Treg se fortalece en relación con la zona intermedia, lo que es consistente con la consolidación progresiva del nicho inmunosupresor a medida que aumenta la densidad tumoral. Al mismo tiempo, la exclusión Célula T CD4+ ↔ Célula T emerge en 3D, lo que indica que dentro del compartimento de células T más amplio, las células CD4+ y las células T no etiquetadas ocupan territorios volumétricos espacialmente distintos que son indistinguibles en 2D. La colocalización Célula B ↔ Macrófago también se vuelve detectable en 3D, lo que sugiere una posible organización de la estructura linfoide terciaria en las regiones tumorales de alta densidad.
En la zona de muy alta densidad tumoral, las tres interacciones específicas de 3D más fuertes fueron Célula T ↔ Célula Treg, Célula B ↔ Macrófago y Célula T CD4+ ↔ Célula T. La colocalización Célula T ↔ Célula Treg alcanza su delta máximo en todas las zonas aquí, formando un gradiente que aumenta de forma monotónica desde la zona intermedia hasta la zona de muy alta densidad tumoral. Este gradiente está completamente ausente en el análisis 2D y representa una de las demostraciones más claras de que el modelado espacial volumétrico recupera dinámicas de supresión inmunitaria dependientes de la densidad que son biológicamente coherentes y que son estructuralmente invisibles para los análisis a nivel de sección. La colocalización Célula B ↔ Macrófago, que se fortalece desde la zona de alta densidad hasta la zona de muy alta densidad, es además consistente con el acoplamiento espacial mieloide-linfoide en el contexto de la infiltración tumoral densa.
En conjunto, estos resultados demuestran que una parte sustancial de la estructura de interacción condicional recuperada por ISPat-3D es atribuible específicamente al desajuste del proceso gaussiano del eje tisular vertical y no se inferiría de ningún análisis que opere sobre secciones individuales o resúmenes espaciales 2D. Las inferencias extraídas de las redes delta representan relaciones que son únicamente atribuibles al componente 3D de la canalización y proporcionan evidencia de interacción espacial que es categóricamente inaccesible para los análisis convencionales de imagen multiplexada 2D.
Muestreo espacial y estimación de la densidad del núcleo
SPANISH TRANSLATION:
Para este fin, las células de la imagen 3D de la lámina histológica completa se estratificaron por zona de intensidad tumoral, definida como cinco categorías ordenadas de densidad celular tumoral local: Muy Baja, Baja, Intermedia, Alta y Muy Alta, que capturan con precisión el gradiente de heterogeneidad de las células tumorales. Debido al volumen de datos, con miles de millones de células presentes, por limitaciones computacionales y metodológicas, dentro de cada zona, se extrajeron tres submuestras espaciales independientes y estratificadas de 50.000, 100.000 y 150.000 células, donde la estratificación se realizó en una cuadrícula de las coordenadas xyz para preservar la cobertura espacial en toda la sección de tejido. Para cada submuestra y cada tipo de célula, se estimó una superficie de intensidad espacial continua utilizando la estimación de densidad kernel (KDE), evaluada en las ubicaciones celulares observadas. Las superficies KDE resultantes se transformaron logarítmicamente para estabilizar el rango dinámico antes del modelado posterior.
Flujo de trabajo ISPat-3D
El marco de trabajo ISPat-3D se aplicó para modelar conjuntamente la co-distribución espacial de nueve tipos de células: Tumor, células T CD8+ (CD8T), células T CD4+ (CD4T), células T reguladoras (Treg), células T pan (T_cell), células B, macrófagos, otras células inmunitarias y estroma. Para cada tipo de célula y cada zona, se ajustó una regresión de proceso gaussiano (GP) a la superficie KDE transformada logarítmicamente utilizando un kernel de Matérn con parámetros de longitud de escala espacial y axial separados, ambos optimizados mediante la verosimilitud marginal L-BFGS-B. El residuo espacial ajustado para cada tipo de célula se obtuvo restando la tendencia espacial estimada de la superficie observada.
MSFA descompuso la matriz de residuos en las zonas en una matriz de carga de factores compartidos y matrices de carga específicas de la zona, estimadas mediante inferencia variacional de ascenso de coordenadas, como se describió anteriormente. A partir de estos, se construyó una red de covarianza compartida y redes de covarianza específicas de la zona, cada una de dimensión , donde .
Agregación entre réplicas de submuestreo
Para reducir la dependencia de cualquier submuestra individual, las redes de correlación parcial se estimaron por separado para cada una de las tres réplicas de submuestreo (50.000, 100.000 y 150.000 células por zona) y luego se combinaron. Para cada réplica, las correlaciones parciales se obtuvieron de la red de covarianza mediante la inversión de la matriz de precisión: dado , la correlación parcial entre los tipos de células e es
Las tres matrices de correlación parcial de las réplicas se agregaron luego utilizando la transformación de Fisher. Cada elemento se asignó a , se promedió entre las réplicas y se transformó de nuevo: . Este enfoque es estadísticamente preferible al promedio directo porque las correlaciones parciales están acotadas en [-1, 1] y su distribución de muestreo está sesgada cerca del límite, mientras que la transformación de Fisher las asigna a una escala aproximadamente normal e ilimitada en la que el promedio es válido. Los bordes con valores por debajo del percentil 30 de todas las correlaciones parciales absolutas fuera de la diagonal se suprimieron para facilitar la claridad visual. Las seis redes resultantes, una compartida y cinco específicas de la zona, se muestran en la Figura 5.
Redes de interacción entre tipos de células en las zonas de densidad tumoral
ISPat-3D se aplicó al espécimen CRC1 para recuperar una red de interacción compartida y cinco redes específicas de la zona, estratificadas por la densidad celular tumoral local. Las asociaciones condicionales por red se muestran como redes de correlación parcial en la Figura 5. Describimos cada red a su vez, teniendo en cuenta que estos patrones de interacción se recuperan como estructuras de independencia condicional que varían a lo largo de la trayectoria tumoral, teniendo en cuenta la característica volumétrica de los datos 3D. Dada la formulación de ISPAT 3D, ahora podemos descubrir los gráficos de interacción ligando-receptor que no se capturan mediante ningún método diseñado para el análisis de imágenes 2D.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales que son consistentes en las cinco zonas de densidad tumoral y, por lo tanto, refleja las características estructurales del microambiente tumoral que no son específicas de ningún régimen de carga tumoral local. El borde dominante es una fuerte correlación parcial positiva entre Macrófago y Estroma, lo que indica que la densidad espacial de los macrófagos covariará con la densidad del estroma, incluso después de tener en cuenta todos los demás tipos de células y eliminar las tendencias espaciales a gran escala mediante la etapa del proceso gaussiano. Este patrón es consistente con la localización bien establecida de los macrófagos asociados al tumor dentro de los compartimentos del estroma en el cáncer colorrectal ([Lin et al., 2023]), pero la magnitud y la independencia de la zona de esta asociación condicional no se habían cuantificado previamente como una característica de red en datos de imagen tridimensional. Los segundo y tercer bordes más fuertes son negativos: las células inmunitarias se asocian negativamente tanto con las células Treg como con las células T, y las células T se asocian negativamente con las células Treg. Estas grandes correlaciones parciales negativas sugieren una exclusión espacial entre el compartimento de células T convencionales y las poblaciones inmunitarias reguladoras después de condicionar la composición completa de los tipos de células, un patrón que no se captura mediante el simple análisis de co-ocurrencia o proximidad del vecino más cercano. En particular, [Lin et al. (2023)] describieron la co-localización de las células Treg con las células T citotóxicas CD8+ en el borde invasor como una característica de la supresión inmunitaria en este tumor, pero ese análisis se basó en la proximidad espacial marginal en lugar de la estimación de la red condicional. Las correlaciones parciales negativas que observamos aquí sugieren que, cuando se mantiene fijo el contexto inmunológico completo de cada región, las células Treg y las células T convencionales ocupan nichos espaciales mutuamente excluyentes a nivel de todo el tejido, lo que no se puede recuperar a partir del análisis de proximidad por pares 2D y se ve oscurecido en cualquier sección histológica individual por la variabilidad de sección a sección en la profundidad de la infiltración inmunitaria.
Dos bordes compartidos adicionales se extienden más allá de lo que [Lin et al. (2023)] caracterizó: una asociación positiva entre las células B y el Estroma, y una asociación negativa entre las células B y los Macrófagos. El compartimento de células B en CRC1 se observó en el estudio original principalmente en el contexto de las estructuras linfoides terciarias (TLS), pero el acoplamiento espacial condicional de las células B con el andamiaje del estroma y su exclusión condicional de las regiones densas en macrófagos no se modelaron. Estos bordes sugieren que la arquitectura del estroma sirve como sustrato organizador para el posicionamiento de las células B en este tumor, al tiempo que es el entorno del que los macrófagos excluyen a las células B, posiblemente porque los nichos del estroma densos en macrófagos están polarizados hacia una función inmunosupresora en lugar de una función organizadora del linaje.
Zona de densidad tumoral muy baja.
En las regiones de carga tumoral mínima, el módulo de células T ya está estructuralmente presente: las células CD4+ T y las células CD8+ T están asociadas positivamente, y tanto las células CD4+ T como las células CD8+ T están asociadas positivamente con las células Treg. La dirección de los bordes CD4+ T↔Treg y CD8+ T↔Treg en esta zona es positiva, en contraste con los bordes Treg negativos observados en la red compartida. Esto no es una contradicción, sino una desviación específica de la zona del patrón global: en las regiones de muy baja densidad, el infiltrado inmunitario es escaso y heterogéneo, y las pocas células Treg presentes tienden a co-localizarse con otras células T en lugar de excluirlas, lo que es consistente con la activación inmunitaria temprana en un entorno de bajo antígeno. El estroma se asocia negativamente con el Tumor, y las células Treg también se asocian negativamente con el Tumor, lo que sugiere que en las regiones de baja carga, las células tumorales y tanto las células inmunitarias reguladoras como las del estroma ocupan compartimentos espaciales distintos. Esta correlación parcial negativa estroma↔tumor es una observación tridimensional: en cualquier sección 2D en una densidad tumoral muy baja, los nidos tumorales están dispersos y el límite estroma-tumor está mal definido, lo que hace que la exclusión condicional direccional sea invisible sin integrar la información a lo largo del eje z.
Zona de densidad tumoral baja.
La red de la zona Baja está dominada por el eje regulador de las células T. CD4+ T↔Treg y CD4+ T↔CD8+ T son los dos bordes más fuertes, con CD8+ T↔Treg siguiéndolos de cerca. La asociación positiva Bcell↔CD4T aparece aquí por primera vez y persistirá en todas las zonas posteriores, lo que sugiere un vínculo estructural estable entre los compartimentos de células B y células T CD4+ que es independiente de la carga tumoral local. [Lin et al. (2023)] caracterizó las células B principalmente en el contexto de la composición de las TLS, pero no cuantificó ni modeló la dependencia espacial condicional entre las células B y las células T CD4+ como una característica de red recurrente. El borde positivo Macrófago↔Estroma reaparece a nivel de la zona, lo que refuerza el hallazgo de la red compartida. También aparece una modesta asociación negativa entre las células B y el Estroma, y entre las células B y los Macrófagos, lo que también es consistente con la estructura de la red compartida.
Zona de densidad tumoral intermedia.
La red de la zona Intermedia conserva los tres bordes principales de la zona Baja (CD4+ T↔Treg, ; CD4+ T↔CD8+ T, ; CD8+ T↔Treg, ), con la magnitud del borde CD4+ T↔Treg aumentando en relación con la zona Baja, lo que indica que el acoplamiento espacial de las células T reguladoras al compartimento de las células T helper se fortalece a medida que aumenta la carga tumoral. Bcell↔CD4T () y B_cell↔Treg mantienen tamaños de efecto similares, lo que es consistente con un compartimento de células B que está estructuralmente vinculado al nicho inmunitario regulador en las regiones de densidad intermedia. Dos bordes adicionales de interés biológico aparecen en esta zona: una asociación negativa entre Treg y Tumor, y una asociación positiva entre Macrófago y Tumor. Estos signos opuestos sugieren que en una densidad tumoral intermedia, los macrófagos se integran más en el espacio adyacente al tumor, mientras que las células Treg permanecen espacialmente separadas de los nidos tumorales, una divergencia en la organización espacial de la maquinaria inmunosupresora que no sería visible en un análisis 2D restringido a una sola sección porque cualquier sección dada muestrea la interfaz tumor↔inmunitaria en un plano z arbitrario.
Zona de densidad tumoral alta.
La red de la zona Alta muestra una consolidación del eje regulador de las células T junto con la aparición de nuevas interacciones de células B y macrófagos. CD4+ T↔Treg sigue siendo el borde dominante, con CD8+ T↔Treg ahora más alto que CD4+ T↔CD8+ T, lo que indica un cambio relativo en el que la proximidad de las células T citotóxicas a las células Treg se vuelve más prominente a medida que aumenta la carga tumoral. Bcell↔CD4T y Bcell↔Treg permanecen estables. El borde positivo CD8+ T↔Macrófago aparece en esta zona y en la zona de muy alta densidad, pero está ausente en las zonas de menor carga, lo que es consistente con el reclutamiento de macrófagos en las regiones densas en tumores donde también están presentes las células T citotóxicas, una yuxtaposición espacial que se ha relacionado con el agotamiento de las células T a través de la expresión de ligandos de puntos de control mieloides ([Lin et al., 2023]). El borde negativo Bcell↔Macrófago y el borde B_cell↔Estroma persisten, lo que apoya la interpretación de que los nichos del estroma densos en macrófagos en las regiones de alta carga son estructuralmente incompatibles con la localización de las células B.
Zona de densidad tumoral muy alta.
La red de la zona de densidad muy alta invierte la dominancia relativa de los dos bordes de Treg que caracterizaban las zonas anteriores: CD8T↔Treg es ahora la asociación más fuerte, superando a CD4T↔Treg. Este cambio en el orden de clasificación de la conectividad de Treg, desde un predominio de CD4 en las zonas de baja carga tumoral hasta un predominio de CD8 en la zona de mayor carga tumoral, es una observación que se resuelve a lo largo de un gradiente y que solo es accesible mediante el enfoque de zonificación de densidad 3D. En los datos bidimensionales, la colocalización de Treg con las células T CD8 es detectable en el margen invasor ([Lin et al., 2023]), pero el fortalecimiento sistemático de este borde con el aumento de la densidad tumoral no puede establecerse a partir de una sola sección 2D o incluso de unas pocas secciones 2D, porque la estimación de la densidad tumoral local a partir de una imagen plana no refleja de forma fiable la carga tumoral volumétrica. El borde positivo CD4_T↔Macrófago también aparece exclusivamente en esta zona y no está presente en ningún nivel de densidad inferior, lo que sugiere que la colocalización de las células T helper y los macrófagos es una característica del microambiente tumoral más denso y no una propiedad general del microambiente tumoral (TME). El borde Stroma↔Célula T persiste desde las zonas de baja hasta las de densidad muy alta, un borde consistente pero secundario que probablemente refleja la organización espacial de las células a lo largo de los canales estromales que atraviesan la masa tumoral.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales que son consistentes en las cinco zonas de densidad tumoral y, por lo tanto, refleja las características estructurales del microambiente tumoral que no son específicas de ningún régimen de carga tumoral local. El borde dominante es una fuerte correlación parcial positiva entre Macrófago y Estroma, lo que indica que la densidad espacial de los macrófagos varía con la densidad del estroma, incluso después de tener en cuenta todos los demás tipos de células y eliminar las tendencias espaciales a gran escala mediante la etapa del proceso gaussiano. Este patrón es consistente con la localización bien establecida de los macrófagos asociados al tumor dentro de los compartimentos estromales en el cáncer colorrectal ([Lin et al., 2023]), pero la magnitud y la independencia de esta asociación condicional en las zonas no se habían cuantificado previamente como una característica de la red en los datos de imagen tridimensional. El segundo y el tercer bordes más fuertes son negativos: las células inmunitarias se asocian negativamente tanto con Treg como con Célula T, y la Célula T se asocia negativamente con Treg. Estas grandes correlaciones parciales negativas sugieren una exclusión espacial entre el compartimento de células T convencionales y las poblaciones inmunitarias reguladoras después de condicionar la composición total de los tipos de células, un patrón que no se captura mediante el simple análisis de coocurrencia o proximidad del vecino más cercano. Cabe destacar que [Lin et al. (2023)] describieron la colocalización de Treg con las células T citotóxicas CD8+ en el margen invasor como una característica de la supresión inmunitaria en este tumor, pero ese análisis se basó en la proximidad espacial marginal en lugar de en la estimación de la red condicional. Las correlaciones parciales negativas que observamos aquí sugieren que, cuando se mantiene fijo el contexto inmunológico completo de cada región, las células Treg y las células T convencionales ocupan nichos espaciales mutuamente excluyentes a nivel tisular, lo que no se puede recuperar a partir de un análisis de proximidad por pares 2D y se ve oscurecido en cualquier sección histológica individual por la variabilidad de la infiltración inmunitaria de una sección a otra.
Dos bordes compartidos adicionales se extienden más allá de lo que [Lin et al. (2023)] caracterizó: una asociación positiva entre Célula B y Estroma, y una asociación negativa entre Célula B y Macrófago. El compartimento de células B en CRC1 se observó en el estudio original principalmente en el contexto de las estructuras linfoides terciarias (TLS), pero el acoplamiento espacial condicional de las células B con el andamiaje estromal y su exclusión condicional de las regiones densas en macrófagos no se modelaron. Estos bordes sugieren que la arquitectura del estroma sirve como sustrato organizador para el posicionamiento de las células B en este tumor, al tiempo que es el entorno del que los macrófagos excluyen a las células B, posiblemente porque los nichos estromales densos en macrófagos están polarizados hacia una función inmunosupresora en lugar de una función organizadora del sistema linfoide.
Zona de densidad tumoral muy baja.
En las regiones de carga tumoral mínima, el módulo de células T ya está estructuralmente presente: las células CD4T y CD8T están asociadas positivamente, y tanto las células CD4T como las CD8T están asociadas positivamente con Treg. La dirección de los bordes CD4T↔Treg y CD8T↔Treg en esta zona es positiva, en contraste con los bordes Treg negativos observados en la red compartida. Esto no es una contradicción, sino una desviación específica de la zona del patrón global: en las regiones de muy baja densidad, el infiltrado inmunitario es escaso y heterogéneo, y las pocas células Treg presentes tienden a colocalizarse con otras células T en lugar de excluirlas, lo que es consistente con la activación inmunitaria temprana en un entorno de bajo antígeno. El estroma se asocia negativamente con el Tumor, y Treg también se asocia negativamente con el Tumor, lo que sugiere que en las regiones de baja carga, las células tumorales y tanto las células inmunitarias del estroma como las reguladoras ocupan compartimentos espacialmente distintos. Esta correlación parcial negativa estroma↔tumor es una observación tridimensional: en cualquier sección 2D individual en una densidad tumoral muy baja, los nidos tumorales están dispersos y el límite estroma-tumor está mal definido, lo que hace que la exclusión condicional direccional sea invisible sin integrar la información a lo largo del eje z.
Zona de baja densidad tumoral.
La red de la zona de baja densidad está dominada por el eje regulador de las células T. CD4T↔Treg y CD4T↔CD8T son los dos bordes más fuertes, con CD8T↔Treg siguiéndolos de cerca. La asociación positiva Bcell↔CD4T aparece aquí por primera vez y persistirá en todas las zonas posteriores, lo que sugiere un vínculo estructural estable entre los compartimentos de células B y células T CD4 que es independiente de la carga tumoral local. [Lin et al. (2023)] caracterizaron las células B principalmente en el contexto de la composición de las TLS, pero no cuantificaron ni modelaron la dependencia espacial condicional entre las células B y las células T CD4 como una característica recurrente de la red. El borde positivo Macrófago↔Estroma reemerge a nivel de la zona, reforzando el hallazgo de la red compartida. También aparece una modesta asociación negativa entre Célula B y Estroma, y entre Célula B y Macrófago, lo que también es consistente con la estructura de la red compartida.
Zona de densidad tumoral intermedia.
La red de la zona intermedia conserva los tres bordes principales de la zona de baja densidad (CD4T↔Treg, CD4T↔CD8T, CD8T↔Treg), con la magnitud del borde CD4T↔Treg aumentando en relación con la zona de baja densidad, lo que indica que el acoplamiento espacial de las células T reguladoras al compartimento de las células T helper se fortalece a medida que aumenta la carga tumoral. Bcell↔CD4T y Bcell↔Treg mantienen tamaños de efecto similares, lo que es consistente con un compartimento de células B que está estructuralmente vinculado al nicho inmunitario regulador en las regiones de densidad intermedia. Aparecen dos bordes adicionales de interés biológico en esta zona: una asociación negativa entre Treg y Tumor, y una asociación positiva entre Macrófago y Tumor. Estos signos opuestos sugieren que, en la densidad tumoral intermedia, los macrófagos se integran más en el espacio adyacente al tumor, mientras que las células Treg permanecen espacialmente separadas de los nidos tumorales, una divergencia en la organización espacial de la maquinaria inmunosupresora que no sería visible en un análisis 2D restringido a una sola sección, porque cualquier sección dada muestrea la interfaz tumor-inmunitaria en un plano z arbitrario.
Zona de alta densidad tumoral.
La red de la zona de alta densidad muestra una consolidación del eje regulador de las células T junto con la aparición de nuevas interacciones de las células B y los macrófagos. CD4T↔Treg sigue siendo el borde dominante, con CD8T↔Treg ahora más alto que CD4T↔CD8T, lo que indica un cambio relativo en el que la proximidad de las células T citotóxicas a las células Treg se vuelve más prominente a medida que aumenta la carga tumoral. Bcell↔CD4T y Bcell↔Treg permanecen estables. El borde positivo CD8T↔Macrófago aparece en esta zona y en la zona de muy alta densidad, pero está ausente en las zonas de menor carga, lo que es consistente con el reclutamiento de macrófagos en las regiones densas en tumores donde también están presentes las células T citotóxicas, una yuxtaposición espacial que se ha relacionado con el agotamiento de las células T a través de la expresión de ligandos de puntos de control mieloides ([Lin et al., 2023]). El borde negativo Bcell↔Macrófago y el borde Bcell↔Estroma persisten, lo que apoya la interpretación de que los nichos estromales densos en macrófagos en las regiones de alta carga son estructuralmente incompatibles con la localización de las células B.
Zona de densidad tumoral muy alta.
La red de la zona de densidad muy alta invierte la dominancia relativa de los dos bordes de Treg que caracterizaban las zonas anteriores: CD8T↔Treg es ahora la asociación más fuerte, superando a CD4T↔Treg. Este cambio en el orden de clasificación de la conectividad de Treg, desde un predominio de CD4 en las zonas de baja carga tumoral hasta un predominio de CD8 en la zona de mayor carga tumoral, es una observación que se resuelve a lo largo de un gradiente y que solo es accesible mediante el enfoque de zonificación de densidad 3D. En los datos bidimensionales, la colocalización de Treg con las células T CD8 es detectable en el margen invasor ([Lin et al., 2023]), pero el fortalecimiento sistemático de este borde con el aumento de la densidad tumoral no puede establecerse a partir de una sola sección 2D o incluso de unas pocas secciones 2D, porque la estimación de la densidad tumoral local a partir de una imagen plana no refleja de forma fiable la carga tumoral volumétrica. El borde positivo CD4_T↔Macrófago también aparece exclusivamente en esta zona y no está presente en ningún nivel de densidad inferior, lo que sugiere que la colocalización de las células T helper y los macrófagos es una característica del microambiente tumoral más denso y no una propiedad general del microambiente tumoral (TME). El borde Stroma↔Célula T persiste desde las zonas de baja hasta las de densidad muy alta, un borde consistente pero secundario que probablemente refleja la organización espacial de las células a lo largo de los canales estromales que atraviesan la masa tumoral.
Interacciones volumétricas 3D específicas en CRC1
Para evaluar la contribución de la desconfusión espacial tridimensional a la recuperación de la red, aplicamos una variante de línea de base 2D de ISPat-3D al conjunto de datos CRC1. Esta línea de base 2D se ajustó en cada sección serial a través de las zonas de densidad tumoral y luego se combinó con el enfoque de transformación Z de Fisher descrito anteriormente. Las redes de correlación parcial de los análisis 3D y 2D se compararon a nivel de borde mediante las puntuaciones delta definidas como para cada par de tipos de células. Los bordes se marcaron como específicos de 3D cuando superaron el percentil 30 de todos los deltas por pares agrupados en las redes. Un delta positivo indica que el modelo 3D recupera una colocalización condicional más fuerte entre dos tipos de células en relación con la línea de base 2D, lo que significa que tener en cuenta el eje tisular vertical revela una afinidad espacial que de otro modo estaría oscurecida por la confusión a nivel de la sección. Por el contrario, un delta negativo indica que el modelo 3D recupera una exclusión espacial condicional más fuerte, lo que significa que dos tipos de células que parecen coexistir o estar distribuidos de forma neutra en una sección transversal 2D están en realidad espacialmente segregados a lo largo del eje de profundidad del tejido. Las redes de interacción específicas de 3D resultantes se muestran en las cinco zonas de densidad tumoral y en la red compartida en la Figura 6.
En la red compartida que abarca todas las zonas, los tres bordes 3D específicos dominantes fueron B cell ↔ T cell, lo que refleja una fuerte exclusión condicional que se recupera exclusivamente mediante la eliminación de sesgos 3D, y que está completamente enmascarada en el análisis 2D; B cell ↔ Other immune, lo que indica un patrón similar de aparente co-ocurrencia en 2D que se resuelve en segregación espacial una vez que se modela el eje vertical del tejido; y CD8+ T cell ↔ Stroma, donde el modelo 3D revela una señal de colocalización que se suprime a casi cero en el análisis 2D. Además, la colocalización Macrophage ↔ Stroma y la colocalización CD+ T cell ↔ Other immune se recuperaron solo bajo el modelo 3D, al igual que las exclusiones condicionales entre Other immune ↔ Treg y B cell ↔ Treg. La magnitud de estos deltas de la red compartida es notablemente mayor que en cualquier zona individual, lo que es consistente con el hecho de que los factores compartidos en MSFA agregan una señal espacial global que se acumula en todas las zonas simultáneamente.
En la zona de densidad tumoral muy baja, los bordes 3D específicos más importantes fueron Stroma ↔ Tumor, Treg ↔ Tumor y CD8+ T cell ↔ Stroma. Las exclusiones Stroma ↔ Tumor y Treg ↔ Tumor sugieren que, en las regiones de carga tumoral mínima, la separación espacial entre las células tumorales y los compartimentos estromales e inmunosupresores circundantes es un fenómeno volumétrico que no se puede recuperar a partir de secciones individuales de tejido. La colocalización CD8+ T cell ↔ Stroma recuperada en 3D es consistente con el hecho de que las células T citotóxicas se desplazan a lo largo del entramado estromal en el margen peri-tumoral, un patrón que se subestimaría cuando se ignora la profundidad de la sección.
En la zona de densidad tumoral baja, las principales interacciones 3D específicas fueron CD4+ T cell ↔ Tumor, T cell ↔ Tumor y CD8+ T cell ↔ Stroma. La inversión de la señal entre CD4+ T cell ↔ Tumor y T cell ↔ Tumor dentro de la misma zona es notable: el modelo 3D separa una exclusión específica de CD4+ de una señal de colocalización más amplia de las células T con el tumor, una distinción que desaparece por completo en el análisis 2D. Esta disociación entre los subtipos de células T solo se puede resolver cuando se modela la estructura espacial en toda la profundidad del tejido.
En la zona de densidad tumoral intermedia, los bordes 3D específicos dominantes fueron T cell ↔ Treg, Other immune ↔ T cell y T cell ↔ Tumor. Los tres son señales de colocalización amplificadas por la eliminación de sesgos 3D, lo que sugiere que, en las regiones de infiltración tumoral moderada, la agrupación espacial de las células T con los compartimentos inmunosupresores y tumorales se organiza a lo largo del eje de profundidad del tejido. La colocalización T cell ↔ Treg en particular es consistente con la formación activa de un nicho inmunosupresor que no es evidente a partir de los patrones de co-ocurrencia a nivel de sección.
En la zona de densidad tumoral alta, los bordes 3D específicos más importantes fueron T cell ↔ Treg, T cell ↔ Tumor y CD4+ T cell ↔ T cell. La colocalización T cell ↔ Treg se fortalece en relación con la zona intermedia, lo que es consistente con la consolidación progresiva del nicho inmunosupresor a medida que aumenta la densidad tumoral. Simultáneamente, la exclusión CD4+ T cell ↔ T cell emerge en 3D, lo que indica que, dentro del compartimento más amplio de las células T, las células CD4+ y las células T no etiquetadas ocupan territorios volumétricos espacialmente distintos que son indistinguibles en 2D. La colocalización B cell ↔ Macrophage también se vuelve detectable en 3D, lo que sugiere una posible organización de la estructura linfoide terciaria en las regiones tumorales de alta densidad.
En la zona de densidad tumoral muy alta, las tres interacciones 3D específicas más fuertes fueron T cell ↔ Treg, B cell ↔ Macrophage y CD4+ T cell ↔ T cell. La colocalización T cell ↔ Treg alcanza su delta máximo en todas las zonas, formando un gradiente monótonamente creciente desde la zona intermedia hasta la zona de densidad tumoral muy alta (respectivamente). Este gradiente está completamente ausente en el análisis 2D y representa una de las demostraciones más claras de que el modelado espacial volumétrico recupera dinámicas de supresión inmune dependientes de la densidad que son biológicamente coherentes y que son estructuralmente invisibles para los análisis a nivel de sección. La colocalización B cell ↔ Macrophage, que se fortalece desde la zona alta hasta la zona muy alta, es además consistente con el acoplamiento espacial mieloide-linfoide en el contexto de la infiltración tumoral densa.
En conjunto, estos resultados demuestran que una parte sustancial de la estructura de interacción condicional recuperada por ISPat-3D se puede atribuir específicamente a la eliminación de sesgos gaussiano del eje vertical del tejido y no se inferiría de ningún análisis que opere sobre secciones individuales o resúmenes espaciales 2D. Las inferencias extraídas de las redes delta representan relaciones que son únicamente atribuibles al componente 3D de la canalización y proporcionan evidencia de interacción espacial que es categóricamente inaccesible para los análisis convencionales de imagen multiplexada 2D.
Descripción de los datos de cáncer de mama 3D
También aplicamos ISPat-3D al conjunto de datos de citometría de masas de imagen tridimensional (IMC) publicado por [Kuett et al. (2022)]. El conjunto de datos comprende un único espécimen de carcinoma ductal HER2-positivo (BC) sometido a una adquisición volumétrica 3D IMC completa. Dado que ISPat-3D requiere una verdadera estructura espacial 3D con coordenadas globales XY consistentes en las secciones seriadas registradas y un eje Z físico, este espécimen satisface los requisitos estructurales del método.
El bloque de tejido se seccionó en 152 cortes consecutivos de FFPE utilizando un ultramicrotomo con una cuchilla de diamante, siguiendo el protocolo descrito en [Kuett et al. (2022)]. A cada sección se le asignó una coordenada de profundidad física, donde es el índice de la sección, lo que da como resultado una profundidad reconstruida total de. La adquisición de IMC se realizó utilizando un panel de 26 anticuerpos conjugados con metal que cubren marcadores de linaje epitelial (pan-citoqueratina, CK5, CK7, CK8/18, CK14, CK19, E/P-caderina, HER2), marcadores de células inmunitarias (CD3, CD8a, CD20, CD45, CD68, CD138), marcadores estromales (SMA, vimentina, colágeno I, vWF/CD31), marcadores de proliferación y apoptosis (Ki-67, fosfo-H3, pS6, cPARP/cCasp3) y marcadores estructurales (histona H3, Ir193). Las imágenes del área superpuesta en todas las 152 secciones se alinearon y las células individuales se segmentaron utilizando un algoritmo de cuencas hidrográficas 3D aplicado al canal nuclear Ir193, lo que dio como resultado coordenadas XY globales consistentes para cada célula segmentada que son directamente comparables en todas las secciones. Se calcularon las intensidades medias de los marcadores por célula en cada máscara 3D de célula única y se exportaron como un catálogo de datos de células. La superposición de isótopos de metal entre los canales se corrigió utilizando la matriz de compensación descrita en [Kuett et al. (2022)].
Análisis de los datos de IMC de cáncer de mama 3D
Canalización ISPat-3D
Con este fin, se aplicó la canalización ISPat-3D para modelar conjuntamente la co-distribución espacial de 12 tipos de células de este conjunto de datos de carcinoma ductal HER2-positivo: células tumorales HER2-positivas, células tumorales basales, células tumorales luminales, otras células tumorales, células endoteliales, macrófagos, fibroblastos asociados al cáncer, células mioepiteliales, células T CD8+, células T CD4+, células B y células plasmáticas, que se muestran como diagramas de red en la Figura 7. En este caso, las zonas tumorales se obtuvieron mediante la partición basada en cuantiles de la intensidad normalizada logarítmicamente del marcador de pancitoqueratina. Describimos cada red a su vez, señalando dónde nuestros hallazgos se extienden más allá de los análisis basados en la proximidad que se informan en [Kuett et al. (2022)] y dónde la organización espacial 3D del tejido es necesaria para recuperar las asociaciones observadas.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales invariantes a la zona que reflejan la biología estructural subyacente del tumor en lugar de los efectos de la carga tumoral local. La estructura de borde dominante en la red compartida es un sistema de correlaciones parciales negativas fuertes, con casi todas las asociaciones entre las principales clases de células que tienen signos negativos. La más fuerte de estas es la exclusión Tumorbasal ↔ TumorHER2pos, una anti-correlación condicional que indica que las dos poblaciones tumorales dominantes ocupan territorios espaciales mutuamente exclusivos cuando se mantienen fijados todos los demás tipos de células. Esto no equivale a decir que los dos subtipos nunca aparecen en proximidad: más bien, refleja que, al condicionar sobre la composición espacial completa del tejido, el enriquecimiento en un subtipo tumoral predice la disminución en el otro. La base estructural de esto es la arquitectura ductal del carcinoma HER2+, en la que el compartimento luminal amplificado por HER2 y la capa basal CK5+ forman capas geométricamente separadas alrededor del lumen ductal. Una única sección 2D a través de esta estructura en un ángulo oblicuo intersecará ambos compartimentos simultáneamente, lo que oscurecerá la exclusión condicional; la reconstrucción 3D resuelve las capas espaciales y hace que esta exclusión sea detectable como un fenómeno a nivel de red.
Los macrófagos están asociados globalmente de forma negativa con los tres subtipos tumorales en la red compartida: TumorHER2pos, Tumorbasal y Plasmacell. La exclusión macrófago-tumor es consistente con las distribuciones espaciales 3D marginales descritas en [Kuett et al. (2022)], que mostraron que los macrófagos se concentran en el compartimento estromal en lugar de dentro de los nidos tumorales, pero la naturaleza condicional de la exclusión (que la disminución de macrófagos de las regiones tumorales persiste después de tener en cuenta las distribuciones espaciales de todos los demás tipos de células) no se estableció en ese trabajo y no se puede inferir a partir de los recuentos de proximidad marginales en las secciones 2D. De manera similar, la célula T CD4+ está asociada negativamente con Tumorbasal y TumorHER2pos, así como con Macrophage y Plasmacell. El borde negativo CD4Tcell ↔ Macrophage en particular es un hallazgo que no se informa en [Kuett et al. (2022)]: sugiere que las células T helper y los macrófagos son vecinos espaciales condicionalmente incompatibles en este tumor, lo que implica que dividen el compartimento estromal en territorios inmunológicos distintos en lugar de cohabitar las mismas regiones, como se esperaría en un nicho inmunosupresor coordinado. Las células mioepiteliales tienen fuertes asociaciones negativas con Plasma_cell y con Macrophage, lo que es consistente con el hecho de que la capa mioepitelial forma una barrera física que separa el compartimento inmunitario intraluminal de las poblaciones inmunitarias estromales.
Zona de densidad tumoral muy baja.
La red de la zona de densidad tumoral muy baja está dominada por las interacciones de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), con CAF ↔ Myoepithelial que muestra la correlación parcial positiva más fuerte en todo el análisis. Este borde refleja el acoplamiento estructural entre los fibroblastos asociados al cáncer y la capa mioepitelial del conducto mamario: en el volumen 3D, los CAF envuelven la superficie exterior de la capa mioepitelial y forman un andamio pericelular integrado. Esta asociación es una característica arquitectónica fundamentalmente tridimensional. En una sola sección 2D, la interfaz CAF ↔ mioepitelial se muestrea a una profundidad arbitraria, y su aparente co-localización depende de si el plano de corte intersecta la región periductal. No se informó ninguna relación cuantitativa equivalente en [Kuett et al. (2022)], cuyo análisis del patrón de células basales fue descriptivo y se limitó a la morfología de la capa CK5 en sí en lugar de a su microentorno fibroblástico. El fuerte borde positivo CAF ↔ Myoepithelial presente en la zona de densidad tumoral muy baja desaparece en las zonas intermedia y alta, lo que sugiere que el acoplamiento estructural CAF ↔ mioepitelial es una característica de las regiones con baja carga tumoral donde la arquitectura ductal está más intacta, y que esta relación se interrumpe a medida que aumenta la densidad tumoral.
El CAF está asociado negativamente con Tumorother, TumorHER2pos, Plasmacell y Macrophage en esta zona, mientras que Myoepithelial está asociado positivamente con TumorHER2pos y Tumorother. Los signos opuestos de CAF y Myoepithelial con respecto a los compartimentos tumorales indican una partición espacial en la que los CAF y las células mioepiteliales forman el límite estructural del conducto desde lados opuestos: las células mioepiteliales revisten la superficie luminal interna y los CAF ocupan el nicho periductal externo, y que las células tumorales están más estrechamente asociadas con la superficie interna que con el límite estromal externo en las regiones de baja carga tumoral. El borde negativo Macrophage↔Tumorother y la exclusión Plasmacell↔Tumorother confirman que las células inmunitarias están desplazadas de las regiones de crecimiento tumoral indiferenciado en las zonas de baja densidad.### Zona de baja densidad tumoral.
La red de la zona de baja densidad muestra una importante reorganización estructural en relación con la zona de muy baja densidad. CD8Tcell emerge como el tipo de célula inmunitaria más conectado: está asociado negativamente con Tumorother, Plasmacell y TumorHER2pos, mientras que presenta una asociación positiva con Myoepithelial. La asociación condicional positiva CD8T_cell↔Myoepithelial es un hallazgo novedoso en relación con [Kuett et al. (2022)]. Ese estudio mostró, utilizando una representación 3D, que las células T CD8+ se agrupan cerca de las estructuras endoteliales, pero no caracterizó su relación espacial condicional con las células mioepiteliales. Nuestro resultado sugiere que en las regiones de baja carga tumoral, las células T citotóxicas están preferentemente colocalizadas con el compartimento basal del conducto en lugar de con su contenido luminal amplificado por HER2, lo que tiene implicaciones para comprender los puntos de entrada de la infiltración de células inmunitarias en el carcinoma ductal HER2-positivo.
CD4Tcell está asociado positivamente con Macrophage en la zona de baja densidad, en contraste con el fuerte borde negativo CD4Tcell↔Macrophage en la red compartida. Esta inversión específica de la zona indica que, en condiciones de baja densidad tumoral, las células T CD4 y los macrófagos están coordinados espacialmente dentro de los mismos nichos microambientales, lo que refleja potencialmente una actividad colaborativa de presentación de antígenos y activación de células T en las regiones de baja carga tumoral. A medida que aumenta la densidad tumoral, esta relación se invierte, lo que sugiere una transición de una función de coordinación inmunitaria a una función de macrófagos espacialmente compartimentada. La asociación negativa Bcell↔Endothelial en la zona de baja densidad está ausente tanto de la red compartida como de la zona de muy baja densidad, lo que indica que, en las regiones de baja carga, las células B y las células endoteliales ocupan territorios espaciales condicionalmente exclusivos, lo que es consistente con la organización de las células B en estructuras linfoides lejos de los lechos vasculares en esta zona, pero que esta exclusión no es una característica global del tumor. El borde positivo CAF↔Tumorbasal en la zona de baja densidad sugiere que, en las áreas de baja carga, los CAF están espacialmente acoplados con las células tumorales basales en el límite ductal en lugar de estar excluidos de ellas, como ocurre en la zona de muy baja densidad, lo que refleja el inicio de la remodelación del estroma que acompaña a la expansión temprana del tumor.### Zona de densidad tumoral intermedia.
La zona intermedia se define por la aparición de una fuerte asociación condicional positiva CAF↔Endothelial, que estaba ausente tanto de las redes de la zona de muy baja densidad como de la de baja densidad. Este borde refleja la integración espacial de los fibroblastos asociados al cáncer con la vasculatura tumoral en una densidad tumoral intermedia y representa un hallazgo que no se puede obtener a partir de un análisis 2D. Los canales endoteliales son estructuras tridimensionales tortuosas cuya relación con el andamio de fibroblastos estromales circundante solo se puede cuantificar correctamente cuando se considera la geometría 3D completa del árbol vascular. En cualquier sección 2D dada, el lumen vascular se muestrea en sección transversal y la distribución periendotelial de los CAF aparece como un halo simple; la integración a lo largo del eje z resuelve la coherente coalineación de los CAF a lo largo del eje del vaso, que es lo que captura la asociación condicional positiva. Este acoplamiento CAF↔Endothelial persiste en la zona de alta densidad con una magnitud similar, lo que indica que es una característica del microambiente tumoral en una densidad tumoral elevada en lugar de un artefacto estructural transitorio.
La zona intermedia también exhibe una asociación positiva Endothelial↔TumorHER2pos y una asociación positiva Endothelial↔Tumorbasal, mientras que los CAF presentan asociaciones negativas con TumorHER2pos y Tumorbasal. Este patrón indica que, en las regiones de carga intermedia, el compartimento vascular está integrado espacialmente con el compartimento tumoral, mientras que los CAF permanecen condicionalmente excluidos de él, lo que sugiere que la angiogénesis tumoral impulsa a las células endoteliales a un acoplamiento espacial directo con los nidos tumorales, mientras que el andamio de CAF periductal se reorganiza lejos del núcleo tumoral. CD4Tcell presenta las asociaciones negativas más fuertes con los subtipos tumorales en esta zona (TumorHER2pos: ; Tumorbasal: ) junto con una asociación positiva con Endothelial (, lo que sugiere que las células T colaboradoras en una densidad tumoral intermedia están colocalizadas con las estructuras vasculares en lugar de con los nidos tumorales, lo que es consistente con un patrón de acumulación inmunitaria perivascular.### Zona de alta densidad tumoral.
La red de la zona de alta densidad introduce una asociación positiva Bcell↔CAF que está ausente de todas las zonas de menor carga y de la red compartida. Esta interacción no se informa en [Kuett et al. (2022)] y representa un acoplamiento condicional específico de la zona entre los compartimentos de células B y fibroblastos estromales que surge solo bajo una carga tumoral elevada. En la literatura sobre el cáncer de mama HER2-positivo, se ha asociado a las células B con la formación de estructuras linfoides terciarias en el estroma, y se ha implicado a los CAF en la organización del andamio estromal que sustenta el desarrollo de las estructuras linfoides terciarias. La correlación parcial positiva Bcell↔CAF observada aquí es consistente con un modelo en el que las señales de organización de las estructuras linfoides terciarias entre las células B y los CAF son más fuertes en las regiones de alta carga tumoral, una hipótesis espacial que no se podía generar a partir de los análisis de proximidad 2D en [Kuett et al. (2022)] porque las interacciones espaciales de las células B con los fibroblastos no se modelaron en ese estudio.
CD4Tcell está asociado negativamente con Macrophage en la zona de alta densidad, lo que invierte la asociación positiva CD4↔Macrophage que se observa en la zona de baja densidad y refuerza el patrón de la red compartida. La asociación negativa CD8Tcell↔Endothelial en la zona de alta densidad sugiere que las células T citotóxicas están condicionalmente excluidas de las regiones vasculares en una alta densidad tumoral, lo contrario de la asociación positiva CD4Tcell↔Endothelial en la misma zona. Esta divergencia entre las relaciones de las células T CD4 y CD8 con el endotelio en una alta densidad tumoral (las células CD4 se colocalizan con los vasos y las células CD8 están excluidas de ellos) es un hallazgo tridimensional: detectar esto requiere integrar la información espacial a lo largo del eje z para estimar correctamente las distancias entre las poblaciones de células T y el lecho vascular, que se orienta de manera que rara vez es paralela a cualquier plano de corte 2D.### Zona de muy alta densidad tumoral.
La red de la zona de muy alta densidad es estructuralmente escasa en comparación con todas las demás zonas. El borde más fuerte sigue siendo la asociación negativa Tumorbasal↔TumorHER2pos, pero este tamaño del efecto es sustancialmente menor que en las zonas de menor carga, lo que refleja la ruptura de la organización espacial coherente en las regiones de carga tumoral máxima. Las correlaciones parciales en esta zona son uniformemente débiles, y solo 29 bordes superan el umbral en el diagrama de acordes en comparación con 53-55 en las zonas intermedias. Este colapso de la estructura de la red en la densidad tumoral más alta es en sí mismo un hallazgo biológicamente informativo: sugiere que los principios de organización espacial que rigen la colocalización de los tipos de células en este tumor (incluido el acoplamiento CAF↔mioepitelial, la integración endotelial↔tumoral y los patrones de exclusión inmunitaria) se desmantelan progresivamente a medida que las células tumorales se convierten en el componente dominante del microambiente. Esta observación resuelta por gradiente requiere la estratificación de densidad de cinco zonas que proporciona ISPat-3D y no se puede detectar a partir de ninguna sección 2D, ya que una sección dada captura el tumor en una profundidad arbitraria sin referencia a la carga tumoral volumétrica en esa ubicación.
La asociación positiva Bcell↔CD8Tcell y la asociación positiva CD4Tcell↔CD8T_cell son uno de los pocos bordes inmunitarios que sobreviven en esta zona, lo que sugiere que la colocalización de las células T citotóxicas y colaboradoras con las células B representa una estructura de organización inmunitaria residual que persiste incluso cuando otras relaciones espaciales se degradan bajo una carga tumoral máxima.### Interacciones volumétricas 3D específicas en el cáncer de mama
Para evaluar la contribución del desajuste espacial tridimensional a la recuperación de la red en el conjunto de datos de cáncer de mama, aplicamos la misma variante de línea de base 2D de ISPat-3D utilizada en el análisis de CRC1 y la aplicamos a las secciones seriadas del tejido de forma independiente y luego combinamos estas redes como antes para obtener redes en las zonas de densidad tumoral. Las redes de correlación parcial de los análisis 3D y 2D se compararon a nivel de borde mediante puntuaciones delta como antes. El conjunto completo de redes de interacción específicas de 3D en todas las cinco zonas de densidad tumoral y la red compartida se muestra en la Figura 8.
En la red compartida que abarca todas las zonas, los tres bordes 3D específicos dominantes fueron CD4+ T cell ↔ CD8+ T cell, lo que refleja una fuerte exclusión condicional entre los compartimentos de células T citotóxicas y colaboradoras que se invierte por completo en una aparente coocurrencia en el análisis 2D; CD8+ T cell ↔ Tumorbasal, donde el modelo 3D revela una marcada segregación espacial entre las células T citotóxicas y las células tumorales basales que el análisis 2D oscurece; y CD8+ T cell ↔ TumorHER2pos, una exclusión igualmente fuerte entre las células T CD8+ y la población tumoral dominante HER2-positiva que no se puede detectar a partir de los datos a nivel de sección. Otras exclusiones de la red compartida recuperadas exclusivamente en 3D incluyen CD4+ T cell ↔ Plasma cell, CD4+ T cell ↔ Macrophage y CD8+ T cell ↔ Myoepithelial. El signo casi universal de los bordes 3D específicos de la red compartida hacia la exclusión sugiere que la arquitectura espacial global de este tumor HER2-positivo está dominada por la segregación volumétrica inmunitaria de los compartimentos tumorales y estromales, una señal que se reduce a una aparente coocurrencia cuando se ignora la profundidad de la sección.
En la zona de muy baja densidad tumoral, los tres bordes 3D específicos principales fueron CAF ↔ Tumorother, TumorHER2pos ↔ Tumorother y CAF ↔ Macrophage. Estos representan inversiones completas del signo: todos los tres pares muestran correlaciones parciales positivas fuertes en la línea de base 2D, pero correlaciones parciales negativas fuertes en el modelo 3D. La magnitud de estos deltas es la más grande observada en cualquier zona en cualquiera de los conjuntos de datos, lo que indica que en las regiones de infiltración tumoral mínima, la organización espacial de los compartimentos estromales y mieloides en relación con las subpoblaciones de células tumorales es casi un fenómeno volumétrico. Myoepithelial ↔ Tumorother y Macrophage ↔ Myoepithelial también se recuperaron como señales de colocalización exclusivas del análisis 3D, lo que sugiere que el acoplamiento espacial mioepitelial con las poblaciones tumorales y mieloides en el margen peritumoral está estructurado a lo largo del eje de profundidad del tejido.
En la zona de baja densidad tumoral, las tres interacciones 3D específicas principales fueron CD8+ T cell ↔ Tumorother, TumorHER2pos↔ Tumorother y Plasma cell ↔ Tumorother. La participación recurrente de Tumorother en múltiples exclusiones de células inmunitarias y tumorales es notable y sugiere que esta subpoblación ocupa un territorio volumétrico espacialmente distinto que no se puede resolver a partir de secciones individuales. En contraste, CAF ↔ Tumorbasal y Macrophage ↔ Tumorbasal surgieron como señales de colocalización recuperadas solo bajo el desajuste 3D, lo que es consistente con las poblaciones estromales y mieloides que rastrean el posicionamiento espacial de las células tumorales basales a lo largo del eje de profundidad.
En la zona de densidad tumoral intermedia, los tres bordes 3D más fuertes fueron CAF ↔ TumorHER2pos, Endotelial ↔ TumorHER2pos y CAF ↔ Tumorbasal. Las exclusiones CAF ↔ TumorHER2pos y CAF ↔ Tumorbasal revelan que los fibroblastos asociados al cáncer están espacialmente segregados de ambas subpoblaciones tumorales principales en 3D, a pesar de que en el análisis 2D parecen estar espacialmente asociados. Por el contrario, la co-localización Endotelial ↔ TumorHER2pos que se recupera en 3D es consistente con la proximidad vascular a las células tumorales HER2-positivas, que se organiza a lo largo del eje de profundidad del tejido, lo que probablemente refleja un patrón espacial angiogénico que no es evidente a partir de la co-ocurrencia a nivel de sección. También se recuperaron exclusivamente en 3D las co-localizaciones Míoepitelial ↔ TumorHER2pos y Célula T CD4+ ↔ Endotelial, siendo esta última indicativa de la posición perivascular de las células T CD4+ como una característica volumétrica de las regiones tumorales de densidad intermedia.
En la zona de alta densidad tumoral, las principales interacciones específicas de 3D fueron CAF ↔ TumorHER2pos, Endotelial ↔ TumorHER2pos y CAF ↔ Célula T CD4+. La exclusión CAF ↔ TumorHER2pos persiste desde la zona intermedia y se intensifica, lo que sugiere que la segregación estromal de las células tumorales HER2-positivas es una característica volumétrica consistente que se intensifica a medida que aumenta la densidad tumoral. La co-localización Endotelial ↔ TumorHER2pos también persiste en las zonas intermedia y alta (y +1.001, respectivamente), formando una señal de proximidad vascular específica de 3D consistente entre las zonas. También surge en esta zona la exclusión Célula T CD4+ ↔ Macrófago, lo que indica que los compartimentos de células T colaboradoras y mieloides están volumétricamente separados en las regiones de alta densidad tumoral, a pesar de la aparente co-ocurrencia en 2D.
En la zona de muy alta densidad tumoral, los tres bordes 3D dominantes fueron Célula B ↔ CAF, Célula T CD4+ ↔ Célula T CD8+ y CAF ↔ TumorHER2pos. La exclusión Célula B ↔ CAF, ausente en todas las demás zonas, sugiere que en las regiones tumorales más densas, las células B y los fibroblastos asociados al cáncer ocupan territorios volumétricos no superpuestos, una relación espacial que está completamente oscurecida por el análisis a nivel de sección. La reaparición de la exclusión Célula T CD4+ ↔ Célula T CD8+ en esta zona, después de haber sido prominente en la red compartida, es consistente con que la segregación espacial de los subtipos de células T sea una característica global de este tumor que se intensifica bajo la máxima carga tumoral. También se recuperó exclusivamente en 3D la co-localización Célula B ↔ TumorHER2pos, lo que podría reflejar una organización espacial antitumoral mediada por anticuerpos en el contexto de la mayor densidad de células tumorales.
En conjunto, el panorama de interacción 3D específico de BC1 se caracteriza por dos temas dominantes que no se pueden recuperar a partir del análisis 2D. El primero es una segregación volumétrica generalizada de las poblaciones de efectores inmunitarios, en particular las células T CD4+ y CD8+, tanto de las subpoblaciones tumorales como de los compartimentos estromales, una señal que consistentemente se reduce a una aparente co-ocurrencia o neutralidad en la línea de base 2D. El segundo es una co-localización recurrente Endotelial ↔ TumorHER2pos que surge en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta exclusivamente bajo la desambiguación 3D, lo que es consistente con el acoplamiento espacial angiogénico impulsado por HER2 que está estructurado a lo largo del eje de profundidad del tejido y es invisible para los análisis a nivel de sección. Estos hallazgos refuerzan la conclusión de que una parte sustancial de la estructura de interacción espacial biológicamente interpretable en los datos de imagen multiplexada volumétrica solo es accesible cuando se modela explícitamente el eje vertical del tejido.
Pipeline ISPat-3D
Con este fin, se aplicó el marco ISPat-3D para modelar conjuntamente la co-distribución espacial de 12 tipos de células de estos datos de carcinoma ductal HER2-positivo: células tumorales HER2-positivas, células tumorales basales, células tumorales luminales, otras células tumorales, células endoteliales, macrófagos, fibroblastos asociados al cáncer, células mioepiteliales, células T CD8+, células T CD4+, células B y células plasmáticas, representadas como diagramas de red en la Figura 7. En este caso, las zonas tumorales se obtuvieron mediante la partición basada en cuantiles de la intensidad normalizada logarítmicamente del marcador pancitokeratina. Describimos cada red a su vez, señalando dónde nuestros hallazgos van más allá de los análisis basados en la proximidad informados en [Kuett et al. (2022)] y dónde la organización espacial 3D del tejido es necesaria para recuperar las asociaciones observadas.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales invariantes de la zona que reflejan la biología estructural subyacente del tumor en lugar de los efectos de la carga tumoral local. La estructura de borde dominante en la red compartida es un sistema de fuertes correlaciones parciales negativas, con casi todas las asociaciones entre las principales clases de células que tienen signos negativos. La más fuerte de estas es la exclusión Tumorbasal ↔ TumorHER2pos, una anti-correlación condicional que indica que las dos subpoblaciones tumorales dominantes ocupan territorios espaciales mutuamente excluyentes cuando se mantienen fijos todos los demás tipos de células. Esto no equivale a decir que los dos subtipos nunca aparecen en proximidad: más bien, refleja que al condicionar sobre la composición espacial completa del tejido, el enriquecimiento en un subtipo tumoral predice el agotamiento en el otro. La base estructural de esto es la arquitectura ductal del carcinoma HER2+, en la que el compartimento luminal amplificado por HER2 y la capa basal CK5+ forman capas geométricamente separadas alrededor del lumen ductal. Una única sección 2D a través de esta estructura en un ángulo oblicuo intersecará ambos compartimentos simultáneamente, oscureciendo la exclusión condicional; la reconstrucción 3D resuelve las capas espaciales y hace que esta exclusión sea detectable como un fenómeno a nivel de red.
Los macrófagos están globalmente asociados negativamente con los tres subtipos tumorales en la red compartida: TumorHER2pos, Tumorbasal y Célulaplasmática. La exclusión macrófago-tumor es consistente con las distribuciones espaciales 3D marginales descritas en [Kuett et al. (2022)], que mostraron que los macrófagos se concentraban en el compartimento estromal en lugar de dentro de los nidos tumorales, pero la naturaleza condicional de la exclusión (que el agotamiento de macrófagos de las regiones tumorales persiste después de tener en cuenta las distribuciones espaciales de todos los demás tipos de células) no se estableció en ese trabajo y no se puede inferir a partir de los recuentos de proximidad marginal en las secciones 2D. De manera similar, la Célula T CD4+ está asociada negativamente con Tumorbasal y TumorHER2pos, así como con Macrófago y Célulaplasmática. El borde negativo Célula T CD4+ ↔ Macrófago en particular es un hallazgo que no se informa en [Kuett et al. (2022)]: sugiere que las células T colaboradoras y los macrófagos son vecinos espaciales condicionalmente incompatibles en este tumor, lo que implica que dividen el compartimento estromal en territorios inmunológicamente distintos en lugar de cohabitar las mismas regiones, como se esperaría en un nicho inmunosupresor coordinado. Las células mioepiteliales tienen fuertes asociaciones negativas con Célula_plasmática y con Macrófago, lo que es consistente con que la capa mioepitelial forme una barrera física que separa el compartimento inmunitario intraluminal de las poblaciones inmunitarias estromales.
Zona de densidad tumoral muy baja.
La red de la zona de densidad tumoral muy baja está dominada por las interacciones de CAF, con CAF ↔ Míoepitelial que muestra la correlación parcial positiva más fuerte en todo el análisis. Este borde refleja el acoplamiento estructural entre los fibroblastos asociados al cáncer y la capa mioepitelial del conducto mamario: en el volumen 3D, los CAF envuelven la superficie exterior de la capa mioepitelial y forman un andamio pericelular integrado. Esta asociación es una característica arquitectónica fundamentalmente tridimensional. En una única sección 2D, la interfaz CAF ↔ mioepitelial se muestrea a una profundidad arbitraria, y su aparente co-localización depende de si el plano de corte intersecta la región periductal. No se informó ninguna relación cuantitativa equivalente en [Kuett et al. (2022)], cuyo análisis del patrón de células basales fue descriptivo y se limitó a la morfología de la capa CK5 en sí en lugar de a su microentorno fibroblástico. El fuerte borde positivo CAF ↔ Míoepitelial presente en la zona de densidad tumoral muy baja desaparece en las zonas intermedia y alta, lo que sugiere que el acoplamiento estructural CAF ↔ mioepitelial es una característica de las regiones con baja carga tumoral donde la arquitectura ductal está más intacta, y que esta relación se interrumpe a medida que aumenta la densidad tumoral.
CAF está asociado negativamente con Tumorotro, TumorHER2pos, Célulaplasmática y Macrófago en esta zona, mientras que Míoepitelial está asociado positivamente con TumorHER2pos y Tumorotro. Los signos opuestos de CAF y Míoepitelial con respecto a los compartimentos tumorales indican una partición espacial en la que los CAF y las células mioepiteliales forman el límite estructural del conducto desde lados opuestos: las células mioepiteliales revisten la superficie luminal interior y los CAF ocupan el nicho periductal exterior, y las células tumorales están más estrechamente asociadas con la superficie interior que con el límite estromal exterior en las regiones de baja carga. El borde negativo Macrófago ↔ Tumorotro y la exclusión Célulaplasmática ↔ Tumorotro confirman que las células inmunitarias se desplazan de las regiones de crecimiento tumoral indiferenciado en las zonas de baja densidad.
Zona de densidad tumoral baja.
La red de la zona de densidad tumoral baja muestra una importante reorganización estructural en relación con la zona de densidad tumoral muy baja. La Célula T CD8+ emerge como el tipo de célula inmunitaria más conectado: está asociada negativamente con Tumorotro, Célulaplasmática y Tumor_HER2pos, y tiene una asociación positiva con Míoepitelial. La asociación condicional positiva Célula T CD8+ ↔ Míoepitelial es un hallazgo novedoso en relación con [Kuett et al. (2022)]. Ese artículo mostró, utilizando la representación 3D, que las células T CD8+ se agrupan cerca de las estructuras endoteliales, pero no caracterizó su relación espacial condicional con las células mioepiteliales. Nuestro resultado sugiere que en las regiones de baja carga tumoral, las células T citotóxicas están preferentemente co-localizadas con el compartimento basal del conducto en lugar de con su contenido luminal amplificado por HER2, lo que tiene implicaciones para comprender los puntos de entrada de la infiltración de células inmunitarias en el carcinoma ductal HER2-positivo.
La Célula T CD4+ está asociada positivamente con Macrófago en la zona de densidad tumoral baja, en contraste con el fuerte borde negativo Célula T CD4+ ↔ Macrófago en la red compartida. Esta inversión específica de la zona indica que en la baja densidad tumoral, las células T CD4+ y los macrófagos están espacialmente coordinados dentro de los mismos nichos microambientales, lo que podría reflejar una actividad colaborativa de presentación de antígenos y activación de células T en las regiones de baja carga tumoral. A medida que aumenta la densidad tumoral, esta relación se invierte, lo que sugiere una transición de una función de macrófagos coordinada inmunológicamente a una función espacialmente particionada. La asociación negativa Bcélula ↔ Endotelial en la zona de densidad tumoral baja está ausente tanto de la red compartida como de la zona de densidad tumoral muy baja, lo que indica que en las regiones de baja carga, las células B y las células endoteliales ocupan territorios espaciales condicionalmente exclusivos, lo que es consistente con que las células B se organicen en estructuras linfoides lejos de los lechos vasculares en esta zona, pero que esta exclusión no es una característica global del tumor. El borde positivo CAF ↔ Tumorbasal en la zona de densidad tumoral baja sugiere que en las áreas de baja carga, los CAF están espacialmente acoplados con las células tumorales basales en el límite ductal en lugar de estar excluidos de ellas, como en la zona de densidad tumoral muy baja, lo que refleja el inicio de la remodelación estromal que acompaña a la expansión tumoral temprana.
Zona de densidad tumoral intermedia.
La zona intermedia se define por la aparición de una fuerte asociación condicional positiva entre CAF y endotelio, que estaba ausente tanto en las redes de la zona de muy baja densidad como de baja densidad. Este vínculo refleja la integración espacial de los fibroblastos asociados al cáncer con la vasculatura tumoral en una densidad tumoral intermedia y representa un hallazgo que no se puede obtener a partir de un análisis bidimensional. Los canales endoteliales son estructuras tridimensionales tortuosas, y su relación con el entramado de fibroblastos estromales circundante solo se puede cuantificar correctamente cuando se considera la geometría 3D completa del árbol vascular. En cualquier sección 2D dada, el lumen vascular se muestrea en corte transversal, y la distribución de los CAF periendoteliales aparece como un simple halo; la integración a lo largo del eje z resuelve la coherente coalineación de los CAF a lo largo del eje del vaso, que es lo que captura la asociación condicional positiva. Este acoplamiento CAF-endotelio persiste en la zona de alta densidad con una magnitud similar, lo que indica que es una característica del microambiente tumoral en una densidad tumoral elevada en lugar de un artefacto estructural transitorio.
La zona intermedia también exhibe una asociación positiva Endotelio-TumorHER2pos y una asociación positiva Endotelio-Tumorbasal, mientras que los CAF presentan asociaciones negativas tanto con TumorHER2pos como con Tumorbasal. Este patrón indica que, en las regiones de densidad intermedia, el compartimento vascular está integrado espacialmente con el compartimento tumoral, mientras que los CAF permanecen condicionalmente excluidos de él, lo que sugiere que la angiogénesis tumoral impulsa a las células endoteliales a un acoplamiento espacial directo con los nidos tumorales, mientras que el entramado de CAF periductal se reorganiza lejos del núcleo tumoral. Las células CD4T presentan las asociaciones negativas más fuertes con los subtipos tumorales en esta zona (TumorHER2pos: ; Tumor_basal: ) junto con una asociación positiva con Endotelio (, lo que sugiere que las células T helper en una densidad tumoral intermedia están colocalizadas con las estructuras vasculares en lugar de con los nidos tumorales, lo que es consistente con un patrón de acumulación inmune perivascular.### Zona de alta densidad tumoral.
La red de la zona de alta densidad introduce una asociación positiva Bcell-CAF () que está ausente en todas las zonas de menor densidad y en la red compartida. Esta interacción no se informa en [Kuett et al. (2022)] y representa un acoplamiento condicional específico de la zona entre los compartimentos de células B y fibroblastos estromales que surge solo en una densidad tumoral elevada. En la literatura sobre cáncer de mama HER2-positivo, se ha asociado a las células B con la formación de estructuras linfoides terciarias en el estroma, y se ha implicado a los CAF en la organización del entramado estromal que respalda el desarrollo de las TLS. La correlación parcial positiva Bcell-CAF observada aquí es consistente con un modelo en el que las señales organizadoras de TLS entre las células B y los CAF son más fuertes en las regiones de alta densidad tumoral, una hipótesis espacial que no se podría generar a partir de los análisis de proximidad 2D en [Kuett et al. (2022)] porque las interacciones espaciales de las células B con los fibroblastos no se modelaron en ese estudio.
Las células CD4T están asociadas negativamente con Macrófago en la zona de alta densidad, lo que invierte la asociación positiva CD4-Macrófago que se observa en la zona de baja densidad y refuerza el patrón de la red compartida. La asociación negativa CD8Tcell-Endotelio en la zona de alta densidad sugiere que las células T citotóxicas están condicionalmente excluidas de las regiones vasculares en una alta densidad tumoral, lo contrario de la asociación positiva CD4T_cell-Endotelio en la misma zona. Esta divergencia entre las relaciones de las células T CD4 y CD8 con el endotelio en una alta densidad tumoral (las células CD4 se colocalizan con los vasos y las células CD8 están excluidas de ellos) es un hallazgo tridimensional: detectar esta diferencia requiere integrar la información espacial a lo largo del eje z para estimar correctamente las distancias entre las poblaciones de células T y el lecho vascular, que se orienta de una manera que rara vez es paralela a cualquier plano de corte 2D.### Zona de muy alta densidad tumoral.
La red de la zona de muy alta densidad es estructuralmente escasa en comparación con todas las demás zonas. El vínculo más fuerte sigue siendo la asociación negativa Tumorbasal-TumorHER2pos, pero este tamaño del efecto es sustancialmente menor que en las zonas de menor densidad, lo que refleja la ruptura de la organización espacial coherente en las regiones de máxima densidad tumoral. Las correlaciones parciales en esta zona son uniformemente débiles, y solo 29 vínculos superan el umbral en el diagrama de acordes en comparación con 53-55 en las zonas intermedias. Este colapso de la estructura de la red en la densidad tumoral más alta es en sí mismo un hallazgo biológicamente informativo: sugiere que los principios de organización espacial que rigen la colocalización de los tipos de células en este tumor (incluido el acoplamiento CAF-mioepitelial, la integración endotelio-tumor y los patrones de exclusión inmune) se desmantelan progresivamente a medida que las células tumorales comienzan a dominar el microambiente. Esta observación resuelta por gradiente requiere la estratificación de densidad de cinco zonas que proporciona ISPat-3D y no se puede detectar a partir de ninguna sección 2D, ya que una sección dada captura el tumor en una profundidad arbitraria sin referencia a la carga tumoral volumétrica en esa ubicación.
La asociación positiva Bcell-CD8Tcell y la asociación positiva CD4Tcell-CD8T_cell son algunos de los pocos vínculos inmunes que sobreviven en esta zona, lo que sugiere que la colocalización de las células T citotóxicas y las células T helper con las células B representa una estructura organizativa inmune residual que persiste incluso cuando otras relaciones espaciales se degradan bajo una máxima carga tumoral.
Red compartida.
La red compartida captura las asociaciones condicionales invariantes de la zona que reflejan la biología estructural subyacente del tumor en lugar de los efectos de la carga tumoral local. La estructura de los vínculos dominante en la red compartida es un sistema de correlaciones parciales negativas fuertes, con casi todas las asociaciones entre las principales clases de células que presentan signos negativos. La más fuerte de estas es la exclusión Tumorbasal-TumorHER2pos, una anticorrelación condicional que indica que las dos poblaciones tumorales dominantes ocupan territorios espaciales mutuamente excluyentes cuando se mantienen fijos todos los demás tipos de células. Esto no equivale a decir que los dos subtipos nunca aparecen en proximidad: más bien, refleja que, al condicionar sobre la composición espacial completa del tejido, el enriquecimiento en un subtipo tumoral predice el agotamiento en el otro. La base estructural de esto es la arquitectura ductal del carcinoma HER2-positivo, en la que el compartimento luminal amplificado por HER2 y la capa basal CK5+ forman capas geométricamente separadas alrededor del lumen ductal. Una sola sección 2D a través de esta estructura en un ángulo oblicuo intersecará ambos compartimentos simultáneamente, lo que oscurecerá la exclusión condicional; la reconstrucción 3D resuelve las capas espaciales y hace que esta exclusión sea detectable como un fenómeno a nivel de red.
Los macrófagos están asociados globalmente de forma negativa con los tres subtipos tumorales en la red compartida: TumorHER2pos, Tumorbasal y Plasmacell. La exclusión macrófago-tumor es consistente con las distribuciones espaciales 3D marginales descritas en [Kuett et al. (2022)], que mostraron que los macrófagos se concentraban en el compartimento estromal en lugar de dentro de los nidos tumorales, pero la naturaleza condicional de la exclusión (que el agotamiento de macrófagos de las regiones tumorales persiste después de tener en cuenta las distribuciones espaciales de todos los demás tipos de células) no se estableció en ese trabajo y no se puede inferir a partir de los recuentos de proximidad marginal en las secciones 2D. De manera similar, las células CD4T están asociadas negativamente tanto con Tumorbasal como con TumorHER2pos, así como con Macrófago y Plasmacell. El vínculo negativo CD4Tcell-Macrófago en particular es un hallazgo que no se informa en [Kuett et al. (2022)]: sugiere que las células T helper y los macrófagos son vecinos espaciales condicionalmente incompatibles en este tumor, lo que implica que dividen el compartimento estromal en territorios inmunológicamente distintos en lugar de cohabitar las mismas regiones, como se esperaría en un nicho inmunosupresor coordinado. Las células mioepiteliales presentan asociaciones negativas fuertes con Plasmacell y con Macrófago, lo que es consistente con la capa mioepitelial que forma una barrera física que separa el compartimento intraluminal inmune de las poblaciones inmunes estromales.
Zona de muy baja densidad tumoral.
La red de la zona de muy baja densidad está dominada por las interacciones de los CAF, con CAF-Mioepitelial que presenta la correlación parcial positiva más fuerte en todo el análisis. Este vínculo refleja el acoplamiento estructural entre los fibroblastos asociados al cáncer y la vaina mioepitelial del conducto mamario: en el volumen 3D, los CAF envuelven la superficie exterior de la capa mioepitelial y forman un entramado pericelular integrado. Esta asociación es una característica arquitectónica fundamentalmente tridimensional. En una sola sección 2D, la interfaz CAF-mioepitelial se muestrea a una profundidad arbitraria, y su aparente colocalización depende de si el plano de corte intersecta la región periductal. No se informó ninguna relación cuantitativa equivalente en [Kuett et al. (2022)], cuyo análisis del patrón de células basales fue descriptivo y se limitó a la morfología de la capa CK5 en sí en lugar de a su microambiente fibroblástico. El vínculo positivo CAF-Mioepitelial fuerte presente en la zona de muy baja densidad desaparece en las zonas intermedia y de alta densidad, lo que sugiere que el acoplamiento estructural CAF-mioepitelial es una característica de las regiones con baja carga tumoral donde la arquitectura ductal está más intacta, y que esta relación se interrumpe a medida que aumenta la densidad tumoral.
Los CAF están asociados negativamente con Tumorother, TumorHER2pos, Plasmacell y Macrófago en esta zona, mientras que el Mioepitelial está asociado positivamente con TumorHER2pos y Tumorother. Los signos opuestos de CAF y Mioepitelial con respecto a los compartimentos tumorales indican una partición espacial en la que los CAF y las células mioepiteliales forman el límite estructural del conducto desde lados opuestos: las células mioepiteliales revisten la superficie luminal interior y los CAF ocupan el nicho periductal exterior, y las células tumorales están más estrechamente asociadas con la superficie interior que con el límite estromal exterior en las regiones de baja densidad. El vínculo negativo Macrófago-Tumorother y la exclusión Plasmacell-Tumorother confirman que las células inmunes se desplazan de las regiones de crecimiento tumoral indiferenciado en las zonas de baja densidad.
Zona de baja densidad tumoral.
La red de la zona de baja densidad muestra una reorganización estructural importante en relación con la zona de muy baja densidad. Las células CD8T emergen como el tipo de célula inmune más conectado: están asociadas negativamente con Tumorother, Plasmacell y TumorHER2pos, mientras que presentan una asociación positiva con Mioepitelial. La asociación condicional positiva CD8Tcell-Mioepitelial es un hallazgo novedoso en relación con [Kuett et al. (2022)]. Ese artículo mostró, utilizando la representación 3D, que las células CD8+ T se agrupan cerca de las estructuras endoteliales, pero no caracterizó su relación espacial condicional con las células mioepiteliales. Nuestro resultado sugiere que, en las regiones de baja carga tumoral, las células T citotóxicas están preferentemente colocalizadas con el compartimento basal del conducto en lugar de con su contenido luminal amplificado por HER2, lo que tiene implicaciones para comprender los puntos de entrada de la infiltración de células inmunes en el carcinoma ductal HER2-positivo.
La célula CD4 T está asociada positivamente con los macrófagos en la zona de baja densidad, en contraste con la marcada asociación negativa entre las células CD4 T y los macrófagos en la red compartida. Esta inversión específica de la zona indica que, en condiciones de baja densidad tumoral, las células CD4 T y los macrófagos están coordinados espacialmente dentro de los mismos nichos microambientales, lo que posiblemente refleja una actividad colaborativa de presentación de antígenos y activación de células T en regiones de baja carga tumoral. A medida que aumenta la densidad tumoral, esta relación se invierte, lo que sugiere una transición de una función de coordinación inmune a una función de macrófagos espacialmente compartimentada. La asociación negativa entre las células B y las células endoteliales en la zona de baja densidad no está presente ni en la red compartida ni en la zona de muy baja densidad, lo que indica que, en las regiones de baja carga tumoral, las células B y las células endoteliales ocupan territorios espaciales condicionalmente exclusivos, lo que concuerda con la organización de las células B en estructuras linfoides alejadas de los lechos vasculares en esta zona, pero esta exclusión no es una característica global del tumor. El borde positivo entre los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células tumorales basales en la zona de baja densidad sugiere que, en las áreas de baja carga tumoral, los CAF están espacialmente acoplados con las células tumorales basales en el límite ductal, en lugar de estar excluidos de ellas, como ocurre en la zona de muy baja densidad, lo que refleja el inicio de la remodelación del estroma que acompaña a la expansión temprana del tumor.
Zona de densidad tumoral intermedia.
La zona intermedia se define por la aparición de una fuerte asociación condicional positiva entre los CAF y las células endoteliales, que no estaba presente ni en las redes de las zonas de muy baja y baja densidad. Este borde refleja la integración espacial de los fibroblastos asociados al cáncer con la vasculatura tumoral en una densidad tumoral intermedia y representa un hallazgo que no se puede obtener a partir de un análisis bidimensional. Los canales endoteliales son estructuras tridimensionales tortuosas, y su relación con el entramado de fibroblastos del estroma circundante solo se puede cuantificar correctamente cuando se considera la geometría 3D completa del árbol vascular. En cualquier sección 2D, el lumen vascular se muestrea en una sección transversal, y la distribución de los CAF periendoteliales aparece como un halo simple; la integración a lo largo del eje z resuelve la coherente coalineación de los CAF a lo largo del eje del vaso, que es lo que captura la asociación condicional positiva. Este acoplamiento entre los CAF y las células endoteliales persiste en la zona de alta densidad con una magnitud similar, lo que indica que es una característica del microambiente tumoral en una densidad tumoral elevada en lugar de un artefacto estructural transitorio.
La zona intermedia también exhibe una asociación positiva entre las células endoteliales y las células tumorales HER2 positivas, así como una asociación positiva entre las células endoteliales y las células tumorales basales, mientras que los CAF presentan asociaciones negativas con las células tumorales HER2 positivas y las células tumorales basales. Este patrón indica que, en las regiones de densidad intermedia, el compartimento vascular está integrado espacialmente con el compartimento tumoral, mientras que los CAF permanecen condicionalmente excluidos de él, lo que sugiere que la angiogénesis tumoral impulsa a las células endoteliales a un acoplamiento espacial directo con los nidos tumorales, mientras que el entramado de CAF periductal se reorganiza lejos del núcleo tumoral. Las células CD4 T presentan las asociaciones negativas más fuertes con los subtipos tumorales en esta zona (células tumorales HER2 positivas: ; células tumorales basales: ) junto con una asociación positiva con las células endoteliales, lo que sugiere que las células T helper en una densidad tumoral intermedia están colocalizadas con las estructuras vasculares en lugar de con los nidos tumorales, lo que concuerda con un patrón de acumulación inmune perivascular.
Zona de alta densidad tumoral.
La red de la zona de alta densidad introduce una asociación positiva entre las células B y los CAF que no está presente en ninguna de las zonas de menor densidad ni en la red compartida. Esta interacción no se informa en [Kuett et al. (2022)] y representa un acoplamiento condicional específico de la zona entre los compartimentos de células B y fibroblastos del estroma que surge solo en condiciones de alta densidad tumoral. En la literatura sobre el cáncer de mama HER2 positivo, se ha asociado a las células B con la formación de estructuras linfoides terciarias en el estroma, y se ha implicado a los CAF en la organización del entramado del estroma que sustenta el desarrollo de las estructuras linfoides terciarias. La correlación parcial positiva entre las células B y los CAF observada aquí es coherente con un modelo en el que las señales de organización de las estructuras linfoides terciarias entre las células B y los CAF son más fuertes en las regiones de alta densidad tumoral, una hipótesis espacial que no se podía generar a partir de los análisis de proximidad 2D en [Kuett et al. (2022)] porque las interacciones espaciales de las células B con los fibroblastos no se modelaron en ese estudio.
Las células CD4 T están asociadas negativamente con los macrófagos en la zona de alta densidad, lo que invierte la asociación positiva entre las células CD4 y los macrófagos que se observa en la zona de baja densidad y refuerza el patrón de la red compartida. La asociación negativa entre las células CD8 T y las células endoteliales en la zona de alta densidad sugiere que las células T citotóxicas están condicionalmente excluidas de las regiones vasculares en una alta densidad tumoral, lo contrario de la asociación positiva entre las células CD4 T y las células endoteliales en la misma zona. Esta divergencia entre las relaciones de las células CD4 y CD8 T con el endotelio en una alta densidad tumoral (las células CD4 se colocalizan con los vasos y las células CD8 están excluidas de ellos) es un hallazgo tridimensional: detectar esto requiere integrar la información espacial a lo largo del eje z para estimar correctamente las distancias entre las poblaciones de células T y el lecho vascular, que se orienta en una dirección que rara vez es paralela a cualquier plano de corte 2D.
Zona de muy alta densidad tumoral.
La red de la zona de muy alta densidad es estructuralmente escasa en comparación con todas las demás zonas. El borde más fuerte sigue siendo la asociación negativa entre las células tumorales basales y las células tumorales HER2 positivas, pero este tamaño del efecto es sustancialmente menor que en las zonas de menor densidad, lo que refleja la ruptura de la organización espacial coherente en las regiones de máxima densidad tumoral. Las correlaciones parciales en esta zona son uniformemente débiles, y solo 29 bordes superan el umbral en el diagrama de cuerdas en comparación con los 53-55 en las zonas intermedias. Este colapso de la estructura de la red en la densidad tumoral más alta es en sí mismo un hallazgo biológicamente informativo: sugiere que los principios de organización espacial que rigen la colocalización de los tipos de células en este tumor (incluido el acoplamiento entre los CAF y las células mioepiteliales, la integración entre las células endoteliales y el tumor, y los patrones de exclusión inmune) se desmantelan progresivamente a medida que las células tumorales se convierten en el componente dominante del microambiente. Esta observación resuelta por gradiente requiere la estratificación de densidad de cinco zonas que proporciona ISPat-3D y no se puede detectar a partir de ninguna sección 2D, ya que una sección dada captura el tumor en una profundidad arbitraria sin referencia a la carga tumoral volumétrica en esa ubicación.
La asociación positiva entre las células B y las células CD8 T y la asociación positiva entre las células CD4 T y las células CD8 T son algunos de los pocos bordes inmunes que sobreviven en esta zona, lo que sugiere que la colocalización de las células T citotóxicas y las células T helper con las células B representa una estructura de organización inmune residual que persiste incluso cuando otras relaciones espaciales se degradan bajo una máxima carga tumoral.
Interacciones volumétricas 3D específicas en el cáncer de mama
Para evaluar la contribución del desajuste espacial tridimensional a la recuperación de la red en el conjunto de datos de cáncer de mama, aplicamos la misma variante de línea de base 2D de ISPat-3D que se utilizó en el análisis de CRC1 y la aplicamos a las secciones seriadas del tejido de forma independiente y luego combinamos estas redes como antes para obtener redes en las zonas de densidad tumoral. Las redes de correlación parcial de los análisis 3D y 2D se compararon a nivel de borde mediante puntuaciones delta como antes. El conjunto completo de redes de interacción 3D específicas en todas las cinco zonas de densidad tumoral y la red compartida se muestra en la Figura 8.
En la red compartida que abarca todas las zonas, los tres bordes 3D específicos dominantes fueron la célula CD4+ T ↔ la célula CD8+ T, lo que refleja una fuerte exclusión condicional entre los compartimentos de células T citotóxicas y células T helper que se invierte por completo en una aparente coocurrencia en el análisis 2D; la célula CD8+ T ↔ la célula tumoral basal, donde el modelo 3D revela una marcada segregación espacial entre las células T citotóxicas y las células tumorales basales que el análisis 2D oscurece; y la célula CD8+ T ↔ la célula tumoral HER2 positiva, una exclusión igualmente fuerte entre las células CD8+ T y la subpoblación tumoral HER2 positiva dominante que no se puede detectar a partir de los datos a nivel de sección. Otras exclusiones de la red compartida recuperadas exclusivamente en 3D incluyen la célula CD4+ T ↔ la célula plasmática, la célula CD4+ T ↔ el macrófago y la célula CD8+ T ↔ la célula mioepitelial. El signo casi universal de los bordes 3D específicos de la red compartida hacia la exclusión sugiere que la arquitectura espacial global de este tumor HER2 positivo está dominada por la segregación inmune volumétrica de los compartimentos tumorales y del estroma, una señal que se reduce a una aparente coocurrencia cuando se ignora la profundidad de la sección.
En la zona de muy baja densidad tumoral, los tres bordes 3D específicos principales fueron CAF ↔ Tumorotro, TumorHER2 positivo ↔ Tumorotro y CAF ↔ Macrófago. Estos representan inversiones completas de la señal: todos los tres pares muestran correlaciones parciales positivas fuertes en la línea de base 2D, pero correlaciones parciales negativas fuertes en el modelo 3D. La magnitud de estos deltas es la más grande observada en cualquier zona en cualquiera de los conjuntos de datos, lo que indica que, en las regiones de infiltración tumoral mínima, la organización espacial de los compartimentos del estroma y del mieloide en relación con las subpoblaciones de células tumorales es casi por completo un fenómeno volumétrico. También se recuperaron la célula mioepitelial ↔ Tumorotro y el macrófago ↔ la célula mioepitelial como señales de colocalización exclusivas del análisis 3D, lo que sugiere que el acoplamiento espacial de las células mioepiteliales con las poblaciones tumorales y mieloides en el margen peritumoral está estructurado a lo largo del eje de profundidad del tejido.
En la zona de baja densidad tumoral, las tres interacciones 3D específicas principales fueron la célula CD8+ T ↔ Tumorotro, la célula tumoral HER2 positiva ↔ Tumorotro y la célula plasmática ↔ Tumorotro. La participación recurrente de Tumorotro en múltiples exclusiones de células inmunes y tumorales es notable y sugiere que esta subpoblación ocupa un territorio volumétrico espacialmente distinto que no se puede resolver a partir de secciones individuales. En contraste, CAF ↔ la célula tumoral basal y el macrófago ↔ la célula tumoral basal surgieron como señales de colocalización recuperadas solo bajo el desajuste 3D, lo que es coherente con las poblaciones del estroma y del mieloide que rastrean el posicionamiento espacial de las células tumorales basales a lo largo del eje de profundidad.
En la zona de densidad tumoral intermedia, los tres bordes 3D específicos más fuertes fueron CAF ↔ la célula tumoral HER2 positiva, la célula endotelial ↔ la célula tumoral HER2 positiva y CAF ↔ la célula tumoral basal. Las exclusiones de CAF ↔ la célula tumoral HER2 positiva y CAF ↔ la célula tumoral basal revelan que los fibroblastos asociados al cáncer están espacialmente segregados de ambas subpoblaciones tumorales principales en 3D, a pesar de que parecen estar espacialmente asociados en el análisis 2D. Por el contrario, la colocalización de la célula endotelial ↔ la célula tumoral HER2 positiva recuperada en 3D es coherente con la proximidad vascular a las células tumorales HER2 positivas que se organiza a lo largo del eje de profundidad del tejido, lo que probablemente refleja un patrón espacial de angiogénesis que no es aparente a partir de la coocurrencia a nivel de sección. También se recuperaron la colocalización de la célula mioepitelial ↔ la célula tumoral HER2 positiva y la célula CD4+ T ↔ la célula endotelial exclusivamente en 3D, lo que sugiere que el posicionamiento perivascular de las células CD4+ T es una característica volumétrica de las regiones tumorales de densidad intermedia.
En la zona de alta densidad tumoral, las interacciones 3D específicas principales fueron CAF ↔ la célula tumoral HER2 positiva, la célula endotelial ↔ la célula tumoral HER2 positiva y CAF ↔ la célula CD4+ T. La exclusión de CAF ↔ la célula tumoral HER2 positiva persiste desde la zona intermedia y se intensifica, lo que sugiere que la segregación del estroma de las células tumorales HER2 positivas es una característica volumétrica coherente que se intensifica a medida que aumenta la densidad tumoral. La colocalización de la célula endotelial ↔ la célula tumoral HER2 positiva también persiste en las zonas intermedia y alta (y +1.001, respectivamente), lo que forma una señal de proximidad vascular 3D específica de la zona. La exclusión de la célula CD4+ T ↔ el macrófago también surge en esta zona, lo que indica que los compartimentos de las células T helper y del mieloide están volumétricamente separados en las regiones de alta densidad tumoral a pesar de la aparente coocurrencia en 2D.
En la zona de densidad tumoral muy alta, los tres bordes 3D específicos dominantes fueron B cell ↔ CAF, CD4+ T cell ↔ CD8+ T cell y CAF ↔ TumorHER2pos. La exclusión de B cell ↔ CAF, ausente en todas las demás zonas, sugiere que, en las regiones tumorales más densas, las células B y los fibroblastos asociados al cáncer ocupan territorios volumétricos no superpuestos, una relación espacial que se ve completamente oscurecida por el análisis a nivel de sección. La exclusión de CD4+ T cell ↔ CD8+ T cell reaparece en esta zona después de haber sido prominente en la red compartida, lo que es consistente con que la segregación espacial de los subconjuntos de células T sea una característica global de este tumor que se intensifica bajo la máxima carga tumoral. La colocalización de B cell ↔ TumorHER2pos también se recuperó exclusivamente en 3D, lo que podría reflejar una organización espacial antitumoral mediada por anticuerpos en el contexto de la mayor densidad de células tumorales.
En conjunto, el paisaje de interacción 3D específico de BC1 se caracteriza por dos temas dominantes que no se pueden recuperar a partir del análisis 2D. El primero es una segregación volumétrica generalizada de las poblaciones de efectores inmunitarios, en particular las células CD4+ y CD8+ T, tanto de las subpoblaciones tumorales como de los compartimentos estromales, una señal que consistentemente se reduce a una coocurrencia o neutralidad aparente en la línea de base 2D. El segundo es una colocalización recurrente de Endothelial ↔ TumorHER2pos que surge en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta exclusivamente bajo el desajuste 3D, lo que es consistente con el acoplamiento espacial angiogénico impulsado por HER2 que está estructurado a lo largo del eje de profundidad del tejido y es invisible para los análisis a nivel de sección. Estos hallazgos refuerzan la conclusión de que una parte sustancial de la estructura de interacción espacial biológicamente interpretable en los datos de imagen multiplexada volumétrica solo es accesible cuando se modela explícitamente el eje vertical del tejido.
Discusión
Introdujimos ISPat-3D, un marco estadístico para recuperar redes de interacción de tipos celulares que varían espacialmente a partir de imágenes de tejido multiplexadas tridimensionales. Hasta donde sabemos, este es el primer método que modela explícitamente la estructura espacial tridimensional en los datos de imagen multiplexada para derivar redes de correlación parcial específicas de la zona en todo el microambiente tumoral. Los métodos de interacción espacial previos en la patología computacional han operado exclusivamente en secciones de tejido bidimensionales, tratando cada sección como una observación independiente y descartando la organización volumétrica del tumor. Al combinar la regresión gaussiana anisotrópica con el análisis factorial multiestudio, ISPat-3D separa las tendencias espacialmente suaves de la covariación residual entre los tipos de células y luego descompone esa covariación residual en un componente de red compartida y perturbaciones específicas de la zona. El resultado es un conjunto de mapas de interacción condicionales interpretables que varían en función de la carga tumoral local, lo que proporciona una caracterización más rica del microambiente tumoral de lo que podría ofrecer cualquier resumen único de toda la lámina.
Relevancia biológica para los datos de cáncer colorrectal
Aplicamos ISPat-3D al espécimen CRC1 de [Lin et al. (2023)], un adenocarcinoma colorrectal MSI-H de etapa IIIB poco diferenciado, para el cual la imagen 3D CyCIF en 25 secciones seriadas produjo uno de los atlas de células únicas espacialmente más detallados de un tumor humano hasta la fecha. [Lin et al. (2023)] utilizaron una variedad de estadísticas espaciales para caracterizar la coocurrencia de tipos de células, las correlaciones de los vecinos más cercanos y la proximidad de PD1:PDL1 en el margen invasivo, y encontraron que la supresión de las células T en el margen invasivo involucró múltiples tipos de células, con los macrófagos desempeñando un papel coordinador central en la arquitectura inmunosupresora del tumor. Nuestros hallazgos son generalmente consistentes con esta imagen y la amplían en varios aspectos.
La señal más fuerte en nuestra red compartida, la correlación parcial positiva entre Macrophage y Stroma, refleja directamente la observación en [Lin et al. (2023)] de que los macrófagos en CRC1 están concentrados en los compartimentos estromales y en el margen invasivo en lugar de dentro de los nidos tumorales. La colocalización espacial de macrófagos y células estromales que nuestro método detecta como una asociación condicional que persiste en las cinco zonas de densidad tumoral es consistente con la idea de que el tejido estromal proporciona el nicho físico dentro del cual los macrófagos se acumulan y probablemente ejercen una función inmunosupresora. Esta asociación también se ha informado en otras cohortes de CRC, donde la infiltración de macrófagos estromales tiene una importancia pronóstica desfavorable.
La correlación parcial compartida fuertemente negativa entre Other immune cells y Treg, y entre T cells y Treg, es consistente con el hallazgo de [Lin et al. (2023)] de que la supresión de las células T en el margen invasivo de CRC1 está estructurada espacialmente, con poblaciones reguladoras y efectoras que ocupan dominios espaciales parcialmente no superpuestos. Condicionado a todos los demás tipos de células, una alta densidad de Treg coexiste con una menor infiltración inmune amplia, que es la firma espacial de un nicho inmunosupresor. Se sabe que las células T reguladoras erigen barreras físicas y funcionales a la infiltración de células T efectoras a través de la supresión mediada por citocinas, la competencia metabólica y la remodelación del estroma, todo lo cual se manifestaría como una segregación espacial de las Tregs de las poblaciones inmunitarias efectoras a nivel tisular.
En las redes específicas de la zona, la correlación parcial positiva consistente entre las células CD4+ T, las células CD8+ T y las Tregs en las cinco capas de densidad refleja una infiltración de células T espacialmente coordinada que está presente incluso en las regiones de baja carga tumoral y persiste en las áreas de máxima densidad tumoral. Esta colocalización de células T auxiliares, citotóxicas y reguladoras es compatible con la agrupación organizada de células inmunitarias en los márgenes invasivos de CRC1. La aparición de la colocalización de células B con las células CD4+ T en las densidades tumorales intermedias y altas, que detectamos como una correlación parcial positiva que aparece consistentemente a partir de la zona baja, es consistente con la formación de estructuras linfoides terciarias o agregados linfoides que surgen preferentemente en las regiones de compromiso inmunitario sostenido con el tumor.
Una característica notable de nuestros resultados es la atenuación de los tamaños del efecto al pasar de las redes compartidas a las redes específicas de la zona. Las asociaciones Macrophage↔Stroma de la magnitud que se observa en la red compartida no se replican dentro de las zonas individuales con una intensidad comparable, lo que refleja el hecho de que el componente compartido captura la organización espacial global del microambiente tumoral, mientras que los componentes específicos de la zona capturan las desviaciones incrementales de esa línea de base. Esta descomposición es metodológicamente útil: la red compartida identifica el esqueleto arquitectónico 3D del microambiente tumoral (TME), y las redes específicas de la zona revelan cómo se modulan las relaciones espaciales inmunitarias y estromales por la densidad tumoral local. Además, el cambio en la asociación principal de las células T de CD4+↔Treg en las zonas intermedias y altas a CD8+↔Treg en la zona muy alta es consistente con una transición hacia la supresión de las células T citotóxicas en el núcleo del tumor.
La colocalización espacial de células B↔CD4+ T detectada por ISPat-3D a partir de la zona de baja densidad tumoral tiene una base molecular bien caracterizada. Dentro de las estructuras linfoides terciarias (TLS), las células B y las células T auxiliares foliculares (Tfh) interactúan a través del eje receptor-ligando CD40↔CD40L, lo que impulsa la formación del centro germinal, el cambio de clase de recombinación de las células B y la maduración de la afinidad ([Gulubova et al., 2024]; [Lv et al., 2024]; [Hegoburu et al., 2025]). Esta interacción CD40↔CD40L se ha caracterizado específicamente en el cáncer colorrectal, donde la fuerza de este acoplamiento receptor-ligando entre las células B del centro germinal y las células T CXCR5+CD4+ es significativamente mayor en la enfermedad en etapa temprana y disminuye en la enfermedad avanzada, lo que coincide con la alteración de la maduración de TLS ([Chen et al., 2025b]). La aparición de esta colocalización condicional de células B↔CD4+ T en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta en el espécimen CRC1, detectada aquí por primera vez en un marco de red espacial 3D, es consistente con que los precursores de TLS se formen preferentemente en las regiones de compromiso tumoral-inmunitario sostenido en lugar de en la periferia de menor densidad tumoral. El segundo hallazgo novedoso es el cambio en la asociación dominante de Treg de CD4+↔Treg en la densidad intermedia a CD8+↔Treg en la densidad tumoral máxima, que tiene un correlato mecanicista en el cruce mediado por IL-2 entre las células T citotóxicas intratumorales y las Tregs. Se ha realizado una investigación que demuestra que las células T CD8+ activadas producen IL-2 y se colocalizan físicamente con las Tregs en el tejido tumoral, lo que promueve la acumulación de Tregs a través de la regulación ascendente de ICOS y, por lo tanto, contrarresta su propia actividad citotóxica ([Geels et al., 2024]). Específicamente en el cáncer colorrectal, la relación de células T CD8+ a Tregs FoxP3+ intratumorales es un determinante reconocido de la inmunidad antitumoral y el resultado clínico, con una alta densidad de Tregs intratumorales que se correlaciona con la supresión de las respuestas citotóxicas de CD8+ ([Syed Khaja et al., 2017]). ISPat-3D recupera esta proximidad espacial CD8+↔Treg como la interacción condicional dominante precisamente en la densidad tumoral máxima, proporcionando evidencia espacialmente resuelta directa a nivel de imagen de proteínas para el nicho inmunosupresor que caracteriza el núcleo del tumor.
Relevancia biológica para el carcinoma ductal HER2-positivo
[Kuett et al. (2022)] caracterizaron este tumor utilizando comparaciones de distancia 2D versus 3D basadas en la proximidad, la agrupación de fenotipos de células con Phenograph y la representación 3D cualitativa de poblaciones celulares seleccionadas, pero no modelaron redes espaciales condicionales entre tipos de células ni examinaron cómo varía la estructura de interacción en las zonas de densidad tumoral. Nuestros hallazgos van más allá de ese marco descriptivo en varios aspectos, y varias de las interacciones clave que recuperamos tienen correlatos mecanicistas directos en la literatura del cáncer de mama HER2-positivo. La característica dominante de la red compartida es un sistema integral de fuertes correlaciones parciales negativas entre las poblaciones inmunitarias y los subtipos tumorales. Las tres poblaciones inmunitarias con las correlaciones parciales absolutas más altas en la red compartida: Macrophage, CD4+ T cells y CD8+ T cells, están asociadas negativamente con TumorHER2pos y Tumorbasal, con tamaños de efecto que van desde hasta . Estos grandes valores negativos indican una exclusión condicional invariante de la zona de las células inmunitarias de las regiones ocupadas por el tumor, independientemente de la densidad tumoral local. [Kuett et al. (2022)] mostraron que los macrófagos, las células CD8+ T y las células B se distribuían en toda la reconstrucción 3D, pero su análisis no tuvo en cuenta la partición espacial entre estas poblaciones y el compartimento tumoral a nivel de la red condicional. El patrón que detectamos es consistente con un fenotipo de exclusión inmune en este carcinoma ductal HER2-positivo, en el que la compartimentación física por la arquitectura del estroma y el epitelio mioepitelial limita la penetración de las células inmunitarias en las regiones ocupadas por el tumor. Se sabe que los tumores HER2-positivos albergan grados heterogéneos de linfocitos infiltrantes tumorales, y la exclusión inmune se ha relacionado mecánicamente con la actividad de CAF impulsada por TGF-β y el remodelado de la MEC que restringen la migración de las células T hacia el epitelio tumoral ([Calon et al., 2015]; [Sewell-Loftin et al., 2017]).
El hallazgo novedoso más importante en relación con [Kuett et al. (2022)] es la correlación parcial positiva entre CAF y mioepitelio en la zona de densidad tumoral muy baja, que representa la asociación condicional positiva más grande en todo el análisis. Las células mioepiteliales revisten la superficie interna de los conductos mamarios y están rodeadas por una vaina periductal de fibroblastos asociados al cáncer que depositan fibronectina, activan la señalización de TGF y contribuyen a la remodelación de la membrana basal ([Hayward et al., 2022]; [Yu et al., 2014]). Esta unidad estructural periductal CAF↔mioepitelial se ha descrito como un mediador crítico de la transición del carcinoma ductal in situ al carcinoma ductal invasivo: las células mioepiteliales asociadas al tumor promueven la progresión invasiva al estimular a los CAF periductales para que degraden la membrana basal a través de la secreción de MMP9 y MMP13, un proceso impulsado por la señalización de TGF-/Smads ([Lo et al., 2017]; [Hayward et al., 2022]). La colocalización condicional casi perfecta que detectamos a baja densidad tumoral es consistente con la arquitectura periductal intacta que se encuentra en las regiones de baja carga, donde la capa basal ductal aún no se ha visto afectada. Es importante destacar que esta asociación no se cuantificó en [Kuett et al. (2022)]: su análisis describió la morfología irregular de la capa de células basales CK5+ en la representación 3D, pero no modeló el acoplamiento espacial condicional entre los CAF y el compartimento mioepitelial. Además, este acoplamiento estructural es una observación fundamentalmente tridimensional; en cualquier sección 2D, la interfaz CAF↔mioepitelial se muestrea a una profundidad arbitraria a través de la vaina periductal, y la asociación espacial aparente depende de si el plano de corte intersecta la región periductal, lo que hace que sea imposible recuperar esta interacción a partir de datos 2D únicamente.
La fuerte correlación parcial positiva entre CAF y endotelio que surge en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta, y que persiste pero se debilita en la zona de densidad muy alta, es consistente con el papel establecido de los CAF en el apoyo a la angiogénesis tumoral a través de mecanismos mecánicos y paracrinos. Los CAF que sobreexpresan SDF-1/CXCL12 reclutan células progenitoras endoteliales en los tumores de mama y estimulan la neovascularización a través de la secreción de VEGF, y esta interacción paracrina entre fibroblastos y células endoteliales se ha demostrado en modelos de vasculogénesis 3D, donde los CAF del cáncer de mama impulsan un crecimiento vascular significativamente mayor que los fibroblastos normales a través de la transmisión de fuerza mecánica mediada por Rho/ROCK ([Sewell-Loftin et al., 2017]). La aparición de esta asociación condicional específicamente en las zonas de carga tumoral intermedia y alta, en lugar de en las de baja carga, sugiere que la angiogénesis mediada por CAF se activa como un proceso dependiente de la densidad tumoral en este carcinoma ductal HER2-positivo, en lugar de ser una característica constitutiva del microambiente tumoral (TME). Esta observación resuelta por zonas solo es accesible a través de la estratificación de densidad volumétrica que proporciona ISPat-3D: los canales vasculares son estructuras tridimensionales tortuosas cuya coalineación con el andamiaje CAF periductal solo se puede cuantificar correctamente integrando la información espacial a lo largo del eje z, ya que cualquier sección 2D individual intersecta los vasos en un ángulo arbitrario que no captura la coorganización longitudinal CAF↔endotelial.
La correlación parcial positiva entre las células B y los CAF que aparece exclusivamente en la zona de densidad tumoral alta y está ausente en todas las demás zonas, proporciona evidencia espacial directa a nivel de proteínas de un vínculo estructural entre el compartimento de células B y el andamiaje CAF que se ha caracterizado a nivel transcripcional en el cáncer de mama ([Cords et al., 2023]; [Lavie et al., 2022]). Se ha demostrado que los subtipos de CAF que presentan antígenos (apCAF) se asocian estrechamente con las estructuras linfoides terciarias (TLS) en múltiples tipos de cáncer, y los CAF PDPN+ son capaces de organizar el andamiaje estromal que respalda la formación de TLS y la acumulación de células B en el cáncer de mama ([Chen et al., 2025a]; [Johansson-Percival y Ganss, 2021]). Específicamente en el cáncer de mama HER2-positivo, una mayor densidad de TLS se asocia con una mejor respuesta patológica completa al tratamiento neoadyuvante, y la presencia de infiltrados inmunitarios ricos en células B en el estroma se ha asociado con mejores resultados ([Denkert et al., 2018]; [Griguolo et al., 2021]). La especificidad de zona de esta interacción B_cell↔CAF, que aparece solo a alta carga tumoral, es consistente con la hipótesis de que la formación de TLS en este tumor es desencadenada por una mayor carga de antígenos en las regiones de alta densidad, en lugar de ser una característica global del microambiente. Esta interacción no se puede recuperar del análisis 2D porque las relaciones espaciales de las células B con el andamiaje de fibroblastos no se modelaron en [Kuett et al. (2022)] y porque la estructura espacial organizadora de TLS en 3D se extiende a lo largo de los ejes de profundidad que no captura ninguna sección individual.
La inversión dependiente de la zona de la relación entre las células T CD4+ y los macrófagos, de positiva (zona baja) a negativa (red compartida, zona alta), refleja una transición funcional bien caracterizada en el compartimento de macrófagos asociados al tumor a medida que aumenta la carga tumoral. En las regiones de baja carga, los macrófagos en un estado de activación inmunitaria interactúan con las células T CD4+ a través de la presentación de antígenos, y la colocalización espacial de los macrófagos polarizados M1 con las células T colaboradoras en los sitios de activación inmunitaria es consistente con la correlación parcial positiva que observamos en la zona baja ([DeNardo et al., 2009]). A medida que aumenta la densidad tumoral, los macrófagos asociados al tumor hacen la transición hacia un fenotipo inmunosupresor polarizado M2 que excluye activamente a las células T CD4+ de su nicho espacial a través de la señalización de TGF-, IL-10 y ligandos de puntos de control ([Cassetta y Pollard, 2018]). La inversión del signo de la interacción entre las células T CD4+ y los macrófagos, de positivo a negativo, a lo largo del espectro de zonas es una observación resuelta por gradiente que requiere una zonificación de densidad volumétrica para detectar: en cualquier sección 2D individual, el estado funcional de los macrófagos varía a lo largo del eje z con la profundidad del tumor, y la integración de la información de una imagen plana confunde los contextos espaciales de macrófagos de activación inmunitaria e inmunosupresión en una única estimación de densidad marginal que no puede resolver esta transición funcional.
La divergencia entre las células T CD4+ y las células T CD8+ en su relación con el endotelio en la zona alta (las células T CD4+ se colocalizan condicionalmente con las células endoteliales, mientras que las células T CD8+ se excluyen condicionalmente del compartimento endotelial) es consistente con un patrón de exclusión inmunitaria en el que las células T citotóxicas se ven impedidas de interactuar con el nicho perivascular, mientras que las células T colaboradoras se acumulan cerca de las estructuras vasculares. Los macrófagos asociados al tumor perivasculares ocupan nichos inmediatamente adyacentes a los vasos sanguíneos y se ha demostrado que suprimen activamente la infiltración de células T CD8+ al tiempo que permiten la acumulación de células T CD4+ y células T reguladoras en el espacio perivascular ([Lewis et al., 2016]; [Harney et al., 2015]). Esta segregación espacial de las células T CD4+ y CD8+ en relación con la vasculatura es una característica organizativa tridimensional del tumor: los canales endoteliales se extienden a lo largo de ejes que no son paralelos a ningún plano de sección 2D estándar, y la distribución perivascular diferencial de los subtipos de células T solo se puede caracterizar midiendo las distancias desde las células hasta la red vascular 3D completa en lugar de hasta las secciones transversales 2D de los vasos.
Finalmente, el colapso progresivo de la complejidad de la red desde la zona intermedia (55 aristas por encima del umbral) hasta la zona muy alta (29 aristas por encima del umbral), acompañado de una reducción en las magnitudes de la correlación parcial en todas las aristas en la zona muy alta, es en sí mismo un hallazgo biológicamente informativo. En las regiones de máxima carga tumoral, los principios organizativos espaciales que rigen la colocalización de los tipos de células en este tumor (el acoplamiento estructural CAF↔mioepitelial, la coorganización angiogénica CAF↔endotelial, los patrones de exclusión inmunitaria y la interacción específica de la zona entre las células B y los CAF) se atenúan colectivamente, lo que sugiere que la densidad tumoral extrema en el carcinoma ductal HER2-positivo altera la arquitectura tisular que normalmente impone estas relaciones espaciales condicionales. Esta observación resuelta por gradiente solo es accesible a través de la zonificación de densidad tumoral volumétrica que proporciona ISPat-3D, y no se puede detectar a partir de ninguna sección 2D individual, ya que una imagen plana captura el tumor a una profundidad arbitraria sin referencia a la carga tumoral volumétrica en esa ubicación.
Contribuciones metodológicas y novedades
Las herramientas de análisis espacial existentes para la imagen multiplexada, incluidos los estadísticos de coocurrencia, las funciones de autocorrelación espacial y los métodos de vecindad celular, operan sobre datos de eventos a nivel celular discretos en 2D y no tienen en cuenta la autocorrelación espacial al estimar las asociaciones entre los tipos de células. ISPat-3D aborda ambas limitaciones. La etapa de regresión GP elimina explícitamente las tendencias espacialmente suaves de cada superficie de intensidad de tipo de célula, de modo que la covariación que se pasa a MSFA refleje la asociación espacial residual en lugar de una confusión introducida por la disposición global de los compartimentos tisulares. El componente MSFA separa entonces las asociaciones que son comunes a todas las zonas de las que son específicas de la zona, lo que permite una descomposición que no está disponible a partir de ningún análisis de una sola zona o de toda la lámina. El uso de un kernel de Matérn anisotrópico con parámetros de longitud de escala lateral y axial separados es esencial para los datos de imagen 3D, donde la resolución de la imagen y la escala física difieren sustancialmente entre el plano y el eje a través de las secciones seriales. Hemos aplicado este método a dos conjuntos de datos de cáncer multiplexados 3D para comprender las interacciones ligando-receptor resueltas espacialmente que varían según la carga tumoral. Pero esto se puede aplicar a cualquier conjunto de datos espaciales 3D con múltiples variables (por ejemplo, tipos de células, genes, valores de intensidad de vóxeles, intensidad de fluorescencia, características radiómicas, etc.) y anotaciones arbitrarias (por ejemplo, específicas del tumor: frente invasor, núcleo tumoral, margen tumoral, región peritumoral, borde principal; específicas de la vasculatura y el nectro: núcleo necrótico, zona perinecrótica, región inducida por hipoxia, punto caliente angiogénico, proliferación microvascular, etc.) para comprender la arquitectura volumétrica de estas variables. Esto hace que este método sea el primero de su tipo en presentarse como un método generalizable en diferentes dominios. Por último, hemos probado este método en el caso en el que el número de variables presentes es menor que el tamaño de la muestra (pn) y esperamos un rendimiento similar.
Limitaciones
La principal limitación práctica de ISPat-3D, tal como se aplica aquí, es computacional. El conjunto de datos 3D de CRC1 contiene aproximadamente 2 × 108 células segmentadas en las 25 secciones analizadas, una escala que está completamente fuera del alcance de la inferencia estándar del proceso gaussiano, que tiene una complejidad de tiempo y memoria en función del número de observaciones. Se observó un problema similar en el conjunto de datos 3D de cáncer de mama (BC). Abordamos esto mediante un submuestreo espacialmente estratificado, seleccionando 50000, 100000 y 150000, o algún otro número de células por zona, y agregando los resultados mediante el promedio de transformación de Fisher de las matrices de correlación parcial entre réplicas. Si bien este enfoque es estadísticamente sólido, introduce una dependencia de la cobertura espacial proporcionada por la submuestra y no puede aprovechar toda la información estadística de la población celular completa. Las aproximaciones de GP dispersas, los métodos de inducción de puntos o la inferencia variacional escalable de GP podrían, en principio, reducir esta carga y permitir que ISPat-3D opere en poblaciones celulares más grandes sin que el submuestreo siga siendo un problema abierto para la investigación futura. La red compartida exhibió una variabilidad ligeramente mayor entre las réplicas de submuestreo que las redes específicas de cada zona, lo cual es de esperar porque la estimación del factor compartido se basa en todas las zonas simultáneamente e hereda la varianza de cada una. Una segunda limitación es que el flujo de trabajo actual trata cada zona de forma independiente en la etapa de regresión de GP antes de agruparlos mediante MSFA. Un modelo completamente conjunto que suavice entre las zonas mejoraría, en principio, la estimación para las zonas con una cobertura celular escasa, pero a costa de una complejidad del modelo y un costo computacional sustancialmente mayores. Finalmente, el análisis presentado aquí se basa en los especímenes independientes de CRC1 y BC-HER2, lo que demuestra que este método es generalizable. Los mapas de interacción recuperados del análisis 3D difieren sustancialmente del análisis 2D de referencia, lo que fortalece nuestro análisis y proporciona una comprensión volumétrica de la colocalización y las funciones celulares. Si bien los datos de BC se caracterizaron menos para la exploración, CRC1 es un tumor bien caracterizado y de alta complejidad con estado MSI-H y un margen invasivo multifrontal, lo que lo convierte en un caso de prueba informativo, pero la generalizabilidad de estas estructuras de red identificadas aquí requiere validación en especímenes 3D adicionales para cada tumor enfermo considerado. La extensión a las 16 muestras de porta completa de CRC restantes disponibles en la cohorte [Lin et al. (2023)], que se pueden utilizar como una cohorte de pacientes con imágenes de porta completa 2D con cáncer colorrectal para comprender qué interacciones ligando-receptor se observan en 2D, así como a otros tipos de tumores para los cuales la imagen multiplexada 3D es ahora factible, representa los próximos pasos inmediatos para ISPat-3D. Si bien reconocemos el hecho de que un análisis 2D de CRC puede fortalecer estructuralmente nuestro análisis, pero no es el objetivo de este manuscrito. Por último, todas las interacciones ‘↔’ consideradas aquí provienen de un gráfico no dirigido, es decir, son bidireccionales por naturaleza; la investigación futura también incluye la comprensión de la direccionalidad y la posterior naturaleza causal de estas funciones de tipo celular en el espectro 3D.
Relevancia biológica para los datos de cáncer colorrectal
Aplicamos ISPat-3D al espécimen CRC1 de [Lin et al. (2023)], un adenocarcinoma colorrectal MSI-H de etapa IIIB poco diferenciado, para el cual la imagen 3D CyCIF en 25 secciones seriadas produjo uno de los atlas de una sola célula de un tumor humano más detallados espacialmente hasta la fecha. [Lin et al. (2023)] utilizaron una variedad de estadísticas espaciales para caracterizar la coocurrencia de tipos de células, las correlaciones de los vecinos más cercanos y la proximidad de PD1:PDL1 en el margen invasivo, y encontraron que la supresión de las células T en el margen invasivo involucró múltiples tipos de células, con los macrófagos desempeñando un papel coordinador central en la arquitectura inmunosupresora del tumor. Nuestros hallazgos son generalmente consistentes con esta imagen y la amplían en varios aspectos.
La señal más fuerte en nuestra red compartida, la correlación parcial positiva entre Macrófago y Estroma, refleja directamente la observación en [Lin et al. (2023)] de que los macrófagos en CRC1 están concentrados en los compartimentos del estroma y en el margen invasivo en lugar de dentro de los nidos tumorales. La colocalización espacial de macrófagos y células del estroma que nuestro método detecta como una asociación condicional que persiste en todas las cinco zonas de densidad tumoral es consistente con la idea de que el tejido del estroma proporciona el nicho físico dentro del cual los macrófagos se acumulan y probablemente ejercen una función inmunosupresora. También se ha informado de esta asociación en otras cohortes de CRC, donde la infiltración de macrófagos del estroma tiene una importancia pronóstica desfavorable.
La fuerte correlación parcial negativa compartida entre Otras células inmunitarias y Treg y entre las células T y Treg es consistente con el hallazgo de [Lin et al. (2023)] de que la supresión de las células T en el margen invasivo de CRC1 está estructurada espacialmente, con poblaciones reguladoras y efectoras que ocupan dominios espaciales parcialmente no superpuestos. Condicionado a todos los demás tipos de células, una alta densidad de Treg coexiste con una menor infiltración inmunitaria amplia, que es la firma espacial de un nicho inmunosupresor. Se sabe que las células T reguladoras erigen barreras físicas y funcionales a la infiltración de las células T efectoras a través de la supresión mediada por citocinas, la competencia metabólica y la remodelación del estroma, todo lo cual se manifestaría como una segregación espacial de las Treg de las poblaciones inmunitarias efectoras a nivel tisular.
En las redes específicas de cada zona, la correlación parcial positiva consistente entre las células T CD4+, las células T CD8+ y las Treg en las cinco capas de densidad refleja la infiltración de células T coordinada espacialmente que está presente incluso en las regiones de baja carga tumoral y persiste en las áreas de máxima densidad tumoral. Esta colocalización de células T auxiliares, citotóxicas y reguladoras es compatible con la agrupación organizada de células inmunitarias en los márgenes invasivos de CRC1. La aparición de la colocalización de células B con las células T CD4+ en las densidades tumorales intermedias y más altas, que detectamos como una correlación parcial que aparece de forma consistente a partir de la zona baja, es consistente con la formación de estructuras linfoides terciarias o agregados linfoides que surgen preferentemente en las regiones de compromiso inmunitario sostenido con el tumor.
Una característica notable de nuestros resultados es la atenuación de los tamaños del efecto al pasar de las redes compartidas a las redes específicas de cada zona. Las asociaciones Macrófago↔Estroma de la magnitud que se observa en la red compartida no se replican dentro de las zonas individuales con una intensidad comparable, lo que refleja el hecho de que el componente compartido captura la organización espacial global del microambiente tumoral, mientras que los componentes específicos de la zona capturan las desviaciones incrementales de esa línea de base. Esta descomposición es metodológicamente útil: la red compartida identifica el esqueleto arquitectónico 3D del MET, y las redes específicas de la zona revelan cómo se modulan las relaciones espaciales inmunitarias y del estroma mediante la densidad tumoral local. Además, el cambio en la asociación principal de las células T de CD4+↔Treg en las zonas intermedias y altas a CD8+↔Treg en la zona muy alta es consistente con una transición hacia la supresión de las células T citotóxicas en el núcleo del tumor.
La colocalización espacial de células B↔células T CD4+ detectada por ISPat-3D a partir de la zona de baja densidad tumoral tiene una base molecular bien caracterizada. Dentro de las estructuras linfoides terciarias (TLS), las células B y las células T auxiliares foliculares (Tfh) interactúan a través del eje receptor-ligando CD40↔CD40L, lo que impulsa la formación del centro germinal, el cambio de clase de recombinación de las células B y la maduración de la afinidad ([Gulubova et al., 2024]; [Lv et al., 2024]; [Hegoburu et al., 2025]). Esta interacción CD40↔CD40L se ha caracterizado específicamente en el cáncer colorrectal, donde la fuerza de este acoplamiento receptor-ligando entre las células B del centro germinal y las células T CXCR5+CD4+ es significativamente mayor en la enfermedad en etapa temprana y disminuye en la enfermedad avanzada, lo que coincide con la alteración de la maduración de TLS ([Chen et al., 2025b]). La aparición de esta colocalización condicional de células B↔células T CD4+ en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta en el espécimen CRC1, detectada aquí por primera vez en un marco de red espacial 3D, es consistente con que los precursores de TLS se formen preferentemente en las regiones de compromiso tumoral-inmunitario sostenido en lugar de en la periferia de menor densidad tumoral. El segundo hallazgo novedoso es el cambio en la asociación dominante de Treg de CD4+↔Treg en la densidad intermedia a CD8+↔Treg en la densidad tumoral máxima, que tiene un correlato mecanicista en la interacción mediada por IL-2 entre las células T citotóxicas intratumorales y las Treg. Se ha realizado una investigación que demuestra que las células T CD8+ activadas producen IL-2 y se colocalizan físicamente con las Treg en el tejido tumoral, lo que promueve la acumulación de Treg a través de la regulación ascendente de ICOS y, por lo tanto, contrarresta su propia actividad citotóxica ([Geels et al., 2024]). Específicamente en el cáncer colorrectal, la relación de células T CD8+ a Treg FoxP3+ intratumorales es un determinante reconocido de la inmunidad antitumoral y el resultado clínico, con una alta densidad de Treg intratumorales que se correlaciona con la supresión de las respuestas citotóxicas de CD8+ ([Syed Khaja et al., 2017]). ISPat-3D recupera esta proximidad espacial de CD8+↔Treg como la interacción condicional dominante precisamente en la densidad tumoral máxima, proporcionando evidencia espacialmente resuelta directa a nivel de imagen de proteínas para el nicho inmunosupresor que caracteriza el núcleo del tumor.
Relevancia biológica para el carcinoma ductal HER2-positivo
[Kuett et al. (2022)] caracterizaron este tumor utilizando comparaciones de distancia 2D versus 3D basadas en la proximidad, la agrupación de fenotipos de células con Phenograph y la representación 3D cualitativa de poblaciones celulares seleccionadas, pero no modelaron redes espaciales condicionales entre tipos de células ni examinaron cómo varía la estructura de la interacción entre las zonas de densidad tumoral. Nuestros hallazgos van más allá de ese marco descriptivo en varios aspectos, y varias de las interacciones clave que recuperamos tienen correlatos mecanicistas directos en la literatura sobre cáncer de mama HER2-positivo. La característica dominante de la red compartida es un sistema integral de fuertes correlaciones parciales negativas entre las poblaciones inmunitarias y los subtipos tumorales. Las tres poblaciones inmunitarias con las correlaciones parciales absolutas más altas en la red compartida: macrófago, células T CD4+ y células T CD8+, están asociadas negativamente con TumorHER2pos y Tumorbasal, con tamaños de efecto que oscilan entre y . Estos grandes valores negativos indican una exclusión condicional invariante de la zona de las células inmunitarias de las regiones ocupadas por el tumor, independientemente de la densidad tumoral local. [Kuett et al. (2022)] mostraron que los macrófagos, las células T CD8+ y las células B se distribuyeron en toda la reconstrucción 3D, pero su análisis no tuvo en cuenta la partición espacial entre estas poblaciones y el compartimento tumoral a nivel de la red condicional. El patrón que detectamos es consistente con un fenotipo de exclusión inmunitaria en este carcinoma ductal HER2-positivo, en el que la partición física por la arquitectura del estroma y del epitelio limita la penetración de las células inmunitarias en las regiones ocupadas por el tumor. Se sabe que los tumores HER2-positivos albergan grados heterogéneos de linfocitos infiltrantes tumorales, y la exclusión inmunitaria se ha relacionado mecánicamente con la actividad de CAF impulsada por TGF-β y el remodelado de la MEC que restringen la migración de las células T hacia el epitelio tumoral ([Calon et al., 2015]; [Sewell-Loftin et al., 2017]).
El hallazgo novedoso más importante en relación con [Kuett et al. (2022)] es la correlación parcial positiva entre CAF y mioepitelio en la zona de densidad tumoral muy baja, que representa la asociación condicional positiva más grande en todo el análisis. Las células mioepiteliales revisten la superficie interna de los conductos mamarios y están rodeadas por una vaina periductal de fibroblastos asociados al cáncer que depositan fibronectina, activan la señalización de TGF y contribuyen a la remodelación de la membrana basal ([Hayward et al., 2022]; [Yu et al., 2014]). Esta unidad estructural periductal CAF↔mioepitelial se ha descrito como un mediador crítico de la transición del carcinoma ductal in situ al carcinoma ductal invasivo: las células mioepiteliales asociadas al tumor promueven la progresión invasiva al estimular a los CAF periductales para que degraden la membrana basal a través de la secreción de MMP9 y MMP13, un proceso impulsado por la señalización de TGF-β/Smads ([Lo et al., 2017]; [Hayward et al., 2022]). La colocalización condicional casi perfecta que detectamos a baja densidad tumoral es consistente con la arquitectura periductal intacta que se encuentra en las regiones de baja carga, donde la capa basal ductal aún no se ha visto alterada. Es importante destacar que esta asociación no se cuantificó en [Kuett et al. (2022)]: su análisis describió la morfología irregular de la capa de células basales CK5+ en la representación 3D, pero no modeló el acoplamiento espacial condicional entre los CAF y el compartimento mioepitelial. Además, este acoplamiento estructural es una observación fundamentalmente tridimensional; en cualquier sección 2D, la interfaz CAF↔mioepitelial se muestrea a una profundidad arbitraria a través de la vaina periductal, y la asociación espacial aparente depende de si el plano de corte intersecta la región periductal, lo que hace que sea imposible obtener esta interacción a partir de datos 2D únicamente.
La fuerte correlación parcial positiva entre CAF y endotelio que surge en las zonas de densidad tumoral intermedia y alta, y que persiste pero se debilita en la zona de densidad muy alta, es consistente con el papel establecido de los CAF en el apoyo a la angiogénesis tumoral a través de mecanismos mecánicos y parcrinos. Los CAF que sobreexpresan SDF-1/CXCL12 reclutan células progenitoras endoteliales en los tumores de mama y estimulan la neovascularización a través de la secreción de VEGF, y esta interacción parcrina entre fibroblastos y células endoteliales se ha demostrado en modelos de vasculogénesis 3D, donde los CAF del cáncer de mama impulsan un crecimiento vascular significativamente mayor que los fibroblastos normales a través de la transmisión de fuerza mecánica mediada por Rho/ROCK ([Sewell-Loftin et al., 2017]). La aparición de esta asociación condicional específicamente en las zonas de carga tumoral intermedia y alta, en lugar de en las de baja carga, sugiere que la angiogénesis mediada por CAF se activa como un proceso dependiente de la densidad tumoral en este carcinoma ductal HER2-positivo, en lugar de ser una característica constitutiva del microambiente tumoral (TME). Esta observación resuelta por zonas solo es accesible a través de la estratificación de densidad volumétrica que proporciona ISPat-3D: los canales vasculares son estructuras tridimensionales tortuosas cuya coalineación con el andamiaje CAF periductal solo se puede cuantificar correctamente integrando la información espacial a lo largo del eje z, ya que cualquier sección 2D individual intersecta los vasos en un ángulo arbitrario que no captura la coorganización longitudinal CAF↔endotelial.
La correlación parcial positiva entre las células B y los CAF que aparece exclusivamente en la zona de densidad tumoral alta y está ausente en todas las demás zonas, proporciona evidencia espacial directa a nivel de proteínas de un vínculo estructural entre el compartimento de células B y el andamiaje CAF que se ha caracterizado a nivel transcripcional en el cáncer de mama ([Cords et al., 2023]; [Lavie et al., 2022]). Se ha demostrado que los subtipos de CAF que presentan antígenos (apCAF) se asocian estrechamente con las estructuras linfoides terciarias (TLS) en múltiples tipos de cáncer, y los CAF PDPN+ son capaces de organizar el andamiaje estromal que respalda la formación de TLS y la acumulación de células B en el cáncer de mama ([Chen et al., 2025a]; [Johansson-Percival y Ganss, 2021]). Específicamente en el cáncer de mama HER2-positivo, una mayor densidad de TLS se asocia con una mejor respuesta patológica completa al tratamiento neoadyuvante, y la presencia de infiltrados inmunitarios ricos en células B en el estroma se ha asociado con mejores resultados ([Denkert et al., 2018]; [Griguolo et al., 2021]). La especificidad de zona de esta interacción B_cell↔CAF, que aparece solo a alta carga tumoral, es consistente con la hipótesis de que la formación de TLS en este tumor es desencadenada por una mayor carga de antígenos en las regiones de alta densidad, en lugar de ser una característica global del microambiente. Esta interacción no se puede recuperar del análisis 2D porque las relaciones espaciales de las células B con el andamiaje de fibroblastos no se modelaron en [Kuett et al. (2022)] y porque la estructura espacial organizadora de TLS en 3D se extiende a lo largo de los ejes de profundidad que no captura ninguna sección individual.
La inversión dependiente de la zona de la relación entre las células T CD4+ y los macrófagos, desde positiva (zona baja) hasta negativa (red compartida; zona alta), refleja una transición funcional bien caracterizada en el compartimento de macrófagos asociados al tumor a medida que aumenta la carga tumoral. En las regiones de baja carga, los macrófagos en un estado de activación inmunitaria interactúan con las células T CD4+ a través de la presentación de antígenos, y la colocalización espacial de los macrófagos polarizados M1 con las células T helper en los sitios de activación inmunitaria es consistente con la correlación parcial positiva que observamos en la zona baja ([DeNardo et al., 2009]). A medida que aumenta la densidad tumoral, los macrófagos asociados al tumor hacen la transición hacia un fenotipo inmunosupresor polarizado M2 que excluye activamente a las células T CD4+ de su nicho espacial a través de la señalización de TGF-β, IL-10 y ligandos de puntos de control ([Cassetta y Pollard, 2018]). La inversión del signo de la interacción entre las células T CD4+ y los macrófagos, de positivo a negativo, a lo largo del espectro de zonas es una observación resuelta por gradiente que requiere una zonificación de densidad volumétrica para detectar: en cualquier sección 2D individual, el estado funcional de los macrófagos varía a lo largo del eje z con la profundidad del tumor, y la integración de la información de una imagen plana confunde los contextos espaciales de macrófagos de activación inmunitaria e inmunosupresión en una única estimación de densidad marginal que no puede resolver esta transición funcional.
La divergencia entre las células T CD4+ y las células T CD8+ en su relación con el endotelio en la zona alta (las células T CD4+ se colocalizan condicionalmente con las células endoteliales, mientras que las células T CD8+ se excluyen condicionalmente del compartimento endotelial) es consistente con un patrón de exclusión inmunitaria en el que las células T citotóxicas se ven impedidas de interactuar con el nicho perivascular, mientras que las células T helper se acumulan cerca de las estructuras vasculares. Los macrófagos asociados al tumor perivascular ocupan nichos inmediatamente adyacentes a los vasos sanguíneos y se ha demostrado que suprimen activamente la infiltración de células T CD8+ al tiempo que permiten la acumulación de células T CD4+ y células T reguladoras en el espacio perivascular ([Lewis et al., 2016]; [Harney et al., 2015]). Esta segregación espacial de las células T CD4+ y CD8+ en relación con la vasculatura es una característica organizativa tridimensional del tumor: los canales endoteliales se extienden a lo largo de ejes que no son paralelos a ningún plano de sección 2D estándar, y la distribución perivascular diferencial de los subtipos de células T solo se puede caracterizar midiendo las distancias desde las células hasta la red vascular 3D completa en lugar de hasta las secciones transversales 2D de los vasos.
Finalmente, el colapso progresivo de la complejidad de la red desde la zona intermedia (55 aristas por encima del umbral) hasta la zona muy alta (29 aristas por encima del umbral), acompañado de una reducción en las magnitudes de la correlación parcial en todas las aristas en la zona muy alta, es en sí mismo un hallazgo biológicamente informativo. En las regiones de máxima carga tumoral, los principios organizativos espaciales que rigen la colocalización de los tipos de células en este tumor (el acoplamiento estructural CAF↔mioepitelial, la coorganización angiogénica CAF↔endotelial, los patrones de exclusión inmunitaria y la interacción específica de la zona entre las células B y los CAF) se atenúan colectivamente, lo que sugiere que la densidad tumoral extrema en el carcinoma ductal HER2-positivo altera la arquitectura tisular que normalmente impone estas relaciones espaciales condicionales. Esta observación resuelta por gradiente solo es accesible a través de la zonificación de densidad tumoral volumétrica que proporciona ISPat-3D, y no se puede detectar a partir de ninguna sección 2D individual, ya que una imagen plana captura el tumor a una profundidad arbitraria sin referencia a la carga tumoral volumétrica en esa ubicación.
Contribuciones metodológicas y novedades
Las herramientas de análisis espacial existentes para la imagen multiplexada, incluidos los estadísticos de coocurrencia, las funciones de autocorrelación espacial y los métodos de vecindad celular, operan sobre datos de eventos a nivel celular discretos en 2D y no tienen en cuenta la autocorrelación espacial al estimar las asociaciones entre los tipos de células. ISPat-3D aborda ambas limitaciones. La etapa de regresión GP elimina explícitamente las tendencias espacialmente suaves de cada superficie de intensidad de tipo celular, de modo que la covariación que se pasa a MSFA refleje la asociación espacial residual en lugar de una confusión introducida por la disposición global de los compartimentos tisulares. El componente MSFA separa entonces las asociaciones que son comunes a todas las zonas de las que son específicas de la zona, lo que permite una descomposición que no está disponible a partir de ningún análisis de una sola zona o de toda la lámina. El uso de un kernel de Matérn anisotrópico con parámetros de longitud de escala lateral y axial separados es esencial para los datos de imagen 3D, donde la resolución de la imagen y la escala física difieren sustancialmente entre el plano y el eje a través de las secciones seriales. Hemos aplicado este método a dos conjuntos de datos de cáncer multiplexados 3D para comprender las interacciones ligando-receptor resueltas espacialmente que varían según la carga tumoral. Pero esto se puede aplicar a cualquier conjunto de datos espaciales 3D con múltiples variables (por ejemplo, tipos de células, genes, valores de intensidad de vóxeles, intensidad de fluorescencia, características radiómicas, etc.) y anotaciones arbitrarias (por ejemplo, específicas del tumor: frente invasor, núcleo tumoral, margen tumoral, región peritumoral, borde principal; específicas vasculares y nectricas: núcleo necrótico, zona perinecrótica, región inducida por hipoxia, punto caliente angiogénico, proliferación microvascular, etc.) para comprender la arquitectura volumétrica de estas variables. Esto hace que este método sea el primero de su tipo en presentarse como un método generalizable en diferentes dominios. Por último, hemos probado este método en el caso en el que el número de variables presentes es menor que el tamaño de la muestra (pn) y esperamos un rendimiento similar.
Limitaciones
La principal limitación práctica de ISPat-3D, tal como se aplica aquí, es computacional. El conjunto de datos 3D de CRC1 contiene aproximadamente 2 × 108 células segmentadas en las 25 secciones analizadas, una escala que está completamente fuera del alcance de la inferencia estándar del proceso gaussiano, que tiene una complejidad de tiempo y memoria en función del número de observaciones. Se observó un problema similar en el conjunto de datos 3D de BC. Abordamos esto mediante un submuestreo espacialmente estratificado, seleccionando 50.000, 100.000 y 150.000 o algún otro número de células por zona y agregando los resultados mediante el promedio de transformación de Fisher de las matrices de correlación parcial en los diferentes análisis. Si bien este enfoque es estadísticamente sólido, introduce una dependencia de la cobertura espacial proporcionada por el submuestreo y no puede aprovechar toda la información estadística de la población celular completa. Las aproximaciones de GP dispersas, los métodos de inducción de puntos o la inferencia de GP variacional escalable podrían, en principio, reducir esta carga y permitir que ISPat-3D opere en poblaciones celulares más grandes sin que el submuestreo siga siendo un problema abierto para la investigación futura. La red compartida exhibió una variabilidad ligeramente mayor en los diferentes análisis de submuestreo que las redes específicas de cada zona, lo cual es de esperar porque la estimación del factor compartido se basa en todas las zonas simultáneamente e hereda la varianza de cada una. Una segunda limitación es que el flujo de trabajo actual trata cada zona de forma independiente en la etapa de regresión de GP antes de agruparlos mediante MSFA. Un modelo completamente conjunto que suavice entre las zonas mejoraría, en principio, la estimación de las zonas con una cobertura celular escasa, pero a costa de una complejidad del modelo y un costo computacional sustancialmente mayores. Finalmente, el análisis presentado aquí se basa en los especímenes independientes de CRC1 y BC-HER2, lo que demuestra que este método es generalizable. El hecho de que los mapas de interacción recuperados del análisis 3D difieran sustancialmente del análisis 2D de referencia fortalece nuestro análisis y proporciona una comprensión volumétrica de la colocalización y las funciones celulares. Si bien los datos de BC se caracterizaron menos para la exploración, CRC1 es un tumor bien caracterizado y de alta complejidad con estado MSI-H y un margen invasivo multifrontal, lo que lo convierte en un caso de prueba informativo, pero la generalizabilidad de estas estructuras de red identificadas aquí requiere validación en especímenes 3D adicionales para cada tumor enfermo considerado. La extensión a los 16 especímenes de láminas completas de CRC restantes disponibles en la cohorte [Lin et al. (2023)] que se pueden utilizar como una cohorte de pacientes con imágenes de láminas completas en 2D con cáncer colorrectal para comprender qué interacciones ligando-receptor se observan en 2D, así como a otros tipos de tumores para los cuales la imagen multiplexada 3D es ahora factible, representa los próximos pasos inmediatos para ISPat-3D. Si bien reconocemos el hecho de que un análisis 2D de CRC puede fortalecer estructuralmente nuestro análisis, pero no es el objetivo de este manuscrito. Por último, todas las interacciones ‘↔’ consideradas aquí provienen de un gráfico no dirigido, es decir, son bidireccionales por naturaleza; la investigación futura también incluye la comprensión de la direccionalidad y la posterior naturaleza causal de estas funciones de tipo celular en el espectro 3D.
¡Aún no hay comentarios. Sé el primero en comentar!