La nanoclusterización y señalamiento de KRAS G12C y KRAS G12D responden a la remodelación de las cadenas acílicas de lípidos de manera específica por alelo

La pequeña GTPasa KRAS es un interruptor molecular que alterna entre los estados inactivos unidos al GDP y los estados activos unidos al GTP ^[1]–^[4]. KRAS activa una amplia variedad de cascadas de señalización, incluidas las quinasas de proteína activadas por mitógenos (MAPK) y la quinasa 3 de fosfoinositol (PI3K), y regula la supervivencia, el crecimiento, la división, la proliferación y la migración celular ^[1]–^[4]. KRAS es uno de los genes mutados con mayor frecuencia en el cáncer, contribuyendo especialmente al 98% de los tumores pancreáticos, al 45% de los tumores colorrectales y al 31% de los tumores de pulmón ^[1]–^[4]. Las mutaciones en los residuos, como G12, G13 y Q61, de KRAS son frecuentes en el cáncer ^[1]–^[4]. Las estrategias tradicionales para dirigirse al dominio enzimático G de KRAS han encontrado desafíos significativos porque su dominio G dinámico carece de surcos estables para que las moléculas pequeñas se unan con alta afinidad. Los tumores también desarrollan rápidamente resistencia a la inhibición de mutantes específicos de KRAS, en parte mediante la generación de mutaciones secundarias de KRAS ^[5]–^[7]. Alternativamente, la interrupción de la distribución espacial de KRAS puede suprimir la señalización y la función de los mutantes de KRAS. Esto se debe a que la señalización del tipo salvaje y los mutantes constitutivamente activos de KRAS se restringe principalmente a nanocúmulos de proteolípidos en la membrana plasmática (MP) ^[1],^[2],^[8]. Si bien, en general, se ha considerado que las asociaciones con la membrana carecen de especificidad, se ha demostrado que la asociación KRAS/membrana posee una selectividad intrincada. Se informó por primera vez que KRAS prefiere localizarse en regiones más fluidas y pobres en colesterol, es decir, regiones líquidas desordenadas (Ld) o no en forma de balsas (enriquecidas con lípidos insaturados) de la MP ^[9]–^[11]. Forzar a KRAS a entrar en las balsas lipídicas enriquecidas con colesterol, que también están enriquecidas con lípidos saturados, elimina la señalización KRAS/MAPK ^[12]–^[14]. Posteriormente, se informó que los nanocúmulos de señalización de KRAS enriquecen selectivamente un fosfolípido aniónico, la fosfatidilserina (PS), más específicamente las especies de PS con cadenas acilo sn-2 insaturadas ^[15]–^[24]. La depleción de PS endógeno interrumpe la nanoaglomeración, la señalización y las actividades oncogénicas de los mutantes de KRAS ^[15]–^[20],^[25]–^[30]. La adición aguda de especies de PS con cadenas acilo sn-2 insaturadas, pero no de PS completamente saturadas, restaura eficazmente la nanoaglomeración y el reclutamiento de efectores del mutante KRAS en las células con PS deplecionada ^[17]–^[21]. Por lo tanto, KRAS posee sensibilidad para los grupos de cabeza de lípidos (PS) y las cadenas acilo (cadenas acilo insaturadas).

Las células de mamíferos contienen típicamente de 30 a 40 especies de PS, con especies de PS insaturadas como componentes principales. Si bien la regulación directa de la biogénesis de la cadena acilo de PS se comprende poco, la PS se convierte de la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE) a través del intercambio de grupos de cabeza ^[31]. Las lisofosfatidilcolina aciltransferasas (LPCAT) remodelan las cadenas acilo sn-2 de PC y PE con alta especificidad ^[32],^[33]. Por lo tanto, es posible que las LPCAT puedan remodelar indirectamente las cadenas acilo de PS y, a su vez, afectar la distribución espacial y las actividades oncogénicas de KRAS. En particular, LPCAT1 cataliza preferentemente la unión de cadenas acilo completamente saturadas a la posición sn-2 de PC y PE ^[32],^[33]. Una mayor expresión de LPCAT1 aumenta los niveles de PC saturada y estabiliza los dominios líquidos ordenados (Lo) ^[33]. Aquí, mostramos que la expresión estable de LPCAT1 agota las principales especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas y altera la nanoaglomeración y las actividades oncogénicas de KRAS en líneas de tumores pancreáticos. Por lo tanto, la remodelación de las cadenas acilo de PS puede ser una estrategia novedosa para dirigirse a la oncogénesis de KRAS.

Resultados

La expresión de LPCAT1 agota la PS insaturada en las células tumorales pancreáticas.

Generamos células de adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC) MiaPaCa-2 que expresan de forma estable un vector vacío V2 o LPCAT1. Se validó la mayor expresión de LPCAT1 en las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable LPCAT1 mediante Western blot (recuadro de la Fig. 1). Se recolectaron lisados celulares totales de las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 para la lipidómica de tipo "shot-gun". Se muestran los cambios en las estructuras de las cadenas acilo, como la longitud de la cadena acilo (Figura Suplementaria 1) y el número de dobles enlaces (Figura Suplementaria 2), de los principales tipos de lípidos. Los principales tipos de lípidos incluyen fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico (PA), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfoinosítidos (PI), esfingomielina (SM), así como especies de lisofosfolípidos (liso PC, liso PE y liso PA). Los cambios detallados en las especies de estos tipos de lípidos también se muestran en las Figuras Suplementarias 3-11. Dado que los nanocúmulos de KRAS se enriquecen selectivamente con especies de PS insaturadas ^[15]–^[24], nos centramos en los efectos de LPCAT1 sobre la homeostasis de las cadenas acilo de PS. En la Fig. 1A, en comparación con el control V2, las células MiaPaCa-2 que expresan LPCAT1 contenían niveles significativamente más bajos de especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas, incluidas 18:0/18:1 PS (que comprenden el 28% del PS total), 18:0/18:2 PS (9% del PS total) y 18:0/20:3 PS (28% del PS total). La expresión de LPCAT1 también elevó los niveles de 16:0/16:1 PS (0,7% del PS total) y 16:1/20:1 PS (0,7% del PS total). En conjunto, la expresión de LPCAT1 disminuyó 3 especies principales de PS (~65% del PS total) con cadenas sn-2 mono- o poliinsaturadas, al tiempo que aumentaba las especies de PS menores (~1,4% del PS total). Coherente con la noción de que PS se convierte en parte de las especies de PC, las especies de PC con las mismas cadenas acilo, como 18:0/18:1 PC, 18:0/18:2 PC y 18:0/20:3 PC, también se agotaron en las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable LPCAT1 en comparación con el control V2. Curiosamente, estas especies de PC combinadas representan aproximadamente el 5% del contenido total de PC. Por lo tanto, la expresión estable de LPCAT1 agota más eficazmente las especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas.

La expresión de LPCAT1 altera la localización en la MP y la nanoaglomeración de KRASG12V.

A continuación, utilizamos el análisis de nanoaglomeración univariante de microscopía electrónica (ME) para examinar los efectos de LPCAT1 sobre los nanocúmulos de señalización de un mutante oncogénico importante, KRASG12V, expresado ectópicamente en las células MiaPaCa-2. Las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 se infectaron con lentivirus con GFP-KRASG12V. Las láminas basolaterales de la MP de estas células se unieron a las rejillas de ME. La GFP-KRASG12V anclada al folleto interno de la MP se inmunomarcó con un anticuerpo anti-GFP conjugado con nanopartículas de oro de 4,5 nm. La GFP-KRASG12V marcada con oro se visualizó mediante ME de transmisión (MET) a un aumento de 100.000x. La distribución espacial de las partículas de oro dentro de un área de MP de 1 μm2 se cuantificó utilizando el análisis de la función K de Ripley, donde el alcance de la nanoaglomeración, , se representó gráficamente en función de la distancia en nanómetros. El valor máximo , o , se utilizó como un resumen estadístico de la nanoaglomeración. Los valores superiores al intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) de 1 indican una nanoaglomeración estadísticamente significativa, con valores más grandes que corresponden a una nanoaglomeración más extensa. En la Fig. 2A, de GFP-KRASG12V en las células MiaPaCa-2 que expresan LPCAT1 disminuyó significativamente (por debajo del IC del 99% marcado por la línea verde) en comparación con de GFP-KRASG12V en las células MiaPaCa-2 que expresan V2. Estos datos indican que la expresión de LPCAT1 abole eficazmente la nanoaglomeración de GFP-KRASG12V en la MP. La Fig. 2B muestra que el marcado con oro de GFP-KRASG12V por 1 μm2 de área de MP en las células que expresan LPCAT1 también fue significativamente menor que en las células que expresan V2, lo que sugiere que la expresión de LPCAT1 deslocaliza significativamente GFP-KRASG12V de la MP. Otro isoforma de RAS, HRAS, se distribuye en nanocúmulos espacialmente separados enriquecidos con diferentes lípidos que KRAS ^[9],^[10],^[15],^[16],^[19],^[20]. La expresión de LPCAT1 disminuyó parcialmente la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2C), sin afectar la localización de GFP-HRASG12V en la MP (Fig. 2D). Por lo tanto, la expresión de LPCAT altera más eficazmente la asociación de la MP de un mutante de KRAS.

Para validar la especificidad de la cadena acilo de PS, realizamos experimentos de adición aguda en células de riñón de hámster de bebé (BHK) que expresan de forma estable el vector vacío pC1 o LPCAT1. De manera similar a las células MiaPaCa-2, la expresión de LPCAT1 abolió eficazmente la nanoaglomeración de GFP-KRASG12V (Fig. 2E) y deslocalizó GFP-KRASG12V de la MP de las células BHK (Fig. 2F). En un experimento de adición aguda, las células BHK que expresan de forma estable LPCAT1 se incubaron con un medio que contenía 10 μM de PS exógeno 18:0/18:1 durante 1 hora antes del análisis de nanoaglomeración por ME. Elegimos 18:0/18:1 PS porque la expresión de LPCAT1 disminuyó significativamente 18:0/18:1 PS (una especie de PS importante que comprende el 28% del PS total, Fig. 1A). La adición aguda de 18:0/18:1 PS restauró eficazmente la nanoaglomeración y la localización de la MP de GFP-KRASG12V (Fig. 2E y F). La expresión de LPCAT1 disminuyó parcial y numéricamente la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2G) y elevó la localización de la MP de GFP-HRASG12V (Fig. 2H) en las células BHK, también de manera similar a los efectos de LPCAT1 sobre GFP-HRASG12V en las células MiaPaCa-2. La adición aguda de 18:0/18:1 PS no tuvo ningún efecto sobre la localización de la MP (Fig. 2G) y la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2H). En conjunto, la expresión de LPCAT1 perturba más eficazmente la asociación de la MP de KRASG12V, lo cual está mediado por las especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas.

La expresión de LPCAT1 suprime la señalización de MAPK y las actividades oncogénicas de las células tumorales dependientes de KRAS.

A continuación, comparamos los efectos de la expresión de LPCAT1 sobre la salida de señal de las cascadas de MAPK y PI3K en las líneas de tumores pancreáticos humanos dependientes de KRAS, incluidas las células MOH y PANC1, y las células de tumores pancreáticos humanos independientes de KRAS, BxPC3. La expresión estable de LPCAT1 disminuyó significativamente los niveles de ERK fosforilada (pERK/ERK total) en las células MOH y PANC1, mientras que tuvo un efecto mínimo sobre la señalización de MAPK en las células BxPC3 (Fig. 3A-D). La señalización de PI3K (pAkt/Akt total), que está menos regulada preferentemente por KRAS, no se vio afectada por la expresión de LPCAT1 (Fig. 3A, F-G). En conjunto, la expresión de LPCAT1 disminuye más eficazmente la señalización de MAPK en las líneas de tumores dependientes de KRAS.

Luego, comparamos los efectos de LPCAT1 sobre las actividades oncogénicas de MOH y BxPC3. MOH que expresa de forma estable LPCAT1 mostró un número menor de colonias que las células MOH que expresan el control V2, sin afectar la formación de colonias de las células BxPC3 (Fig. 4A-C). La expresión de LPCAT1 también disminuyó significativamente la proliferación de las células MOH, sin afectar a las células BxPC3 (Fig. 4D y E). Para evaluar aún más la especificidad de LPCAT1, utilizamos la línea iKRAS, una línea de adenocarcinoma ductal pancreático murino (PDAC) con expresión inducida por doxiciclina (DOX) de KRASG12D ^[7],^[34]. La expresión estable de LPCAT1 disminuyó significativamente el tamaño de las colonias de las células iKRAS con la expresión inducida de KRASG12D (DOX+), sin afectar el tamaño de las colonias de las células iKRAS sin el mutante KRAS (DOX-) (Fig. 4F). En conjunto, LPCAT1 suprime más preferentemente las actividades oncogénicas de las células tumorales impulsadas por KRAS.

Para evaluar los efectos de LPCAT1 sobre la migración de las células cancerosas, realizamos un ensayo de rascado utilizando las células MiaPaCa-2, un modelo de metástasis. Las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 se sembraron hasta la confluencia. Veinticuatro horas después de un rascado, se midieron las brechas entre las células para indicar la capacidad de curación de heridas y la migración. En la Fig. 5, la brecha de las células MiaPaCa-2 que expresan LPCAT1 fue significativamente más ancha que la de las células MiaPaCa-2 que expresan V2. Por lo tanto, la expresión de LPCAT1 da como resultado una migración más lenta de las células MiaPaCa-2.

LPCAT1 sensibiliza a un inhibidor específico de KRAS.

Para examinar los efectos de LPCAT1 sobre la quimiosensibilización de las células tumorales dependientes de KRAS, tratamos las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 con el inhibidor específico de KRASG12C, Sotorasib. En la Fig. 6A, Sotorasib disminuyó aún más la proliferación de las células MiaPaCa-2 que expresan de forma estable LPCAT1 en comparación con las células MiaPaCa-2 que expresan V2. A continuación, tratamos las células MiaPaCa-2 con Trametinib, un inhibidor de MEK. En la Fig. 6B, la expresión de LPCAT1 no afectó los efectos inhibitorios de Trametinib sobre la proliferación de las células MiaPaCa-2. Nuestros datos sugieren que las actividades de KRAS son sensibles a la expresión de LPCAT1.

La expresión de LPCAT1 se correlaciona con la oncogénesis de KRAS en los pacientes.

Para examinar más a fondo la correlación entre LPCAT1 y la oncogénesis de KRAS en pacientes, realizamos un análisis estadístico utilizando datos de pacientes obtenidos del Cancer Genome Atlas (TCGA) en el portal de datos Genomic Data Commons (GDC). Mostramos que los pacientes con cáncer de páncreas que presentaban tumores dependientes de KRAS tenían niveles significativamente más bajos de expresión de LPCAT1 que aquellos con tumores independientes de KRAS (Fig. 7A). El análisis de Kaplan-Meier ilustró que los pacientes con cáncer de páncreas con mayor expresión de LPCAT1 presentaban una mayor probabilidad de supervivencia en comparación con aquellos con menor expresión de LPCAT1 (Fig. 7B). Un análisis adicional de Kaplan-Meier reveló que una mayor expresión de LPCAT1 mejoraba significativamente la probabilidad de supervivencia de los pacientes con cáncer de pulmón dependiente de KRAS (Fig. 7C). Por otro lado, los pacientes con cáncer de pulmón con tumores independientes de KRAS no mostraron ninguna correlación entre la expresión de LPCAT1 y la probabilidad de supervivencia (Fig. 7D). En conjunto, una mayor expresión de LPCAT1 mejora el pronóstico de los pacientes con tumores dependientes de KRAS.

La expresión de LPCAT1 reduce los niveles de PS insaturados en las células tumorales pancreáticas.

Generamos células humanas de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) MiaPaCa-2 que expresan de forma estable ya sea un vector vacío V2 o LPCAT1. Se validó la mayor expresión de LPCAT1 en las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable LPCAT1 mediante Western blotting (recuadro de la Fig. 1). Se recolectaron lisados celulares totales de las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable V2 o LPCAT1 para realizar una lipidómica de "shot-gun". Se muestran los cambios en las estructuras de las cadenas de acilo, como la longitud de la cadena de acilo (Figura Suplementaria 1) y el número de dobles enlaces (Figura Suplementaria 2), de los principales tipos de lípidos. Los principales tipos de lípidos incluyen fosfatidilcolina (PC), ácido fosfatídico (PA), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfoinosítidos (PI), esfingomielina (SM), así como especies de lisofosfolípidos (liso PC, liso PE y liso PA). Los cambios detallados en las especies de estos tipos de lípidos también se muestran en las Figuras Suplementarias 3-11. Dado que los nanocúmulos de KRAS enriquecen selectivamente las especies de PS insaturadas ^[15]-^[24], nos centramos en los efectos de LPCAT1 sobre la homeostasis de las cadenas de acilo de PS. En la Fig. 1A, en comparación con el control V2, las células MiaPaCa-2 que expresaban LPCAT1 contenían niveles significativamente más bajos de especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas, incluyendo 18:0/18:1 PS (que comprende el 28% del PS total), 18:0/18:2 PS (9% del PS total) y 18:0/20:3 PS (28% del PS total). La expresión de LPCAT1 también elevó los niveles de 16:0/16:1 PS (0,7% del PS total) y 16:1/20:1 PS (0,7% del PS total). En conjunto, la expresión de LPCAT1 disminuyó 3 especies principales de PS (~65% del PS total) con cadenas sn-2 mono- o poliinsaturadas, al tiempo que aumentaba las especies menores de PS (~1,4% del PS total). Coherente con la noción de que el PS se convierte, en parte, a partir de especies de PC, las especies de PC con las mismas cadenas de acilo, como 18:0/18:1 PC, 18:0/18:2 PC y 18:0/20:3 PC, también se redujeron en las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable LPCAT1 en comparación con el control V2. Curiosamente, estas especies de PC combinadas representan aproximadamente el 5% del contenido total de PC. Por lo tanto, la expresión estable de LPCAT1 reduce de manera más efectiva las especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas.

La expresión de LPCAT1 altera la localización en la membrana plasmática y la nanoaglomeración de KRASG12V.

A continuación, utilizamos microscopía electrónica (ME) y análisis univariado de nanoaglomeración para examinar los efectos de LPCAT1 sobre los nanoaglomerados de señalización de un importante mutante oncogénico KRASG12V expresado ectópicamente en las células MiaPaCa-2. Las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable V2 o LPCAT1 se infectaron con lentivirus con GFP-KRASG12V. Las láminas basolaterales de la membrana plasmática de estas células se unieron a las rejillas de ME. La GFP-KRASG12V anclada al folleto interno de la membrana plasmática se inmunomarcó con un anticuerpo anti-GFP conjugado con nanopartículas de oro de 4,5 nm. La GFP-KRASG12V marcada con oro se visualizó mediante ME de transmisión (MET) con un aumento de 100.000X. La distribución espacial de las partículas de oro dentro de un área de membrana plasmática de 1 μm2 se cuantificó utilizando el análisis de la función K de Ripley, donde el grado de nanoaglomeración, , se representó gráficamente frente a la distancia en nanómetros. El valor máximo , o , se utilizó como un resumen estadístico para la nanoaglomeración. Los valores de superiores al 99% del intervalo de confianza (IC del 99%) de 1 indican una nanoaglomeración estadísticamente significativa, con valores de mayores que corresponden a una nanoaglomeración más extensa. En la Fig. 2A, el valor de GFP-KRASG12V en las células MiaPaCa-2 que expresaban LPCAT1 disminuyó significativamente (por debajo del IC del 99% marcado por la línea verde) en comparación con el valor de GFP-KRASG12V en las células MiaPaCa-2 que expresaban V2. Estos datos indican que la expresión de LPCAT1 abole de manera efectiva la nanoaglomeración de GFP-KRASG12V en la membrana plasmática. La Fig. 2B muestra que el marcado con oro de GFP-KRASG12V por 1 μm2 de área de membrana plasmática en las células que expresaban LPCAT1 también fue significativamente menor que en las células que expresaban V2, lo que sugiere que la expresión de LPCAT1 deslocaliza significativamente GFP-KRASG12V de la membrana plasmática. Otro isoforma de RAS, HRAS, se distribuye en nanoaglomerados espacialmente separados enriquecidos con diferentes lípidos que KRAS ^[9],^[10],^[15],^[16],^[19],^[20]. La expresión de LPCAT1 disminuyó parcialmente la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2C), sin afectar la localización de GFP-HRASG12V en la membrana plasmática (Fig. 2D). Por lo tanto, la expresión de LPCAT altera de manera más efectiva la asociación de la membrana plasmática de un mutante de KRAS.

Para validar la especificidad de la cadena de acilo de PS, realizamos experimentos de adición aguda en células de riñón de hámster bebé (BHK) que expresaban de forma estable un vector vacío pC1 o LPCAT1. De manera similar a las células MiaPaCa-2, la expresión de LPCAT1 abolió de manera efectiva la nanoaglomeración de GFP-KRASG12V (Fig. 2E) y deslocalizó GFP-KRASG12V de la membrana plasmática de las células BHK (Fig. 2F). En un experimento de adición aguda, las células BHK que expresaban de forma estable LPCAT1 se incubaron con un medio que contenía 10 μM de 18:0/18:1 PS exógeno durante 1 hora antes del análisis de nanoaglomeración por ME. Elegimos 18:0/18:1 PS porque la expresión de LPCAT1 disminuyó significativamente 18:0/18:1 PS (una especie principal de PS que comprende el 28% del PS total, Fig. 1A). La adición aguda de 18:0/18:1 PS restauró de manera efectiva la nanoaglomeración y la localización en la membrana plasmática de GFP-KRASG12V (Fig. 2E y F). La expresión de LPCAT1 disminuyó parcial y cuantitativamente la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2G) y elevó la localización en la membrana plasmática de GFP-HRASG12V (Fig. 2H) en las células BHK, también de manera similar a los efectos de LPCAT1 sobre GFP-HRASG12V en las células MiaPaCa-2. La adición aguda de 18:0/18:1 PS no tuvo ningún efecto sobre la localización en la membrana plasmática (Fig. 2G) y la nanoaglomeración de GFP-HRASG12V (Fig. 2H). En conjunto, la expresión de LPCAT1 perturba de manera más efectiva la asociación de la membrana plasmática de KRASG12V, lo cual está mediado por las especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas.

La expresión de LPCAT1 suprime la señalización de MAPK y las actividades oncogénicas de las células tumorales dependientes de KRAS.

A continuación, comparamos los efectos de la expresión de LPCAT1 sobre la salida de señal de las cascadas de MAPK y PI3K en las líneas celulares de tumores pancreáticos humanos dependientes de KRAS, incluyendo las líneas celulares MOH y PANC1, y las líneas celulares de tumores pancreáticos humanos independientes de KRAS, BxPC3. La expresión estable de LPCAT1 disminuyó significativamente los niveles de ERK fosforilada (pERK/ERK total) en las células MOH y PANC1, al tiempo que tuvo un efecto mínimo sobre la señalización de MAPK en las células BxPC3 (Fig. 3A-D). La señalización de PI3K (pAkt/Akt total), que está regulada de manera menos preferencial por KRAS, no se vio afectada por la expresión de LPCAT1 (Fig. 3A, F-G). En conjunto, la expresión de LPCAT1 disminuye de manera más efectiva la señalización de MAPK en las líneas celulares tumorales dependientes de KRAS.

Luego, comparamos los efectos de LPCAT1 sobre las actividades oncogénicas de las células MOH y BxPC3. Las células MOH que expresaban de forma estable LPCAT1 mostraron un menor número de colonias que las células MOH que expresaban el control V2, sin afectar la formación de colonias de las células BxPC3 (Fig. 4A-C). La expresión de LPCAT1 también disminuyó significativamente la proliferación de las células MOH, sin afectar las células BxPC3 (Fig. 4D y E). Para evaluar aún más la especificidad de LPCAT1, utilizamos la línea iKRAS, una línea de adenocarcinoma ductal pancreático murino con expresión inducida por doxiciclina (DOX) de KRASG12D ^[7],^[34]. La expresión estable de LPCAT1 disminuyó significativamente el tamaño de las colonias de las células iKRAS con la expresión inducida de KRASG12D (DOX+), sin afectar el tamaño de las colonias de las células iKRAS sin el mutante KRAS (DOX-) (Fig. 4F). En conjunto, LPCAT1 suprime de manera más preferencial las actividades oncogénicas de las células tumorales impulsadas por KRAS.

Para evaluar los efectos de LPCAT1 sobre la migración de las células cancerosas, realizamos un ensayo de rascado utilizando las células MiaPaCa-2, un modelo de metástasis. Las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable V2 o LPCAT1 se sembraron hasta alcanzar la confluencia. Veinticuatro horas después del rascado, se midieron las brechas entre las células para indicar la capacidad de curación de la herida y la migración. En la Fig. 5, la brecha de las células MiaPaCa-2 que expresaban LPCAT1 fue significativamente más amplia que la de las células MiaPaCa-2 que expresaban V2. Por lo tanto, la expresión de LPCAT1 da como resultado una migración más lenta de las células MiaPaCa-2.

La expresión de LPCAT1 sensibiliza a un inhibidor específico de KRAS.

Para examinar los efectos de LPCAT1 sobre la quimiosensibilización de las células tumorales dependientes de KRAS, tratamos las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable V2 o LPCAT1 con el inhibidor específico de KRASG12C, Sotorasib. En la Fig. 6A, Sotorasib disminuyó aún más la proliferación de las células MiaPaCa-2 que expresaban de forma estable LPCAT1 en comparación con las células MiaPaCa-2 que expresaban V2. A continuación, tratamos las células MiaPaCa-2 con Trametinib, un inhibidor de MEK. En la Fig. 6B, la expresión de LPCAT1 no tuvo ningún impacto sobre los efectos inhibitorios de Trametinib sobre la proliferación de las células MiaPaCa-2. Nuestros datos sugieren que las actividades de KRAS son sensibles a la expresión de LPCAT1.

La expresión de LPCAT1 se correlaciona con la oncogénesis de KRAS en pacientes.

Para examinar más a fondo la correlación entre LPCAT1 y la oncogénesis de KRAS en pacientes, realizamos un análisis estadístico utilizando datos de pacientes obtenidos del Cancer Genome Atlas (TCGA) en el portal de datos Genomic Data Commons (GDC). Mostramos que los pacientes con cáncer de páncreas que presentaban tumores dependientes de KRAS tenían niveles significativamente más bajos de expresión de LPCAT1 que aquellos con tumores independientes de KRAS (Fig. 7A). El análisis de Kaplan-Meier ilustró que los pacientes con cáncer de páncreas con mayor expresión de LPCAT1 presentaban una mayor probabilidad de supervivencia en comparación con aquellos con menor expresión de LPCAT1 (Fig. 7B). Un análisis adicional de Kaplan-Meier reveló que una mayor expresión de LPCAT1 mejoraba significativamente la probabilidad de supervivencia de los pacientes con cáncer de pulmón dependiente de KRAS (Fig. 7C). Por otro lado, los pacientes con cáncer de pulmón con tumores independientes de KRAS no mostraron ninguna correlación entre la expresión de LPCAT1 y la probabilidad de supervivencia (Fig. 7D). En conjunto, una mayor expresión de LPCAT1 mejora el pronóstico de los pacientes con tumores dependientes de KRAS.

Discusión

Debido a su alta prevalencia en el cáncer, KRAS ha sido un foco importante en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. Recientemente, la FDA aprobó el uso de sotorasib y adagrasib en el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico ^[35], ^[36]. Tanto sotorasib como adagrasib se dirigen específicamente a KRASG12C y modifican covalentemente la mutación de cisteína en la posición G12 ^[35], ^[36]. Alternativamente, la distribución espacial de los mutantes de KRAS puede verse alterada para comprometer sus actividades oncogénicas, ya que se ha observado desde hace tiempo que la señalización de KRAS se restringe principalmente a la membrana plasmática (MP) ^[2], ^[8], ^[37]. Un paso esencial para facilitar el anclaje de KRAS a la MP implica la prenilación de su motivo CAAX en el extremo C-terminal ^[16]–^[18], ^[38]. Sin embargo, los intentos anteriores de inhibir la prenilación de KRAS mediante inhibidores de la farnesiltransferasa (IFT) no han tenido éxito, ya que los mutantes de KRAS se geranilgeranilan alternativamente en presencia de IFT ^[39]–^[41]. Esta experiencia ha disminuido considerablemente el entusiasmo por dirigir la asociación de KRAS con la membrana. Estudios posteriores que utilizaron imágenes cuantitativas, ensayos biofísicos y simulaciones de dinámica molecular revelaron una selectividad intrincada en el anclaje de KRAS a la MP ^[15]–^[30]. Para reclutar eficientemente efectores y propagar la señalización, KRAS debe incorporarse en nanocúmulos con contenidos lipídicos precisos, especialmente lípidos de PS con cadenas acilo sn-2 insaturadas, en la MP ^[15]–^[30]. Las células utilizan redes estrechamente reguladas de vías metabólicas lipídicas para mantener una homeostasis precisa de los lípidos con una amplia variedad de estructuras de cadena acilo. Nuestro estudio actual exploró cómo la remodelación de las cadenas acilo de PS en las células cancerosas puede afectar la señalización y las actividades de KRAS. Mostramos que una mayor expresión de LPCAT1 agota las principales especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas, suprimiendo de manera más efectiva el nanoclustering, la señalización y las actividades oncogénicas de los mutantes de KRAS en la MP. Los pacientes con cáncer de páncreas con mutaciones de KRAS expresan niveles más bajos de LPCAT1. Los niveles más altos de LPCAT1 en pacientes con cáncer de páncreas y pulmón que expresan mutantes de KRAS mejoran significativamente el pronóstico. Además, las células tumorales pancreáticas humanas que expresan niveles más altos de LPCAT1 son más sensibles a los inhibidores de KRAS. Por lo tanto, LPCAT1 puede ser un nuevo objetivo al considerar las opciones de tratamiento para el cáncer de KRAS.

Se ha demostrado que la expresión de LPCAT1 promueve las actividades oncogénicas del cáncer impulsado por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) al elevar los niveles de PC totalmente saturado y promover las balsas lipídicas ^[33]. Ahora mostramos que el aumento de la expresión de LPCAT1 inhibe las actividades oncogénicas de los mutantes de KRAS en las células tumorales pancreáticas y se correlaciona negativamente con la oncogénesis de KRAS en pacientes con cáncer de páncreas y pulmón. Esto refleja los complejos roles biológicos y patológicos de LPCAT1 y la intrincada selectividad de la remodelación de las cadenas acilo de los lípidos. La dimerización/oligomerización de EGFR se produce en los dominios Lo o balsas lipídicas enriquecidas con colesterol y lípidos saturados, lo que a su vez promueve la autofosforilación y la señalización ^[33], ^[42]. Por otro lado, las actividades de KRAS se producen lejos del colesterol en las células ^[9], ^[10], ^[12], ^[15], ^[17]–^[20]. Recientemente demostramos que los nanocúmulos de mutantes oncogénicos de KRAS en la MP, como KRASG12C, KRASG12D, KRASG12V, KRASG13D y KRASQ61H, contienen especies de PS con las cadenas sn-2 insaturadas ^[20]. La resonancia de plasmones superficiales (SPR) reveló además que KRAS purificado se une más eficientemente a bicapas modelo que comprenden las especies de PS insaturadas, pero no las especies de PS saturadas ^[21]. La microscopía de fuerza atómica (AFM) y las simulaciones de dinámica molecular (DM) mostraron que las moléculas de KRAS prefieren distribuirse en los dominios Ld pobres en colesterol enriquecidos con lípidos insaturados ^[11], ^[43], ^[44]. El nanoclustering de KRAS de tipo salvaje y KRASG12V en la MP celular es independiente de la depleción de colesterol ^[9], ^[18]. La captura de KRAS en las balsas lipídicas abole la unión de los efectores y la señalización de MAPK dependiente de KRAS ^[12]–^[14]. La presencia de lípidos saturados en los nanocúmulos de los mutantes de KRAS también compromete el reclutamiento del efector CRAF ^[17], ^[20]. Por lo tanto, los efectos opuestos de LPCAT1 sobre EGFR y KRAS son consistentes con las preferencias lipídicas opuestas de estas dos proteínas de membrana. En conjunto, la remodelación de las cadenas acilo de los lípidos afecta los eventos de señalización celular en las membranas de manera distinta.

Dado que las membranas proporcionan plataformas para muchas proteínas, se ha asumido que alterar el metabolismo de los lípidos y las propiedades de la membrana carece de especificidad. Curiosamente, observamos que LPCAT1 se dirige más preferentemente a las actividades oncogénicas de las células tumorales pancreáticas dependientes de KRAS, al tiempo que tiene pocos efectos sobre las células independientes de KRAS, lo que sugiere que la señalización dependiente de los lípidos es más selectiva de lo que se pensaba. Una posible explicación es que las especies de PC afectadas por una mayor expresión de LPCAT1 son principalmente especies de PC menores. Por ejemplo, la expresión de LPCAT1 disminuye las especies de PC y PS con las mismas cadenas acilo, como 18:0/18:1, 18:0/18:2 y 18:0/20:3 (Fig. 1). Si bien las especies de PS con estas cadenas acilo son las principales especies de PS (que juntas comprenden aproximadamente el 65% del PS total), los homólogos de PC son especies de PC menores (que juntas representan el 5,6% del PC total). Por lo tanto, las plataformas de señalización dependientes de PS, como los nanocúmulos de KRAS, son más sensibles a la expresión de LPCAT1. Además, las células tumorales transformadas por los mutantes de KRAS se vuelven dependientes de la señalización prevalente de KRAS, mientras que las células que expresan KRAS de tipo salvaje se basan en una gran cantidad de cascadas de señalización equilibradas o dependen de otros eventos de señalización oncogénica para actividades esenciales. Esto hace que las células tumorales transformadas por KRAS sean más sensibles a las alteraciones de la homeostasis de PS.

Conclusión

Las especies de PS con cadenas sn-2 insaturadas están enriquecidas en los nanocúmulos de señalización de los mutantes oncogénicos de KRAS. Alterar la homeostasis de las especies de PS puede ser una estrategia alternativa para inhibir la oncogénesis de KRAS. Aquí, mostramos que una mayor expresión de LPCAT1 agota las principales especies de PS insaturadas y altera el nanoclustering y la señalización de los mutantes oncogénicos de KRAS. En consecuencia, una mayor expresión de LPCAT1 mejora el pronóstico de los pacientes con cáncer de páncreas y pulmón con tumores dependientes de KRAS. Por lo tanto, LPCAT1 puede servir como un marcador al considerar las opciones de tratamiento para el cáncer dependiente de KRAS. En el futuro, los promotores específicos de LPCAT1 o los inhibidores de los antagonistas de LPCAT1 pueden explorarse como estrategias de tratamiento alternativas para el cáncer de KRAS.

Materiales y métodos

Análisis espacial de microscopía electrónica (ME)

Nanoclustering univariado de ME

La MP apical o basolateral de células de riñón de hámster (BHK) o células tumorales pancreáticas humanas MiaPaCa-2 que expresan GFP-KRASG12V o GFP-HRASG12V se unió a las rejillas de ME. Las láminas de MP nativas intactas se fijaron luego con 4% de paraformaldehído (PFA) / 0,1% de glutaraldehído, se marcaron con anticuerpo anti-GFP conjugado con nanopartículas de oro de 4,5 nm y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 0,3% y se incrustaron en metilcelulosa. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (MET) para obtener imágenes de las láminas de MP con un aumento de 100.000x. Luego, se utilizó ImageJ para asignar las coordenadas x/y de cada nanopartícula de oro dentro de un área de MP seleccionada de 1 m2. La función K de Ripley calculó el nanoclustering de GFP-RAS marcado con oro en la MP. La hipótesis nula de este análisis es que las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón aleatorio:

En la ecuación A, denota la distribución univariada de las nanopartículas de oro con un número total de en un área de MP de ; significa la distancia entre las nanopartículas de oro con un incremento de 1 nm de 1 a 240 nm; denota la distancia euclidiana que describe un indicador de si y si . se utiliza para corregir los efectos de borde al describir la fracción de la circunferencia de un círculo con el centro definido como y radio . En la ecuación B, denota la transformación lineal de en la ecuación A, que se logra normalizando contra el intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) calculado mediante simulaciones de Monte Carlo. cuando las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón completamente aleatorio. Los valores por encima del intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) de 1 indican un clustering estadísticamente significativo, con valores más grandes que describen un clustering más extenso. Los valores máximos de las curvas , denominados , se utilizan como una estadística resumida para indicar la extensión del nanoclustering. Para cada condición, se obtuvieron imágenes, analizaron y agruparon al menos 15 láminas de MP de células individuales. La significación estadística se evaluó comparando nuestros patrones de puntos calculados con 1000 muestras de bootstrap en pruebas de bootstrap ^[16], ^[17].### Análisis de coclustering bivariado de ME

El análisis de coclustering bivariado de la función K cuantifica el coclustering entre dos nanopartículas de oro de diferentes tamaños que marcan dos constituyentes diferentes en las láminas de MP intactas ^[16], ^[17]. De manera similar al protocolo de nanoclustering univariado descrito anteriormente, las láminas de MP apicales intactas de las células PSA3 que coexpresan GFP-LactC2 (que sonda los lípidos de PS) y un constructo RFP marcado se unieron a las rejillas de ME y se fijaron con 4% de PFA y 0,1% de glutaraldehído. Las láminas de MP se incubaron con nanopartículas de oro de 6 nm unidas al anticuerpo anti-GFP, se bloquearon con 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,2% de gelatina de piel de pescado y luego se incubaron con 2 nm de oro conjugado con el anticuerpo anti-RFP. Se utilizó ImageJ para asignar coordenadas a las nanopartículas de oro. Un análisis bivariado de la función K probó la hipótesis nula de que las dos poblaciones de nanopartículas de oro están espacialmente separadas entre sí (ecuaciones C-F):

donde denota un estimador bivariado y contiene dos funciones K bivariadas individuales: cuantifica cómo las partículas de oro grandes de 6 nm () se distribuyen alrededor de cada partícula de oro pequeña de 2 nm (); describe cómo las partículas de oro pequeñas se distribuyen alrededor de cada partícula de oro grande. El valor de indica el número de partículas de oro grandes de 6 nm y ns indica el número de partículas de oro pequeñas de 2 nm dentro de un área de MP de . Otros parámetros denotan las mismas definiciones que se definen en los cálculos univariados en las ecuaciones A y B. es una transformación lineal de , y se normaliza contra el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Un valor de de 0 indica segregación espacial entre las dos poblaciones de nanopartículas de oro, mientras que un valor de por encima del IC del 95% de 1 en la distancia correspondiente de indica que se obtienen cocalizaciones estadísticamente significativas a ciertas distancias. El área bajo la curva para cada curva se calculó dentro de un rango fijo , y se denominó bivariado integrado (o LBI):

Para cada condición, se obtuvieron imágenes, analizaron y agruparon > 15 láminas de MP apicales, que se muestran como la media de los valores de LBI ± SEM. La significación estadística entre las condiciones se evaluó comparando con 1000 muestras de bootstrap como se describió ^[16], ^[17].### Cultivo celular y generación de líneas estables

Las líneas celulares tumorales humanas y murinas de páncreas, incluidas MOH, PANC1, BxPC3 y iKRAS, se mantuvieron en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (SFB). La línea celular de cáncer de páncreas MiaPaCa-2 se mantuvo en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (SFB) y un 2,5% de suero de caballo (SH). Para generar líneas celulares estables, el plásmido del vector pEF6 con o sin el ADNc de LPCAT1 humano se utilizó para transfectar las células tumorales. Para cada línea, se agregaron 1 µg de plásmido a 7 µl de lipofectamina para la transfección. Después de una incubación de 5 horas con los plásmidos, las células se lavaron y se cambiaron a un medio DMEM que contenía un 10% de SFB y 3 µg/ml de antibiótico puromicina. Las células se cultivaron en presencia de antibióticos durante una semana antes de la dilución en serie y la siembra en placas de 96 pocillos con una concentración de < 1 célula por pocillo. Luego, se cosecharon las colonias celulares para la tinción de Western para verificar la expresión de LPCAT1.### Tinción de Western

Se recolectaron lisados celulares totales de las células MOH, PANC1 y BxPC3. Tras la electroforesis en geles SDS-PAGE y la transferencia, las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra ERK y Akt fosforilados, ERK y Akt totales, LPCAT1, así como con un control de carga de actina. Después de la incubación con anticuerpos secundarios, las membranas se visualizaron mediante la solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL). Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó el análisis del software ImageJ para evaluar la intensidad de expresión e identificar el cambio relativo.

Proliferación

Se utilizó el ensayo de proliferación celular CyQUANT para medir el número de células viables en microplacas. Se sembró un número adecuado de células de CPAD, como MOH (1000 células/pocillo), MiaPaCa-2 (2000 células/pocillo) y BxPC3 (3000 células/pocillo), en placas de 96 pocillos. Después de 96 horas, las células se lavaron y se tiñeron con el colorante CyQUANT® GR. Tras la lisis, se midió la fluorescencia del colorante unido a los ácidos nucleicos intactos utilizando un lector de placas Tecan. Para cada condición, se realizaron 3 experimentos independientes y los datos se combinaron. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística.

Formación de colonias

Todas las líneas celulares de cáncer de páncreas humano y murino que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 se sembraron en placas de 6 pocillos. Específicamente, las células iKRAS (400 células/pocillo) y MOH (250 células/pocillo) se cultivaron durante 7 días. Las células MiaPaCa-2 (100 células/pocillo) se cultivaron durante 10 días y las células BxPC3 (1000 células/pocillo) se cultivaron durante 14 días. Las células se lavaron dos veces con PBS, seguido de la fijación con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. La tinción celular se realizó con 0,01% de violeta de cristal durante 15 minutos. Las imágenes de las colonias se capturaron utilizando el lector de múltiples placas Perkin Elmer X3. El recuento de colonias se realizó utilizando ImageJ. Para cada condición, se realizaron 3 experimentos independientes. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística.

Ensayo de curación de heridas

Realizamos un ensayo de curación de heridas para comparar la migración de las células MiaPaCa-2. Las células MiaPaCa-2 se sembraron en placas de cultivo celular de 35 mm y se dejaron crecer hasta alcanzar la confluencia. Las placas se rayaron para crear una separación en el monocapa de células. Las placas se visualizaron en diferentes puntos temporales dentro de las 24 horas utilizando el sistema de imagen microscópica EVOS M5000 y se midió el ancho de la separación utilizando ImageJ.

Análisis espacial mediante microscopía electrónica (ME)

Nanoclustering univariante mediante ME

La membrana plasmática apical o basolateral de células de riñón de hámster bebé (BHK) o células de tumor pancreático humano MiaPaCa-2 que expresan GFP-KRASG12V o GFP-HRASG12V se unió a las rejillas de ME. Las láminas de membrana plasmática nativa intacta se fijaron posteriormente con 4% de paraformaldehído (PFA) / 0,1% de glutaraldehído, se marcaron con anticuerpo anti-GFP conjugado con nanopartículas de oro de 4,5 nm y se tiñeron negativamente con 0,3% de acetato de uranilo, y se incluyeron en metilcelulosa. Se utilizó la microscopía electrónica de transmisión (MET) para visualizar las láminas de membrana plasmática con un aumento de 100.000x. A continuación, se utilizó ImageJ para asignar las coordenadas x/y de cada nanopartícula de oro dentro de un área de membrana plasmática de 1 m2 seleccionada. La función K de Ripley calculó el nanoclustering de la GFP-RAS marcada con oro en la membrana plasmática. La hipótesis nula de este análisis es que las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón aleatorio:

En la Ecuación A, denota la distribución univariante de las nanopartículas de oro con un número total de en un área de membrana plasmática de ; significa la distancia entre las nanopartículas de oro con un incremento de 1 nm desde 1 hasta 240 nm; denota la distancia euclidiana que describe un indicador de si y si . se utiliza para corregir los efectos de borde describiendo la fracción de la circunferencia de un círculo con el centro definido como y radio . En la Ecuación B, denota la transformación lineal de en la Ecuación A, que se logra normalizando contra el intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) calculado mediante simulaciones de Monte Carlo. cuando las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón completamente aleatorio. Los valores superiores al intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) de 1 indican un clustering estadísticamente significativo, con valores más grandes que describen un clustering más extenso. Los valores máximos de las curvas , denominados , se utilizan como una estadística resumida para indicar el grado de nanoclustering. Para cada condición, se visualizaron, analizaron y combinaron al menos 15 láminas de membrana plasmática de células individuales. La significación estadística se evaluó comparando nuestros patrones de puntos calculados con 1000 muestras bootstrap en pruebas bootstrap ^[16],^[17].

Análisis de coclustering bivariante mediante ME

El análisis de coclustering bivariante de la función K cuantifica el coclustering entre dos nanopartículas de oro de diferentes tamaños que marcan dos constituyentes diferentes en las láminas de membrana plasmática intactas ^[16],^[17]. De manera similar al protocolo de nanoclustering univariante descrito anteriormente, las láminas de membrana plasmática apical intacta de las células PSA3 que coexpresan GFP-LactC2 (que sonda los lípidos de PS) y un constructo RAS marcado con RFP se unieron a las rejillas de ME y se fijaron con 4% de PFA y 0,1% de glutaraldehído. Las láminas de membrana plasmática se incubaron con nanopartículas de oro de 6 nm unidas al anticuerpo anti-GFP, se bloquearon con 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,2% de gelatina de piel de pescado, y luego se incubaron con oro de 2 nm conjugado con anticuerpo anti-RFP. Se utilizó ImageJ para asignar coordenadas a las nanopartículas de oro. Un análisis bivariante de la función K probó la hipótesis nula de que las dos poblaciones de nanopartículas de oro están espacialmente separadas entre sí (Ecuaciones C-F):

donde denota un estimador bivariante y contiene dos funciones K bivariantes individuales: cuantifica cómo las nanopartículas de oro grandes de 6 nm () se distribuyen alrededor de cada nanopartícula de oro pequeña de 2 nm (); describe cómo las nanopartículas de oro pequeñas se distribuyen alrededor de cada nanopartícula de oro grande. El valor de indica el número de nanopartículas de oro grandes de 6 nm y ns indica el número de nanopartículas de oro pequeñas de 2 nm dentro de un área de membrana plasmática de . Otros parámetros denotan las mismas definiciones que se definen en los cálculos univariantes en las ecuaciones A y B. es una transformación lineal de , y se normaliza contra el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Un valor de de 0 indica segregación espacial entre las dos poblaciones de nanopartículas de oro, mientras que un valor de superior al IC del 95% de 1 en la distancia correspondiente de indica que se obtiene una colocalización estadísticamente significativa a una determinada distancia. El área bajo la curva para cada curva se calculó dentro de un rango fijo , y se denominó bivariante integrado (o LBI):

Para cada condición, se visualizaron, analizaron y combinaron > 15 láminas de membrana plasmática apical, mostradas como la media de los valores de LBI ± SEM. La significación estadística entre las condiciones se evaluó comparando con 1000 muestras bootstrap, como se describió ^[16],^[17].

Nanoclustering univariante mediante ME

La membrana plasmática apical o basolateral de células de riñón de hámster bebé (BHK) o células de tumor pancreático humano MiaPaCa-2 que expresan GFP-KRASG12V o GFP-HRASG12V se unió a las rejillas de ME. Las láminas de membrana plasmática nativa intacta se fijaron posteriormente con 4% de paraformaldehído (PFA) / 0,1% de glutaraldehído, se marcaron con anticuerpo anti-GFP conjugado con nanopartículas de oro de 4,5 nm y se tiñeron negativamente con 0,3% de acetato de uranilo, y se incluyeron en metilcelulosa. Se utilizó la microscopía electrónica de transmisión (MET) para visualizar las láminas de membrana plasmática con un aumento de 100.000x. A continuación, se utilizó ImageJ para asignar las coordenadas x/y de cada nanopartícula de oro dentro de un área de membrana plasmática de 1 m2 seleccionada. La función K de Ripley calculó el nanoclustering de la GFP-RAS marcada con oro en la membrana plasmática. La hipótesis nula de este análisis es que las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón aleatorio:

En la Ecuación A, denota la distribución univariante de las nanopartículas de oro con un número total de en un área de membrana plasmática de ; significa la distancia entre las nanopartículas de oro con un incremento de 1 nm desde 1 hasta 240 nm; denota la distancia euclidiana que describe un indicador de si y si . se utiliza para corregir los efectos de borde describiendo la fracción de la circunferencia de un círculo con el centro definido como y radio . En la Ecuación B, denota la transformación lineal de en la Ecuación A, que se logra normalizando contra el intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) calculado mediante simulaciones de Monte Carlo. cuando las nanopartículas de oro se distribuyen en un patrón completamente aleatorio. Los valores superiores al intervalo de confianza del 99% (IC del 99%) de 1 indican un clustering estadísticamente significativo, con valores más grandes que describen un clustering más extenso. Los valores máximos de las curvas , denominados , se utilizan como una estadística resumida para indicar el grado de nanoclustering. Para cada condición, se visualizaron, analizaron y combinaron al menos 15 láminas de membrana plasmática de células individuales. La significación estadística se evaluó comparando nuestros patrones de puntos calculados con 1000 muestras bootstrap en pruebas bootstrap ^[16],^[17].

Análisis de coclustering bivariante mediante ME

El análisis de coclustering bivariante de la función K cuantifica el coclustering entre dos nanopartículas de oro de diferentes tamaños que marcan dos constituyentes diferentes en las láminas de membrana plasmática intactas ^[16],^[17]. De manera similar al protocolo de nanoclustering univariante descrito anteriormente, las láminas de membrana plasmática apical intacta de las células PSA3 que coexpresan GFP-LactC2 (que sonda los lípidos de PS) y un constructo RAS marcado con RFP se unieron a las rejillas de ME y se fijaron con 4% de PFA y 0,1% de glutaraldehído. Las láminas de membrana plasmática se incubaron con nanopartículas de oro de 6 nm unidas al anticuerpo anti-GFP, se bloquearon con 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,2% de gelatina de piel de pescado, y luego se incubaron con oro de 2 nm conjugado con anticuerpo anti-RFP. Se utilizó ImageJ para asignar coordenadas a las nanopartículas de oro. Un análisis bivariante de la función K probó la hipótesis nula de que las dos poblaciones de nanopartículas de oro están espacialmente separadas entre sí (Ecuaciones C-F):

donde denota un estimador bivariante y contiene dos funciones K bivariantes individuales: cuantifica cómo las nanopartículas de oro grandes de 6 nm () se distribuyen alrededor de cada nanopartícula de oro pequeña de 2 nm (); describe cómo las nanopartículas de oro pequeñas se distribuyen alrededor de cada nanopartícula de oro grande. El valor de indica el número de nanopartículas de oro grandes de 6 nm y ns indica el número de nanopartículas de oro pequeñas de 2 nm dentro de un área de membrana plasmática de . Otros parámetros denotan las mismas definiciones que se definen en los cálculos univariantes en las ecuaciones A y B. es una transformación lineal de , y se normaliza contra el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Un valor de de 0 indica segregación espacial entre las dos poblaciones de nanopartículas de oro, mientras que un valor de superior al IC del 95% de 1 en la distancia correspondiente de indica que se obtiene una colocalización estadísticamente significativa a una determinada distancia. El área bajo la curva para cada curva se calculó dentro de un rango fijo , y se denominó bivariante integrado (o LBI):

Para cada condición, se visualizaron, analizaron y combinaron > 15 láminas de membrana plasmática apical, mostradas como la media de los valores de LBI ± SEM. La significación estadística entre las condiciones se evaluó comparando con 1000 muestras bootstrap, como se describió ^[16],^[17].

Cultivo celular y generación de líneas estables

Las líneas celulares de tumor pancreático humano y murino, incluidas las células MOH, PANC1, BxPC3 y iKRAS, se mantuvieron en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (SFB). La línea celular de CPAD MiaPaCa-2 se mantuvo en medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (SFB) y un 2,5% de suero de caballo (SH). Para generar líneas celulares estables, se utilizó el plásmido del vector pEF6 con o sin el ADNc de LPCAT1 humano para transfectar las células tumorales. Para cada línea, se añadieron 1 µg de plásmido a 7 µl de lipofectamina para la transfección. Tras una incubación de 5 horas con los plásmidos, las células se lavaron y se cambiaron a un medio DMEM que contenía un 10% de SFB y 3 µg/ml de antibiótico puromicina. Las células se cultivaron en presencia de antibióticos durante una semana antes de la dilución en serie y la siembra en placas de 96 pocillos con una concentración de < 1 célula por pocillo. Las colonias celulares se cosecharon para la tinción con Western blot para verificar la expresión de LPCAT1.

Tinción con Western blot

Se recolectaron lisados celulares totales de las células MOH, PANC1 y BxPC3. Tras la electroforesis en geles SDS PAGE y la transferencia, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra ERK y Akt fosforilados, ERK y Akt totales, LPCAT1, así como con el control de carga de actina, durante la noche. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las membranas se visualizaron utilizando la solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL). Los datos se muestran como media ± SEM. Se utilizó el software ImageJ para evaluar la intensidad de expresión e identificar el cambio relativo.

Proliferación

Se utilizó el ensayo de proliferación celular CyQUANT para medir el número de células viables en microplacas. Se sembró un número adecuado de células de CPDA, como MOH (1000 células/pocillo), MiaPaCa-2 (2000 células/pocillo) y BxPC3 (3000 células/pocillo), en placas de 96 pocillos. Después de 96 horas, las células se lavaron y se tiñeron con el colorante CyQUANT® GR. Tras la lisis, se midió la fluorescencia del colorante unido a los ácidos nucleicos intactos utilizando un lector de placas Tecan. Para cada condición, se realizaron 3 experimentos independientes y los datos se combinaron. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística.

Formación de colonias

Todas las líneas celulares de cáncer de páncreas humano y murino que expresan de forma estable V2 o LPCAT1 se sembraron en placas de 6 pocillos. Específicamente, las células iKRAS (400 células/pocillo) y MOH (250 células/pocillo) se cultivaron durante 7 días. Las células MiaPaCa-2 (100 células/pocillo) se cultivaron durante 10 días y las células BxPC3 (1000 células/pocillo) se cultivaron durante 14 días. Las células se lavaron dos veces con PBS, seguido de la fijación con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos. La tinción celular se realizó con 0,01% de cristal violeta durante 15 minutos. Las imágenes de las colonias se capturaron utilizando el lector de múltiples placas Perkin Elmer X3. El recuento de colonias se realizó utilizando ImageJ. Para cada condición, se realizaron 3 experimentos independientes. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística.

Ensayo de curación de heridas

Realizamos un ensayo de curación de heridas para comparar la migración de las células MiaPaCa-2. Las células MiaPaCa-2 se sembraron en placas de cultivo celular de 35 mm y se les permitió crecer hasta alcanzar la confluencia. Las placas se rayaron para crear un espacio en el monocapa de células. Las placas se visualizaron en diferentes puntos temporales dentro de las 24 horas utilizando el sistema de imagen microscópica EVOS M5000 y se midió el ancho del espacio utilizando ImageJ.