La hipertranscripción y la diseminación metastásica en el cáncer colorrectal impulsadas por KRAS podrían superarse mediante el objetivo del eje de señalización NMHC IIA/PLK1 con un nuevo derivado acrídino.

Las mutaciones de KRAS están presentes en aproximadamente el 45% de los pacientes con cáncer colorrectal (CCR). Los estudios han demostrado que los pacientes con CCR metastásico (mCCR) con mutaciones en KRAS presentan una peor supervivencia global y libre de progresión en comparación con aquellos con KRAS de tipo salvaje ^[1]. En los últimos años, se han logrado avances en el desarrollo de fármacos que se dirigen a KRAS, en particular con el descubrimiento de agentes dirigidos contra la mutación G12C ^[2]. Sin embargo, la prevalencia de la mutación KRAS G12C en el CCR es muy baja ^[3]. En consecuencia, descubrir tratamientos eficaces para el mCCR con mutaciones en KRAS sigue siendo una necesidad médica insatisfecha.

En este estudio, el análisis de la expresión transcripcional reveló que las mutaciones de KRAS impulsan un aumento de la actividad de la transcripción global. Establecimos estrategias de cribado de fármacos para identificar inhibidores para el mCCR con mutaciones en KRAS. Específicamente, generamos una serie de organoides derivados de pacientes (PDO) y xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) a partir de cánceres colorrectales metastásicos con mutaciones en KRAS, con énfasis en los casos refractarios, para identificar los compuestos terapéuticos más eficaces. Un cribado de alto rendimiento de una biblioteca de fármacos oncológicos aprobados por la FDA identificó el derivado de la acridina, hidrocloruro de amsacrina (m-AMSA), como un inhibidor selectivo de los PDO y líneas celulares con mutaciones en KRAS. Aunque m-AMSA muestra actividad clínica en neoplasias hematológicas como la leucemia aguda y el linfoma ^[4], ^[5], su eficacia limitada contra los tumores sólidos probablemente se deba a barreras farmacocinéticas o a la resistencia microambiental ^[6], ^[7]. Para abordar estas limitaciones, diseñamos una biblioteca guiada por la estructura de derivados de pirrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-ona, empleando estrategias de salto de andamio para mejorar la penetración en los tumores sólidos y la tolerabilidad. De esta serie, LS-1-2 surgió como un candidato a fármaco preclínico, demostrando una potente eficacia antiproliferativa y antimetastásica tanto in vitro como in vivo en modelos de cáncer colorrectal con mutaciones en KRAS. Al integrar ensayos bioquímicos con análisis multiómicos, incluyendo la fosfoproteómica y el RNA-seq, investigamos sistemáticamente el mecanismo de acción de LS-1-2 e identificamos su diana, la vía de señalización NMHC IIA/FOXO/PLK1.

Materiales y Métodos

Pacientes y Muestras

Las muestras de tejido de CCR utilizadas en este estudio se obtuvieron del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín. Los Comités de Revisión Ética del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín aprobaron la recolección y el uso de estas muestras de acuerdo con la Declaración de Helsinki (IRBK-2021-026-01, 2021.7). Las características clínicas de estos pacientes se resumen en las Tablas S1-3 y la Figura S1.

Cultivo de organoides derivados de pacientes y ensayo de fármacos

Los organoides derivados de pacientes se cultivaron según los métodos descritos en un estudio previo ^[8]. Los protocolos de cultivo detallados se proporcionan en los materiales suplementarios. Para los ensayos de fármacos, se recolectaron, pasaron y sembraron organoides en buenas condiciones en placas de cultivo de 96 pocillos. El medio de cultivo estándar de organoides se reemplazó por un medio que contenía el fármaco. La viabilidad de las células de los organoides se evaluó utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 3D (Promega, G9683).

Establecimiento y cultivo de líneas celulares derivadas de pacientes (PDC)

Los tumores establecidos a partir de PDX se extirparon y se procesaron para el cultivo in vitro. Los métodos de cultivo detallados se proporcionan en los materiales suplementarios.

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (CL11, CL40, LS513, HCT116, HCT8, SW480, SW620, LOVO y LS174T; todas con mutación en KRAS) se obtuvieron del American Type Culture Collection (EE. UU.) y se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con un 10% de suero fetal bovino a 37 °C bajo un 5% de CO2. La línea celular DiFi (KRAS de tipo salvaje) se adquirió de Nanjing Cobioer Biosciences. Las células HCT8-5Fu resistentes a la quimioterapia se generaron mediante la exposición gradual a 5-fluorouracilo. Las células HCT116/self se establecieron a partir de esférulas enriquecidas en células madre, como se describió previamente ^[9]. Todas las líneas celulares se autenticaron y verificaron utilizando el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR). El estado de mutación de KRAS de las células de CCR utilizadas en este manuscrito se muestra en la Tabla S4.

Construcción de la biblioteca de fármacos y estrategia de cribado

Para identificar posibles agentes terapéuticos para el cáncer colorrectal con mutaciones en KRAS y microsatélites estables (MSS), construimos una biblioteca de fármacos seleccionada integrando compuestos de dos repositorios establecidos: la Biblioteca de compuestos contra el cáncer (L3000, Selleck) y la Biblioteca de fármacos aprobados por la FDA (L1300, Selleck). Este enfoque integrado produjo una colección enfocada de 786 compuestos clínicamente relevantes para la evaluación. Todos los fármacos incluidos cumplen dos criterios críticos: actividad biológica documentada y perfiles de seguridad establecidos de ensayos clínicos previos, y una amplia cobertura de las vías de señalización y los objetivos moleculares implicados en la oncogénesis y la resistencia terapéutica. Estos compuestos se dirigen a diversos mecanismos relacionados con el tumor, incluidas las principales vías de señalización, como la vía de la quinasa activada por mitógenos (MAPK), Wnt, PI3K/proteína quinasa B (Akt)/objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR), quinasa Janus/transductor de señal y activador de la transcripción (JAK/STAT) y factor nuclear kappa-B (NF-κB). También se dirigen a procesos celulares fundamentales, como la apoptosis, la angiogénesis, la autofagia, la regulación del ciclo celular, la respuesta al daño del ADN y la señalización del citoesqueleto, además de objetivos específicos como las tirosina quinasas, los receptores acoplados a proteínas G y el proteasoma.

Además, sintetizamos 131 moléculas pequeñas que presentan un andamio de pirrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-ona como una biblioteca de compuestos interna para un cribado adicional.

Secuenciación de ARN y análisis de microarrays de ARN en organoides y líneas celulares

La secuenciación de ARN de las muestras de PDO se realizó en una plataforma Illumina por Annoroad Gene Technology. El análisis de microarrays de ARN para las líneas celulares se realizó por Shanghai Biotechnology Corporation. Los protocolos experimentales detallados se proporcionan en los materiales suplementarios.

Tinción inmunofluorescente y citometría de flujo

Las células se aislaron del cultivo utilizando EDTA/PBS al 0,02% o mediante homogeneización mecánica de tumores primarios o xenoinjertados. Las células aisladas se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-CD133 de ratón (1:11 dilución, Miltenyi Biotec, 130-098-046). El análisis de las muestras etiquetadas se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSAria II (BD Biosciences, San José, CA).

Estudios in vivo en ratones

Se obtuvieron ratones macho BALB/c-nu y NOD-SCID (de 4 a 6 semanas de edad) de Beijing HFK Bio-technology Co., Ltd., y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos de acuerdo con los protocolos de cuidado de animales institucionales (IACUC, Universidad de Pekín).

La actividad de LS-1-2 se evaluó in vivo utilizando modelos de xenoinjerto derivados de líneas celulares de cáncer colorrectal con mutaciones en KRAS (CDX) y modelos PDX. Los modelos CDX se establecieron mediante la inyección subcutánea de 5 × 10^6 células tumorales en ratones NOD/SCID. Los modelos PDX se generaron como se describió previamente ^[10] e incluyeron PDX1 (cáncer de colon), PDX2 y PDX3 (lesiones primarias y metastásicas hepáticas de un paciente con cáncer de colon) y PDX4 (cáncer rectal después de quimiorradioterapia neoadyuvante: 50,6 Gy/22 fracciones con capecitabina concurrente [825 mg/m² dos veces al día durante 5 semanas]). Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron los 100-200 mm³, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento o control (3-5 ratones por grupo).

Para los modelos de metástasis hepática, se inyectaron células LS174T-luciferasa (1 × 10^6) en la subcápsula esplénica de ratones desnudos. Los regímenes de tratamiento incluyeron LS-1-2 (10, 20 o 40 mg/kg, por vía intraperitoneal, días 1-5 semanales), 5-fluorouracilo (5-FU, 30 mg/kg/semana), irinotecán (CPT-11, 20 mg/kg/semana) o TAS-102 (150 mg/kg dos veces al día, por vía oral). Los animales de control recibieron vehículo (PBS). TAS-102 (trifluridina-tipiracil) es un fármaco de combinación administrado por vía oral y bien tolerado que se compone de trifluridina, un análogo de la timidina, y tipiracil, un inhibidor de la timidina fosforilasa. El volumen tumoral se calculó como 0,52 × longitud × anchura × altura y se midió dos veces por semana. La carga metastásica se cuantificó utilizando la imagen de bioluminiscencia IVIS Spectrum-CT (PerkinElmer) y se analizó con el software Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences).

Los estudios in vivo se interrumpieron cuando los animales murieron o cuando la carga tumoral alcanzó una dimensión máxima de 1,5 cm, según lo recomendado en las directrices anteriores.

Análisis cuantitativo de fosfoproteómica

El análisis cuantitativo de fosfoproteómica se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar de Jingjie PTM BioLab (Hangzhou, China). Los métodos experimentales detallados se proporcionan en los materiales suplementarios. Para identificar fosfo-péptidos de alta confianza regulados por LS-1-2, aplicamos criterios de filtrado de un cambio de pliegue mayor que 1,3 o menor que 0,77 con un valor de P < 0,05 (prueba t de Student). Se construyó una red global de interacción de proteínas para las fosfoproteínas alteradas de forma significativa utilizando la base de datos STRING y se anotó con las vías KEGG. Para dilucidar la vía de señalización afectada por LS-1-2 a través de su interacción con MYH9, analizamos las interacciones entre las fosfoproteínas alteradas, los ARNm expresados de forma diferencial y la proteína MYH9 utilizando la base de datos STRING, y la determinación del enriquecimiento de vías se realizó mediante la anotación KEGG.

Las relaciones sustrato-quinasa se predijeron utilizando el software iGPS1.0, que opera sobre el principio de que los motivos lineales cortos que rodean los sitios de fosforilación determinan la especificidad primaria. El software empleó el algoritmo GPS2.0 ^[11] para predecir las relaciones sustrato-quinasa específicas del sitio, y los datos de interacción proteína-proteína se utilizaron como un filtro contextual importante para reducir las predicciones falsas positivas. Se seleccionó un umbral "medio" con el parámetro "Interacción" establecido en "Exp./String". Las actividades de la quinasa se predijeron utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), con los niveles de fosforilación log-transformados que sirvieron como métrica de clasificación y las regulaciones de los sitios de fosforilación de la quinasa se formatearon en un archivo .gmt. Los puntajes de enriquecimiento normalizados de los resultados de GSEA se interpretaron como puntajes de actividad de la quinasa. Se predijo que una quinasa se activaría si sus sustratos mostraran predominantemente un aumento de la fosforilación, y se inhibiría si se observara el patrón opuesto. El análisis de los datos del Consorcio de Proteómica Tumoral Clínica (CPTAC) se realizó a través de la plataforma UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html) para examinar la expresión y los niveles de fosforilación de la proteína MYH9 en el cáncer colorrectal y su asociación con las etapas clínicas.

Ensayo de extracción con biotina e identificación de proteínas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)

Los lisados de células HCT116 se incubaron con biotina, LS-1-2 biotinilado (LS-1-2-Biotina) o LS-1-2-Biotina en presencia de un exceso de LS-1-2 no etiquetado a 4 °C durante 4 h. Los complejos de proteínas se aislaron utilizando el kit de interacción proteína-proteína biotinilada Pierce™ Pull-Down (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. Las muestras se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se visualizaron mediante tinción con plata. Las bandas de proteínas específicas se excindieron, se sometieron a digestión de tripsina en gel y se identificaron mediante análisis de LC-MS/MS.

Acoplamiento molecular y dinámica molecular

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina no muscular IIA (NMHC IIA; número de acceso: ALX00019.1) se recuperó de la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica. La estructura tridimensional de NMHC IIA se generó utilizando Rosetta 8. Se proporcionan descripciones metodológicas detalladas en los materiales suplementarios.

Ensayo de actividad de la ATPasa

La actividad de la ATPasa se midió utilizando un método optimizado de molibdato azul ^[12]. La proteína NMHC IIA recombinante (ab226278, Abcam) se preincubó con Blebbistatina o LS-1-2 durante 10 minutos, mientras que el grupo de control recibió un 0,1% de DMSO. Después de la reacción enzimática, se añadió molibdato de amonio para cuantificar el fosfato inorgánico liberado.

Ensayo de cambio térmico celular (CETSA)

Se proporcionan los procedimientos detallados para el ensayo de cambio térmico celular en los materiales suplementarios.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± EE y se analizaron utilizando SPSS 19.0. Las asociaciones entre la expresión de los marcadores y las características clinicopatológicas se evaluaron mediante el análisis de correlación de Spearman. Las curvas de supervivencia se construyeron mediante la metodología de Kaplan-Meier y se compararon utilizando las pruebas de rango logarítmico. Los datos de los experimentos in vitro e in vivo se analizaron mediante pruebas t de dos colas no pareadas o ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey. Todos los experimentos in vitro se repitieron de forma independiente al menos tres veces, y los tamaños de los grupos para los estudios con animales se indican en las respectivas figuras. Se implementó la aleatorización cuando los tumores alcanzaron volúmenes predeterminados.

Pacientes y Muestras

Las muestras de tejido de CRC utilizadas en este estudio se obtuvieron del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín. Los Comités de Revisión de Ética del Hospital Shougang de la Universidad de Pekín aprobaron la recolección y el uso de estas muestras de acuerdo con la Declaración de Helsinki (IRBK-2021-026-01, 2021.7). Las características clínicas de estos pacientes se resumen en las Tablas S1-3 y la Figura S1.

Cultivo de Organoides Derivados del Paciente y Ensayo de Fármacos

Los organoides derivados del paciente se cultivaron según los métodos descritos en un estudio previo ^[8]. Los protocolos de cultivo detallados se proporcionan en los materiales suplementarios. Para los ensayos de fármacos, se recolectaron, pasaron y sembraron organoides en buenas condiciones en placas de cultivo celular de 96 pocillos. El medio de cultivo estándar de organoides se reemplazó por un medio que contenía el fármaco. Se evaluó la viabilidad de las células de los organoides utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 3D (Promega, G9683).

Establecimiento y Cultivo de Líneas Celulares Derivadas del Paciente (LDP)

Los tumores establecidos a partir de PDX se extirparon y se procesaron para el cultivo in vitro. Los métodos de cultivo detallados se proporcionan en los materiales suplementarios.

Líneas Celulares

Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano (CL11, CL40, LS513, HCT116, HCT8, SW480, SW620, LOVO y LS174T; todas con mutación KRAS) se obtuvieron de la Colección de Cultivos Celulares de la Asociación Americana de Tipos (EE. UU.) y se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con un 10% de suero bovino fetal a 37 °C bajo un 5% de CO2. La línea celular DiFi (KRAS de tipo salvaje) se adquirió de Nanjing Cobioer Biosciences. Las células HCT8-5Fu resistentes a los quimioterapéuticos se generaron mediante la exposición gradual a 5-fluorouracilo. Las células HCT116/self se establecieron a partir de esférulas enriquecidas con células madre, como se describió previamente ^[9]. Todas las líneas celulares se autenticaron y verificaron mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR). El estado de mutación de KRAS de las células de CRC utilizadas en este manuscrito se muestra en la Tabla S4.

Construcción de la Biblioteca de Fármacos y Estrategia de Cribado

Para identificar posibles agentes terapéuticos para el cáncer colorrectal con mutación KRAS y microsatélite estable (MSS), construimos una biblioteca de fármacos seleccionada integrando compuestos de dos repositorios establecidos: la Biblioteca de Compuestos Anticancerígenos (L3000, Selleck) y la Biblioteca de Fármacos Aprobados por la FDA (L1300, Selleck). Este enfoque integrado produjo una colección enfocada de 786 compuestos clínicamente relevantes para la evaluación. Todos los fármacos incluidos cumplen dos criterios críticos: actividad biológica documentada y perfiles de seguridad establecidos a partir de ensayos clínicos previos, y una amplia cobertura de las vías de señalización y los objetivos moleculares implicados en la oncogénesis y la resistencia terapéutica. Estos compuestos se dirigen a diversos mecanismos relacionados con el tumor, incluidas las vías de señalización clave, como la quinasa activada por mitógenos (MAPK), Wnt, PI3K/proteína quinasa B (Akt)/objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR), quinasa Janus/transductor de señal y activador de la transcripción (JAK/STAT) y el factor nuclear kappa-B (NF-κB). También se dirigen a procesos celulares fundamentales, como la apoptosis, la angiogénesis, la autofagia, la regulación del ciclo celular, la respuesta al daño del ADN y la señalización del citoesqueleto, además de objetivos específicos como las proteínas tirosina quinasas, los receptores acoplados a proteínas G y el proteasoma.

Además, sintetizamos 131 moléculas pequeñas que presentan un andamio de pirrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-ona como una biblioteca de compuestos interna para un cribado adicional.

Secuenciación de ARN y Análisis de Microarrays de ARN en Organoides y Líneas Celulares

La secuenciación de ARN de las muestras de PDO se realizó en una plataforma Illumina por Annoroad Gene Technology. El análisis de microarrays de ARN para las líneas celulares se realizó por Shanghai Biotechnology Corporation. Los protocolos experimentales detallados se proporcionan en los materiales suplementarios.

Tinción Inmunofluorescente y Citometría de Flujo

Las células se aislaron del cultivo utilizando EDTA/PBS al 0,02% o mediante homogeneización mecánica de tumores primarios o xenoinjertados. Las células aisladas se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-CD133 de ratón (dilución 1:11, Miltenyi Biotec, 130-098-046). El análisis de las muestras etiquetadas se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSAria II (BD Biosciences, San José, CA).

Estudios in vivo con Ratones

Se obtuvieron ratones macho BALB/c-nu y NOD-SCID (de 4 a 6 semanas de edad) de Beijing HFK Bio-technology Co., Ltd., y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos de acuerdo con los protocolos de cuidado de animales institucionales (IACUC, Universidad de Pekín).

La actividad de LS-1-2 se evaluó in vivo utilizando modelos de xenoinjerto derivados de líneas celulares de cáncer colorrectal con mutación KRAS (CDX) y modelos PDX. Los modelos CDX se establecieron mediante la inyección subcutánea de 5 × 10^6 células tumorales en ratones NOD/SCID. Los modelos PDX se generaron como se describió previamente ^[10] e incluyeron PDX1 (cáncer de colon), PDX2 y PDX3 (lesiones primarias y metastásicas hepáticas de un paciente con cáncer de colon) y PDX4 (cáncer rectal después de quimiorradioterapia neoadyuvante: 50,6 Gy/22 fracciones con capecitabina concurrente [825 mg/m² dos veces al día durante 5 semanas]). Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron los 100-200 mm³, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento o control (3-5 ratones por grupo).

Para los modelos de metástasis hepática, se inyectaron células LS174T-luciferina (1 × 10^6) en la subcápsula esplénica de ratones desnudos. Los regímenes de tratamiento incluyeron LS-1-2 (10, 20 o 40 mg/kg, por vía intraperitoneal, días 1-5 semanales), 5-fluorouracilo (5-FU, 30 mg/kg/semana), irinotecán (CPT-11, 20 mg/kg/semana) o TAS-102 (150 mg/kg dos veces al día, por vía oral). Los animales de control recibieron vehículo (PBS). TAS-102 (trifluridina-tipiracil) es un fármaco de combinación administrado por vía oral y bien tolerado que se compone de trifluridina, un análogo de la timidina, y tipiracil, un inhibidor de la timidina fosforilasa. El volumen tumoral se calculó como 0,52 × longitud × ancho × altura y se midió dos veces por semana. La carga metastásica se cuantificó utilizando la imagen de bioluminiscencia IVIS Spectrum-CT (PerkinElmer) y se analizó con el software Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences).

Los estudios in vivo se interrumpieron cuando el animal murió o cuando la carga tumoral alcanzó una dimensión máxima de 1,5 cm, según lo recomendado en las pautas anteriores.

Análisis Cuantitativo de Fosfoproteómica

Se realizó un análisis cuantitativo de fosfoproteómica de acuerdo con los procedimientos estándar de Jingjie PTM BioLab (Hangzhou, China). Los métodos experimentales detallados se proporcionan en los materiales suplementarios. Para identificar fosfopéptidos de alta confianza regulados por LS-1-2, aplicamos criterios de filtrado de un cambio de pliegue mayor que 1,3 o menor que 0,77 con un valor de P < 0,05 (prueba t de Student). Se construyó una red de interacción de proteínas global para las fosfoproteínas alteradas significativamente utilizando la base de datos STRING y se anotó con las vías KEGG. Para dilucidar la vía de señalización afectada por LS-1-2 a través de su interacción con MYH9, analizamos las interacciones entre las fosfoproteínas alteradas, los ARNm expresados diferencialmente y la proteína MYH9 utilizando la base de datos STRING, y la determinación del enriquecimiento de vías se realizó mediante la anotación KEGG.

Se predijeron las relaciones quinasa-sustrato utilizando el software iGPS1.0, que opera sobre el principio de que los motivos lineales cortos que rodean los sitios de fosforilación determinan la especificidad primaria. El software empleó el algoritmo GPS2.0 ^[11] para predecir las relaciones quinasa-sustrato específicas del sitio, y los datos de interacción proteína-proteína se utilizaron como un filtro contextual importante para reducir las predicciones falsas positivas. Se seleccionó un umbral "medio" con el parámetro "Interacción" establecido en "Exp./String". Se predijeron las actividades de las quinasas utilizando el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA), con los niveles de fosforilación transformados logarítmicamente que sirvieron como métrica de clasificación y las regulaciones de los sitios de fosforilación de las quinasas se formatearon en un archivo .gmt. Los puntajes de enriquecimiento normalizados de los resultados de GSEA se interpretaron como puntajes de actividad de la quinasa. Se predijo que una quinasa se activaría si sus sustratos mostraran predominantemente un aumento de la fosforilación, y se inhibiría si se observara el patrón opuesto. El análisis de los datos del Consorcio de Proteómica Tumoral Clínica (CPTAC) se realizó a través de la plataforma UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html) para examinar la expresión y los niveles de fosforilación de la proteína MYH9 en el cáncer colorrectal y su asociación con las etapas clínicas.

Ensayo de Captura con Biotina e Identificación de Proteínas por Cromatografía Líquida-Espectrometría de Masas en Tándem (CL-EM/EM)

Los lisados de células HCT116 se incubaron con biotina, LS-1-2 biotinilado (LS-1-2-Biotina) o LS-1-2-Biotina en presencia de un exceso de LS-1-2 no etiquetado a 4 °C durante 4 h. Los complejos de proteínas se aislaron utilizando el Kit de Interacción Proteína-Proteína Biotinilada Pierce™ Pull-Down (Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. Las muestras se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se visualizaron mediante tinción con plata. Las bandas de proteínas específicas se excindieron, se sometieron a digestión de tripsina en gel y se identificaron mediante análisis de CL-EM/EM.

Acoplamiento Molecular y Dinámica Molecular

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina no muscular IIA (NMHC IIA; número de acceso: ALX00019.1) se recuperó de la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica. La estructura tridimensional de NMHC IIA se generó utilizando Rosetta 8. Se proporcionan descripciones metodológicas detalladas en los materiales suplementarios.

Ensayo de Actividad de la ATPasa

La actividad de la ATPasa se midió utilizando un método optimizado de molibdeno azul ^[12]. La proteína NMHC IIA recombinante (ab226278, Abcam) se preincubó con Blebbistatina o LS-1-2 durante 10 minutos, mientras que el grupo de control recibió un 0,1% de DMSO. Después de la reacción enzimática, se añadió molibdato de amonio para cuantificar el fosfato inorgánico liberado.

Ensayo de Desplazamiento Térmico Celular (CETSA)

Se proporcionan los procedimientos detallados para el ensayo de desplazamiento térmico celular en los materiales suplementarios.

Análisis Estadístico

Los datos se presentan como media ± EE y se analizaron utilizando SPSS 19.0. Las asociaciones entre la expresión de los marcadores y las características clinicopatológicas se evaluaron mediante el análisis de correlación de Spearman. Las curvas de supervivencia se construyeron mediante la metodología de Kaplan-Meier y se compararon utilizando las pruebas de rango logarítmico. Los datos de los experimentos in vitro e in vivo se analizaron mediante pruebas t de dos colas no pareadas o ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey. Todos los experimentos in vitro se repitieron de forma independiente al menos tres veces, y los tamaños de los grupos para los estudios con animales se indican en las respectivas figuras. Se implementó la aleatorización cuando los tumores alcanzaron volúmenes predeterminados.

Resultados

El Cribado de Fármacos Identifica Agentes Terapéuticos a Base de Acridina para el CRC con Mutación KRAS y MSS

Para abordar los desafíos terapéuticos en el CRC con mutación KRAS y MSS, implementamos una estrategia de cribado de doble plataforma utilizando cinco PDO y cinco modelos de líneas celulares (Figura 1A). Todos los PDO se derivaron de pacientes con CRC avanzado con mutación KRAS y MSS que demostraron un beneficio clínico limitado de las terapias multidroga previas, lo que refleja así la resistencia al tratamiento en el mundo real. Los antecedentes de tratamiento representativos de los pacientes se documentan en la Figura S1.

De los 786 compuestos analizados en la biblioteca de fármacos aprobados por la FDA, seis agentes dirigidos contra MEK, el proteasoma, la síntesis de proteínas y las vías de daño del ADN lograron más del 60% de inhibición del crecimiento en los cinco modelos de derivados de pacientes (PDO) (Figura 1B-D). Doce compuestos dirigidos contra los complejos del proteasoma, la maquinaria de reparación del ADN y la histona desacetilasa (HDAC) demostraron una eficacia mayor del 60% en todas las líneas celulares (Figura 1E). El derivado de la acridina, amsacrina clorhidrato, y el inhibidor del proteasoma, ixazomib citrato, mostraron una actividad antitumoral consistente y potente en ambos sistemas biológicos (Figura 1F).

Mayor actividad global de la transcripción en las células de CRC con mutación KRAS

Para delimitar las diferencias moleculares entre el CRC con mutación KRAS y el CRC con KRAS de tipo salvaje (wild-type) MSS, realizamos secuenciación de ARN en cinco PDO con mutación KRAS y cinco PDO con KRAS de tipo salvaje. Los análisis de genómica funcional, que incluyen el enriquecimiento de la ontología génica y la vía KEGG, revelaron una activación pronunciada de las redes reguladoras de la transcripción en los PDO MSS con mutación KRAS. Los genes regulados al alza se enriquecieron significativamente en las vías que gobiernan los procesos metabólicos del ARN, los procesos biosintéticos del ARN y la regulación de la transcripción mediada por ADN (Figura 1G-I). El análisis del proceso biológico de la ontología génica demostró que los genes significativamente elevados en los PDO con mutación KRAS estaban asociados principalmente con el metabolismo del ARN, la transcripción mediada por ADN y la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II. La transcripción mediada por ADN y la regulación de la transcripción impulsada por la ARN polimerasa II representan pasos clave en la expresión génica, que abarcan la síntesis de ARNm y la producción de ciertos ARN nucleares pequeños. El análisis de la vía KEGG identificó la expresión génica como la vía más significativamente enriquecida. Estos resultados indican colectivamente que la mutación KRAS promueve una regulación al alza global de la actividad de la transcripción.

Realizamos un análisis transcriptómico comparativo de las células epiteliales de CRC con mutación KRAS frente a las de tipo salvaje utilizando datos de secuenciación de ARN de una sola célula de una cohorte publicada ^[13], en la que el estado de mutación se validó mediante secuenciación Sanger de cDNA dirigida a nivel de una sola célula. Coherente con nuestros hallazgos en los PDO, el análisis de la expresión génica diferencial reveló patrones de enriquecimiento similares en los procesos biológicos relacionados con la transcripción del ARN y las vías reguladoras asociadas (Figura S2). Esta concordancia entre los modelos de organoides y las células tumorales primarias subraya la solidez de la activación de la red de transcripción como una característica distintiva del CRC MSS con mutación KRAS.

Descubrimiento de LS-1-2

Para identificar inhibidores de la proliferación del CRC con mutación KRAS, analizamos 131 pequeñas moléculas con un andamiaje de pirrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-ona de nuestra biblioteca interna, contra líneas celulares de CRC con mutación KRAS (HCT8, HCT116, SW480) y KRAS de tipo salvaje (HT29, Difi, Caco2) (Figura 1J, Tabla S5). Tres compuestos demostraron efectos inhibitorios robustos en las líneas celulares con mutación KRAS. Entre estos, LS-1-2 mostró una potencia significativamente mayor contra las células con mutación KRAS (tasas de inhibición: 93.8%, 86.7% y 76.2%) en comparación con las células de tipo salvaje (tasas de inhibición: 83.7%, 35.4% y 50%), mientras que los otros dos compuestos no mostraron una selectividad genotípica estadísticamente significativa (Figura 1J). LS-1-2 (Figura 2A) se evaluó posteriormente en líneas celulares de CRC adicionales y modelos de PDO, lo que confirmó su amplia eficacia antiproliferativa contra las células de CRC con mutación KRAS.

LS-1-2 demostró una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis contra las líneas celulares de CRC con mutación KRAS (CI50: 0.0819-0.9456 µM) y variantes resistentes a la quimioterapia (HCT8-5-FU: 0.2239 µM; HCT116/self: 1.187 µM; PDC1: 0.1722 µM) (Figura 2B-C). Si bien LS-1-2 también inhibió el crecimiento de las células de CRC con KRAS de tipo salvaje, estas células mostraron una sensibilidad reducida (Difi CI50 = 0.9456 µM, HT29 CI50 = 1.379 µM, RKO CI50 = 3.049 µM, Caco-2 CI50 = 2.018 µM) en comparación con sus contrapartes con mutación KRAS (Figura 2D).

Se observaron respuestas diferenciales similares en los PDO. En seis PDO metastásicos de CRC con mutación KRAS, incluidos pares de lesiones primarias y recurrentes de un mismo paciente, LS-1-2 suprimió el crecimiento de manera dependiente de la dosis, a pesar de una heterogeneidad sustancial en la quimiosensibilidad basal a los agentes convencionales (5-FU CI50: 32.82-1143 µM; oxaliplatino CI50: 19.02-3341 µM) (Figura 2E). En particular, los PDO derivados de pacientes con resistencia a múltiples fármacos (tratados previamente con fluoropirimidina/irinotecán/oxaliplatino con o sin bevacizumab/radioterapia; Figura S1) siguieron siendo sensibles a LS-1-2, lo que confirmó su potencial traslacional para el tratamiento del CRC con mutación KRAS resistente. Aunque LS-1-2 también mostró eficacia en los PDO con KRAS de tipo salvaje (CI50: 0.3951-2.26 µM), se observó una reducción moderada en la sensibilidad en relación con los PDO con mutación KRAS (Figura 2F).

LS-1-2 supera el crecimiento del CRC con mutación KRAS y la resistencia al 5-FU in vivo

La actividad antitumoral in vivo de LS-1-2 se evaluó utilizando modelos de xenoinjerto derivados de células HCT116 y HCT8/5Fu y cuatro modelos de xenoinjerto derivados de pacientes (PDX1-4) con mutación KRAS. Los ratones fueron tratados durante 18 días con PBS (control), LS-1-2 (10, 20 o 40 mg/kg), 5-FU (30 mg/kg) o CPT-11 (20 mg/kg). LS-1-2 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de HCT116 de manera dependiente de la dosis en comparación con el control (todos los valores de p < 0.01; Figura S3A). A 40 mg/kg, LS-1-2 demostró una inhibición del crecimiento tumoral superior en relación con el 5-FU (p = 0.0414 para el peso tumoral; p = 0.0005 para la tasa de inhibición tumoral). En el modelo resistente al 5-FU, HCT8/5-FU, LS-1-2 (40 mg/kg) también suprimió eficazmente el crecimiento tumoral en comparación con los grupos de control y 5-FU (Figura S3B).

Los modelos PDX exhibieron una heterogeneidad considerable en la respuesta a los fármacos. PDX1, derivado de una lesión de cáncer de colon primaria no tratada, mostró la respuesta más fuerte al 5-FU, con una inhibición tumoral del 64.99% (Figura 3A, Figura S4B). En contraste, PDX4, derivado de un paciente con cáncer de recto que recibió quimiorradioterapia neoadyuvante y que posteriormente desarrolló metástasis en el hígado y los pulmones, fue el menos sensible al 5-FU, con solo una inhibición del 31.93% (Figura 3C, Figura S4H). PDX3, establecido a partir de una lesión metastásica, exhibió la respuesta más fuerte a CPT-11, con una inhibición del 81.15%, aproximadamente el doble que PDX2, que se derivó de la lesión primaria del mismo paciente (inhibición del 42.37%; Figura 3B, Figura S4F). PDX4 y PDX2 mostraron una sensibilidad similar a CPT-11 (Figura 3B, Figura S4D).

LS-1-2 (40 mg/kg) logró mayores tasas de inhibición tumoral en los modelos de cáncer de colon primario (PDX1 y PDX2: 68.99% y 89.4%, respectivamente) que el 5-FU (64.99% y 57.20%) o CPT-11 (56.28% y 42.37%). En el modelo de metástasis en el hígado, PDX3, LS-1-2 produjo una supresión significativamente mayor del crecimiento tumoral (inhibición del 90.83%) en comparación con el 5-FU (60.47%) y CPT-11 (81.15%). LS-1-2 también inhibió fuertemente el crecimiento tumoral en el modelo PDX4 resistente a la quimiorradioterapia (inhibición del 81.51%), superando tanto al 5-FU (31.93%) como a CPT-11 (47.89%) (Figura 3, Figura S4).

LS-1-2 suprime la metástasis hepática del CRC con mutación KRAS in vitro e in vivo

Basado en la inhibición observada del crecimiento tumoral del CRC metastásico con mutación KRAS tras el tratamiento con LS-1-2, investigamos si LS-1-2 podría prevenir directamente la metástasis hepática en el cáncer colorrectal con mutación KRAS. LS-1-2 suprimió significativamente la invasión y la migración de las células HCT116 in vitro (Figura 4A-B). Evaluamos además este efecto in vivo utilizando un modelo de metástasis hepática en ratones. La administración intraperitoneal de LS-1-2 redujo significativamente la diseminación de las metástasis hepáticas del CRC de manera dependiente de la concentración (Figura 4C-E).

La eficacia de LS-1-2 (40 mg/kg) fue comparable a la de TAS-102 (150 mg/kg, dos veces al día) en la supresión de la metástasis hepática (Figura 4F). No se observó pérdida de peso corporal en el grupo tratado con LS-1-2, mientras que los ratones tratados con TAS-102 exhibieron una reducción del 10-14% en el peso corporal en comparación con las mediciones de referencia durante el período de tratamiento (Figura 4G).

LS-1-2 reduce la formación de colonosferas y la proporción de CSC

LS-1-2 inhibió notablemente la formación de colonosferas en las líneas celulares HCT116, HCT8, LS174T, SW480 y SW620, así como en dos líneas celulares derivadas de pacientes (CASE1 y CASE3; Figura S5A-G). Además, LS-1-2 redujo significativamente la proporción de células madre cancerosas CD133+ en las células HCT116/self (del 85.6% al 71.5%) y en las líneas celulares derivadas de pacientes (PDC1: del 2.1% al 0.5%; PDC4: del 17.7% al 8.6%; Figura S5H).

Además, el tratamiento con LS-1-2 resultó en una regulación a la baja dependiente de la concentración de los marcadores clave de la capacidad de formar colonosferas y la resistencia a los fármacos, que incluyen el sitio de inserción del virus de la leucemia de células B específico (BMI-1), el factor similar a Krüppel 4 (KLF4), la proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MDR1), NANOG y el miembro 2 de la subfamilia de unión a ATP de la familia G de transportadores (ABCG2; Figura S5I).

LS-1-2 regula la vía FOXO inducida por MAPK y PI3K/AKT

El análisis multi-ómico integrado que combina la fosfoproteómica y la secuenciación de ARN dilucidó el mecanismo de acción de LS-1-2 en el cáncer colorrectal con mutación KRAS. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG reveló que LS-1-2 afectó varias vías clave, que incluyen el ciclo celular, la señalización de p53, la señalización de FOXO, el transporte de ARN y las vías metabólicas (Figura 5A). El perfilado de fosfoproteómica identificó 2253 sitios de fosforilación regulados de manera diferencial (749 regulados al alza, 1504 regulados a la baja; Tablas S6-7). El análisis de la predicción de la actividad de la quinasa indicó que LS-1-2 inhibió las quinasas del ciclo celular [quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1), quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2), quinasa similar a la polo 1 (PLK1)] al tiempo que activaba la quinasa 4 dependiente de p53 (PDK4) (Figura 5B).

LS-1-2 reguló al alza los genes de la vía FOXO [proteína 32 de la caja F (FBXO32), proteína 3 que interactúa con BCL2 (BNIP3), BCL2 similar a 11 (BCL2L11)] y reguló a la baja los reguladores del ciclo celular [ciclina B1 (CCNB1), CDK2, PLK1] (Figura 5C). El análisis de Western blot confirmó que LS-1-2 restauró la expresión de FOXO3/4 en las líneas celulares resistentes a la quimioterapia (HCT8-5Fu, HCT8-CPT11 y HCT116/self) al tiempo que suprimía la activación de PLK1, PLK4, CDK2, ciclina A1/A2 y la vía MAPK/PI3K (Figura 5D-E). Además, LS-1-2 inhibió de manera dependiente de la dosis la fosforilación de EGFR/ERK/AKT y promovió la acumulación nuclear de FOXO3A (Figura 5F-G).

El análisis de citometría de flujo demostró que LS-1-2 indujo la apoptosis de manera dependiente de la concentración, con tasas de apoptosis que alcanzaron el 32.79% a 0.5 µM y el 43.79% a 1.0 µM (Figura 5H). A 0.5 µM, LS-1-2 aumentó la proporción de células en la fase G2/M (19.96% frente a 10.44% en los controles) al tiempo que redujo la población en fase S (8.55% frente a 19.18%). En contraste, a la concentración más alta de 1.0 µM, el compuesto aumentó notablemente la acumulación en fase S (31.73% frente a 19.18%) al tiempo que disminuyó las proporciones de células en fase G1 (61.9% frente a 70.35%) y células en fase G2/M (6.33% frente a 10.44%) (Figura 5H). La microscopía electrónica de transmisión reveló además alteraciones ultraestructurales inducidas por LS-1-2, que incluyen la condensación de la cromatina y el encogimiento de las mitocondrias a las 12 horas, seguido de la lisis de la cromatina nuclear, la hinchazón de las mitocondrias y la vacuolización a las 24 horas, lo que finalmente culminó en la disolución de la membrana celular (Figura S6).

Estos hallazgos establecen el mecanismo dual de LS-1-2: ataca simultáneamente las vías de resistencia a los fármacos impulsadas por EGFR y las vías descendentes al tiempo que reactiva la supresión tumoral mediada por FOXO.

NMHC-IIA se identifica como un objetivo directo de LS-1-2

Para investigar el objetivo farmacológico de LS-1-2, sintetizamos sondas químicas para el perfilado de proteínas basado en la afinidad (Figura 6A). Una sonda de LS-1-2 conjugada con biotina mantuvo la actividad antitumoral (Figura 6B) y seleccionó selectivamente la cadena pesada de la miosina no muscular IIA (NMHC-IIA, 226 kDa) mediante la purificación por afinidad con estreptavidina. Esta interacción se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción con plata (Figura 6C), cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS; Tabla S8) y análisis de Western blot (Figura 6C).

La microscopía confocal demostró la colocalización citoplasmática de la sonda LS-1-2-biotina con NMHC-IIA (Figura 6D). La inhibición de MYH9, el gen que codifica NMHC-IIA, redujo la sensibilidad celular a LS-1-2, lo que apoya la idea de que NMHC-IIA es un objetivo funcional (Figura 6E). El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) validó aún más la unión directa, mostrando que LS-1-2 estabilizó NMHC-IIA frente a la desnaturalización térmica (Figura 6F). En contraste con el inhibidor conocido, blebbistatina (IC50 = 4,49 μM), LS-1-2 no inhibió la actividad de la ATPasa de NMHC-IIA, lo que indica un mecanismo de acción independiente de la interferencia con el sitio de unión a ATP (Figura 6G).

La fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 promueve la proliferación y la invasión de las células de CRC

El análisis de datos de fosfoproteómica cuantitativa global reveló una disminución de la fosforilación de NMHC IIA en los residuos S1714, S1943 y T1151 en las células HCT116 tratadas con LS-1-2 en comparación con los controles (Figura 7A). El análisis de Western blot validó la reducción de la fosforilación de NMHC IIA en S1943 tanto en las células HCT116 como en PDO1 (Figura 7B; solo estaban disponibles anticuerpos comerciales para pS1943 NMHC IIA). El perfilado de fosfoproteómica también indicó que NMHC IIA interactúa con múltiples vías de señalización enriquecidas en proteínas que exhiben cambios de fosforilación inducidos por LS-1-2 (Figura 7C).

Para dilucidar las vías de señalización afectadas por la interacción LS-1-2-NMHC IIA, analizamos las asociaciones entre las foscoproteínas alteradas, los ARNm expresados de forma diferencial y NMHC IIA utilizando la base de datos STRING, con la evaluación del enriquecimiento de vías mediante la anotación de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Este análisis identificó perturbaciones en varias vías clave, que incluyen la regulación del citoesqueleto de actina, la unión estrecha, el ciclo celular, la apoptosis, la señalización de Hippo y la señalización de FOXO (Figura 7D).

Notablemente, las líneas celulares de CRC con una menor fosforilación basal en S1943 demostraron una mayor sensibilidad a LS-1-2, como lo indica una correlación inversa entre los valores de IC50 y los niveles de fosforilación (Figura S7 y Figura 2B). Los estudios de mutación confirmaron la importancia funcional de la fosforilación de NMHC IIA, ya que las células HCT116 que expresan mutantes del sitio de fosforilación S1714 exhibieron una sensibilidad reducida a LS-1-2 (IC50 = 0,7856 μM) en comparación con los controles transfectados con un vector vacío (IC50 = 0,2487 μM; Figuras 7F-G).

Evaluamos además la relevancia clínica de la fosforilación de NMHC IIA en CRC utilizando datos de CPTAC ^[14]. Se observó una mayor fosforilación en S1714 y S1943 en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales y se correlacionó con una etapa avanzada de TNM y progresión metastásica. La fosforilación de S1714 aumentó significativamente en los tumores de etapa 4, mientras que la fosforilación de S1943 se elevó en las etapas 2-4. Los niveles totales de proteína NMHC IIA permanecieron sin cambios en las diferentes etapas de la enfermedad (Figura 7H).

LS-1-2 inhibe competitivamente la fosforilación de NMHC IIA en S1943 y S1714 por CK2

Utilizando el modelado de homología y el análisis CASTp, predijimos los sitios activos de NMHC IIA (volumen del dominio de unión a ligandos: 71,031 Å) y confirmamos mediante el acoplamiento molecular que LS-1-2 se une a estas regiones (Figuras 8A-E). CETSA demostró que LS-1-2 estabiliza NMHC IIA a través de la interacción directa con S1714, ya que la mutación de este residuo abolió la estabilización térmica (Figura 8F), mientras que la mutación de S1943 no afectó la estabilización inducida por LS-1-2 (Figura 8G). Las simulaciones de dinámica molecular revelaron que la unión de LS-1-2 en S1714 crea un impedimento estérico que impide la fosforilación en este sitio (Figura 8E). Dado que informes anteriores indican que NMHC IIA S1943 es fosforilado por la quinasa de caseína II (CK2) ^[15], la unión de LS-1-2 indujo cambios conformacionales en las hélices alfa de unión a CK2A1 de NMHC IIA (Figuras 8H-I), reduciendo la energía de unión CK2A1-NMHC IIA de -92,08 kJ/mol a -48,73 kJ/mol (Figuras 8J-M). La sobreexpresión de CK2A1 aumentó la fosforilación de S1943, y este efecto fue inhibido por el tratamiento con LS-1-2 (Figuras 8N-O). Estos resultados indican que LS-1-2 interrumpe la fosforilación mediada por CK2A1 en S1943 a través de la interferencia alostérica con la interacción quinasa-sustrato.

La fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 promueve la activación mediada por YAP de la señalización de FOXO/PLK1 y es suprimida por LS-1-2

Investigamos el efecto de la fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 en las vías de señalización de MAPK, AKT y FOXO. La sobreexpresión de MYH9 de tipo salvaje aumentó la fosforilación de AKT, ERK1/2 y FOXO3 en comparación con el control. En contraste, las mutaciones deficientes en fosfato (S1943A y S1714A) no lograron aumentar la fosforilación de estas proteínas. Tanto las mutaciones S1943A como S1714A también suprimieron la expresión de la ciclina A1/A2 al tiempo que aumentaron los niveles de ciclina E en relación con MYH9 de tipo salvaje (Figura 9A).

Examinamos además la relación entre la fosforilación de NMHC IIA y la regulación de la vía de Hippo. Las mutaciones S1943A y S1714A promovieron la fosforilación del regulador transcripcional asociado a Yes1 (YAP) y el coactivador transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ), lo que resultó en una disminución de los niveles de proteína YAP. El tratamiento con LS-1-2 también mejoró la fosforilación de YAP (Figura 9B).

Los ensayos de extracción de GTPasa Rho demostraron que NMHC IIA de tipo salvaje mejoró significativamente la actividad de RhoA en las células HCT116, mientras que tanto las mutaciones S1943A como S1714A inhibieron la activación de Rho. El tratamiento con LS-1-2 también suprimió sustancialmente la actividad de Rho en los ensayos celulares (Figuras 9C-D).

La fosforilación de NMHC IIA se correlaciona inversamente con el pronóstico y los resultados de la quimioterapia adyuvante en CRC

Evaluamos además la asociación entre la fosforilación de NMHC IIA en S1943 y el pronóstico clínico. El análisis inmunohistoquímico reveló que la pS1943-miosina se localizaba tanto en la membrana celular como en el citoplasma de las células tumorales (Figura S8A). El examen de 12 pares de muestras de pacientes con y sin mutaciones de KRAS mostró niveles elevados de p-NMHC IIA en las muestras con mutaciones de KRAS (Figura S8B). El grado de fosforilación de NMHC IIA se correlacionó positivamente con una etapa avanzada de TNM, metástasis hepática (etapa M), diferenciación deficiente y expresión de CD44 (Tabla S9). La fosforilación elevada de NMHC IIA en los tejidos tumorales se asoció significativamente con una reducción de la supervivencia general (p = 0,049, prueba de rango logarítmico; Figura S8C). Además, el aumento de la fosforilación de NMHC IIA se correlacionó con una menor supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CRC en etapa I-III (p = 0,04; Figura S8D).

La detección de fármacos identifica terapéuticos basados en acridina para CRC MSS con mutación de KRAS

Para abordar los desafíos terapéuticos en CRC MSS con mutación de KRAS, implementamos una estrategia de detección de doble plataforma que utiliza cinco PDO y cinco modelos de líneas celulares (Figura 1A). Todos los PDO se derivaron de pacientes con CRC metastásico MSS con mutación de KRAS que demostraron un beneficio clínico limitado de las terapias multidroga previas, lo que refleja así la resistencia al tratamiento en el mundo real. Los historiales de tratamiento representativos de los pacientes se documentan en la Figura S1.

De los 786 compuestos examinados en la biblioteca de fármacos aprobados por la FDA, seis agentes que se dirigen a MEK, el proteasoma, la síntesis de proteínas y las vías de daño del ADN lograron más del 60% de inhibición del crecimiento en todos los cinco PDO (Figuras 1B-D). Doce compuestos dirigidos a los complejos del proteasoma, la maquinaria de reparación del ADN y la histona desacetilasa (HDAC) demostraron una eficacia mayor del 60% en todas las líneas celulares (Figura 1E). El derivado de acridina, hidrocloruro de amsacrina, y el inhibidor del proteasoma, citrato de ixazomib, mostraron una actividad antitumoral consistente y potente en ambos sistemas biológicos (Figura 1F).

Mayor actividad de transcripción global en las células de CRC con mutación de KRAS

Para dilucidar las distinciones moleculares entre CRC MSS con mutación de KRAS y CRC MSS de tipo salvaje, realizamos un secuenciamiento de ARN en cinco PDO con mutación de KRAS y cinco PDO de tipo salvaje (Figura 1A). Los análisis de genómica funcional, que incluyen el enriquecimiento de la ontología génica y la vía KEGG, revelaron una pronunciada activación de las redes de regulación transcripcional en los PDO MSS con mutación de KRAS. Los genes regulados al alza se enriquecieron significativamente en las vías que gobiernan los procesos metabólicos del ARN, los procesos biosintéticos del ARN y la regulación de la transcripción basada en ADN (Figuras 1G-I). El análisis del proceso biológico de la ontología génica demostró que los genes significativamente elevados en los PDO con mutación de KRAS se asociaron principalmente con el metabolismo del ARN, la transcripción basada en ADN y la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II. La transcripción basada en ADN y la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II representan pasos clave en la expresión génica, que abarcan la síntesis de ARNm y la producción de ciertos ARN nucleares pequeños. El análisis de la vía KEGG identificó la expresión génica como la vía más significativamente enriquecida.

Realizamos un análisis transcriptómico comparativo de las células epiteliales de CRC con mutación de KRAS frente a las de tipo salvaje utilizando datos de secuenciación de ARN de una sola célula de una cohorte publicada ^[13], en la que el estado de mutación se validó mediante el secuenciamiento de cDNA dirigido a nivel de una sola célula. Coherente con nuestros hallazgos en PDO, el análisis de la expresión génica diferencial reveló patrones de enriquecimiento similares en los procesos biológicos relacionados con la transcripción del ARN y las vías de regulación asociadas (Figura S2). Esta concordancia entre los modelos de organoides y las células tumorales primarias subraya la solidez de la activación de la red transcripcional como una característica distintiva del CRC MSS con mutación de KRAS.

Descubrimiento de LS-1-2

Para identificar inhibidores de la proliferación de CRC con mutación de KRAS, examinamos 131 pequeñas moléculas de andamio de pirrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-ona de nuestra biblioteca interna frente a las líneas celulares de CRC con mutación de KRAS (HCT8, HCT116, SW480) y de tipo salvaje (HT29, Difi, Caco2) (Figura 1J, Tabla S5). Tres compuestos demostraron efectos inhibidores robustos en las líneas celulares con mutación de KRAS. Entre estos, LS-1-2 mostró una mayor potencia contra las células con mutación de KRAS (tasas de inhibición: 93,8%, 86,7% y 76,2%) en comparación con las células de tipo salvaje (tasas de inhibición: 83,7%, 35,4% y 50%), mientras que los otros dos compuestos no mostraron una selectividad de genotipo estadísticamente significativa (Figura 1J). LS-1-2 (Figura 2A) se evaluó posteriormente en líneas celulares de CRC y modelos de PDO adicionales, lo que confirmó su amplia eficacia antiproliferativa contra las células de CRC con mutación de KRAS.

LS-1-2 demostró una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis contra las líneas celulares de CRC con mutación de KRAS (IC50: 0,0819-0,9456 μM) y las variantes resistentes a los fármacos (HCT8-5-FU: 0,2239 μM; HCT116/self: 1,187 μM; PDC1: 0,1722 μM) (Figuras 2B-C). Si bien LS-1-2 también inhibió el crecimiento de las células de CRC de tipo salvaje, estas células mostraron una sensibilidad reducida (Difi IC50 = 0,9456 μM, HT29 IC50 = 1,379 μM, RKO IC50 = 3,049 μM, Caco-2 IC50 = 2,018 μM) en comparación con sus contrapartes con mutación de KRAS (Figura 2D).

Se observaron respuestas diferenciales similares en los PDO. En seis PDO metastásicos de CRC con mutación de KRAS, incluidos pares de lesiones primarias y recurrentes de un paciente, LS-1-2 suprimió el crecimiento de manera dependiente de la dosis a pesar de una heterogeneidad sustancial en la quimiosensibilidad basal a los agentes convencionales (5-FU IC50: 32,82-1143 μM; oxaliplatino IC50: 19,02-3341 μM) (Figura 2E). Notablemente, los PDO derivados de pacientes refractarios a múltiples fármacos (tratados previamente con fluoropirimidina/irinotecán/oxaliplatino con o sin bevacizumab/radioterapia; Figura S1) siguieron siendo sensibles a LS-1-2, lo que confirma su potencial de traslación para el tratamiento del CRC con mutación de KRAS resistente al tratamiento. Si bien LS-1-2 también mostró eficacia en los PDO de tipo salvaje (IC50: 0,3951-2,26 μM), se observó una reducción moderada en la sensibilidad en relación con los PDO con mutación de KRAS (Figura 2F).

LS-1-2 supera el crecimiento de CRC con mutación de KRAS y la resistencia al 5-FU in vivo

La actividad antitumoral in vivo de LS-1-2 se evaluó utilizando modelos de xenoinjerto derivados de células HCT116 y HCT8/5Fu, así como cuatro modelos de xenoinjerto derivados de pacientes con mutaciones en el gen KRAS (PDX1-4). Los ratones fueron tratados durante 18 días con PBS (control), LS-1-2 (10, 20 o 40 mg/kg), 5-FU (30 mg/kg) o CPT-11 (20 mg/kg). LS-1-2 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de HCT116 de forma dependiente de la dosis en comparación con el control (p < 0,01 en todos los casos; Figura S3A). A 40 mg/kg, LS-1-2 demostró una inhibición superior del crecimiento tumoral en relación con 5-FU (p = 0,0414 para el peso tumoral; p = 0,0005 para la tasa de inhibición tumoral). En el modelo HCT8/5-FU resistente a 5-FU, LS-1-2 (40 mg/kg) también suprimió eficazmente el crecimiento tumoral en comparación con los grupos de control y 5-FU (Figura S3B).

Los modelos PDX mostraron una heterogeneidad considerable en la respuesta a los fármacos. PDX1, derivado de una lesión de cáncer colorrectal primaria sin tratamiento previo, mostró la respuesta más fuerte a 5-FU, con una inhibición tumoral del 64,99% (Figura 3A, Figura S4B). En contraste, PDX4, derivado de un paciente con cáncer de recto que recibió quimiorradioterapia neoadyuvante y que posteriormente desarrolló metástasis hepáticas y pulmonares, fue el menos sensible a 5-FU, con solo un 31,93% de inhibición tumoral (Figura 3C, Figura S4H). PDX3, establecido a partir de una lesión metastásica, exhibió la respuesta más fuerte a CPT-11, con una inhibición tumoral del 81,15%, aproximadamente el doble que PDX2, que se derivó de la lesión primaria del mismo paciente (42,37% de inhibición; Figura 3B, Figura S4F). PDX4 y PDX2 mostraron una sensibilidad similar a CPT-11 (Figura 3B, Figura S4D).

LS-1-2 (40 mg/kg) logró tasas de inhibición tumoral más altas en los modelos de cáncer colorrectal primario (PDX1 y PDX2: 68,99% y 89,4%, respectivamente) que 5-FU (64,99% y 57,20%) o CPT-11 (56,28% y 42,37%). En el modelo PDX3 derivado de metástasis hepáticas, LS-1-2 produjo una supresión significativamente mayor del crecimiento tumoral (90,83% de inhibición) en comparación con 5-FU (60,47%) y CPT-11 (81,15%). LS-1-2 también inhibió fuertemente el crecimiento tumoral en el modelo PDX4 resistente a la quimiorradioterapia (81,51% de inhibición), superando tanto a 5-FU (31,93%) como a CPT-11 (47,89%) (Figura 3, Figura S4).

LS-1-2 Suprime las Metástasis Hepáticas de CRC con Mutación en KRAS In Vitro e In Vivo

Basándonos en la inhibición observada del crecimiento tumoral de CRC con mutación en KRAS tras el tratamiento con LS-1-2, investigamos si LS-1-2 podría prevenir directamente las metástasis hepáticas en el cáncer colorrectal con mutación en KRAS. LS-1-2 suprimió significativamente la invasión y migración de las células HCT116 in vitro (Figura 4A-B). Evaluamos además este efecto in vivo utilizando un modelo de metástasis hepáticas en ratones. La administración intraperitoneal de LS-1-2 redujo significativamente la diseminación de las metástasis hepáticas de CRC de forma dependiente de la concentración (Figura 4C-E).

La eficacia de LS-1-2 (40 mg/kg) fue comparable a la de TAS-102 (150 mg/kg, dos veces al día) en la supresión de las metástasis hepáticas (Figura 4F). No se observó pérdida de peso corporal en el grupo tratado con LS-1-2, mientras que los ratones tratados con TAS-102 mostraron una reducción del 10-14% en el peso corporal durante el período de tratamiento en comparación con las mediciones de referencia (Figura 4G).

LS-1-2 Reduce la Formación de Esferoides y la Proporción de Células Madre Cancerosas (CSC)

LS-1-2 inhibió notablemente la formación de esferoides en las líneas celulares HCT116, HCT8, LS174T, SW480 y SW620, así como en dos líneas celulares derivadas de pacientes (CASE1 y CASE3; Figura S5A-G). Además, LS-1-2 redujo significativamente la proporción de células madre cancerosas CD133+ en las células HCT116/self (del 85,6% al 71,5%) y en las líneas celulares derivadas de pacientes (PDC1: del 2,1% al 0,5%; PDC4: del 17,7% al 8,6%; Figura S5H).

Además, el tratamiento con LS-1-2 resultó en una regulación a la baja dependiente de la concentración de marcadores clave de la "stemness" y la resistencia a los fármacos, incluyendo el gen B-cell-specific Moloney leukemia virus insertion site 1 (BMI-1), el factor similar a Krüppel 4 (KLF4), la proteína de resistencia múltiple a los fármacos 1 (MDR1), NANOG y el miembro 2 de la subfamilia de proteínas transportadoras de unión a ATP (ABCG2; Figura S5I).

LS-1-2 Regula la Vía de Señalización de FOXO Inducida por MAPK y PI3K/AKT

El análisis multi-ómico integrado que combina la fosfoproteómica y el secuenciamiento de ARN dilucidó el mecanismo de acción de LS-1-2 en el cáncer colorrectal con mutación en KRAS. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG reveló que LS-1-2 afectó varias vías clave, incluyendo el ciclo celular, la señalización de p53, la señalización de FOXO, el transporte de ARN y las vías metabólicas (Figura 5A). El perfilado de fosfoproteómica identificó 2253 sitios de fosforilación regulados de forma diferencial (749 regulados al alza, 1504 regulados a la baja; Tablas S6-7). El análisis de predicción de la actividad de la quinasa indicó que LS-1-2 inhibió las quinasas del ciclo celular [quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1), quinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2), quinasa similar a polo 1 (PLK1)] al tiempo que activaba la quinasa dependiente de piruvato 4 relacionada con p53 (PDK4) (Figura 5B).

LS-1-2 reguló al alza los genes de la vía de FOXO [proteína F-box 32 (FBXO32), proteína interactuante con BCL2 3 (BNIP3), BCL2 like 11 (BCL2L11)] y reguló a la baja los reguladores del ciclo celular [ciclina B1 (CCNB1), CDK2, PLK1] (Figura 5C). El análisis de Western blot confirmó que LS-1-2 restauró la expresión de FOXO3/4 en las líneas celulares resistentes a la quimioterapia (HCT8-5Fu, HCT8-CPT11 y HCT116/self) al tiempo que suprimía PLK1, PLK4, CDK2, ciclina A1/A2 y la activación de la vía MAPK/PI3K (Figura 5D-E). Además, LS-1-2 inhibió de forma dependiente de la concentración la fosforilación de EGFR/ERK/AKT y promovió la acumulación nuclear de FOXO3A (Figura 5F-G).

El análisis de citometría de flujo demostró que LS-1-2 indujo la apoptosis de forma dependiente de la concentración, con tasas de apoptosis que alcanzaron el 32,79% a 0,5 µM y el 43,79% a 1,0 µM (Figura 5H). A 0,5 µM, LS-1-2 aumentó la proporción de células en la fase G2/M (19,96% frente al 10,44% en los controles) al tiempo que redujo la población en fase S (8,55% frente al 19,18%). En contraste, a la concentración más alta de 1,0 µM, el compuesto aumentó notablemente la acumulación en fase S (31,73% frente al 19,18%) al tiempo que disminuyó las proporciones de células en fase G1 (61,9% frente al 70,35%) y células en fase G2/M (6,33% frente al 10,44%) (Figura 5H). La microscopía electrónica de transmisión reveló además alteraciones ultraestructurales inducidas por LS-1-2, incluyendo la condensación de la cromatina y el encogimiento de las mitocondrias a las 12 horas, seguido de la lisis de la cromatina nuclear, el hinchamiento de las mitocondrias y la vacuolización a las 24 horas, culminando finalmente en la disolución de la membrana celular (Figura S6).

Estos hallazgos establecen el mecanismo dual de LS-1-2: se dirige simultáneamente a EGFR y a las vías de señalización que impulsan la resistencia a la quimioterapia, al tiempo que reactiva la supresión tumoral mediada por FOXO.

NMHC-IIA se identifica como un objetivo directo de LS-1-2

Para investigar el objetivo farmacológico de LS-1-2, sintetizamos sondas químicas para el perfilado de proteínas basado en la afinidad (Figura 6A). Una sonda de LS-1-2 conjugada con biotina mantuvo la actividad antitumoral (Figura 6B) y unió selectivamente la miosina pesada no muscular IIA (NMHC-IIA, 226 kDa) mediante la purificación por afinidad con estreptavidina. Esta interacción se confirmó mediante SDS-PAGE con tinción con plata (Figura 6C), cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS; Tabla S8) y análisis de Western blot (Figura 6C).

La microscopía confocal demostró la colocalización citoplasmática de la sonda de LS-1-2-biotina con NMHC-IIA (Figura 6D). La eliminación de MYH9, el gen que codifica NMHC-IIA, redujo la sensibilidad celular a LS-1-2, lo que apoya que NMHC-IIA es un objetivo funcional (Figura 6E). El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) validó además la unión directa, mostrando que LS-1-2 estabilizó NMHC-IIA frente a la desnaturalización térmica (Figura 6F). En contraste con el inhibidor conocido, la blebbistatina (IC50 = 4,49 µM), LS-1-2 no inhibió la actividad de la ATPasa de NMHC-IIA, lo que indica un mecanismo de acción independiente de la interferencia con el sitio de unión a ATP (Figura 6G).

La fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 promueve la proliferación y la invasión de las células de CRC

El análisis de los datos de fosfoproteómica cuantitativa global reveló una disminución de la fosforilación de NMHC IIA en los residuos S1714, S1943 y T1151 en las células HCT116 tratadas con LS-1-2 en comparación con los controles (Figura 7A). El análisis de Western blot validó la reducción de la fosforilación de NMHC IIA en S1943 tanto en las células HCT116 como en PDO1 (Figura 7B; solo estaban disponibles anticuerpos comerciales para NMHC IIA pS1943). El perfilado de fosfoproteómica indicó además que NMHC IIA interactúa con múltiples vías de señalización enriquecidas en proteínas que exhiben cambios de fosforilación inducidos por LS-1-2 (Figura 7C).

Para dilucidar las vías de señalización afectadas por la interacción LS-1-2-NMHC IIA, analizamos las asociaciones entre las proteínas fosforiladas alteradas, los ARNm expresados de forma diferencial y NMHC IIA utilizando la base de datos STRING, con el enriquecimiento de las vías evaluado mediante la anotación de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Este análisis identificó perturbaciones en varias vías clave, incluyendo la regulación del citoesqueleto de actina, las uniones estrechas, el ciclo celular, la apoptosis, la señalización de Hippo y la señalización de FOXO (Figura 7D).

En particular, las líneas celulares de CRC con una fosforilación basal más baja en S1943 mostraron una mayor sensibilidad a LS-1-2, como lo indica una correlación inversa entre los valores de IC50 y los niveles de fosforilación (Figura S7 y Figura 2B). Los estudios de mutación confirmaron la importancia funcional de la fosforilación de NMHC IIA, ya que las células HCT116 que expresaban mutantes del sitio de fosforilación S1714 mostraron una sensibilidad reducida a LS-1-2 (IC50 = 0,7856 µM) en comparación con los controles transfectados con un vector vacío (IC50 = 0,2487 µM; Figuras 7F-G).

Evaluamos además la relevancia clínica de la fosforilación de NMHC IIA en CRC utilizando los datos de CPTAC ^[14]. Se observó una mayor fosforilación en S1714 y S1943 en los tumores de CRC en comparación con los tejidos normales y se correlacionó con una etapa de TNM más avanzada y la progresión metastásica. La fosforilación de S1714 aumentó significativamente en los tumores de etapa 4, mientras que la fosforilación de S1943 se elevó en las etapas 2-4. Los niveles totales de proteína NMHC IIA permanecieron sin cambios en las diferentes etapas de la enfermedad (Figura 7H).

LS-1-2 inhibe competitivamente la fosforilación de NMHC IIA en S1943 y S1714 por CK2

Utilizando el modelado de homología y el análisis CASTp, predijimos los sitios activos de NMHC IIA (volumen del dominio de unión al ligando: 71,031 Å) y confirmamos mediante el acoplamiento molecular que LS-1-2 se une a estas regiones (Figuras 8A-E). CETSA demostró que LS-1-2 estabiliza NMHC IIA a través de la interacción directa con S1714, ya que la mutación de este residuo abolió la estabilización térmica (Figura 8F), mientras que la mutación de S1943 no afectó la estabilización inducida por LS-1-2 (Figura 8G). Las simulaciones de dinámica molecular revelaron que la unión de LS-1-2 en S1714 crea un impedimento estérico que impide la fosforilación en este sitio (Figura 8E). Dado que se informó previamente que NMHC IIA S1943 es fosforilado por la quinasa dependiente de caseína II (CK2) ^[15], la unión de LS-1-2 indujo cambios conformacionales en las hélices alfa de unión a CK2A1 de NMHC IIA (Figuras 8H-I), reduciendo la energía de unión CK2A1-NMHC IIA de -92,08 kJ/mol a -48,73 kJ/mol (Figuras 8J-M). La sobreexpresión de CK2A1 aumentó la fosforilación de S1943, y este efecto fue inhibido por el tratamiento con LS-1-2 (Figuras 8N-O). Estos resultados indican que LS-1-2 interrumpe la fosforilación mediada por CK2A1 en S1943 a través de la interferencia alostérica con la interacción quinasa-sustrato.

La fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 promueve la activación mediada por YAP de la señalización de FOXO/PLK1 y es suprimida por LS-1-2

Investigamos el efecto de la fosforilación de NMHC IIA en S1714 y S1943 en las vías de señalización de MAPK, AKT y FOXO. La sobreexpresión de MYH9 de tipo salvaje aumentó la fosforilación de AKT, ERK1/2 y FOXO3 en comparación con el control. En contraste, las mutaciones deficientes en fosfato (S1943A y S1714A) no lograron aumentar la fosforilación de estas proteínas. Tanto las mutaciones S1943A como S1714A también suprimieron la expresión de la ciclina A1/A2 al tiempo que aumentaron los niveles de ciclina E en relación con MYH9 de tipo salvaje (Figura 9A).

Examinamos más a fondo la relación entre la fosforilación de la NMHC IIA y la regulación de la vía Hippo. Las mutaciones S1943A y S1714A promovieron la fosforilación del regulador transcripcional asociado a Yes1 (YAP) y el coactivador transcripcional con motivo de unión a PDZ (TAZ), lo que resultó en una disminución de los niveles de proteína YAP. El tratamiento con LS-1-2 también mejoró la fosforilación de YAP (Figura 9B).

Los ensayos de precipitación de Rho GTPasa demostraron que la NMHC IIA de tipo salvaje mejoró significativamente la actividad de RhoA en las células HCT116, mientras que ambas mutaciones, S1943A y S1714A, inhibieron la activación de Rho. El tratamiento con LS-1-2 también suprimió sustancialmente la actividad de Rho en los ensayos celulares (Figura 9C-D).

La fosforilación de la NMHC IIA se correlaciona inversamente con el pronóstico y los resultados de la quimioterapia adyuvante en el CCRC

Evaluamos más a fondo la asociación entre la fosforilación de la NMHC IIA en S1943 y el pronóstico clínico. El análisis inmunohistoquímico reveló que la pS1943-miosina se localizaba tanto en la membrana celular como en el citoplasma de las células tumorales (Figura S8A). El examen de 12 muestras emparejadas de pacientes con y sin mutaciones de KRAS mostró niveles elevados de p-NMHC IIA en las muestras con mutaciones de KRAS (Figura S8B). El grado de fosforilación de la NMHC IIA se correlacionó positivamente con la etapa avanzada del TNM, la metástasis hepática (etapa M), la mala diferenciación y la expresión de CD44 (Tabla S9). La fosforilación elevada de la NMHC IIA en los tejidos tumorales se asoció significativamente con una reducción de la supervivencia global (p = 0,049, prueba de log-rank; Figura S8C). Además, el aumento de la fosforilación de la NMHC IIA se correlacionó con una menor supervivencia libre de enfermedad en pacientes con CCRC en etapa I-III (p = 0,04; Figura S8D).

Discusión

Hasta la fecha, con la excepción de los recientes éxitos en la focalización de la mutación relativamente poco común de KRAS-G12C en el CCRC, la focalización terapéutica de KRAS en el CCRC y otros cánceres ha tenido un progreso limitado ^[16]. Nuestro análisis de secuenciación de ARN de los PDO demostró que las mutaciones de KRAS impulsan la activación transcripcional global en todo el genoma, un hallazgo validado a nivel de célula única. Esta observación es consistente con informes anteriores ^[17]. La hipertranscripción se ha asociado con un peor pronóstico en varios tipos de tumores, incluido el CCRC ^[18].

Los modelos de cáncer derivados de pacientes, como los organoides y los PDX, se reconocen cada vez más como herramientas valiosas para el cribado de fármacos y el desarrollo de terapias contra el cáncer ^[19], ^[20]. En este estudio, utilizamos múltiples PDO derivados de CCRC metastásico refractario con mutaciones de KRAS como plataformas de cribado de fármacos. El cribado de una biblioteca de fármacos anticancerígenos aprobados por la FDA identificó el derivado de la acridina, amsacrina, como un potente inhibidor tanto de los PDO con mutaciones de KRAS como de las líneas celulares. Se sabe que los derivados de la acridona interactúan con múltiples dianas, incluidas las topoisomerasas, la telomerasa y las CDK. Estas interacciones interrumpen procesos oncogénicos clave, como la replicación del ADN, la transcripción, la señalización proliferativa y la estabilidad genómica, lo que en última instancia induce respuestas apoptóticas o citotóxicas en las células malignas ^[21].

Sintetizamos y examinamos una serie de nuevos derivados de la acridina para abordar las limitaciones en la penetración en los tumores sólidos y la tolerabilidad. Este esfuerzo identificó LS-1-2, un derivado de la acridina que demuestra una potente actividad antitumoral y antimetastásica contra el CCRC con mutaciones de KRAS tanto in vitro como en modelos in vivo. El análisis multi-ómico reveló que LS-1-2 modula significativamente la vía de señalización de FOXO. Los factores de transcripción de la familia de las cajas de horquilla O (FOXO) desempeñan funciones críticas en la regulación de la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la progresión del ciclo celular ^[22]. Una investigación más profunda demostró que LS-1-2 inhibe EGFR y las vías de señalización MAPK/ERK y PI3K/AKT posteriores, que son conocidos reguladores negativos de los factores de transcripción de FOXO.

Se descubrió que LS-1-2 suprime la expresión y la actividad quinasa de los principales reguladores del ciclo celular, incluidos PLK1, CDK2 y CDK4. Las mutaciones de KRAS impulsan una mayor transcripción global, lo que aumenta la dependencia celular de las proteínas esenciales del ciclo celular, como PLK1, los complejos de promoción de la anafase, los cop9 signalosomas y los componentes del proteasoma. Esta dependencia crea oportunidades para la letalidad sintética mediante la focalización de estos críticos reguladores del ciclo celular en las células con mutaciones de KRAS ^[23]. La evidencia preclínica y clínica respalda la inhibición de PLK1 como una prometedora estrategia terapéutica para el cáncer colorrectal con mutaciones de KRAS ^[24].

Los estudios mecanicistas revelaron que LS-1-2 se une directamente a la NMHC IIA e inhibe su fosforilación, suprimiendo así la activación de la vía Hippo. La NMHC II regula la motilidad celular a través de interacciones dinámicas con la actina F y los microtúbulos ^[25], y su activación aberrante promueve la progresión tumoral, lo que convierte a la NMHC II en una diana terapéutica en los cánceres invasivos ^[26]-^[30]. Se ha implicado la activación de la miosina II en la resistencia a los inhibidores de la vía MAPK, y esta resistencia puede superarse inhibiendo la actividad de la miosina II ^[31].

La fosforilación de la NMHC-IIA desempeña un papel fundamental en el ensamblaje y el desmontaje de la miosina, facilitando el reclutamiento de la NMHC-IIA en la lamela durante la expansión celular ^[32], ^[33]. En este estudio, observamos una fosforilación elevada de la NMHC-IIA en S1714 y S1943 en los tejidos de cáncer colorrectal, lo que se correlacionó con la progresión tumoral y la metástasis a distancia. La fosforilación en S1943 fue notablemente mayor en los tejidos de CCRC con mutaciones de KRAS en comparación con las muestras de tipo salvaje de KRAS. Los ensayos funcionales confirmaron que la fosforilación de la NMHC-IIA en S1943 y S1714 promueve la proliferación, la invasión y la migración de las células de CCRC.

Una investigación más profunda reveló que la fosforilación de la NMHC-IIA activa la vía de señalización de YAP y modula las vías de señalización de ERK, AKT y FOXO. La unión de LS-1-2 a la NMHC-IIA induce cambios conformacionales en la proteína, lo que resulta en una fosforilación alterada en S1943 y S1714 por parte de CK2A1.

Estudios anteriores han establecido que las vías PI3K/AKT y MAPK/ERK pueden ser moduladas por la activación de la señalización de Hippo. YAP mejora la fosforilación de AKT ^[34] y regula directamente al alza la expresión de Pik3cb a través de los factores de transcripción TEAD, activando así la vía PI3K-AKT ^[35]. Además, se ha demostrado que YAP1 induce la reactivación de ERK a través de la GTPasa relacionada con RAS, MRAS, tras el tratamiento con un inhibidor de KRAS G12C ^[36]. La reducción observada en la expresión y la actividad de ERK y AKT tras el tratamiento con LS-1-2 puede, por lo tanto, estar mediada por la inhibición de la señalización de YAP.

Se descubrió que trifluridina/tipiracil (TAS-102) recibió la aprobación de la FDA de EE. UU. en 2015 para el tratamiento del CCRC metastásico refractario. Como régimen de agente único para pacientes con CCRC metastásico refractario, TAS-102 ha demostrado una mejora moderada en la supervivencia global ^[37], ^[38]. En nuestra evaluación comparativa de la eficacia antimetastásica, LS-1-2 mostró una actividad comparable a la de TAS-102. En particular, el tratamiento con LS-1-2 no indujo pérdida de peso, mientras que se observó una reducción significativa del peso en el grupo de TAS-102.

Nuestros hallazgos también revelan una dimensión biológica adicional de la función de la NMHC IIA. Se ha implicado a la miosina IIA no muscular en el transporte de proteínas a las membranas biológicas, donde participa en diversos procesos, incluida la regulación de la exocitosis y la localización de orgánulos ^[39]. Estudios anteriores han demostrado que la NMIIA interactúa con RIPK1 para facilitar el transporte del complejo RIPK1-ceramida a la membrana plasmática, lo que conduce a la formación de grandes poros de membrana denominados ceramidosomas que median en el abultamiento de la membrana y la necroptosis ^[40]. En línea con estas observaciones, encontramos que LS-1-2 induce un fenotipo de muerte celular similar a la metuosis, lo que sugiere que su unión a la NMHC IIA interrumpe la integridad de la bicapa lipídica, promoviendo la formación de grandes vacuolas y la muerte celular necroptótica.

En conclusión, este estudio demuestra que las células de cáncer colorrectal con mutaciones de KRAS desarrollan un fenotipo de hipertranscripción que contribuye a la progresión agresiva del tumor. A través de un cribado farmacológico sistemático, identificamos un nuevo derivado de la acridina, LS-1-2, que suprime eficazmente el crecimiento y la metástasis del tumor impulsados por KRAS. Mecánicamente, LS-1-2 contrarresta la hipertranscripción oncogénica al inhibir la fosforilación de la NMHC IIA, reactivando así la vía supresora de tumores de FOXO y alterando la adicción transcripcional. Estos hallazgos establecen a LS-1-2 como un prometedor candidato preclínico para la focalización de las malignidades con mutaciones de KRAS que son adictas a la transcripción y proporcionan una base para la focalización terapéutica del eje NMHC IIA/FOXO en los cánceres asociados a la hipertranscripción.