Una nueva bacteria, Enterocloster sp. M3, promueve la tumorigénesis del cáncer colorrectal mediante la producción del carcinógeno estireno.

El cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud a nivel mundial, relacionado con la disbiosis intestinal, caracterizada por un aumento de las bacterias patógenas y una disminución de las bacterias beneficiosas. Estudios previos han demostrado el papel de diversas bacterias patógenas en la promoción del CCR, como Fusobacterium nucleatum, ^[1],^[2]
Escherichia coli con sintasas de policétidos (pks),^[3] y Bacteroides fragilis enterotoxigénica.^[4] Estas bacterias contribuyen al desarrollo del CCR al inducir inflamación, producir genotoxinas, modular las respuestas inmunitarias o alterar la integridad de la barrera epitelial intestinal. En nuestros estudios previos, identificamos un marcador de ADN bacteriano de 1935 pares de bases, denominado ‘m3’, obtenido mediante secuenciación metagenómica aleatoria, como un biomarcador prometedor para el diagnóstico del CCR y el adenoma.^[5],^[6] Sin embargo, la bacteria que porta el marcador m3 aún no ha sido cultivada. Con la aplicación generalizada del análisis metagenómico, se están identificando más bacterias no cultivadas y no clasificadas, como la que porta el marcador m3 asociado al CCR. Aislar y cultivar estas bacterias, junto con una mayor elucidación funcional, es esencial para obtener una comprensión más profunda de la compleja relación entre la disbiosis intestinal y el CCR.

La investigación previa ha destacado la participación de la microbiota intestinal en el metabolismo de carcinógenos, como la conversión del compuesto nitrosamina BBN (N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina) en el carcinógeno BCPN (N-butil-N-(3-carboxipropil)-nitrosamina).^[7] Ciertas bacterias producen enterotoxinas no proteicas, como tilivalina y tilimicina de especies específicas de Klebsiella, así como proteínas genotóxicas como la colibactina de E. coli con pks, que aumentan el riesgo de cáncer al causar daño en el ADN e inflamación.^[3,8,11] Sin embargo, no existen pruebas concluyentes de que las bacterias intestinales sinteticen directamente carcinógenos ambientales bien conocidos, como el estireno. En este estudio, aislamos la bacteria que porta el m3 (M3) e investigamos su función y mecanismos en la tumorigénesis colorrectal. Revelamos que M3 desempeña un papel crucial en la tumorigénesis colorrectal al producir directamente estireno y dilucidamos el mecanismo molecular subyacente a su síntesis directa, lo que arroja nueva luz sobre el papel de las bacterias intestinales en la salud y la enfermedad.

Resultados

La bacteria que porta el m3 (M3) está estrechamente relacionada, pero es distinta de Enterocloster aldenensis

Utilizando una estrategia de enriquecimiento selectivo en agar Columbia con un 5% de sangre de oveja, aislamos con éxito la cepa M3 de una mujer de 73 años con adenoma colónico (Figura 1A). La PCR de longitud completa y la secuenciación de Sanger confirmaron la presencia del marcador gen m3 en el aislado. La microscopía electrónica reveló que las células M3 tienen forma de bastón, no son flageladas y no forman esporas (Figura 1B). El análisis de ADN ribosomal 16S indicó que M3 está más estrechamente relacionada con Enterocloster aldenensis (Figura 1C). La secuenciación del genoma completo mostró una alta identidad promedio de nucleótidos (ANI) del 98,5% entre M3 y una cepa de referencia de E. aldenensis (Figura 1D). La biotipificación MALDI también clasificó a M3 como E. aldenensis, aunque con una puntuación inferior a la de la cepa tipo de E. aldenensis (Figura 1E). A pesar de esta alta similitud genética, la caracterización polifásica reveló varias distinciones clave: las células M3 son más pequeñas (0,4–0,7 µm de diámetro y 1,5–4,3 µm de longitud) que E. aldenensis (Figura 1F); las dos cepas difieren en sus perfiles de utilización de fuentes de carbono (Figura 1G); y, lo más importante, la PCR y el análisis del genoma completo confirmaron la ausencia completa de la secuencia de ADN m3 en E. aldenensis (Figura 1D y 1H). Basándonos en estas características fenotípicas y genéticas únicas, proponemos que M3 pertenece al género Enterocloster y puede representar una nueva cepa de E. aldenensis.

M3 promueve la tumorigénesis en el colon en ratones

Para investigar el papel funcional de M3 en el CCR, administramos M3 y E. aldenensis RMA 9741 a ratones Apcmin/+ y a ratones de tipo salvaje tratados con azoximetano (AOM), utilizando E. coli y PBS como controles. En ratones Apcmin/+, M3 no solo aumentó significativamente la incidencia y el tamaño del tumor de colon en comparación con los grupos de control, sino que también exhibió un efecto promotor del tumor más fuerte, aunque no estadísticamente significativo, en relación con E. aldenensis; M3 se detectó exclusivamente en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 2A). El examen histológico reveló una mayor incidencia de displasia y cáncer en los ratones tratados con M3 en comparación con los grupos de control y los tratados con E. aldenensis (Figura 2B). La PCR cuantitativa (qPCR) mostró un aumento gradual de la abundancia de M3 en las heces a lo largo del período de tratamiento en los ratones tratados con M3. Es importante destacar que la abundancia de M3 en las heces al final del estudio se correlacionó positivamente tanto con el número de tumores como con su tamaño (Figura 2C). En ratones de tipo salvaje tratados con AOM, M3 también promovió significativamente la incidencia y el tamaño del tumor de colon, como lo demuestra la colonización exclusiva de M3 en este grupo, mientras que E. aldenensis produjo solo una tendencia promotora no significativa (Figura 2D). El análisis histológico demostró además la mayor incidencia de cáncer y displasia en el grupo tratado con M3 (Figura 2E). La longitud del colon no diferió significativamente entre los grupos en ninguno de los modelos (Figura S1). Estos resultados indican que M3 dentro de la microbiota intestinal media directamente los efectos promotores del tumor.

Los metabolitos secretados por M3 promueven el crecimiento de las células del colon, los xenoinjertos tumorales y los organoides intestinales

Para determinar si los efectos oncogénicos de M3 están mediados por metabolitos secretados, tratamos células del colon, xenoinjertos subcutáneos y organoides intestinales humanos con sobrenadante de cultivo de M3, utilizando sobrenadante de E. coli y caldo como controles. El sobrenadante de M3 mejoró significativamente la proliferación y la capacidad de formación de colonias de las tres líneas celulares de cáncer de colon y la línea celular epitelial del colon inmortalizada NCM460 (Figura 3A y 3B), y también promovió las capacidades de migración e invasión de las células del cáncer de colon (Figura 3C). En los modelos de xenoinjertos subcutáneos, la inyección intratumoral de sobrenadante de M3 aceleró significativamente el crecimiento tumoral (Figura 3D). En particular, el sobrenadante de M3 también estimuló la expansión de organoides intestinales normales, como lo demuestra el aumento de las áreas de superficie tanto en cultivos diferenciados como no diferenciados (Figura 3E). Estos hallazgos indican colectivamente que M3 secreta metabolitos funcionales que median sus efectos oncogénicos.

M3 promueve la proliferación celular y altera la reparación del ADN al desregular la expresión génica del huésped

El análisis de secuenciación de ARN de las células de cáncer de colon tratadas con M3 reveló una desregulación significativa de los genes implicados en la respuesta al daño del ADN, la reparación del ADN (por ejemplo, la señalización de ATM) y la regulación del ciclo celular G1-S en las tres líneas celulares probadas, en comparación con los controles tratados con E. coli (Figura 4A). El análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo mostró que el sobrenadante de M3 aceleró la transición G1-S, acompañado de una reducción de la expresión del inhibidor del ciclo celular p21 y un aumento de la expresión de CDK6, ciclina D1 y Phospho-RB1, reguladores clave de la progresión G1-S (Figura 4B). La tinción con Ki-67 demostró además un aumento significativo de la población de células proliferantes en los organoides no diferenciados tratados con M3 (Figura 4C). En particular, los genes clave que se redujeron en estas vías, como Chk1, desempeñan un papel crucial en la reparación del ADN y el arresto del ciclo celular (Figura 4D). La inmunotransferencia e inmunohistoquímica mostraron de forma consistente que las formas fosforiladas activas de Chk1 (pChk1) se redujeron significativamente después del tratamiento con M3 en las células de cáncer de colon, los tejidos del colon de ratón no tumorales y los organoides intestinales humanos (Figura 4E y 4F; Figura S2). Estos hallazgos indican que los metabolitos de M3 ejercen efectos oncogénicos al acelerar la progresión del ciclo celular e inhibir la reparación del ADN.

La metabolómica dirigida y no dirigida identifica posibles metabolitos oncogénicos producidos por M3, en particular el estireno

Tras los experimentos de inactivación de proteínas que confirmaron que los componentes no proteicos median los efectos oncogénicos del sobrenadante de cultivo de M3 (Figura S3), realizamos un análisis metabolómico no dirigido mediante LC-MS. En comparación con los controles de caldo cultivado, identificamos 39 metabolitos aumentados y 76 disminuidos en el sobrenadante de M3 (VIP > 1, |Log2FC| > 0,5, q < 0,2; Figura 5A; Tabla S1). En particular, la mayoría de los metabolitos disminuidos (73,7%) fueron componentes del medio de cultivo presumiblemente consumidos por M3 (Figura 5B). Entre los metabolitos aumentados, ocho fueron particularmente prominentes: tres carcinógenos establecidos que se sabe que causan daño en el ADN y aumentan el riesgo de cáncer (estireno, 2,6-dimetilanilina y 2-aminonaftaleno); tres posibles metabolitos oncogénicos que se han informado previamente como elevados en las heces de pacientes con CCR (ácido quenodesoxicólico, norvalina y ácido piroglutámico); y dos metabolitos potencialmente relacionados con el estireno (fenilacetaldehído y 4-hidroxistireno) (Figura 5B; Figuras S4 y S5). Cuatro de estos se encontraban entre los diez metabolitos más aumentados en el sobrenadante de M3, incluido el estireno y sus dos derivados, así como la 2,6-dimetilanilina. Es interesante destacar que la tirosina, un posible intermedio aguas arriba en la biosíntesis del estireno, se encontraba entre los diez metabolitos más disminuidos (Figura 5C). Seleccionamos tres metabolitos para la validación utilizando LC/GC-MS dirigida, lo que confirmó aumentos significativos de estireno, 2,6-dimetilanilina y ácido piroglutámico en los sobrenadantes de M3 en comparación con los controles (E. coli, E. aldenensis y caldo) (Figura 5D; Figuras S6–8). El análisis de la vía KEGG reveló una disminución general de los metabolitos asociados con el metabolismo de la tirosina y la fenilalanina en el sobrenadante de M3, lo que podría estar relacionado con la producción de estireno (Figura 5E). En particular, también observamos un aumento general de los metabolitos asociados con la vía de degradación del estireno, incluido el estireno y sus metabolitos posteriores, fenilacetaldehído y lactato, lo que apoya aún más la presencia de estireno (Figuras 5E, S9). Estos hallazgos destacan la producción de metabolitos promotores de tumores por parte de M3, en particular el estireno.

Los metabolitos promotores de tumores están elevados en los metabolitos fecales de los ratones tratados con M3, siendo el estireno prominente

Extrajimos metabolitos de las heces de los ratones y evaluamos sus efectos sobre el crecimiento celular in vitro. Los metabolitos fecales de los ratones tratados con M3 promovieron significativamente la proliferación tanto de las células de cáncer de colon como de las células epiteliales NCM460 (Figura 6A), lo que indica la presencia de compuestos oncogénicos. El análisis metabolómico no dirigido y OPLS-DA posterior identificó 25 metabolitos aumentados y 18 disminuidos en las heces de los ratones tratados con M3 (VIP > 1, |log2FC| > 0,5, q < 0,2; Figura 6B; Tabla S2). En particular, cuatro metabolitos (estireno, fenilacetaldehído, ácido piroglutámico y uracilo) aumentaron tanto en los sobrenadantes de cultivo de M3 como en las heces de los ratones, lo que confirma su asociación directa con M3. Además del fenilacetaldehído, dos metabolitos posteriores del estireno (feniletilamina y ácido mandélico) se elevaron en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 6C; Figura S10), lo que apoya la conversión activa del estireno derivado de M3 por la microbiota intestinal y las enzimas del huésped (Figura 6D). La cuantificación GC-MS dirigida posterior en condiciones optimizadas (para evitar la evaporación del estireno) confirmó niveles significativamente más altos de estireno en las heces de los ratones tratados con M3 (0,263 ± 0,226 ng/mg) en comparación con los controles (0,060 ± 0,047 ng/mg) (Figura 6E; Figura S11). Esto corresponde a una exposición diaria media de estireno de 12,5 µg/kg de peso corporal en los ratones tratados con M3 (asumiendo un peso corporal de 21 g y una producción diaria de heces de 1 g), lo que supera la ingesta diaria tolerable establecida por la OMS para los humanos (7,7 µg/kg).^[12] Es importante destacar que los niveles de estireno en las heces se correlacionaron positivamente con la abundancia de M3 en los ratones tratados con M3 (Figura 6F). Estos hallazgos demuestran que M3 produce niveles biológicamente relevantes de estireno in vivo, lo que probablemente contribuye a sus efectos tumorigénicos observados.

El estireno está significativamente elevado en los metabolitos fecales de los pacientes humanos con CCR.

Es fundamental destacar que los metabolitos diferenciales identificados en el sobrenadante del cultivo M3 y en las heces de ratones tratados con M3 también se modificaron significativamente en las heces de pacientes humanos con CRC. Analizamos datos de metabolómica no dirigida mediante LC-MS de muestras de heces de pacientes con CRC de inicio tardío (≥ 50 años) y de inicio temprano (< 50 años) en comparación con controles de la misma edad.^[13] Tanto el estireno como su metabolito derivado, el fenilacetaldehído, se encontraron significativamente elevados en las heces de pacientes con CRC de inicio tardío y de inicio temprano (Figura 6G; Tabla S3). Entre estos, el estireno fue el más prominente, mostrando aumentos de 2,72 y 3,13 veces en pacientes con CRC de inicio tardío y de inicio temprano, respectivamente, en comparación con sus respectivos controles. Estos hallazgos sugieren que el estireno derivado de la microbiota intestinal puede contribuir a la carcinogénesis colorrectal humana.### Un sistema enzimático para la biosíntesis de estireno en M3 representa el primer informe de producción de estireno bacteriano.

Dado que el estireno es el metabolito más prominente identificado tanto en los cultivos M3 como en las heces de ratones a los que se les administró M3, es un producto bacteriano no reportado previamente. Por lo tanto, buscamos dilucidar su vía biosintética en M3. El análisis de la vía KEGG rastreó la conversión bacteriana de proteínas y azúcares dietéticos a fenilalanina, un precursor clave para el estireno, a través de las vías map00350 (metabolismo de la tirosina), map01063 (biosíntesis de alcaloides derivados de la vía del shikimato) y map00400 (biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano). Si bien se sabe que ciertos hongos convierten la fenilalanina en ácido trans-cinámico (tCA) y, posteriormente, en estireno a través de la fenilalanina amoníaco liasa (PAL) y la ferúlico ácido descarboxilasa (FDC),^[14],^[15] este proceso no se ha documentado en bacterias (Figura 7A).

Los análisis proteómicos y genómicos revelaron que M3 posee las ocho enzimas necesarias para la biosíntesis de fenilalanina a partir de proteínas y azúcares. Aunque estas enzimas exhiben más del 99% de homología de secuencia con sus contrapartes de E. aldenensis, la enzima clave, la tirosina fenol-liasa, fue más de 250 veces más abundante en M3 (Figura 7B; Tablas S4 y S5). Se observaron cambios metabólicos correspondientes (tirosina, fenilalanina y tCA) asociados con la biosíntesis de estireno en el sobrenadante de M3 en comparación con el caldo (Figura S12; Tabla S6). Curiosamente, a pesar de carecer de las enzimas PAL y FDC canónicas, M3 exhibió actividades significativamente mayores de conversión de PAL y de tCA a estireno que los controles de E. aldenensis y E. coli (Figura 7C), lo que sugiere la presencia de análogos funcionales en M3.### Nuevas enzimas AAL y UROD median pasos clave en la síntesis de estireno en M3

Integramos datos proteómicos y de genoma completo para identificar las enzimas responsables de la conversión de fenilalanina a estireno en M3. El análisis de las isoformas de PAL identificó tres amoníaco liasas en M3, entre las cuales solo la aspartato amoníaco liasa (AAL) mostró una expresión elevada en comparación con E. aldenensis (Figura 7D, Tablas S4 y S5). Cabe destacar que se ha demostrado que la AAL de Lactobacillus paracasei posee actividad similar a la PAL.^[16] Aunque la AAL de M3 comparte solo un 55,6% de similitud de secuencia con su contraparte de L. paracasei, conserva el mismo dominio funcional (Figura S13). Entre las descarboxilasas candidatas, la uroporfirinógeno descarboxilasa (UROD) surgió como el candidato principal para la enzima que convierte el tCA en estireno, con niveles de expresión significativamente más altos en M3 que en E. aldenensis y que contiene un residuo de Arg29 predicho y residuos adyacentes con carga positiva, que son críticos para el posicionamiento del grupo acetato (Figura 7E; Figura S14; Tablas S4 y S5).^[17]

La AAL recombinante de M3 exhibió una alta actividad similar a la PAL (convirtiendo la fenilalanina en tCA y amoníaco), que se redujo significativamente al aleatorizar la secuencia de consenso de 8 aminoácidos dentro del motivo de desaminación (Figura 7F; Figura S15). De manera similar, la UROD recombinante de M3 catalizó eficientemente la conversión de tCA a estireno, y esta actividad se vio significativamente afectada por las mutaciones en Arg29 y otros sitios de posicionamiento del acetato (Figura 7G; Figura S15). Es importante destacar que los extractos de proteínas de las heces de ratones tratados con M3 exhibieron una actividad significativamente mayor similar a la PAL (Figura 7H). Además, la actividad similar a la PAL se correlacionó positivamente con la abundancia de M3 en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 7I), lo que corrobora aún más la contribución de M3 a esta actividad enzimática. Estos resultados establecen colectivamente la base molecular para la primera síntesis bacteriana de estireno reportada por M3.

La bacteria que contiene m3 (M3) está estrechamente relacionada pero es distinta de Enterocloster aldenensis

Utilizando una estrategia de cultivo de enriquecimiento dirigida en agar Columbia con un 5% de sangre de oveja, aislamos con éxito la cepa M3 de una mujer de 73 años con adenoma colónico (Figura 1A). La PCR de longitud completa y el secuenciamiento de Sanger confirmaron la presencia del marcador del gen m3 en el aislado. La microscopía electrónica reveló que las células de M3 tienen forma de bastón, no son flageladas y no forman esporas (Figura 1B). El análisis del ARNr 16S indicó que M3 está más estrechamente relacionado con Enterocloster aldenensis (Figura 1C). El secuenciamiento del genoma completo mostró una alta identidad promedio de nucleótidos (ANI) del 98,5% entre M3 y una cepa de referencia de E. aldenensis (Figura 1D). La biotipificación MALDI también clasificó a M3 como E. aldenensis, aunque con una puntuación más baja que la cepa tipo de E. aldenensis (Figura 1E). A pesar de esta alta similitud genética, la caracterización polifásica reveló varias distinciones clave: las células de M3 son más pequeñas (0,4–0,7 µm de diámetro y 1,5–4,3 µm de longitud) que E. aldenensis (Figura 1F); las dos cepas difieren en sus perfiles de utilización de fuentes de carbono (Figura 1G); y, lo más importante, la PCR y el análisis del genoma completo confirmaron la ausencia completa de la secuencia de ADN m3 en E. aldenensis (Figura 1D y 1H). Con base en estas características fenotípicas y genéticas únicas, proponemos que M3 pertenece al género Enterocloster y puede representar una nueva cepa de E. aldenensis.

M3 promueve la tumorigénesis del colon en ratones

Para investigar el papel funcional de M3 en el CRC, administramos M3 y E. aldenensis RMA 9741 a ratones Apcmin/+ y a ratones de tipo salvaje tratados con azoximetano (AOM), utilizando E. coli y PBS como controles. En ratones Apcmin/+, M3 no solo aumentó significativamente la incidencia y el tamaño del tumor de colon en comparación con los grupos de control, sino que también exhibió un efecto promotor del tumor más fuerte, aunque no estadísticamente significativo, en relación con E. aldenensis; M3 se detectó exclusivamente en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 2A). El examen histológico reveló una mayor incidencia de displasia y cáncer en los ratones tratados con M3 en comparación con los grupos de control y tratados con E. aldenensis (Figura 2B). La PCR cuantitativa (qPCR) mostró un aumento gradual de la abundancia de M3 en las heces durante el período de tratamiento en los ratones tratados con M3. Es importante destacar que la abundancia de M3 en las heces al final del estudio se correlacionó positivamente tanto con el número de tumores como con el tamaño (Figura 2C). En ratones de tipo salvaje tratados con AOM, M3 nuevamente promovió significativamente la incidencia y el tamaño del tumor de colon, como lo evidenció la colonización exclusiva de M3 en este grupo, mientras que E. aldenensis produjo solo una tendencia promotora no significativa (Figura 2D). El análisis histológico demostró además la mayor incidencia de cáncer y displasia en el grupo tratado con M3 (Figura 2E). La longitud del colon no diferenció significativamente entre los grupos en ninguno de los modelos (Figura S1). Estos resultados indican que M3 dentro de la microbiota intestinal media directamente los efectos promotores del tumor.

Los metabolitos secretados por M3 promueven el crecimiento de las células del colon, los xenoinjertos tumorales y los organoides intestinales

Para determinar si los efectos oncogénicos de M3 están mediados por los metabolitos secretados, tratamos las células del colon, los xenoinjertos subcutáneos y los organoides intestinales humanos con el sobrenadante del cultivo de M3, utilizando el sobrenadante de E. coli y el caldo como controles. El sobrenadante de M3 mejoró significativamente la proliferación y la capacidad de formación de colonias de las tres líneas celulares de cáncer de colon probadas y la línea celular epitelial del colon inmortalizada NCM460 (Figura 3A y 3B), y también promovió las capacidades de migración e invasión de las células de cáncer de colon (Figura 3C). En los modelos de xenoinjertos subcutáneos, la inyección intratumoral del sobrenadante de M3 aceleró significativamente el crecimiento tumoral (Figura 3D). Es notable que el sobrenadante de M3 también estimuló la expansión de los organoides intestinales normales, como lo evidenció el aumento de las áreas de superficie en los cultivos diferenciados y no diferenciados (Figura 3E). Estos hallazgos indican colectivamente que M3 secreta metabolitos funcionales que median sus efectos oncogénicos.

M3 promueve la proliferación celular y altera la reparación del ADN al desregular la expresión génica del huésped

El análisis del secuenciamiento del ARN de las células de cáncer de colon tratadas con M3 reveló una desregulación significativa de los genes involucrados en la respuesta al daño del ADN, la reparación del ADN (por ejemplo, la señalización de ATM) y la regulación del ciclo celular G1-S en las tres líneas celulares probadas, en comparación con los controles tratados con E. coli (Figura 4A). El análisis del ciclo celular por citometría de flujo mostró que el sobrenadante de M3 aceleró la transición G1-S, acompañado de una expresión reducida del inhibidor del ciclo celular p21 y una mayor expresión de CDK6, ciclina D1 y Phospho-RB1, que son reguladores clave de la progresión G1-S (Figura 4B). El tinte de Ki-67 demostró además un aumento significativo de la población de células proliferantes en los organoides no diferenciados tratados con M3 (Figura 4C). Es notable que los genes clave que se redujeron en estas vías, como Chk1, desempeñan un papel crucial en la reparación del ADN y el arresto del ciclo celular (Figura 4D). El Western blot y la inmunohistoquímica mostraron constantemente que las formas fosforiladas activas de Chk1 (pChk1) se redujeron significativamente después del tratamiento con M3 en las células de cáncer de colon, los tejidos del colon de ratón no tumorales y los organoides intestinales humanos (Figura 4E y F; Figura S2). Estos hallazgos indican que los metabolitos de M3 ejercen efectos oncogénicos al acelerar la progresión del ciclo celular e inhibir la reparación del ADN.

La metabolómica dirigida y no dirigida identifica posibles metabolitos oncogénicos producidos por M3, notablemente el estireno

Tras los experimentos de inactivación de proteínas que confirmaron que los componentes no proteicos median los efectos oncogénicos del sobrenadante del cultivo M3 (Figura S3), realizamos un análisis metabolómico no dirigido mediante LC-MS. En comparación con los controles de caldo cultivado, identificamos 39 metabolitos aumentados y 76 disminuidos en el sobrenadante de M3 (VIP > 1, |Log2FC| > 0,5, q < 0,2; Figura 5A; Tabla S1). Cabe destacar que la mayoría de los metabolitos disminuidos (73,7 %) eran componentes del medio de cultivo, presumiblemente consumidos por M3 (Figura 5B). Entre los metabolitos aumentados, ocho fueron particularmente prominentes: tres carcinógenos establecidos que se sabe que causan daño en el ADN y aumentan el riesgo de cáncer (estireno, 2,6-dimetilanilina y 2-aminonaftaleno); tres posibles metabolitos oncogénicos que se informó previamente que estaban elevados en las heces de pacientes con CRC (ácido quenodesoxicólico, norvalina y ácido pirroglutámico); y dos metabolitos potencialmente relacionados con el estireno (fenilacetaldehído e 4-hidroxistireno) (Figura 5B; Figuras S4 y S5). Cuatro de estos se encontraban entre los diez metabolitos más aumentados en el sobrenadante de M3, incluido el estireno y sus dos derivados, así como la 2,6-dimetilanilina. Curiosamente, la tirosina, un posible intermediario aguas arriba en la biosíntesis de estireno, se encontraba entre los diez metabolitos más disminuidos (Figura 5C). Seleccionamos tres metabolitos para su validación utilizando LC/GC-MS dirigida, confirmando aumentos significativos de estireno, 2,6-dimetilanilina y ácido pirroglutámico en los sobrenadantes de M3 en comparación con los controles (E. coli, E. aldenensis y caldo) (Figura 5D; Figuras S6-8). El análisis de la vía KEGG reveló una disminución general de los metabolitos asociados con el metabolismo de la tirosina y la fenilalanina en el sobrenadante de M3, posiblemente relacionado con la producción de estireno (Figura 5E). Cabe destacar que también observamos un aumento general de los metabolitos asociados con la vía de degradación del estireno, incluido el estireno y sus metabolitos posteriores, el fenilacetaldehído y el lactato, lo que apoya aún más la presencia de estireno (Figuras 5E, S9). Estos hallazgos resaltan la producción de metabolitos promotores de tumores por parte de M3, en particular el estireno.

Los metabolitos promotores de tumores están elevados en las heces de ratones a los que se les administró M3, siendo el estireno el más prominente

Extraímos metabolitos de las heces de los ratones y evaluamos sus efectos sobre el crecimiento celular in vitro. Los metabolitos fecales de los ratones tratados con M3 promovieron significativamente la proliferación tanto de las células de cáncer de colon como de las células epiteliales NCM460 (Figura 6A), lo que indica la presencia de compuestos oncogénicos. El análisis metabolómico no dirigido y OPLS-DA posteriores identificaron 25 metabolitos aumentados y 18 disminuidos en las heces de los ratones tratados con M3 (VIP > 1, |log2FC| > 0,5, q < 0,2; Figura 6B; Tabla S2). Cabe destacar que cuatro metabolitos (estireno, fenilacetaldehído, ácido pirroglutámico y uracilo) aumentaron tanto en los sobrenadantes del cultivo M3 como en las heces de los ratones, lo que confirma su asociación directa con M3. Además del fenilacetaldehído, dos metabolitos posteriores adicionales del estireno (feniletilamina y ácido mandélico) se elevaron en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 6C; Figura S10), lo que apoya la conversión activa del estireno derivado de M3 por la microbiota intestinal y las enzimas del huésped (Figura 6D). La cuantificación GC-MS dirigida adicional en condiciones optimizadas (para evitar la evaporación del estireno) confirmó niveles significativamente más altos de estireno fecal en los ratones tratados con M3 (0,263 ± 0,226 ng/mg) en comparación con los controles (0,060 ± 0,047 ng/mg) (Figura 6E; Figura S11). Esto corresponde a una exposición diaria media de estireno de 12,5 µg/kg de peso corporal en los ratones tratados con M3 (asumiendo un peso corporal de 21 g y una producción diaria de heces de 1 g), lo que supera la ingesta diaria tolerable establecida por la OMS para los humanos (7,7 g/kg).^[12] Es importante destacar que los niveles de estireno fecal se correlacionaron positivamente con la abundancia de M3 en los ratones tratados con M3 (Figura 6F). Estos hallazgos demuestran que M3 produce niveles biológicamente relevantes de estireno in vivo, lo que probablemente contribuye a sus efectos tumorigénicos observados.

El estireno está significativamente elevado en los metabolitos fecales de pacientes humanos con CRC

De manera crucial, los metabolitos diferenciales identificados en el sobrenadante del cultivo M3 y en las heces de los ratones tratados con M3 también se alteraron significativamente en las heces de los pacientes humanos con CRC. Analizamos los datos de metabolómica LC-MS no dirigida de muestras de heces de pacientes con CRC de inicio tardío (≥ 50 años) y de inicio temprano (< 50 años) en comparación con controles de la misma edad.^[13] Tanto el estireno como su metabolito posterior, el fenilacetaldehído, se elevaron significativamente en las heces de los pacientes con CRC de inicio tardío y de inicio temprano (Figura 6G; Tabla S3). Entre estos, el estireno fue el más prominente, mostrando aumentos de 2,72 y 3,13 veces en los pacientes con CRC de inicio tardío y de inicio temprano, respectivamente, en comparación con sus controles correspondientes. Estos hallazgos sugieren que el estireno derivado de la microbiota intestinal puede contribuir a la carcinogénesis colorrectal humana.

Un sistema enzimático para la biosíntesis de estireno en M3 representa el primer informe de producción de estireno bacteriano

Dado que el estireno es el metabolito más prominente identificado tanto en los cultivos de M3 como en las heces de los ratones a los que se les administró M3, es un producto bacteriano no informado previamente. Por lo tanto, buscamos dilucidar su vía biosintética en M3. El análisis de la vía KEGG reveló una disminución general de los metabolitos asociados con el metabolismo de la tirosina y la fenilalanina en el sobrenadante de M3, posiblemente relacionado con la producción de estireno (Figura 5E). Cabe destacar que también observamos un aumento general de los metabolitos asociados con la vía de degradación del estireno, incluido el estireno y sus metabolitos posteriores, el fenilacetaldehído y el lactato, lo que apoya aún más la presencia de estireno (Figuras 5E, S9). Estos hallazgos resaltan la producción de metabolitos promotores de tumores por parte de M3, en particular el estireno.

Los análisis proteómicos y genómicos revelaron que M3 posee las ocho enzimas necesarias para la biosíntesis de fenilalanina a partir de proteínas y azúcares. Aunque estas enzimas exhiben más del 99 % de homología de secuencia con sus contrapartes de E. aldenensis, la enzima clave, la tirosina fenol-liasa, fue más de 250 veces más abundante en M3 (Figura 7B; Tablas S4 y S5). Los cambios metabólicos correspondientes (tirosina, fenilalanina y ácido trans-cinámico) asociados con la biosíntesis de estireno se observaron en el sobrenadante de M3 en comparación con el caldo (Figura S12; Tabla S6). Curiosamente, a pesar de carecer de las enzimas PAL y FDC canónicas, M3 exhibió actividades de conversión de tCA a estireno significativamente más altas que los controles de E. aldenensis y E. coli (Figura 7C), lo que sugiere la presencia de análogos funcionales en M3.

Las enzimas novedosas AAL y UROD median los pasos clave en la síntesis de estireno en M3

Integramos los datos proteómicos y del genoma completo para identificar las enzimas responsables de la conversión de fenilalanina a estireno en M3. El análisis de las isoformas de PAL identificó tres amoniaco-liasas en M3, entre las cuales solo la aspartato amoniaco-liasa (AAL) mostró una expresión elevada en comparación con E. aldenensis (Figura 7D, Tablas S4 y S5). Cabe destacar que se ha demostrado que la AAL de Lactobacillus paracasei posee actividad similar a la PAL.^[16] Aunque la AAL de M3 comparte solo un 55,6 % de similitud de secuencia con su contraparte de L. paracasei, conserva el mismo dominio funcional (Figura S13). Entre las descarboxilasas candidatas, la uroporfirinógeno descarboxilasa (UROD) surgió como el candidato principal para la enzima que convierte el tCA en estireno, con niveles de expresión significativamente más altos en M3 que en E. aldenensis y que contiene un residuo Arg29 predicho y residuos cargados positivamente adyacentes críticos para el posicionamiento del grupo acetato (Figura 7E; Figura S14; Tablas S4 y S5).^[17]

La AAL recombinante de M3 exhibió una alta actividad similar a la PAL (convirtiendo la fenilalanina en tCA y amoníaco), que se redujo significativamente al aleatorizar la secuencia de consenso de 8 aminoácidos dentro del motivo de desaminación (Figura 7F; Figura S15). De manera similar, la UROD recombinante de M3 catalizó eficientemente la conversión de tCA en estireno, y esta actividad se vio significativamente afectada por las mutaciones en Arg29 y otros sitios de posicionamiento del acetato (Figura 7G; Figura S15). Es importante destacar que los extractos de proteínas de las heces de los ratones tratados con M3 exhibieron una actividad similar a la PAL significativamente más alta (Figura 7H). Además, la actividad similar a la PAL se correlacionó positivamente con la abundancia de M3 en las heces de los ratones tratados con M3 (Figura 7I), lo que corrobora aún más la contribución de M3 a esta actividad enzimática. Estos resultados establecen colectivamente la base molecular para la primera síntesis bacteriana de estireno informada por M3.

Discusión

En este estudio, aislamos y caracterizamos con éxito una nueva cepa de Enterocloster, M3, y demostramos su papel promotor de tumores. M3 lleva el marcador de ADN m3 que nuestro grupo identificó previamente como un biomarcador diagnóstico para el CRC y los adenomas.^[6] Estos dos hallazgos se refuerzan mutuamente, lo que destaca la importancia de M3 tanto en la carcinogénesis colorrectal como en el diagnóstico. M3 exhibió amplios efectos promotores de tumores tanto in vitro como in vivo. Produjo directamente el carcinógeno conocido, el estireno, junto con otros posibles metabolitos oncogénicos, e inhibió las vías de reparación del daño del ADN del huésped y los genes relacionados. M3 generó altos niveles de estireno en el intestino del ratón, y también se detectaron niveles elevados de estireno en las heces de los pacientes con CRC, lo que subraya su posible papel en la carcinogénesis colorrectal.

Es importante destacar que dilucidamos la base molecular de la síntesis directa de estireno por parte de M3, que implica dos enzimas novedosas que no se informaron previamente en bacterias. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de la biosíntesis bacteriana de estireno, que antes solo se conocía como un carcinógeno ambiental humano.

El mecanismo carcinogénico del estireno está relativamente bien establecido. Aunque el propio estireno no es un carcinógeno potente, su metabolito, el óxido de estireno-7,8, actúa como un intermediario reactivo clave capaz de causar daño en el ADN e inducir mutaciones genéticas, lo que posiblemente inicia el desarrollo del cáncer.^[18] La investigación actual sobre el riesgo de cáncer relacionado con el estireno se ha limitado en gran medida a los estudios de exposición ocupacional. Los trabajadores de las industrias de plásticos reforzados y caucho de estireno-butadieno mostraron un mayor riesgo de leucemia, linfoma y otros cánceres linfoides.^[19] Algunas poblaciones de trabajadores expuestos al estireno también mostraron un mayor riesgo de cáncer de páncreas o esófago.^[20] Sin embargo, las inconsistencias en los estudios epidemiológicos pueden deberse a las medidas de protección generalmente eficaces en los entornos ocupacionales. Para la población general con exposición no ocupacional, las principales fuentes de estireno incluyen el tabaquismo, los envases de alimentos de poliestireno y las emisiones de muebles o escapes de vehículos. Los niveles de exposición de estas fuentes son típicamente bajos y no se considera que aumenten significativamente el riesgo de cáncer, lo que puede explicar el énfasis relativamente limitado en la carcinogénesis relacionada con el estireno en la salud pública. Cabe destacar que se ha demostrado que el estireno induce tumores pulmonares en múltiples modelos de ratón.^[21-24] Nuestro descubrimiento de la síntesis bacteriana directa de estireno cambia el enfoque de la exposición puramente ocupacional a la posible exposición intestinal. El nivel de estireno producido por M3 en el intestino del ratón superó el límite de seguridad de la OMS para los humanos. La exposición intestinal a largo plazo al estireno probablemente ejercerá efectos significativos sobre las células intestinales. El trabajo futuro se centrará en vincular directamente la producción bacteriana de estireno con los resultados genotóxicos en las células del huésped, como la formación de aductos de ADN específicos y las mutaciones del ADN. En consonancia con esto, observamos niveles significativamente elevados de estireno fecal en los pacientes con CRC en comparación con los controles sanos, lo que apoya aún más la participación del estireno derivado de la microbiota intestinal en la carcinogénesis colorrectal. La correlación directa entre la abundancia de M3 y el estireno fecal en los pacientes sigue siendo un objetivo para la validación futura.

Los niveles de estireno fecal fueron significativamente más altos tanto en pacientes con CRC de inicio tardío como en pacientes con CRC de inicio temprano, mostrando aumentos de 2,72 y 3,13 veces, respectivamente, en comparación con los controles de la misma edad. Sin embargo, la utilidad clínica del estireno fecal como biomarcador requiere superar varios desafíos técnicos: mejorar el manejo de las muestras para minimizar la pérdida de estireno durante la recolección y el procesamiento, y el desarrollo de plataformas de cuantificación simplificadas adecuadas para el diagnóstico de rutina. Si bien el ácido mandélico y el fenilacetaldehído en la orina se han establecido como biomarcadores in vivo para la exposición por inhalación de estireno,[25, 27] observamos de manera notable elevaciones concurrentes tanto de estireno como de fenilacetaldehído en las heces de ratones tratados con M3 y en pacientes con CRC. Este hallazgo sugiere que la detección de fenilacetaldehído fecal podría servir como un enfoque alternativo prometedor para evaluar la exposición intestinal al estireno.

Además del estireno, identificamos otros posibles metabolitos oncogénicos producidos por M3, incluido el ácido piroglutámico, el ácido quenodesoxicólico y la norvalina, todos los cuales se encontraron elevados en las heces de pacientes con CRC.[28, 30] En particular, el ácido piroglutámico aumentó tanto en el sobrenadante del cultivo de M3 como en las heces de ratones tratados con M3. Estudios previos han informado de niveles elevados de ácido piroglutámico en las heces de pacientes con síndrome del intestino irritable,^[31] así como en el suero de pacientes con cáncer de mama y colitis ulcerosa,[32, 33], lo que respalda el posible papel de M3 en el CRC a través de la producción de metabolitos oncogénicos.

Además, determinamos cómo M3 utiliza las proteínas y los azúcares de la dieta para sintetizar estireno. Los análisis proteómicos y genómicos confirmaron que M3 posee todas las enzimas necesarias para la biosíntesis de estireno. Se identificaron dos enzimas clave, AAL y UROD, que catalizan los pasos finales que convierten la fenilalanina en tCA y luego en estireno, y no se habían informado previamente en bacterias. Las mutaciones en los dominios estructurales críticos o en los sitios de unión al sustrato de estas enzimas redujeron significativamente su actividad. Aunque algunos hongos, como Penicillium camemberti y Saccharomyces cerevisiae, pueden convertir la fenilalanina en estireno, sus actividades enzimáticas informadas son bajas,[14, 15], lo que limita su relevancia para la tumorigénesis colorrectal. Aunque filogenéticamente relacionado con E. aldenensis, M3 exhibió efectos promotores del tumor más fuertes en modelos de ratón que la cepa tipo de E. aldenensis. Si bien E. aldenensis también contiene genes que codifican estas enzimas, sus niveles de expresión y actividades enzimáticas son más bajos que los de M3. En consecuencia, M3, pero no E. aldenensis, produce estireno en altas concentraciones, lo que destaca la singularidad de M3. Experimentos genéticos adicionales mediante la eliminación de estas enzimas in vivo e in vitro y la evaluación del nivel de estireno y los efectos promotores del tumor ayudarán a consolidar la importante contribución de la producción de estireno al efecto oncogénico de M3.

Si bien nuestro estudio demuestra la función promotora del tumor de M3 utilizando modelos de ratón convencionales, no puede excluir por completo los efectos indirectos mediados por la microbiota residente. Los estudios futuros que utilicen modelos germófobos podrían ayudar a dilucidar estas posibles contribuciones. También se necesita más investigación para comprender las diferencias pronunciadas en la expresión de genes casi idénticos entre E. aldenensis y M3. Además del estireno, M3 puede ejercer efectos oncogénicos a través de otros metabolitos oncogénicos y proteínas oncogénicas, lo que se investigará más a fondo. Nuestra futura investigación empleará análisis genómicos y proteómicos integrativos para identificar factores específicos de M3, altamente expresados e involucrados en la adhesión, la invasión y la promoción del tumor.

Este estudio revela el papel y el mecanismo de una nueva bacteria patógena en el CRC. Nuestro trabajo subraya la importancia de aislar y cultivar bacterias asociadas a enfermedades que antes no se cultivaban e investigar sus funciones para comprender de manera integral el papel de la microbiota intestinal en la salud y la enfermedad. Lo que es más importante, nuestros hallazgos proporcionan información pionera sobre cómo las bacterias intestinales sintetizan directamente carcinógenos y promueven una mayor exploración sobre si otras bacterias exhiben funciones similares. Estos resultados también destacan la necesidad de más investigación sobre M3 y el estireno derivado de la microbiota intestinal para desarrollar estrategias dirigidas para la prevención del CRC.

Métodos

Aislamiento y cultivo de M3

Las muestras de heces de pacientes con CRC o adenoma, que se confirmó que tenían una alta abundancia de m3 mediante qPCR, se utilizaron para el aislamiento de M3. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Clínica de The Joint Chinese University of Hong Kong, New Territories East Cluster (The Joint CUHK-NTEC CREC, CREC Ref. No: 2021.270). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes. Se utilizó agar Colombia con un 5% de sangre de oveja (PA-254005.06, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) para la selección de M3. Las placas se cultivaron en condiciones anaeróbicas (80% N2, 10% H2, 10% CO2) a 37 °C, siguiendo los métodos de cultivo de Lachnoclostridium.[34, 38] Los aislados de M3 se mantuvieron en agar Colombia enriquecido con un 5% de sangre de oveja.

Cepas bacterianas

Enterocloster aldenensis RMA 9741 se compró a DSMZ (19262, Alemania). La cepa Escherichia coli MG1655 (700926, ATCC, EE. UU.), una bacteria intestinal humana no patógena, se utilizó como control bacteriano. Ambas cepas se cultivaron en caldo Columbia (C0971, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) a 37 °C en condiciones aeróbicas.

Experimentos con animales

Los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo las pautas aprobadas por el Comité de Ética Animal de The Chinese University of Hong Kong (AEEC ref# 21-107-NSF) y en línea con las pautas ARRIVE.

Modelo de ratón Apcmin/+

Se aleatorizaron ratones Apcmin/+/+ C57BL/6J machos de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) en cuatro grupos y se les administró por sonda gástrica diariamente 1 × 109 unidades formadoras de colonias (UFC) de M3, E. aldenensis, E. coli_ MG1655 o un volumen igual de PBS (200 μL) durante 12 semanas. Se recolectaron muestras de heces semanalmente, 24 horas después de la administración previa. Se recolectaron los colones después de sacrificar los ratones. Todos los tejidos se almacenaron inmediatamente a -80 °C o se fijaron en formaldehído al 4%.

Modelo de cáncer inducido por carcinógenos

Se sometieron ratones C57BL/6 machos convencionales de cinco semanas de edad a seis inyecciones intraperitoneales consecutivas de azoximetano (AOM; 10 mg/kg) semanales, seguidas de la administración oral de 1 × 109 UFC de M3, E. aldenensis, E. coli MG1655 o un volumen igual de PBS (200 μL) cada 3 días durante 32 semanas para promover el desarrollo de lesiones neoplásicas. Se recolectaron los tejidos del colon después de sacrificar los ratones. Todas las muestras se almacenaron a -80 °C o se fijaron en formaldehído al 4% para su posterior procesamiento.

Modelo de ratón de xenoinjerto

Ratones desnudos machos de cuatro semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) recibieron una inyección subcutánea de HCT116 (2,5 × 106 en 0,2 mL de PBS) en el flanco derecho para establecer tumores de xenoinjerto. Después de 21 días de crecimiento tumoral, se aleatorizaron los ratones en tres grupos y se les administraron inyecciones intratumorales cada 3 días durante cuatro ciclos con 30 μL de sobrenadante de M3 al 5%, sobrenadante de E. coli al 5% o caldo en PBS.

Líneas celulares y condiciones de crecimiento

Las líneas celulares de cáncer de colon HT-29, HCT116 y Caco-2 se adquirieron de ATCC. La línea celular epitelial inmortalizada normal del colon NCM460 se obtuvo de INCELL (San Antonio, TX, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Waltham, MA) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB; Gibco) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Se confirmó que todas las células eran negativas para la contaminación por micoplasma.

Análisis metabolómicos no dirigidos

Se realizó un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) no dirigido utilizando un sistema Vanquish UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con una columna UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) conectado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Fisher Scientific). La anotación de metabolitos se realizó utilizando la base de datos MS2 de BiotreeDB (Biotree, Shanghái, China), la base de datos del metaboloma humano (HMDB, www.hmdb.ca) y la base de datos de metabolitos METLIN (metlin.scripps.edu). El enriquecimiento de vías y los análisis PLS-DA se realizaron utilizando la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) y la plataforma MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca/).

Proteómica cuantitativa sin etiquetas

Los gránulos bacterianos de M3 y E. aldenensis (dos cultivos independientes para cada uno) se disolvieron con tampón RIPA y se sonicaron sobre hielo durante 2 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a 4 °C para obtener la proteína en el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteínas BCA. Las proteínas totales se prepararon mediante digestión de proteínas y luego se separaron y analizaron utilizando un sistema EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific) acoplado a un instrumento Q Exactive HFX Orbitrap con una fuente de iones nanoelectrospray (Thermo Fisher Scientific). Los datos de MS brutos se procesaron utilizando el software Proteome Discoverer (versión 2.4.0.305) y se buscaron en la base de datos FASTA de UniProt de E. aldenensis (https://www.uniprot.org/taxonomy/358742; descargada en noviembre de 2022) utilizando el motor de búsqueda Sequest HT. Se permitió un máximo de 2 desgarramientos. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se estableció en 0,01 para los niveles de PSM y péptidos. La identificación de péptidos se realizó con una desviación de masa precursora inicial de hasta 10 ppm y una desviación de masa de fragmentos de 0,02 Da. Se utilizaron péptidos únicos y péptidos Razor para la cuantificación de proteínas y la cantidad total de péptidos para la normalización. Todos los demás parámetros se establecieron como valores predeterminados.

Análisis estadístico

Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar (DE) o mediana y cuartiles según la distribución. Se compararon dos grupos utilizando la prueba t no pareada o la prueba de Mann-Whitney U. Se compararon múltiples grupos utilizando ANOVA de una vía (prueba post hoc de Tukey) o Kruskal-Wallis (corrección de Dunn) con un umbral de significancia de p = 0,05 cuando corresponda. Se utilizó ANOVA de dos vías de medidas repetidas para comparar datos longitudinales. Se compararon las variables categóricas utilizando la prueba de Chi-cuadrado. Se realizaron correlaciones entre los niveles bacterianos y las características funcionales mediante el análisis de Pearson. Para los datos de secuenciación de ARN y los datos de metabolómica, se aplicó una prueba múltiple con el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamin y Hochberg, con valores p corregidos (valores q) < 0,05 y < 0,2 respectivamente considerados estadísticamente significativos. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando Graphpad Prism 9.4.1 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA) o el software estadístico MedCalc versión 22.021 (MedCalc Software Ltd, Ostende, Bélgica). La significación estadística se definió como un valor p bilateral de < 0,05.

Se proporcionan otros detalles y procedimientos experimentales adicionales en los Métodos suplementarios.

Aislamiento y cultivo de M3

Las muestras de heces de pacientes con CRC o adenoma, que se confirmó que tenían una alta abundancia de m3 mediante qPCR, se utilizaron para el aislamiento de M3. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Clínica de The Joint Chinese University of Hong Kong, New Territories East Cluster (The Joint CUHK-NTEC CREC, CREC Ref. No: 2021.270). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes. Se utilizó agar Colombia con un 5% de sangre de oveja (PA-254005.06, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) para la selección de M3. Las placas se cultivaron en condiciones anaeróbicas (80% N2, 10% H2, 10% CO2) a 37 °C, siguiendo los métodos de cultivo de Lachnoclostridium.[34, 38] Los aislados de M3 se mantuvieron en agar Colombia enriquecido con un 5% de sangre de oveja.

Cepas bacterianas

Enterocloster aldenensis RMA 9741 se compró a DSMZ (19262, Alemania). La cepa Escherichia coli MG1655 (700926, ATCC, EE. UU.), una bacteria intestinal humana no patógena, se utilizó como control bacteriano. Ambas cepas se cultivaron en caldo Columbia (C0971, Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) a 37 °C en condiciones aeróbicas.

Experimentos con animales

Se llevaron a cabo experimentos con animales siguiendo las directrices aprobadas por el Comité de Ética Animal de la Universidad China de Hong Kong (AEEC ref# 21-107-NSF) y en consonancia con las directrices ARRIVE.

Modelo de ratón Apcmin/+

Se asignaron aleatoriamente ratones macho C57BL/6J de seis semanas de edad (Apcmin/+) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a cuatro grupos y se les administró por sonda gástrica diariamente 1 × 109 unidades formadoras de colonias (UFC) de M3, E. aldenensis, E. coli_ MG1655 o un volumen equivalente de PBS (200 μL) durante 12 semanas. Se recogieron muestras de heces semanalmente, 24 horas después de la administración previa. Los colones se recogieron después de sacrificar los ratones. Todos los tejidos se almacenaron inmediatamente a -80 °C o se fijaron en un 4% de paraformaldehído.

Modelo de cáncer inducido por carcinógenos

Se sometieron ratones macho C57BL/6 salvajes convencionales de cinco semanas de edad a seis inyecciones intraperitoneales consecutivas de azoximetano (AOM; 10 mg/kg) semanales, seguidas de la administración oral de 1 × 109 UFC de M3, E. aldenensis, E. coli MG1655 o un volumen equivalente de PBS (200 μL) cada 3 días durante 32 semanas para promover el desarrollo de lesiones neoplásicas. Los tejidos cólicos se recogieron después de sacrificar los ratones. Todos los especímenes se almacenaron a -80 °C o se fijaron en un 4% de paraformaldehído para su posterior procesamiento.

Modelo de ratón xenógeno

Ratones desnudos macho de cuatro semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) recibieron una inyección subcutánea de HCT116 (2,5 × 106 en 0,2 mL de PBS) en el flanco derecho para establecer tumores xenógenos. Después de 21 días de crecimiento tumoral, se asignaron aleatoriamente los ratones a tres grupos y se les administraron inyecciones intratumorales cada 3 días durante cuatro ciclos con 30 μL de sobrenadante de M3 al 5%, sobrenadante de E. coli al 5% o caldo al 5% en PBS.

Líneas celulares y condiciones de crecimiento

Las líneas celulares de cáncer de colon HT-29, HCT116 y Caco-2 se adquirieron de ATCC. La línea celular epitelial inmortalizada normal del colon NCM460 se obtuvo de INCELL (San Antonio, TX, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Waltham, MA) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB; Gibco) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Se confirmó que todas las células eran negativas para la contaminación por micoplasma.

Análisis metabolómico no dirigido

Se realizó un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) no dirigido utilizando un sistema Vanquish UHPLC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con una columna UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) conectada a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120 (Thermo Fisher Scientific). La anotación de metabolitos se realizó utilizando la base de datos BiotreeDB MS2 (Biotree, Shanghái, China), la base de datos del metaboloma humano (HMDB, www.hmdb.ca) y la base de datos de metabolitos METLIN (metlin.scripps.edu). El enriquecimiento de vías y los análisis PLS-DA se realizaron utilizando la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) y la plataforma MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca/).

Proteómica cuantitativa sin etiquetas

Los gránulos bacterianos de M3 y E. aldenensis (dos cultivos independientes para cada uno) se disolvieron con tampón RIPA y se sonicaron sobre hielo durante 2 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a 4 °C para obtener la proteína en el sobrenadante. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA. Las proteínas totales se prepararon mediante digestión de proteínas y posteriormente se separaron y analizaron utilizando un sistema EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific) acoplado a un instrumento Q Exactive HFX Orbitrap con una fuente de iones nanoelectrospray (Thermo Fisher Scientific). Los datos brutos de MS se procesaron utilizando el software Proteome Discoverer (versión 2.4.0.305) y se buscaron en la base de datos UniProt FASTA de E. aldenensis (https://www.uniprot.org/taxonomy/358742; descargada en noviembre de 2022) utilizando el motor de búsqueda Sequest HT. Se permitió un máximo de 2 clivajes perdidos. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se estableció en 0,01 para los niveles de PSM y péptidos. La identificación de péptidos se realizó con una desviación inicial de masa precursora de hasta 10 ppm y una desviación de masa de fragmentos de 0,02 Da. Se utilizaron péptidos únicos y péptidos Razor para la cuantificación de proteínas y la cantidad total de péptidos para la normalización. Todos los demás parámetros se establecieron como predeterminados.

Análisis estadístico

Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar (DE) o mediana y cuartiles según la distribución. Se compararon dos grupos utilizando la prueba t de Student no pareada o la prueba de Mann-Whitney U. Se compararon múltiples grupos utilizando ANOVA de una vía (prueba post hoc de Tukey) o Kruskal-Wallis (corrección de Dunn) con un umbral de significación de p = 0,05 cuando fue apropiado. Se utilizó ANOVA de dos vías de medidas repetidas para comparar datos longitudinales. Se compararon las variables categóricas utilizando la prueba de Chi-cuadrado. Las correlaciones entre los niveles bacterianos y las características funcionales se realizaron mediante el análisis de Pearson. Para los datos de secuenciación de ARN y los datos de metabolómica, se aplicó una prueba múltiple con el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamin y Hochberg, con valores p corregidos (valores q) < 0,05 y < 0,2 respectivamente considerados estadísticamente significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism 9.4.1 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA) o MedCalc Statistical Software versión 22.021 (MedCalc Software Ltd, Ostende, Bélgica). La significación estadística se definió como un valor p bilateral de < 0,05.

Otros detalles y procedimientos experimentales adicionales se proporcionan en los Métodos suplementarios.