Nuevos Metabólicos Esteroideos Homo-Aza (Láctam) Activos para el Tratamiento del Cáncer Pancreático y Colorrectal Humano.

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, y es responsable de millones de muertes cada año, a pesar de los importantes avances en el diagnóstico y la terapia. Los avances recientes en la medicina moderna han acelerado el desarrollo de terapias dirigidas. Sin embargo, para muchos tipos de cáncer, la quimioterapia sigue siendo la base del tratamiento. El cáncer colorrectal y el cáncer de páncreas son comunes y letales, y la quimioterapia (incluido el 5-fluorouracilo y la gemcitabina) todavía se utiliza en el entorno neoadyuvante o adyuvante [^[1],^[2]]. La eficacia de los agentes quimioterapéuticos convencionales a menudo se ve obstaculizada por varias limitaciones intrínsecas, que incluyen una escasa solubilidad acuosa, falta de selectividad, toxicidad sistémica y el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos. En consecuencia, existe una necesidad continua de nuevas entidades moleculares capaces de ejercer una potente actividad antineoplásica al tiempo que presentan perfiles farmacológicos y farmacocinéticos mejorados. Esto incluye moléculas que ya se utilizan para indicaciones no oncológicas (por ejemplo, agonistas del receptor GLP-1 [^[3]]) o moléculas de origen natural (como los cannabinoides [^[4]]).

Los extensos estudios realizados en las últimas décadas han demostrado la amplia aplicabilidad de la conjugación en diversos ámbitos terapéuticos, que van desde la administración dirigida de fármacos y la obtención de imágenes hasta la inhibición enzimática y la terapia contra el cáncer [^[5]]. Mediante esta técnica, se pueden unir dos o más moléculas diferentes con perfiles muy diversos, formando una "conjugación", que a su vez conlleva los efectos de ambas moléculas.

Entre las clases de agentes anticancerígenos más eficaces se encuentran los análogos de purina y pirimidina, que actúan como antimetabolitos, interfiriendo con la síntesis y la reparación de los ácidos nucleicos [^[6]]. Estos compuestos se asemejan estructuralmente a las nucleobases o nucleósidos endógenos y se incorporan a las vías metabólicas celulares, interrumpiendo así los procesos bioquímicos esenciales necesarios para la replicación del ADN y la transcripción del ARN. Su mecanismo de acción suele implicar la inhibición de enzimas clave, como la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR) [^[7]].

Los análogos de pirimidina, incluido el 5-fluorouracilo (5-FU), la citarabina (Ara-C) y la gemcitabina, siguen siendo agentes fundamentales en el tratamiento de una variedad de tumores sólidos y neoplasias hematológicas [^[8]]. Su eficacia terapéutica se debe en gran medida a la incorporación de bases de pirimidina modificadas en el ADN o el ARN, lo que da como resultado la terminación de la cadena o la inhibición enzimática. De manera similar, los análogos de purina, como la 6-mercaptopurina, la 6-tioguanina, la cladribina y la fludarabina, han demostrado una actividad pronunciada contra las leucemias y los linfomas al imitar los metabolitos de purina e interferir con la función de la ADN polimerasa [^[9]]. Sin embargo, sus principales inconvenientes incluyen la toxicidad sistémica y la falta de selectividad, lo que provoca la muerte de células cancerosas y células sanas.

Para reducir la toxicidad, la idea de combinar estas moléculas con portadores lipofílicos puede reducir la toxicidad y posiblemente mejorar la administración intracelular de los agentes quimioterapéuticos. Entre los numerosos andamios explorados, los conjugados esteroideos han atraído una atención significativa debido a la actividad biológica intrínseca del andamio esteroideo y su capacidad para mejorar la permeabilidad de la membrana, la estabilidad metabólica y la selectividad tisular. La combinación de un núcleo esteroideo con fragmentos farmacológicamente activos ha surgido, por lo tanto, como una estrategia prometedora para generar moléculas multifuncionales con un potencial terapéutico superior [^[10]]. Basándose en este concepto, se han desarrollado numerosos conjugados esteroideos mediante la unión covalente del andamio esteroideo a varios farmacóforos citotóxicos, incluidos los análogos de nucleósidos [^[11]], los complejos organometálicos (cisplatino [^[12],^[13]] u otros [^[14],^[15]]), las mostazas nitrogenadas [^[16]], las nitrosureas [^[17]], los taxoles [^[18]] y los derivados de antraciclina [^[19],^[20],^[21]], así como los derivados de carbohidratos (glucósidos [^[22]] o saponinas [^[23]]). Los compuestos híbridos que utilizan andamios de pirazolina-tiazol han demostrado ser prometedores [^[24]], mientras que los nuevos derivados de tiazol hibridizados con indenoquinoxalina fluorada como inhibidores duales dirigidos a VEGFR2/AKT han demostrado ser prometedores contra el carcinoma hepatocelular [^[25]]. Nuestro equipo en particular ha tenido una amplia experiencia a lo largo de los años en el desarrollo de diferentes moléculas, como la combinación de esteroides con las mostazas nitrogenadas [^[16],^[26],^[27],^[28]] y los homo-aza esteroides [^[28],^[29],^[30],^[31]].

La timidilato sintasa (TS) es una enzima fundamental en la síntesis de novo de timidilato (dTMP), un precursor esencial para la replicación y la reparación del ADN [^[32]]. La TS cataliza la metilación reductiva del 2C-desoxiuridina-5C-monofosfato (dUMP) a 2C-desoxitimidina-5C-monofosfato (dTMP), utilizando el 5,10-metilenotetrahidrofolato como cofactor (una fuente de un grupo metilo de un carbono). El dTMP sufre dos fosforilaciones posteriores, generando el precursor de la síntesis de ADN, el 2C-desoxitimidina-5C-trifosfato (dTTP). Dado que esta vía constituye la única fuente de dTTP, la TS ha surgido como un objetivo terapéutico crucial en la quimioterapia contra el cáncer. En las células cancerosas que proliferan rápidamente, la elevada actividad de la TS favorece la continua síntesis de ADN y contribuye a la resistencia contra los agentes citotóxicos. La inhibición de la TS constituye la piedra angular de la terapia antimetabolítica en las neoplasias gastrointestinales [^[33],^[34]]. Los agentes como el 5-fluorouracilo (5-FU) y su profármaco, la capecitabina, ejercen su efecto citotóxico al formar complejos ternarios estables con la TS, lo que reduce los niveles de timidilato e induce un daño letal en el ADN.

Otro objetivo terapéutico crítico en la enfermedad cancerosa es la vía del folato, donde la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) lleva a cabo la reducción del dihidrofolato a tetrahidrofolato (THF) utilizando NADPH. La presencia del cofactor THF es de suma importancia, ya que contribuye a la biosíntesis de purinas, pirimidinas (incluido el timidilato) y varios aminoácidos. El papel de la DHFR en la síntesis de precursores esenciales para la proliferación celular ha convertido a la enzima en un objetivo atractivo para varios fármacos anticancerígenos, como la aminopterina, el metotrexato (MTX), el pralatrexato y el trimetrexato [^[35],^[36],^[37]].

Basándose en estos andamios moleculares establecidos, el diseño de nuevos conjugados de purina y pirimidina homo-aza (lactama) esteroideos representa una vía prometedora para el desarrollo de la próxima generación de agentes quimioterapéuticos. Al combinar la actividad antimetabolítica derivada de la nucleobase con las propiedades lipofílicas, permeables a la membrana y potencialmente selectivas para los tejidos y de orientación a las células cancerosas a nivel molecular de los andamios lactámicos esteroideos, estos híbridos pueden superar los principales inconvenientes de los agentes clásicos, a saber, la escasa selectividad, la rápida eliminación y la toxicidad sistémica. En particular, el direccionamiento de ambas enzimas clave, como la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR), mediante la conjugación lactámica esteroidea podría potenciar la eficacia citotóxica al tiempo que mejora el comportamiento farmacocinético.

El objetivo del presente estudio fue diseñar, sintetizar y evaluar biológicamente una nueva serie de híbridos antimetabolíticos homo-aza (lactámicos) esteroideos dirigidos a enzimas clave de la biosíntesis de nucleótidos, a saber, la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR). Buscamos evaluar sus efectos citostáticos y citotóxicos en modelos de cáncer colorrectal y de páncreas, investigar las alteraciones de la apoptosis y del ciclo celular y explorar si los parámetros de acoplamiento in silico se correlacionan con la actividad biológica in vitro.

2. Resultados

2.1. La actividad citostática y citotóxica in vitro de los antimetabolitos lactámicos esteroideos: ensayo MTT

Se llevó a cabo el cribado de fármacos in vitro de los nuevos antimetabolitos lactámicos esteroideos. Se evaluaron los efectos citostáticos y citotóxicos de los antimetabolitos lactámicos esteroideos sintetizados (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en comparación con los antimetabolitos de referencia, el 5-fluorouracilo (5-FU), el metotrexato (MTX) y la gemcitabina (GEM), utilizando el ensayo MTT en líneas de carcinoma de páncreas (Hup-T3, Panc 03.27, Panc 08.13) y de cáncer colorrectal (LoVo, HT-29, LS174T, SW403). Los resultados se muestran en la Tabla 1, la Tabla 2 y la Tabla 3.

Entre los compuestos de referencia, el 5-FU exhibió una potente actividad citostática en las líneas de adenocarcinoma gastrointestinal y pancreático probadas, con valores de GI50 que oscilaron entre 13 y 36,5 µM, y los efectos más pronunciados se observaron en las líneas HT-29 (13 µM) y Panc 03.27 (18 µM) (p < 0,01 frente al control). El compuesto alcanzó la inhibición total del crecimiento (TGI) a concentraciones entre 48 y 82 µM en las líneas más sensibles, mientras que los valores de IC50 generalmente superaron los 250 µM, lo que indica un mecanismo predominantemente citostático en lugar de citotóxico. Las líneas LoVo y LS174T demostraron una resistencia relativa, lo que requirió dosis más altas para una inhibición significativa del crecimiento (p < 0,05).

El MTX mostró una actividad antiproliferativa moderada, con valores de GI50 que oscilaron entre 6,2 y 55 µM, lo que indica una sensibilidad variable en el panel (p < 0,05). Los efectos más pronunciados se observaron en SW403 (GI50 = 6,2 µM) y HT-29 (8,5 µM), seguidos de LoVo y LS174T (18-20 µM). Se logró una supresión completa del crecimiento (TGI) a concentraciones de 126-220 µM, con valores de IC50 que superaron los 250 µM en casi todas las líneas celulares. Estos datos confirman que el MTX actúa principalmente a través de la detención del crecimiento antimetabolítica, en lugar de inducir una citotoxicidad extensa en el período de exposición probado.

La gemcitabina (GEM) demostró la mayor potencia citostática general entre los fármacos de referencia, con valores de GI50 tan bajos como 10 µM en las células HT-29 y SW403, y una actividad moderada en otras líneas (11-20 µM). Los valores de TGI oscilaron entre 18 y 64 µM, mientras que los umbrales citotóxicos (IC50) fueron consistentemente altos (>250 µM), excepto para SW403 (25 µM), donde la gemcitabina mostró una citotoxicidad notable (p < 0,01 frente al control y frente al MTX). Estos hallazgos se ajustan al mecanismo conocido de la gemcitabina como análogo de nucleósido, que induce tanto el bloqueo de la síntesis de ADN como la apoptosis a concentraciones más altas.

Considerados en conjunto, los fármacos de referencia mostraron una potencia citostática clasificada de GEM > 5-FU > MTX, lo que fue consistente en la mayoría de las líneas de cáncer colorrectal y de páncreas. La comparación estadística confirmó la superioridad de la gemcitabina en la reducción de la proliferación celular (p < 0,001 frente al MTX, p < 0,05 frente al 5-FU). Sin embargo, el 5-FU exhibió una mayor eficacia en todo el espectro celular, mientras que los efectos del metotrexato fueron más selectivos. La ausencia de una citotoxicidad pronunciada (IC50 > 250 µM en la mayoría de los casos) para los tres sugiere que su acción dominante en las condiciones probadas fue antiproliferativa, no lítica.

b. Entre los nuevos compuestos sintetizados, GE23 mostró una actividad antiproliferativa moderada, con valores de GI50 que oscilaron entre 73 µM (Panc 03.27) y 130 µM (Hup-T3) en las células pancreáticas y entre 24 y 100 µM en las líneas de cáncer colorrectal. Su efecto fue principalmente citostático, ya que los valores de IC50 superaron los 250 µM en todos los casos. La modesta actividad en Panc 03.27 y LoVo sugiere cierta sensibilidad en las células que albergan mutaciones KRAS G12V/G13D, pero la potencia inhibidora general siguió siendo menor en comparación con CS18 o CS23 (p < 0,05). Estos hallazgos indican que GE23, aunque activo, requiere concentraciones más altas para una supresión del crecimiento comparable y puede servir como línea de base estructural en la serie.

CS18 demostró una actividad mejorada en comparación con GE23, con valores de GI50 que oscilaron entre 50 y 80 µM en las líneas pancreáticas y entre 32 y 90 µM en los modelos de cáncer colorrectal. En particular, CS18 mostró una potente inhibición en HT-29 (GI50 = 32 µM) y SW403 (GI50 = 54 µM), ambas que albergan mutaciones de KRAS y PIK3CA, lo que sugiere una mayor afinidad por las células que proliferan rápidamente o que presentan una desregulación de la señalización. Aunque la citotoxicidad siguió siendo limitada (IC50 > 200 µM), el compuesto logró valores de GI50 significativamente más bajos que GE23 (p < 0,05), lo que indica una mayor eficiencia citostática.

CS23 surgió como el compuesto más activo de la serie de lactamas esteroideas. Mostró bajos valores de GI50 en casi todas las líneas celulares: 10 µM en Panc 03.27, 30 µM en LoVo y 52 µM en SW403, superando tanto a CS18 como a GE23 (p < 0,01). Además, su actividad consistente en líneas celulares de cáncer de páncreas y de colon sugiere un potencial antiproliferativo y una actividad citotóxica de amplio espectro. Si bien los valores de IC50 se mantuvieron por encima de 100 µM, sus valores de TGI (48–128 µM) indicaron una supresión eficaz del crecimiento celular. En general, CS23 exhibe una alta potencia citostática, con potentes efectos citotóxicos observados a concentraciones más altas, lo que la convierte en una molécula líder prometedora.

KA44 mostró una inhibición selectiva para las células, pero muy potente, particularmente en LoVo (GI50 = 3,5 µM) y HT-29 (GI50 = 4 µM), superando a 5-FU y GEM (p < 0,001). Su eficacia disminuyó notablemente en otras líneas, lo que indica una selectividad molecular hacia genotipos específicos o condiciones microambientales (por ejemplo, perfiles de mutación de BRAF). A pesar de su fuerte actividad citostática, los valores de IC50 se mantuvieron por encima de 250 µM, lo que confirmó un mecanismo no citotóxico a niveles terapéuticos. El patrón de potencia distinto de KA44 sugiere un modo de acción diferente al de las lactamas esteroideas, posiblemente relacionado con la cinética de interacción del ADN o de las enzimas en lugar de la conjugación estructural.

MV16 exhibió una actividad variable pero notable en Panc 03.27 (GI50 = 13,2 µM) y SW403 (GI50 = 12 µM), mostrando una inhibición selectiva de las líneas con mutación de KRAS, mientras que la actividad disminuyó en otras (>40 µM). El rango de TGI (30–230 µM) y la ausencia de una citotoxicidad marcada sugieren una supresión citostática reversible. En comparación con KA44, MV16 mostró un perfil de inhibición más amplio pero menos pronunciado, lo que sugiere una interferencia multi-objetivo en lugar de una fuerte unión a un único sitio enzimático. Las diferencias entre MV16 y KA44 fueron estadísticamente significativas en LoVo y HT-29 (p < 0,05).

Al compararse entre todos los compuestos, CS23 y KA44 demostraron la mayor actividad antiproliferativa general. Los valores de GI50 consistentemente bajos de CS23 en múltiples líneas celulares de cáncer de páncreas y colon subrayan su efecto citostático y citotóxico amplio y equilibrado, mientras que los valores de GI50 excepcionalmente bajos de KA44 en líneas celulares específicas apuntan a una potencia dirigida. El análisis estadístico confirmó que ambos compuestos exhibieron una inhibición significativamente mayor en comparación con los fármacos de referencia (p < 0,01 frente a 5-FU; p < 0,05 frente a GEM).

CS18 se clasificó en segundo lugar, ofreciendo una potencia intermedia favorable con una amplia aplicabilidad y una selectividad moderada, mientras que GE23 sirvió como un análogo estructural menos activo. MV16, aunque variable, mostró una selectividad prometedora hacia los tumores impulsados por KRAS y puede justificar una mayor exploración en este contexto genético.

En general, los nuevos análogos de lactamas esteroideas demostraron fuertes efectos citostáticos reproducibles, comparables o superiores a los antimetabolitos clásicos, al tiempo que mantienen perfiles de baja citotoxicidad.

2.2. Índice terapéutico y selectividad hacia las células cancerosas

Para evaluar aún más la selectividad de los compuestos probados hacia las células malignas frente a las células no transformadas, se determinaron los valores de GI50 en tres líneas celulares humanas normales (FHC, CCD-112CoN y MRC-5) y se calcularon las relaciones del índice terapéutico (IT).

Los antimetabolitos conocidos MTX, 5-FU y GEM, así como los compuestos GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16, se probaron para la actividad citostática y citotóxica contra las tres líneas celulares humanas normales (FHC, CCD-112CoN y MRC-5) y mostraron TGI e IC50 > 250 µM.

Como se muestra en la Tabla 4, todos los híbridos esteroideos exhibieron valores medios de GI50 significativamente más altos en las células normales (468–568 µM) en comparación con los antimetabolitos clásicos, lo que indica una actividad citostática reducida en los tejidos no transformados en las mismas condiciones experimentales.

Los valores del índice terapéutico (IT) se calcularon como la relación entre el valor medio de GI50 en las células normales y el GI50 en cada línea celular tumoral. Este análisis reveló que varios híbridos esteroideos mostraron valores de IT favorables y, en algunos casos, significativamente elevados en modelos de cáncer específicos (Tabla 5). En particular, KA44, CS23 y MV16 exhibieron los valores medios de IT más altos en todo el panel de tumores, lo que refleja una actividad citostática preferencial en las células malignas en relación con las células normales.

Los compuestos experimentales KA44, CS23 y MV16 exhibieron los índices terapéuticos más altos entre todos los compuestos probados (en ese orden). Basándose en los valores de IT muy altos que se generaron a partir de KA44, CS23 y MV16 en líneas celulares tumorales específicas, lo que indica una especificidad dirigida y una alta sensibilidad, es de gran interés terapéutico explorar los mecanismos moleculares responsables de este fenómeno. Cabe destacar que los valores de IT excepcionalmente altos observados en ciertas líneas celulares (por ejemplo, KA44 en células LoVo) se debieron a una combinación de valores de GI50 muy bajos en las células tumorales y valores de GI50 altos en las células normales, lo que indica una sensibilidad específica de la línea celular en lugar de una selectividad uniforme en todos los modelos.

2.3. El efecto del derivado de lactama esteroidea antimetabolito CS23 sobre la apoptosis

Se realizó un análisis citométrico de flujo para determinar si los efectos citotóxicos del análogo de pirimidina esteroidea CS23 estaban asociados con la inducción de la apoptosis. Las células HT-29 y HUPT3 se trataron con CS23 a una concentración de IC50 durante 48 y 72 horas. Se realizaron experimentos comparativos con 5-fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (GEM) durante 48 y 72 horas. 5-FU, que se administró a doble de la concentración de TGI durante los mismos intervalos de tiempo, mientras que GEM se administró a 250 µM (Hup-T3) y 500 µM (HT-29).

En la línea celular de cáncer de colon HT29, CS23 aumentó notablemente la población de células en fase de apoptosis temprana, alcanzando el 28,69% después de 48 horas y el 40,29% después de 72 horas (Figura 1). Estos valores fueron significativamente más altos que los observados para 5-FU (17,22% y 27,75%, p < 0,01) y para GEM (10,56% y 19,95%, p < 0,001). El patrón de distribución general indicó que CS23 desencadena principalmente la apoptosis en lugar de la necrosis, ya que la fracción de células necróticas se mantuvo mínima en ambos puntos temporales.

En la línea celular de cáncer de páncreas Hup-T3, CS23 también demostró un efecto proapoptótico distinto, con poblaciones de apoptosis temprana del 19,16% a las 48 horas y del 38,92% a las 72 horas (Figura 2). Estos resultados fueron significativamente más altos que los inducidos por gemcitabina (12,24% y 19,95%, p < 0,01) pero no difirieron significativamente de 5-FU (43,27% y 49,21%, p > 0,05). El aumento dependiente del tiempo de las células apoptóticas confirma que CS23 actúa a través de un mecanismo apoptótico progresivo.

En general, estos hallazgos demuestran que CS23 funciona como un potente inductor de la apoptosis, exhibiendo una actividad superior a la de la gemcitabina y una eficacia comparable o mejorada en relación con el 5-FU, según el tipo de cáncer. Su pronunciado efecto apoptótico, particularmente en las células de cáncer de colon, apoya la hipótesis de que la hibridación de pirimidina-esteroide mejora la capacidad de los análogos de bases nucleicas para iniciar la muerte celular programada al tiempo que minimiza la necrosis.

2.4. El efecto de CS23 en la progresión del ciclo celular

El efecto de CS23 en la progresión del ciclo celular se evaluó en dos líneas celulares de cáncer, HT-29 y HUPT3, tras el tratamiento a las concentraciones de IC50 y TGI durante 24 y 48 horas, respectivamente. Los compuestos de referencia, 5-FU y GEM, se administraron a 250 µM durante 48 horas. En todos los casos, también se cultivaron células no tratadas, actuando así como grupos de control.

Según el análisis citométrico de flujo, la mayoría de las células HT-29 no tratadas, cultivadas durante 48 horas, se distribuyeron en la fase G1 (71,88%), mientras que el 8,34% y el 5,93% de las células se observaron en las fases S y G2/M, respectivamente. Sin embargo, el tratamiento con CS23 a la concentración de IC50 durante 24 horas indujo un arresto significativo del ciclo celular en la fase G1 (68,43%; p < 0,001), junto con una disminución significativa en la fase G2/M (1,91%; p < 0,001). En el punto temporal de 48 horas, las células de cáncer HT-29 no tratadas se detuvieron particularmente en la fase G1 (53,54%), con una población celular más baja observada en las fases S (8,77%) y G2/M (23,01%). En comparación con el grupo de control, la administración de CS23 a la concentración de TGI resultó en una disminución significativa de la población en la fase G2/M (9,68%; p < 0,001), junto con un aumento concomitante en la fase S (14,89%; p < 0,001). Ambos compuestos de referencia, GEM y 5-FU, a 250 µM durante 48 horas, redujeron significativamente las tasas en la fase G2/M, disminuyendo al 0,36% (p < 0,001) y al 4,98% (p < 0,001), respectivamente. Al mismo tiempo, la población celular aumentó en la fase S (11,54% (p < 0,001) para GEM y 17,03% (p < 0,001) para 5-FU) (Tabla 6, Figura 3). Cabe mencionar que, en todas las condiciones de tratamiento, las tasas en la fase SubG1 aumentaron notablemente, lo que indica el efecto apoptótico de todos los compuestos, incluido CS23, GEM y 5-FU.

Tras el análisis de las células HUPT3, el 59,87% de las células no tratadas, cultivadas durante 24 horas, se distribuyeron principalmente en la fase G1, mientras que el 24,89% se registraron en la fase S y el 6,45% se registraron en la fase G2/M. En comparación con las células HUPT3 no tratadas a las 24 horas, el tratamiento con CS23, a una concentración de IC50 para el mismo punto temporal, condujo a un aumento significativo de las tasas de la fase SubG1 (14,21%; p < 0,001), acompañado de un aumento en la fase S (26,23%; p < 0,001) (Tabla 7, Figura 4). Para las células HUPT3 no tratadas, cultivadas durante 48 horas, el porcentaje más alto se registró en la fase G1 (53,65%). En comparación con el grupo de control, el tratamiento con CS23 a la concentración de TGI durante 48 horas redujo significativamente la población celular en la fase G2/M (3,69%; p < 0,001), al tiempo que aumentó simultáneamente las tasas en la fase SubG1 (19,38%; p < 0,001) y en la fase S (29,54%; p < 0,001). El tratamiento con GEM y 5-FU a 250 µM durante 48 horas también indujo un aumento en la fase SubG1, alcanzando el 15,86% (p < 0,001) y el 27,29% (p < 0,001), respectivamente. De manera similar a CS23, los dos compuestos de referencia aumentaron la distribución celular en la fase S, reduciendo simultáneamente las tasas en la fase G2/M. Más concretamente, la población celular en la fase S alcanzó el 30,54% y el 29,09% para GEM y 5-FU, respectivamente, mientras que la distribución celular en la fase G2/M disminuyó al 7,6% y al 6,26%, respectivamente.

2.5. Estudios computacionales para investigar los efectos de los antimetabolitos de lactama esteroidea sobre TYSY

Para investigar la interacción de los derivados híbridos esteroideos-pirimidínicos con la timidilato sintasa (TYSY o TS), se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando la estructura tridimensional de la enzima (ID de PDB: 1JU6), obtenida del Banco de datos de proteínas RCSB (PDB). Esta estructura se seleccionó en función de su alta resolución cristalográfica y su relevancia biológica para la clase de compuestos que se está estudiando.

Para validar el protocolo de acoplamiento, primero se eliminó el dUMP co-cristalizado y luego se volvió a acoplar en el sitio de unión de la timidilato sintasa (ID de PDB: 1JU6; RMSD = 0,228 v) (Figura 5A). Este paso de validación se realizó para evaluar la fiabilidad de la metodología de acoplamiento [^[37]].

El análisis de los resultados del acoplamiento reveló que los híbridos esteroideos GE23, CS18 y CS23 exhibieron afinidades de unión particularmente fuertes hacia la timidilato sintasa, con puntuaciones de acoplamiento (DBS) de -11,8, -11,4 y -11,2 kcal/mol, respectivamente. El orden general de la fuerza de unión fue el siguiente (Figura 5A-G, Tabla 8) GE23 (-11,8) > CS18 (-11,4) > CS23 (-11,2) > MV16 (-11,0) > MTX (-9,7) > KA44 (-6,7) > 5-FU (-5,1).

Estas moléculas híbridas se estabilizaron dentro del sitio activo de la enzima principalmente a través de múltiples enlaces de hidrógeno con Asp218, Asn226 y Gln214, así como a través de interacciones extensas de -alquilo y -azufre que involucran a Leu221, Phe225 y Met311, lo que contribuyó colectivamente a la estabilidad energética mejorada de los complejos.

En contraste, KA44, con una puntuación de acoplamiento más baja (-6,7 kcal/mol), formó un número limitado de enlaces de hidrógeno y exhibió contactos hidrofóbicos más débiles, lo que indica una estabilidad conformacional reducida y un ajuste menos favorable dentro del sitio de unión.

El inhibidor de referencia, metotrexato (MTX), validó la fiabilidad del modelo de acoplamiento, mostrando una puntuación de acoplamiento de ?9,7 kcal/mol, lo que es consistente con una potente inhibición de la TS y comparable a la de las moléculas híbridas activas. Por el contrario, el 5-fluorouracilo (5-FU) mostró una afinidad de unión marcadamente menor (4,9 kcal/mol), lo que es consistente con su estructura química simple y la ausencia de interacciones hidrofóbicas o de apilamiento π extensas.

En general, los resultados indican que los híbridos esteroideos GE23 y CS18 forman los complejos inhibidor-enzima más estables, caracterizados por una combinación óptima de enlaces de hidrógeno e interacciones estabilizadoras π-alquilo y π-azufre dentro del bolsillo catalítico. Su unión energéticamente favorable supera la de los compuestos de referencia convencionales, lo que sugiere una mayor bioactividad y selectividad hacia el objetivo de la timidilato sintasa.

De manera similar, el metotrexato (MTX) (puntuación de acoplamiento: ?9,7 kcal/mol), como antifolato clásico, mostró una afinidad significativa por la TS, formando enlaces de hidrógeno con Phe80, Cys195, Ser216, Gly220, Phe225 y Tyr258. Las interacciones π-π y π-anión con Asp218, Phe225 y Met311 contribuyeron a la estabilización general.

Aunque la puntuación de acoplamiento fue alta (9,7 kcal/mol), el MTX mostró ligeramente menos contactos hidrofóbicos que los derivados híbridos, lo que refleja su naturaleza altamente polar. Esto apoya la hipótesis de que la incorporación de un andamio esteroideo en las moléculas híbridas mejora la lipofilicidad y fortalece la unión a través de contactos no polares, lo que puede traducirse en un mejor comportamiento farmacocinético.

El antimetabolito de referencia 5-FU, un inhibidor bien conocido de la timidilato sintasa, demostró una puntuación de acoplamiento relativamente débil en las mismas condiciones. Interactuó con Ser216, Gly222 y Asn226 a través de enlaces de hidrógeno y carbonilo, lo que refleja su modo de unión conocido pero transitorio al sitio catalítico. La ausencia de contactos hidrofóbicos o aromáticos fuertes probablemente explique la menor energía de unión favorable en comparación con los análogos híbridos. Este hallazgo es consistente con los datos experimentales que indican que la actividad del 5-FU surge de la conversión intracelular a FdUMP, que forma un complejo ternario covalente con la TS y el folato, en lugar de a través de una unión no covalente directa y estable. El 5-FU forma un enlace de hidrógeno entre el grupo NH del andamio de uracilo y Ser216. Mientras tanto, el grupo carbonilo en C2 también forma un enlace de hidrógeno con el mismo aminoácido. Además, el grupo carbonilo en C4 forma un enlace de hidrógeno con Asn226, mientras que se formaron interacciones de apilamiento π entre la región aromática y los residuos de aminoácidos Leu221 y Phe225. En nuestro modelo, el NH en la tercera posición también forma un enlace de hidrógeno con Ser216, y el grupo C2=O forma un enlace de hidrógeno con el mismo aminoácido. Sin embargo, el grupo carbonilo en C4 forma su enlace de hidrógeno con el aminoácido Gln214 en lugar de Asn226 y también forma un enlace C-H con Gly217. A pesar de las diferencias entre los aminoácidos que interactúan, nuestro modelo sugiere que el 5-FU se une en la misma región catalítica que se informó anteriormente [^[37],^[38],^[39],^[40]].

El compuesto GE23, un conjugado de 5-FU y la testosterona modificada, también se encontró que está fuertemente unido a la TS y, de hecho, mostró la afinidad de unión más fuerte por la timidilato sintasa, lo que se refleja en su energía de acoplamiento más favorable, con una puntuación de acoplamiento de ?11,8 kcal/mol. La porción esteroidea del conjugado forma interacciones de van der Waals hidrofóbicas con los aminoácidos Ile108, Leu221 y Met311, y se forma una interacción π-π entre C10 del anillo de ciclopentano y Phe225. La porción de 5-fluorouracilo se une al mismo bolsillo que el modelo de acoplamiento de 5-FU, formando dos enlaces de hidrógeno entre C2=O, el grupo NH en la tercera posición y Asn226. Además, el grupo C4=O forma tres enlaces de hidrógeno (dos convencionales y uno carbono-hidrógeno) con Gln214, Asp218 y Gly217 (C-H). Estos resultados sugieren que la arquitectura molecular de GE23 permite una acomodación óptima dentro de la cavidad catalítica, proporcionando fuertes interacciones de anclaje comparables o superiores a los inhibidores clásicos de la TS.

Los compuestos CS18 y CS23 exhiben un motivo de unión parcialmente diferente. En el caso de CS18 (11,4 kcal/mol), la porción esteroidea de los conjugados forma interacciones alquilo y π-alquilo con los aminoácidos Ile108, Leu221 y Phe225, que son los tres aminoácidos importantes del sitio catalítico de la TS. Además, la porción de pirazolpirimidina forma un enlace de hidrógeno π-donante entre el anillo de pirimidina aromático y Tyr258 e interacciones π-alquilo con los aminoácidos Leu192 y Cys195, una interacción π-azufre entre el anillo de pirimidina y Met311, y una interacción π-catión con Arg50, pero también se observa que se forma una interacción donante-donante desfavorable entre el NH de anilina y Arg50, lo que sugiere una pérdida de afinidad de unión. Curiosamente, el conjugado forma enlaces de hidrógeno con la región catalítica a través del enlazador introducido. En detalle, se forman dos enlaces de hidrógeno entre la región etano del enlazador que está unida al NH en la posición 1 del anillo de pirazol y los aminoácidos Ser216 y His256. Finalmente, los grupos carbonilo del enlazador de succinato forman tres enlaces de hidrógeno con los aminoácidos Tyr135, Gln214 y Asp218.

CS23 (11,2 kcal/mol) es un conjugado modificado de CS18 que tiene un anillo de fenilo en C3 del anillo de pirazol. La porción de testosterona del conjugado forma un enlace de hidrógeno entre el grupo carbonilo y Lys308, mientras que los anillos de ciclohexano forman interacciones π-alquilo con Phe80, y el anillo de ciclopentano forma una interacción π-alquilo con Phe225 del sitio catalítico. Mientras tanto, el NH de anilina del anillo de pirimidina forma un enlace de hidrógeno con el aminoácido Asp218, y el anillo de pirazol forma un enlace de hidrógeno con Cys195. Con este aminoácido, se forman dos interacciones más: un enlace de hidrógeno π-donante con el anillo de fenilo y una interacción π-azufre con el anillo de pirazol. La unión de la porción de pirazolpirimidina se estabiliza aún más a través de interacciones π-alquilo entre el anillo de pirimidina y los aminoácidos Leu221 y Met311 y entre el anillo de fenilo y Leu192.

MV16 logró una puntuación de acoplamiento de ?11,0 kcal/mol, formando enlaces de hidrógeno con Arg50, Arg215, His256 y Tyr258 e interacciones halógenas con Asp21 y Ser59. Los anillos aromáticos del ligando participaron en interacciones π-π y π-π con Phe31 y Phe225, mientras que Ile108, Cys195, Leu221 y Met311 proporcionaron estabilización hidrofóbica. Las contribuciones polares e hidrofóbicas combinadas implican un modo de unión multi-ancla que puede traducirse en una inhibición eficiente de la enzima y una cinética de disociación más lenta.

KA44 (puntuación de acoplamiento: ?6,7 kcal/mol) exhibió una afinidad moderada hacia el sitio activo de la TS. Se observaron interacciones de enlace de hidrógeno con Asp218, Leu221 y Lys308, estabilizando el compuesto dentro del bolsillo catalítico. Interacciones hidrofóbicas adicionales con Val79, Phe80, Trp109, His196 y Leu221 (π), así como contactos π-alquilo con Phe225 y enlace π-azufre con Met311, contribuyeron a la estabilización del complejo ligando-enzima. Aunque la puntuación de acoplamiento general fue menor que la de otros derivados, el perfil de interacción de KA44 indica un ajuste moderado dentro del bolsillo activo, impulsado principalmente por contactos hidrofóbicos y de tipo alquilo en lugar de interacciones polares. El número limitado de enlaces de hidrógeno puede explicar su menor potencial inhibitorio en relación con los otros análogos.

2.6. Estudios computacionales para investigar los efectos de los antimetabolitos lactámicos esteroideos sobre la DHFR

También se realizaron simulaciones de acoplamiento molecular utilizando la estructura cristalina de la DHFR humana (PDB: 1KMS) para dilucidar las interacciones de unión y predecir el potencial inhibitorio de los derivados de lactama esteroideos sintetizados (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en comparación con los antimetabolitos de referencia, 5-fluorouracilo (5-FU) y metotrexato (MTX). La validación del protocolo de acoplamiento se llevó a cabo con SRI-9439 (RMSD = 1,853) (Figura 6A). Los resultados del acoplamiento (Tabla 9, Figura 6A-G) revelaron fuertes afinidades de unión para todos los derivados esteroideos, con puntuaciones de acoplamiento que oscilan entre ?10,9 y ?12,2 kcal/mol, lo que supera significativamente las de los inhibidores clásicos MTX (9,5 kcal/mol) y 5-FU (4,9 kcal/mol), lo que indica una mayor estabilidad energética y una mejor complementariedad del sitio activo.

Como se esperaba, el 5-FU exhibió la afinidad de unión más débil (4,9 kcal/mol) y formó solo interacciones limitadas de hidrógeno y halógeno (Ile7, Val115, Glu30), junto con contactos hidrofóbicos débiles (Val8, Ala9). La falta de dominios aromáticos o no polares extensos impide que el 5-FU logre una unión profunda en el bolsillo de la DHFR. Su actividad conocida en las células surge principalmente de la interferencia indirecta con la timidilato sintasa, no a través de la inhibición de la DHFR, lo que es consistente con los resultados computacionales presentes.

El orden de las afinidades de unión de la DHFR predichas fue KA-44 (12,2) > GE23 (11,7) > CS18 (11,6) > CS23 (11,5) > MV16 (10,9) > MTX (9,5) >> 5-FU (4,9).

Todas las moléculas híbridas superaron a los inhibidores estándar en la energía de unión predicha, lo que confirma el papel de mejora del andamio esteroideo en el logro de una unión más profunda y estable con el bolsillo catalítico de la DHFR. KA44 surgió como el ligando energéticamente más estable, probablemente debido a sus densas interacciones π-π y catiónicas, mientras que GE23, CS18 y CS23 combinaron el anclaje hidrofóbico con múltiples enlaces de hidrógeno, lo que refleja un potencial de inhibición enzimática multimodal.

En conjunto, estos resultados respaldan la hipótesis de que la hibridación esteroidea mejora tanto la afinidad de la DHFR como la estabilidad de la unión, lo que ofrece un marco de diseño racional para desarrollar inhibidores de doble objetivo capaces de interrumpir las vías del metabolismo del folato y la síntesis de ADN en el cáncer colorrectal y pancreático resistente.

El antifolato clásico MTX mostró una fuerte puntuación de acoplamiento de ?9,5 kcal/mol, participando en múltiples enlaces de hidrógeno con Glu30, Thr56, Ser59, Asn64, Arg70, Val115 y Tyr121, así como en un apilamiento π-π con Phe31. Interacciones π-π y hidrofóbicas adicionales con Ala9 e Ile60 estabilizaron la orientación de unión. Aunque el MTX sigue siendo un ligando de la DHFR de alta afinidad, las energías de acoplamiento superiores de los derivados esteroideos (10,9 a ?12,2 kcal/mol) sugieren que la conjugación lipofílica mejora sustancialmente la afinidad de la enzima a través de una mejor ocupación del bolsillo y complementariedad no polar.

GE23 demostró una puntuación de acoplamiento altamente favorable (11,7 kcal/mol), comparable a KA-44, respaldada por múltiples enlaces de hidrógeno (Ala9, Glu30, Asn64) e interacciones halógenas/aromáticas (Phe31, Leu22, Phe34, Ile60, Pro61). La estructura híbrida permite que la porción de 5-fluorouracilo ocupe el bolsillo del sustrato canónico, mientras que el andamio esteroideo refuerza la unión a través del anclaje hidrofóbico a lo largo de Leu67 y Val115. Este comportamiento de anclaje dual refleja el patrón de inhibición bifuncional que se observa en los análogos antifolato híbridos, lo que sugiere que GE23 puede imitar tanto las regiones de sustrato como de cofactor de la DHFR.

CS18 logró una puntuación de acoplamiento de ?11,6 kcal/mol, caracterizada por enlaces de hidrógeno con Gly30, Ser59 y Tyr121 e interacciones π-donantes con Ala9. Su porción esteroidea formó múltiples interacciones π-alquilo y alquilo con Val8, Leu22, Phe31, Phe34, Ile60 y Leu67, lo que resultó en una extensa estabilización hidrofóbica en todo el bolsillo catalítico. La fuerte contribución del enlace de hidrógeno π-donante con Tyr121 y el enlace de hidrógeno carbonilo en Ser59 respalda un perfil de unión polar-no polar mixto, que puede facilitar una inhibición enzimática duradera y velocidades de desacoplamiento más lentas en comparación con los inhibidores clásicos de la DHFR.

CS23 (11,2 kcal/mol) es un conjugado modificado de CS18 que tiene un anillo de fenilo en C3 del anillo de pirazol. La porción de testosterona del conjugado forma un enlace de hidrógeno entre el grupo carbonilo y Lys308, mientras que los anillos de ciclohexano forman interacciones π-alquilo con Phe80, y el anillo de ciclopentano forma una interacción π-alquilo con Phe225 del sitio catalítico. Mientras tanto, el NH de anilina del anillo de pirimidina forma un enlace de hidrógeno con el aminoácido Asp218, y el anillo de pirazol forma un enlace de hidrógeno con Cys195. Con este aminoácido, se forman dos interacciones más: un enlace de hidrógeno π-donante con el anillo de fenilo y una interacción π-azufre con el anillo de pirazol. La unión de la porción de pirazolpirimidina se estabiliza aún más a través de interacciones π-alquilo entre el anillo de pirimidina y los aminoácidos Leu221 y Met311 y entre el anillo de fenilo y Leu192.

MV16 logró una puntuación de acoplamiento de ?11,0 kcal/mol, formando enlaces de hidrógeno con Arg50, Arg215, His256 y Tyr258 e interacciones halógenas con Asp21 y Ser59. Los anillos aromáticos del ligando participaron en interacciones π-π y π-π con Phe31 y Phe225, mientras que Ile108, Cys195, Leu221 y Met311 proporcionaron estabilización hidrofóbica. Las contribuciones polares e hidrofóbicas combinadas implican un modo de unión multi-ancla que puede traducirse en una inhibición eficiente de la enzima y una cinética de disociación más lenta.

CS23 (11,5 kcal/mol) se unió firmemente dentro del sitio activo, formando enlaces de hidrógeno con Gly116 y Tyr121, al tiempo que exhibió un extenso apilamiento π-π e interacciones hidrofóbicas con Phe31, Phe34, Ile60, Leu67, Val115 y Arg28/Arg32. La interacción en forma de T π-π con Phe31 sugiere una estabilización aromática similar al sistema de anillos de pteridina del MTX. La extensión fenilo de CS23 en C3 probablemente mejora la complementariedad de Van der Waals, mejorando la afinidad de unión sin depender de un fuerte emparejamiento de cargas.

MV16 (10,9 kcal/mol) mostró una afinidad de unión sustancial mediada por cuatro enlaces de hidrógeno (Asp21, Lys63, Asn64, Val115), respaldada por interacciones halógenas con Asp21 y Ser59. Los contactos hidrofóbicos con Phe31, Phe34, Ile60 y Pro61 estabilizaron la conformación del ligando. El modo de unión indica un mecanismo de anclaje híbrido que combina interacciones polares en la región de unión a NADPH y estabilización hidrofóbica cerca del sitio catalítico. El patrón se asemeja a los conocidos conjugados de gemcitabina y esteroides que modulan los cofactores redox e interfieren con la renovación enzimática.

KA44 exhibió la mayor afinidad de unión (12,2 kcal/mol) entre todos los compuestos probados. Aunque no se formaron enlaces de hidrógeno convencionales, la molécula se estabilizó mediante una extensa red de interacciones hidrofóbicas y aromáticas. Más específicamente, se formaron cinco interacciones -alquílicas; dos de ellas se encuentran entre el anillo de pirimidina de la reversina y los aminoácidos Pro26 y Pro61 del centro catalítico, una se forma entre el anillo de pirazol de la reversina y Leu22, y dos se forman entre el anillo de ciclohexano del fragmento esteroideo del conjugado y Phe31 y Phe34. Además, el anillo bencílico de la reversina desempeña un papel central en el acoplamiento del conjugado al formar una interacción - en forma de T con Phe31 y una interacción -catiónica con la cadena lateral cargada de Lys63. Finalmente, el conjugado forma múltiples interacciones alquílicas con el centro catalítico hidrofóbico; la porción de ciclohexilamina de la reversina forma una interacción alquílica con Pro61. Se forman dos interacciones alquílicas entre los grupos metilo del fragmento esteroideo e Ile60, y finalmente, se forma una interacción alquílica entre Pro61 y el anillo de ciclopentano del esteroide. Estos resultados sugieren que KA-44 se ajusta óptimamente a la hendidura hidrofóbica de la DHFR, funcionando como un potente inhibidor no clásico.

2.7. Resultados de Western Blot: GE23, CS18 y CS23 como posibles inhibidores de TYSY

Como se mencionó anteriormente, se probaron tres antimetabolitos esteroideos de lactama (GE23, CS18 y CS23) como posibles inhibidores de TYSY en células HT-29 y HUPT3 después de un tratamiento de 6 h a la concentración TGI. Para comparar sus efectos, se incluyó 5-FU como compuesto de referencia. Según el análisis de Western blot, en las células HT-29, los tres derivados inhibieron la actividad de TYSY de manera similar a 5-FU. Específicamente, la segunda banda en el blot señala el efecto inhibidor de los derivados y 5-FU, mientras que la banda específica está ausente en el grupo de control (Figura 7A). Las bandas superiores de TYSY representan a TYSY en complejos ternarios compuestos por TYSY, CH2THF y FdUMP. La densidad de las bandas superiores se correlaciona con la concentración intracelular de FdUMP [^[38]]. Resultados similares se muestran en la Figura 7B, donde aparece la segunda banda tras el tratamiento con los tres derivados y 5-FU, en contraste con su ausencia en las células no tratadas.

2.8. Inhibición de la actividad de la dihidrofolato reductasa (DHFR)

Se realizó un cribado de la inhibición de la DHFR para los compuestos probados GE23, CS18, CS23, KA44, MV16, 5-FU, GEM y MTX en un ensayo colorimétrico de actividad enzimática de la DHFR sin células. Se incluyó MTX como control positivo y compuesto de referencia. Todos los compuestos se probaron en un rango de concentraciones entre 5 y 500 nM. Todos los resultados se presentan en la Figura 8 y la Figura 9 como curvas de dosis-respuesta, así como en la Tabla 10. Todos los antimetabolitos esteroideos homo-aza probados mostraron un efecto inhibidor significativo sobre la actividad de la DHFR (mayor que MTX). 5-FU y GEM demostraron un bajo efecto inhibidor. El inhibidor de DHFR más potente resultó ser KA44. El efecto inhibidor de los compuestos probados en orden descendente, desde el inhibidor más fuerte hasta el más débil, fue KA44 > GE23 > CS18 ? CS23 > MV16 > MTX > GEM > 5-FU.

2.9. Correlación de datos y resultados

2.9.1. Efectos citostáticos/citotóxicos acumulativos de las moléculas probadas

Los datos acumulativos con respecto a los efectos citostáticos (GI50) de los compuestos probados sobre las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon humano se presentan en la Figura 10. El potencial citostático medio correspondiente de los compuestos probados en orden descendente, desde el más fuerte hasta el más débil, contra las líneas celulares de cáncer de páncreas fue

GEM > 5-FU ? KA44 > MV16 > CS23 > CS18 > MTX > GE2,

mientras que contra las líneas celulares de cáncer de colon, fue

KA44 > 5-FU ? CS23 > GEM > CS18 > MV16 > MTX > GE23 (p < 0,05).

Cuando se consideraron los valores de inhibición del crecimiento total (TGI), que reflejan el comportamiento citotóxico de los compuestos, la potencia citotóxica media siguió un patrón similar pero menos pronunciado (Figura 11). Para las líneas celulares de cáncer de páncreas, el orden fue el siguiente:

GEM > 5-FU > CS23 > CS18 ? MV16 > KA44 > MTX > GE23.

Y para las líneas celulares de cáncer de colon, fue el siguiente:

CS23 > GEM ? CS18 > 5-FU ? MV16 > KA44 > GE23 > MTX (p < 0,05).

La actividad citostática media (media GI50) inducida por los compuestos probados contra las cuatro líneas celulares de cáncer de colon fue significativamente superior a la de las tres líneas celulares de cáncer de páncreas (media GI50 = 19,06 y 49,84 ?, respectivamente (p < 0,01)). Por otro lado, la actividad citotóxica media de los compuestos probados fue similar para las líneas celulares de cáncer de colon y páncreas (TGI = 147,5 y 145,5 ?, respectivamente).

2.9.2. Correlación de los efectos citostáticos/citotóxicos de las moléculas probadas con las puntuaciones de acoplamiento en la timidilato sintasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en TYSY reveló una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,75 (R cuadrado ajustado = 0,488, p < 0,05) (Figura 12).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en TYSY resultó ser cero, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,008 (R cuadrado ajustado = ?0,16, p < 0,02).

La citotoxicidad inducida contra las siete líneas celulares de cáncer humano por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con su actividad inhibidora y las puntuaciones de acoplamiento en TYSY. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con la inhibición inducida de TYSY. Los antimetabolitos esteroideos de lactama híbridos presentaron una muy buena y significativa correlación entre su actividad citostática y las puntuaciones de acoplamiento en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > GE23 ? CS23 ? MV16 > KA44. Estos resultados se pueden explicar por los mecanismos moleculares más complejos y por el hecho de que los compuestos probados inducen citotoxicidad en las células cancerosas más allá de la inhibición de la actividad de TYSY.

2.9.3. Correlación de los efectos citostáticos/citotóxicos de las moléculas probadas con las puntuaciones de acoplamiento en la dihidrofolato reductasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en DHFR reveló una correlación moderada, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,76 (R cuadrado ajustado = 0,512, p < 0,03) (Figura 13).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en DHFR resultó ser baja/moderada y no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,44 (R cuadrado ajustado = 0,06, p < 0,12). La correlación débil entre DBS/TGI sugiere que la citotoxicidad implica otras vías, como efectos moleculares fuera del objetivo o estrés celular general del conjugado esteroideo lipofílico.

La correlación lineal entre el 50% de inhibición de la actividad de la DHFR (IC50) inducida por los compuestos probados en un ensayo enzimático de DHFR sin células, in vitro, y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en DHFR mostró una correlación muy fuerte, con un índice de correlación de Pearson (r) = 0,96 (R cuadrado ajustado = 0,915, p < 0,001) (Figura 14).

Por lo tanto, los estudios de acoplamiento computacional sobre la afinidad de unión de los compuestos probados en el sitio activo de la DHFR pueden predecir la inhibición inducida de la actividad de la DHFR con alta precisión.

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de la DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,65 (R cuadrado ajustado = 0,322, p < 0,03) (Figura 15).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se interpretó mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de la DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación débil/moderada no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,44 (R cuadrado ajustado = 0,059, p < 0,13).

En conclusión, la citotoxicidad producida contra las siete líneas celulares de cáncer humano por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con sus puntuaciones de acoplamiento en el sitio activo de la DHFR, ni con la inhibición generada de la actividad enzimática de la DHFR. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con sus puntuaciones de acoplamiento en el sitio activo de la DHFR o con la inhibición inducida de la actividad enzimática de la DHFR. Los antimetabolitos esteroideos de lactama híbridos presentaron una muy buena y significativa correlación de su actividad citostática con la inhibición de la actividad enzimática de la DHFR en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > MV16 ? CS23 > KA44 > GE23.

Los efectos citotóxicos de los fármacos probados probablemente se ejercen con la participación de otros mecanismos celulares más allá de la inhibición de la actividad de la DHFR.

Las correlaciones lineales entre las medias de actividad citostática (GI50) y los efectos citostáticos/citotóxicos generados, tal como se interpretaron mediante los correspondientes índices de crecimiento (TGI), por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las puntuaciones de unión combinadas (DBS DHFR + DBS TYSY) se presentan en la Figura 16. Se observaron correlaciones significativas entre la actividad citostática (GI50) de los compuestos probados y sus respectivas puntuaciones de unión combinadas en DHFR y TYSY (índice de correlación de Pearson, r = ?0,81, R cuadrado ajustado = 0,604, p < 0,01). Los antimetabolitos híbridos de lactama esteroidea presentaron una correlación muy buena y significativa de su actividad citostática con su respectiva afinidad de unión combinada en los sitios activos de unión de DHFR y TYSY, en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > KA44 > MV16 ? CS23. Estos resultados indicaron que la actividad anticancerígena citostática de los compuestos probados y, más específicamente, de los antimetabolitos esteroideos CS18, KA44, CS23 y MV16 en el cáncer colorrectal y pancreático puede predecirse de forma segura mediante sus puntuaciones de unión combinadas en DHFR y TYSY. Por otro lado, no se observó una correlación significativa en la actividad de los compuestos probados entre sus puntuaciones de unión combinadas en DHFR y TYSY y sus respectivos efectos citotóxicos, como lo indican los correspondientes TGI (índice de correlación de Pearson, r = ?0,24, R cuadrado ajustado = ?0,097, p < 0,23).

2.9.4. Correlaciones de la sensibilidad de los compuestos probados a las mutaciones conocidas, relevantes y clínicamente significativas en las líneas celulares probadas

Se detectaron mutaciones oncogénicas relevantes y clínicamente significativas en las líneas celulares humanas de cáncer de páncreas y colon mediante tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). Las mutaciones oncogénicas frecuentes y clínicamente significativas en el cáncer colorrectal y pancreático de las vías de señalización RAS-RAF-MEK-ERK y PI3K-AKT-mTOR, así como en TP53, se muestran en la Tabla 1.

Como se muestra en la Figura 17 y la Figura 18, no se pueden extraer conclusiones sobre una actividad anticancerígena específica o dependiente de los compuestos probados sobre las líneas celulares cancerosas analizadas, en relación con las respectivas mutaciones en los genes KRAS, BRAF, PI3K y TP53 que portan. No se observó una correlación universal simple con mutaciones individuales de KRAS, BRAF, PI3K o TP53, aunque el contexto celular (definido potencialmente por una combinación de mutaciones u otros factores y alteraciones combinadas de la vía) influye en la sensibilidad. Las células cancerosas PANC 08.13 que portan la mutación p.G12D c.35G>A en KRAS y portan BRAF, PI3K y TP53 no mutados mostraron la mayor resistencia al tratamiento con los compuestos probados. Por otro lado, las células LS174T que portan la misma mutación en KRAS y, además, la mutación p.D211G c.632A>G en BRAF y la mutación p.H1047R c.3140A>G en PIK3CA, parecieron ser más sensibles. Por el contrario, las células PANC 03.27 con KRAS mutado (p.G12V c.35G>T) y TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) pero con BRAF y PI3K de tipo salvaje (wt) son más sensibles a los antimetabolitos anticancerígenos probados que las células cancerosas SW403 que portan la misma mutación en KRAS; TP53 mutado; y, además, PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y BRAF de tipo salvaje. Además, las células HT-29 con KRAS de tipo salvaje, BRAF mutado (p.V600E c.1799T>A), PIK3CA mutado (p.P449T c.1345C>A) y TP53 mutado (p.R273H c.818G>A) presentan una sensibilidad intermedia a los fármacos probados. Sin embargo, cabe destacar que, con respecto a los antimetabolitos esteroideos homo-aza, (a) KA44 es el más activo contra las células cancerosas colorrectales HT29 (KRAS wt; BRAF mutado V600E; PIK3CA mutado P449T) y las células cancerosas colorrectales LoVo que portan KRAS mutado (p.G13D c.38G>A) y PIK3CB (p.E1051K c.3151G>A), así como BRAF y TP53 de tipo salvaje. Por otro lado, las células LS174T con PIK3CA mutado (p.H1047R c.3140A>G), KRAS (p.G12D c.35G>A), BRAF (p.D211G c.632A>G) y TP53 de tipo salvaje (wt) presentaron baja sensibilidad a KA44. Tal vez las células cancerosas con mutaciones específicas de PI3K o combinaciones de mutaciones específicas sean más sensibles a los efectos antiproliferativos de KA44. (b) CS23 induce el mayor efecto antitumoral citostático y citotóxico contra las células cancerosas de páncreas PANC 03.27 que portan KRAS mutado (p.G12V c.35G>T), mientras que TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) tiene BRAF y PIK3 de tipo salvaje. Por el contrario, las células cancerosas SW403 portan la misma mutación que la mutación KRAS de PANC 03.27 y tienen PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y TP53 (p.E51* c.151G>T), mientras que BRAF no está mutado y presentan una sensibilidad significativamente menor a CS23. En general, con respecto a KRAS (tipo salvaje y diferentes mutaciones), las células cancerosas colorrectales LoVo que portan la mutación p.G13D c.38G>A son las más sensibles a los compuestos probados.

2.1. La actividad citostática y citotóxica in vitro de los antimetabolitos de lactama esteroidea: ensayo MTT

Se realizó el cribado de fármacos in vitro de los nuevos antimetabolitos de lactama esteroidea. Se evaluaron los efectos citostáticos y citotóxicos de los antimetabolitos de lactama esteroidea sintetizados (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en comparación con los antimetabolitos de referencia 5-fluorouracilo (5-FU), metotrexato (MTX) y gemcitabina (GEM) utilizando el ensayo MTT en líneas celulares de carcinoma de páncreas (Hup-T3, Panc 03.27, Panc 08.13) y colon (LoVo, HT-29, LS174T, SW403). Los resultados se muestran en la Tabla 1, la Tabla 2 y la Tabla 3.

Entre los compuestos de referencia, el 5-FU exhibió una potente actividad citostática en todas las líneas celulares de adenocarcinoma gastrointestinal y pancreático probadas, con valores de GI50 que oscilaron entre 13 y 36,5 µM, y los efectos más pronunciados se observaron en las líneas HT-29 (13 µM) y Panc 03.27 (18 µM) (p < 0,01 frente al control). El compuesto alcanzó la inhibición total del crecimiento (TGI) a concentraciones entre 48 y 82 µM en las líneas más sensibles, mientras que los valores de IC50 generalmente superaron los 250 µM, lo que indica un mecanismo predominantemente citostático en lugar de citotóxico. Las líneas LoVo y LS174T demostraron una resistencia relativa, requiriendo dosis más altas para una inhibición significativa del crecimiento (p < 0,05).

MTX mostró una actividad antiproliferativa moderada, con valores de GI50 que oscilaron entre 6,2 y 55 µM, lo que indica una sensibilidad variable en todo el panel (p < 0,05). Los efectos más pronunciados se observaron en SW403 (GI50 = 6,2 µM) y HT-29 (8,5 µM), seguidos de LoVo y LS174T (18-20 µM). La supresión completa del crecimiento (TGI) se logró a concentraciones de 126-220 µM, con valores de IC50 que superaron los 250 µM en casi todas las líneas celulares. Estos datos confirman que MTX actúa principalmente a través de la detención del crecimiento antimetabólica, en lugar de inducir una citotoxicidad extensa en el período de exposición probado.

La gemcitabina (GEM) demostró la mayor potencia citostática general entre los fármacos de referencia, con valores de GI50 tan bajos como 10 µM en HT-29 y SW403, y una actividad moderada en otras líneas (11-20 µM). Los valores de TGI oscilaron entre 18 y 64 µM, mientras que los umbrales citotóxicos (IC50) fueron consistentemente altos (>250 µM), excepto en SW403 (25 µM), donde la gemcitabina mostró una citotoxicidad notable (p < 0,01 frente al control y frente a MTX). Estos hallazgos se alinean con el mecanismo conocido de la gemcitabina como análogo de nucleósido, que induce tanto el bloqueo de la síntesis de ADN como la apoptosis a concentraciones más altas.

Considerados en conjunto, los fármacos de referencia mostraron una potencia citostática clasificada de GEM > 5-FU > MTX, lo que es consistente en la mayoría de las líneas celulares de cáncer colorrectal y pancreático. La comparación estadística confirmó la superioridad de la gemcitabina en la reducción de la proliferación celular (p < 0,001 frente a MTX, p < 0,05 frente a 5-FU). Sin embargo, el 5-FU exhibió una mayor eficacia en todo el espectro de células, mientras que los efectos del metotrexato fueron más selectivos. La ausencia de una citotoxicidad pronunciada (IC50 > 250 µM en la mayoría de los casos) para los tres sugiere que su acción dominante en las condiciones probadas fue antiproliferativa, no lítica.

b. Entre los compuestos sintetizados recientemente, GE23 mostró una actividad antiproliferativa moderada, con valores de GI50 que oscilaron entre 73 µM (Panc 03.27) y 130 µM (Hup-T3) en las células pancreáticas y entre 24 y 100 µM en las líneas celulares colorrectales. Su efecto fue principalmente citostático, ya que los valores de IC50 superaron los 250 µM en todos los casos. La actividad modesta en Panc 03.27 y LoVo sugiere cierta sensibilidad en las células que albergan mutaciones KRAS G12V/G13D, pero la potencia inhibidora general siguió siendo menor en comparación con CS18 o CS23 (p < 0,05). Estos hallazgos indican que GE23, aunque activo, requiere concentraciones más altas para una supresión del crecimiento comparable y puede servir como base estructural en la serie.

CS18 demostró una actividad mejorada en comparación con GE23, con valores de GI50 entre 50 y 80 µM en las líneas pancreáticas y entre 32 y 90 µM en los modelos colorrectales. En particular, CS18 mostró una potente inhibición en HT-29 (GI50 = 32 µM) y SW403 (GI50 = 54 µM), ambas que albergan mutaciones de KRAS y PIK3CA, lo que sugiere una mayor afinidad hacia las células que proliferan rápidamente o que presentan una desregulación de la señalización. Aunque la citotoxicidad siguió siendo limitada (IC50 > 200 µM), el compuesto logró valores de GI50 significativamente más bajos que GE23 (p < 0,05), lo que indica una mayor eficiencia citostática.

CS23 surgió como el compuesto más activo de la serie de lactamas esteroideas. Exhibió valores bajos de GI50 en casi todas las líneas, 10 µM en Panc 03.27, 30 µM en LoVo y 52 µM en SW403, superando tanto a CS18 como a GE23 (p < 0,01). Además, su actividad constante en las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon sugiere un potencial antiproliferativo de amplio espectro y actividad citotóxica. Si bien los valores de IC50 se mantuvieron > 100 µM, sus valores de TGI (48-128 µM) indicaron una supresión eficaz del crecimiento celular. En general, CS23 exhibe una alta potencia citostática, con potentes efectos citotóxicos observados a concentraciones más altas, lo que lo convierte en una molécula líder prometedora.

KA44 mostró una inhibición selectiva pero muy potente, particularmente en LoVo (GI50 = 3,5 µM) y HT-29 (GI50 = 4 µM), superando a 5-FU y GEM (p < 0,001). Su eficacia disminuyó notablemente en otras líneas, lo que indica una selectividad molecular hacia genotipos o condiciones microambientales específicas (por ejemplo, perfiles de BRAF mutado). A pesar de su fuerte actividad citostática, los valores de IC50 se mantuvieron > 250 µM, lo que confirmó un mecanismo no citotóxico a niveles terapéuticos. El patrón de potencia distinto de KA44 sugiere un modo de acción diferente al de las lactamas esteroideas, posiblemente relacionado con la cinética de interacción del ADN o de las enzimas en lugar de la conjugación estructural.

MV16 exhibió una actividad variable pero notable en Panc 03.27 (GI50 = 13,2 µM) y SW403 (GI50 = 12 µM), mostrando una inhibición selectiva de las líneas mutadas en KRAS, mientras que la actividad disminuyó en otras (>40 µM). El rango de TGI (30-230 µM) y la ausencia de una citotoxicidad marcada sugieren una supresión citostática reversible. En comparación con KA44, MV16 mostró un perfil de inhibición más amplio pero menos pronunciado, lo que es consistente con la interferencia multi-objetivo en lugar de una fuerte unión a un único sitio enzimático. Las diferencias entre MV16 y KA44 fueron estadísticamente significativas en LoVo y HT-29 (p < 0,05).

Cuando se comparan todos los compuestos, CS23 y KA44 demostraron la mayor actividad antiproliferativa general. Los valores bajos y consistentes de GI50 de CS23 en múltiples líneas celulares de cáncer de páncreas y colon subrayan su amplio y equilibrado efecto citostático y citotóxico, mientras que los valores de GI50 excepcionalmente bajos de KA44 en líneas selectas apuntan a una potencia específica del objetivo. El análisis estadístico confirmó que ambos compuestos exhibieron una inhibición significativamente mayor en comparación con los fármacos de referencia (p < 0,01 frente a 5-FU; p < 0,05 frente a GEM).

CS18 ocupó el siguiente lugar, ofreciendo una potencia intermedia favorable con una amplia aplicabilidad y una selectividad moderada, mientras que GE23 sirvió como un análogo estructural menos activo. MV16, aunque variable, mostró una promesa selectiva hacia los tumores impulsados por KRAS y puede justificar una mayor exploración en este contexto genético.

En general, los nuevos análogos de lactama esteroidea demostraron fuertes efectos citostáticos reproducibles comparables o superiores a los antimetabolitos clásicos, manteniendo al mismo tiempo perfiles de baja citotoxicidad.

2.2. Índice terapéutico y selectividad hacia las células cancerosas

Para evaluar más a fondo la selectividad de los compuestos probados hacia las células malignas frente a las células no transformadas, se determinaron los valores de GI50 en tres líneas celulares humanas normales (FHC, CCD-112CoN y MRC-5) y se calcularon las ratios del índice terapéutico (IT).

Se probaron los antimetabolitos conocidos MTX, 5-FU y GEM, así como los compuestos GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16, para determinar su actividad citostática y citotóxica contra las tres líneas celulares humanas normales (FHC, CCD-112CoN y MRC-5), y mostraron valores de TGI e IC50 > 250 ?.

Como se muestra en la Tabla 4, todos los híbridos esteroideos exhibieron valores medios de GI50 significativamente más altos en las células normales (468–568 µM) en comparación con los antimetabolitos clásicos, lo que indica una actividad citostática reducida en los tejidos no transformados en las mismas condiciones experimentales.

Los valores del índice terapéutico (IT) se calcularon como la relación entre el valor medio de GI50 en las células normales y el valor de GI50 en cada línea celular tumoral. Este análisis reveló que varios híbridos esteroideos mostraron valores de IT favorables e, en algunos casos, significativamente elevados en modelos específicos de cáncer (Tabla 5). En particular, KA44, CS23 y MV16 exhibieron los valores medios de IT más altos en todo el panel tumoral, lo que refleja una actividad citostática preferencial en las células malignas en relación con las células normales.

Los compuestos experimentales KA44, CS23 y MV16 exhibieron los índices terapéuticos más altos entre todos los compuestos probados (en ese orden). Basándose en los valores de IT muy altos que se obtuvieron de KA44, CS23 y MV16 en líneas celulares tumorales específicas, lo que indica una especificidad dirigida y una alta sensibilidad, resulta de gran interés terapéutico explorar los mecanismos moleculares responsables de este fenómeno. Cabe destacar que los valores de IT excepcionalmente altos observados en ciertas líneas celulares (por ejemplo, KA44 en células LoVo) fueron el resultado de una combinación de valores de GI50 muy bajos en las células tumorales y valores de GI50 altos en las células normales, lo que indica una sensibilidad específica de la línea celular en lugar de una selectividad uniforme en todos los modelos.

2.3. El efecto del derivado antimetabolítico esteroideo de lactama CS23 sobre la apoptosis

Se realizó un análisis citométrico de flujo para determinar si los efectos citotóxicos del análogo pirimídico esteroideo CS23 estaban asociados con la inducción de la apoptosis. Las células HT-29 y HUPT3 se trataron con CS23 a una concentración de IC50 ( ) durante 48 y 72 horas. Se realizaron experimentos comparativos con 5-fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (GEM) durante 48 y 72 horas. El 5-FU se administró a doble concentración de TGI durante los mismos intervalos de tiempo, mientras que GEM se administró a 250 ?? (Hup-T3) y 500 ?? (HT-29).

En la línea celular de cáncer colorrectal HT29, CS23 aumentó significativamente la población de células en fase temprana de apoptosis, alcanzando el 28,69% después de 48 horas y el 40,29% después de 72 horas (Figura 1). Estos valores fueron significativamente más altos que los observados para 5-FU (17,22% y 27,75%, p < 0,01) y para GEM (10,56% y 19,95%, p < 0,001). El patrón de distribución general indicó que CS23 desencadena principalmente la apoptosis en lugar de la necrosis, ya que la fracción de células necróticas se mantuvo mínima en ambos puntos temporales.

En la línea celular de cáncer de páncreas Hup-T3, CS23 también demostró un efecto proapoptótico distinto, con poblaciones en fase temprana de apoptosis del 19,16% a las 48 horas y del 38,92% a las 72 horas (Figura 2). Estos resultados fueron significativamente más altos que los inducidos por gemcitabina (12,24% y 19,95%, p < 0,01), pero no difirieron significativamente de 5-FU (43,27% y 49,21%, p > 0,05). El aumento dependiente del tiempo en las células apoptóticas confirma que CS23 actúa a través de un mecanismo apoptótico progresivo.

En general, estos hallazgos demuestran que CS23 funciona como un potente inductor de la apoptosis, exhibiendo una actividad superior a la de la gemcitabina y una eficacia comparable o mejorada en relación con el 5-FU, según el tipo de cáncer. Su pronunciado efecto apoptótico, particularmente en las células de cáncer colorrectal, apoya la hipótesis de que la hibridación pirimidina-esteroide mejora la capacidad de los análogos de las bases nucleicas para iniciar la muerte celular programada, al tiempo que minimiza la necrosis.

2.4. El efecto de CS23 sobre la progresión del ciclo celular

El efecto de CS23 sobre la progresión del ciclo celular se evaluó en dos líneas celulares cancerosas, HT-29 y HUPT3, tras el tratamiento a las concentraciones de IC50 y TGI ( ) durante 24 y 48 horas, respectivamente. Los compuestos de referencia, 5-FU y GEM, se administraron a 250 ?? durante 48 horas. En todos los casos, también se cultivaron células no tratadas, que sirvieron como grupos de control.

Según el análisis citométrico de flujo, la mayoría de las células HT-29 no tratadas, cultivadas durante 48 horas, se distribuyeron en la fase G1 (71,88%), mientras que el 8,34% y el 5,93% de las células se observaron en las fases S y G2/M, respectivamente. Sin embargo, el tratamiento con CS23 a la concentración de IC50 ( ) durante 24 horas indujo un arresto significativo del ciclo celular en la fase G1 (68,43%; p < 0,001), junto con una disminución significativa en la fase G2/M (1,91%; p < 0,001). En el punto temporal de 48 horas, las células cancerosas HT-29 no tratadas se detuvieron particularmente en la fase G1 (53,54%), con una población celular más baja observada en las fases S (8,77%) y G2/M (23,01%). En comparación con el grupo de control, la administración de CS23 a la concentración de TGI ( ) produjo una disminución significativa en la población de la fase G2/M (9,68%; p < 0,001), junto con un aumento concomitante en la fase S (14,89%; p < 0,001). Ambos compuestos de referencia, GEM y 5-FU, a 250 ? durante 48 horas, redujeron significativamente las tasas en la fase G2/M, disminuyendo al 0,36% (p < 0,001) y al 4,98% (p < 0,001), respectivamente. Al mismo tiempo, la población celular aumentó en la fase S (11,54% (p < 0,001) para GEM y 17,03% (p < 0,001) para 5-FU) (Tabla 6, Figura 3). Cabe mencionar que, en todas las condiciones de tratamiento, las tasas en la fase SubG1 aumentaron notablemente, lo que indica el efecto apoptótico de todos los compuestos, incluido CS23, GEM y 5-FU.

Tras el análisis de las células HUPT3, el 59,87% de las células no tratadas, cultivadas durante 24 horas, se distribuyeron principalmente en la fase G1, mientras que el 24,89% se registraron en la fase S y el 6,45% se registraron en la fase G2/M. En comparación con las células HUPT3 no tratadas a las 24 horas, el tratamiento con CS23, a una concentración de IC50 para el mismo punto temporal, condujo a un aumento significativo en las tasas de la fase SubG1 (14,21%; p < 0,001), acompañado de un aumento en la fase S (26,23%; p < 0,001) (Tabla 7, Figura 4). Para las células HUPT3 no tratadas, cultivadas durante 48 horas, el porcentaje más alto se registró en la fase G1 (53,65%). En comparación con el grupo de control, el tratamiento con CS23 a la concentración de TGI durante 48 horas redujo significativamente la población celular en la fase G2/M (3,69%; p < 0,001), al tiempo que aumentó simultáneamente las tasas en la fase SubG1 (19,38%; p < 0,001) y en la fase S (29,54%; p < 0,001). El tratamiento con GEM y 5-FU a 250 ?? durante 48 horas también indujo un aumento en la fase SubG1, alcanzando el 15,86% (p < 0,001) y el 27,29% (p < 0,001), respectivamente. De manera similar a CS23, los dos compuestos de referencia aumentaron la distribución celular en la fase S, reduciendo simultáneamente las tasas en la fase G2/M. Más concretamente, la población celular en la fase S alcanzó el 30,54% y el 29,09% para GEM y 5-FU, respectivamente, mientras que la distribución celular en la fase G2/M disminuyó al 7,6% y al 6,26%, respectivamente.

2.5. Estudios computacionales para investigar los efectos de los antimetabolitos lactámicos esteroideos sobre TYSY

Para investigar la interacción de los derivados híbridos esteroideos-pirimídicos con la timidilato sintasa (TYSY o TS), se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando la estructura tridimensional de la enzima (ID de PDB: 1JU6), obtenida del Banco de datos de proteínas RCSB (PDB). Esta estructura se seleccionó en función de su alta resolución cristalográfica y su relevancia biológica para la clase de compuestos que se está estudiando.

Para validar el protocolo de acoplamiento, primero se eliminó el dUMP co-cristalizado y luego se volvió a acoplar en el sitio de unión de la timidilato sintasa (ID de PDB: 1JU6; RMSD = 0,228 v) (Figura 5A). Este paso de validación se realizó para evaluar la fiabilidad de la metodología de acoplamiento [^[37]].

El análisis de los resultados del acoplamiento reveló que los híbridos esteroideos GE23, CS18 y CS23 exhibieron afinidades de unión particularmente fuertes hacia la timidilato sintasa, con puntuaciones de acoplamiento (DBS) de ?11,8, ?11,4 y ?11,2 kcal/mol, respectivamente. El orden general de la fuerza de unión fue el siguiente (Figura 5A–G, Tabla 8) GE23 ( 11,8) > CS18 ( 11,4) > CS23 ( 11,2) > MV16 ( 11,0) > MTX ( 9,7) > KA44 ( 6,7) > 5-FU ( 5,1).

Estas moléculas híbridas se estabilizaron dentro del sitio activo de la enzima principalmente a través de múltiples enlaces de hidrógeno con Asp218, Asn226 y Gln214, así como mediante interacciones ?–alquilo y ?–azufre extensas que involucran a Leu221, Phe225 y Met311, lo que contribuyó colectivamente a la estabilidad energética mejorada de los complejos.

En contraste, KA44, con una puntuación de acoplamiento más baja ( 6,7 kcal/mol), formó un número limitado de enlaces de hidrógeno y exhibió contactos hidrofóbicos más débiles, lo que indica una estabilidad conformacional reducida y un ajuste menos favorable dentro del sitio de unión.

El inhibidor de referencia, metotrexato (MTX), validó la fiabilidad del modelo de acoplamiento, mostrando una puntuación de acoplamiento de ?9,7 kcal/mol, lo que es consistente con una potente inhibición de la TS y comparable a la de las moléculas híbridas activas. Por el contrario, el 5-fluorouracilo (5-FU) mostró una afinidad de unión marcadamente menor ( 4,9 kcal/mol), lo que es consistente con su estructura química simple y la ausencia de interacciones hidrofóbicas o de apilamiento ? extensas.

En general, los resultados indican que los híbridos esteroideos GE23 y CS18 forman los complejos enzima-inhibidor más estables, caracterizados por una combinación óptima de enlaces de hidrógeno e interacciones ?–alquilo y ?–azufre estabilizadoras dentro del sitio catalítico. Su unión energéticamente favorable supera a la de los compuestos de referencia convencionales, lo que sugiere una mejor bioactividad y selectividad hacia el objetivo de la timidilato sintasa.

De la misma manera, el metotrexato (MTX) (puntuación de acoplamiento: ?9,7 kcal/mol), como antifolato clásico, mostró una afinidad significativa por la TS, formando enlaces de hidrógeno con Phe80, Cys195, Ser216, Gly220, Phe225 y Tyr258. Las interacciones ?–? y ?–anión con Asp218, Phe225 y Met311 contribuyeron a la estabilidad general.

Aunque la puntuación de acoplamiento fue alta ( 9,7 kcal/mol), MTX mostró ligeramente menos contactos hidrofóbicos que los derivados híbridos, lo que refleja su naturaleza altamente polar. Esto apoya la hipótesis de que la incorporación de un andamio esteroideo en las moléculas híbridas mejora la lipofilicidad y fortalece la unión a través de contactos no polares, lo que puede traducirse en un mejor comportamiento farmacocinético.

El antimetabolito de referencia 5-FU, un conocido inhibidor de la timidilato sintasa, demostró una puntuación de acoplamiento relativamente baja en las mismas condiciones. Interactuó con Ser216, Gly222 y Asn226 a través de enlaces carbonilo e hidrógeno, lo que refleja su conocido, aunque transitorio, modo de unión al sitio catalítico. La ausencia de contactos hidrofóbicos o aromáticos fuertes probablemente explica la menor energía de unión favorable en comparación con los análogos híbridos. Este hallazgo es consistente con los datos experimentales que indican que la actividad del 5-FU surge de la conversión intracelular a FdUMP, que forma un complejo ternario covalente con la TS y el folato, en lugar de a través de una unión no covalente directa y estable. El 5-FU forma un enlace de hidrógeno entre el grupo NH del andamio de uracilo y Ser216. Mientras tanto, el grupo carbonilo en C2 también forma un enlace de hidrógeno con el mismo aminoácido. Además, el grupo carbonilo en C4 forma un enlace de hidrógeno con Asn226, mientras que se formaron interacciones de apilamiento ?-apilamiento entre la región aromática y los residuos de aminoácidos Leu221 y Phe225. En nuestro modelo, el NH en la tercera posición también forma un enlace de hidrógeno con Ser216, y el grupo C2=O forma un enlace de hidrógeno con el mismo aminoácido. Sin embargo, el grupo carbonilo en C4 forma su enlace de hidrógeno con el aminoácido Gln214 en lugar de Asn226 y también forma un enlace C-H con Gly217. A pesar de las diferencias entre los aminoácidos que interactúan, nuestro modelo sugiere que el 5-FU se une en la misma región catalítica que se informó anteriormente [^[37],^[38],^[39],^[40]].

El compuesto GE23, un conjugado de 5-FU y la testosterona modificada, también se encontró que se une fuertemente a la TS y, de hecho, mostró la mayor afinidad de unión para la timidilato sintasa, lo que se refleja en su energía de acoplamiento más favorable, con una puntuación de acoplamiento de ?11,8 kcal/mol. La porción esteroide del conjugado forma interacciones de van der Waals hidrofóbicas con los aminoácidos Ile108, Leu221 y Met311, y se forma una interacción ?-? entre C10 del anillo de ciclopentano y Phe225. La porción de 5-fluorouracilo se une al mismo bolsillo que el modelo acoplado de 5-FU, formando dos enlaces de hidrógeno entre C2=O, el grupo NH en la tercera posición y Asn226. Además, el grupo C4=O forma tres enlaces de hidrógeno (dos convencionales y uno carbono-hidrógeno) con Gln214, Asp218 y Gly217 (C-H). Estos resultados sugieren que la arquitectura molecular de GE23 permite una acomodación óptima dentro de la cavidad catalítica, proporcionando fuertes interacciones de anclaje comparables o superiores a los inhibidores clásicos de la TS.

Los compuestos CS18 y CS23 exhiben un motivo de unión parcialmente diferente. En el caso de CS18 (11,4 kcal/mol), la porción esteroide de los conjugados forma interacciones alquilo y -alquilo con los aminoácidos Ile108, Leu221 y Phe225, que son los tres aminoácidos importantes del sitio catalítico de la TS. Además, la porción pirazolpirimidina forma un enlace -donador de hidrógeno entre el anillo de pirimidina aromático y Tyr258, y interacciones -alquilo con los aminoácidos Leu192 y Cys195, una interacción -azufre entre el anillo de pirimidina y Met311, y una interacción -catiónica con Arg50, pero también se observa que se forma una interacción donante-donante desfavorable entre el NH de anilina y Arg50, lo que sugiere una pérdida de afinidad de unión. Curiosamente, el conjugado forma enlaces de hidrógeno con la región catalítica a través del enlazador introducido. En detalle, se forman dos enlaces de hidrógeno entre la región etano del enlazador que está unido al NH en la posición 1 del anillo de pirazol y los aminoácidos Ser216 y His256. Finalmente, los grupos carbonilo del enlazador succínico forman tres enlaces de hidrógeno con los aminoácidos Tyr135, Gln214 y Asp218.

CS23 (11,2 kcal/mol) es un conjugado modificado de CS18 que tiene un anillo de fenilo en C3 del anillo de pirazol. La porción de testosterona del conjugado forma un enlace de hidrógeno entre el grupo carbonilo y Lys308, mientras que los anillos de ciclohexano forman interacciones -alquilo con Phe80, y el anillo de ciclopentano forma una interacción -alquilo con Phe225 del sitio catalítico. Mientras tanto, el NH de anilina del anillo de pirimidina forma un enlace de hidrógeno con el aminoácido Asp218, y el anillo de pirazol forma un enlace de hidrógeno con Cys195. Con este aminoácido, se forman dos interacciones más: un enlace -donador de hidrógeno con el anillo de fenilo y una interacción -azufre con el anillo de pirazol. La unión de la porción pirazolpirimidina se estabiliza aún más a través de interacciones -alquilo entre el anillo de pirimidina y los aminoácidos Leu221 y Met311 y entre el anillo de fenilo y Leu192.

MV16 logró una puntuación de acoplamiento de ?11,0 kcal/mol, formando enlaces de hidrógeno con Arg50, Arg215, His256 y Tyr258 e interacciones halógeno con Asp21 y Ser59. Los anillos aromáticos del ligando se unieron en interacciones ?-? y ?-? con Phe31 y Phe225, mientras que Ile108, Cys195, Leu221 y Met311 proporcionaron estabilización hidrofóbica. Las contribuciones polares e hidrofóbicas combinadas implican un modo de unión multi-ancla que puede traducirse en una inhibición enzimática eficiente y una cinética de disociación más lenta.

KA44 (puntuación de acoplamiento: ?6,7 kcal/mol) exhibió una afinidad moderada hacia el sitio activo de la TS. Se observaron interacciones de enlace de hidrógeno con Asp218, Leu221 y Lys308, estabilizando el compuesto dentro del bolsillo catalítico. Interacciones hidrofóbicas adicionales con Val79, Phe80, Trp109, His196 y Leu221 ( – ), así como contactos ?-alquilo con Phe225 y enlace ?-azufre con Met311, contribuyeron a la estabilización del complejo ligando-enzima. Aunque la puntuación de acoplamiento general fue menor que la de otros derivados, el perfil de interacción de KA44 indica un ajuste moderado dentro del bolsillo activo, impulsado principalmente por contactos hidrofóbicos y de tipo alquilo en lugar de interacciones polares. El número limitado de enlaces de hidrógeno puede explicar su potencial inhibitorio más débil en relación con los otros análogos.

2.6. Estudios computacionales para investigar los efectos de los antimetabolitos lactámicos esteroideos sobre la DHFR

También se realizaron simulaciones de acoplamiento molecular utilizando la estructura cristalina de la DHFR humana (PDB: 1KMS) para dilucidar las interacciones de unión y predecir el potencial inhibitorio de los derivados de lactama esteroideos sintetizados (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en comparación con los antimetabolitos de referencia 5-fluorouracilo (5-FU) y metotrexato (MTX). La validación del protocolo de acoplamiento se llevó a cabo con SRI-9439 (RMSD = 1,853) (Figura 6A). Los resultados del acoplamiento (Tabla 9, Figura 6A–G) revelaron fuertes afinidades de unión para todos los derivados esteroideos, con puntuaciones de acoplamiento que oscilan entre ?10,9 y ?12,2 kcal/mol, superando significativamente las de los inhibidores clásicos MTX (9,5 kcal/mol) y 5-FU (4,9 kcal/mol), lo que indica una mayor estabilidad energética y una mejor complementariedad del sitio activo.

Como se esperaba, el 5-FU exhibió la afinidad de unión más débil (4,9 kcal/mol) y formó solo interacciones limitadas de hidrógeno y halógeno (Ile7, Val115, Glu30), junto con contactos hidrofóbicos débiles (Val8, Ala9). La falta de dominios aromáticos o no polares extendidos impide que el 5-FU logre una unión profunda en el bolsillo de la DHFR. Su actividad conocida en las células surge principalmente de la interferencia indirecta con la timidilato sintasa, no a través de la inhibición de la DHFR, lo que es consistente con los resultados computacionales presentes.

El orden de las afinidades de unión de la DHFR predichas fue KA-44 (12,2) > GE23 (11,7) > CS18 (11,6) > CS23 (11,5) > MV16 (10,9) > MTX (9,5) >> 5-FU (4,9).

Todas las moléculas híbridas superaron a los inhibidores estándar en la energía de unión predicha, lo que confirma el papel de mejora del andamio esteroideo en el logro de una unión más profunda y estable con el bolsillo catalítico de la DHFR. KA44 surgió como el ligando energéticamente más estable, probablemente debido a sus densas interacciones de apilamiento ?- y catiónicas, mientras que GE23, CS18 y CS23 combinaron el anclaje hidrofóbico con múltiples enlaces de hidrógeno, lo que refleja un potencial de inhibición enzimática multimodal.

En conjunto, estos resultados respaldan la hipótesis de que la hibridación esteroidea mejora tanto la afinidad de la DHFR como la estabilidad de la unión, ofreciendo un marco de diseño racional para desarrollar inhibidores de doble objetivo capaces de interrumpir las vías del metabolismo del folato y la síntesis de ADN en el cáncer colorrectal y pancreático resistente.

El antifolato clásico MTX mostró una fuerte puntuación de acoplamiento de ?9,5 kcal/mol, participando en múltiples enlaces de hidrógeno con Glu30, Thr56, Ser59, Asn64, Arg70, Val115 y Tyr121, así como en un apilamiento ?-? con Phe31. Interacciones ?-? e hidrofóbicas adicionales con Ala9 e Ile60 estabilizaron la orientación de unión. Aunque MTX sigue siendo un ligando de DHFR de alta afinidad, las energías de acoplamiento superiores de los híbridos esteroideos (10,9 a ?12,2 kcal/mol) sugieren que la conjugación lipofílica mejora sustancialmente la afinidad de la enzima a través de una mejor ocupación del bolsillo y complementariedad no polar.

GE23 demostró una puntuación de acoplamiento muy favorable (11,7 kcal/mol), comparable a KA-44, respaldada por múltiples enlaces de hidrógeno (Ala9, Glu30, Asn64) e interacciones halógeno/aromáticas (Phe31, Leu22, Phe34, Ile60, Pro61). La estructura híbrida permite que la porción de 5-fluorouracilo ocupe el bolsillo del sustrato canónico, mientras que el andamio esteroideo refuerza la unión a través del anclaje hidrofóbico a lo largo de Leu67 y Val115. Este comportamiento de doble anclaje refleja el patrón de inhibición bifuncional que se observa en los análogos antifolato híbridos, lo que sugiere que GE23 puede imitar tanto la región del sustrato como la del cofactor de la DHFR.

CS18 logró una puntuación de acoplamiento de ?11,6 kcal/mol, caracterizada por enlaces de hidrógeno con Gly30, Ser59 y Tyr121 e interacciones ?-donadoras con Ala9. Su porción esteroide formó múltiples interacciones ?-alquilo y alquilo con Val8, Leu22, Phe31, Phe34, Ile60 y Leu67, lo que resultó en una extensa estabilización hidrofóbica en todo el bolsillo catalítico. La fuerte contribución del enlace de hidrógeno ?-donador con Tyr121 y el enlace de hidrógeno carbonilo en Ser59 respalda un perfil de unión polar-no polar mixto, que puede facilitar una inhibición enzimática duradera y velocidades de desacoplamiento más lentas en comparación con los inhibidores clásicos de la DHFR.

CS23 (11,5 kcal/mol) se unió firmemente dentro del sitio activo, formando enlaces de hidrógeno con Gly116 y Tyr121 mientras exhibía un extenso apilamiento ?- y interacciones hidrofóbicas con Phe31, Phe34, Ile60, Leu67, Val115 y Arg28/Arg32. La interacción ?-? en forma de T con Phe31 sugiere una estabilización aromática similar al anillo de pteridina del MTX. La extensión de fenilo de CS23 en C3 probablemente mejora la complementariedad de Van der Waals, mejorando la afinidad de unión sin depender de un fuerte emparejamiento de cargas.

MV16 (10,9 kcal/mol) mostró una afinidad de unión sustancial mediada por cuatro enlaces de hidrógeno (Asp21, Lys63, Asn64, Val115), respaldados por interacciones halógeno con Asp21 y Ser59. Los contactos hidrofóbicos con Phe31, Phe34, Ile60 y Pro61 estabilizaron la conformación del ligando. El modo de unión indica un mecanismo de anclaje híbrido que combina interacciones polares en la región de unión a NADPH y estabilización hidrofóbica cerca del sitio catalítico. El patrón se asemeja a los conjugados de esteroides y gemcitabina conocidos que modulan los cofactores redox e interfieren con la rotación de la enzima.

KA44 exhibió la mayor afinidad de unión (12,2 kcal/mol) entre todos los compuestos probados. Aunque no se formaron enlaces de hidrógeno convencionales, la molécula se estabilizó mediante una extensa red de interacciones hidrofóbicas y aromáticas. Más concretamente, se formaron cinco interacciones -alquílicas; dos de ellas se encuentran entre el anillo de pirimidina de la reversina y los aminoácidos Pro26 y Pro61 del centro catalítico, una se forma entre el anillo de pirazol de la reversina y Leu22, y dos se forman entre el anillo de ciclohexano del fragmento esteroideo del conjugado y Phe31 y Phe34. Además, el anillo bencílico de la reversina desempeña un papel central en el acoplamiento del conjugado al formar una interacción - en forma de T con Phe31 y una interacción -catiónica con la cadena lateral cargada de Lys63. Finalmente, el conjugado forma múltiples interacciones alquílicas con el centro catalítico hidrofóbico; la porción de ciclohexilamina de la reversina forma una interacción alquílica con Pro61. Se forman dos interacciones alquílicas entre los grupos metilo del fragmento esteroideo e Ile60, y, por último, se forma una interacción alquílica entre Pro61 y el anillo de ciclopentano del esteroide. Estos resultados sugieren que KA-44 se ajusta óptimamente a la hendidura hidrofóbica de la DHFR, funcionando como un potente inhibidor no clásico.

2.7. Resultados de Western Blot: GE23, CS18 y CS23 como posibles inhibidores de TYSY

Como se mencionó anteriormente, se probaron tres antimetabolitos esteroideos láctámicos (GE23, CS18 y CS23) como posibles inhibidores de TYSY en células HT-29 y HUPT3 tras un tratamiento de 6 h a la concentración TGI. Para comparar sus efectos, se incluyó 5-FU como compuesto de referencia. Según el análisis de Western blot, en las células HT-29, los tres derivados inhibieron la actividad de TYSY de forma similar a 5-FU. Específicamente, la segunda banda en el blot señala el efecto inhibidor de los derivados y 5-FU, mientras que la banda específica está ausente en el grupo de control (Figura 7A). Las bandas superiores de TYSY representan a TYSY en complejos ternarios compuestos por TYSY, CH2THF y FdUMP. La densidad de las bandas superiores se correlaciona con la concentración intracelular de FdUMP [^[38]]. Resultados similares se muestran en la Figura 7B, donde la segunda banda aparece tras el tratamiento con los tres derivados y 5-FU, en contraste con su ausencia en las células no tratadas.

2.8. Inhibición de la actividad de la dihidrofolato reductasa (DHFR)

Se realizó un cribado de la inhibición de la DHFR para los compuestos probados GE23, CS18, CS23, KA44, MV16, 5-FU, GEM y MTX en un ensayo colorimétrico de actividad enzimática de la DHFR sin células. Se incluyó MTX como control positivo y compuesto de referencia. Todos los compuestos se probaron en un rango de concentraciones entre 5 y 500 nM. Todos los resultados se presentan en la Figura 8 y la Figura 9 como curvas de respuesta a la dosis, así como en la Tabla 10. Todos los antimetabolitos esteroideos homo-aza probados mostraron un efecto inhibidor significativo sobre la actividad de la DHFR (mayor que MTX). 5-FU y GEM demostraron un bajo efecto inhibidor. El inhibidor de DHFR más potente resultó ser KA44. El efecto inhibidor de los compuestos probados en orden descendente, desde el inhibidor más potente hasta el más débil, fue KA44 > GE23 > CS18 ? CS23 > MV16 > MTX > GEM > 5-FU.

2.9. Correlación de datos y resultados

2.9.1. Efectos citostáticos/citotóxicos acumulativos de las moléculas probadas

Los datos acumulativos con respecto a los efectos citostáticos (GI50) de los compuestos probados sobre las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon humano se presentan en la Figura 10. El potencial citostático medio correspondiente de los compuestos probados en orden descendente, desde el más potente hasta el más débil, contra las líneas celulares de cáncer de páncreas fue

GEM > 5-FU ? KA44 > MV16 > CS23 > CS18 > MTX > GE2,

mientras que contra las líneas celulares de cáncer de colon, fue

KA44 > 5-FU ? CS23 > GEM > CS18 > MV16 > MTX > GE23 (p < 0,05).

Cuando se consideraron los valores de inhibición total del crecimiento (TGI), que reflejan el comportamiento citotóxico de los compuestos, la potencia citotóxica media siguió un patrón similar, pero menos pronunciado (Figura 11). Para las líneas celulares de cáncer de páncreas, el orden fue el siguiente:

GEM > 5-FU > CS23 > CS18 ? MV16 > KA44 > MTX > GE23.

Y para las líneas celulares de cáncer de colon, fue el siguiente:

CS23 > GEM ? CS18 > 5-FU ? MV16 > KA44 > GE23 > MTX (p < 0,05).

La actividad citostática media (media GI50) inducida por los compuestos probados contra las cuatro líneas celulares de cáncer de colon fue significativamente superior a la de las tres líneas celulares de cáncer de páncreas (media GI50 = 19,06 y 49,84 ?, respectivamente (p < 0,01)). Por otro lado, la actividad citotóxica media de los compuestos probados fue similar para las líneas celulares de cáncer de colon y páncreas (TGI = 147,5 y 145,5 ?, respectivamente).

2.9.2. Correlación de los efectos citostáticos/citotóxicos de las moléculas probadas con las puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular de la timidilato sintasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en el estudio de modelado molecular de TYSY reveló una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,75 (R cuadrado ajustado = 0,488, p < 0,05) (Figura 12).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes valores de TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en el estudio de modelado molecular de TYSY resultó ser cero, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,008 (R cuadrado ajustado = ?0,16, p < 0,02).

La citotoxicidad inducida contra las siete líneas celulares de cáncer humano por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con su actividad inhibidora y las puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular de TYSY. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con la inhibición inducida de TYSY. Los antimetabolitos esteroideos láctámicos híbridos presentaron una muy buena y significativa correlación entre su actividad citostática y las puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > GE23 ? CS23 ? MV16 > KA44. Estos resultados pueden explicarse por los mecanismos moleculares más complejos y por el hecho de que los compuestos probados inducen citotoxicidad en las células cancerosas más allá de la inhibición de la actividad de TYSY.

2.9.3. Correlación de los efectos citostáticos/citotóxicos de las moléculas probadas con las puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular de la dihidrofolato reductasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en el estudio de modelado molecular de DHFR reveló una correlación moderada, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,76 (R cuadrado ajustado = 0,512, p < 0,03) (Figura 13).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes valores de TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en el estudio de modelado molecular de DHFR resultó ser baja/moderada y no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,44 (R cuadrado ajustado = 0,06, p < 0,12). La correlación débil entre DBS/TGI sugiere que la citotoxicidad implica otras vías, como efectos moleculares fuera del objetivo o estrés celular general del conjugado esteroideo lipofílico.

La correlación lineal entre el 50% de inhibición de la actividad de la DHFR (IC50) inducida por los compuestos probados en un ensayo enzimático de DHFR sin células, in vitro, y las respectivas puntuaciones de acoplamiento in silico en el estudio de modelado molecular de DHFR mostró una correlación muy fuerte, con un índice de correlación de Pearson (r) = 0,96 (R cuadrado ajustado = 0,915, p < 0,001) (Figura 14).

Por lo tanto, los estudios de acoplamiento computacional sobre la afinidad de unión de los compuestos probados en el sitio activo de la DHFR pueden predecir la inhibición inducida de la actividad de la DHFR con alta precisión.

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de la DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,65 (R cuadrado ajustado = 0,322, p < 0,03) (Figura 15).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se interpretó mediante los correspondientes valores de TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de la DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación débil/moderada no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0,44 (R cuadrado ajustado = 0,059, p < 0,13).

En conclusión, la citotoxicidad inducida contra las siete líneas celulares de cáncer humano por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con sus puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular en el sitio activo de la DHFR, ni con la inhibición generada de la actividad enzimática de la DHFR. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con sus puntuaciones de acoplamiento en el estudio de modelado molecular en el sitio activo de la DHFR o con la inhibición inducida de la actividad enzimática de la DHFR. Los antimetabolitos esteroideos láctámicos híbridos presentaron una muy buena y significativa correlación de su actividad citostática con la inhibición de la actividad enzimática de la DHFR en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > MV16 ? CS23 > KA44 > GE23.

Los efectos citotóxicos de los fármacos probados probablemente se ejercen con la participación de otros mecanismos celulares más allá de la inhibición de la actividad de la DHFR.

Las correlaciones lineales entre los efectos citostáticos medios (GI50) y los efectos citostáticos/citotóxicos generados, tal como se interpretó mediante los correspondientes valores de TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares de cáncer humano y las respectivas puntuaciones de acoplamiento combinadas (DBS DHFR + DBS TYSY) se presentan en la Figura 16. Aparecieron correlaciones significativas entre la actividad citostática (GI50) de los compuestos probados y sus respectivas DBS combinadas en DHFR y TYSY (índice de correlación de Pearson, r = ?0,81, R cuadrado ajustado = 0,604, p < 0,01). Los antimetabolitos esteroideos láctámicos híbridos presentaron una muy buena y significativa correlación de su actividad citostática con sus respectivas puntuaciones de acoplamiento combinadas en los sitios de unión de DHFR y TYSY en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > KA44 > MV16 ? CS23. Estos resultados indicaron que la actividad antitumoral citostática de los compuestos probados y, más específicamente, de los antimetabolitos esteroideos CS18, KA44, CS23 y MV16 sobre el cáncer de colon y páncreas puede predecirse de forma segura mediante sus DBS combinadas en DHFR y TYSY. Por otro lado, no se observó una correlación significativa en la actividad de los compuestos probados entre sus DBS combinadas en DHFR y TYSY y sus respectivos efectos citotóxicos, tal como lo indican los correspondientes valores de TGI (índice de correlación de Pearson, r = ?0,24, R cuadrado ajustado = ?0,097, p < 0,23).

2.9.4. Correlaciones de la sensibilidad de los compuestos probados a las mutaciones conocidas, clínicamente significativas y susceptibles de ser abordadas en las líneas celulares probadas

Se detectaron mutaciones oncogénicas clínicamente significativas y susceptibles de ser abordadas en las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon humano probadas mediante tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). Las mutaciones oncogénicas frecuentes y clínicamente significativas en el cáncer de colon y páncreas de las vías de señalización RAS-RAF-MEK-ERK y PI3K-AKT-mTOR, así como en TP53, se muestran en la Tabla 1.

Como se muestra en las Figuras 17 y 18, no se pueden extraer conclusiones sobre una actividad antitumoral específica o dependiente de los compuestos probados sobre las líneas celulares cancerosas analizadas, en relación con las respectivas mutaciones en los genes KRAS, BRAF, PI3K y TP53 que portan. No se observó una correlación universal simple con mutaciones individuales de KRAS, BRAF, PI3K o TP53, aunque el contexto celular (potencialmente definido por una combinación de mutaciones u otros factores y alteraciones combinadas de las vías de señalización) influye en la sensibilidad. Las células cancerosas PANC 08.13 que portan la mutación p.G12D c.35G>A en KRAS y que no tienen mutaciones en BRAF, PI3K y TP53, mostraron la mayor resistencia al tratamiento con los compuestos probados. Por otro lado, las células LS174T que portan la misma mutación en KRAS y, además, la mutación p.D211G c.632A>G en BRAF y la mutación p.H1047R c.3140A>G en PIK3CA, parecieron ser más sensibles. Por el contrario, las células PANC 03.27 con KRAS mutado (p.G12V c.35G>T) y TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) pero con BRAF y PI3K de tipo salvaje (wt), son más sensibles a los antimetabolitos antineoplásicos probados que las células cancerosas SW403 que portan la misma mutación en KRAS; TP53 mutado; y, además, PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y BRAF de tipo salvaje. Además, las células HT-29 con KRAS de tipo salvaje, BRAF mutado (p.V600E c.1799T>A), PIK3CA mutado (p.P449T c.1345C>A) y TP53 mutado (p.R273H c.818G>A) presentan una sensibilidad intermedia a los fármacos probados. Sin embargo, cabe destacar que, con respecto a los antimetabolitos esteroideos homo-aza, (a) el KA44 es el más activo contra las células cancerosas de colon HT29 (KRAS wt; BRAF mutado V600E; PIK3CA mutado P449T) y las células cancerosas de colon LoVo que portan KRAS mutado (p.G13D c.38G>A) y PIK3CB (p.E1051K c.3151G>A), así como BRAF y TP53 de tipo salvaje. Por otro lado, las células LS174T con PIK3CA mutado (p.H1047R c.3140A>G), KRAS (p.G12D c.35G>A), BRAF (p.D211G c.632A>G) y TP53 de tipo salvaje (wt) presentaron baja sensibilidad a KA44. Tal vez las células cancerosas con mutaciones específicas de PI3K o combinaciones de mutaciones específicas sean más sensibles a los efectos antiproliferativos de KA44. (b) CS23 induce el mayor efecto antitumoral citostático y citotóxico contra las células cancerosas de páncreas PANC 03.27 que portan KRAS mutado (p.G12V c.35G>T), mientras que TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) tiene BRAF y PI3K de tipo salvaje. Por el contrario, las células cancerosas SW403 portan la misma mutación que la mutación de KRAS de PANC 03.27 y tienen PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y TP53 (p.E51* c.151G>T), mientras que BRAF no está mutado y presentaron una sensibilidad significativamente menor a CS23. En general, con respecto a KRAS (tipo salvaje y diferentes mutaciones), las células cancerosas de colon LoVo que portan la mutación p.G13D c.38G>A son las más sensibles a los compuestos probados.

2.9.1. Efectos Citostáticos/Citotóxicos Cumulativos de las Moléculas Probadas

Los datos acumulados sobre los efectos citostáticos (GI50) de los compuestos probados sobre las líneas celulares humanas de cáncer de páncreas y colon analizadas se presentan en la Figura 10. El correspondiente potencial citostático medio de los compuestos probados en orden descendente, desde el más fuerte hasta el más débil, contra las líneas celulares de cáncer de páncreas fue:

GEM > 5-FU ? KA44 > MV16 > CS23 > CS18 > MTX > GE2,

mientras que contra las líneas celulares de cáncer de colon, fue:

KA44 > 5-FU ? CS23 > GEM > CS18 > MV16 > MTX > GE23 (p < 0.05).

Cuando se consideraron los valores de inhibición total del crecimiento (TGI), que reflejan el comportamiento citotóxico de los compuestos, la potencia citotóxica media siguió un patrón similar pero menos pronunciado (Figura 11). Para las líneas celulares de cáncer de páncreas, el orden fue el siguiente:

GEM > 5-FU > CS23 > CS18 ? MV16 > KA44 > MTX > GE23.

Y para las líneas celulares de cáncer de colon, fue el siguiente:

CS23 > GEM ? CS18 > 5-FU ? MV16 > KA44 > GE23 > MTX (p < 0.05).

La actividad citostática media (GI50 medio) inducida por los compuestos probados contra las cuatro líneas celulares de cáncer de colon fue significativamente superior a la de las tres líneas celulares de cáncer de páncreas (GI50 medio = 19.06 y 49.84 ?, respectivamente (p < 0.01)). Por otro lado, la actividad citotóxica media de los compuestos probados fue similar para las líneas celulares de cáncer de colon y páncreas (TGI = 147.5 y 145.5 ?, respectivamente).

2.9.2. Correlación de los Efectos Citostáticos/Citotóxicos de las Moléculas Probadas con las Puntuaciones de Unión del Acoplamiento en la Timidilato Sintasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento in silico en TYSY reveló una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.75 (R cuadrado ajustado = 0.488, p < 0.05) (Figura 12).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento in silico en TYSY resultó ser cero, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.008 (R cuadrado ajustado = ?0.16, p < 0.02).

La citotoxicidad inducida contra las siete líneas celulares humanas de cáncer por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con su actividad inhibidora y las puntuaciones de unión del acoplamiento en TYSY. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con la inhibición inducida de TYSY. Los antimetabolitos esteroideos lactámicos híbridos presentaron una correlación muy buena y significativa entre su actividad citostática y las puntuaciones de unión del acoplamiento en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > GE23 ? CS23 ? MV16 > KA44. Estos resultados pueden explicarse por los mecanismos moleculares más complejos y por el hecho de que los compuestos probados inducen citotoxicidad en las células cancerosas más allá de la inhibición de la actividad de TYSY.

2.9.3. Correlación de los Efectos Citostáticos/Citotóxicos de las Moléculas Probadas con las Puntuaciones de Acoplamiento en la Dihidrofolato Reductasa

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento in silico en DHFR reveló una correlación moderada, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.76 (R cuadrado ajustado = 0.512, p < 0.03) (Figura 13).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se demostró mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento in silico en DHFR resultó ser baja/moderada y no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.44 (R cuadrado ajustado = 0.06, p < 0.12). La correlación débil entre DBS/TGI sugiere que la citotoxicidad implica otras vías, como efectos moleculares fuera del objetivo o estrés celular general del conjugado esteroideo lipofílico.

La correlación lineal entre el 50% de inhibición de la actividad de DHFR (IC50) inducida por los compuestos probados en un ensayo enzimático in vitro y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento in silico en DHFR mostró una correlación muy fuerte, con un índice de correlación de Pearson (r) = 0.96 (R cuadrado ajustado = 0.915, p < 0.001) (Figura 14).

Por lo tanto, los estudios de acoplamiento computacional sobre la afinidad de unión de los compuestos probados en el sitio activo de DHFR pueden predecir la inhibición inducida de la actividad de DHFR con alta precisión.

La correlación lineal entre los efectos citostáticos medios (GI50) producidos por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación moderada significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.65 (R cuadrado ajustado = 0.322, p < 0.03) (Figura 15).

La correlación lineal entre los efectos citostáticos/citotóxicos medios generados, tal como se interpretó mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas concentraciones de fármaco que inhiben la actividad de DHFR en un 50% (IC50) mostró una correlación débil/moderada no significativa, con un índice de correlación de Pearson (r) = ?0.44 (R cuadrado ajustado = 0.059, p < 0.13).

En conclusión, la citotoxicidad inducida contra las siete líneas celulares humanas de cáncer por los compuestos probados no se correlacionó significativamente con sus puntuaciones de unión del acoplamiento en DHFR, ni con la inhibición generada de la actividad enzimática de DHFR. Por otro lado, los efectos citostáticos de los compuestos probados se correlacionaron significativamente con sus puntuaciones de unión del acoplamiento en DHFR o con la inhibición inducida de la actividad enzimática de DHFR. Los antimetabolitos esteroideos lactámicos híbridos presentaron una correlación muy buena y significativa de su actividad citostática con la inhibición de la actividad enzimática de DHFR en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > MV16 ? CS23 > KA44 > GE23.

Los efectos citotóxicos de los fármacos probados probablemente se ejercen con la participación de otros mecanismos celulares más allá de la inhibición de la actividad de DHFR.

Las correlaciones lineales entre los efectos citostáticos medios (GI50) y los efectos citostáticos/citotóxicos generados, tal como se interpretó mediante los correspondientes TGI, por los compuestos probados contra las siete líneas celulares humanas de cáncer y las respectivas puntuaciones de unión del acoplamiento combinadas (DBS DHFR + DBS TYSY) se presentan en la Figura 16. Se observaron correlaciones significativas entre la actividad citostática (GI50) de los compuestos probados y sus respectivas DBS combinadas en DHFR y TYSY (índice de correlación de Pearson, r = ?0.81, R cuadrado ajustado = 0.604, p < 0.01). Los antimetabolitos esteroideos lactámicos híbridos presentaron una correlación muy buena y significativa de su actividad citostática con su respectiva puntuación de unión del acoplamiento combinada en los sitios de unión de DHFR y TYSY en el siguiente orden dentro de los intervalos de confianza del 95%: CS18 > KA44 > MV16 ? CS23. Estos resultados indicaron que la actividad antitumoral citostática de los compuestos probados y, más específicamente, de los antimetabolitos esteroideos CS18, KA44, CS23 y MV16 sobre el cáncer de colon y páncreas puede predecirse de forma segura mediante sus DBS combinadas en DHFR y TYSY. Por otro lado, no se observó una correlación significativa en la actividad de los compuestos probados entre sus DBS combinadas en DHFR y TYSY y sus respectivos efectos citotóxicos, tal como lo indican los correspondientes TGI (índice de correlación de Pearson, r = ?0.24, R cuadrado ajustado = ?0.097, p < 0.23).

2.9.4. Correlaciones de la Sensibilidad de los Compuestos Probados con las Mutaciones Conocidas, Accionables y Clínicamente Significativas en las Líneas Celulares Probadas

Se detectaron mutaciones oncogénicas accionables y clínicamente significativas en las líneas celulares humanas de cáncer de páncreas y colon probadas utilizando la tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). Las mutaciones oncogénicas frecuentes y clínicamente significativas en el cáncer de colon y páncreas de las vías de señalización RAS-RAF-MEK-ERK y PI3K-AKT-mTOR, así como en TP53, se muestran en la Tabla 1.

Como se muestra en las Figuras 17 y 18, no se pueden extraer conclusiones sobre una actividad antitumoral específica o dependiente de los compuestos probados en las líneas celulares cancerosas analizadas, en relación con las respectivas mutaciones en los genes KRAS, BRAF, PI3K y TP53 que portan. No se observó una correlación universal simple con mutaciones individuales de KRAS, BRAF, PI3K o TP53, aunque el contexto celular (potencialmente definido por una combinación de mutaciones u otros factores y alteraciones combinadas de las vías de señalización) influye en la sensibilidad. Las células cancerosas PANC 08.13 que portan la mutación p.G12D c.35G>A en KRAS y que no presentan mutaciones en BRAF, PI3K y TP53, mostraron la mayor resistencia al tratamiento con los compuestos probados. Por otro lado, las células LS174T que portan la misma mutación en KRAS y, además, la mutación p.D211G c.632A>G en BRAF y la mutación p.H1047R c.3140A>G en PIK3CA, parecieron ser más sensibles. Por el contrario, las células PANC 03.27 con KRAS mutado (p.G12V c.35G>T) y TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) pero con BRAF y PI3K de tipo salvaje (wt), son más sensibles a los antimetabolitos antineoplásicos probados que las células cancerosas SW403 que portan la misma mutación en KRAS; TP53 mutado; y, además, PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y BRAF de tipo salvaje. Además, las células HT-29 con KRAS de tipo salvaje, BRAF mutado (p.V600E c.1799T>A), PIK3CA mutado (p.P449T c.1345C>A) y TP53 mutado (p.R273H c.818G>A) presentan una sensibilidad intermedia a los fármacos probados. Sin embargo, cabe destacar que, con respecto a los antimetabolitos homo-aza esteroideos, (a) el KA44 es el más activo contra las células cancerosas colorrectales HT29 (KRAS wt; BRAF mutado V600E; PIK3CA mutado P449T) y las células cancerosas colorrectales LoVo que portan KRAS mutado (p.G13D c.38G>A) y PIK3CB (p.E1051K c.3151G>A), así como BRAF y TP53 de tipo salvaje. Por otro lado, las células LS174T con PIK3CA mutado (p.H1047R c.3140A>G), KRAS (p.G12D c.35G>A), BRAF (p.D211G c.632A>G) y TP53 de tipo salvaje (wt) presentaron baja sensibilidad a KA44. Tal vez las células cancerosas con mutaciones específicas de PI3K o combinaciones de mutaciones específicas sean más sensibles a los efectos antiproliferativos de KA44. (b) CS23 induce el mayor efecto antitumoral citostático y citotóxico contra las células cancerosas pancreáticas PANC 03.27 que portan KRAS mutado (p.G12V c.35G>T), mientras que TP53 (variante de empalme p. c.375+5G>T) tiene BRAF y PIK3K de tipo salvaje. Por el contrario, las células cancerosas SW403 portan la misma mutación que la mutación de KRAS de PANC 03.27 y tienen PIK3CA mutado (p.Q546K c.1636C>A) y TP53 (p.E51* c.151G>T), mientras que BRAF no está mutado y presentaron una sensibilidad significativamente menor a CS23. En general, con respecto a KRAS (tipo salvaje y diferentes mutaciones), las células cancerosas colorrectales LoVo que portan la mutación p.G13D c.38G>A son las más sensibles a los compuestos probados.

3. Discusión

El presente estudio introduce y evalúa sistemáticamente una nueva familia de antimetabolitos homo-aza esteroideos diseñados para explotar las vulnerabilidades farmacodinámicas de las células cancerosas colorrectales y pancreáticas. Estos compuestos (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) se concibieron como inhibidores de doble objetivo que integran las propiedades mecánicas de los análogos de nucleobases (que se dirigen a la timidilato sintasa, TS) y los antifolatos (que se dirigen a la dihidrofolato reductasa, DHFR) en un único marco molecular. La conjugación de estos farmacóforos sobre una estructura de esteroides representa una hibridación estratégica que fusiona la potencia citostática con una mejor lipofilicidad, penetración celular y, posiblemente, una mayor selectividad. Además, esta citostasis podría predecirse cuantitativamente a partir del acoplamiento in silico a TS y DHFR.

Los antimetabolitos híbridos esteroideos exhibieron efectos antiproliferativos moderados pero consistentes, con valores medios de GI50 que oscilan entre 10 y 80 µM en múltiples modelos de cáncer colorrectal y pancreático, y esto se combinó con la inhibición dual de TS/DHFR. GI50 es la métrica de potencia primaria para estos compuestos, y la citotoxicidad (IC50) se produce a concentraciones significativamente más altas. Los compuestos indujeron un pronunciado efecto citostático, particularmente contra las líneas celulares de cáncer colorrectal, manteniendo una citotoxicidad limitada a niveles de TGI superiores a 100 µM. CS23 y CS18 surgieron como los miembros más activos de la serie, y KA44 demostró una potencia excepcional en la inhibición de DHFR a pesar de tener efectos antiproliferativos más moderados en ciertos contextos celulares.

Para evaluar aún más la selectividad hacia las células malignas, se determinaron los valores de GI50 en tres líneas celulares humanas normales (FHC, CCD-112CoN y MRC-5) y se calcularon las relaciones del índice terapéutico (TI) como el valor medio de GI50 en las células normales dividido por el GI50 en las células tumorales. Todos los híbridos esteroideos exhibieron valores de GI50 sustancialmente más altos en las células normales (468–568 µM) en comparación con los antimetabolitos clásicos, lo que indica una actividad citostática reducida en las células no transformadas. El análisis de TI reveló que KA44, CS23 y MV16 mostraron los perfiles de selectividad más favorables en todo el panel tumoral, con valores de TI particularmente altos observados en modelos de cáncer específicos. Estos valores elevados de TI reflejan una pronunciada sensibilidad dependiente de la línea celular resultante de bajos valores de GI50 de las células tumorales combinados con una actividad mínima en las células normales, en lugar de una especificidad tumoral uniforme. En conjunto, estos hallazgos respaldan una ventana terapéutica mejorada para los híbridos esteroideos seleccionados al tiempo que destacan la influencia del contexto celular en la respuesta de los compuestos.

Las comparaciones con los antimetabolitos de referencia tenían como objetivo proporcionar puntos de referencia contextuales en lugar de comparaciones farmacodinámicas de dosis equivalentes. Sin embargo, el perfil citostático-citotóxico de estas moléculas contrasta marcadamente con los antimetabolitos clásicos como el 5-fluorouracilo (5-FU) y el metotrexato (MTX). Si bien el 5-FU y el GEM actúan principalmente como agentes que dañan el ADN e inducen tanto la detención de la replicación como la muerte celular, los híbridos esteroideos parecen inducir preferentemente una citostasis sostenida a través de la detención reversible de la fase S y la apoptosis progresiva en lugar de la necrosis aguda, con la excepción de CS23, que exhibe una alta potencia citostática, con también se observan potentes efectos citotóxicos a concentraciones más altas. Este comportamiento se alinea con la razón de diseño de dirigirse a los puntos de control metabólicos (TS y DHFR) en lugar de la escisión directa del ADN o la incorporación de nucleósidos [^[1], ^[7], ^[33]].

La citometría de flujo confirmó que CS23 desencadena la apoptosis de manera dependiente del tiempo y de la dosis, con fracciones de apoptosis temprana que alcanzan el 40% en las células HT-29 a las 72 horas, superando significativamente tanto la gemcitabina como el 5-FU. La cinética de la apoptosis temprana es detectable antes, pero se seleccionó el punto de tiempo de 72 horas para la consistencia con la sincronización de la proliferación/MTT. La mínima fracción necrótica subraya una vía de muerte regulada. Además, la acumulación observada en la fase S y el aumento concomitante en la fracción Sub-G1 respaldan firmemente un mecanismo de estrés de replicación debido al agotamiento de la timidilato, lo que es consistente con la inhibición de TS [^[32], ^[39]]. Los hallazgos paralelos en las células pancreáticas HUP-T3 revelan que la inducción de la apoptosis se conserva en los diferentes tipos de tejidos. Los análisis de apoptosis y del ciclo celular se centraron en el compuesto principal CS23, y los análisis comparativos más amplios en todos los derivados y puntos de tiempo siguen siendo un área para futuras investigaciones.

Los datos de acoplamiento y Western blot convergen para establecer TS como un objetivo genuino de los derivados esteroideos. Los compuestos exhibieron energías de acoplamiento entre ?11,2 y ?11,8 kcal/mol, superando al 5-FU clásico (5,1 kcal/mol). Los enlaces de hidrógeno formados con los residuos Asp218, Gln214 y Asn226, combinados con los contactos ?–alquilo y ?–azufre con Leu221, Phe225 y Met311, emulan la geometría de unión del complejo ternario FdUMP–TS–CH2THF que subyace a la citotoxicidad del 5-FU [^[32], ^[37]].

La validación de Western blot confirmó este mecanismo: la desaparición característica de la banda TS activa inferior y la aparición de las bandas del complejo ternario superior en las células tratadas con CS23, CS18 y GE23 reflejaron el comportamiento bioquímico de las muestras tratadas con 5-FU.

El paralelismo entre las predicciones de acoplamiento in silico y la inhibición bioquímica apoya firmemente que el resto esteroideo mejora la ocupación y la estabilidad del bolsillo, posiblemente a través de interacciones hidrofóbicas aumentadas y una reducción de los costos de desolvatación del ligando. Es importante destacar que la correlación (r = ?0,75, p < 0,05) entre las puntuaciones de acoplamiento de TS y los valores medios de GI50 en todas las siete líneas celulares cancerosas indica que la afinidad de unión es un fuerte predictor de la potencia citostática. Esta correlación implica que la inhibición de TS es un contribuyente principal a la detención del crecimiento observada, aunque no es el único determinante de la citotoxicidad general.

El análisis in silico de la unión a DHFR reveló una tendencia uniforme de alta afinidad entre los análogos esteroideos, con energías que van desde ?10,9 a ?12,2 kcal/mol, muy superiores a las del MTX (9,5 kcal/mol). El compuesto principal, KA44, logró una extensa interacción ?–? apilada con Phe31 y un acoplamiento ?–catiónico con Lys63, proporcionando una densa red hidrofóbica que recuerda a los andamios de antifolato optimizados [^[35]].

Estas predicciones computacionales se validaron empíricamente a través del ensayo de inhibición enzimática de DHFR, que demostró valores de IC50 de bajo nanomolar para todos los híbridos probados. KA44 (12 nM) y GE23 (16 nM) fueron particularmente potentes, superando la capacidad inhibitoria del MTX (30 nM). La extraordinaria correlación lineal (r = 0,96, p < 0,001) entre las puntuaciones de acoplamiento y los valores de IC50 enzimáticos confirma que el modelo de acoplamiento representa con precisión el entorno bioquímico real de DHFR. Esta correspondencia uno a uno establece el acoplamiento computacional como un sustituto predictivo para la inhibición enzimática en esta clase de compuestos.

Curiosamente, si bien todos los híbridos inhibieron eficazmente DHFR in vitro, los efectos citostáticos celulares (GI50) mostraron solo una correlación moderada (r = ?0,65, p < 0,03) con los valores de IC50 de DHFR, lo que sugiere una mediación parcial de la actividad antiproliferativa a través de esta vía. Esta discrepancia probablemente surge de las limitaciones farmacocinéticas, como la captación celular y la distribución subcelular, o de la dependencia multifactorial de la citostasis en el bloqueo tanto de TS como de DHFR.

Un resultado conceptual importante de este estudio es la demostración de que la inhibición combinada de TS y DHFR actúa sinérgicamente para predecir los resultados citostáticos. Cuando se combinaron las puntuaciones de acoplamiento de ambas enzimas (DBSTS + DBSDHFR), se obtuvo una correlación altamente significativa con los valores medios de GI50 (r = ?0,81, R2 ajustado = 0,604, p < 0,01). Esta sólida relación indica que la inhibición de la proliferación celular depende no solo de la fuerza de unión a una sola enzima, sino de la supresión integrada de ambos puntos de control del ciclo del folato.

Aunque se observaron fuertes correlaciones entre las puntuaciones de acoplamiento, la inhibición enzimática y la actividad citostática, estas asociaciones no implican una causalidad directa. Los estudios futuros investigarán las adaptaciones metabólicas posteriores y las respuestas de las vías compensatorias tras la inhibición de TS/DHFR por los híbridos esteroideos. Los experimentos de rescate utilizando la suplementación con timidina o ácido folínico dilucidarían aún más la contribución relativa de la inhibición de TS y DHFR, lo que podría realizarse en futuros estudios mecanicistas.

Mecanísticamente, este bloqueo dual interrumpe tanto la síntesis de dTMP (a través de la inhibición de TS) como la regeneración de tetrahidrofolato (a través de la inhibición de DHFR), lo que lleva al colapso del equilibrio del grupo de nucleótidos y a la detención en la fase S. La estrecha correlación con los parámetros citostáticos en lugar de citotóxicos sugiere aún más que esta interferencia combinada produce una estasis metabólica sin desencadenar una necrosis extensa, un efecto deseable para mantener el índice terapéutico.

La escasa correlación entre los valores combinados de DBS y los TGI (r = ?0,24, p > 0,2) proporciona una distinción mecanicista crucial: la citostasia (GI50) refleja la inhibición enzimática directa, mientras que la citotoxicidad (TGI o IC50) implica eventos secundarios, como el fallo mitocondrial, el estrés oxidativo, el colapso autofágico, etc., que se producen más allá del ámbito del eje TS-DHFR. Estos hallazgos corroboran que el principal determinante molecular de la potencia antiproliferativa reside en la supresión coordinada de TS/DHFR, mientras que otras vías posteriores regulan la citotoxicidad irreversible.

La estructura jerárquica de las correlaciones (IC50 de DHFR frente a DBS, r = 0,96 > DBS combinados frente a GI50, r = ?0,81 > DBS enzimáticos individuales frente a GI50, r ? ?0,75) delimita una cascada de información que va desde el acoplamiento molecular hasta el resultado celular. La correlación más alta entre la inhibición bioquímica y el acoplamiento refleja una congruencia estructural casi perfecta a nivel enzimático. La posterior disminución de la fuerza de la correlación al considerar los puntos finales celulares probablemente refleja el ruido biológico introducido por la captación, la eflusión y la señalización compensatoria específicas de cada célula.

Un elemento mecanicista esencial que emerge del presente trabajo es la constatación de que el núcleo de lactama (omo-aza) constituye el principal determinante estructural de la actividad biológica dentro de estos conjugados basados en esteroides. Si bien la hibridación general de un marco esteroideo con un farmacóforo antimetabolito proporciona un equilibrio topológico favorable entre la lipofilicidad y la funcionalidad polar, parece que el dominio de aza-lactama es el que impulsa las altas afinidades de acoplamiento y la eficacia citostática observadas en los compuestos probados. La amida cíclica introduce tanto rigidez como un patrón de enlace de hidrógeno direccional que permite un ajuste geométrico óptimo dentro de los sitios catalíticos, como los de la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR). En contraste con las amidas de cadena abierta o los derivados esteroideos no aza, el anillo de lactama impone una conformación restringida que minimiza las penalizaciones entrópicas durante la unión, mejorando la complementariedad entálpica y el tiempo de residencia dentro de la cavidad enzimática.

A nivel electrónico, la presencia de un átomo de nitrógeno dentro del anillo de lactama aumenta la densidad electrónica local y el momento dipolar, favoreciendo interacciones más estables con los residuos polares del sitio activo de la enzima diana. Esta mayor polarizabilidad puede facilitar el apilamiento ?–? o catión–? con aminoácidos aromáticos adyacentes (por ejemplo, Phe, Tyr, Trp), mientras que el oxígeno carbonílico de la lactama puede actuar como un aceptor de enlaces de hidrógeno dual, lo cual es fundamental para anclar el conjugado en regiones ricas en donantes de enlaces de hidrógeno. Además, la sustitución omo-aza introduce una deslocalización de resonancia parcial que redistribuye la carga a lo largo del sistema conjugado, mejorando la superposición orbital con los residuos catalíticos clave. Estas características a nivel cuántico proporcionan una justificación estructural plausible para las puntuaciones de acoplamiento consistentemente superiores obtenidas para los análogos que contienen lactama en comparación con sus contrapartes que no contienen lactama o que son amidas simples.

Desde el punto de vista de la química medicinal, esta información cambia la interpretación de la potencia de los compuestos, pasando de ser simplemente el resultado aditivo de la conjugación de esteroides y antimetabolitos a reflejar la contribución bioactiva intrínseca del farmacóforo de lactama. Por lo tanto, el anillo de lactama debe considerarse no como un enlazador neutro, sino como un núcleo farmacofórico dinámico y electrónicamente activo que orquesta la orientación espacial y la energía de unión del conjugado. Esta innovación estructural representa la principal novedad del diseño molecular actual: la integración de un aza-heterociclo basado en lactama que modula tanto la alineación estérica como las interacciones electrónicas, amplificando la eficacia de las moléculas híbridas más allá de lo que logran las estrategias de conjugación convencionales. En conjunto, estos hallazgos destacan el núcleo omo-aza como un impulsor clave de la selectividad, la afinidad y el rendimiento citotóxico, estableciendo así una nueva base conceptual para la optimización posterior de los antimetabolitos esteroideos.

No obstante, la persistencia de correlaciones estadísticamente significativas en tres escalas biológicas (enzima ? célula ? par enzimático combinado) es notable, lo que demuestra que la realidad bioquímica de la inhibición enzimática se transmite fielmente al comportamiento fenotípico. En el modelado farmacológico, este nivel de coherencia traslacional valida la hipótesis de diseño subyacente y subraya el poder predictivo de los enfoques computacionales y experimentales integrados [^[40],^[41]].

El perfilado de mutaciones de KRAS, BRAF, PI3K y TP53 en las siete líneas probadas no reveló una correlación estricta entre el genotipo y la respuesta, lo que indica que la actividad de los antimetabolitos esteroideos es mecanicísticamente independiente de las alteraciones clásicas de la señalización de MAPK y PI3K. En otras palabras, no se observó una asociación clara con las mutaciones individuales de KRAS, BRAF, PI3K o TP53, aunque el contexto celular parece influir en la sensibilidad. Esta posible independencia los distingue de los inhibidores de quinasas específicos de la vía y subraya su potencial eficacia en tumores genéticamente heterogéneos.

Sin embargo, se observaron tendencias sutiles. Por ejemplo, las células PANC 08.13 que albergan una única mutación KRAS G12D con BRAF y TP53 de tipo salvaje se encontraban entre las más resistentes, lo que sugiere que la maquinaria apoptótica y de control de puntos de control intacta puede modular los umbrales de sensibilidad. Por el contrario, las células LS174T con mutaciones triples en KRAS, BRAF y PI3KCA mostraron una mayor sensibilidad, lo que posiblemente refleja una vulnerabilidad metabólica aditiva. Estas observaciones implican que el bloqueo metabólico impuesto por la inhibición de TS/DHFR ejerce un efecto dominante que anula la transducción de señales oncogénicas, lo que hace que estos compuestos sean ampliamente activos en entornos con diversas mutaciones.

Los perfiles de correlación divergentes entre los valores de GI50 y TGI ilustran una importante distinción farmacodinámica. La citostasia (inhibición del crecimiento) está gobernada principalmente por la inhibición de las enzimas metabólicas, mientras que la citotoxicidad (muerte celular total) implica efectos de red secundarios, por ejemplo, la despolarización mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y el fallo del control de puntos de control. La falta de correlación entre TGI y las energías de acoplamiento (r ? 0) subraya que, más allá de un umbral de alteración metabólica, el destino celular está dominado por las respuestas posteriores estocásticas en lugar del bloqueo enzimático directo.

Esta separación sugiere que los híbridos esteroideos aza actúan como "frenos metabólicos" en lugar de citotóxicos directos. Su capacidad para mantener una inhibición del crecimiento a largo plazo con una necrosis mínima podría traducirse en perfiles de seguridad favorables in vivo, lo que se ha demostrado en nuestros trabajos anteriores [^[26],^[28]]. Además, la citostasia selectiva puede sensibilizar los tumores a insultos posteriores, como la radiación, los alquilantes del ADN o las inmunoterapias, lo que convierte a estas moléculas en candidatas para regímenes de combinación.

Desde la perspectiva del diseño de fármacos, la correlación entre las puntuaciones de acoplamiento combinadas y la actividad citostática ofrece una métrica predictiva cuantitativa. La ecuación de regresión derivada del conjunto de datos actual podría servir como modelo de calibración para futuros análogos, donde una puntuación de DBS_TS + DHFR combinada ? ?22 kcal/mol predice un GI50 inferior a 30 ?M con un 95% de confianza. Este tipo de predictibilidad matemática es extremadamente raro en la farmacoquímica y proporciona un marco tangible para el cribado virtual de alto rendimiento.

En esencia, los resultados actuales ejemplifican un bucle mecanicista cerrado: el acoplamiento computacional predice la inhibición bioquímica, que a su vez predice la citostasia fenotípica. Esta continuidad valida la premisa teórica del diseño racional multi-objetivo y sitúa estas moléculas dentro del paradigma emergente de la farmacología de redes, donde la modulación simultánea de nodos interconectados (TS, DHFR, metabolismo del folato) produce un mejor control terapéutico.

El núcleo esteroideo, además de servir como portador lipofílico, probablemente facilita la permeabilidad de la membrana y la retención intracelular. Su superficie no polar complementa la porción de nucleobase hidrofílica, lo que da como resultado un equilibrio anfipático óptimo para la difusión pasiva y la localización subcelular. Además, la conjugación puede conferir protección contra la desaminación y la eflusión, prolongando la exposición intracelular en relación con los antimetabolitos clásicos.

Desde el punto de vista farmacocinético, el esqueleto lipofílico también puede favorecer la unión a las proteínas plasmáticas y la reducción de la eliminación renal, lo que prolonga la vida media. Estas ventajas podrían compensar la necesidad de dosis altas, una limitación persistente de las terapias con 5-FU y MTX. La modesta variabilidad intercelular en el GI50 en las siete líneas (DE < 25%) apoya una biodisponibilidad uniforme dentro del sistema experimental.

A pesar de su diseño exhaustivo, el presente estudio tiene varias limitaciones inherentes que exigen una interpretación cautelosa. En primer lugar, todos los experimentos biológicos se llevaron a cabo in vitro utilizando líneas celulares establecidas; por lo tanto, los factores farmacocinéticos, metabólicos e inmunológicos que influyen en el comportamiento de los fármacos in vivo no se han caracterizado. La falta de validación in vivo limita la extrapolación de los hallazgos citostáticos y enzimáticos a la relevancia clínica. En segundo lugar, si bien el acoplamiento molecular y los análisis de correlación demostraron fuertes asociaciones estadísticas, estas relaciones no pueden dar cuenta por completo de los cambios conformacionales dinámicos de las enzimas o de los efectos del disolvente que se producen en condiciones fisiológicas. En tercer lugar, este estudio empleó un panel limitado de líneas celulares de páncreas y colon, que, aunque son genéticamente diversas, pueden no capturar toda la heterogeneidad de los tumores humanos, en particular en lo que respecta a los transportadores, los mecanismos de eflusión y las enzimas metabólicas. En cuarto lugar, no se realizó ninguna confirmación estructural directa (por ejemplo, cristalografía o dinámica molecular) para verificar los modos de unión predichos de los híbridos. Por último, si bien las correlaciones entre las puntuaciones de acoplamiento y la actividad biológica fueron sólidas, se basan en valores medios de grupo en lugar de en la cinética celular individual, lo que introduce un posible exceso de simplificación. Los estudios futuros que incorporen modelos animales, modelado cinético y estructuras de co-cristal son necesarios para corroborar la validez traslacional de estos prometedores antimetabolitos esteroideos.

Sin embargo, la relevancia traslacional de este trabajo radica en demostrar que la hibridación de doble objetivo puede lograr una inhibición sinérgica predecible a nivel enzimático y celular. En términos clínicos, estas moléculas podrían superar potencialmente los mecanismos de resistencia asociados con la inhibición aislada de TS o DHFR, en particular, la regulación al alza de TS o los transportadores de folato tras la exposición a 5-FU o MTX [^[1],^[8],^[38]]. Al privar simultáneamente a las células de timidilato y tetrahidrofolato, los híbridos hacen que la adaptación metabólica compensatoria sea inviable.

El presente estudio se limita a análisis in vitro e in silico y, por lo tanto, no aborda la farmacocinética in vivo, la eficacia o la toxicidad sistémica. Basándose en el marco mecanístico y correlativo establecido en el presente estudio, estos resultados deben considerarse como una prueba de concepto preclínica, que proporciona una justificación mecanística y biológica para futuras investigaciones, que deberían extenderse más allá de la validación in vitro e in silico hacia una evaluación preclínica exhaustiva. El siguiente paso crítico es la evaluación de los perfiles farmacocinéticos, metabólicos y toxicológicos de los antimetabolitos esteroideos in vivo, con el fin de determinar la biodisponibilidad, la distribución en los órganos y la estabilidad dentro de la red metabólica del folato. Simulaciones avanzadas de dinámica molecular y estudios cristalográficos de complejos compuesto-enzima podrían refinar aún más la comprensión de los eventos de unión dinámica y la adaptabilidad conformacional dentro de los sitios activos de TS y DHFR. En paralelo, las pruebas en organoides o xenoinjertos derivados de pacientes que presenten constelaciones mutacionales específicas (KRAS, PIK3CA, BRAF, TP53) podrían aclarar la eficacia independiente de las mutaciones observada in vitro y guiar el diseño de terapias basadas en biomarcadores. Finalmente, la optimización estructural mediante la modificación racional de la porción esteroidea podría mejorar la solubilidad, la captación celular y la selectividad, mientras que los estudios de combinación con moduladores inmunitarios o de la reparación del ADN podrían mejorar la sinergia terapéutica. En conjunto, estas líneas de investigación trazan una vía de traslación desde el modelado predictivo hasta las aplicaciones de la oncología de precisión.

4. Materiales y Métodos

4.1. Química

Nuestro grupo se propuso generar moléculas híbridas que contuvieran un esteroide de testosterona modificado, acoplado a los antimetabolitos 5-FU, gemcitabina, aza-reversina y un mimético de la base de ADN adenina, 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina, a través de enlaces éster. Como enlazadores, se utilizaron el succinato y un enlazador de acetato simple (Figura 19). La pureza de los compuestos sintetizados se comprobó mediante análisis de RMN y LC-MS. La documentación complementaria incluye los procedimientos de síntesis, la RMN-1H, la RMN-13C y el análisis de LC-MS de los compuestos finales (Material Suplementario S1).

4.1.1. Síntesis del esteroide de testosterona modificado

La síntesis de los conjugados comenzó con la preparación de la homo-aza-testosterona 7, según el procedimiento experimental establecido desarrollado por nuestro grupo [^[31]]. Inicialmente, el grupo hidroxilo (-OH) se protege utilizando anhídrido acético en presencia de piridina y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (Figura 20). La cetona reacciona para formar la oxima correspondiente en presencia de clorhidrato de hidroxilamina. El reordenamiento de Beckmann del grupo oxima en presencia de SOCl2 en dioxano conduce al lactamo 6 con un rendimiento del 62%. La desprotección del grupo -OH utilizando LiOH acuoso produce homo-aza-testosterona (7) con un rendimiento del 75%.

4.1.2. Síntesis de KA44, un derivado de azareversina

La síntesis de azareversina se inició con la reacción de 6-cloro-2-fluoropurina y bencilamina, como se describió previamente por nuestro grupo [^[42]]. Posteriormente, una sustitución aromática nucleófila con tert-butil-(4-aminofenil)piperazina-1-carboxilato, seguida de hidrólisis ácida, produjo azareversina 11 (Figura 21) [^[9]].

La homo-aza-testosterona 7 reacciona con el anhídrido succínico, formando el ácido 12. Esta reacción va seguida del acoplamiento de 12 con azareversina en presencia de EDCI y DMAP en disolvente DMF. El híbrido KA44 (13) se aisló con un rendimiento del 73% (Figura 22).

4.1.3. Síntesis del conjugado GE23, un híbrido de 5-FU/Homo-aza-testosterona

La molécula híbrida que contiene el antimetabolito 5-FU también se sintetizó a partir del esteroide modificado 7. El 5-FU reaccionó con el ácido bromoacético para introducir un enlazador de acetato, que luego se esterifica con la homo-aza-testosterona 7. El conjugado GE23 se aisló con un rendimiento del 92% (Figura 23).

4.1.4. Síntesis de los conjugados de pirimidina CS18 y CS23

La síntesis del derivado 18 comenzó con la preparación del aminocarbonitrilo 17 basada en un procedimiento experimental conocido [^[43],^[44]]. El compuesto 17 se cicló con formamida, produciendo 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina 18 con un rendimiento del 70% (Figura 24).

Para producir el derivado esteroideo CS18, se llevó a cabo la siguiente vía sintética. Primero, el compuesto 18 se trató con NaH en disolvente DMF, seguido de la adición de cloroetanol a temperatura ambiente. La mezcla se calentó, produciendo la pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina alquilada 19. Esta última reaccionó con el ácido 12 en una reacción de esterificación, utilizando 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida de etilo (EDCI) como agente de acoplamiento, y una cantidad catalítica de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en DMF seco. El derivado esteroideo híbrido CS18 se aisló mediante cromatografía en columna con un rendimiento del 48% (Figura 25).

Para la síntesis del derivado esteroideo CS23, primero se preparó la 3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina. El procedimiento comienza con una reacción de yodación utilizando N-yodosuccinimida (NIS) en DMF seco, lo que conduce al derivado yodado 19 en la posición 3. La alquilación del compuesto 19 en DMF seco se siguió de la adición de cloroetanol y el calentamiento, lo que condujo a la formación del alcohol 20. Posteriormente, se realizó un acoplamiento de Suzuki catalizado por paladio. El compuesto 20 reaccionó con ácido fenilborónico en presencia de Na2CO3, Pd(OAc)2 y PPh3 (con una relación Pd(OAc)2/PPh3 de 1:4) en un sistema de disolventes de 1,4-dioxano/agua (5/1), produciendo la 3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina deseada 21 con un rendimiento cuantitativo (Figura 26).

El último paso en la vía sintética del derivado esteroideo CS23 implica la reacción de esterificación entre el derivado 21 y el derivado de testosterona 12 en presencia de EDCI y una cantidad catalítica de DMAP en DMF seco. El derivado esteroideo híbrido CS23 se aisló con un rendimiento del 53% (Figura 27).

4.1.5. Síntesis del conjugado MV16, un híbrido esteroideo de gemcitabina

La homo-aza-testosterona (7) reaccionó con el anhídrido succínico para formar el ácido 12. La metodología de conjugación se llevó a cabo según el protocolo sintético de nuestro grupo [^[45]]. El compuesto 12 se conjugó con gemcitabina en presencia de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en DMF seco a 36 °C durante 48 h. El híbrido MV16 se aisló mediante cromatografía en columna con un rendimiento del 46% (Figura 28).

4.2. Preparación de fármacos

Se sintetizaron cinco nuevos antimetabolitos esteroideos de lactama, CS18, CS23, GE23, KA44 y MV16 (Figura 19), según el procedimiento experimental descrito anteriormente. Se prepararon soluciones madre disolviendo la cantidad requerida de las sustancias en disolvente DMSO para alcanzar la concentración deseada de 15 mM. El volumen final de DMSO no superó el 1% del medio de cultivo. Además, se prepararon soluciones madre de metotrexato (MTX), 5-FU y gemcitabina (GEM) disueltas en solución salina normal (NaCl 0,9%) a una concentración de 15 mM.

4.3. Líneas celulares

Nuestro estudio se llevó a cabo en siete líneas celulares de cáncer humano con características moleculares distintas, de las cuales tres eran de origen cáncer de páncreas (HUPT3, Panc 03.27 y Panc 08.13) y cuatro eran de origen cáncer colorrectal (LoVo, HT29, LS174T y SW403) (Tabla 1). Las líneas celulares de cáncer colorrectal y páncreas seleccionadas representan un espectro de antecedentes moleculares clínicamente relevantes y sensibilidades intrínsecas a los fármacos, lo que permite evaluar la actividad del compuesto en contextos celulares heterogéneos. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en diferentes medios de cultivo según las instrucciones del proveedor. Las células Panc 03.27 y Panc 08.13 se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con 15% de suero fetal bovino (SFB) inactivado térmicamente y 10 µg/mL de insulina. Las células HUPT3 se cultivaron en medio EMEM, suplementado con 10% de SFB inactivado térmicamente, 2 mM de glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de piruvato de sodio. Las células LoVo y LS174T se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de SFB inactivado térmicamente. Las células HT29 y SW403 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% de SFB inactivado térmicamente. Todos los medios de cultivo se suplementaron con 1% de penicilina/estreptomicina. Todas las líneas celulares de cáncer se cultivaron como monocapas y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Para la evaluación de la actividad citostática y citotóxica de los nuevos antimetabolitos híbridos esteroideos de lactama (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en células humanas normales, se probaron tres líneas celulares humanas, FHC (CRL-1831; colonocitos epiteliales humanos normales), CCD-112CoN (CRL-1541; fibroblastos de colon humanos normales) y MRC-5 (CCL-171; fibroblastos pulmonares humanos normales). Las líneas celulares fueron proporcionadas por ATCC. Las células CCD-112CoN y MRC-5 se cultivaron en medio Eagle mínimo esencial (EMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino no inactivado térmicamente (SFB). Las células FHC se cultivaron en medio DMEM:F12, suplementado con 10 mM de HEPES (para una concentración final de 25 mM), 10 ng/mL de toxina del cólera, 0,005 mg/mL de insulina, 0,005 mg/mL de transferrina, 100 ng/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL de EGF humano recombinante y 10% de SFB. Todas las líneas celulares se cultivaron como monocapas y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Todos los materiales de cultivo celular se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Se detectaron mutaciones oncogénicas clínicamente significativas y susceptibles a fármacos en las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon humano probadas mediante tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). Las mutaciones oncogénicas frecuentes y clínicamente significativas en el cáncer colorrectal y de páncreas de las vías de señalización, así como en TP53, se muestran en la Tabla 11.

4.4. Actividad anticancerígena in vitro: ensayo MTT

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células/mL por pocillo y se mantuvieron durante 72 h en una incubadora y se cultivaron como monocapas. Después de 24 h, se trataron con 0,1-100 µM de los compuestos GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16 (10-200 µM para LT y LE) durante 48 h. Se incluyeron 5-FU, gemcitabina y MTX como compuestos de referencia. La viabilidad de las células cultivadas se estimó mediante un ensayo metabólico de (3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) bromuro (MTT), como se describió anteriormente [^[27],^[42],^[46]]. El MTT (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) se disolvió en PBS a una concentración de 5 mg/mL, se esterilizó por filtración y se almacenó a 4 °C. Se añadió MTT (0,2 mL de solución madre) a cada cultivo (por mL) y se incubó durante 3 h a 37 °C para permitir la metabolización. Los cristales de formazán se solubilizaron con isopropanol ácido (0,04 N HCl en isopropanol absoluto en una relación de 1:3 v/v). La absorbancia del tinte convertido se midió a una longitud de onda de 540 nm en un lector de ELISA (Versamax, Orleans, LA, EE. UU.). Las concentraciones medias de cada fármaco que generaron una inhibición del crecimiento del 50% o total (100%) (GI50 y TGI, respectivamente) y las concentraciones de fármaco que produjeron citotoxicidad contra el 50% de las células cultivadas [concentración inhibitoria media (IC50)] se calcularon utilizando el método de regresión lineal. Utilizando siete mediciones de absorbancia [tiempo 24 h (Ct24), crecimiento de control a 72 h (Ct72) y crecimiento de prueba en presencia de fármaco en 5 niveles de concentración (Tt72x)], se calculó el porcentaje de crecimiento en cada nivel de las concentraciones de fármaco. El porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó según el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de la siguiente manera: [(Tt72x) - (Ct24)/(Ct72) - (Ct24)] × 100 para las concentraciones para las que Tt72x > Ct24 y [(Tt72x) - (Ct24)/Ct24] × 100 para las concentraciones para las que Tt72x < Ct24. GI50 se calculó a partir de [(Tt72x) - (Ct24)/(Ct72) - (Ct24)] × 100 = 50, TGI a partir de [(Tt72x) - (Ct24)/(Ct72) - (Ct24)] × 100 = 0, e IC50 a partir de [(Tt72x) - (Ct24)/Ct24] × 100 = 50. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

4.5. Análisis de la apoptosis mediante citometría de flujo

La apoptosis se evaluó utilizando el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.). Para los fines del presente estudio, se probaron dos líneas celulares, HT-29 y HUPT3, que se sembraron (1,0 × 106 células/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se mantuvieron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Después de 24 h de crecimiento celular, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco y las células se expusieron a CS23 en sus respectivas concentraciones IC50 de los experimentos de MTT (para HT29, IC50 = 100 μM; para HUPT3, IC50 = 70 μM). La razón de esta elección fue que se encontró que era consistentemente el más citotóxico de los compuestos. Como compuestos de referencia, se utilizaron 5-FU y gemcitabina durante 48 y 72 h. Se probó 5-FU a el doble de la concentración de su TGI (para HT29, 165 μM; para HUPT3, 95 μM) durante 48 y 72 h. En ambos casos, las células no tratadas sirvieron como controles. En cada caso, el experimento se realizó por triplicado. Annexin V/PI se realizó intencionalmente a las 72 h para evaluar la carga apoptótica acumulada.

Para el ensayo de apoptosis, las células se lavaron con PBS frío (pH 7,4) y se separaron enzimáticamente mediante la tripsinización estándar. Todas las centrifugaciones necesarias se realizaron a 1500 rpm durante 5 min, incluido el descarte del medio de cultivo y dos pasos de lavado con 2 mL de tampón frío para el tinte celular (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Posteriormente, los sedimentos se resuspendieron en 150 μL de tampón de unión a Annexin V y se transfirió 100 μL de la suspensión celular. Las células se tiñeron con 5 μL de FITC Annexin V y 5 μL de solución de tinte de viabilidad 7-AAD y luego se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después, se agregaron 400 μL de tampón de unión a Annexin V y 400 μL de tampón de tinte celular antes de analizarlas en el citómetro de flujo (CyFlow®, SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Para cada muestra, se adquirieron 1 × 104 eventos y el análisis se realizó por triplicado. El análisis citométrico de flujo se realizó utilizando el software Partec FloMax (v2.9 SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania).

4.6. Análisis del arresto del crecimiento del ciclo celular mediante citometría de flujo

La progresión del ciclo celular se analizó según el kit de reactivo CyStain PI Absolute T (Sysmex, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Las células cancerosas HT29 y HUPT3 se cultivaron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Después de 24 h, el medio de crecimiento se reemplazó con medio fresco. Las células no tratadas sirvieron como controles, mientras que las células se trataron con CS23 en sus respectivas concentraciones IC50 durante 24 h y 48 h. De manera similar, ambas líneas celulares se trataron con CS23 en sus concentraciones TGI durante 48 h. Como compuestos de referencia, se incluyeron 5-FU y gemcitabina en sus respectivas concentraciones TGI y se trataron durante 48 h. Para realizar el análisis del ciclo celular, las células se lavaron con PBS frío (pH 7,4) y se separaron utilizando la tripsinización estándar. Los pasos de centrifugación se realizaron a 1500 rpm durante 5 min, con pasos de lavado de 2 mL de tampón frío para el tinte celular (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Luego, los sedimentos se resuspendieron en 150 μL de tampón de extracción de núcleos y se incubaron en la oscuridad durante 15 min con agitación suave. Una vez que se extrajo el ADN, el contenido de ADN se tiñó con 2 mL de solución de tinte celular (que contiene tampón de tinte, PI y RNAse) y se incubó durante 30 a 60 min en la oscuridad antes de analizar las muestras en el citómetro de flujo (CyFlow®, SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Para cada muestra, se adquirieron 1 × 104 eventos y el análisis se realizó por triplicado. El análisis citométrico de flujo se realizó utilizando el software Partec FloMax.

4.7. Análisis de Western Blot: inhibición de la actividad de la timidilato sintasa (TYSY)

Para explorar más a fondo el impacto inhibitorio de los nuevos lactámicos esteroides antimetabolitos sobre la actividad de la timidilato sintasa, se realizó Western blot en dos líneas celulares, HT-29 y HUPT3, que se trataron con GE23, CS18 y CS23 a la concentración TGI (10 μM) durante 6 h, mientras que como compuesto de referencia, se incluyó 5-FU. Después del tratamiento, se recogieron los lisados celulares y se centrifugaron a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y se determinó la concentración total de proteína según el ensayo de Bradford. Todos los anticuerpos (Tabla 12), la escala de proteínas biotiniladas (#7727, dilución 1:1000), las membranas de nitrocelulosa (#12369) y el reactivo lumiGLO 20× y el peróxido 20× (#95538S) se compraron a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Se separaron cantidades iguales de proteína (40 μg) y la escala utilizando un gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio al 12 %. Las bandas de proteína separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Posteriormente, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina al 5 % en tampón Tris con 0,1 % de Tween. Después del paso de bloqueo, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C en un agitador con el anticuerpo primario contra la timidilato sintasa (TYSY) (anticuerpo policlonal de conejo purificado, catálogo #AP6682b, Abcam). Después de 24 h de incubación, se eliminó el anticuerpo primario y las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario (anti-rabbit IgG) a 37 °C durante 1 h. Las bandas de unión de anticuerpos se visualizaron utilizando el reactivo lumiGLO 20× y el peróxido 20× (dilución 1:20). La densidad de la banda se cuantificó mediante el software Image-Pro Plus versión 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EE. UU.) y se normalizó con respecto a los controles de carga (actina). Las formas inhibitorias contra TYSY se normalizaron en relación con el TYSY total.

4.8. Evaluación de la inhibición de la dihidrofolato reductasa (DHFR)

Se realizó un ensayo colorimétrico de actividad enzimática DHFR libre de células para evaluar la inhibición de DHFR de los compuestos probados GE23, CS18, CS23, KA44, MV16, 5-FU, GEM y MTX (AssayGenie, Dublín, Irlanda; catálogo #BN00512). Se incluyó MTX como control positivo y compuesto de referencia. Las pruebas y la evaluación de la inhibición de DHFR se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de DHFR se monitoreó mediante la reducción de la lectura de absorbancia a OD340 nm, mientras que los posibles inhibidores detienen esta disminución de acuerdo con las siguientes reacciones generales:

Todos los compuestos se probaron en un rango de concentración de 5 a 500 nM. Brevemente, el metotrexato (MTX) y los compuestos de detección se diluyeron 100 veces en el tampón de ensayo DHFR a las concentraciones finales deseadas y se agregaron 2 μL a los pocillos en una placa ELISA de 96 pocillos de fondo plano, designados como muestra de detección (S), control de enzima (EC) y control de inhibidor (IC), respectivamente. Se preparó una dilución 400 veces de DHFR en tampón de ensayo DHFR, suficiente para el número de pocillos que se analizarán. Se agregaron 98 μL de DHFR diluido al pocillo o pocillos deseados que contienen las muestras de prueba, EC e IC, con un volumen parcial de 100 μL. Luego, se agregaron 100 μL de tampón de ensayo DHFR al pocillo o pocillos deseados, como control de fondo. Se preparó una dilución 40 veces de la solución de NADPH y se agitó brevemente, y se mantuvo en hielo. Se agregaron 40 μL de NADPH diluido a cada pocillo que contiene las muestras de prueba, EC, IC y control de fondo, y se mezcló bien. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Se evitó la exposición a la luz. Se preparó una dilución 15 veces del sustrato DHFR en tampón de ensayo DHFR, se agitó brevemente y se mantuvo en hielo. Se agregaron 60 μL de sustrato DHFR diluido a cada pocillo que contiene las muestras de prueba, EC, IC y control de fondo, y se mezcló bien. El volumen total fue de 200 μL. Se midió la absorbancia a 340 nm en modo cinético durante 15 min a temperatura ambiente en un lector de ELISA. Se eligieron dos puntos de tiempo (t1 = 4 min y t2 = 10 min) en el rango lineal del gráfico y se observaron los valores correspondientes para la absorbancia (OD1 y OD2).

La pendiente de todas las muestras de inhibidor de prueba [S] y [EC] se calculó dividiendo los valores netos de ΔOD (A1 - A2) por el tiempo Δt (t2 - t1). Se restaron las lecturas del control de solvente o control de fondo del inhibidor de sus lecturas de muestra correspondientes. La actividad relativa de DHFR y la inhibición inducida por el tratamiento de los compuestos de prueba se calcularon mediante las siguientes ecuaciones, y se demostraron las curvas respectivas.

4.9. Estudios de acoplamiento molecular

Todos los conjugados sintetizados se evaluaron in silico para sus interacciones de unión con la timidilato sintasa humana (TS), también conocida como TYSY; PDB ID: 1JU6) y la dihidrofolato reductasa (DHFR; PDB ID: 1KMS). Las estructuras de cristal seleccionadas se obtuvieron del Banco de datos de proteínas RCSB en función de su alta resolución y relevancia biológica para la unión de antimetabolitos.

Antes del acoplamiento, las estructuras de las proteínas se prepararon eliminando las moléculas de agua cristalográfica y los ligandos co-cristalizados, seguidas de la adición de átomos de hidrógeno polares y la asignación de cargas de Kollman. Las estructuras de los ligandos se minimizaron energéticamente y se convirtieron al formato apropiado utilizando el software PyRx 0.8. Las simulaciones de acoplamiento se realizaron utilizando AutoDock Vina (versión 1.1.2), con cajas de cuadrícula definidas para abarcar completamente los bolsillos de unión catalíticos, según las coordenadas de los residuos del sitio activo conocidos y los inhibidores de referencia [^[40],^[41]].

Los parámetros de acoplamiento se mantuvieron constantes en todos los ligandos para permitir una evaluación comparativa de las afinidades de unión dentro del mismo sistema enzimático. Para cada compuesto, se generaron múltiples posturas de unión y la conformación de menor energía, según lo clasificado por la función de puntuación de Vina, se seleccionó para un análisis posterior. Las interacciones proteína-ligando se visualizaron y analizaron utilizando BIOVIA Discovery Studio Visualizer (v24), centrándose en los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los contactos π-π o π-alquilo dentro del sitio activo [^[47]].

Preparación de ligandos: los ligandos se dibujaron en ChemDraw Professional 15 y se minimizó su energía utilizando el campo de fuerza universal (UFF) para alcanzar un mínimo local. Luego, todos los ligandos se convirtieron al formato PDBQT, asegurándose de que todos los enlaces rotatorios estén definidos.

Preparación del receptor: la estructura de cristal de la timidilato sintasa PBD 1JU6 se obtuvo del Banco de datos de proteínas RCSB. Se eliminaron todas las moléculas de agua y los ligandos co-cristalizados. Se agregaron átomos de hidrógeno polares y se asignaron cargas de Kollman utilizando AutoDockTools.

El sitio activo de la enzima se identificó de acuerdo con el inhibidor co-cristalizado presente en la estructura 1JU6 y se verificó mediante la localización de los aminoácidos clave conocidos por participar en la unión del ligando. El bolsillo catalítico se caracteriza por tres enlaces de hidrógeno que involucran a Asn226 y Ser216, así como dos interacciones catión-π con Phe225 y Leu221, que contribuyen a la estabilización del complejo ligando-receptor [^[36]].

Para definir la región de acoplamiento, se generó una caja de cuadrícula con los siguientes parámetros:

El campo de cuadrícula se diseñó para abarcar toda la cavidad activa de la enzima, lo que garantiza la identificación precisa de las posturas de unión más favorables de los compuestos probados.

Para obtener una comprensión más profunda de las interacciones entre las moléculas objetivo y la timidilato sintasa, se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando AutoDock Vina.

El parámetro "exhaustividad" se estableció en 128 para garantizar una búsqueda exhaustiva del espacio conformacional. Los resultados del acoplamiento se clasificaron en función de sus puntuaciones de afinidad de unión (kcal/mol).

También se realizaron simulaciones de acoplamiento molecular utilizando la estructura cristalina de la DHFR humana (PDB: 1KMS) para dilucidar las interacciones de unión y predecir el potencial inhibidor de los derivados de lactámicos esteroides sintetizados.

El sitio activo, que comprende los residuos clave Ile7, Ala9, Glu30, Phe31, Phe34, Ile60, Pro61 y Val115, se encerró dentro de una caja de cuadrícula con los siguientes parámetros:

Para validar y evaluar la fiabilidad del protocolo de acoplamiento, primero se eliminó el dUMP co-cristalizado y luego se volvió a acoplar en el sitio de unión de la timidilato sintasa (PDB ID: 1JU6) (Figura 5A). De manera similar, se utilizó SRI-9439 en la dihidrofolato reductasa (PDB: 1KMS) (Figura 6A) [^[37]].

Cabe señalar que el acoplamiento molecular proporciona una aproximación predictiva y estática de las interacciones ligando-enzima y no tiene en cuenta la flexibilidad de las proteínas, los efectos del disolvente o el metabolismo intracelular. Por lo tanto, las puntuaciones de acoplamiento se interpretaron de forma comparativa en lugar de como predictores absolutos de la potencia inhibitoria y se utilizaron para respaldar el análisis de la relación estructura-actividad en conjunto con datos enzimáticos y celulares experimentales.

4.10. Análisis estadístico

Se utilizaron la prueba t de Student y el coeficiente de correlación de Pearson (r) para comparar el nivel de significación entre los grupos experimentales. Las diferencias con valores p inferiores a 0,05 se consideraron significativas. Se utilizaron Microsoft Excel (versión 16.19, Microsoft Hellas, Atenas, Grecia) y Origin(Pro), versión 2016 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.) para el análisis y las figuras.

4.1. Química

Nuestro grupo se propuso generar moléculas híbridas que contuvieran un esteroide de testosterona modificado, acoplado con los antimetabolitos 5-FU, gemcitabina, aza-reversina y un mimético de la base de ADN adenina, 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina, a través de enlaces éster. Como enlazadores, se utilizaron el succinato y un enlace acetato simple (Figura 19). La pureza de los compuestos sintetizados se comprobó mediante análisis de RMN y LC-MS. La documentación de respaldo incluye los procedimientos de síntesis, la RMN-1H, la RMN-13C y el análisis de LC-MS de los compuestos finales (Material suplementario S1).

4.1.1. Síntesis del esteroide de testosterona modificado

La síntesis de los conjugados comenzó con la preparación de la homo-aza-testosterona 7, según el procedimiento experimental establecido desarrollado por nuestro grupo [^[31]]. Inicialmente, el grupo hidroxilo (-OH) se protege utilizando anhídrido acético en presencia de piridina y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (Figura 20). La cetona reacciona para formar la oxima correspondiente en presencia de clorhidrato de hidroxilamina. El reordenamiento de Beckmann del grupo oxima en presencia de SOCl2 en dioxano conduce a la lactama 6 con un rendimiento del 62%. La desprotección del grupo -OH utilizando LiOH acuoso produce homo-aza-testosterona (7) con un rendimiento del 75%.

4.1.2. Síntesis de KA44, un derivado de aza-reversina

La síntesis de aza-reversina se inició con la reacción de 6-cloro-2-fluoropurina y bencilamina, como se describió anteriormente por nuestro grupo [^[42]]. Posteriormente, una sustitución aromática nucleófila con tert-butil-(4-aminofenil)piperazina-1-carboxilato, seguida de hidrólisis ácida, produjo aza-reversina 11 (Figura 21) [^[9]].

La homo-aza-testosterona 7 reacciona con el anhídrido succínico, formando el ácido 12. Esta reacción va seguida del acoplamiento de 12 con aza-reversina en presencia de EDCI y DMAP en disolvente DMF. El híbrido KA44 (13) se aisló con un rendimiento del 73% (Figura 22).

4.1.3. Síntesis del conjugado GE23, un híbrido de 5-FU/Homo-aza-testosterona

La molécula híbrida que contiene el antimetabolito 5-FU también se sintetizó a partir del esteroide modificado 7. El 5-FU reaccionó con el ácido bromoacético para introducir un enlazador acetato, que luego se esterifica con la homo-aza-testosterona 7. El conjugado GE23 se aisló con un rendimiento del 92% (Figura 23).

4.1.4. Síntesis de los conjugados de pirimidina CS18 y CS23

La síntesis del derivado 18 comenzó con la preparación del amino-carbonitrilo 17 basada en un procedimiento experimental conocido [^[43],^[44]]. El compuesto 17 se cicló con formamida, produciendo 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina 18 con un rendimiento del 70% (Figura 24).

Para producir el derivado esteroideo CS18, se llevó a cabo la siguiente ruta sintética. Primero, el compuesto 18 se trató con NaH en disolvente DMF, seguido de la adición de cloroetanol a temperatura ambiente. La mezcla se calentó y se obtuvo la pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina 19 alquilada. Esta reaccionó con el ácido 12 en una reacción de esterificación, utilizando 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida de etilo (EDCI) como agente de acoplamiento, y una cantidad catalítica de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en DMF seco. El derivado esteroideo híbrido CS18 se aisló mediante cromatografía en columna con un rendimiento del 48% (Figura 25).

Para la síntesis del derivado esteroideo CS23, primero se preparó la 3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina. El procedimiento comienza con una reacción de yodación utilizando N-yodosuccinimida (NIS) en DMF seco, lo que lleva al derivado yodado 19 en la posición 3. La alquilación del compuesto 19 en DMF seco fue seguida por la adición de cloroetanol y el calentamiento, lo que llevó a la formación del alcohol 20. Posteriormente, se realizó un acoplamiento de Suzuki catalizado por paladio. El compuesto 20 reaccionó con el ácido fenilborónico en presencia de Na2CO3, Pd(OAc)2 y PPh3 (con una relación Pd(OAc)2/PPh3 de 1:4) en un sistema de disolventes de 1,4-dioxano/agua (5/1), produciendo la 3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina 21 deseada con un rendimiento cuantitativo (Figura 26).

El último paso en la ruta sintética del derivado esteroideo CS23 implica la reacción de esterificación entre el derivado 21 y el derivado de testosterona 12 en presencia de EDCI y una cantidad catalítica de DMAP en DMF seco. El derivado esteroideo híbrido CS23 se aisló con un rendimiento del 53% (Figura 27).

4.1.5. Síntesis del conjugado MV16, un híbrido esteroideo de gemcitabina

La homo-aza-testosterona (7) reaccionó con el anhídrido succínico para formar el ácido 12. La metodología de conjugación se llevó a cabo según el protocolo sintético de nuestro grupo [^[45]]. El compuesto 12 se conjugó con gemcitabina en presencia de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en DMF seco a 36 °C durante 48 h. El híbrido MV16 se aisló mediante cromatografía en columna con un rendimiento del 46% (Figura 28).

4.2. Preparación de fármacos

Se sintetizaron cinco nuevos antimetabolitos esteroideos de lactama, CS18, CS23, GE23, KA44 y MV16 (Figura 19), según el procedimiento experimental descrito anteriormente. Se prepararon soluciones madre disolviendo la cantidad necesaria de las sustancias en disolvente DMSO para alcanzar la concentración deseada de 15 mM. El volumen final de DMSO no superó el 1% del medio de cultivo. Además, se prepararon soluciones madre de metotrexato (MTX), 5-FU y gemcitabina (GEM) disueltas en solución salina normal (NaCl 0,9%) a una concentración de 15 mM.

4.3. Líneas celulares

Nuestro estudio se llevó a cabo en siete líneas celulares de cáncer humano con características moleculares distintas, de las cuales tres eran de origen cáncer de páncreas (HUPT3, Panc 03.27 y Panc 08.13) y cuatro eran de origen cáncer colorrectal (LoVo, HT29, LS174T y SW403) (Tabla 1). Las líneas celulares de cáncer colorrectal y de páncreas seleccionadas representan un espectro de antecedentes moleculares clínicamente relevantes y sensibilidades intrínsecas a los fármacos, lo que permite evaluar la actividad del compuesto en contextos celulares heterogéneos. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se cultivaron en diferentes medios de cultivo según las instrucciones del proveedor. Las células Panc 03.27 y Panc 08.13 se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con un 15% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor y 10 µg/mL de insulina. Las células HUPT3 se cultivaron en medio EMEM, suplementado con un 10% de SFB inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de piruvato de sodio. Las células LoVo y LS174T se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con un 10% de SFB inactivado por calor. Las células HT29 y SW403 se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con un 10% de SFB inactivado por calor. Todos los medios de cultivo se suplementaron con 1% de penicilina/estreptomicina. Todas las líneas celulares de cáncer se cultivaron como monocapas y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.

Para la evaluación de la actividad citostática y citotóxica de los nuevos híbridos esteroides láctámicos antimetabolitos (GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16) en células humanas normales, se utilizaron tres líneas celulares humanas: FHC (CRL-1831; colonocitos epiteliales humanos normales), CCD-112CoN (CRL-1541; fibroblastos de colon humanos normales) y MRC-5 (CCL-171; fibroblastos de pulmón humanos normales). Las líneas celulares fueron proporcionadas por ATCC. Las células CCD-112CoN y MRC-5 se cultivaron en medio Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino no inactivado por calor (FBV). Las células FHC se cultivaron en medio DMEM:F12, suplementado con 10 mM de HEPES (para una concentración final de 25 mM), 10 ng/mL de toxina colérica, 0,005 mg/mL de insulina, 0,005 mg/mL de transferrina, 100 ng/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL de EGF humano recombinante y 10% de FBS. Todas las líneas celulares se cultivaron como monocapas y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Todos los materiales para el cultivo celular se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Se detectaron mutaciones oncogénicas significativas y susceptibles de tratamiento en las líneas celulares de cáncer de páncreas y colon rectal probadas, utilizando la tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). Las mutaciones oncogénicas frecuentes y clínicamente significativas en el cáncer colorrectal y pancreático de las vías de señalización, así como en TP53, se muestran en la Tabla 11.

4.4. Actividad Anticancerígena In Vitro: Ensayo MTT

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 104 células/mL por pocillo y se mantuvieron durante 72 h en una incubadora, cultivándose como monocapas. Después de 24 h, se trataron con 0,1–100 µM de los compuestos GE23, CS18, CS23, KA44 y MV16 (10–200 µM para LT y LE) durante 48 h. Se incluyeron 5-FU, gemcitabina y MTX como compuestos de referencia. La viabilidad de las células cultivadas se estimó mediante el ensayo metabólico (3-(4,5-dimetil-2-iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), según se describió anteriormente [^[27],^[42],^[46]]. El MTT (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) se disolvió en PBS a una concentración de 5 mg/mL, se esterilizó por filtración y se almacenó a 4 °C. Se añadió MTT (0,2 mL de solución madre) a cada cultivo (por mL) y se incubó durante 3 h a 37 °C para permitir la metabolización. Los cristales de formazán se solubilizaron con isopropanol ácido (0,04 N de HCl en isopropanol absoluto en una proporción de 1:3 v/v). La absorbancia del tinte convertido se midió a una longitud de onda de 540 nm en un lector de ELISA (Versamax, Orleans, LA, EE. UU.). Las concentraciones medias de cada fármaco que generaron una inhibición del crecimiento del 50% o total (100%) (GI50 y TGI, respectivamente) y las concentraciones de fármaco que produjeron citotoxicidad contra el 50% de las células cultivadas [concentración inhibitoria media (IC50)] se calcularon utilizando el método de regresión lineal. Utilizando siete mediciones de absorbancia [tiempo 24 h (Ct24), crecimiento de control a las 72 h (Ct72) y crecimiento de prueba en presencia de fármaco a 5 niveles de concentración (Tt72x)], se calculó el porcentaje de crecimiento en cada nivel de las concentraciones de fármaco. El porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó según el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de la siguiente manera: [(Tt72x) – (Ct24)/(Ct72) – (Ct24)] × 100 para las concentraciones para las que Tt72x > Ct24 y [(Tt72x) – (Ct24)/Ct24] × 100 para las concentraciones para las que Tt72x < Ct24. GI50 se calculó a partir de [(Tt72x) – (Ct24)/(Ct72) – (Ct24)] × 100 = 50, TGI a partir de [(Tt72x) – (Ct24)/(Ct72) – (Ct24)] × 100 = 0, e IC50 a partir de [(Tt72x) – (Ct24)/Ct24] × 100 = 50. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

4.5. Análisis de la Apoptosis mediante Citometría de Flujo

La apoptosis se evaluó utilizando el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.). Para los fines del presente estudio, se probaron dos líneas celulares, células de cáncer HT-29 y HUPT3, que se sembraron (1,0 × 106 células/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se mantuvieron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Después de 24 h de crecimiento celular, el medio de cultivo se reemplazó con medio fresco y las células se expusieron a CS23 a sus respectivas concentraciones de IC50 de los experimentos MTT (para HT29, IC50 = 100 µM; para HUPT3, IC50 = 70 µM). La razón de esta elección fue que se encontró que era consistentemente el más citotóxico de los compuestos. Como compuestos de referencia, se utilizaron 5-FU y gemcitabina durante 48 y 72 h. Se probó 5-FU a una concentración dos veces mayor que su TGI (para HT29, 165 µM; para HUPT3, 95 µM) durante 48 y 72 h. En ambos casos, las células no tratadas sirvieron como controles. En cada caso, el experimento se realizó por triplicado. Annexin V/PI se realizó intencionalmente a las 72 h para evaluar la carga apoptótica acumulativa.

Para el ensayo de apoptosis, las células se lavaron con PBS helado (pH 7,4) y se separaron enzimáticamente con tripsinización estándar. Todos los pasos de centrifugación requeridos se llevaron a cabo a 1500 rpm durante 5 min, incluido el descarte del medio de cultivo y dos pasos de lavado con 2 mL de tampón de tinción celular frío (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Posteriormente, los sedimentos se resuspendieron en 150 µL de tampón de unión de anexina V y se transfirieron 100 µL de la suspensión celular. Las células se tiñeron con 5 µL de anexina V-FITC y 5 µL de solución de tinción de viabilidad 7-AAD y luego se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Posteriormente, se añadieron 400 µL de tampón de unión de anexina V y 400 µL de tampón de tinción celular antes de analizar en el citómetro de flujo (CyFlow®, SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Para cada muestra, se adquirieron 1 × 104 eventos y el análisis se realizó por triplicado. El análisis citométrico de flujo se realizó utilizando el software Partec FloMax (v2.9 SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania).

4.6. Análisis del Arresto del Crecimiento del Ciclo Celular mediante Citometría de Flujo

La progresión del ciclo celular se analizó según el kit de reactivo CyStain PI Absolute T (Sysmex, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Las células de cáncer HT29 y HUPT3 se cultivaron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2. Después de 24 h, el medio de crecimiento se reemplazó con medio fresco. Las células no tratadas sirvieron como controles, mientras que las células se trataron con CS23 a sus respectivas concentraciones de IC50 durante 24 h y 48 h. De manera similar, ambas líneas celulares se trataron con CS23 a sus concentraciones de TGI durante 48 h. Como compuestos de referencia, se incluyeron 5-FU y gemcitabina a sus respectivas concentraciones de TGI y se trataron durante 48 h. Para realizar el análisis del ciclo celular, las células se lavaron con PBS helado (pH 7,4) y se separaron utilizando una tripsinización estándar. Los pasos de centrifugación se realizaron a 1500 rpm durante 5 min, con pasos de lavado de 2 mL de tampón de tinción celular frío (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Los sedimentos se resuspendieron en 150 µL de tampón de extracción de núcleos y se incubaron en la oscuridad durante 15 min con agitación suave. Una vez que se extrajo el ADN, el contenido de ADN se tiñó con 2 mL de solución de tinción (que contiene tampón de tinción, PI y RNAse) y se incubó durante 30 a 60 min en la oscuridad antes de analizar las muestras en el citómetro de flujo (CyFlow®, SL, Partec, GmbH, Münster, Alemania). Para cada muestra, se adquirieron 1 × 104 eventos y el análisis se realizó por triplicado. El análisis citométrico de flujo se realizó utilizando el software Partec FloMax.

4.7. Análisis de Western Blot: Inhibición de la Actividad de la Timidilato Sintasa (TYSY)

Para explorar más a fondo el impacto inhibitorio de los nuevos antimetabolitos esteroides láctámicos sobre la actividad de la timidilato sintasa, se realizó Western blot en dos líneas celulares, HT-29 y HUPT3, que se trataron con GE23, CS18 y CS23 a una concentración de TGI (10 µM) durante 6 h, mientras que como compuesto de referencia se incluyó 5-FU. Después del tratamiento, se recogieron los lisados celulares y se centrifugaron a 20.000× g durante 10 min a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo y se determinó la concentración total de proteína según el ensayo de Bradford. Todos los anticuerpos (Tabla 12), la escalera de proteínas biotinilada (#7727, dilución 1:1000), las membranas de nitrocelulosa (#12369) y el reactivo 20× lumiGLO y el peróxido 20× (#95538S) se compraron a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Se separaron cantidades iguales de proteína (40 µg) y la escalera utilizando un gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio al 12%. Las bandas de proteína separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Posteriormente, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina al 5% en tampón Tris con 0,1% de Tween. Después del paso de bloqueo, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C en un agitador con el anticuerpo primario contra la timidilato sintasa (TYSY) (anticuerpo policlonal de conejo purificado, catálogo #AP6682b, Abcam). Después de 24 h de incubación, se eliminó el anticuerpo primario y las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo) a 37 °C durante 1 h. Las bandas de unión de anticuerpos se visualizaron utilizando el reactivo 20× lumiGLO y el peróxido 20× (dilución 1:20). La densidad de la banda se cuantificó mediante el software Image-Pro Plus versión 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EE. UU.) y se normalizó con respecto a los controles de carga (actina). Las formas inhibitorias contra TYSY se normalizaron en relación con el TYSY total.

4.8. Evaluación de la Inhibición de la Dihidrofolato Reductasa (DHFR)

El cribado de la inhibición de DHFR para los compuestos probados GE23, CS18, CS23, KA44, MV16, 5-FU, GEM y MTX se realizó en un ensayo colorimétrico de actividad enzimática DHFR sin células (AssayGenie, Dublín, Irlanda; catálogo #BN00512). Se incluyó MTX como control positivo y compuesto de referencia. La prueba y el cribado de la inhibición de DHFR se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de DHFR se monitoreó mediante la reducción de la lectura de absorbancia a OD340 nm, mientras que los posibles inhibidores detienen esta disminución de acuerdo con las siguientes reacciones generales:

Todos los compuestos se probaron en un rango de concentración de 5 a 500 nM. Brevemente, el metotrexato (MTX) y los compuestos de cribado se diluyeron 100 veces en tampón de ensayo DHFR a las concentraciones finales deseadas y se añadieron 2 µL en los pocillos de una placa de ELISA de 96 pocillos de fondo plano, asignados como muestra de cribado (S), control de enzima (EC) y control de inhibidor (IC), respectivamente. Se preparó una dilución de 400 veces de DHFR en tampón de ensayo DHFR, suficiente para el número de pocillos que se analizarán. Se añadieron 98 µL de DHFR diluido a los pocillos deseados que contenían las muestras de prueba, EC e IC, con un volumen parcial de 100 µL. Luego, se añadieron 100 µL de tampón de ensayo DHFR a los pocillos deseados, como control de fondo. Se preparó una dilución de 40 veces de la solución de NADPH y se agitó brevemente, y se mantuvo en hielo. Se añadieron 40 µL de NADPH diluido a cada pocillo que contenía las muestras de prueba, EC, IC y control de fondo, y se mezclaron bien. Se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Se evitó la exposición a la luz. Se preparó una dilución de 15 veces del sustrato DHFR en tampón de ensayo DHFR, se agitó brevemente y se mantuvo en hielo. Se añadieron 60 µL de sustrato DHFR diluido a cada pocillo que contenía las muestras de prueba, EC, IC y control de fondo, y se mezclaron bien. El volumen total fue de 200 µL. Se midió la absorbancia a 340 nm en modo cinético durante 15 min a temperatura ambiente en un lector de ELISA. Se eligieron dos puntos de tiempo (t1 = 4 min y t2 = 10 min) en el rango lineal del gráfico y se observaron los valores correspondientes para la absorbancia (OD1 y OD2).

La pendiente de todas las muestras de inhibidor de prueba [S] y [EC] se calculó dividiendo los valores netos de ?OD (A1 – A2) por el tiempo ?t (t2 – t1). Se restaron las lecturas del control de solvente o control de fondo del inhibidor de sus lecturas de muestra correspondientes. El porcentaje de actividad relativa de DHFR y la inhibición inducida por el tratamiento de los compuestos de prueba se calcularon mediante las siguientes ecuaciones, y se demostraron las curvas respectivas.

4.9. Estudios de Acoplamiento Molecular

Todos los conjugados sintetizados se evaluaron in silico para determinar sus interacciones de unión con la timidilato sintasa humana (TS, también denominada TYSY; ID PDB: 1JU6) y la dihidrofolato reductasa (DHFR; ID PDB: 1KMS). Las estructuras cristalinas seleccionadas se obtuvieron del Banco de datos de proteínas RCSB en función de su alta resolución y relevancia biológica para la unión de los antimetabolitos.

Antes del acoplamiento, las estructuras de las proteínas se prepararon eliminando las moléculas de agua cristalográficas y los ligandos co-cristalizados, seguidas de la adición de átomos de hidrógeno polares y la asignación de cargas de Kollman. Las estructuras de los ligandos se minimizaron energéticamente y se convirtieron al formato adecuado utilizando el software PyRx 0.8. Las simulaciones de acoplamiento se realizaron utilizando AutoDock Vina (versión 1.1.2), con cajas de rejilla definidas para abarcar completamente los sitios de unión catalíticos, según lo determinado por las coordenadas de los residuos conocidos del sitio activo y los inhibidores de referencia [^[40],^[41]].

Los parámetros de acoplamiento se mantuvieron constantes en todos los ligandos para permitir una evaluación comparativa de las afinidades de unión dentro del mismo sistema enzimático. Para cada compuesto, se generaron múltiples posturas de unión y la conformación de menor energía, según lo clasificado por la función de puntuación de Vina, se seleccionó para un análisis posterior. Las interacciones proteína-ligando se visualizaron y analizaron utilizando BIOVIA Discovery Studio Visualizer (v24), centrándose en los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los contactos π-π o π-alquilo dentro del sitio activo [^[47]].

Preparación de los ligandos: Los ligandos se dibujaron en ChemDraw Professional 15 y se minimizó su energía utilizando el campo de fuerza universal (UFF) para alcanzar un mínimo local. Luego, todos los ligandos se convirtieron al formato PDBQT, asegurando que se definieran todos los enlaces rotatorios.

Preparación del receptor: La estructura cristalina de la timidilato sintasa PBD 1JU6 se obtuvo del Banco de datos de proteínas RCSB. Se eliminaron todas las moléculas de agua y los ligandos co-cristalizados. Se agregaron átomos de hidrógeno polares y se asignaron cargas de Kollman utilizando AutoDockTools.

El sitio activo de la enzima se identificó según el inhibidor co-cristalizado presente en la estructura 1JU6 y se verificó mediante la localización de los aminoácidos clave conocidos por participar en la unión del ligando. El sitio catalítico se caracteriza por tres enlaces de hidrógeno que involucran a Asn226 y Ser216, así como dos interacciones catión-π con Phe225 y Leu221, que contribuyen a la estabilización del complejo ligando-receptor [^[36]].

Para definir la región de acoplamiento, se generó una caja de rejilla con los siguientes parámetros:

El campo de la rejilla se diseñó para abarcar toda la cavidad activa de la enzima, asegurando la identificación precisa de las posturas de unión más favorables de los compuestos probados.

Para obtener una comprensión más profunda de las interacciones entre las moléculas objetivo y la timidilato sintasa, se realizaron estudios de acoplamiento molecular utilizando AutoDock Vina.

El parámetro "exhaustividad" se estableció en 128 para garantizar una búsqueda exhaustiva del espacio conformacional. Los resultados del acoplamiento se clasificaron en función de sus puntuaciones de afinidad de unión (kcal/mol).

También se realizaron simulaciones de acoplamiento molecular utilizando la estructura cristalográfica de la DHFR humana (PDB: 1KMS) para dilucidar las interacciones de unión y predecir el potencial inhibidor de los derivados de lactama esteroideos sintetizados.

El sitio activo, que comprende los residuos clave Ile7, Ala9, Glu30, Phe31, Phe34, Ile60, Pro61 y Val115, se encerró dentro de una caja de rejilla con los siguientes parámetros:

Para validar y evaluar la fiabilidad del protocolo de acoplamiento, primero se eliminó el dUMP co-cristalizado y luego se re-acopló al sitio de unión de la timidilato sintasa (ID PDB: 1JU6) (Figura 5A). De manera similar, se utilizó SRI-9439 en la dihidrofolato reductasa (PDB: 1KMS) (Figura 6A) [^[37]].

Cabe señalar que el acoplamiento molecular proporciona una aproximación estática y predictiva de las interacciones ligando-enzima y no tiene en cuenta la flexibilidad de las proteínas, los efectos del disolvente o el metabolismo intracelular. Por lo tanto, las puntuaciones de acoplamiento se interpretaron de forma comparativa en lugar de como predictores absolutos de la potencia inhibidora y se utilizaron para respaldar el análisis de la relación estructura-actividad en conjunto con los datos enzimáticos y celulares experimentales.

4.10. Análisis estadístico

Se utilizaron la prueba t de Student y la prueba del coeficiente de correlación de Pearson (r) para comparar el nivel de significación entre los grupos experimentales. Las diferencias con valores p inferiores a 0,05 se consideraron significativas. Microsoft Excel (versión 16.19, Microsoft Hellas, Atenas, Grecia) y Origin(Pro), versión 2016 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.), se utilizaron para el análisis y las figuras.

5. Conclusiones

En última instancia, estos hallazgos posicionan a los antimetabolitos esteroideos homo-aza como andamios principales para los citostáticos multi-objetivo de nueva generación, que unen la farmacología clásica de los antimetabolitos y el diseño moderno basado en la estructura. Dentro de la serie, CS23 surgió como el híbrido más equilibrado y potente, que combina una fuerte afinidad de unión tanto a la TS (11,2 kcal/mol) como a la DHFR (11,5 kcal/mol) con una marcada inducción de la apoptosis y el arresto en fase S. Las correlaciones estadísticamente significativas entre las energías de acoplamiento, la inhibición bioquímica (r = 0,96) y la actividad citostática (r = -0,81 para las puntuaciones combinadas de TS/DHFR) establecen, por primera vez, un continuo predictivo entre la afinidad in silico y la eficacia in vitro. Estos hallazgos validan el principio de diseño de doble objetivo como una estrategia eficaz para superar la plasticidad metabólica que subyace a la resistencia a los antimetabolitos de vía única, como el 5-FU y el metotrexato.

En conclusión, este trabajo no solo introduce una prometedora clase de antimetabolitos de doble acción, sino que también proporciona un sólido modelo metodológico, que vincula la química computacional, la enzimología y la farmacodinámica celular, para el diseño racional de futuros agentes anticancerígenos destinados a la precisión traslacional y la superación de la resistencia.