La farmacología de red integrativa y el aprendizaje automático identifican potentes objetivos del ácido indol-3-láctico en cáncer colorrectal

El cáncer colorrectal (CCR), que ocupa el tercer lugar entre los cánceres más comunes a nivel mundial y es la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer, representa una importante carga para la salud pública a nivel mundial. Su patogénesis está estrechamente asociada con la inflamación crónica, la disbiosis de la microbiota intestinal y las alteraciones metabólicas [^[1]]. Si bien los avances en el diagnóstico y la terapia han mejorado los resultados en las etapas iniciales, los pacientes con CCR avanzado siguen enfrentando pronósticos sombríos debido a los desafíos persistentes, como la resistencia a la quimioterapia y las toxicidades relacionadas con el tratamiento [^[2]]. Además, la complejidad de la patogénesis del CCR implica no solo la heterogeneidad genética, sino también una profunda reprogramación metabólica y un microambiente tumoral inmunosupresor (MTI). Un importante obstáculo en el tratamiento actual del CCR es la eficacia limitada de las inmunoterapias en la mayoría de los pacientes, en gran medida debido a la evasión inmune mediada por el MTI [^[3],^[4]]. Por lo tanto, identificar agentes que puedan modular simultáneamente los programas metabólicos y remodelar el contexto inmunitario sigue siendo un objetivo fundamental en la investigación del CCR.

En la búsqueda de nuevas vías terapéuticas, la microbiota intestinal y sus productos metabólicos han surgido como una frontera crítica. Durante el metabolismo de los componentes dietéticos, los microbios generan diversos metabolitos bioactivos, incluidos los ácidos grasos de cadena corta y los derivados del indol, que pueden señalar a través de receptores del huésped y modular la fisiología intestinal [^[5]]. La disbiosis de la microbiota puede alterar tanto la composición como la función de estos metabolitos, interrumpiendo así la homeostasis inmune del huésped y asociándose con la iniciación y la progresión del tumor [^[6]]. La evidencia emergente indica que los metabolitos microbianos actúan como mensajeros químicos directos en la interfaz huésped-microbiota. Estas pequeñas moléculas pueden atravesar la barrera intestinal e influir en los procesos clave del huésped, incluida la homeostasis inmune, la regulación epigenética y la reprogramación metabólica [^[7]]. Estas observaciones han despertado un creciente interés en las pequeñas moléculas derivadas de la microbiota intestinal como candidatos para la prevención y el tratamiento adyuvante del CCR.

El ácido indólico-3-láctico (AIL) es un metabolito microbiano derivado del triptófano que se ha informado que ejerce actividades antiinflamatorias y antioxidantes [^[8]]. La evidencia clínica reciente indica que los niveles de AIL en las heces están significativamente reducidos en pacientes con CCR y están inversamente asociados con la etapa del tumor, lo que sugiere un posible papel supresor del tumor [^[9]]. Los estudios mecanicistas muestran además que, en modelos de cáncer colorrectal asociado a colitis, el AIL puede activar la señalización del receptor de hidrocarburos aromáticos (AhR) en los macrófagos, influir en la diferenciación de los macrófagos y atenuar la inflamación intestinal, restringiendo así la tumorigénesis impulsada por la inflamación [^[10]]. Además, se ha sugerido que el AIL remodela el microambiente inmunitario tumoral al suprimir la polarización de los macrófagos M2, mejorar la citotoxicidad de las células T CD8+, preservar la integridad de la barrera epitelial y aliviar la lesión mucosa inducida por la inflamación [^[11],^[12]]. A pesar de estos hallazgos alentadores, la red reguladora multifacética a través de la cual el AIL interactúa con la complejidad genética y el contexto inmunitario del CCR aún no está completamente definida y justifica una investigación sistemática.

En los últimos años, el rápido desarrollo de los enfoques de la biología computacional, que incluyen la farmacología de redes, el aprendizaje automático y el acoplamiento molecular, ha proporcionado herramientas poderosas para dilucidar los mecanismos de los fármacos y seleccionar posibles objetivos. La farmacología de redes revela sistemáticamente las intrincadas relaciones entre los fármacos, los objetivos y las enfermedades, a través de la integración de datos de múltiples fuentes, lo que permite a los investigadores comprender de manera integral los mecanismos farmacológicos desde una perspectiva holística [^[12]]. Los algoritmos de aprendizaje automático identifican eficazmente los genes críticos y los posibles objetivos a partir de conjuntos de datos a gran escala, lo que mejora significativamente la eficiencia y la precisión de la selección de fármacos [^[13]]. La tecnología de acoplamiento molecular valida la afinidad y la estabilidad de unión simulando las interacciones ligando-proteína, proporcionando así información estructural para el diseño racional de fármacos. La integración de estas metodologías acelera los procesos de descubrimiento de fármacos y establece una base teórica sólida para las aplicaciones clínicas. En este estudio, integramos el aprendizaje automático con la farmacología de redes para identificar posibles objetivos y dilucidar los mecanismos moleculares del AIL en el CCR. Las simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular posteriores validaron estas predicciones computacionales. Nuestros hallazgos proporcionan nuevas bases teóricas y prometedores objetivos putativos para la aplicación de metabolitos derivados de la microbiota intestinal en la terapia del CCR. La figura 1 muestra un esquema del flujo de trabajo de este estudio.

2. Materiales y métodos

2.1. Recopilación de los objetivos del AIL

Se utilizó la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[14]] para obtener las fórmulas estructurales moleculares y la información SMILES canónica del AIL. Posteriormente, se utilizaron cinco bases de datos públicas en línea para predecir los objetivos relacionados con el AIL: SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[15]], Similarity Ensemble Approach (https://sea.bkslab.org/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[16]], TargetNet (http://targetnet.scbdd.com/home/index/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[17]], SuperPred (http://prediction.charite.de/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[18]] y PharmMapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[19]].

Para SwissTargetPrediction, SEA, SuperPred y PharmMapper, se retuvieron todos los objetivos predichos anotados como Homo sapiens sin aplicar umbrales de puntuación o probabilidad adicionales, ya que estas plataformas proporcionan principalmente predicciones clasificadas o basadas en la similitud en lugar de umbrales de probabilidad unificados. Esta estrategia se adoptó para garantizar una cobertura completa de los posibles objetivos humanos en la etapa inicial de selección. Para TargetNet, que proporciona probabilidades de predicción explícitas, solo se incluyeron los objetivos con una probabilidad mayor que 0, según los criterios de salida de la base de datos. Los objetivos predichos obtenidos de las cinco bases de datos se fusionaron posteriormente y se eliminaron las entradas duplicadas. Todas las proteínas objetivo se estandarizaron a genes de la especie humana mediante la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/) (consultada el 9 de enero de 2025) [^[20]]. Finalmente, se creó la red objetivo del AIL utilizando Cytoscape 3.9.1 (https://cytoscape.org/) (consultada el 9 de enero de 2025).

2.2. Recopilación de los objetivos del CCR

Realizamos una búsqueda exhaustiva utilizando las palabras clave "cáncer colorrectal" y "carcinoma colorrectal" para identificar los objetivos relacionados con el CCR de cuatro bases de datos: OMIM (http://www.omim.org) (consultada el 10 de enero de 2025) [^[21]], TTD (https://db.idrblab.org/ttd/) (consultada el 10 de enero de 2025) [^[22]], GeneCards (https://www.genecards.org/) (consultada el 10 de enero de 2025) [^[23]] y DrugBank (https://go.drugbank.com/) (consultada el 10 de enero de 2025) [^[24]]. Para GeneCards, aplicamos un umbral de puntuación de relevancia establecido en o por encima del valor mediano. Los objetivos de las cuatro bases de datos se combinaron y se eliminaron los duplicados. Al mismo tiempo, recuperamos el conjunto de datos de microarrays de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO; http://www.ncbi.nih.gov/geo/) (consultada el 10 de enero de 2025) [^[25]], y los conjuntos de datos se filtraron según los siguientes criterios de inclusión: (1) organismo restringido a Homo sapiens; (2) diseño del estudio que compara los tejidos primarios de cáncer colorrectal frente a los tejidos cólicos normales; (3) perfil de expresión génica mediante matrices; y (4) tamaño de muestra suficiente (>25 muestras) para garantizar la fiabilidad estadística. Con base en estos criterios, se seleccionaron cuatro conjuntos de datos de microarrays relacionados con el CCR disponibles públicamente (GSE44076, GSE74602, GSE32323 y GSE113513) para los análisis posteriores. Estos conjuntos de datos se eligieron porque proporcionan perfiles transcripómicos de alta calidad con tamaños de muestra suficientes y se han utilizado ampliamente o son conjuntos de datos representativos en los estudios de expresión génica relacionados con el CCR. Entre ellos, GSE44076 se designó como el conjunto de datos de entrenamiento, mientras que GSE74602, GSE32323 y GSE113513 se utilizaron como conjuntos de datos de validación externos. Las matrices de expresión de los conjuntos de datos de validación se extrajeron utilizando el software Perl (versión 5.30.2) y se integraron posteriormente. Los efectos de lote que surgen de las diferencias entre los conjuntos de datos se corrigieron utilizando los paquetes limma (versión 3.64.1) y sva (versión 3.56.0) implementados en el software R (versión 4.4.2), lo que resultó en datos de expresión génica normalizados adecuados para los análisis bioinformáticos posteriores. La información detallada de todos los conjuntos de datos incluidos se resume en la Tabla 1.

2.3. Identificación de genes expresados diferencialmente (DEG)

Se realizó un análisis de expresión diferencial entre los grupos normal y CCR utilizando el paquete limma en R, con umbrales de significación establecidos en |logFC| > 1 y valor p ajustado < 0,05. Los DEG resultantes se visualizaron mediante un diagrama de dispersión y un mapa de calor, generados utilizando los paquetes ggplot2 (versión 3.5.2) y pheatmap (versión 1.0.12), respectivamente.

2.4. Análisis de red de coexpresión génica ponderada

El análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA) es un método de biología de sistemas que permite la exploración de conjuntos de datos de expresión génica de alta dimensión a través de enfoques basados en redes, con el objetivo de confirmar los módulos génicos y los genes clave asociados con los procesos biológicos para revelar posibles vías o mecanismos biológicos [^[26]]. Primero, preprocesamos los datos de expresión génica sin procesar y construimos una matriz de relación génica. Determinamos la potencia óptima del umbral suave (β) utilizando la función pickSoftThreshold en el paquete R de WGCNA. El criterio para la selección fue lograr un índice de ajuste de topología a escala libre (R2) de al menos 0,85 manteniendo una conectividad media razonable. En consecuencia, se seleccionó una potencia de β = X en función de los diagramas de independencia de escala y conectividad media. Utilizando el valor β seleccionado, se construyó una matriz de adyacencia y se transformó en una matriz de superposición topológica (TOM), que refleja la conectividad de la red entre los pares de genes. La medida de disimilitud (1-TOM) se utilizó luego como métrica de distancia para la agrupación jerárquica para identificar los módulos génicos. Los módulos se detectaron utilizando el algoritmo de corte de árbol dinámico con un tamaño de módulo mínimo predefinido, y los módulos altamente similares se fusionaron en función de la correlación del gen propio para mejorar la solidez del módulo. Para evaluar la asociación entre los módulos génicos y los rasgos relacionados con el CCR, las relaciones módulo-rasgo se evaluaron calculando los coeficientes de correlación de Pearson entre los genes propios del módulo y los rasgos fenotípicos. Los valores de significación génica (GS) y membresía del módulo (MM) se calcularon además para identificar los módulos y genes centrales biológicamente relevantes que están más fuertemente asociados con el CCR para los análisis posteriores.

2.5. Construcción de la red de interacción proteína-proteína (PPI)

Identificamos posibles genes clave para el CCRC mediante la intersección de bases de datos, genes con expresión diferencial (DGE) y genes de módulos centrales. Los objetivos superpuestos entre ILA y CCRC se identificaron utilizando el análisis de diagramas de Venn (http://www.bioinformatics.com.cn/). Estos objetivos comunes se analizaron posteriormente en la base de datos STRING (versión 12.0; https://string-db.org) [^[27]] con los siguientes parámetros: organismo restringido a Homo sapiens y puntuación mínima de confianza de interacción establecida en >0,4 (confianza media). Los datos de interacción proteína-proteína (PPI) se descargaron de la base de datos STRING en formato TSV y se importaron al software Cytoscape (versión 3.9.1) para la construcción y visualización de la red. Para analizar las características topológicas, se utilizó la herramienta "Analizar red" con el tipo de interacción establecido en "Tratar la red como no dirigida". A continuación, se calcularon las medidas de centralidad de los nodos utilizando el complemento CytoNCA (versión 2.1.6), utilizando la centralidad de grado como métrica principal. Los nodos aislados sin interacciones (grado = 0) se excluyeron de la red. Finalmente, para visualizar intuitivamente la estructura de la red, se utilizó el panel "Estilo" para asignar atributos a los nodos: el tamaño y el color de los nodos se ajustaron según sus valores de DC, donde los nodos más grandes y oscuros representaban una mayor conectividad. Empleamos tres algoritmos topológicos del complemento cytoHubba (versión 0.1) – intermediación, cercanía y centralidad de máxima clique (MCC) – para identificar los genes centrales dentro de la red PPI.

2.6. Análisis de enriquecimiento

Utilizamos la herramienta en línea Metascape (versión 3.5; http://metascape.org/) [^[28]] para realizar anotaciones de Ontología Génica (GO) y análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los genes seleccionados. El análisis de enriquecimiento GO incluyó los tres dominios: proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). Los datos resultantes se visualizaron en una plataforma de visualización en línea (http://www.bioinformatics.com.cn) [^[29]]. Además, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en los genes centrales utilizando el paquete R clusterProfiler (versión 4.16.0). Las vías biológicas enriquecidas relevantes para los mecanismos predichos de ILA en CCRC se visualizaron posteriormente utilizando los paquetes enrichplot (versión 1.28.4) y pathview (versión 1.30).

2.7. Determinación de genes centrales con algoritmos de aprendizaje automático

En este estudio, se aplicaron tres algoritmos de aprendizaje automático: el operador de selección y contracción absoluta mínima (LASSO), el bosque aleatorio (RF) y la eliminación recursiva de características de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE), para identificar conjuntamente los genes centrales asociados con los roles regulatorios hipotetizados de ILA en CCRC. Para garantizar resultados reproducibles, establecimos la semilla aleatoria en 12345 [^[30]]. Para abordar el desequilibrio de la muestra entre los grupos de CCRC y normal, se empleó la validación cruzada estratificada en todos los modelos para mantener proporciones de clase consistentes. Específicamente, LASSO emplea la regularización L1 para mitigar la multicolinealidad e inducir la dispersión en conjuntos de datos de alta dimensión; RF se seleccionó para capturar interacciones no lineales complejas; y SVM-RFE identifica el subconjunto óptimo de características para maximizar el rendimiento de la clasificación. Estos tres algoritmos se complementan entre sí, y su integración minimiza el sesgo inherente a cualquier modelo único, mejorando así la solidez de los resultados del cribado.

El análisis de regresión LASSO se realizó utilizando el paquete glmnet (versión 4.1.10) [^[31]]. Específicamente, los parámetros incluyeron family = binomial (clasificación binaria) y alpha = 1 (penalización LASSO) para mitigar el sobreajuste. Para optimizar los hiperparámetros, se realizó un procedimiento de validación cruzada de 10 pliegues utilizando la desviación como métrica de optimización. El valor óptimo de lambda (lambda.min) se seleccionó en función de la desviación media mínima validada cruzadamente. Las características con coeficientes distintos de cero en este valor óptimo de lambda se conservaron como objetivos significativos.

El modelado RF se implementó utilizando el paquete randomForest (versión 4.7.1.2) [^[32]]. El número de árboles de decisión se evaluó en un rango de 1 a 500, y el número óptimo de árboles se determinó en función de la tasa de error fuera de la bolsa (OOB) para equilibrar el rendimiento y la complejidad del modelo. A continuación, se construyó un modelo RF optimizado utilizando este número de árboles. Las puntuaciones de importancia de las características se calcularon utilizando la métrica de disminución media de la precisión. Los genes con puntuaciones de importancia superiores a 0,3 se conservaron como características candidatas para el análisis posterior. Este umbral se aplicó como un criterio de filtrado pragmático para conservar las características de importancia relativamente alta al tiempo que se reduce el ruido antes de la integración con otros algoritmos. Los análisis de sensibilidad que utilizan umbrales alternativos confirmaron que los genes centrales de consenso finales eran robustos a las variaciones razonables en este valor límite.

SVM-RFE se realizó utilizando los paquetes svmRadial, e1071 (versión 1.7.16) y caret (versión 7.0.1) [^[33]]. Antes del entrenamiento de SVM, todas las características se estandarizaron utilizando la normalización de la puntuación z para garantizar escalas de características comparables. Para evitar fugas de datos, los parámetros de normalización se estimaron exclusivamente en los pliegues de entrenamiento y se aplicaron posteriormente a los pliegues de validación correspondientes. Se empleó un esquema de eliminación recursiva de características de validación cruzada estratificada de cinco pliegues. El subconjunto óptimo de genes se seleccionó en función del error medio de clasificación más bajo y del rendimiento predictivo validado cruzadamente más alto.

Finalmente, los genes identificados de forma consistente por los tres algoritmos (LASSO, RF y SVM-RFE) se definieron como genes centrales de alta confianza asociados con los mecanismos regulatorios predichos de ILA en CCRC.

2.8. Validación de genes centrales

En este estudio, GSE44076 se utilizó como un conjunto de entrenamiento que contiene 148 muestras (50 normales y 98 muestras de CCRC). Se integraron tres conjuntos de datos independientes (GSE74602, GSE32323 y GSE113513) para formar un conjunto de validación que comprende 122 muestras (61 normales y 61 muestras de CCRC). Los patrones de expresión diferencial de los genes centrales y su rendimiento diagnóstico se evaluaron utilizando los paquetes limma (versión 3.64.1), ggpubr (versión 0.6.0) y pROC (versión 1.18.5) en R, que generaron diagramas de caja comparativos y curvas de características operativas del receptor (ROC) para ambos grupos de muestras.

2.9. Infiltración de células inmunitarias

Realizamos análisis de infiltración de células inmunitarias utilizando el algoritmo CIBERSORT [^[34]], que emplea la regresión de vectores de soporte lineal para cuantificar las proporciones relativas de 22 subtipos distintos de células inmunitarias tanto en pacientes con CCRC como en sujetos normales. Tras este análisis, identificamos las poblaciones de células inmunitarias que mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos y evaluamos sus correlaciones con los niveles de expresión de los genes centrales utilizando el método de Spearman.

2.10. Análisis de acoplamiento molecular

Las estructuras de proteínas y ligandos se prepararon utilizando los módulos Protein Preparation Wizard y LigPrep en la Suite Schrödinger 2021 4, con minimización de energía realizada bajo el campo de fuerza OPLS4 [^[35]]. Las estructuras de cristal de EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se obtuvieron de la Base de Datos de Proteínas (PDB; https://www.rcsb.org/structure) y se procesaron asignando órdenes de enlace, agregando hidrógenos, optimizando las redes de enlaces de hidrógeno y minimizando los átomos pesados para aliviar las colisiones estéricas. El ligando (ILA) se preparó con LigPrep generando posibles estados de ionización/tautomería a pH fisiológico y enumerando conformeros de baja energía. Las cuadrículas del receptor se generaron utilizando el panel Receptor Grid Generation en Glide. El centro de la caja de la cuadrícula se definió mediante el centroide del ligando co-cristalizado dentro del sitio activo de cada proteína objetivo. El tamaño de la caja delimitadora se dimensionó para encerrar suficientemente el sitio activo y acomodar el ligando. El acoplamiento se realizó utilizando Glide Standard Precision (SP) con muestreo de ligandos flexible habilitado, incluido el muestreo de conformación de anillos, y se aplicó la minimización posterior al acoplamiento. La escala de los radios de Van der Waals se estableció en 0,8 para los átomos de ligando con un corte de carga parcial de 0,15 (escala del receptor: 1,0, corte de carga 0,25) para permitir una suavidad limitada en el potencial. Las poses resultantes se sometieron a una minimización posterior al acoplamiento, y la pose con la puntuación más alta (puntuación Glide más baja) se seleccionó para un análisis posterior.

2.11. Simulaciones de dinámica molecular (DM)

Las poses de acoplamiento de mayor rango de los cuatro compuestos se utilizaron como estructuras iniciales para las simulaciones de DM, realizadas con Desmond en la Suite Schrödinger 2021 4 [^[35]]. Cada complejo se solvató en una caja de agua ortorrómbica TIP3P y se neutralizó con contraiones; se añadió NaCl hasta una concentración final de 0,15 M. Las simulaciones se realizaron utilizando el campo de fuerza OPLS4. Los sistemas se sometieron primero a una minimización de energía seguida de una relajación utilizando el protocolo de relajación estándar de Desmond, tras lo cual se llevaron a cabo simulaciones de producción bajo el conjunto NPT a 300 K y 1 atm. La temperatura y la presión se controlaron utilizando la configuración predeterminada del termostato y barostato de Desmond para la Suite Schrödinger 2021 4. Para la evaluación comparativa, cada uno de los cuatro complejos (ILA unido a EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1) se simuló durante 10 ns en condiciones idénticas. Basándose en la estabilidad comparativa, se realizó una simulación de producción adicional de 100 ns para el complejo ILA-HMOX1. Los análisis de trayectoria incluyeron la desviación media de la raíz cuadrática (RMSD) para evaluar la estabilidad conformacional global, la fluctuación media de la raíz cuadrática (RMSF) de los átomos Cα de las proteínas para evaluar la flexibilidad a nivel de los residuos y los análisis de interacción proteína-ligando para caracterizar la persistencia y los tipos de contactos intermoleculares a lo largo del tiempo. Los valores de energía libre de enlace y las interacciones de los ligandos con las proteínas se calcularon mediante el método MM/GBSA.

2.1. Recopilación de objetivos de ILA

La base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[14]] se utilizó para obtener fórmulas estructurales moleculares e información SMILES canónica para ILA. Posteriormente, se emplearon cinco bases de datos públicas en línea para predecir los objetivos relacionados con ILA: SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[15]], Similarity Ensemble Approach (https://sea.bkslab.org/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[16]], TargetNet (http://targetnet.scbdd.com/home/index/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[17]], SuperPred (http://prediction.charite.de/) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[18]] y PharmMapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper) (consultada el 8 de enero de 2025) [^[19]].

Para SwissTargetPrediction, SEA, SuperPred y PharmMapper, se conservaron todos los objetivos predichos anotados como Homo sapiens sin aplicar umbrales de puntuación o probabilidad adicionales, ya que estas plataformas proporcionan principalmente predicciones clasificadas o basadas en la similitud en lugar de umbrales de probabilidad unificados. Se adoptó esta estrategia para garantizar una cobertura completa de los posibles objetivos humanos en la etapa inicial de selección. Para TargetNet, que proporciona probabilidades de predicción explícitas, solo se incluyeron los objetivos con una probabilidad superior a 0 según los criterios de salida de la base de datos. Los objetivos predichos obtenidos de las cinco bases de datos se fusionaron posteriormente y se eliminaron las entradas duplicadas. Todas las proteínas objetivo se estandarizaron a genes de la especie humana mediante la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/) (consultada el 9 de enero de 2025) [^[20]]. Finalmente, se creó la red de objetivos de ILA utilizando Cytoscape 3.9.1 (https://cytoscape.org/) (consultada el 9 de enero de 2025).

2.2. Recopilación de objetivos de CCRC

Realizamos una búsqueda exhaustiva utilizando las palabras clave “cáncer colorrectal” y “carcinoma colorrectal” para identificar los objetivos relacionados con el CRC en cuatro bases de datos: OMIM (http://www.omim.org) (consultado el 10 de enero de 2025) [^[21]], TTD (https://db.idrblab.org/ttd/) (consultado el 10 de enero de 2025) [^[22]], GeneCards (https://www.genecards.org/) (consultado el 10 de enero de 2025) [^[23]] y DrugBank (https://go.drugbank.com/) (consultado el 10 de enero de 2025) [^[24]]. Para GeneCards, aplicamos un umbral de puntuación de relevancia establecido en o por encima del valor mediano. Los objetivos de las cuatro bases de datos se combinaron y se eliminaron los duplicados. Al mismo tiempo, recuperamos el conjunto de datos de microarrays de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO; http://www.ncbi.nih.gov/geo/) (consultado el 10 de enero de 2025) [^[25]], y los conjuntos de datos se filtraron según los siguientes criterios de inclusión: (1) organismo restringido a Homo sapiens; (2) diseño del estudio que compare tejidos primarios de cáncer colorrectal frente a tejidos colónicos normales; (3) perfil de expresión génica mediante array; y (4) tamaño de muestra suficiente (>25 muestras) para garantizar la fiabilidad estadística. Basándonos en estos criterios, se seleccionaron cuatro conjuntos de datos de microarrays relacionados con el CRC disponibles públicamente (GSE44076, GSE74602, GSE32323 y GSE113513) para análisis posteriores. Estos conjuntos de datos se eligieron porque proporcionan perfiles transcripómicos de alta calidad con tamaños de muestra suficientes y se han utilizado ampliamente o son conjuntos de datos representativos en estudios de expresión génica relacionados con el CRC. Entre ellos, GSE44076 se designó como el conjunto de datos de entrenamiento, mientras que GSE74602, GSE32323 y GSE113513 se utilizaron como conjuntos de datos de validación externos. Las matrices de expresión de los conjuntos de datos de validación se extrajeron utilizando el software Perl (versión 5.30.2) y posteriormente se integraron. Los efectos de lote derivados de las diferencias entre los conjuntos de datos se corrigieron utilizando los paquetes limma (versión 3.64.1) y sva (versión 3.56.0) implementados en el software R (versión 4.4.2), lo que dio como resultado datos de expresión génica normalizados adecuados para análisis bioinformáticos posteriores. La información detallada de todos los conjuntos de datos incluidos se resume en la Tabla 1.

2.3. Identificación de genes expresados diferencialmente (DEG)

Se realizó un análisis de expresión diferencial entre los grupos normal y CRC utilizando el paquete limma en R, con umbrales de significación establecidos en |logFC| > 1 y valor p ajustado < 0,05. Los DEG resultantes se visualizaron a través de un diagrama de volcanes y un mapa de calor, generados utilizando los paquetes ggplot2 (versión 3.5.2) y pheatmap (versión 1.0.12), respectivamente.

2.4. Análisis de red de coexpresión génica ponderada

El análisis de red de coexpresión génica ponderada (WGCNA) es un método de biología de sistemas que permite la exploración de conjuntos de datos de expresión génica de alta dimensión a través de enfoques basados en redes, con el objetivo de confirmar los módulos génicos y los genes clave asociados con los procesos biológicos para revelar posibles vías o mecanismos biológicos [^[26]]. Primero, preprocesamos los datos de expresión génica brutos y construimos una matriz de relación génica. Determinamos la potencia óptima del umbral suave ( ) utilizando la función pickSoftThreshold en el paquete WGCNA de R. El criterio para la selección fue lograr un índice de ajuste de topología sin escala (R2) de al menos 0,85, manteniendo al mismo tiempo una conectividad media razonable. En consecuencia, se seleccionó una potencia de ? = X basándose en los gráficos de independencia de escala y conectividad media. Utilizando el valor de ? seleccionado, se construyó una matriz de adyacencia y se transformó en una matriz de superposición topológica (TOM), que refleja la conectividad de la red entre pares de genes. La medida de disimilitud (1-TOM) se utilizó entonces como métrica de distancia para la agrupación jerárquica para identificar los módulos génicos. Los módulos se detectaron utilizando el algoritmo de corte de árbol dinámico con un tamaño mínimo de módulo predefinido, y los módulos muy similares se fusionaron basándose en la correlación del eigengene del módulo para mejorar la robustez del módulo. Para evaluar la asociación entre los módulos génicos y los rasgos relacionados con el CRC, las relaciones módulo-rasgo se evaluaron calculando los coeficientes de correlación de Pearson entre los eigengenes del módulo y los rasgos fenotípicos. Los valores de significancia génica (GS) y pertenencia al módulo (MM) se calcularon además para identificar los módulos y genes centrales biológicamente relevantes asociados con el CRC para análisis posteriores.

2.5. Construcción de la red de interacción proteína-proteína (PPI)

Identificamos los posibles genes clave para el CRC mediante la intersección de bases de datos, DEG y genes del módulo central. Los objetivos superpuestos entre ILA y CRC se identificaron utilizando el análisis de diagramas de Venn (http://www.bioinformatics.com.cn/). Estos objetivos comunes se analizaron posteriormente en la base de datos STRING (versión 12.0; https://string-db.org) [^[27]] con los siguientes parámetros: organismo restringido a Homo sapiens y puntuación mínima de confianza de interacción establecida en >0,4 (confianza media). Los datos de PPI se descargaron de la base de datos STRING en formato TSV y se importaron al software Cytoscape (versión 3.9.1) para la construcción y visualización de la red. Para analizar las características topológicas, se utilizó la herramienta ‘Analizar red’ con el tipo de interacción establecido en ‘Tratar la red como no dirigida’. Las medidas de centralidad de los nodos se calcularon entonces utilizando el complemento CytoNCA (versión 2.1.6), utilizando la centralidad de grado como la métrica principal. Los nodos aislados sin interacciones (grado = 0) se excluyeron de la red. Finalmente, para visualizar intuitivamente la estructura de la red, se utilizó el panel ‘Estilo’ para asignar atributos de los nodos: el tamaño y el color de los nodos se ajustaron según sus valores de DC, donde los nodos más grandes y más oscuros representaban una mayor conectividad. Empleamos tres algoritmos topológicos del complemento cytoHubba (versión 0.1) – entreness, closeness y centralidad de máxima clique (MCC) – para identificar los genes centro en la red PPI.

2.6. Análisis de enriquecimiento

Empleamos la herramienta en línea Metascape (versión 3.5; http://metascape.org/) [^[28]] para realizar anotaciones de Gene Ontology (GO) y análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) de los genes seleccionados. El análisis de enriquecimiento GO incluyó los tres dominios: proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). Los datos resultantes se visualizaron en una plataforma de visualización en línea (http://www.bioinformatics.com.cn) [^[29]]. Además, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en los genes centro utilizando el paquete R clusterProfiler (versión 4.16.0). Las vías biológicas enriquecidas relevantes para los mecanismos predichos de ILA en el CRC se visualizaron posteriormente utilizando los paquetes enrichplot (versión 1.28.4) y pathview (versión 1.30).

2.7. Determinación de los genes centro con algoritmos de aprendizaje automático

En este estudio, se aplicaron tres algoritmos de aprendizaje automático, el operador de selección y contracción absoluta mínima (LASSO), el bosque aleatorio (RF) y la eliminación recursiva de características de máquina de vectores de soporte (SVM-RFE), para identificar conjuntamente los genes centro asociados con los papeles reguladores hipotetizados de ILA en el CRC. Para garantizar resultados reproducibles, establecimos la semilla aleatoria en 12345 [^[30]]. Para abordar el desequilibrio de la muestra entre los grupos de CRC y normal, se empleó la validación cruzada estratificada en todos los modelos para mantener proporciones de clase consistentes. Específicamente, LASSO emplea la regularización L1 para mitigar la multicolinealidad e inducir la dispersión dentro de los conjuntos de datos de alta dimensión; RF se seleccionó para capturar interacciones no lineales complejas; y SVM-RFE identifica el subconjunto óptimo de características para maximizar el rendimiento de la clasificación. Estos tres algoritmos se complementan entre sí, y su integración minimiza el sesgo inherente a cualquier modelo único, mejorando así la robustez de los resultados del cribado.

El análisis de regresión LASSO se realizó utilizando el paquete glmnet (versión 4.1.10) [^[31]]. Específicamente, los parámetros incluyeron family = binomial (clasificación binaria) y alpha = 1 (penalización LASSO) para mitigar el sobreajuste. Para optimizar los hiperparámetros, se realizó un procedimiento de validación cruzada de 10 pliegues utilizando la desviación como la métrica de optimización. El valor lambda óptimo (lambda.min) se seleccionó basándose en la desviación media mínima validada cruzadamente. Las características con coeficientes distintos de cero en este valor lambda óptimo se conservaron como objetivos significativos.

El modelado de RF se implementó utilizando el paquete randomForest (versión 4.7.1.2) [^[32]]. El número de árboles de decisión se evaluó en un rango de 1 a 500, y el número óptimo de árboles se determinó basándose en la tasa de error fuera de la bolsa (OOB) para equilibrar el rendimiento y la complejidad del modelo. A continuación, se construyó un modelo RF optimizado utilizando este número de árboles. Las puntuaciones de importancia de las características se calcularon utilizando la métrica de disminución media de la precisión. Los genes con puntuaciones de importancia mayores que 0,3 se conservaron como características candidatas para el análisis posterior. Este umbral se aplicó como un criterio de filtrado pragmático para conservar las características de importancia relativamente alta al tiempo que se reduce el ruido antes de la integración con otros algoritmos. Los análisis de sensibilidad que utilizan umbrales alternativos confirmaron que los genes centro de consenso finales eran robustos a las variaciones razonables en este valor de corte.

SVM-RFE se realizó utilizando los paquetes svmRadial, e1071 (versión 1.7.16) y caret (versión 7.0.1) [^[33]]. Antes del entrenamiento de SVM, todas las características se estandarizaron utilizando la normalización de la puntuación z para garantizar escalas de características comparables. Para evitar la fuga de datos, los parámetros de normalización se estimaron exclusivamente en los pliegues de entrenamiento y posteriormente se aplicaron a los pliegues de validación correspondientes. Se empleó un esquema de eliminación recursiva de características de validación cruzada estratificada de cinco pliegues. El subconjunto óptimo de genes se seleccionó basándose en el error medio de clasificación más bajo y el rendimiento predictivo validado cruzadamente más alto.

Finalmente, los genes identificados de forma consistente por los tres algoritmos (LASSO, RF y SVM-RFE) se definieron como genes centro de alta confianza asociados con los mecanismos reguladores predichos de ILA en el CRC.

2.8. Validación de los genes centro

En este estudio, GSE44076 se utilizó como un conjunto de datos de entrenamiento que contiene 148 muestras (50 normales y 98 muestras de CRC). Se integraron tres conjuntos de datos independientes (GSE74602, GSE32323 y GSE113513) para formar un conjunto de datos de validación que comprende 122 muestras (61 normales y 61 muestras de CRC). Los patrones de expresión diferencial de los genes centro y su rendimiento diagnóstico se evaluaron utilizando los paquetes limma (versión 3.64.1), ggpubr (versión 0.6.0) y pROC (versión 1.18.5) en R, que generaron diagramas de caja comparativos y curvas de características operativas del receptor (ROC) para ambos grupos de muestras.

2.9. Infiltración de células inmunitarias

Realizamos análisis de infiltración de células inmunitarias utilizando el algoritmo CIBERSORT [^[34]], que emplea la regresión de vectores de soporte lineal para cuantificar las proporciones relativas de 22 subtipos distintos de células inmunitarias tanto en pacientes con CRC como en sujetos normales. Tras este análisis, identificamos las poblaciones de células inmunitarias que mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos y evaluamos sus correlaciones con los niveles de expresión de los genes centro utilizando el método de Spearman.

2.10. Análisis de acoplamiento molecular

Las estructuras de proteínas y ligandos se prepararon utilizando los módulos Protein Preparation Wizard y LigPrep en el paquete Schrödinger Suite 2021 4, con minimización de energía realizada bajo el campo de fuerza OPLS4 [^[35]]. Las estructuras cristalinas de EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se obtuvieron de la Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org/structure) y se procesaron asignando órdenes de enlace, agregando hidrógenos, optimizando las redes de enlaces de hidrógeno y minimizando los átomos pesados para aliviar las colisiones estéricas. El ligando (ILA) se preparó con LigPrep generando posibles estados de ionización/tautomería a pH fisiológico y enumerando conformeros de baja energía. Las cuadrículas del receptor se generaron utilizando el panel Receptor Grid Generation en Glide. El centro de la caja de la cuadrícula se definió mediante el centroide del ligando co-cristalizado dentro del sitio activo de cada proteína objetivo. El tamaño de la caja delimitadora se ajustó para encerrar suficientemente el sitio activo y acomodar el ligando. El acoplamiento se realizó utilizando Glide Standard Precision (SP) con muestreo flexible del ligando habilitado, incluyendo el muestreo de la conformación del anillo, y se aplicó la minimización post-acoplamiento. La escala de los radios de Van der Waals se estableció en 0.8 para los átomos del ligando con un valor de corte de carga parcial de 0.15 (escala del receptor: 1.0, valor de corte de carga 0.25) para permitir una suavidad limitada en el potencial. Las poses resultantes se sometieron a minimización post-acoplamiento, y se seleccionó la pose con la mejor puntuación (puntuación Glide más baja) para un análisis posterior.

2.11. Simulaciones de dinámica molecular (DM)

Las poses de acoplamiento de mayor rango de los cuatro compuestos se utilizaron como estructuras iniciales para las simulaciones de DM, realizadas con Desmond en el paquete Schrödinger Suite 2021 4 [^[35]]. Cada complejo se solvató en una caja de agua ortorrómbica TIP3P y se neutralizó con contraiones; se añadió NaCl hasta una concentración final de 0.15 M. Las simulaciones se realizaron utilizando el campo de fuerza OPLS4. Primero, los sistemas se sometieron a minimización de energía seguida de equilibrio utilizando el protocolo de relajación estándar de Desmond, después del cual se llevaron a cabo las simulaciones de producción bajo el conjunto NPT a 300 K y 1 atm. La temperatura y la presión se controlaron utilizando la configuración predeterminada del termostato y barostato de Desmond para Schrödinger Suite 2021 4. Para la evaluación comparativa, cada uno de los cuatro complejos (ILA unido a EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1) se simuló durante 10 ns en condiciones idénticas. Basándose en la estabilidad comparativa, se realizó una simulación de producción adicional de 100 ns para el complejo ILA-HMOX1. Los análisis de la trayectoria incluyeron la desviación media cuadrática (RMSD) para evaluar la estabilidad conformacional global, la fluctuación media cuadrática (RMSF) de los átomos Cα de la proteína para evaluar la flexibilidad a nivel de residuo y los análisis de interacción proteína-ligando para caracterizar la persistencia y los tipos de contactos intermoleculares a lo largo del tiempo. Los valores de energía libre de unión y las interacciones de los ligandos con las proteínas se calcularon mediante el método MM/GBSA.

3. Resultados

3.1. Adquisición de los objetivos del compuesto ILA

La estructura química de ILA se presenta en la Fig. 2A. Recuperamos 100, 150, 140, 92 y 297 objetivos relacionados con ILA de cinco bases de datos de farmacología de red, respectivamente (Archivo S1 en los Datos S1). Después de eliminar las entradas duplicadas, se retuvieron 626 objetivos únicos putativos de ILA. La superposición de los objetivos relacionados con ILA identificados en las cinco bases de datos se resume en el diagrama de Venn (Fig. 2B). Estos objetivos se visualizaron posteriormente como una red de interacción ILA-objetivo construida en Cytoscape (Fig. 2C).

3.2. Adquisición de los objetivos de la enfermedad CRC

De cuatro bases de datos, obtuvimos 93, 95, 2005 y 25 objetivos relacionados con CRC, respectivamente. Después de eliminar los duplicados, quedaron 2122 objetivos únicos relacionados con CRC (Fig. 3A; Archivo S2 en los Datos S1). Utilizando el conjunto de datos GEO relacionado con CRC GSE44076 como conjunto de entrenamiento, identificamos 1891 DEG, que comprenden 891 genes sobreexpresados y 1000 genes subexpresados. La distribución de los DEG se muestra en el gráfico de dispersión (Fig. 3B), y los patrones de expresión de los 50 DEG más significativos se muestran en el mapa de calor de agrupamiento jerárquico (Fig. 3C), lo que indica una clara separación entre las muestras normales y de CRC. El conjunto de validación se obtuvo mediante la combinación de los tres conjuntos de datos GSE74602, GSE32323 y GSE113513. Para evaluar la eficacia de la integración de datos, realizamos un análisis de componentes principales (PCA). Como se muestra en la Fig. S1 en los Datos S1, las muestras de los diferentes conjuntos de datos estaban claramente separadas antes de la corrección, lo que indica un efecto de lote significativo. Sin embargo, después de la corrección del efecto de lote, las muestras de los tres conjuntos de datos estaban bien mezcladas y distribuidas uniformemente, lo que demuestra que las variaciones no biológicas se eliminaron con éxito para los análisis posteriores. Para identificar los módulos génicos relacionados con CRC, construimos una red de coexpresión génica ponderada utilizando WGCNA. Basándose en la independencia de la escala y la conectividad media, el umbral óptimo suave se estableció en 4, logrando un índice de escala libre de 0.9 con una conectividad media favorable (Fig. 3D). El dendrograma de agrupamiento génico resultante (Fig. 3E) identificó distintos módulos de coexpresión representados por diferentes ramas de colores. Después de fusionar los módulos similares, se obtuvieron seis módulos génicos distintos. El módulo MEturquesa mostró la asociación más fuerte con los fenotipos normal/CRC (R = 0.97, P < 0.0001; Fig. 3F) y contenía 3314 genes priorizados como posibles objetivos de CRC. Finalmente, la intersección de los genes relacionados con CRC de las bases de datos (2122 genes), los DEG (1891 genes) y los genes del módulo MEturquesa (3314 genes) arrojó 252 genes clave de CRC (Fig. 3G).

3.3. Red de interacción proteína-proteína y análisis de enriquecimiento de los objetivos comunes asociados con ILA en CRC

Basándose en el análisis de intersección anterior, se identificaron 39 posibles objetivos de ILA contra CRC (Fig. 4A). Se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) de estos 39 objetivos utilizando STRING para caracterizar las interacciones objetivo-objetivo (Fig. 4B). Luego, aplicamos el complemento cytoHubba para clasificar los candidatos de centro; los 15 objetivos principales basados en la intermediación, la cercanía y el MCC se muestran en la Fig. 4C, y su intersección arrojó 11 genes centrales (Fig. 4D): ICAM1, MMP3, HMOX1, LCN2, PPARG, MMP7, IDO1, PARP1, HSP90AB1, EPHA2 y CBS. Se realizaron análisis de enriquecimiento KEGG y GO basados en estos 39 objetivos para identificar los procesos biológicos y las vías de señalización que probablemente estén involucrados en los roles regulatorios predichos de ILA en CRC. El análisis de la vía KEGG reveló 17 vías significativamente enriquecidas (P < 0.05) (Fig. S2 en los Datos S1), siendo las cinco principales: lípidos y aterosclerosis, vías en el cáncer, vía de señalización IL-17, vía de señalización PI3K-Akt y vía de señalización PPAR. Los objetivos centrales asociados con estas vías incluyeron HSP90AB1, ICAM1, MMP1, MMP3 y HMOX1; las asociaciones entre los objetivos clave y las vías principales se visualizan en el gráfico de burbujas de Sankey (Fig. 4E). El análisis GO identificó 247 BP, 15 CC y 66 MF, con los 10 términos enriquecidos principales que se muestran en la Fig. S2 en los Datos S1. El diagrama de acordes (Fig. 4F) destaca las cinco BP principales: respuestas celulares a compuestos nitrogenados, respuestas celulares a estímulos hormonales, regulación positiva de la muerte celular programada, respuesta a amiloide-beta y respuesta a bacterias (Archivo S3 en los Datos S1).

3.4. Selección de genes centrales objetivo mediante aprendizaje automático

Para identificar aún más los genes centrales críticos para ILA contra CRC, examinamos los 39 objetivos utilizando tres algoritmos de aprendizaje automático. Para la regresión LASSO, se trazó la trayectoria cambiante de los coeficientes de las variables independientes y la desviación de verosimilitud parcial, identificando 17 objetivos centrales en el valor óptimo de lambda (Fig. 5A). En el algoritmo RF, la tasa de error se estabilizó a medida que aumentó el número de árboles de decisión; seleccionamos 14 genes con una puntuación de importancia relativa mayor que 0.3 para el análisis posterior (Fig. 5B). El algoritmo SVM-RFE seleccionó 13 genes con el error más bajo (Fig. 5C). El Archivo S4 en los Datos S1 presenta una lista clasificada de los genes centrales identificados por los tres algoritmos de aprendizaje automático. Finalmente, la intersección de los candidatos de cytoHubba, LASSO, RF y SVM-RFE identificó cuatro genes centrales: EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 (Fig. 5D).

3.5. Detección de la expresión de los genes centrales en CRC

A continuación, examinamos los patrones de expresión de los cuatro genes centrales entre los grupos normal y CRC. En el conjunto de entrenamiento GSE44076, EPHA2, MMP3 y PARP1 se sobreexpresaron significativamente en CRC, mientras que HMOX1 se subexpresó significativamente (Fig. 6A). Los valores del área bajo la curva (AUC) de ROC fueron 0.939 para EPHA2, 0.980 para HMOX1, 0.955 para MMP3 y 0.997 para PARP1 (Fig. 6B). Validamos aún más estos hallazgos en una cohorte de validación independiente combinada (GSE74602 + GSE32323 + GSE113513). Las tendencias de expresión siguieron siendo consistentes (Fig. 6C), y el análisis ROC confirmó el valor diagnóstico de estos genes centrales (Fig. 6D), con los valores AUC de ROC de 0.935 para EPHA2, 0.883 para HMOX1, 0.935 para MMP3 y 0.804 para PARP1. Estos resultados respaldan la solidez de los genes centrales identificados en la distinción entre CRC y muestras normales en diferentes conjuntos de datos.

3.6. Análisis GSEA

El análisis GSEA identificó las vías de señalización asociadas con los cuatro genes centrales, con las 10 vías principales sobreexpresadas y subexpresadas que se muestran en las Fig. 7A-D. EPHA2 se asoció significativamente con la biosíntesis de aminoacil-ARNt, el metabolismo del ascorbato y el aldarato, la replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7A). La expresión de HMOX1 se correlacionó significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, la replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7B). MMP3 se correlacionó significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, el metabolismo del butanoato y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7C). PARP1 se asoció significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, el metabolismo del butanoato y la replicación del ADN (Fig. 7D). En general, estos resultados sugieren que los genes centrales están estrechamente relacionados con las vías que involucran el metabolismo relacionado con el redox, la replicación del ADN y el metabolismo de los lípidos.

3.7. Infiltración de células inmunitarias

Dado el estrecho vínculo entre la progresión del CRC y el microambiente inmunitario tumoral, evaluamos la abundancia relativa de 22 subtipos de células inmunitarias utilizando CIBERSORT. La infiltración diferencial de células inmunitarias entre las muestras normales y de CRC en el conjunto de entrenamiento GSE44076 se muestra en la Fig. 8A. En comparación con el grupo normal, las células plasmáticas, las células T foliculares auxiliares, los macrófagos M0/M1/M2, las células cebadas activadas y los neutrófilos aumentaron significativamente en CRC, mientras que las células T de memoria CD4 en reposo, las células Treg, las células cebadas en reposo y los eosinófilos disminuyeron significativamente.

Evaluamos aún más las asociaciones entre los cuatro genes centrales y la infiltración de células inmunitarias; el mapa de calor de correlación de Spearman se proporciona en la Fig. 8B. EPHA2 mostró una correlación positiva significativa con las células cebadas activadas y una correlación negativa significativa con las células plasmáticas. HMOX1 se correlacionó positivamente con los neutrófilos y se correlacionó negativamente con las células T de memoria CD4 en reposo y las células Treg. MMP3 se correlacionó positivamente con las células cebadas activadas y se correlacionó negativamente con las células cebadas en reposo. PARP1 se correlacionó negativamente con las células dendríticas en reposo y los macrófagos M1. Estos resultados indican que la expresión de los genes centrales está relacionada con distintos patrones de infiltración inmunitaria en CRC.

3.8. Acoplamiento molecular

Se realizó un acoplamiento molecular para evaluar la afinidad de unión y las posibles conformaciones de unión de ILA con los cuatro genes clave. Las conformaciones de acoplamiento de ILA con EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se muestran en la Fig. 9A-D, respectivamente. Los cuatro complejos exhibieron puntuaciones de acoplamiento favorables (EPHA2: ?6.247; HMOX1: ?5.876; MMP3: ?7.208; PARP1: ?5.857), lo que sugiere un potencial de unión estable. En el complejo EPHA2-ILA (Fig. 9A), ILA formó interacciones ?-? apiladas con TYR694, interacciones ?-alquílicas con LEU746, ALA644 e ILE619, y un enlace de hidrógeno con THR692. Las posibles conformaciones de unión predichas para HMOX1, MMP3 y PARP1 (Fig. 9B-D) respaldan aún más que ILA puede acomodarse dentro de sus sitios de unión con patrones de interacción favorables, lo que es consistente con las afinidades de acoplamiento informadas en la Tabla 2. En general, estos resultados de acoplamiento sugieren que ILA puede estar involucrado en los procesos regulatorios asociados con el CRC a través de interacciones con estas proteínas.

3.9. Simulaciones de dinámica molecular de ILA con genes clave

Para evaluar la estabilidad dinámica de las conformaciones de acoplamiento y validar las interacciones de unión, se realizaron simulaciones de dinámica molecular (DM). Los perfiles comparativos de RMSD para los cuatro complejos proteína-ILA durante una simulación de 10 ns se muestran en la Fig. 10A-D, lo que indica que el complejo ILA-HMOX1 exhibió el equilibrio más rápido y la menor fluctuación de RMSD entre los cuatro candidatos. Se debe reconocer que las trayectorias de DM de 10 ns representan una evaluación preliminar de la estabilidad y son insuficientes para caracterizar completamente los cambios conformacionales a largo plazo. Por lo tanto, las conclusiones derivadas de las simulaciones cortas deben interpretarse con cautela y se complementaron con un muestreo extendido para el complejo representativo ILA-HMOX1. La simulación de 100 ns confirmó la estabilidad dinámica del complejo ILA-HMOX1 (Fig. 10E). El RMSD de los átomos C? de la proteína convergió después de aproximadamente 20 ns, manteniendo un valor estable de aproximadamente 1.8 Å. Fundamentalmente, el RMSD del ligando, cuando se ajustó a la proteína, también se mantuvo estable dentro de un rango estrecho (fluctuando alrededor de 2.2 Å), lo que indica que ILA mantuvo una conformación de unión consistente dentro del sitio activo sin disociarse. Además, los resultados de MM/GBSA mostraron que la energía libre de unión de ILA a la proteína HMOX1 fue de ?25.58 kcal/mol.

Para evaluar aún más la flexibilidad a nivel de los residuos, se realizó un análisis de RMSF de los átomos C? de la proteína basado en la trayectoria de 100 ns (Fig. 10F). La mayoría de los residuos exhibieron valores de RMSF bajos (generalmente por debajo de 1.2 Å), lo que indica una estabilidad estructural general de la proteína durante la simulación. Además, se realizó un análisis de interacción proteína-ligando para caracterizar la persistencia y la naturaleza de los contactos intermoleculares a lo largo de la simulación (Fig. 10G). Varios residuos, incluidos LYS18, TYR134, LYS179 y ARG183, exhibieron altas fracciones de interacción, predominantemente mediadas por enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas y puentes de agua. Los mapas de interacción resueltos en el tiempo demostraron que estos contactos se mantuvieron durante la mayor parte del período de simulación, lo que respalda la formación de una interfaz de unión estable y persistente. El diagrama de interacción 2D destaca los contactos intermoleculares críticos y persistentes, lo que demuestra que estas interacciones anclan eficazmente a ILA dentro del sitio de unión de HMOX1 durante toda la simulación de 100 ns (Fig. 10H).

3.1. Adquisición de los objetivos del compuesto ILA

La estructura química de ILA se presenta en la Fig. 2A. Recuperamos 100, 150, 140, 92 y 297 objetivos relacionados con ILA de cinco bases de datos de farmacología de red, respectivamente (Archivo S1 en los Datos S1). Después de eliminar las entradas duplicadas, se retuvieron 626 objetivos únicos putativos de ILA. La superposición de los objetivos relacionados con ILA identificados en las cinco bases de datos se resume en el diagrama de Venn (Fig. 2B). Estos objetivos se visualizaron posteriormente como una red de interacción ILA-objetivo construida en Cytoscape (Fig. 2C).

3.2. Adquisición de los objetivos de la enfermedad CRC

De cuatro bases de datos, obtuvimos 93, 95, 2005 y 25 objetivos relacionados con el CRC, respectivamente. Después de eliminar los duplicados, quedaron 2122 objetivos únicos relacionados con el CRC (Fig. 3A; Archivo S2 en los Datos S1). Utilizando el conjunto de datos GEO relacionado con el CRC GSE44076 como conjunto de entrenamiento, identificamos 1891 genes expresados diferencialmente (DEG), que comprenden 891 genes sobreexpresados y 1000 genes subexpresados. La distribución de los DEG se muestra en el diagrama de dispersión (Fig. 3B), y los patrones de expresión de los 50 DEG más significativos se muestran en el mapa de calor de agrupación jerárquica (Fig. 3C), lo que indica una clara separación entre las muestras normales y de CRC. El conjunto de validación se obtuvo mediante la combinación de los tres conjuntos de datos GSE74602, GSE32323 y GSE113513. Para evaluar la eficacia de la integración de datos, realizamos un análisis de componentes principales (PCA). Como se muestra en la Fig. S1 en los Datos S1, las muestras de los diferentes conjuntos de datos estaban claramente separadas antes de la corrección, lo que indica un efecto de lote significativo. Sin embargo, después de la corrección del efecto de lote, las muestras de los tres conjuntos de datos se mezclaron y distribuyeron uniformemente, lo que demuestra que las variaciones no biológicas se eliminaron con éxito para los análisis posteriores. Para identificar los módulos génicos relacionados con el CRC, construimos una red de coexpresión génica ponderada utilizando WGCNA. Basado en la independencia de la escala y la conectividad promedio, el umbral óptimo suave se estableció en 4, logrando un índice de escala libre de 0.9 con una conectividad media favorable (Fig. 3D). El dendrograma de agrupación génica resultante (Fig. 3E) identificó distintos módulos de coexpresión representados por diferentes ramas de colores. Después de fusionar los módulos similares, se obtuvieron seis módulos génicos distintos. El módulo MEturquesa mostró la asociación más fuerte con los fenotipos normal/CRC (R = 0.97, P < 0.0001; Fig. 3F) y contenía 3314 genes priorizados como posibles objetivos de CRC. Finalmente, la intersección de los genes relacionados con el CRC de las bases de datos (2122 genes), los DEG (1891 genes) y los genes del módulo MEturquesa (3314 genes) produjo 252 genes clave de CRC (Fig. 3G).

3.3. Red de interacción proteína-proteína y análisis de enriquecimiento de los objetivos comunes asociados con ILA en el CRC

Basado en el análisis de intersección anterior, se identificaron 39 posibles objetivos de ILA contra el CRC (Fig. 4A). Se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) de estos 39 objetivos utilizando STRING para caracterizar las interacciones objetivo-objetivo (Fig. 4B). Luego, aplicamos el complemento cytoHubba para clasificar los candidatos clave; los 15 objetivos principales basados en la intermediación, la cercanía y el MCC se muestran en la Fig. 4C, y su intersección produjo 11 genes centrales (Fig. 4D): ICAM1, MMP3, HMOX1, LCN2, PPARG, MMP7, IDO1, PARP1, HSP90AB1, EPHA2 y CBS. Se realizaron análisis de enriquecimiento KEGG y GO basados en estos 39 objetivos para identificar los procesos biológicos y las vías de señalización que probablemente estén involucrados en los posibles roles regulatorios de ILA en el CRC. El análisis de la vía KEGG reveló 17 vías enriquecidas significativamente (P < 0.05) (Fig. S2 en los Datos S1), siendo las cinco principales: lípidos y aterosclerosis, vías en el cáncer, vía de señalización IL-17, vía de señalización PI3K-Akt y vía de señalización PPAR. Los objetivos centrales asociados con estas vías incluyeron HSP90AB1, ICAM1, MMP1, MMP3 y HMOX1; las asociaciones entre los objetivos clave y las vías principales se visualizan en el diagrama de burbujas de Sankey (Fig. 4E). El análisis GO identificó 247 BP, 15 CC y 66 MF, con los 10 términos enriquecidos principales que se muestran en la Fig. S2 en los Datos S1. El diagrama de acordes (Fig. 4F) destaca las cinco BP principales: respuestas celulares a compuestos nitrogenados, respuestas celulares a estímulos hormonales, regulación positiva de la muerte celular programada, respuesta al amiloide-beta y respuesta a bacterias (Archivo S3 en los Datos S1).

3.4. Selección de los genes clave objetivo mediante aprendizaje automático

Para identificar aún más los genes clave críticos para ILA contra el CRC, examinamos los 39 objetivos utilizando tres algoritmos de aprendizaje automático. Para la regresión LASSO, se trazó la trayectoria cambiante de los coeficientes de las variables independientes y la desviación parcial de la verosimilitud, lo que identificó 17 objetivos centrales en el valor óptimo de lambda (Fig. 5A). En el algoritmo RF, la tasa de error se estabilizó a medida que aumentó el número de árboles de decisión; seleccionamos 14 genes con una puntuación de importancia relativa mayor que 0.3 para el análisis posterior (Fig. 5B). El algoritmo SVM-RFE seleccionó 13 genes con el error más bajo (Fig. 5C). El Archivo S4 en los Datos S1 presenta una lista clasificada de los genes centrales identificados por los tres algoritmos de aprendizaje automático. Finalmente, la intersección de los candidatos de cytoHubba, LASSO, RF y SVM-RFE identificó cuatro genes clave: EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 (Fig. 5D).

3.5. Detección de la expresión de los genes clave en el CRC

A continuación, examinamos los patrones de expresión de los cuatro genes clave entre los grupos normal y de CRC. En el conjunto de entrenamiento GSE44076, EPHA2, MMP3 y PARP1 se sobreexpresaron significativamente en el CRC, mientras que HMOX1 se subexpresó significativamente (Fig. 6A). Los valores del área bajo la curva (AUC) de ROC fueron 0.939 para EPHA2, 0.980 para HMOX1, 0.955 para MMP3 y 0.997 para PARP1 (Fig. 6B). Validamos aún más estos hallazgos en una cohorte de validación independiente combinada (GSE74602 + GSE32323 + GSE113513). Las tendencias de expresión se mantuvieron consistentes (Fig. 6C), y el análisis ROC confirmó el valor diagnóstico de estos genes clave (Fig. 6D), con los valores del AUC de ROC de 0.935 para EPHA2, 0.883 para HMOX1, 0.935 para MMP3 y 0.804 para PARP1. Estos resultados respaldan la solidez de los genes clave identificados en la distinción entre el CRC y las muestras normales en diferentes conjuntos de datos.

3.6. Análisis GSEA

El análisis GSEA identificó las vías de señalización asociadas con los cuatro genes clave, con las 10 vías principales sobreexpresadas y subexpresadas que se muestran en la Fig. 7A-D. EPHA2 se asoció significativamente con la biosíntesis de aminoacil-ARNt, el metabolismo del ascorbato y el aldarato, la replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7A). La expresión de HMOX1 se correlacionó significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, la replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7B). MMP3 se correlacionó significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, el metabolismo del butanoato y el metabolismo de los ácidos grasos (Fig. 7C). PARP1 se asoció significativamente con el metabolismo del ascorbato y el aldarato, el metabolismo del butanoato y la replicación del ADN (Fig. 7D). En general, estos resultados sugieren que los genes clave están estrechamente relacionados con las vías que involucran el metabolismo relacionado con la oxidación-reducción, la replicación del ADN y el metabolismo de los lípidos.

3.7. Infiltración de células inmunitarias

Dado el estrecho vínculo entre la progresión del CRC y el microambiente inmunitario tumoral, evaluamos la abundancia relativa de 22 subtipos de células inmunitarias utilizando CIBERSORT. La infiltración diferencial de células inmunitarias entre las muestras normales y de CRC en el conjunto de entrenamiento GSE44076 se muestra en la Fig. 8A. En comparación con el grupo normal, las células plasmáticas, las células T foliculares auxiliares, los macrófagos M0/M1/M2, los mastocitos activados y los neutrófilos aumentaron significativamente en el CRC, mientras que las células T de memoria CD4 en reposo, las células Tregs, los mastocitos en reposo y los eosinófilos disminuyeron significativamente.

Evaluamos aún más las asociaciones entre los cuatro genes clave y la infiltración de células inmunitarias; el mapa de calor de correlación de Spearman se proporciona en la Fig. 8B. EPHA2 mostró una correlación positiva significativa con los mastocitos activados y una correlación negativa significativa con las células plasmáticas. HMOX1 se correlacionó positivamente con los neutrófilos y se correlacionó negativamente con las células T de memoria CD4 en reposo y las células Tregs. MMP3 se correlacionó positivamente con los mastocitos activados y se correlacionó negativamente con los mastocitos en reposo. PARP1 se correlacionó negativamente con las células dendríticas en reposo y los macrófagos M1. Estos resultados indican que la expresión de los genes clave está relacionada con distintos patrones de infiltración inmunitaria en el CRC.

3.8. Acoplamiento molecular

Se realizó un acoplamiento molecular para evaluar la afinidad de unión y las posibles conformaciones de unión de ILA con los cuatro genes clave. Las conformaciones de acoplamiento de ILA con EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se muestran en la Fig. 9A-D, respectivamente. Los cuatro complejos exhibieron puntuaciones de acoplamiento favorables (EPHA2: ?6.247; HMOX1: ?5.876; MMP3: ?7.208; PARP1: ?5.857), lo que sugiere un potencial de unión estable. En el complejo EPHA2-ILA (Fig. 9A), ILA formó interacciones ?-? apiladas con TYR694, interacciones ?-alquílicas con LEU746, ALA644 e ILE619, y un enlace de hidrógeno con THR692. Las posibles conformaciones de unión para HMOX1, MMP3 y PARP1 (Fig. 9B-D) respaldan aún más que ILA puede acomodarse dentro de sus sitios de unión con patrones de interacción favorables, lo que es consistente con las afinidades de acoplamiento informadas en la Tabla 2. En general, estos resultados de acoplamiento sugieren que ILA puede estar involucrado en los procesos regulatorios asociados con el CCRC a través de interacciones con estas proteínas.

3.9. Simulaciones de dinámica molecular de ILA con genes clave

Para evaluar la estabilidad dinámica de las conformaciones de acoplamiento y validar las interacciones de unión, se realizaron simulaciones de dinámica molecular (DM). Los perfiles comparativos de RMSD para los cuatro complejos proteína-ILA durante una simulación de 10 ns se muestran en la Fig. 10A-D, lo que indica que el complejo ILA-HMOX1 exhibió el equilibrio más rápido y la menor fluctuación de RMSD entre los cuatro candidatos. Se debe reconocer que las trayectorias de DM de 10 ns representan una evaluación preliminar de la estabilidad y son insuficientes para caracterizar completamente los cambios conformacionales a largo plazo. Por lo tanto, las conclusiones derivadas de las simulaciones cortas deben interpretarse con cautela y se complementaron con un muestreo extendido para el complejo representativo ILA-HMOX1. La simulación de 100 ns confirmó la estabilidad dinámica del complejo ILA-HMOX1 (Fig. 10E). El RMSD de los átomos C? de la proteína convergió después de aproximadamente 20 ns, manteniendo un valor estable de aproximadamente 1.8 Å. Fundamentalmente, el RMSD del ligando, cuando se ajustó a la proteína, también se mantuvo estable dentro de un rango estrecho (fluctuando alrededor de 2.2 Å), lo que indica que ILA mantuvo una conformación de unión consistente dentro del sitio activo sin disociarse. Además, los resultados de MM/GBSA mostraron que la energía libre de unión para ILA a la proteína HMOX1 fue de ?25.58 kcal/mol.

Para evaluar aún más la flexibilidad a nivel de los residuos, se realizó un análisis de RMSF de los átomos C? de la proteína basado en la trayectoria de 100 ns (Fig. 10F). La mayoría de los residuos exhibieron valores de RMSF bajos (generalmente por debajo de 1.2 Å), lo que indica una estabilidad estructural general de la proteína durante la simulación. Además, se realizó un análisis de interacción proteína-ligando para caracterizar la persistencia y la naturaleza de los contactos intermoleculares a lo largo de la simulación (Fig. 10G). Varios residuos, incluidos LYS18, TYR134, LYS179 y ARG183, exhibieron altas fracciones de interacción, predominantemente mediadas por enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas y puentes de agua. Los mapas de interacción resueltos en el tiempo demostraron que estos contactos se mantuvieron durante la mayor parte del período de simulación, lo que respalda la formación de una interfaz de unión estable y persistente. El diagrama de interacción 2D destaca los contactos intermoleculares críticos y persistentes, lo que demuestra que estas interacciones anclan eficazmente a ILA dentro del bolsillo de unión de HMOX1 durante toda la simulación de 100 ns (Fig. 10H).

4. Discusión

A pesar de las mejoras en la supervivencia de los pacientes con CCRC en los últimos años, un subconjunto de pacientes aún enfrenta importantes desafíos clínicos, que incluyen resistencia a la quimioterapia, beneficio limitado de la inmunoterapia y recurrencia postoperatoria [^[36]]. En consecuencia, la identificación de nuevos objetivos moleculares y el desarrollo de conceptos de intervención eficaces siguen siendo prioridades importantes en la investigación del CCRC. Cada vez hay más evidencia que respalda la participación de la microbiota intestinal y sus metabolitos en la iniciación y la progresión del CCRC. Los metabolitos microbianos actúan como mediadores clave de las interacciones microbiota-huésped y, por lo tanto, han atraído un interés creciente como posibles contribuyentes a los procesos biológicos relacionados con el CCRC. El triptófano, por ejemplo, puede ser convertido por los microbios intestinales en múltiples derivados de indol bioactivos, incluido el indol, ILA, el aldehído de indol-3 (IAld) y el ácido indol-3-propiónico (IPA), que se ha informado que dan forma al microambiente tumoral (MET) [^[5]]. Se ha informado que ILA fortalece la función de la barrera intestinal y atenúa las respuestas inflamatorias a través de la señalización de AhR, con una posible relevancia para los fenotipos relacionados con el CCRC [^[8]]. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos que vinculan a ILA con los procesos regulatorios asociados con el CCRC aún no se comprenden por completo.

Este estudio representa la primera elucidación sistemática del posible mecanismo subyacente a ILA en el tratamiento del CCRC, utilizando un enfoque integrador que combina la farmacología de redes, el aprendizaje automático, el acoplamiento molecular y las simulaciones de dinámica molecular. Estas metodologías son particularmente adecuadas para descifrar las complejas interacciones metabolito-enfermedad, ya que permiten la identificación exhaustiva de los objetivos relacionados con la enfermedad y los fármacos, al tiempo que descubren las principales redes de vías de señalización [^[11]]. En este estudio, se identificaron cuatro objetivos críticos (EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1) (Fig. 11). Dilucidamos los posibles mecanismos regulatorios asociados con el CCRC de ILA a través de la modulación de los objetivos y analizamos su posible relevancia inmunológica, ofreciendo nuevas perspectivas mecanicistas sobre los metabolitos derivados de la microbiota intestinal en el CCRC.

4.1. Posibles mecanismos asociados con el CCRC vinculados a ILA a través de la regulación multi-objetivo

4.1.1. Regulación del estrés oxidativo.

La hemo oxigenasa 1 (HMOX1) es una enzima antioxidante que cataliza la degradación del hemo en monóxido de carbono, biliverdina y hierro ferroso. Cada vez hay más evidencia que vincula a HMOX1 con la ferroptosis, una forma regulada de muerte celular impulsada por la peroxidación de lípidos dependiente del hierro [^[37]]. Al modular el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria y la apoptosis, la proteína HMOX1 ha estado implicada en la supervivencia, la proliferación y el comportamiento metastásico de las células tumorales. Por ejemplo, se informó que los gránulos de Shenqi Sanjie inducen la ferroptosis en las células de cáncer de colon a través de la regulación ascendente de HMOX1, con la consiguiente supresión del crecimiento y la metástasis del tumor [^[38]]. Los estudios in vitro e in vivo recientes sugieren que ILA tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. El trabajo mecanicista indica que ILA puede activar la vía Nrf2 y aumentar la expresión de los genes de defensa antioxidantes en las células epiteliales intestinales [^[39]]. Estudios adicionales sugieren que ILA activa Nrf2 a través de un mecanismo dependiente de AhR, aumenta la expresión de HMOX1 en las células de cáncer de colon HT-29 y mejora la expresión de las proteínas de unión estrecha, mejorando así la lesión de la barrera intestinal inducida por LPS [^[40]]. En conjunto, estos informes respaldan la plausibilidad de que la señalización asociada con ILA pueda estar relacionada con los programas de estrés oxidativo relacionados con HMOX1 en contextos asociados con el CCRC.

4.1.2. Regulación de la reparación del daño del ADN.

La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) participa en la reparación del ADN, la regulación transcripcional y la apoptosis. Cataliza la transferencia de unidades de ADP-ribosa de NAD+ a proteínas objetivo, formando cadenas de poli(ADP-ribosa) (PAR) [^[41]]. Se ha informado que la sobreexpresión de PARP1 en múltiples tipos de cáncer se asocia con la progresión del tumor, la metástasis y la angiogénesis [^[42]]. Clínicamente, los inhibidores de PARP pueden alterar la reparación del ADN y promover la apoptosis, ya sea como monoterapia o en combinación [^[43]]. Lin et al. informaron que un inhibidor de PARP redujo los nódulos metastásicos en varios órganos en modelos de ratón con CCRC, lo que respalda a PARP1 como un objetivo terapéutico relevante en el CCRC [^[44]]. Un estudio reciente informó que el anillo de indol del triptófano puede formar interacciones ?-? apiladas y enlaces de hidrógeno estables dentro del sitio activo de PARP1, lo que podría imitar algunos aspectos de la unión a NAD+ y reducir la actividad de PARP1, lo que puede contribuir a los defectos en la reparación del ADN [^[45]]. En nuestro conjunto de datos, la expresión de PARP1 estaba elevada en las muestras de CCRC, y el acoplamiento molecular sugirió que ILA puede adoptar una conformación de unión plausible con PARP1 a través de enlaces de hidrógeno. Estos resultados proporcionan una justificación estructural para una posible asociación entre las interacciones ILA-PARP1 y las vías de respuesta al daño del ADN relevantes para el CCRC.

4.1.3. Remodelación de la matriz extracelular.

El receptor tipo A de efrina 2 (EPHA2) y la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3) pueden estar relacionados conjuntamente con la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y la reprogramación del MET durante la progresión del CCRC. Se ha informado que EPHA2 se sobreexpresa con frecuencia en las neoplasias, incluidos el cáncer de mama, próstata y colorrectal, y una mayor expresión a menudo se asocia con la invasividad y el mal pronóstico [^[46]]. Se ha implicado a EPHA2 en la metástasis a través de mecanismos que involucran EMT y la remodelación de la MEC. En el CCRC, la sobreexpresión de EPHA2 se ha asociado con la metástasis hepática y los resultados clínicos adversos [^[47]]. Se informó que los conjugados de ácido cólico-triptófano son antagonistas de EPHA2 [^[48]]. Sin embargo, la evidencia directa de las interacciones ILA-EPHA2 sigue siendo limitada. En nuestro análisis, EPHA2 se sobreexpresó en las muestras de CCRC, y el acoplamiento sugirió una posible interacción ILA-EPHA2. Estas observaciones computacionales plantean la posibilidad de que ILA pueda estar relacionado con los programas de MEC asociados con EPHA2.

MMP3 codifica una metaloproteinasa de matriz involucrada en la degradación y remodelación de la MEC [^[49]]. Se ha informado que la expresión elevada de MMP3 en los tejidos tumorales de CCRC se asocia con la progresión del tumor y el mal pronóstico [^[50]]. Aunque las interacciones ILA-MMP3 no se han caracterizado bien, se informó que IAld e IPA, dos metabolitos de indol derivados del triptófano, mitigan la inflamación de los condrocitos inducida por IL-1 y la degradación de la MEC, en parte a través de la supresión de los mediadores inflamatorios y la expresión de MMP3 [^[51]–^[52]]. Dada la similitud estructural entre los metabolitos de indol, es razonable hipotetizar que ILA podría estar relacionado con las vías de remodelación de la MEC relacionadas con MMP3 en el CCRC, aunque se requiere una validación directa.

En los análisis integrados de aprendizaje automático y PPI, EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se priorizaron constantemente como genes clave que conectan los objetivos asociados con ILA con los procesos patológicos relacionados con el CCRC. Aunque actualmente no existen pruebas experimentales directas de la unión de ILA a estas proteínas en el CCRC, la convergencia en la topología de la red, el perfil de expresión, el enriquecimiento funcional, el análisis de infiltración inmune y las simulaciones estructurales sugiere que estos genes representan candidatos biológicamente significativos en lugar de señales computacionales aisladas. Funcionalmente, EPHA2 y MMP3 están asociados con la señalización oncogénica y la remodelación de la MEC, PARP1 es fundamental para las respuestas de reparación del daño del ADN y el estrés de replicación, y HMOX1 está involucrado en la regulación del estrés oxidativo y la homeostasis inflamatoria. Estos hallazgos sugieren que ILA puede estar involucrado en los procesos regulatorios asociados con el CCRC al modular coordinadamente las respuestas al estrés oxidativo, la reparación del daño del ADN y la dinámica de la matriz extracelular, proporcionando así información mecanicista sobre el posible papel de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal como estrategias regulatorias adyuvantes en el CCRC.

4.2. Modulación predicha de las vías de señalización asociadas con el CCRC por ILA

En este estudio, se realizaron análisis de enriquecimiento KEGG y GO sobre los 39 objetivos comunes de ILA-CCRC. Los términos enriquecidos se relacionaron principalmente con la vía de señalización PPAR, la vía de señalización PI3K-AKT y la vía de señalización IL-17. Además, los cuatro genes clave mostraron asociaciones con las firmas de replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos en los análisis transcriptómicos.

Se ha informado que el ILA presenta propiedades antioxidantes y antiinflamatorias en sistemas experimentales, y estos efectos pueden implicar la modulación de múltiples vías que contribuyen a la homeostasis intestinal [^[53]]. La vía PPAR desempeña un papel en el metabolismo de los lípidos y la señalización inflamatoria, y la desregulación de esta vía se ha relacionado con el desarrollo del CCRC. Lian y colaboradores informaron que el ILA redujo los productos de peroxidación lipídica y alivió la toxicidad cardíaca en ratones [^[54]]. La vía PI3K-AKT es un eje de señalización importante que controla la proliferación, el metabolismo y la migración. Los estudios previos sugieren que el ILA puede activar la señalización de PI3K-AKT a través de AhR en algunos contextos, lo que puede estar relacionado con la regulación inflamatoria y los fenotipos de los macrófagos [^[10]]. IL-17 es una citocina proinflamatoria producida por las células Th17 y se ha relacionado con la inflamación promotora de tumores y la evasión inmunitaria [^[55]]. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un factor de riesgo reconocido para el CCRC asociado a la colitis [^[56]]. Los estudios mecanicistas sugieren que el ILA puede reducir la producción de IL-8 inducida por LPS/TNF- en las células epiteliales intestinales, lo que puede ser relevante para la carcinogénesis impulsada por la inflamación [^[39]]. Otros estudios informaron que el ILA puede dirigirse a ROR t, inhibir la diferenciación de Th17 y reducir la activación de la señalización de IL-17 en modelos de ratón de CCRC [^[57]]. Wang y sus colegas informaron que el ILA apoya la integridad de la barrera intestinal a través de la activación coordinada de AhR, el aumento de la expresión de proteínas de unión estrecha y la inhibición de la actividad de NF-B, junto con la reducción de las citocinas proinflamatorias y el aumento de IL-10 en entornos relacionados con la EII [^[38],^[58]]. Estos hallazgos sugieren que el ILA puede tener implicaciones mecanicistas potenciales para la prevención y el tratamiento del CCRC a través de las vías de señalización mencionadas anteriormente.

4.3. Hallazgos relacionados con el sistema inmunitario y análisis de la infiltración inmunitaria

La evidencia acumulada indica que la infiltración de células inmunitarias está asociada con el pronóstico y la respuesta al tratamiento en el CCRC [^[59]]. Las alteraciones en la composición de la MEC y la distribución de las células inmunitarias en el microambiente tumoral (MET) pueden contribuir a los estados inmunosupresores y la progresión tumoral [^[60],^[61]]. En nuestro estudio, el análisis de la infiltración inmunitaria identificó correlaciones estadísticamente significativas entre la expresión de los genes centrales y las proporciones inferidas de células inmunitarias. Los niveles de expresión de EPHA2 y MMP3 se correlacionaron positivamente con los mastocitos activados. La expresión de HMOX1 se correlacionó positivamente con los neutrófilos y negativamente con las células T CD4 de memoria en reposo y las células T reguladoras. La expresión de PARP1 se correlacionó negativamente con las células dendríticas en reposo y los macrófagos M1.

Se ha informado que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal influyen en la señalización relacionada con el sistema inmunitario a través de receptores como los receptores acoplados a proteínas G y AhR, lo que da forma a las respuestas inmunitarias en varios contextos de enfermedades [^[59]]. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos que apoyan la activación de las células T CD8, y los experimentos previos sugirieron que el ILA puede mejorar las respuestas asociadas a las células T CD8 a través de la regulación de IL12A en las células dendríticas en condiciones específicas [^[62]]. Los macrófagos también son componentes clave del MET con diversos fenotipos en la iniciación y la progresión del tumor [^[63]]. Se ha identificado que el ILA es un ligando de AhR, y la señalización de AhR se ha relacionado con el equilibrio fenotípico de los macrófagos y la regulación inflamatoria. Li y colaboradores informaron sobre una expresión reducida del gen sensible a AhR, CYP1B1, en el CCRC según el análisis de GEPIA, mientras que el trabajo in vitro sugirió que el ILA puede estar involucrado en la diferenciación de los macrófagos y las respuestas inflamatorias en los modelos de tumores asociados a la colitis [^[64]]. En conjunto, si bien estos hallazgos previos proporcionan un contexto biológico que respalda una posible relación entre las vías relacionadas con el ILA y la regulación inmunitaria, los resultados del análisis de la infiltración inmunitaria en este estudio deben interpretarse con cautela. Los efectos inmunomoduladores directos y los mecanismos causales requieren una mayor validación a través de experimentos in vitro e in vivo dirigidos.

4.4. Limitaciones de la investigación y direcciones futuras

A través de un marco integrador que combina la farmacología de redes, el aprendizaje automático, el acoplamiento molecular y los análisis de dinámica molecular, este estudio exploró sistemáticamente los posibles objetivos y mecanismos moleculares del ILA en el CCRC. Sin embargo, se deben reconocer varias limitaciones. Primero, aunque los cuatro genes centrales identificados contaron con el respaldo constante de múltiples enfoques computacionales, se derivaron principalmente de análisis bioinformáticos y, por lo tanto, requieren una mayor validación experimental. Los estudios futuros que empleen ensayos in vitro y modelos in vivo serán necesarios para confirmar los papeles funcionales de estos objetivos y para dilucidar su participación causal en los procesos regulatorios asociados al CCRC vinculados al ILA. En segundo lugar, los datos transcriptómicos proporcionan información a nivel de genes, pero capas multiómicas adicionales, que incluyen la proteómica y la metabolómica, pueden ofrecer una visión más completa de las redes regulatorias relacionadas con el ILA. La integración de estas capas puede ayudar a aclarar si las relaciones predichas entre objetivos y vías se reflejan a los niveles de proteínas y metabolitos.

4.1. Posibles mecanismos asociados al CCRC vinculados al ILA a través de la regulación multiobjetivo

4.1.1. Regulación del estrés oxidativo.

La hemo oxigenasa 1 (HMOX1) es una enzima antioxidante que cataliza la degradación del hemo en monóxido de carbono, biliverdina y hierro ferroso. Cada vez hay más evidencia que relaciona a HMOX1 con la ferroptosis, una forma regulada de muerte celular impulsada por la peroxidación lipídica dependiente del hierro [^[37]]. Al modular el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria y la apoptosis, la proteína HMOX1 se ha relacionado con la supervivencia, la proliferación y el comportamiento metastásico de las células tumorales. Por ejemplo, se informó que los gránulos de Shenqi Sanjie inducen la ferroptosis en las células de cáncer de colon a través de la regulación ascendente de HMOX1, con la consiguiente supresión del crecimiento y la metástasis del tumor [^[38]]. Los estudios recientes in vitro e in vivo sugieren que el ILA tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. El trabajo mecanicista indica que el ILA puede activar la vía Nrf2 y aumentar la expresión de los genes de defensa antioxidantes en las células epiteliales intestinales [^[39]]. Otros estudios sugieren que el ILA activa Nrf2 a través de un mecanismo dependiente de AhR, aumenta la expresión de HMOX1 en las células de cáncer de colon HT-29 y mejora la expresión de las proteínas de unión estrecha, lo que alivia la lesión de la barrera intestinal inducida por LPS [^[40]]. En conjunto, estos informes respaldan la plausibilidad de que la señalización asociada al ILA pueda estar relacionada con los programas de estrés oxidativo relacionados con HMOX1 en contextos asociados al CCRC.

4.1.2. Regulación de la reparación del daño del ADN.

La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) participa en la reparación del ADN, la regulación transcripcional y la apoptosis. Cataliza la transferencia de unidades de ADP-ribosa de NAD+ a proteínas objetivo, formando cadenas de poli(ADP-ribosa) (PAR) [^[41]]. Se ha informado que la sobreexpresión de PARP1 se produce en múltiples tipos de cáncer y se ha asociado con la progresión tumoral, la metástasis y la angiogénesis [^[42]]. Clínicamente, los inhibidores de PARP pueden alterar la reparación del ADN y promover la apoptosis, ya sea como monoterapia o en combinación con otros tratamientos [^[43]]. Lin y colaboradores informaron que un inhibidor de PARP redujo los nódulos metastásicos en varios órganos en modelos de ratón con CCRC, lo que respalda a PARP1 como un objetivo terapéutico relevante en el CCRC [^[44]]. Un estudio reciente informó que el anillo de indolo del triptófano puede formar interacciones estables de apilamiento ?-? y enlaces de hidrógeno dentro del sitio activo de PARP1, lo que podría imitar algunos aspectos de la unión a NAD+ y reducir la actividad de PARP1, lo que puede contribuir a los defectos en la reparación del ADN [^[45]]. En nuestro conjunto de datos, la expresión de PARP1 estaba elevada en las muestras de CCRC, y el acoplamiento molecular sugirió que el ILA puede adoptar una postura de unión plausible con PARP1 a través de enlaces de hidrógeno. Estos resultados proporcionan una base estructural para una posible asociación entre las interacciones ILA-PARP1 y las vías de respuesta al daño del ADN relevantes para el CCRC.

4.1.3. Remodelación de la matriz extracelular.

El receptor tipo A de efrina 2 (EPHA2) y la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3) pueden estar relacionados conjuntamente con la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y la reprogramación del MET durante la progresión del CCRC. EPHA2 se expresa con frecuencia en neoplasias, incluidos el cáncer de mama, próstata y colorrectal, y una mayor expresión a menudo se asocia con la invasividad y el mal pronóstico [^[46]]. Se ha relacionado a EPHA2 con la metástasis a través de mecanismos que involucran EMT y la remodelación de la MEC. En el CCRC, la sobreexpresión de EPHA2 se ha asociado con la metástasis hepática y los resultados clínicos adversos [^[47]]. Se informó que los conjugados de ácido cólico-triptófano son antagonistas de EPHA2 [^[48]]. Sin embargo, la evidencia directa de las interacciones ILA-EPHA2 sigue siendo limitada. En nuestro análisis, EPHA2 se sobreexpresó en las muestras de CCRC, y el acoplamiento sugirió una interacción ILA-EPHA2 plausible. Estas observaciones computacionales plantean la posibilidad de que el ILA pueda estar relacionado con los programas de la MEC asociados a EPHA2.

MMP3 codifica una metaloproteinasa de matriz que participa en la degradación y remodelación de la MEC [^[49]]. Se ha informado que una mayor expresión de MMP3 en los tejidos tumorales de CCRC se asocia con la progresión tumoral y el mal pronóstico [^[50]]. Si bien las interacciones ILA-MMP3 no se han caracterizado bien, IAld e IPA, dos metabolitos de indolo derivados del triptófano, mitigaron la inflamación de los condrocitos inducida por IL-1 y la degradación de la MEC, en parte a través de la supresión de los mediadores inflamatorios y la expresión de MMP3 [^[51]–^[52]]. Dada la similitud estructural entre los metabolitos de indolo, es razonable hipotetizar que el ILA podría estar relacionado con las vías de remodelación de la MEC relacionadas con MMP3 en el CCRC, aunque se requiere una validación directa.

En los análisis integradores de aprendizaje automático y PPI, EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se priorizaron constantemente como genes centrales que conectan los objetivos asociados al ILA con los procesos patológicos relacionados con el CCRC. Si bien actualmente no existen pruebas experimentales directas de la unión del ILA a estas proteínas en el CCRC, la convergencia en la topología de la red, el perfil de expresión, el enriquecimiento funcional, el análisis de la infiltración inmunitaria y las simulaciones estructurales sugiere que estos genes representan candidatos biológicamente significativos en lugar de señales computacionales aisladas. Funcionalmente, EPHA2 y MMP3 están asociados con la señalización oncogénica y la remodelación de la MEC, PARP1 es fundamental para las respuestas de daño del ADN y el estrés de replicación, y HMOX1 está involucrado en la regulación del estrés oxidativo y la homeostasis inflamatoria. Estos hallazgos sugieren que el ILA puede estar involucrado en los procesos regulatorios asociados al CCRC al modular coordinadamente las respuestas al estrés oxidativo, la reparación del daño del ADN y la dinámica de la matriz extracelular, lo que proporciona información mecanicista sobre el posible papel de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal como estrategias regulatorias adyuvantes en el CCRC.

4.1.1. Regulación del estrés oxidativo.

La hemooxigenasa 1 (HMOX1) es una enzima antioxidante que cataliza la degradación del hemo en monóxido de carbono, biliverdina y hierro ferroso. Cada vez hay más evidencia que relaciona la HMOX1 con la ferroptosis, una forma regulada de muerte celular impulsada por la peroxidación lipídica dependiente del hierro [^[37]]. Al modular el estrés oxidativo, la señalización inflamatoria y la apoptosis, la proteína HMOX1 se ha relacionado con la supervivencia, la proliferación y el comportamiento metastásico de las células tumorales. Por ejemplo, se informó que los gránulos de Shenqi Sanjie inducen la ferroptosis en las células de cáncer de colon a través de la regulación al alza de la HMOX1, con la consiguiente supresión del crecimiento y la metástasis del tumor [^[38]]. Estudios recientes in vitro e in vivo sugieren que el ILA tiene propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Los estudios mecanicistas indican que el ILA puede activar la vía Nrf2 y aumentar la expresión de los genes de defensa antioxidantes en las células epiteliales intestinales [^[39]]. Estudios adicionales sugieren que el ILA activa Nrf2 a través de un mecanismo dependiente de AhR, aumenta la expresión de HMOX1 en las células de cáncer de colon HT-29 y mejora la expresión de las proteínas de unión estrecha, lo que mejora la lesión de la barrera intestinal inducida por LPS [^[40]]. En conjunto, estos informes respaldan la plausibilidad de que la señalización asociada al ILA pueda estar relacionada con los programas de estrés oxidativo relacionados con la HMOX1 en contextos asociados con el CRC.

4.1.2. Regulación de la reparación del daño del ADN.

La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) participa en la reparación del ADN, la regulación transcripcional y la apoptosis. Cataliza la transferencia de unidades de ADP-ribosa de NAD+ a proteínas diana, formando cadenas de poli(ADP-ribosa) (PAR) [^[41]]. Se ha informado que la sobreexpresión de PARP1 se produce en múltiples tipos de cáncer y se ha asociado con la progresión tumoral, la metástasis y la angiogénesis [^[42]]. Clínicamente, los inhibidores de PARP pueden alterar la reparación del ADN y promover la apoptosis, ya sea como monoterapia o en combinación [^[43]]. Lin et al. informaron que un inhibidor de PARP redujo los nódulos metastásicos en varios órganos en modelos de ratón desnudo de CRC, lo que respalda a la PARP1 como un objetivo terapéutico relevante en el CRC [^[44]]. Un estudio reciente informó que el anillo de indolo del triptófano puede formar interacciones estables de apilamiento ?-? y enlaces de hidrógeno dentro del sitio activo de PARP1, lo que podría imitar aspectos de la unión de NAD+ y reducir la actividad de PARP1, lo que puede contribuir a los defectos en la reparación del ADN [^[45]]. En nuestro conjunto de datos, la expresión de PARP1 estaba elevada en las muestras de CRC, y el acoplamiento molecular sugirió que el ILA puede adoptar una postura de unión plausible con PARP1 a través de enlaces de hidrógeno. Estos resultados proporcionan una base estructural para una posible asociación entre las interacciones ILA-PARP1 y las vías de respuesta al daño del ADN relevantes para el CRC.

4.1.3. Remodelación de la matriz extracelular.

El receptor tipo A de efrina 2 (EPHA2) y la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3) pueden estar relacionados conjuntamente con la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y la reprogramación del microambiente tumoral (TME) durante la progresión del CRC. EPHA2 se sobreexpresa con frecuencia en neoplasias, incluidos el cáncer de mama, próstata y colorrectal, y una mayor expresión a menudo se asocia con invasividad y mal pronóstico [^[46]]. Se ha relacionado a EPHA2 con la metástasis a través de mecanismos que involucran la EMT y la remodelación de la MEC. En el CRC, la sobreexpresión de EPHA2 se ha asociado con metástasis hepática y resultados clínicos adversos [^[47]]. Se informó que los conjugados de ácido cólico-triptófano son antagonistas de EPHA2 [^[48]]. Sin embargo, la evidencia directa de las interacciones ILA-EPHA2 sigue siendo limitada. En nuestro análisis, EPHA2 se sobreexpresó en las muestras de CRC, y el acoplamiento sugirió una interacción ILA-EPHA2 plausible. Estas observaciones computacionales plantean la posibilidad de que el ILA pueda estar relacionado con los programas de la MEC asociados con EPHA2.

MMP3 codifica una metaloproteinasa de matriz involucrada en la degradación y remodelación de la MEC [^[49]]. Se ha informado que la expresión elevada de MMP3 se produce en los tejidos tumorales de CRC y se asocia con la progresión tumoral y el mal pronóstico [^[50]]. Aunque las interacciones ILA-MMP3 no se han caracterizado bien, se informó que IAld e IPA, dos metabolitos de indolo derivados del triptófano, mitigan la inflamación de los condrocitos inducida por IL-1 y la degradación de la MEC, en parte a través de la supresión de los mediadores inflamatorios y la expresión de MMP3 [^[51]–^[52]]. Dada la similitud estructural entre los metabolitos de indolo, es razonable hipotetizar que el ILA podría estar relacionado con las vías de remodelación de la MEC relacionadas con MMP3 en el CRC, aunque se requiere una validación directa.

En los análisis integrados de aprendizaje automático y PPI, EPHA2, HMOX1, MMP3 y PARP1 se identificaron de forma consistente como genes clave que conectan los objetivos asociados con el ILA con los procesos patológicos relacionados con el CRC. Aunque la evidencia experimental directa de la unión del ILA a estas proteínas en el CRC es actualmente limitada, la convergencia en la topología de la red, el perfil de expresión, el enriquecimiento funcional, el análisis de infiltración inmune y las simulaciones estructurales sugiere que estos genes representan candidatos biológicamente significativos en lugar de señales computacionales aisladas. Funcionalmente, EPHA2 y MMP3 están asociados con la señalización oncogénica y la remodelación de la MEC, PARP1 es fundamental para las respuestas al daño del ADN y el estrés de replicación, y HMOX1 está involucrado en la regulación del estrés oxidativo y la homeostasis inflamatoria. Estos hallazgos sugieren que el ILA puede estar involucrado en los procesos regulatorios asociados con el CRC mediante la modulación coordinada de las respuestas al estrés oxidativo, la reparación del daño del ADN y la dinámica de la matriz extracelular, lo que proporciona información mecanicista sobre el posible papel de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal como estrategias regulatorias adyuvantes en el CRC.

4.2. Modulación predicha de las vías de señalización asociadas con el CRC por el ILA

En este estudio, se realizaron análisis de enriquecimiento KEGG y GO sobre los 39 objetivos comunes ILA-CRC. Los términos enriquecidos se relacionaron principalmente con la vía de señalización PPAR, la vía de señalización PI3K-AKT y la vía de señalización IL-17. Además, los cuatro genes clave mostraron asociaciones con las firmas de replicación del ADN y el metabolismo de los ácidos grasos en los análisis transcriptómicos.

Se informó que el ILA exhibe propiedades antioxidantes y antiinflamatorias en sistemas experimentales, y estos efectos pueden involucrar la modulación de múltiples vías que contribuyen a la homeostasis intestinal [^[53]]. La vía PPAR desempeña un papel en el metabolismo de los lípidos y la señalización inflamatoria, y la desregulación de esta vía se ha relacionado con el desarrollo del CRC. Lian et al. informaron que el ILA redujo los productos de peroxidación lipídica y alivió la toxicidad cardíaca en ratones [^[54]]. La vía PI3K-AKT es un eje de señalización importante que controla la proliferación, el metabolismo y la migración. Los estudios previos sugieren que el ILA puede activar la señalización PI3K-AKT a través de AhR en algunos contextos, lo que puede estar relacionado con la regulación inflamatoria y los fenotipos de los macrófagos [^[10]]. IL-17 es una citoquina proinflamatoria producida por las células Th17 y se ha relacionado con la inflamación que promueve el tumor y la evasión inmune [^[55]]. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un factor de riesgo reconocido para el CRC asociado con la colitis [^[56]]. Los estudios mecanicistas sugieren que el ILA puede reducir la producción de IL-8 inducida por LPS/TNF- en las células epiteliales intestinales, lo que puede ser relevante para la carcinogénesis impulsada por la inflamación [^[39]]. Otros estudios informaron que el ILA puede dirigirse a ROR t, inhibir la diferenciación de Th17 y reducir la activación de la señalización de IL-17 en modelos de ratón de CRC [^[57]]. Wang y sus colegas informaron que el ILA apoya la integridad de la barrera intestinal a través de la activación coordinada de AhR, el aumento de la expresión de las proteínas de unión estrecha y la inhibición de la actividad de NF-B, junto con la reducción de las citoquinas proinflamatorias y el aumento de IL-10 en entornos relacionados con la EII [^[38],^[58]]. Estos hallazgos sugieren que el ILA puede tener implicaciones mecanicistas potenciales para la prevención y el tratamiento del CRC a través de las vías de señalización mencionadas.

4.3. Hallazgos relacionados con el sistema inmunitario y análisis de infiltración inmune

Cada vez hay más evidencia que indica que la infiltración de células inmunitarias está asociada con el pronóstico y la respuesta al tratamiento en el CRC [^[59]]. Las alteraciones en la composición de la MEC y la distribución de las células inmunitarias en el TME pueden contribuir a los estados inmunosupresores y la progresión tumoral [^[60],^[61]]. En nuestro estudio, el análisis de infiltración inmune identificó correlaciones estadísticamente significativas entre la expresión de los genes clave y las proporciones inferidas de las células inmunitarias. Los niveles de expresión de EPHA2 y MMP3 se correlacionaron positivamente con los mastocitos activados. La expresión de HMOX1 se correlacionó positivamente con los neutrófilos y negativamente con las células T CD4 de memoria en reposo y las células T reguladoras. La expresión de PARP1 se correlacionó negativamente con las células dendríticas en reposo y los macrófagos M1.

Se informó que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal influyen en la señalización relacionada con el sistema inmunitario a través de receptores como los receptores acoplados a proteínas G y AhR, lo que da forma a las respuestas inmunitarias en varios contextos de enfermedades [^[59]]. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos que apoyan la activación de las células T CD8, y los experimentos previos sugirieron que el ILA puede mejorar las respuestas asociadas con las células T CD8 a través de la regulación de IL12A en las células dendríticas en condiciones específicas [^[62]]. Los macrófagos también son componentes clave del TME con diversos fenotipos en la iniciación y la progresión del tumor [^[63]]. Se identificó el ILA como un ligando de AhR, y la señalización de AhR se ha relacionado con el equilibrio fenotípico de los macrófagos y la regulación inflamatoria. Li et al. informaron una expresión reducida del gen responsivo a AhR CYP1B1 en el CRC según el análisis GEPIA, mientras que el trabajo in vitro sugirió que el ILA puede estar involucrado en la diferenciación de los macrófagos y las respuestas inflamatorias en los modelos de tumores asociados con la colitis [^[64]]. En conjunto, si bien estos hallazgos previos brindan un contexto biológico que respalda una posible relación entre las vías relacionadas con el ILA y la regulación inmunitaria, los resultados del análisis de infiltración inmune en este estudio deben interpretarse con cautela. Se requiere una validación adicional a través de experimentos in vitro e in vivo dirigidos para confirmar los efectos inmunomoduladores directos y los mecanismos causales.

4.4. Limitaciones de la investigación y direcciones futuras

A través de un marco integrador que combina la farmacología de la red, el aprendizaje automático, el acoplamiento molecular y los análisis de dinámica molecular, este estudio exploró sistemáticamente los posibles objetivos y mecanismos moleculares del ILA en el CRC. Sin embargo, se deben reconocer varias limitaciones. Primero, aunque los cuatro genes clave identificados contaron con el respaldo constante de múltiples enfoques computacionales, se derivaron principalmente de análisis bioinformáticos y, por lo tanto, requieren una validación experimental adicional. Los estudios futuros que empleen ensayos in vitro y modelos in vivo serán necesarios para confirmar los papeles funcionales de estos objetivos y para dilucidar su participación causal en los procesos regulatorios asociados con el CRC relacionados con el ILA. En segundo lugar, los datos transcriptómicos brindan información a nivel del gen, pero capas adicionales de ómica, que incluyen la proteómica y la metabolómica, pueden ofrecer una visión más completa de las redes regulatorias relacionadas con el ILA. La integración de estas capas puede ayudar a aclarar si las relaciones predichas entre objetivos y vías se reflejan a nivel de proteínas y metabolitos.

5. Conclusión

Al integrar la farmacología de la red, el aprendizaje automático, el acoplamiento molecular y las simulaciones de dinámica, este estudio dilucida sistemáticamente el papel mecanicista previsto del metabolito derivado de la microbiota intestinal ILA en el CRC. Se identificaron cuatro genes clave como nodos moleculares clave potencialmente asociados con los procesos regulatorios relacionados con el CRC que involucran al ILA. Estos hallazgos brindan información mecanicista sobre cómo el ILA puede participar en la regulación molecular asociada con el CRC a través de interacciones coordinadas y de múltiples objetivos. Es importante destacar que este estudio no solo avanza en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a la actividad del ILA en el CRC, sino que también destaca el potencial más amplio de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal como candidatos prometedores para estrategias regulatorias adyuvantes en el CRC.