Una plataforma nanométrica basada en fullerenos amilados permite una terapia sinérgica dirigida a VEGFR2 contra la angiogénesis y la inmunoterapia del tumor.

Los tumores malignos representan una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial [^[1],^[2]]. Una característica clave de la progresión tumoral es la angiogénesis: la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente [^[3]]. Este proceso suministra nutrientes y oxígeno, al tiempo que fomenta un microambiente tumoral inmunosupresor (MTI) mediante el reclutamiento de células T reguladoras (Tregs) y células supresoras derivadas de la médula ósea [^[4],^[5]]. Sin embargo, la vasculatura tumoral suele ser anormal, presentando desorganización estructural, hiperpermeabilidad y perfusión ineficiente, lo que contribuye a una presión elevada del líquido intersticial (PEL), una perfusión heterogénea y una administración deficiente de agentes terapéuticos y células inmunitarias [[^[6]], [^[7]], [^[8]], [^[9]]]. El desequilibrio entre la rápida proliferación tumoral y la vascularización insuficiente induce hipoxia, estabiliza los factores inductibles por hipoxia (FIH) y aumenta la expresión de señales proangiogénicas, como los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [[^[10]], [^[11]], [^[12]]], lo que a su vez exacerba la inmunosupresión al inducir la expresión de puntos de control inmunitarios y promover subpoblaciones de células inmunitarias supresoras [^[13],^[14]]. En conjunto, la vasculatura tumoral aberrante y la señalización proangiogénica sostenida contribuyen a la progresión tumoral y la supresión inmune, lo que destaca la angiogénesis como un importante objetivo terapéutico [^[15]].

La terapia antiangiogénica (TAA) bloquea la formación de vasos tumorales, privando a las células cancerosas de oxígeno y nutrientes, y atenuando la señalización inmunosupresora inducida por la hipoxia dentro del MTI [^[16]]. Se ha observado un aumento de la infiltración de células inmunitarias y una reducción del reclutamiento de poblaciones inmunitarias supresoras tras la inhibición de la angiogénesis, lo que proporciona la base para combinar la TAA con la inmunoterapia con el fin de mejorar los resultados del tratamiento [^[17]]. Entre los principales mediadores de la angiogénesis patológica, el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) y su receptor primario VEGFR2 (receptor de la quinasa insertada, KDR) se expresan con frecuencia en exceso en los tumores y constituyen objetivos terapéuticos clave [^[18]]. El bloqueo de VEGFR2 inhibe la angiogénesis y podría modular la composición de las células inmunitarias dentro del MTI, incluidos los efectos sobre la polarización de los macrófagos y la infiltración de células T [^[19]]. Los estudios clínicos de inhibidores de VEGFR2 de moléculas pequeñas, como apatinib (NCT03192735), han demostrado beneficios para la supervivencia en diversos tumores sólidos [^[20]]. Sin embargo, la eficacia de estos agentes se ve limitada por la escasa acumulación tumoral y la toxicidad sistémica, lo que subraya la necesidad de mejorar las estrategias de administración para potenciar la focalización tumoral y la eficacia terapéutica [^[21]].

Los fullerenos y sus derivados presentan una excelente biocompatibilidad y efectos antitumorales a través de la focalización directa de las células tumorales o la modulación del MTI mediante la defensa antioxidante, la activación inmunitaria, la inhibición de la angiogénesis, la supresión de las células madre cancerosas y la regulación de las oncoproteínas [[^[22]], [^[23]], [^[24]], [^[25]], [^[26]]]. Por ejemplo, los fullerenos polihidroxilados reducen la expresión de factores angiogénicos [^[27]], mientras que los fullerenos funcionalizados con ?-alanina pueden influir en la estructura vascular [^[28]]. Sin embargo, la asimetría molecular y las modificaciones en múltiples sitios de estos derivados a menudo dan como resultado composiciones complejas, lo que dificulta la identificación del objetivo [^[29]]. Recientemente, identificamos el tetra[4-(amino)piperidin-1-il]C60 epóxido (TAPC), un fullereno amínico de composición química definida, como un inhibidor del crecimiento y la metástasis tumoral a través de la detención en G0/G1 y la supresión de la transición epitelio-mesenquimal [^[30],^[31]]. Aquí, utilizamos el cribado fenotípico de una biblioteca sintetizada de derivados de fullerenos amínicos e identificamos el TAPC como un potente candidato antiangiogénico. Los análisis transcriptómicos destacaron la asociación pronóstica desfavorable de VEGFR2 en el cáncer colorrectal, lo que guio la investigación posterior sobre el mecanismo de acción del TAPC. El TAPC redujo la expresión y la fosforilación de VEGFR2, interrumpiendo así la cascada de señalización PI3K-AKT. La interacción molecular directa entre el TAPC y VEGFR2 se confirmó posteriormente mediante interferometría de bicapa (IBI) y cálculos teóricos. En conjunto, estos resultados identifican el TAPC como un derivado de fullereno que modula la señalización asociada a VEGFR2 y la actividad angiogénica.

Para mejorar la traslación clínica del TAPC, empleamos nanopartículas recubiertas con membrana celular (CNP), una plataforma biomimética en la que los núcleos de nanopartículas sintéticas están recubiertos con membranas celulares naturales. Esta estrategia mejora la evasión inmunitaria, prolonga la circulación y mejora la focalización tumoral, facilitando la administración de fármacos y la modulación del MTI [[^[32]], [^[33]], [^[34]], [^[35]]]. Específicamente, el TAPC se encapsuló en núcleos de nanopartículas de PLGA y se recubrió con membranas celulares tumorales homólogas para generar TAPC@CNP. En un modelo de tumor colorrectal MC38, las TAPC@CNP suprimieron el crecimiento tumoral y redujeron la expresión de marcadores asociados a la angiogénesis, incluido VEGFR2 y CD31. La formulación mostró una seguridad favorable, sin lesiones detectables en los principales órganos. Los análisis de biodistribución y farmacocinética demostraron una circulación sostenida y una acumulación de nanopartículas asociadas al tumor, lo que respalda una mejor administración. Además, el tratamiento con TAPC@CNP redujo los niveles de células T reguladoras y aumentó la infiltración de células T dentro de los tumores, lo que indica la modulación de las poblaciones de células inmunitarias en el microambiente tumoral. En conjunto, estos hallazgos respaldan el uso de TAPC@CNP como una formulación de nanopartículas para la administración de un derivado de fullereno que se dirige a VEGFR2 con efectos antiangiogénicos e inmunomoduladores.

Materiales y métodos

Materiales

El TAPC se preparó, se caracterizó y se etiquetó fluorescentemente con Cy5.5 (abreviado como TAPC-Cy5.5) y se biotiniló (abreviado como TAPC-Biotina), según se describe en nuestro trabajo anterior [^[30]]. Todos los reactivos comerciales se utilizaron sin purificación adicional. TPFE y TAEPFE se sintetizaron siguiendo nuestro método anterior [^[31]].

Síntesis de epóxidos de ^[60]fullereno terminados con tetraamina

50 mg de C60Cl6 (1 eq) se disolvieron por completo en 50 ml de tolueno. A continuación, se añadieron amina secundaria (7,5 eq), cumil hidroperóxido (30 µL, 3 eq) y K2CO3 (250 mg). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la capa orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando tolueno:metanol como eluyente para obtener un sólido de color amarillo-marrón. Posteriormente, el producto se disolvió en diclorometano:ácido trifluoroacético (7:3) y se hizo reaccionar durante 2 horas para efectuar la desprotección. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido amarillo (Fig. S1a).

Síntesis de mono-adductos de malonato de Bingel (MBAMF/MBMAF-2)

72 mg de C60 (1 eq) se disolvieron por completo en 72 ml de tolueno. A continuación, se añadieron malonato (1,1 eq), 1,8-diazabiciclo^[5,4,0]undec-7-eno (11,8 µL, 1,1 eq) y CBr4 (35,2 mg, 1,1 eq). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la capa orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando tolueno puro como eluyente para obtener un producto marrón. Posteriormente, el producto se disolvió en diclorometano:ácido trifluoroacético (7:3) y se hizo reaccionar durante 2 horas para efectuar la desprotección. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido marrón (Fig. S1b).

Síntesis de derivado de yoduro de N-metilpirrolidinio (NDMPFI)

El NDMPFI se preparó mediante la reacción de Prato y la metilación con yodometano, según nuestro trabajo anterior [^[36]]. 72 mg de C60 (1 eq) se disolvieron por completo en 72 ml de tolueno. A continuación, se añadieron sarcosina (13,5 mg, 1,5 eq) y paraformaldehído (4,5 mg, 1,5 eq). La mezcla de reacción se reflujó a 140 °C durante 2 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la capa orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando tolueno puro como eluyente para obtener un producto marrón. Posteriormente, 40 mg de derivados de pirrolidina de C60 se disolvieron en 100 ml de CH3I. La mezcla de reacción se reflujó a temperatura ambiente durante 48 horas. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido marrón (Fig. S1c).

Modificación de TAPC con PEG-PO

El PEG-PO se preparó con PEG (Mw 1900) y oxicloruro de fósforo según el método descrito [^[37]]. El TAPC se mezcló por separado con una relación molar de 10 veces de PEG-PO en una solución acuosa para su uso posterior en experimentos in vivo e in vitro.

Cultivo celular y tratamiento

La línea celular endotelial humana (HUVEC), la línea celular de carcinoma mamario (4T1) y la línea celular de adenocarcinoma de colon murino (MC38) se adquirieron del Centro de Recursos Celulares de la Universidad de Medicina de Pekín. Las células se cultivaron en RPMI 1640 (Mediatech, 10-040) o DMEM (Mediatech, 10-013) que contenía un 10% de FBS (Mediatech, 35-081) en un incubador de CO2 al 5% a 37 °C.

Extracción de membranas celulares tumorales

Las células MC38 se cultivaron a gran escala, se lavaron con PBS después de la digestión, se centrifugaron a 500 × g, se resuspendieron en un tampón de lisis de baja osmolaridad que contenía 20 mM de Tris-HCl, 10 mM de KCl, 2 mM de MgCl2 y un inhibidor de proteasas sin EDTA, y luego se rompieron utilizando un homogeneizador. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 3200 × g durante 15 minutos, seguida de otra centrifugación a 10 000 × g durante 15 minutos para recoger el sobrenadante. Por último, el pellet se recogió mediante centrifugación a 100 000 × g durante 60 minutos, se resuspendió en solución de PBS y se denominó membrana celular tumoral extraída (OPTIMA XPN-100).

Preparación de nanopartículas de TAPC-PLGA

El PLGA adquirido se disolvió en acetona para preparar una solución de 1 mg/ml. A continuación, se añadieron 40 ml de esta solución gota a gota a una solución acuosa de 120 ml que contenía 8 mg de TAPC y 10 veces la cantidad molar de PEG-PO, mientras se agitaba continuamente durante 2 horas para obtener nanopartículas de TAPC-PLGA. Las nanopartículas se resuspendieron en 10 ml de agua utilizando un tubo de ultrafiltración de 10 kDa.

Preparación y caracterización de TAPC-PLGA@Membrana

Utilizando un microinyector, la solución de TAPC-PLGA y la solución de membrana celular tumoral se exprimieron alternativamente a través de membranas de diferentes tamaños (1000 nm y 400 nm) mediante extrusión física para obtener nanoesferas de TAPC-PLGA@Membrana (TAPC@CNP). La morfología se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (MET, HT7700) y el tamaño y el potencial zeta se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS, NanoZS ZEN3600).

Toxicidad celular

La concentración inhibidora media (CI50) de TAPC se evaluó en células MC38. Las células se cultivaron en una placa de 96 pocillos durante 24 horas, se trataron con TAPC a concentraciones que oscilaban entre 0 y 20 µM durante 24 horas a 37 °C en la oscuridad. La viabilidad celular se detectó utilizando un kit de ensayo CCK-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japón). La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas iMark, Bio-RAD, EE. UU.) para determinar la viabilidad celular (viabilidad celular = (ODtre - ODmedio)/(ODcon - ODmedio)), donde ODtre es la absorbancia de las células tratadas a 450 nm, ODcon es la absorbancia de las células de control y ODmedio es la absorbancia del medio de cultivo.

Ensayo de formación de tubos

El ensayo de formación de tubos se realizó utilizando placas ibidi. Se añadió 10 µL de gel de matriz preenfriado a cada pocillo y se dejó solidificar a 37 °C. A continuación, se añadió 50 µL de suspensión celular (10 000 células) a cada pocillo. Después de 6 horas de tratamiento con 5-20 µM de TAPC, la formación de tubos se observó bajo un microscopio y se obtuvieron resultados cuantitativos utilizando el software ImageJ.

Ensayo de la membrana corioalantoidea (MCA)

El sexto día de incubación, los embriones de pollo se agruparon aleatoriamente y se colocaron sobre una campana de flujo de aire ultra limpio. Bajo la lámpara de iluminación de huevos, se abrió una ventana en el extremo cefálico, se marcó el área a 1 cm del extremo cefálico y se abrió una ventana de aproximadamente 1 cm × 1 cm. Se añadieron unas gotas de solución salina para que la membrana corioalantoidea de los embriones de pollo se retraiga. Se eliminó la membrana blanca de la cámara de aire lo más posible con unas pinzas, exponiendo la capa inferior de la membrana corioalantoidea. El soporte se colocó en el área relativamente avascular entre los dos vasos sanguíneos principales en la superficie de la membrana corioalantoidea, y se aspiraron 20 µL de la solución del fármaco de cada grupo en el centro de la superficie del soporte con un aplicador estéril. A continuación, se selló la ventana y el extremo del ventrículo de aire con una cinta adhesiva estéril, y se continuó la incubación durante 72 horas. Después de 72 horas de administración, se fijó y se fotografió la membrana corioalantoidea bajo un microscopio.

Cámara de pliegue dérmico dorsal

Se eliminó la piel de un lado de la región dorsal de ratones desnudos y se suturó una lámina de vidrio con un clip de acero inoxidable para fijarla. Esto permitió la observación de los vasos sanguíneos debajo de la piel. Después de una semana de inyección de células tumorales, se inyectó solución de TAPC en la vena de la cola y se observaron los cambios en los vasos sanguíneos a lo largo del tiempo (Olympus-BX51WI).

Ensayo de co-inmunoprecipitación

Se co-incubaron durante la noche TAPC biotinilado y lisados de células MC38. El complejo de fulereno-proteína se separó utilizando resina recubierta con estreptomicina, se calentó en el tampón de muestra y se sometió a electroforesis SDS-PAGE. Los resultados de la inmunoprecipitación se obtuvieron incubando con los anticuerpos de proteína correspondientes, y el grupo sin TAPC biotinilado se utilizó como control negativo.

Supresión de la expresión de VEGFR2 mediante ARN de interferencia (ARNi)

La supresión de la expresión de VEGFR2 se realizó utilizando ARNi. Se sembraron células HUVEC en placas de 6 pocillos y se transfectaron con ARNi dirigido a VEGFR2 o ARNi de control no dirigido utilizando Lipofectamina 3000 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se recogieron las células y se evaluó la expresión de VEGFR2 mediante Western blot para confirmar la eficacia de la supresión. Las células transfectadas se utilizaron posteriormente para ensayos de formación de túbulos y análisis de proteínas. Secuencia de ARNi:

GUACAUAGUUGUCGUUGUATT,
UACAACGACAACUAUGUACTT.

Ensayo de liberación

El perfil de liberación de TAPC@CNP se evaluó en condiciones fisiológicas y ácidas. Se suspendieron TAPC-Cy5.5@CNP en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) o tampón de acetato (pH 6,0) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave. En momentos predeterminados, se recogió el sobrenadante. Se cuantificó el TAPC-Cy5.5 liberado midiendo la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de liberación se calculó en relación con la señal de fluorescencia total de TAPC-Cy5.5.

Ensayo de estabilidad de nanopartículas

La estabilidad de TAPC@CNP se evaluó en condiciones de almacenamiento y en presencia de suero. Para la estabilidad en suero, se incubaron TAPC@CNP en PBS que contenía un 10% de suero fetal bovino a 37 °C. Para la estabilidad en el almacenamiento, las nanopartículas se almacenaron a 4 °C. En momentos designados, se midió el tamaño de las nanopartículas y el índice de polidispersidad utilizando dispersión dinámica de la luz (NanoZS ZEN3600, Malvern Instruments).

Ensayo de inmunofluorescencia (IF) in vitro

Las células MC38 se trataron con TAPC marcado con Cy5.5 durante 24 horas, se fijaron con metanol, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon con una solución de BSA al 5% y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (1:300), se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a temperatura ambiente durante 1 hora y, a continuación, se tiñeron con un colorante nuclear. Las imágenes de las proteínas se obtuvieron utilizando microscopía confocal.

Anticuerpos

Los anticuerpos se enumeran a continuación: Anticuerpo anti-receptor de VEGF 2 [EPRER16Y] (Abcam, Cat: ab134191), Anticuerpo anti-subunidad catalítica de PI 3 quinasa gamma (Abcam, Cat: ab302958), Anticuerpo anti-AKT (fosfo T308) (Abcam, Cat: ab38449), Anticuerpo anti-STAT3 [EPR787Y] (Abcam, Cat: ab68153), ?-Actina (13E5) mAb de conejo (CST, Cat: #4970), Anticuerpo anti-CD31 [EPR17260-263] (Abcam, Cat: ab222783), FITC anti-ratón CD45 (Biolegend, Cat: 103108), PerCP/Cianina5.5 anti-ratón CD4 (Biolegend, Cat: 100434), Anticuerpo monoclonal FOXP3 (NRRF-30), PE, eBioscience (Thermo, Cat: 12-4771-82), CD3 (Abcam, Cat: ab16669), CD4 (Servicebio, Cat: GB15064).

Western blot

Las células MC38 tratadas con TAPC durante 24 horas se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las proteínas recogidas se hirvieron en un tampón de muestra 5× durante 5 minutos, se separaron por SDS-PAGE y, a continuación, se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con leche descremada al 5% durante 1 hora, las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C, seguido de la incubación con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora. Finalmente, las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un método de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Absin, abs920).

Acoplamiento molecular

La simulación de acoplamiento molecular se realizó utilizando el software Autodock versión 4.2.6.20. Las estructuras proteicas 3D de VEGFR2 se obtuvieron de la base de datos de estructuras proteicas modeladas de AlphaFold. En el proceso de acoplamiento, la proteína se designó como receptor, mientras que TAPC era el ligando. Se generaron archivos de entrada de acoplamiento y se analizaron los resultados del acoplamiento utilizando el módulo AutoDockTools versión 1.5.620. El sitio de unión para cada proteína estaba casi completamente cubierto estableciendo un tamaño de caja de cuadrícula de 60 × 60 × 60 puntos con un espaciamiento de puntos de cuadrícula de 0,375 Å. El software AutoGrid se utilizó para calcular el mapa de afinidad de unión. Cada proceso de acoplamiento implicó 100 ensayos de acoplamiento con un mínimo de 150 conformaciones de acoplamiento, inicializadas con posiciones de inicio aleatorias tanto para el receptor como para el ligando. Las conformaciones acopladas resultantes se agruparon utilizando una tolerancia de desviación cuadrática media (RMSD) de 1,5 Å. La pose de unión con la energía de acoplamiento más baja del clúster más grande se seleccionó para un análisis posterior.

Ensayo de interferometría de capa biológica (BLI)

El ensayo BLI se realizó utilizando un instrumento Octet RED96e. La proteína VEGFR2 marcada con His se acopló y la concentración de la molécula pequeña se fijó en 8,8-100 µM en una solución de PBS que contenía 0,1% de BSA y 0,02% de Tween-20. Primero, el biosensor se equilibró en la solución tampón y, a continuación, la proteína se unió a la superficie del biosensor para aumentar el grosor de la capa de membrana superficial. Posteriormente, el biosensor se sumergió en la solución de muestra de prueba y se realizó un seguimiento en tiempo real del grosor de la capa de membrana biológica para obtener las constantes cinéticas de la muestra de prueba.

Ensayo de analizador de flujo extracelular Seahorse

Las células MC38 se incubaron en microplacas para cultivo celular Seahorse XFe96 (Agilent) a una densidad de 8 × 103 durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron diferentes reactivos para los diferentes ensayos correspondientes. Los valores correspondientes se detectaron utilizando el analizador Seahorse XFe96 (Agilent). Para el ensayo ECAR, se añadieron secuencialmente 25 µL de glucosa (Sigma, G7528), 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina (Abcam, ab141829) y 25 µL de 2-desoxiglucosa (2-DG, Sigma, D8375). Para el ensayo OCR, se añadieron secuencialmente 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina, 25 µL de 1 µmol/L de mesoxalonitrilo 4-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP, Sigma, C2920) y 25 µL de antimicina A (Abcam, ab141904)/rotenona (Sigma, R8875). Para el ensayo de la tasa de ATP en tiempo real, las células se trataron secuencialmente con 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina y 25 µL de antimicina A/rotenona.

Experimento in vivo

El modelo animal se estableció utilizando ratones hembra Balb/c de 6 semanas de edad y C57BL/6 comprados en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Pekín. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Química de la Academia China de Ciencias (número de aprobación: SYXK (Jing) 2018-0033). Los ratones se alojaron en condiciones controladas de aproximadamente 50% de humedad, 25 °C de temperatura y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se implantaron tumores MC38 por vía subcutánea y, a continuación, se inyectaron por vía intravenosa a los ratones 100 µL de solución salina, PEG-PO (5 mM), PEG-PO recubierto con TAPC (0,5 mM), CNP o TAPC@CNP (0,5 mM de TAPC equivalente) para un total de 5 inyecciones con un intervalo de 2 días. El tamaño de los tumores subcutáneos se controló cada 2 días utilizando un calibrador durante 2 semanas. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: Volumen tumoral (mm3) = 1/2 × (longitud × anchura × anchura).

Imagen fluorescente ex vivo

TAPC-Cy5.5@CNP y Cy5.5 libre se inyectaron por vía intravenosa en ratones con tumores a una dosis de 100 µg/kg de Cy5.5. Después de 24, 48 horas, 4 y 7 días, se recogieron los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tumor) y se visualizaron utilizando el sistema IVIS Spectrum.

Citometría de flujo (FCM)

Se prepararon suspensiones de células individuales a partir del tumor, el timo, el bazo y los ganglios linfáticos de los ratones y se incubaron con los siguientes anticuerpos: F4/80 (Biolegend, 123109), FITC anti-ratón CD45 (Biolegend, 103108), PE/Cianina7 anti-ratón CD3 (Biolegend, 100220), PerCP/Cianina5.5 anti-ratón CD4 (Biolegend, 100434), Anticuerpo monoclonal PE Foxp3 (eBioscience, 12-4771-82). Para la tinción intracelular, las células se fijaron y se permeabilizaron antes de la tinción con anticuerpos contra Foxp3 o interferón gamma (IFN).

Ensayo de inmunofluorescencia in vivo

Después de retirar los tumores de los ratones, se limpiaron con solución salina, se incluyeron en OCT y se cortaron en secciones de 4 µm de grosor, que se dejaron a temperatura ambiente y luego se lavaron con TBS. A continuación, se sumergieron en PBST que contenía un 5% de solución de leche descremada para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Después de lavar con TBST, se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes anti-CD4 (Servicebio, GB15064) y anti-CD3 (Abcam, ab16669) a 4 °C durante la noche, protegidos de la luz. A continuación, se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente. Por último, las láminas se bloquearon con un agente de extinción de la fluorescencia que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI, para etiquetar los núcleos) y se cubrieron con un cubreobjetos. Las muestras se visualizaron con un escáner confocal láser. La fluorescencia media se cuantificó utilizando Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, EE. UU.).

Análisis de la expresión génica y la supervivencia

Se realizaron análisis de datos transcriptómicos y de supervivencia utilizando bases de datos de acceso público. La expresión diferencial del gen VEGFR2 entre el tejido tumoral de colon y el tejido normal se obtuvo de la plataforma TNMplot (https://tnmplot.com), que integra perfiles basados en chips de genes y en secuenciación de ARN de las bases de datos TCGA, GTEx y GEO. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando el Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com) para el cáncer de colon, con la supervivencia general estratificada por los niveles de expresión de VEGFR2. Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se analizaron a través del Portal de una sola célula (https://singlecell.broadinstitute.org), específicamente utilizando el conjunto de datos "Unidades funcionales multicelulares espacialmente definidas en el cáncer de colon". La expresión específica del tipo celular de VEGFR2 se visualizó mediante proyección UMAP, gráficos de características y gráficos de violín.

Análisis estadístico

La significación estadística entre dos grupos se determinó utilizando una prueba t de Student de dos colas. La comparación entre múltiples grupos se realizó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Los cálculos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Se consideró significativo un valor de p inferior a 0,05.

Materiales

TAPC se preparó, se caracterizó y se etiquetó fluorescentemente con Cy5.5 (abreviado como TAPC-Cy5.5) y TAPC biotinilado (abreviado como TAPC-Biotina) según se describe en nuestro trabajo anterior [^[30]]. Todos los reactivos comerciales se utilizaron sin purificación adicional. TPFE y TAEPFE se sintetizaron siguiendo nuestro método anterior [^[31]].

Síntesis de fulerenos epóxidos terminados en tetraamina

50 mg de C60Cl6 (1 eq) se disolvió por completo en 50 ml de tolueno. A continuación, se añadieron amina secundaria (7,5 eq), peróxido de cumilo (30 µL, 3 eq) y K2CO3 (250 mg). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la fase orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando tolueno:metanol como eluyente, para obtener un sólido de color amarillo-marrón. Posteriormente, el producto se disolvió en diclorometano:ácido trifluoroacético (7:3) y se hizo reaccionar durante 2 h para llevar a cabo la desprotección. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido amarillo (Fig. S1a).

Síntesis de mono-adductos de bingel de malonato (MBAMF/MBMAF-2)

72 mg de C60 (1 eq) se disolvieron por completo en 72 ml de tolueno. A continuación, se añadieron éster malónico (1,1 eq), 1,8-diazabiciclo^[5,4,0]undec-7-eno (11,8 µL, 1,1 eq) y CBr4 (35,2 mg, 1,1 eq). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la fase orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando tolueno puro como eluyente, para obtener un producto marrón. Posteriormente, el producto se disolvió en diclorometano:ácido trifluoroacético (7:3) y se hizo reaccionar durante 2 h para llevar a cabo la desprotección. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido marrón (Fig. S1b).

Síntesis del derivado de yoduro de N-metilpirrolidinio (NDMPFI)

El NDMPFI se preparó mediante la reacción de Prato y metilación con yodometano, según nuestro trabajo anterior [^[36]]. 72 mg de C60 (1 eq) se disolvieron por completo en 72 ml de tolueno. A continuación, se añadieron sarcosina (13,5 mg, 1,5 eq) y paraformaldehído (4,5 mg, 1,5 eq). La mezcla de reacción se reflujó a 140 °C durante 2 h. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se extrajo con agua y la fase orgánica se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando tolueno puro como eluyente, para obtener un producto marrón. Posteriormente, 40 mg de derivados de pirrolidina de C60 se disolvieron en 100 ml de CH3I. La mezcla de reacción se reflujó a temperatura ambiente durante 48 h. A continuación, los disolventes se eliminaron por destilación a presión reducida, obteniendo un sólido marrón (Fig. S1c).

Modificación de TAPC con PEG-PO

El PEG-PO se preparó con PEG (Mw 1900) y oxicloruro de fósforo, según el método descrito [^[37]]. El TAPC se mezcló por separado con una relación molar 10 veces superior de PEG-PO en una solución acuosa para experimentos in vivo e in vitro.

Cultivo celular y tratamiento

La línea celular endotelial humana (HUVEC), la línea celular de carcinoma mamario (4T1) y la línea celular de adenocarcinoma de colon murino (MC38) se adquirieron del Centro de Recursos Celulares de la Facultad de Medicina de la Unión de Pekín. Las células se cultivaron en RPMI 1640 (Mediatech, 10-040) o DMEM (Mediatech, 10-013) que contenía 10% de FBS (Mediatech, 35-081) en un incubador de 5% de CO2 a 37 °C.

Extracción de la membrana de células tumorales

Las células MC38 se cultivaron a gran escala, se lavaron con PBS después de la digestión, se centrifugaron a 500 × g, se resuspendieron en un tampón de lisis de baja osmolaridad que contenía 20 mM de Tris-HCl, 10 mM de KCl, 2 mM de MgCl2 y un inhibidor de proteasas sin EDTA, y luego se rompieron utilizando un homogeneizador. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 3200 × g durante 15 min, seguida de otra centrifugación a 10.000 × g durante 15 min para recoger el sobrenadante. Finalmente, el precipitado se recogió mediante centrifugación a 100.000 × g durante 60 min, se resuspendió en solución de PBS y se denominó membrana celular tumoral extraída (OPTIMA XPN-100).

Preparación de nanopartículas de TAPC-PLGA

El PLGA adquirido se disolvió en acetona para obtener una solución de 1 mg/ml. A continuación, se añadieron 40 ml de esta solución por goteo a 120 ml de una solución acuosa que contenía 8 mg de TAPC y 10 veces la cantidad molar de PEG-PO, mientras se agitaba continuamente durante 2 h para obtener nanopartículas de TAPC-PLGA. Las nanopartículas se resuspendieron en 10 ml de agua utilizando un tubo de ultrafiltración de 10 kDa.

Preparación y caracterización de TAPC-PLGA@Membrana

Utilizando un microinyector, la solución de TAPC-PLGA y la solución de membrana celular tumoral se exprimieron alternativamente a través de membranas de diferentes tamaños (1000 nm y 400 nm) mediante extrusión física para obtener nanoesferas de TAPC-PLGA@Membrana (TAPC@CNPs). La morfología se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, HT7700) y el tamaño y el potencial zeta se midieron utilizando dispersión dinámica de luz (DLS, NanoZS ZEN3600).

Toxicidad celular

La concentración inhibitoria media (IC50) de TAPC se evaluó en células MC38. Las células se cultivaron en una placa de 96 pocillos durante 24 h, se trataron con TAPC a concentraciones que oscilaban entre 0 y 20 µM durante 24 h a 37 °C en la oscuridad. La viabilidad celular se detectó utilizando un kit de ensayo CCK-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japón). La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas iMark, Bio-RAD, EE. UU.) para determinar la viabilidad celular (viabilidad celular = (ODtre - ODmedio)/(ODcon - ODmedio)), donde ODtre es la absorbancia de las células tratadas a 450 nm, ODcon es la absorbancia de las células de control y ODmedio es la absorbancia del medio de cultivo.

Ensayo de formación de tubos

El ensayo de formación de tubos se realizó utilizando placas ibidi. Se añadió 10 µL de gel de matriz preenfriado a cada pocillo y se dejó solidificar a 37 °C. A continuación, se añadió 50 µL de suspensión celular (10.000 células) a cada pocillo. Después de 6 h de tratamiento con 5-20 µM de TAPC, la formación de tubos se observó bajo un microscopio y se obtuvieron resultados cuantitativos utilizando el software ImageJ.

Ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM)

El sexto día de incubación, los embriones de pollo se agruparon aleatoriamente y se colocaron sobre un banco de trabajo ultra limpio. Bajo la lámpara de iluminación de huevos, se abrió una ventana en el extremo cefálico, se marcó el área 1 cm por debajo del extremo cefálico y se abrió una ventana de aproximadamente 1 cm × 1 cm. Se añadieron unas gotas de solución salina para que la membrana corioalantoidea de los embriones de pollo se hundiera. Se eliminó la membrana blanca de la cámara de aire en la medida de lo posible con unas pinzas, exponiendo la capa inferior de la membrana corioalantoidea. El soporte se colocó en el área relativamente avascular entre los dos vasos sanguíneos principales en la superficie de la CAM y se aspiraron 20 µL de la solución de fármaco de cada grupo en el centro de la superficie del soporte con un aplicador estéril. A continuación, la ventana y el extremo del ventrículo aéreo se sellaron con una cinta adhesiva estéril y se continuó la incubación durante 72 h. Después de 72 h de administración, se fijó y se fotografió la CAM bajo un microscopio.

Cámara de pliegue dérmico dorsal

Se eliminó la piel de un lado de la región dorsal de ratones desnudos y se suturó una lámina de vidrio con un clip de acero inoxidable para fijarla. Esto permitió la observación de los vasos sanguíneos debajo de la piel. Después de una semana de inyección de células tumorales, se inyectó solución de TAPC en la vena de la cola y se observaron los cambios en los vasos sanguíneos a lo largo del tiempo (Olympus-BX51WI).

Ensayo de co-inmunoprecipitación

El TAPC biotinilado y los lisados de células MC38 se co-incubaron durante la noche. El complejo de fulereno-proteína se extrajo utilizando resina recubierta de estreptomicina, se calentó en el tampón de muestra y se sometió a electroforesis en gel SDS-PAGE. Los resultados de la inmunoprecipitación se obtuvieron incubando con los anticuerpos de proteína correspondientes, y el grupo sin TAPC biotinilado se utilizó como control negativo.

Supresión de VEGFR2 mediante ARN de interferencia (ARNi)

La supresión de VEGFR2 se realizó utilizando ARNi. Las células HUVEC se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron con ARNi dirigido a VEGFR2 o ARNi de control no dirigido utilizando Lipofectamina 3000 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, se recogieron las células y se evaluó la expresión de VEGFR2 mediante Western blot para confirmar la eficacia de la supresión. Las células transfectadas se utilizaron posteriormente para los ensayos de formación de tubos y el análisis de proteínas. Secuencia del ARNi:

GUACAUAGUUGUCGUUGUATT,

UACAACGACAACUAUGUACTT.

Ensayo de liberación

El perfil de liberación de TAPC@CNPs se evaluó en condiciones fisiológicas y ácidas. Las nanopartículas de TAPC-Cy5.5@CNPs se suspendieron en tampón fosfato (PBS, pH 7,4) o tampón de acetato (pH 6,0) y se incubaron a temperatura ambiente bajo una agitación suave. En momentos predeterminados, se recogió el sobrenadante. El TAPC-Cy5.5 liberado se cuantificó midiendo la intensidad de la fluorescencia utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de liberación se calculó en relación con la señal de fluorescencia total del TAPC-Cy5.5.

Ensayo de estabilidad de nanopartículas

La estabilidad de TAPC@CNPs se evaluó en condiciones de almacenamiento y en presencia de suero. Para la estabilidad en suero, las nanopartículas de TAPC@CNPs se incubaron en PBS que contenía 10% de suero fetal bovino a 37 °C. Para la estabilidad en el almacenamiento, las nanopartículas se almacenaron a 4 °C. En momentos designados, se midió el tamaño de las nanopartículas y el índice de polidispersidad utilizando dispersión dinámica de luz (NanoZS ZEN3600, Malvern Instruments).

Ensayo de inmunofluorescencia (IF) in vitro

Las células MC38 se trataron con TAPC marcado con Cy5.5 durante 24 h, se fijaron con metanol, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon con una solución de BSA al 5% y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios (1:300), seguida de la incubación con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a temperatura ambiente durante 1 h, y luego se tiñeron con un colorante nuclear. Las imágenes de las proteínas se obtuvieron utilizando un microscopio confocal.

Anticuerpos

Los anticuerpos se enumeran a continuación: Anticuerpo anti-receptor de VEGF 2 [EPRER16Y] (Abcam, Cat: ab134191), Anticuerpo anti-subunidad gamma de la quinasa PI 3 (Abcam, Cat: ab302958), Anticuerpo anti-AKT (fosfo T308) (Abcam, Cat: ab38449), Anticuerpo anti-STAT3 [EPR787Y] (Abcam, Cat: ab68153), ?-Actina (13E5) mAb de conejo (CST, Cat: #4970), Anticuerpo anti-CD31 [EPR17260-263] (Abcam, Cat: ab222783), FITC anti-ratón CD45 (Biolegend, Cat: 103108), PerCP/Cianina 5.5 anti-ratón CD4 (Biolegend, Cat: 100434), Anticuerpo monoclonal FOXP3 (NRRF-30), PE, eBioscience (Thermo, Cat: 12-4771-82), CD3 (Abcam, Cat: ab16669), CD4 (Servicebio, Cat: GB15064).

Western blot

Las células MC38 tratadas con TAPC durante 24 h se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las proteínas recogidas se hirvieron en un tampón de muestra 5× durante 5 min, se separaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y luego se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con leche descremada al 5% durante 1 h, las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a 4 °C, seguida de la incubación con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h. Finalmente, las bandas de proteína se visualizaron utilizando un método de quimioluminiscencia mejorada (ECL, Absin, abs920).

Acoplamiento molecular

La simulación de acoplamiento molecular se realizó utilizando el software Autodock versión 4.2.6.20. Las estructuras de proteínas 3D de VEGFR2 se obtuvieron de la base de datos de estructuras de proteínas de modelado AlphaFold. En el proceso de acoplamiento, la proteína se designó como receptor, mientras que TAPC era el ligando. Se generaron archivos de entrada de acoplamiento y se analizaron los resultados del acoplamiento utilizando el módulo AutoDockTools versión 1.5.620. El mapa de afinidad de unión se calculó utilizando el software AutoGrid. Cada proceso de acoplamiento implicó 100 ensayos de acoplamiento con un mínimo de 150 conformaciones de acoplamiento, inicializadas con posiciones de inicio aleatorias tanto para el receptor como para el ligando. Las conformaciones de acoplamiento resultantes se agruparon utilizando una tolerancia de desviación cuadrática media (RMSD) de 1,5 Å. La pose de unión con la energía de acoplamiento más baja del clúster más grande se seleccionó para un análisis posterior.

Ensayo de interferometría de capa superficial (BLI)

Se realizó el ensayo BLI utilizando un instrumento Octet RED96e. Se acopló la proteína VEGFR2 marcada con His, y la concentración de la molécula pequeña se estableció en 8,8-100 µM en una solución PBS que contenía 0,1% de BSA y 0,02% de Tween-20. Primero, el biosensor se equilibró en la solución tampón y, a continuación, la proteína se unió a la superficie del biosensor para aumentar el grosor de la capa de membrana superficial. Posteriormente, el biosensor se sumergió en la solución de la muestra de prueba, y se realizó un monitoreo en tiempo real del grosor de la capa de membrana biológica para obtener las constantes cinéticas de la muestra de prueba.

Ensayo con el analizador de flujo extracelular Seahorse

Las células MC38 se incubaron en microplacas de cultivo celular Seahorse XFe96 (Agilent) a una densidad de 8 × 103 durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron diferentes reactivos para los diferentes ensayos correspondientes. Los valores correspondientes se detectaron utilizando el analizador Seahorse XFe96 (Agilent). Para el ensayo de ECAR, se añadieron secuencialmente 25 µL de glucosa (Sigma, G7528), 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina (Abcam, ab141829) y 25 µL de 2-desoxiglucosa (2-DG, Sigma, D8375). Para el ensayo de OCR, se añadieron secuencialmente 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina, 25 µL de 1 µmol/L de mesoxalonitrilo 4-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP, Sigma, C2920) y 25 µL de antimicina A (Abcam, ab141904)/rotenona (Sigma, R8875). Para el ensayo de la tasa de ATP en tiempo real, las células se trataron secuencialmente con 25 µL de 1,5 µmol/L de oligomicina y 25 µL de antimicina A/rotenona.

Experimento in vivo

El modelo animal se estableció utilizando ratones hembra Balb/c de 6 semanas y C57BL/6 adquiridos del Centro de Animales de Experimentación de la Universidad de Pekín. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Química de la Academia China de Ciencias (el número de aprobación es SYXK (Jing) 2018-0033). Los ratones se alojaron en condiciones controladas de aproximadamente 50% de humedad, 25 °C de temperatura y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se implantaron tumores MC38 de forma subcutánea y, a continuación, se inyectaron por vía intravenosa a los ratones 100 µL de solución salina, PEG-PO (5 mM), TAPC recubierto con PEG-PO (0,5 mM), CNP o TAPC@CNP (0,5 mM de TAPC equivalente) para un total de 5 inyecciones con un intervalo de 2 días. El tamaño de los tumores subcutáneos se controló cada 2 días utilizando un calibrador durante 2 semanas. El volumen tumoral se calculó utilizando la fórmula: Volumen tumoral (mm3) = 1/2 × (longitud × anchura × anchura).

Imagen de fluorescencia ex vivo

TAPC-Cy5.5@CNP y Cy5.5 libre se inyectaron por vía intravenosa en ratones con tumores a una dosis de 100 µg/kg de Cy5.5. Después de 24, 48 horas, 4 y 7 días, se recogieron los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tumor) y se visualizaron utilizando el sistema IVIS Spectrum.

Citometría de flujo (FCM)

Se prepararon suspensiones de células simples a partir del tumor, el timo, el bazo y los ganglios linfáticos de los ratones y se incubaron con los siguientes anticuerpos: F4/80 (Biolegend, 123109), FITC anti-ratón CD45 (Biolegend, 103108), PE/Cyanina7 anti-ratón CD3 (Biolegend, 100220), PerCP/Cyanina5.5 anti-ratón CD4 (Biolegend, 100434), anticuerpo monoclonal PE Foxp3 (eBioscience, 12-4771-82). Para la tinción intracelular, las células se fijaron y permeabilizaron antes de la tinción con anticuerpos contra Foxp3 o interferón gamma (IFNγ).

Ensayo de inmunofluorescencia in vivo

Después de retirar los tumores del ratón, se limpiaron con solución salina, se incluyeron en OCT y se cortaron en secciones de 4 µm de grosor, que se dejaron a temperatura ambiente y luego se lavaron con TBS. A continuación, se sumergieron en PBST que contenía 5% de leche descremada en polvo para bloquear los sitios de unión inespecíficos. Después de lavar con TBST, se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente anti-CD4 (Servicebio, GB15064) y anti-CD3 (Abcam, ab16669) a 4 °C durante la noche, protegidos de la luz. A continuación, se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente. Por último, las láminas se bloquearon con un agente anti-fluorescencia que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI, para etiquetar los núcleos) y se cubrieron con un cubreobjetos. A continuación, se visualizaron las muestras con un escáner confocal láser. La fluorescencia media se cuantificó utilizando Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, EE. UU.).

Análisis de la expresión génica y la supervivencia

Los análisis de datos transcriptómicos y de supervivencia se realizaron utilizando bases de datos de acceso público. La expresión diferencial del gen VEGFR2 entre el tumor de colon y los tejidos normales se obtuvo de la plataforma TNMplot (https://tnmplot.com), que integra perfiles basados en chips de genes y basados en RNA-seq de los conjuntos de datos TCGA, GTEx y GEO. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando el Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com) para el cáncer de colon, con la supervivencia general estratificada por los niveles de expresión de VEGFR2. Los datos de secuenciación de ARN de una sola célula se analizaron a través del Single Cell Portal (https://singlecell.broadinstitute.org), específicamente utilizando el conjunto de datos "Unidades funcionales multicelulares espacialmente definidas en el cáncer de colon". La expresión específica del tipo celular de VEGFR2 se visualizó mediante la proyección UMAP, los gráficos de características y los gráficos de violín.

Análisis estadístico

La significación estadística entre dos grupos se determinó utilizando una prueba t de Student de dos colas. La comparación entre múltiples grupos se realizó utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey. Los cálculos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Se consideró significativo un valor de P inferior a 0,05.

Resultados

Los derivados de fulerenos aminados exhiben actividad antiangiogénica

Para explorar las relaciones estructura-actividad en la antiangiogénesis, sintetizamos una serie de derivados de fulerenos aminados, que incluyen MBAMF, MBAMF-2, NDMPFI, TAPC, TAFE, TAEPFE, TIFE, THFE y TPFE. Estos derivados variaron en el número de sustituciones, el carácter donador de electrones, la hidrofilicidad y la simetría molecular. Todos los compuestos se sintetizaron mediante una adición nucleófila escalable, lo que produjo cantidades a escala de gramos con alta pureza (Fig. S1). El cribado fenotípico utilizando un ensayo de formación de tubos de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) reveló que los fulerenos aminados interrumpieron de forma dependiente de la dosis la formación de la red, reduciendo la longitud total de las ramas y las estructuras tubulares (Fig. 1a y b y S2). Entre los compuestos probados, TAPC exhibió el efecto inhibidor más fuerte y redujo significativamente la longitud total del tubo en comparación con otros derivados (Fig. 1c y d). Un análisis adicional en condiciones de ensayo optimizadas confirmó la inhibición dependiente de la dosis de la formación de la red endotelial por parte de TAPC (Fig. S3).

Para evaluar la actividad antiangiogénica in vivo, utilizamos el ensayo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo (CAM), donde TAPC (20 µL aplicado a una región definida) indujo una respuesta antiangiogénica dependiente de la dosis después de 72 horas, caracterizada por una reducción de la densidad y el diámetro de los vasos, así como la inhibición de la neovascularización (Fig. 1e y f). A concentraciones más altas, la inhibición vascular fue comparable al anticuerpo anti-VEGF aprobado clínicamente, bevacizumab, utilizado como control positivo, lo que validó su capacidad para inhibir la neovascularización (Fig. 1e y f). Para evaluar aún más su actividad in vivo y contra la vasculatura establecida, utilizamos un modelo de ventana de la piel dorsal (DSWC) en ratones Balb/c desnudos implantados con células de cáncer de mama 4T1. La administración intravenosa de TAPC (1 mM, formulado con PEG-PO para la estabilidad) indujo la ruptura de los microvasos y la hemorragia localizada en unas pocas horas después del tratamiento (Fig. 1g y S4), lo que indica la desestabilización de la vasculatura tumoral establecida. Estas observaciones demuestran que TAPC afecta a las estructuras vasculares asociadas al tumor in vivo.

En conjunto, estos resultados identifican a TAPC como el compuesto antiangiogénico más potente entre los derivados de fulerenos aminados probados y demuestran su capacidad para inhibir la formación de la red endotelial y alterar la vasculatura asociada al tumor en múltiples modelos experimentales.

VEGFR2 es un impulsor angiogénico clave y un objetivo clínicamente relevante en el cáncer colorrectal

Dado que TAPC tiene una potente actividad antiangiogénica, planteamos la hipótesis de que su acción se produce a través de un regulador angiogénico clave. Entre los mediadores conocidos de la angiogénesis tumoral, VEGFR2 (KDR) destaca como la principal tirosina quinasa receptora que se expresa predominantemente en las células endoteliales, y que actúa como el principal impulsor del crecimiento vascular inducido por VEGF-A, la supervivencia endotelial y la permeabilidad [^[38]]. Más allá de la angiogénesis clásica, VEGFR2 contribuye a los procesos intrínsecos de las células tumorales, como la mímica vascular (estructuras similares a vasos derivadas de las células tumorales), la progresión metastásica y la resistencia a la terapia antitumoral (AAT), lo que lo convierte en un objetivo mecanístico atractivo [^[9], ^[39]]. Seleccionamos el cáncer colorrectal (CRC) porque depende fundamentalmente de la angiogénesis para el crecimiento y la metástasis, y VEGF-A/VEGFR-2 es el eje de señalización dominante en la angiogénesis del CRC [^[40]]. Además, se ha demostrado que VEGFR-2 media la diferenciación similar a la endotelial de las células de CRC y se asocia estrechamente con malos resultados clínicos [^[41]].

La alta expresión de VEGFR2 se asoció con una supervivencia general significativamente peor en los pacientes con CRC (Fig. 2a). De manera consistente, la expresión de VEGFR2 fue notablemente mayor en los tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes (Fig. 2b). Estos hallazgos subrayan la importancia clínica y pronóstica de VEGFR2 en el CRC. La secuenciación de ARN de una sola célula de más de 900.000 células de tejidos humanos de CRC mostró que la expresión de VEGFR2 estaba muy restringida a las células endoteliales vasculares, con una expresión insignificante en los compartimentos epitelial, estromal o inmunitario (Fig. 2c y d). El análisis de correlación confirmó la alineación con los marcadores angiogénicos (VEGFA, CD34, PECAM1), lo que refuerza su papel como un regulador central de la vascularización tumoral (Fig. S5). Estos hallazgos establecen a VEGFR2 como un objetivo clínicamente viable, altamente expresado y específico de las células endoteliales en el CRC, lo que proporciona una sólida base para investigar su papel en la mediación de los efectos de TAPC.

TAPC interactúa con VEGFR2 y modula la señalización descendente

Dado que tiene una alta expresión y una asociación clínica en el CRC, examinamos a continuación el papel biológico de VEGFR2 en la angiogénesis tumoral y su potencial como objetivo terapéutico. La vía VEGF-A/VEGFR2 es un impulsor central de la vascularización tumoral. VEGFR2, que se expresa en las células endoteliales y en las células tumorales, promueve la angiogénesis, la tumorigénesis y la metástasis [[^[42]], [^[43]], [^[44]]]. La mímica vascular, que se observa en el CRC, el glioblastoma y el cáncer de pulmón, proporciona un suministro de sangre alternativo, que actúa como un mecanismo de resistencia a la terapia antitumoral [[^[45]], [^[46]], [^[47]], [^[48]]]. El VEGF-A derivado del tumor activa la señalización de VEGFR2 (PI3K-AKT, MAPK), lo que impulsa la proliferación, la migración y la permeabilidad de las células endoteliales para apoyar la formación de nuevos vasos, mientras que el bloqueo de VEGFR2 interrumpe la vascularización y restringe la progresión tumoral [^[49]].

A continuación, se evaluó el impacto de TAPC en la señalización de VEGFR2 utilizando células de carcinoma de colon murino MC38, un modelo vascularizado e inmuno-"frío". TAPC inhibió el crecimiento de las células MC38 con una concentración inhibitoria media (IC50) de 21,96 µM (Fig. 3a) y redujo la expresión de VEGFR2 de forma dependiente de la dosis (Fig. 3b). De manera consistente, la reducción de la fosforilación de VEGFR2 en HUVECs confirmó la interrupción tanto de la expresión como de la activación del receptor (Fig. S6). Esta interferencia con el eje VEGF-A/VEGFR2 atenuó la señalización PI3K-AKT-STAT3 aguas abajo, lo que condujo a la supresión de las vías proliferativas y proangiogénicas (Fig. 3b). Para evaluar si la modulación de VEGFR2 depende de características estructurales específicas, comparamos TAPC con un derivado estructuralmente relacionado, tetra[4-(carboxilo)piperidin-1-il]C60 epóxido (TCPC) [^[30]], en el que los sustituyentes aminados se reemplazaron por grupos carboxilados (Fig. S7a). A diferencia de TAPC, TCPC no redujo la expresión de VEGFR2 en condiciones idénticas (Fig. S7b), lo que indica que la reducción de VEGFR2 puede ser específica de la estructura aminada de TAPC en lugar de ser una propiedad general de los derivados de fulerenos. El enlace directo de TAPC a VEGFR2 se confirmó además mediante un ensayo de "pull-down" utilizando TAPC biotinilado en lisados de MC38 (Fig. 3c) y mediante imágenes de confocal, que mostraron la colocalización intracelular de TAPC marcado con Cy5.5 con VEGFR2 (Fig. 3d y S8). Para cuantificar esta interacción, empleamos BLI, una técnica en tiempo real y sin etiquetas que mide la interacción molecular a través de cambios en el grosor óptico en la superficie de un biosensor. Se inmovilizó VEGFR2 recombinante en la superficie del sensor y se registraron las cinéticas de asociación/disociación tras la exposición a TAPC. El análisis de BLI reveló una constante de disociación (Kd) de 11,4 µM, lo que indica una afinidad de enlace moderada pero específica entre TAPC y VEGFR2 (Fig. 3e). Aunque el análisis de BLI mostró una afinidad de enlace micromolar entre TAPC y VEGFR2, esta medición refleja una interacción proteína-ligando simplificada [^[50]]. En la formulación de nanopartículas, la presentación a nanoescala de TAPC puede permitir interacciones multivalentes y un enriquecimiento local, lo que podría mejorar el compromiso funcional. Además, las simulaciones de dinámica molecular que comparan TAPC con otros derivados de fulerenos (NDMPFI, MBAMF, TPFE) revelaron además que TAPC formó el complejo VEGFR2 más estable a través de interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno (Fig. 3f y S9). El acoplamiento molecular indicó que TAPC ocupa el bolsillo de unión a ATP de VEGFR2 y forma múltiples interacciones estabilizadoras con residuos en el dominio de la quinasa (Fig. 3f y S10). Esta ubicación de enlace se superpone con el sitio de unión a ATP al que se dirigen los inhibidores de VEGFR2 de moléculas pequeñas [^[51]]. Los cálculos de la energía de enlace respaldaron estos hallazgos, y TAPC mostró la energía libre más baja (67,5 kcal/mol), impulsada principalmente por las fuerzas de van der Waals (Fig. 3g). Además, el análisis de acoplamiento comparativo en múltiples quinasas receptoras de tirosina, incluidas VEGFR1, VEGFR3, PDGFR, FGFR1 y EGFR, mostró la mayor energía de enlace predicha para VEGFR2 (Tabla S1), lo que respalda la interacción preferencial con VEGFR2.

Para evaluar la relevancia funcional del compromiso de VEGFR2, realizamos la inhibición de la expresión de VEGFR2 mediante ARN de interferencia (ARNi) en HUVECs y evaluamos la formación de tubos endoteliales. El análisis de inmunoblotaje confirmó la reducción eficiente de la expresión de VEGFR2 tras el tratamiento con ARNi de VEGFR2 (Fig. S11a). En las HUVECs no tratadas, TAPC inhibió marcadamente la formación de tubos, reduciendo la longitud total del tubo en más del 60% en comparación con el grupo de control (Fig. S11b-c). Por el contrario, las HUVECs con la expresión de VEGFR2 inhibida por ARNi aún formaron redes tubulares; sin embargo, en condiciones de deficiencia de VEGFR2, TAPC produjo solo una ligera inhibición, disminuyendo la longitud total del tubo en menos del 10% en relación con los controles con la expresión de VEGFR2 inhibida por ARNi (Fig. S11b-c). Estos resultados indican que la inhibición de la formación de tubos endoteliales mediada por TAPC depende en gran medida de la expresión de VEGFR2.

Más allá de la angiogénesis, la señalización de VEGFR2 también regula el metabolismo tumoral, mejorando la glucólisis a través de los transportadores de glucosa y la regulación al alza de las enzimas. El análisis del flujo extracelular en células MC38 mostró que TAPC disminuyó de forma dependiente de la dosis la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva, lo que sugiere un metabolismo de la glucosa alterado (Fig. 3h e i). Si bien el mecanismo preciso aún debe aclararse, estos resultados sugieren que TAPC interrumpe la reprogramación metabólica impulsada por VEGFR2, además de sus efectos antiangiogénicos. Esta inhibición dual del soporte vascular y metabólico subraya la eficacia antitumoral de TAPC, posiblemente a través del direccionamiento directo de VEGFR2 y la supresión de la señalización PI3K-AKT.

TAPC@CNPs exhiben una mayor estabilidad y captación celular

Dado que se observó la interacción de TAPC con VEGFR2 y su actividad antiangiogénica, desarrollamos a continuación una formulación de nanopartículas para mejorar la administración y las propiedades farmacocinéticas. Los inhibidores de VEGFR2 de moléculas pequeñas a menudo exhiben una biodisponibilidad limitada y una exposición tumoral subóptima, lo que puede reducir la eficacia terapéutica [^[52]]. Los fulerenos aminados enfrentan desafíos farmacocinéticos adicionales, ya que su fuerte carga positiva promueve la unión inespecífica a las proteínas plasmáticas y la eliminación sistémica rápida, lo que limita el beneficio terapéutico [^[53]]. Para abordar estas limitaciones, diseñamos nanopartículas recubiertas con membrana de células tumorales (TAPC@CNPs), que comprenden un núcleo de PLGA cargado con TAPC que proporciona estabilidad estructural y liberación controlada, recubierto con membranas celulares tumorales MC38 homólogas (Fig. 4a). Se utilizaron nanopartículas recubiertas con membrana sin TAPC (CNPs) como controles.

TAPC@CNPs formaron una suspensión transparente y estable en solución acuosa y conservaron el color característico de TAPC (Fig. 4b). La microscopía electrónica de transmisión (MET) reveló estructuras de nanopartículas bien definidas con una morfología consistente con nanopartículas recubiertas con membrana (Fig. 4c y S12). Las mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) mostraron un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 106 nm, consistente con las observaciones de MET (Fig. 4c y d). TAPC@CNPs mostraron un cambio en el potencial zeta a -18 mV, lo que indica una inversión de la carga superficial por el recubrimiento de la membrana y posiblemente reduce la unión inespecífica a las proteínas plasmáticas (Fig. 4e). Además, la eficiencia del recubrimiento de la membrana se cuantificó utilizando un ensayo de ácido bicinquinónico (BCA). La proteína asociada a la membrana en TAPC@CNPs se midió después de la eliminación de los componentes de la membrana no unidos, lo que arrojó una eficiencia de recubrimiento de aproximadamente el 65,8%, lo que confirmó la incorporación efectiva de la membrana en la superficie de la nanopartícula. Para verificar aún más el recubrimiento de la membrana, el análisis de SDS-PAGE mostró patrones de bandas de proteínas en TAPC@CNPs consistentes con los observados en las membranas celulares MC38 aisladas, lo que confirmó la presencia de proteínas derivadas de la membrana en la superficie de la nanopartícula (Fig. 4f). La estabilidad físico-química se evaluó mediante el seguimiento del tamaño de las partículas en condiciones de almacenamiento y que contienen suero. TAPC@CNPs mantuvieron un tamaño hidrodinámico estable durante períodos de almacenamiento prolongados y durante la incubación en medios que contienen suero, lo que indica estabilidad en condiciones de almacenamiento y fisiológicas (Fig. 4g y h). A continuación, examinamos la captación celular de TAPC@CNPs. La microscopía confocal mostró que TAPC@CNPs marcadas con Cy5.5 se localizaron dentro de las células MC38 después de la incubación (Fig. 4i). Un análisis de colocalización adicional reveló una superposición parcial de la fluorescencia de Cy5.5 con los marcadores lisosomales, lo que indica que una fracción de las TAPC@CNPs internalizadas se transportó a través del compartimento lisosomal (Fig. S13). Un análisis cuantitativo mediante citometría de flujo demostró además una mayor captación celular de TAPC@CNPs marcadas con DiO en comparación con las nanopartículas de control después de 6 horas de incubación, posiblemente debido al direccionamiento mediado por la membrana celular tumoral homóloga (Fig. 4j).

Para evaluar la cinética de liberación de TAPC@CNPs, se realizaron estudios de liberación en diferentes condiciones de pH que imitan los entornos fisiológicos y asociados con tumores. TAPC@CNPs exhibieron un comportamiento de liberación sensible al pH. La liberación de TAPC fue relativamente gradual, alcanzando aproximadamente el 30% de liberación a las 48 horas en condiciones fisiológicas (pH 7,4). Por el contrario, en condiciones ácidas (pH 6,0), la liberación de TAPC se aceleró significativamente, con aproximadamente el 50% de liberación observada a las 24 horas y una liberación continua a partir de entonces, lo que indica un comportamiento de liberación controlada (Fig. 4k).

Para evaluar si la nanoformulación afecta la actividad de TAPC, examinamos la expresión de VEGFR2 y la formación de tubos endoteliales después del tratamiento con TAPC-PLGA y TAPC@CNPs. El análisis de inmunoblotaje mostró que ambas formulaciones redujeron la expresión de VEGFR2 en comparación con los controles (Fig. S14a). De manera consistente, los ensayos de formación de tubos demostraron que TAPC-PLGA y TAPC@CNPs redujeron significativamente la formación de redes endoteliales y la longitud total del tubo (Fig. S14b-c). Estos resultados indican que TAPC conserva su actividad inhibidora de VEGFR2 y antiangiogénica después de la formulación de nanopartículas.

En conjunto, estos resultados demuestran la fabricación exitosa de TAPC@CNPs recubiertas con membrana con propiedades físico-químicas estables, proteínas asociadas a la membrana conservadas, mayor captación celular y circulación sostenida, lo que respalda su idoneidad como formulación de nanopartículas para la administración in vivo.

TAPC@CNPs inhiben el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo

Después de demostrar una mejor administración y captación celular de TAPC@CNPs in vitro, evaluamos a continuación su eficacia terapéutica in vivo utilizando modelos de tumores MC38 subcutáneos. En ratones Balb/c que presentaban tumores establecidos (100 mm3), los animales se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (control de PBS, PEG-PO, CNPs, TAPC con PEG-PO y TAPC@CNPs) y se trataron por vía intravenosa cada dos días (Fig. 5a). Durante todo el período de tratamiento, el peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos, lo que indica una buena tolerabilidad de las formulaciones (Fig. 5b). El crecimiento tumoral se inhibió progresivamente en el grupo tratado con TAPC@CNP, como se demuestra en las curvas de crecimiento tumoral y las fotografías representativas de los tumores extirpados (Fig. 5c y d). Coherente con estas observaciones, los pesos tumorales al final del estudio fueron significativamente menores, y TAPC@CNPs lograron una reducción del 60,8% en comparación con el 34,3% de TAPC libre y el 27,7% de CNPs, lo que confirmó la mayor eficacia terapéutica de la formulación de nanopartículas (Fig. 5e). Para validar la eficacia terapéutica en un entorno sinérgico inmunocompetente, también se establecieron tumores MC38 en ratones C57BL/6. El tratamiento con TAPC@CNP también resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (67,0%) en comparación con los grupos de control (Fig. S15), lo que confirmó que los efectos antitumorales observados fueron reproducibles en un modelo tumoral completamente sinérgico.

Para investigar los cambios moleculares asociados con el tratamiento, se analizaron los tejidos tumorales. El análisis de inmunoblotaje mostró una reducción de la expresión de VEGFR2 en los lisados tumorales después del tratamiento con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. 5f). De manera consistente, el tinte inmunohistoquímico (IHQ) y el tinte IF para CD31, un marcador endotelial ampliamente utilizado para evaluar la densidad de los microvasos, reveló una reducción del tinte positivo para CD31 en los tumores de los ratones tratados con TAPC@CNP, lo que indica una reducción de la densidad vascular tumoral (Fig. 5g y S16). Para evaluar la biocompatibilidad y la posible toxicidad, el tinte con hematoxilina y eosina (H&E) no mostró ninguna anomalía patológica en los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón), mientras que las secciones tumorales mostraron una densidad celular reducida y características necróticas consistentes con la regresión tumoral (Fig. 5h). Además, el análisis de sangre mostró una mayor frecuencia de linfocitos circulantes en los ratones tratados con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. S17). Para evaluar aún más la toxicidad sistémica, se midieron los marcadores bioquímicos séricos de la función hepática. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) fueron comparables entre los ratones tratados con TAPC@CNP y los grupos de control (Fig. 5i), lo que indica una función hepática preservada después del tratamiento.

En conjunto, estos resultados demuestran que el tratamiento con TAPC@CNP inhibe significativamente el crecimiento tumoral tanto en los modelos tumorales Balb/c como C57BL/6, acompañado de una reducción de la vascularización tumoral y perfiles de seguridad favorables in vivo.### Los TAPC@CNP exhiben acumulación tumoral y activan la inmunidad antitumoral

Para evaluar el comportamiento de la distribución in vivo de los TAPC@CNP, primero realizamos un análisis de biodistribución en ratones portadores de tumores MC38 utilizando nanopartículas marcadas con Cy5.5. La imagen de fluorescencia ex vivo de los principales órganos y tumores en múltiples puntos temporales tras la administración intravenosa reveló señales de fluorescencia detectables tanto en los órganos reticuloendoteliales como en los tejidos tumorales (Fig. 6a). En los primeros puntos temporales, la fluorescencia fue prominente en el bazo, lo que concuerda con la captación de nanopartículas por los tejidos asociados al sistema fagocítico mononuclear. Con el tiempo, la intensidad de la fluorescencia esplénica disminuyó gradualmente, lo que indica la eliminación progresiva de la señal asociada a las nanopartículas (Fig. 6a y b y S18). En paralelo, la fluorescencia asociada al tumor fue detectable en múltiples puntos temporales, y el análisis cuantitativo confirmó una intensidad de fluorescencia medible dentro de los tejidos tumorales (Fig. 6a y c). Estas observaciones indican la distribución sistémica de los TAPC@CNP y la señal asociada a las nanopartículas detectable en el tejido tumoral.

Para caracterizar aún más el comportamiento circulatorio de los TAPC@CNP, realizamos un análisis farmacocinético midiendo la intensidad de la fluorescencia sérica en puntos temporales definidos tras la administración intravenosa. El perfil de disminución de la fluorescencia se ajustó bien a un modelo de decaimiento exponencial de una fase, lo que arrojó una vida media de circulación estimada de aproximadamente 13,1 h (Fig. 6d). Este resultado indica una presencia sistémica sostenida de la formulación de nanopartículas durante el tiempo analizado.

Dado que se detectó una señal asociada al tumor, investigamos a continuación si los TAPC@CNP se asociaban con cambios en las poblaciones de células inmunitarias. Primero analizamos los órganos linfoides para evaluar posibles alteraciones inmunitarias sistémicas. La citometría de flujo de los órganos linfoides (bazo, timo, ganglios linfáticos que drenan el tumor) reveló que los TAPC@CNP redujeron las Tregs CD4+Foxp3+ en los ganglios linfáticos, una población conocida por suprimir las células T efectoras y promover la evasión inmunitaria (Fig. 7a y b y S19). Esta reducción sugiere un alivio de la inmunosupresión. En paralelo, los TAPC@CNP causaron un aumento del 20% en las células T CD4+ en el bazo y un aumento del 7% en el timo, lo que indica una activación citotóxica sistémica (Fig. 7c y S20). Estos análisis establecen la distribución basal de los subconjuntos de células T CD4+ en los tejidos linfoides. A continuación, examinamos la presencia de células inmunitarias dentro del microambiente tumoral. El análisis de inmunofluorescencia de las secciones tumorales mostró células T CD3+ y CD4+ localizadas dentro de los tejidos tumorales en los diferentes grupos de tratamiento, lo que confirmó la presencia de poblaciones de células T dentro del microambiente tumoral (Fig. 7d). Estos hallazgos demuestran que las poblaciones de linfocitos están presentes dentro de los tumores tras el tratamiento.

Para caracterizar aún más las poblaciones inmunitarias infiltrantes tumorales, realizamos análisis adicionales de citometría de flujo de los tejidos tumorales disociados. La cuantificación de las células T CD8+ reveló diferencias en los niveles de células T CD8+ entre los grupos de tratamiento (Fig. 7e y S21a-b). Además de las poblaciones linfoides, evaluamos las células mieloides cuantificando la expresión de CD206 en las células CD45+CD11b+, lo que reveló una reducción de la expresión de CD206 en las células mieloides CD45+CD11b+ en los tumores tras el tratamiento con TAPC@CNP (Fig. 7f y S21c-d). Estos análisis establecen la distribución de los subconjuntos de células inmunitarias linfoides y mieloides dentro de los tumores.

Finalmente, para evaluar aún más las características asociadas a la activación de las células T CD8+ infiltrantes tumorales, medimos la expresión de CD69, un marcador de activación temprana, y el interferón gamma intracelular (IFNγ), una citocina asociada con la función efectora de las células T citotóxicas. El análisis de citometría de flujo reveló un aumento significativo de la expresión de CD69 en las células T CD8+ tras el tratamiento con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. 7g y S21e-f). El tinte intracelular demostró además un aumento significativo de la expresión de IFNγ en las células T CD8+ infiltrantes tumorales tras el tratamiento con TAPC@CNP (Fig. 7h e i), lo que indica un aumento de los niveles de células T CD8+ que expresan marcadores asociados a la activación y la función efectora.

En conjunto, estos resultados demuestran la distribución de nanopartículas asociadas al tumor y la circulación sistémica sostenida, acompañadas de una reducción de los niveles de células T reguladoras CD4+Foxp3+, poblaciones de células T CD4+ alteradas, una reducción de la expresión de CD206 en las células mieloides CD45+CD11b+ y un aumento de la infiltración y la expresión de marcadores asociados a la activación en las células T CD8+, lo que indica colectivamente la activación de las respuestas inmunitarias antitumorales tras el tratamiento con TAPC@CNP.

Los derivados de fulerenos aminados exhiben actividad antiangiogénica

Para explorar las relaciones estructura-actividad en la antiangiogénesis, sintetizamos una serie de derivados de fulerenos aminados, incluidos MBAMF, MBAMF-2, NDMPFI, TAPC, TAFE, TAEPFE, TIFE, THFE y TPFE. Estos derivados variaron en el número de sustituciones, el carácter donador de electrones, la hidrofilicidad y la simetría molecular. Todos los compuestos se sintetizaron mediante una adición nucleófila escalable, lo que arrojó cantidades a escala de gramos con alta pureza (Fig. S1). El cribado fenotípico utilizando un ensayo de formación de tubos de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) reveló que los fulerenos aminados interrumpieron de forma dependiente de la dosis la formación de la red, lo que redujo la longitud total de las ramas y las estructuras tubulares (Fig. 1a y b y S2). Entre los compuestos probados, TAPC exhibió el efecto inhibidor más fuerte y redujo significativamente la longitud total del tubo en comparación con otros derivados (Fig. 1c y d). Un análisis adicional en condiciones de ensayo optimizadas confirmó la inhibición dependiente de la dosis de la formación de la red endotelial por parte de TAPC (Fig. S3).

Para evaluar la actividad antiangiogénica in vivo, utilizamos el ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM) de pollo, donde TAPC (20 µL aplicado a una región definida) indujo una respuesta antiangiogénica dependiente de la dosis después de 72 h, caracterizada por una reducción de la densidad y el diámetro de los vasos, así como la inhibición de la neovascularización (Fig. 1e y f). En concentraciones más altas, la inhibición vascular fue comparable al anticuerpo anti-VEGF aprobado clínicamente, bevacizumab, utilizado como control positivo, lo que validó su capacidad para inhibir la neovascularización (Fig. 1e y f). Para evaluar aún más su actividad in vivo y contra la vasculatura establecida, utilizamos un modelo de ventana de la piel dorsal (DSWC) en ratones desnudos Balb/c implantados con células de cáncer de mama 4T1. La administración intravenosa de TAPC (1 mM, formulado con PEG-PO para la estabilidad) indujo la ruptura de los microvasos y la hemorragia localizada en unas pocas horas después del tratamiento (Fig. 1g y S4), lo que indica la desestabilización de la vasculatura tumoral establecida. Estas observaciones demuestran que TAPC afecta a las estructuras vasculares asociadas al tumor in vivo.

En conjunto, estos resultados identifican a TAPC como el compuesto antiangiogénico más potente entre los derivados de fulerenos aminados probados y demuestran su capacidad para inhibir la formación de la red endotelial y alterar la vasculatura asociada al tumor en múltiples modelos experimentales.

VEGFR2 es un impulsor angiogénico clave y un objetivo clínicamente relevante en el cáncer colorrectal

Dada la potente actividad antiangiogénica de TAPC, planteamos la hipótesis de que su acción se produce a través de un regulador angiogénico clave. Entre los mediadores conocidos de la angiogénesis tumoral, VEGFR2 (KDR) destaca como la principal tirosina quinasa receptora que se expresa predominantemente en las células endoteliales, y que actúa como el principal impulsor del crecimiento vascular inducido por VEGF-A, la supervivencia endotelial y la permeabilidad [^[38]]. Más allá de la angiogénesis clásica, VEGFR2 contribuye a los procesos intrínsecos de las células tumorales, como la mímica vascular (estructuras similares a vasos derivadas de las células tumorales), la progresión metastásica y la resistencia a la AAT, lo que lo convierte en un objetivo mecanístico atractivo [^[9], ^[39]]. Seleccionamos el cáncer colorrectal (CRC) porque depende fundamentalmente de la angiogénesis para el crecimiento y la metástasis, siendo VEGF-A/VEGFR-2 el eje de señalización dominante en la angiogénesis del CRC [^[40]]. Además, se ha demostrado que VEGFR-2 media la diferenciación similar a la endotelial de las células de CRC y se asocia estrechamente con malos resultados clínicos [^[41]].

La alta expresión de VEGFR2 se asoció con una peor supervivencia general en los pacientes con CRC (Fig. 2a). De manera consistente, la expresión de VEGFR2 fue notablemente elevada en los tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes (Fig. 2b). Estos hallazgos subrayan la importancia clínica y pronóstica de VEGFR2 en el CRC. El secuenciamiento de ARN de una sola célula de >900 000 células de tejidos de CRC humanos mostró que la expresión de VEGFR2 se restringió en gran medida a las células endoteliales vasculares, con una expresión insignificante en los compartimentos epitelial, estromal o inmunitario (Fig. 2c y d). El análisis de correlación confirmó la alineación con los marcadores angiogénicos (VEGFA, CD34, PECAM1), lo que refuerza su papel como un regulador central de la vascularización tumoral (Fig. S5). Estos hallazgos establecen a VEGFR2 como un objetivo clínicamente accionable altamente expresado y específico de las células endoteliales en el CRC, lo que proporciona una sólida base para investigar su papel en la mediación de los efectos de TAPC.

TAPC interactúa con VEGFR2 y modula la señalización descendente

Dada su alta expresión y asociación clínica en el CRC, examinamos a continuación el papel biológico de VEGFR2 en la angiogénesis tumoral y su posible valor como objetivo terapéutico. La vía VEGF-A/VEGFR2 es un impulsor central de la vascularización tumoral. VEGFR2, expresado en las células endoteliales y también en las células tumorales, promueve la angiogénesis, la tumorigénesis y la metástasis [[^[42]], [^[43]], [^[44]]]. La mímica vascular, que se observa en el CRC, el glioblastoma y el cáncer de pulmón, proporciona un suministro de sangre alternativo, lo que sirve como mecanismo de resistencia a la AAT [[^[45]], [^[46]], [^[47]], [^[48]]]. El VEGF-A derivado del tumor activa la señalización de VEGFR2 (PI3K-AKT, MAPK), lo que impulsa la proliferación, la migración y la permeabilidad de las células endoteliales para favorecer la formación de nuevos vasos, mientras que el bloqueo de VEGFR2 interrumpe la vascularización y restringe la progresión tumoral [^[49]].

A continuación, se evaluó el impacto de TAPC en la señalización de VEGFR2 utilizando células de carcinoma de colon murino MC38, un modelo vascularizado e inmuno-"frío". TAPC inhibió el crecimiento de las células MC38 con una concentración inhibitoria media (IC50) de 21,96 µM (Fig. 3a) y redujo la expresión de VEGFR2 de forma dependiente de la dosis (Fig. 3b). De manera consistente, la reducción de la fosforilación de VEGFR2 en HUVECs confirmó la interrupción tanto de la expresión como de la activación del receptor (Fig. S6). Esta interferencia con el eje VEGF-A/VEGFR2 atenuó la señalización PI3K-AKT-STAT3 aguas abajo, lo que condujo a la supresión de las vías proliferativas y proangiogénicas (Fig. 3b). Para evaluar si la modulación de VEGFR2 depende de características estructurales específicas, comparamos TAPC con un derivado estructuralmente relacionado, tetra[4-(carboxilo)piperidin-1-il]C60 epóxido (TCPC) [^[30]], en el que los sustituyentes aminados se reemplazaron por grupos carboxilados (Fig. S7a). A diferencia de TAPC, TCPC no redujo la expresión de VEGFR2 en condiciones idénticas (Fig. S7b), lo que indica que la reducción de VEGFR2 puede ser específica de la estructura aminada de TAPC en lugar de ser una propiedad general de los derivados de fulerenos. El enlace directo de TAPC a VEGFR2 se confirmó además mediante un ensayo de "pull-down" utilizando TAPC biotinilado en lisados de MC38 (Fig. 3c) y mediante microscopía confocal, que mostró la colocalización intracelular de TAPC marcado con Cy5.5 con VEGFR2 (Fig. 3d y S8). Para cuantificar esta interacción, empleamos BLI, una técnica en tiempo real y sin etiquetas que mide la interacción molecular a través de cambios en el grosor óptico en la superficie de un biosensor. Se inmovilizó VEGFR2 recombinante en la superficie del sensor y se registraron las cinéticas de asociación/disociación tras la exposición a TAPC. El análisis de BLI reveló una constante de disociación (Kd) de 11,4 µM, lo que indica una afinidad de enlace moderada pero específica entre TAPC y VEGFR2 (Fig. 3e). Aunque el análisis de BLI mostró una afinidad de enlace micromolar entre TAPC y VEGFR2, esta medición refleja una interacción proteína-ligando simplificada [^[50]]. En la formulación de nanopartículas, la presentación a nanoescala de TAPC puede permitir interacciones multivalentes y un enriquecimiento local, lo que podría mejorar el compromiso funcional. Además, las simulaciones de dinámica molecular que comparan TAPC con otros derivados de fulerenos (NDMPFI, MBAMF, TPFE) revelaron además que TAPC formó el complejo VEGFR2 más estable a través de interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno (Fig. 3f y S9). El acoplamiento molecular indicó que TAPC ocupa el bolsillo de unión a ATP de VEGFR2 y forma múltiples interacciones estabilizadoras con residuos en el dominio de la quinasa (Fig. 3f y S10). Esta ubicación de unión se superpone con el sitio de unión a ATP al que se dirigen los inhibidores de VEGFR2 de moléculas pequeñas [^[51]]. Los cálculos de la energía de enlace respaldaron estos hallazgos, y TAPC mostró la energía libre más baja (67,5 kcal/mol), impulsada principalmente por las fuerzas de van der Waals (Fig. 3g). Además, el análisis de acoplamiento comparativo en múltiples quinasas receptoras de tirosina, incluidas VEGFR1, VEGFR3, PDGFR, FGFR1 y EGFR, mostró la mayor energía de enlace predicha para VEGFR2 (Tabla S1), lo que respalda la interacción preferencial con VEGFR2.

Para evaluar la relevancia funcional del compromiso de VEGFR2, realizamos la inhibición de la expresión de VEGFR2 mediada por ARN de interferencia (siRNA) en HUVECs y evaluamos la formación de tubos endoteliales. El análisis de inmunoblotaje confirmó la reducción eficiente de la expresión de VEGFR2 tras el tratamiento con siRNA de VEGFR2 (Fig. S11a). En las HUVECs no tratadas, TAPC inhibió notablemente la formación de tubos, reduciendo la longitud total del tubo en más del 60% en comparación con el grupo de control (Fig. S11b–c). En contraste, las HUVECs con la expresión de VEGFR2 inhibida por siRNA aún formaron redes tubulares; sin embargo, en condiciones de deficiencia de VEGFR2, TAPC produjo solo una ligera inhibición, disminuyendo la longitud total del tubo en menos del 10% en relación con los controles con la expresión de VEGFR2 inhibida por siRNA (Fig. S11b–c). Estos resultados indican que la inhibición de la formación de tubos endoteliales mediada por TAPC depende en gran medida de la expresión de VEGFR2.

Más allá de la angiogénesis, la señalización de VEGFR2 también regula el metabolismo tumoral, mejorando la glucólisis a través de los transportadores de glucosa y la regulación al alza de las enzimas. El análisis del flujo extracelular en células MC38 mostró que TAPC disminuyó de forma dependiente de la dosis la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva, lo que sugiere un metabolismo de la glucosa alterado (Fig. 3h e i). Si bien el mecanismo preciso aún debe aclararse, estos resultados sugieren que TAPC interrumpe la reprogramación metabólica impulsada por VEGFR2, además de sus efectos antiangiogénicos. Esta inhibición dual del soporte vascular y metabólico subraya la eficacia antitumoral de TAPC, posiblemente a través del direccionamiento directo de VEGFR2 y la supresión de la señalización PI3K-AKT.

TAPC@CNPs exhiben una mayor estabilidad y captación celular

Dado el efecto observado de la interacción de TAPC con VEGFR2 y su actividad antiangiogénica, desarrollamos a continuación una formulación de nanopartículas para mejorar la administración y las propiedades farmacocinéticas. Los inhibidores de VEGFR2 de moléculas pequeñas a menudo exhiben una biodisponibilidad limitada y una exposición tumoral subóptima, lo que puede reducir la eficacia terapéutica [^[52]]. Los fulerenos aminados enfrentan desafíos farmacocinéticos adicionales, ya que su fuerte carga positiva promueve la unión inespecífica a las proteínas plasmáticas y la rápida eliminación sistémica, lo que limita el beneficio terapéutico [^[53]]. Para abordar estas limitaciones, diseñamos nanopartículas recubiertas con membrana de células tumorales (TAPC@CNPs), que comprenden un núcleo de PLGA cargado con TAPC que proporciona estabilidad estructural y liberación controlada, recubierto con membranas de células tumorales MC38 homólogas (Fig. 4a). Se utilizaron nanopartículas recubiertas con membrana sin TAPC (CNPs) como controles.

TAPC@CNPs formaron una suspensión transparente y estable en solución acuosa y conservaron el color característico de TAPC (Fig. 4b). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló estructuras de nanopartículas bien definidas con una morfología consistente con nanopartículas recubiertas con membrana (Fig. 4c y S12). Las mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) mostraron un diámetro hidrodinámico promedio de aproximadamente 106 nm, lo que es consistente con las observaciones de TEM (Fig. 4c y d). TAPC@CNPs mostró un cambio en el potencial zeta a -18 mV, lo que indica una inversión de la carga superficial por el recubrimiento de la membrana y posiblemente reduce la unión inespecífica a las proteínas plasmáticas (Fig. 4e). Además, la eficiencia del recubrimiento de la membrana se cuantificó utilizando un ensayo de ácido bicinquinónico (BCA). La proteína asociada a la membrana en TAPC@CNPs se midió después de la eliminación de los componentes de la membrana no unidos, lo que arrojó una eficiencia de recubrimiento de aproximadamente el 65,8%, lo que confirma la incorporación efectiva de la membrana en la superficie de la nanopartícula. Para verificar aún más el recubrimiento de la membrana, el análisis de SDS-PAGE mostró patrones de bandas de proteínas en TAPC@CNPs consistentes con los observados en las membranas de células MC38 aisladas, lo que confirma la presencia de proteínas derivadas de la membrana en la superficie de la nanopartícula (Fig. 4f). La estabilidad físico-química se evaluó mediante el seguimiento del tamaño de las partículas en condiciones de almacenamiento y que contienen suero. TAPC@CNPs mantuvo un tamaño hidrodinámico estable durante períodos de almacenamiento prolongados y durante la incubación en medios que contienen suero, lo que indica estabilidad en condiciones de almacenamiento y fisiológicas (Fig. 4g y h). A continuación, examinamos la captación celular de TAPC@CNPs. La microscopía confocal mostró que TAPC@CNPs marcadas con Cy5.5 se localizaron dentro de las células MC38 después de la incubación (Fig. 4i). Un análisis de colocalización adicional reveló una superposición parcial de la fluorescencia de Cy5.5 con los marcadores lisosomales, lo que indica que una fracción de las TAPC@CNPs internalizadas se transportó a través del compartimento lisosomal (Fig. S13). Un análisis cuantitativo mediante citometría de flujo demostró además una mayor captación celular de TAPC@CNPs marcadas con DiO en comparación con las nanopartículas de control después de 6 horas de incubación, posiblemente debido al direccionamiento mediado por la membrana de células tumorales homólogas (Fig. 4j).

Para evaluar la cinética de liberación de TAPC@CNPs, se realizaron estudios de liberación en diferentes condiciones de pH que imitan los entornos fisiológicos y asociados con tumores. TAPC@CNPs exhibió un comportamiento de liberación sensible al pH. La liberación de TAPC fue relativamente gradual, alcanzando aproximadamente el 30% de liberación a las 48 horas en condiciones fisiológicas (pH 7,4). En contraste, en condiciones ácidas (pH 6,0), la liberación de TAPC se aceleró significativamente, con aproximadamente el 50% de liberación observada a las 24 horas y una liberación continua posterior, lo que indica un comportamiento de liberación controlada (Fig. 4k).

Para evaluar si la nanoformulación afecta la actividad de TAPC, examinamos la expresión de VEGFR2 y la formación de tubos endoteliales después del tratamiento con TAPC-PLGA y TAPC@CNPs. El análisis de inmunoblotaje mostró que ambas formulaciones redujeron la expresión de VEGFR2 en comparación con los controles (Fig. S14a). De manera consistente, los ensayos de formación de tubos demostraron que TAPC-PLGA y TAPC@CNPs redujeron significativamente la formación de redes endoteliales y la longitud total del tubo (Fig. S14b–c). Estos resultados indican que TAPC conserva su actividad inhibidora de VEGFR2 y antiangiogénica después de la formulación de nanopartículas.

En conjunto, estos resultados demuestran la fabricación exitosa de TAPC@CNPs recubiertas con membrana con propiedades físico-químicas estables, proteínas asociadas a la membrana conservadas, mayor captación celular y circulación sostenida, lo que respalda su idoneidad como formulación de nanopartículas para la administración in vivo.

TAPC@CNPs inhiben el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo

Después de demostrar la mejora de la administración y la captación celular de TAPC@CNPs in vitro, evaluamos a continuación su eficacia terapéutica in vivo utilizando modelos de tumores MC38 subcutáneos. En ratones Balb/c que presentaban tumores establecidos (100 mm3), los animales se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (control de PBS, PEG-PO, CNPs, TAPC con PEG-PO y TAPC@CNPs) y se trataron por vía intravenosa cada dos días (Fig. 5a). Durante todo el período de tratamiento, el peso corporal se mantuvo estable en todos los grupos, lo que indica una buena tolerabilidad de las formulaciones (Fig. 5b). El crecimiento tumoral se inhibió progresivamente en el grupo tratado con TAPC@CNP, como se demuestra en las curvas de crecimiento tumoral y las fotografías representativas de los tumores extirpados (Fig. 5c y d). En consonancia con estas observaciones, los pesos tumorales al final del estudio fueron significativamente menores, y TAPC@CNPs lograron una reducción del 60,8% en comparación con el 34,3% de TAPC libre y el 27,7% de CNPs, lo que confirmó la mayor eficacia terapéutica de la formulación de nanopartículas (Fig. 5e). Para validar la eficacia terapéutica en un entorno sinérgico inmunocompetente, también se establecieron tumores MC38 en ratones C57BL/6. El tratamiento con TAPC@CNP también resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (67,0%) en comparación con los grupos de control (Fig. S15), lo que confirma que los efectos antitumorales observados son reproducibles en un modelo tumoral completamente sinérgico.

Para investigar los cambios moleculares asociados con el tratamiento, se analizaron los tejidos tumorales. El análisis de inmunoblotaje mostró una reducción de la expresión de VEGFR2 en los lisados tumorales después del tratamiento con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. 5f). De manera consistente, el tinte inmunohistoquímico (IHC) y de inmunofluorescencia (IF) para CD31, un marcador endotelial ampliamente utilizado para evaluar la densidad de los microvasos, reveló una reducción del tinte positivo para CD31 en los tumores de los ratones tratados con TAPC@CNP, lo que indica una reducción de la densidad vascular tumoral (Fig. 5g y S16). Para evaluar la biocompatibilidad y la posible toxicidad, la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) no mostró ninguna anomalía patológica en los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón), mientras que las secciones tumorales mostraron una densidad celular reducida y características necróticas consistentes con la regresión tumoral (Fig. 5h). Además, el análisis de sangre mostró una mayor frecuencia de linfocitos circulantes en los ratones tratados con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. S17). Para evaluar aún más la toxicidad sistémica, se midieron los marcadores bioquímicos séricos de la función hepática. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) fueron comparables entre los ratones tratados con TAPC@CNP y los grupos de control (Fig. 5i), lo que indica una función hepática preservada después del tratamiento.

En conjunto, estos resultados demuestran que el tratamiento con TAPC@CNP inhibe significativamente el crecimiento tumoral tanto en los modelos de tumor Balb/c como en C57BL/6, acompañado de una reducción de la vascularización tumoral y perfiles de seguridad favorables in vivo.

Los TAPC@CNP exhiben acumulación tumoral y activan la inmunidad antitumoral

Para evaluar el comportamiento de la distribución in vivo de los TAPC@CNP, primero realizamos un análisis de biodistribución en ratones portadores de tumores MC38 utilizando nanopartículas marcadas con Cy5.5. La imagen de fluorescencia ex vivo de los principales órganos y tumores en múltiples puntos temporales después de la administración intravenosa reveló señales de fluorescencia detectables tanto en los órganos reticuloendoteliales como en los tejidos tumorales (Fig. 6a). En los primeros puntos temporales, la fluorescencia fue prominente en el bazo, lo que es consistente con la captación de nanopartículas por los tejidos asociados al sistema fagocítico mononuclear. Con el tiempo, la intensidad de la fluorescencia esplénica disminuyó gradualmente, lo que indica la eliminación progresiva de la señal asociada a las nanopartículas (Fig. 6a y b y S18). En paralelo, la fluorescencia asociada al tumor fue detectable en múltiples puntos temporales, y el análisis cuantitativo confirmó una intensidad de fluorescencia medible dentro de los tejidos tumorales (Fig. 6a y c). Estas observaciones indican la distribución sistémica de los TAPC@CNP y la señal detectable asociada a las nanopartículas en el tejido tumoral.

Para caracterizar aún más el comportamiento circulatorio de los TAPC@CNP, realizamos un análisis farmacocinético midiendo la intensidad de la fluorescencia sérica en puntos temporales definidos después de la administración intravenosa. El perfil de decaimiento de la fluorescencia se ajustó bien a un modelo de decaimiento exponencial de una fase, lo que arrojó una vida media de circulación estimada de aproximadamente 13,1 h (Fig. 6d). Este resultado indica una presencia sistémica sostenida de la formulación de nanopartículas durante el tiempo analizado.

Dado que se detectó una señal asociada al tumor, investigamos a continuación si los TAPC@CNP se asociaban con cambios en las poblaciones de células inmunitarias. Primero analizamos los órganos linfoides para evaluar posibles alteraciones inmunitarias sistémicas. La citometría de flujo de los órganos linfoides (bazo, timo, ganglios linfáticos que drenan el tumor) reveló que los TAPC@CNP redujeron las Tregs CD4+Foxp3+ en los ganglios linfáticos, una población conocida por suprimir las células T efectoras y promover la evasión inmunitaria (Fig. 7a y b y S19). Esta reducción sugiere el alivio de la inmunosupresión. En paralelo, los TAPC@CNP causaron un aumento del 20% en las células T CD4+ en el bazo y un aumento del 7% en el timo, lo que indica una activación citotóxica sistémica (Fig. 7c y S20). Estos análisis establecen la distribución basal de los subconjuntos de células T CD4+ en los tejidos linfoides. Luego, examinamos la presencia de células inmunitarias dentro del microambiente tumoral. El tinte de inmunofluorescencia de las secciones de tumor mostró células T CD3+ y CD4+ localizadas dentro de los tejidos tumorales en los diferentes grupos de tratamiento, lo que confirmó la presencia de poblaciones de células T dentro del microambiente tumoral (Fig. 7d). Estos hallazgos demuestran que las poblaciones de linfocitos están presentes dentro de los tumores después del tratamiento.

Para caracterizar aún más las poblaciones inmunitarias infiltrantes tumorales, realizamos análisis adicionales de citometría de flujo de los tejidos tumorales disociados. La cuantificación de las células T CD8+ reveló diferencias en los niveles de células T CD8+ entre los grupos de tratamiento (Fig. 7e y S21a-b). Además de las poblaciones linfoides, evaluamos las células mieloides cuantificando la expresión de CD206 en las células CD45+CD11b+, lo que reveló una reducción de la expresión de CD206 en las células mieloides CD45+CD11b+ en los tumores después del tratamiento con TAPC@CNP (Fig. 7f y S21c-d). Estos análisis establecen la distribución de los subconjuntos de células inmunitarias linfoides y mieloides dentro de los tumores.

Finalmente, para evaluar aún más las características asociadas a la activación de las células T CD8+ infiltrantes tumorales, medimos la expresión de CD69, un marcador de activación temprana, y la interferona gamma intracelular (IFNγ), una citocina asociada con la función efectora de las células T citotóxicas. El análisis de citometría de flujo reveló un aumento significativo de la expresión de CD69 en las células T CD8+ después del tratamiento con TAPC@CNP en comparación con los grupos de control (Fig. 7g y S21e-f). El tinte intracelular demostró además un aumento significativo de la expresión de IFNγ en las células T CD8+ infiltrantes tumorales después del tratamiento con TAPC@CNP (Fig. 7h e i), lo que indica un aumento de los niveles de células T CD8+ que expresan marcadores asociados a la activación y la función efectora.

En conjunto, estos resultados demuestran la distribución de nanopartículas asociadas al tumor y la circulación sistémica sostenida, acompañadas de una reducción de los niveles de células T reguladoras CD4+Foxp3+, alteraciones en las poblaciones de células T CD4+, una reducción de la expresión de CD206 en las células mieloides CD45+CD11b+ y un aumento de la infiltración y la expresión de marcadores asociados a la activación en las células T CD8+, lo que indica colectivamente la activación de las respuestas inmunitarias antitumorales después del tratamiento con TAPC@CNP.

Conclusiones

Este trabajo identifica a TAPC como el compuesto principal de un cribado fenotípico de derivados de fulerenos aminados y lo establece como un inhibidor de VEGFR2. Tanto en los modelos celulares endoteliales como en los de células tumorales, TAPC redujo la expresión de VEGFR2 y suprimió las vías de señalización descendentes implicadas en la angiogénesis. La interacción directa entre TAPC y VEGFR2 se confirmó mediante ensayos bioquímicos, interferometría de bicapa y análisis computacionales. Además, el perfil metabólico reveló una reducción de la actividad glucolítica después del tratamiento con TAPC, lo que sugiere que los programas asociados a VEGFR2 relacionados con el crecimiento tumoral también pueden verse afectados. Para superar las limitaciones farmacocinéticas de TAPC libre, desarrollamos una estrategia de administración biomimética encapsulando TAPC en núcleos de PLGA y recubriendo las nanopartículas con membranas celulares tumorales homólogas para generar TAPC@CNP. Esta formulación mejoró la estabilidad de las nanopartículas y la persistencia sistémica, permitió la acumulación tumoral in vivo y preservó la actividad inhibidora de VEGFR2 y antiangiogénica de TAPC in vitro. En los modelos murinos de tumor colorrectal, los TAPC@CNP lograron un marcado beneficio terapéutico, acompañado de una reducción de la expresión de marcadores asociados a la angiogénesis en los tejidos tumorales. Es importante destacar que el perfil inmunológico reveló un cambio hacia una mayor inmunidad antitumoral, caracterizada por una disminución de los niveles de células T reguladoras y un aumento de la infiltración y la activación de las células T. Estos hallazgos indican que los TAPC@CNP pueden combinar la inhibición vascular con la participación inmunitaria. El tratamiento fue bien tolerado y presentó un perfil de seguridad favorable.

En general, este estudio amplía el espacio químico de los agentes dirigidos a VEGFR2 al introducir una molécula de carbono estructuralmente distinta como agente dirigido a VEGFR2 y demuestra que la administración de nanopartículas recubiertas con membranas de células tumorales puede mejorar la eficacia antitumoral in vivo al tiempo que permite efectos antiangiogénicos e inmunomoduladores concurrentes. El trabajo futuro se centrará en optimizar los derivados de TAPC para mejorar la potencia y la selectividad, dilucidar los vínculos mecanicistas entre la inhibición de VEGFR2 y la modulación inmunitaria, y evaluar las combinaciones racionales con el bloqueo de puntos de control inmunitarios, la radioterapia y las intervenciones metabólicas.

Declaración de contribución de autoría CRediT

Jiawei Huo: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Visualización, Validación, Software, Administración del proyecto, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos, Conceptualización. Yijun Wang: Validación, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos. Lei Liu: Visualización, Validación, Metodología, Investigación, Análisis formal, Curación de datos. Jie Li: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Supervisión, Recursos, Administración del proyecto, Metodología, Investigación, Adquisición de financiación, Análisis formal, Conceptualización. Libin Yang: Visualización, Validación, Metodología, Investigación. Zehu Wang: Metodología, Investigación, Análisis formal. Bowen Li: Validación, Metodología, Investigación. Weixin Zhang: Validación, Metodología, Investigación. Xin Wang: Validación, Metodología, Investigación. Mark John Siringan: Redacción: borrador original. Xue Li: Supervisión, Investigación, Adquisición de financiación, Análisis formal. Ruili Zhao: Validación, Metodología, Investigación. Dongling Huang: Metodología, Investigación. Wanwen Liao: Metodología, Investigación. Chunru Wang: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Supervisión, Software, Recursos, Administración del proyecto, Adquisición de financiación, Conceptualización. Chunli Bai: Redacción: revisión y edición, Redacción: borrador original, Supervisión, Software, Recursos, Administración del proyecto, Adquisición de financiación, Conceptualización.

Aprobación ética y consentimiento para participar

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Química de la Academia China de Ciencias (número de aprobación: SYXK (Jing) 2018-0033). Los ratones se alojaron en condiciones controladas de aproximadamente 50% de humedad, 25 °C de temperatura y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo se presentan en el artículo y en la información suplementaria.

Financiación

Este trabajo cuenta con el apoyo del 10.13039/501100012166 Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (Número de subvención: 2022YFA1205900) y el proyecto de investigación principal de la 10.13039/501100001809 Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Número de subvención: 52272049).

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran las siguientes relaciones personales que pueden considerarse como posibles conflictos de intereses: Ruili Zhao, Dongling Huang y Wanwen Liao son actualmente empleados por Shenzhen 863 New Material and Technology Co., Ltd. Ruili Zhao es actualmente empleado por Zhejiang Osmum Biological Co., Ltd.