La hipoxia y el ácido acetilsalicílico aumentan de manera aditiva la acumulación intracelular de glutamina en células de cáncer colorrectal con mutaciones en PIK3CA.

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) presentan un considerable potencial como fármacos reutilizables para prevenir y tratar el cáncer, especialmente el cáncer colorrectal^[1],^[2]. La ciclooxigenasa (COX) se ha identificado en la investigación farmacológica como la molécula diana clásica para la aspirina. Recientemente, los efectos antitumorales independientes de la COX de la aspirina, como la inhibición de mTOR, la activación de la autofagia y los efectos sobre el microambiente tumoral, han despertado un interés significativo en la investigación^[3],^[4]. Varios ensayos aleatorizados que investigan el impacto preventivo de la aspirina sobre los eventos cardiovasculares y cerebrovasculares han demostrado que el uso constante de aspirina puede reducir tanto la incidencia como las tasas de mortalidad del cáncer colorrectal^[5]–^[8]. En particular, se ha demostrado que la aspirina reduce epidemiológicamente la mortalidad en el cáncer colorrectal (CCR) con mutación PIK3CA (MT), que representa entre el 10 y el 20% de los casos. La evidencia clínica acumulada apoya firmemente la mutación PIK3CA como un prometedor biomarcador predictivo para la eficacia de la aspirina^[9]–^[13]. Por ejemplo, el estudio ALASCCA^[13], un gran ensayo controlado aleatorizado, demostró que tres años de aspirina adyuvante a baja dosis redujeron significativamente el riesgo de recurrencia en aproximadamente un 50% en pacientes con CCR localmente avanzado que presentaban mutaciones en la vía PI3K. En consecuencia, las guías NCCN 2025 ahora hacen referencia a las mutaciones en la vía PI3K como un biomarcador predictivo del beneficio de la aspirina. Esta sensibilidad clínica está respaldada aún más por evidencia experimental; se ha demostrado que la aspirina induce la detención del ciclo celular y promueve la apoptosis de manera más efectiva en las células de CCR con mutación PIK3CA (MT) que en sus contrapartes de tipo salvaje, como lo informaron Gu et al.^[14] y Zumwalt et al.^[15]. Las mutaciones PIK3CA se consideran un indicador de mal pronóstico debido a su asociación con la resistencia a la quimioterapia^[16],^[17]. En los cánceres con mutación PIK3CA (MT), incluido el cáncer colorrectal, se han informado varios hallazgos sobre la remodelación del sistema glucolítico y el metabolismo de la glutamina^[18],^[19], lo que indica que el crecimiento del cáncer colorrectal con mutación PIK3CA (MT) podría inhibirse mediante la focalización del metabolismo de la glutamina^[20]. Aunque previamente hemos establecido que la depleción de glutamina reduce los efectos antitumorales de la aspirina en el cáncer colorrectal con mutación PIK3CA (MT) y que la aspirina promueve el metabolismo de la glutamina^[21], los mecanismos subyacentes de la respuesta favorable a la aspirina en el cáncer colorrectal con mutación PIK3CA (MT) aún no están claros.

Al evaluar los efectos antitumorales de la aspirina, es esencial considerar el entorno de crecimiento tumoral. La hipoxia, caracterizada por bajos niveles de oxígeno, es una característica prominente de la mayoría de los cánceres sólidos^[22]. Existe cada vez más evidencia de que la hipoxia contribuye a la resistencia a la terapia contra el cáncer al promover la quimiorresistencia, la angiogénesis y la invasividad^[23],^[24]. El factor inducible por hipoxia-1α (HIF-1α), inducido por la hipoxia, desempeña un papel importante en la proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y la pluripotencia de las células cancerosas al aumentar la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) durante la hipoxia, aumentando así la abundancia de su producto enzimático, la prostaglandina E2 (PGE2)^[25],^[26]. Además del efecto bien conocido de la aspirina sobre la activación de las plaquetas, también se ha informado que la mayoría de los AINE, incluida la aspirina a dosis superiores al umbral antiplaquetario inhibidor de la COX-1, tienen la capacidad de inhibir la producción de prostaciclina mediada por COX-2. Se cree que esta inhibición desempeña un papel en el mecanismo asociado con la respuesta angiogénica inducida por la hipoxia en las células endoteliales^[27]. Aunque el cáncer colorrectal induce un microambiente hipóxico^[28],^[29], el comportamiento biológico molecular del cáncer colorrectal con mutación PIK3CA (MT) y los efectos antitumorales de la aspirina en tales condiciones no se comprenden bien. Por lo tanto, nuestro objetivo fue investigar los mecanismos a través de los cuales la hipoxia influye en la acumulación intracelular de glutamina asociada a la aspirina en las líneas celulares de cáncer colorrectal con mutación PIK3CA (MT).

Materiales y métodos

Líneas celulares y cultivo

Las células de cáncer de colon humano, DLD-1, se obtuvieron del American Type Culture Collection. PIK3CA (H1047R/-) HCT116, PIK3CA de tipo salvaje (WT) HCT116, PIK3CA (E545K/+) SW48 y PIK3CA de tipo salvaje (WT) SW48 se obtuvieron de Horizon Discovery (Waterbeach, Reino Unido). La autenticidad de cada línea celular se verificó mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas en el banco de células respectivo. La contaminación por micoplasma se comprobó utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza, Rockland, ME, EE. UU.), confirmando su ausencia. Las células se utilizaron dentro de los tres meses posteriores a la descongelación y se cultivaron en medio RPMI 1640 (#01859-34, Nacalai Tesque, Kioto, Japón) con un 10% de suero bovino fetal (#30264-85, Nacalai Tesque, Kioto, Japón), 2 mM de glutamina, 50 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (#26253-84, Nacalai Tesque, Kioto, Japón). El medio de cultivo se utilizó dentro de las 2 semanas para evitar la degradación de la L-glutamina. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada. Las condiciones hipóxicas (1% de O2 y 5% de CO2) se establecieron utilizando una incubadora de CO2 9000EX (Wakenyaku Co., Ltd.), con los niveles de oxígeno controlados y mantenidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para todos los experimentos que duraron hasta 72 horas, el medio de cultivo no se cambió para mantener condiciones experimentales estables. El pH del medio se controló utilizando el indicador de rojo fenol y se mantuvo dentro del rango fisiológico (7,2–7,4) durante todo el período de 72 horas, lo que garantiza que el agotamiento de los nutrientes o la acidificación no afectaran los efectos metabólicos observados.

Reactivos

La aspirina, la L-metionina sulfoximina (L-MS) y V-9302 se compraron a Sigma-Aldrich (#A5376-100G, Saint Louis, MO, EE. UU.), Nacalai Tesque (#21730-74, Kioto, Japón) y Fujifilm (#1855871-76-9, Tokio, Japón), respectivamente. Para su uso, la aspirina y la L-MS se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO, #13445-74, Nacalai Tesque, Kioto, Japón) para preparar soluciones madre de 1 M y 250 mM, respectivamente. Estas se diluyeron posteriormente en el medio de cultivo para su uso experimental, asegurando una concentración final de DMSO del 0,2% en todos los grupos de tratamiento y control. V-9302 se disolvió en agua para preparar una solución madre de 20 mM, que luego se diluyó a las concentraciones de trabajo necesarias en el medio de cultivo.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 (#347-07623, Dojindo, Kumamoto, Japón) según las instrucciones del fabricante. Las células PIK3CA-MT HCT116 y PIK3CA-MT DLD-1 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5–5,0 × 10³ células por pocillo en 100 µL e se incubaron durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron a 2 mM de aspirina (ASA) y/o 20 µM de V-9302 en condiciones de 20% de O2 (normóxica: NO) y 1% de O2 (hipóxica: HY), con cada fármaco diluido en un volumen total de 200 µL. Después del período de incubación especificado, se añadieron 10 µL de reactivo WST-8 al medio y se incubó durante 4 horas. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un SpectraMax iD5 (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA, EE. UU.). Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los resultados se expresan como la media ± DE de experimentos biológicos independientes (n), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Líneas celulares y cultivo

Las células de cáncer de colon humano, DLD-1, se obtuvieron del American Type Culture Collection. PIK3CA (H1047R/-) HCT116, PIK3CA de tipo salvaje (WT) HCT116, PIK3CA (E545K/+) SW48 y PIK3CA de tipo salvaje (WT) SW48 se obtuvieron de Horizon Discovery (Waterbeach, Reino Unido). La autenticidad de cada línea celular se verificó mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas en el banco de células respectivo. La contaminación por micoplasma se comprobó utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza, Rockland, ME, EE. UU.), confirmando su ausencia. Las células se utilizaron dentro de los tres meses posteriores a la descongelación y se cultivaron en medio RPMI 1640 (#01859-34, Nacalai Tesque, Kioto, Japón) con un 10% de suero bovino fetal (#30264-85, Nacalai Tesque, Kioto, Japón), 2 mM de glutamina, 50 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (#26253-84, Nacalai Tesque, Kioto, Japón). El medio de cultivo se utilizó dentro de las 2 semanas para evitar la degradación de la L-glutamina. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada. Las condiciones hipóxicas (1% de O2 y 5% de CO2) se establecieron utilizando una incubadora de CO2 9000EX (Wakenyaku Co., Ltd.), con los niveles de oxígeno controlados y mantenidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para todos los experimentos que duraron hasta 72 horas, el medio de cultivo no se cambió para mantener condiciones experimentales estables. El pH del medio se controló utilizando el indicador de rojo fenol y se mantuvo dentro del rango fisiológico (7,2–7,4) durante todo el período de 72 horas, lo que garantiza que el agotamiento de los nutrientes o la acidificación no afectaran los efectos metabólicos observados.

Las células HCT116 (PIK3CA-MT/WT) se cultivaron en placas de 100 mm con medio de cultivo durante la noche. A continuación, las células se trataron con DMSO, aspirina (2 mM) y V-9302 (20 µM) o L-MS (10 mM) con aspirina (2 mM), dividiéndose en grupos bajo condiciones de 1% de O2 y 20% de O2, seguido de un período de incubación de 24 horas. Las células se cultivaron hasta alcanzar una subconfluencia, se recogieron con tripsina (#35553-74, Nacalai Tesque, Kioto, Japón) y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, #14249-95, Nacalai Tesque, Kioto, Japón). La extracción y el análisis de los metabolitos se llevaron a cabo como se describió previamente^[38]. En resumen, las células se centrifugaron a 1.000 × g durante 5 minutos a 4 °C, y los pellets resultantes se resuspendieron en 200 µL de metanol. La suspensión se mezcló con agua Milli-Q y cloroformo en una proporción volumétrica de 5:2:5, seguido de una centrifugación a 9.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. La fase acuosa se filtró a continuación a través de un filtro de corte de 3 kDa (Amicon Ultra, Merck KGaA) para eliminar los componentes de alto peso molecular. El filtrado se concentró por centrifugación, y los metabolitos correspondientes a 5 × 10⁵ células se disolvieron en 5 µL de hidróxido de amonio antes de ser analizados por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando un sistema HPLC UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) equipado con una columna YMC-Triart PFP (tamaño de partícula de 3 mm, tamaño de poro de 12 nm, 150 × 2,1 mm; YMC Co., Ltd., Kioto, Japón). La fase móvil consistió en un 0,5% de ácido fórmico en agua, con una velocidad de flujo de 0,2 mL/min y un volumen de inyección de 5 µL. El sistema HPLC se conectó a un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Thermo Scientific TSQ Endura. Se aplicó ionización por electrospray en modo positivo para la detección de glutamina y ácido glutámico, y en modo negativo para otros metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). El voltaje de pulverización se ajustó a 3.500 V en modo positivo y a 2.500 V en modo negativo. Los metabolitos del ciclo del TCA se detectaron utilizando la monitorización de múltiples reacciones (MRM) en espectrometría de masas en tándem. Un resumen de los parámetros de MS se muestra en la Tabla S1. Para garantizar la precisión analítica y controlar la supresión de iones, se añadieron estándares internos (IS) a cada muestra durante la extracción. Las soluciones estándar del TCA se prepararon a una concentración de 50 mM en una solución de hidróxido de amonio. Todas las soluciones estándar se prepararon diariamente justo antes de ejecutar las muestras en el sistema LC-MS/MS. Se prepararon curvas de calibración del estándar del TCA a partir de la solución estándar de trabajo a concentraciones de 100 nM a 5 mM. Las muestras de control de calidad (QC) se prepararon de forma idéntica a los estándares a concentraciones finales de 5 y 500 µM y 5 mM. La desviación estándar relativa (RSD) de todos los metabolitos cuantificados se mantuvo por debajo del 15%, y se inyectaron blancos de disolvente entre las muestras para descartar el arrastre. Los metabolitos se informaron como concentraciones absolutas normalizadas al número de células.

Ensayo ROS-Glo™ H2O2

El estrés oxidativo se evaluó utilizando el ensayo ROS-Glo™ H2O2 (Promega, Madison, WI, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Este ensayo bioluminiscente mide específicamente el peróxido de hidrógeno (H2O2), una especie reactiva del oxígeno (ROS), en cultivos celulares o reacciones enzimáticas. En resumen, se sembraron 1,5 × 10⁵ células en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio RPMI 1640. Las células se trataron con 2 mM de aspirina, 20 µM de V-9302 o 10 mM de L-MS y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 horas. Tras la incubación, se añadió la solución de sustrato de H2O2 durante 2 horas para producir un precursor de luciferina. A continuación, se añadió la solución de detección ROS-Glo™ durante 20 minutos, convirtiendo el precursor en luciferina y activando la luciferasa recombinante Ultra-Glo™, generando una señal de luz proporcional a la concentración de H2O2. La bioluminiscencia se midió utilizando el lector multietiqueta EnSpire™ 2300, y los resultados se expresaron en unidades de luminiscencia relativa. Para la cuantificación de ROS, las células se sembraron a una densidad idéntica en todos los grupos al inicio del experimento. Por lo tanto, los niveles de ROS se informan como RLU brutos para representar la carga oxidativa acumulada total generada por los tratamientos dentro del nicho. La normalización por el recuento de células tras el tratamiento se evitó intencionadamente para evitar el enmascaramiento matemático del estrés oxidativo total que impulsa los resultados biológicos posteriores. Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los datos se expresan como la media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Ensayo de formación de colonias

Sembró células PIK3CA-MT HCT116 de cáncer colorrectal a una densidad de 2.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos y las dejó crecer durante 24 horas. A continuación, las células se expusieron a 2 mM de aspirina (ASA) y/o 20 µM de V-9302 en condiciones de 20% de O2 (NO) y 1% de O2 (HY), y se incubaron durante 6 días. Después de la incubación, las células se fijaron utilizando un 10% de formalina (Fujifilm, Tokio, Japón) y se tiñeron con un 0,1% de cristal violeta (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.). El área total y el porcentaje de área cubierta por las colonias se cuantificaron utilizando el software ImageJ (versión 1.54, National Institutes of Health, EE. UU.). Primero, las imágenes digitales de las placas de cultivo se convirtieron a escala de grises de 8 bits para facilitar el establecimiento de umbrales. Para eliminar las señales de fondo no específicas y la iluminación desigual, se aplicó el comando "Subtract Background" con un radio de bola rodante de 50 píxeles. Las regiones de las colonias se definieron aplicando un algoritmo de establecimiento de umbrales automatizado (método de Otsu). Tras la binarización, se utilizó la función "Analyze Particles" para medir el área total. Para garantizar la exclusión de artefactos menores y restos celulares, se aplicó un filtro basado en el tamaño, incluyendo solo partículas mayores de 100 píxeles. Los resultados se expresaron como "Fraction Area" (%), que representa la relación entre el área ocupada por las colonias y el área total de la superficie del pocillo. Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los resultados se expresan como la media ± DE de réplicas biológicas independientes (n), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) de réplicas biológicas independientes (n). Para la viabilidad celular, la formación de colonias y los ensayos ROS-Glo, cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Las diferencias entre tres o más grupos se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de pruebas post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student de dos colas. Los valores P exactos se indican en las figuras para garantizar la total transparencia, y se consideró que un valor P < 0,05 era estadísticamente significativo en relación con el grupo de control especificado. Los análisis estadísticos y la visualización de datos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.).

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 (#347-07623, Dojindo, Kumamoto, Japón) según las directrices del fabricante. Las células PIK3CA-MT HCT116 y PIK3CA-MT DLD-1 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5-5,0 × 10³ células por pocillo en 100 µL y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron a 2 mM de aspirina (ASA) y/o 20 µM de V-9302 en condiciones de 20% de O2 (normóxica: NO) y 1% de O2 (hipóxica: HY), con cada fármaco diluido en un volumen total de 200 µL. Después del período de incubación especificado, se añadieron 10 µL de reactivo WST-8 al medio y se incubó durante 4 horas. La absorbancia a 450 nm se midió utilizando un SpectraMax iD5 (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA, EE. UU.). Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los resultados se expresan como la media ± DE de réplicas biológicas independientes (n), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Mapa de conectividad

El Mapa de Conectividad ofrece un repositorio público de más de 7.000 perfiles de expresión génica en 1.309 compuestos (www.broad.mit.edu/cmap/)^[30]. Para evaluar las variaciones en la expresión génica, este estudio analizó datos de ocho líneas celulares: A375 (melanoma maligno), A549 y HCC515 (cáncer de pulmón), HT-29 (PIK3CA-MT cáncer colorrectal), MCF-7 (PIK3CA-MT cáncer de mama), PC3 y VCaP (cáncer de próstata) y HA1E (células renales inmortalizadas), todas tratadas con 10 µM de aspirina durante 6 horas. El análisis de enriquecimiento de genes se realizó utilizando Metascape v3.5^[31] (accedido el 30 de diciembre de 2025) para los genes con una puntuación > 90.

Secuenciación y análisis de ARN

Se extrajo el ARN total de las células semi-confluentes utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). A continuación, el ARN se procesó con el kit de preparación de muestras de ARN mensajero (ARNm) TruSeq Stranded (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Las bibliotecas de ARNm poli(A) se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARNm TruSeq Stranded (Illumina), seguido de la secuenciación como lecturas apareadas de 100 pb en la plataforma Illumina NovaSeq6000. Las lecturas de ARN-seq se cuantificaron utilizando ikra v1.2.2^[32], una canalización de ARN-seq centrada en Salmon^[33] (accedido el 30 de abril de 2020). La canalización ikra automatizó el proceso de análisis de datos de ARN-seq, incluido el control de calidad de las lecturas (Trim Galore versión 0.6.6 (Babraham Bioinformatics, Reino Unido^[34] con Cutadapt^[35]) y la cuantificación de transcritos (Salmon versión 1.4.1 utilizando conjuntos de transcritos de referencia en GENCODE release 31 para humanos). Se aplicaron la configuración predeterminada para todas las herramientas de la canalización ikra. Las tablas de recuento se importaron a iDEP v2.01 (accedido el 30 de diciembre de 2025), una herramienta web utilizada para el análisis de vías y la expresión diferencial de datos de ARN-seq^[36]. Las lecturas de transcritos se filtraron para retener solo aquellas con un mínimo de 0,5 recuentos por millón (CPM) en al menos una muestra. Los datos se transformaron utilizando EdgeR con un cálculo de log2 (CPM + 4), donde se aplicó un pseudocuento de 4. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)^[37] se realizó dentro del software iDEP, utilizando valores de cambio de pliegue derivados de DESeq2. Se seleccionaron para una mayor exploración los conjuntos de genes con un valor q de tasa de descubrimiento falso (FDR) inferior a 0,05.

Análisis de metabolitos

Las células HCT116 (PIK3CA-MT/WT) se cultivaron en placas de 100 mm con medio de cultivo durante la noche. Luego, las células se trataron con DMSO, aspirina (2 mM) y V-9302 (20 µM) o L-MS (10 mM) con aspirina (2 mM), dividiéndolas en grupos bajo condiciones de 1% de O2 y 20% de O2, seguido de un período de incubación de 24 horas. Las células se cultivaron hasta alcanzar una subconfluencia, se recolectaron con tripsina (#35553-74, Nacalai Tesque, Kioto, Japón) y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS, #14249-95, Nacalai Tesque, Kioto, Japón). La extracción y el análisis de los metabolitos se llevaron a cabo como se describió previamente ^[38]. En resumen, las células se centrifugaron a 1.000 × g durante 5 minutos a 4 °C, y los pellets resultantes se resuspendieron en 200 µL de metanol. La suspensión se mezcló con agua Milli-Q y cloroformo en una proporción volumétrica de 5:2:5, seguido de centrifugación a 9.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. La fase acuosa se filtró luego a través de un filtro de corte de 3 kDa (Amicon Ultra, Merck KGaA) para eliminar los componentes de alto peso molecular. El filtrado se concentró por centrifugación, y los metabolitos correspondientes a 5 × 10⁵ células se disolvieron en 5 µL de hidróxido de amonio antes de ser analizados por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando un sistema HPLC UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) equipado con una columna YMC-Triart PFP (tamaño de partícula de 3 mm, tamaño de poro de 12 nm, 150 × 2,1 mm; YMC Co., Ltd., Kioto, Japón). La fase móvil consistió en 0,5% de ácido fórmico en agua, con una velocidad de flujo de 0,2 mL/min y un volumen de inyección de 5 µL. El sistema HPLC se conectó a un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple Thermo Scientific TSQ Endura (Thermo Fisher Scientific). Se aplicó ionización por electrospray en modo positivo para la detección de glutamina y ácido glutámico, y en modo negativo para otros metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). El voltaje de pulverización se ajustó a 3.500 V en modo positivo y 2.500 V en modo negativo. Los metabolitos del ciclo del TCA se detectaron utilizando el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) en espectrometría de masas en tándem. Un resumen de los parámetros de MS se muestra en la Tabla S1. Para garantizar la precisión analítica y controlar la supresión de iones, se agregaron estándares internos (IS) a cada muestra durante la extracción. Las soluciones estándar del ciclo del TCA se prepararon a una concentración de 50 mM en una solución de hidróxido de amonio. Todas las soluciones estándar se prepararon diariamente justo antes de ejecutar las muestras en el sistema LC-MS/MS. Se prepararon curvas de calibración del estándar del ciclo del TCA a partir de la solución estándar de trabajo a concentraciones de 100 nM a 5 mM. Las muestras de control de calidad (QC) se prepararon de manera idéntica a los estándares a concentraciones finales de 5 y 500 µM y 5 mM. La desviación estándar relativa (RSD) de todos los metabolitos cuantificados se mantuvo por debajo del 15%, y se inyectaron blancos de disolvente entre las muestras para descartar el arrastre. Los metabolitos se informaron como concentraciones absolutas normalizadas al número de células.

Ensayo ROS-Glo™ H2O2

El estrés oxidativo se evaluó utilizando el ensayo ROS-Glo™ H2O2 (Promega, Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo bioluminiscente mide específicamente el peróxido de hidrógeno (H2O2), una especie reactiva de oxígeno (ROS), en cultivos celulares o reacciones enzimáticas. En resumen, se sembraron 1,5 × 10⁵ células en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio RPMI 1640. Las células se trataron con 2 mM de aspirina, 20 µM de V-9302 o 10 mM de L-MS y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, se agregó la solución de sustrato de H2O2 durante 2 horas para producir un precursor de luciferina. Luego, se agregó la solución de detección ROS-Glo™ durante 20 minutos, convirtiendo el precursor en luciferina y activando la luciferasa recombinante Ultra-Glo™, generando una señal de luz proporcional a la concentración de H2O2. La bioluminiscencia se midió utilizando el lector multietiqueta EnSpire™ 2300, y los resultados se expresaron en unidades de luminiscencia relativa. Para la cuantificación de ROS, las células se sembraron a una densidad idéntica en todos los grupos al inicio del experimento. Por lo tanto, los niveles de ROS se informan como RLU brutos para representar la carga oxidativa acumulativa total generada por los tratamientos dentro del nicho. La normalización por el recuento de células después del tratamiento se evitó intencionalmente para evitar el enmascaramiento matemático del estrés oxidativo total que impulsa los resultados biológicos posteriores. Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los datos se expresan como la media ± DE de tres réplicas biológicas independientes (n = 3), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Ensayo de formación de colonias

Sembró células de cáncer de colon HCT116 PIK3CA-MT a una densidad de 2.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos y las dejó crecer durante 24 horas. Luego, las células se expusieron a 2 mM de aspirina (ASA) y/o 20 µM de V-9302 bajo condiciones de 20% de O2 (NO) y 1% de O2 (HY), y se incubaron durante 6 días. Después de la incubación, las células se fijaron utilizando 10% de formalina (Fujifilm, Tokio, Japón) y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.). El área total y el porcentaje de área cubierta por las colonias se cuantificaron utilizando el software ImageJ (versión 1.54, Institutos Nacionales de la Salud, EE. UU.). Primero, las imágenes digitales de las placas de cultivo se convirtieron a escala de grises de 8 bits para facilitar el establecimiento de umbrales. Para eliminar las señales de fondo no específicas y la iluminación desigual, se aplicó el comando "Restar fondo" con un radio de bola rodante de 50 píxeles. Las regiones de las colonias se definieron aplicando un algoritmo de establecimiento de umbrales automatizado (método de Otsu). Después de la binarización, se utilizó la función "Analizar partículas" para medir el área total. Para garantizar la exclusión de artefactos menores y restos celulares, se aplicó un filtro basado en el tamaño, incluyendo solo partículas mayores de 100 píxeles. Los resultados se expresaron como "Fracción de área" (%), que representa la relación entre el área ocupada por las colonias y el área total de la superficie del pocillo. Cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Los resultados se expresan como la media ± DE de réplicas biológicas independientes (n), según se especifica en las leyendas de las figuras.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) de réplicas biológicas independientes (n). Para la viabilidad celular, la formación de colonias y los ensayos ROS-Glo, cada experimento biológico independiente se realizó en duplicado técnico para garantizar la consistencia intraexperimental. Las diferencias entre tres o más grupos se evaluaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de pruebas post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas. Los valores P exactos se indican en las figuras para garantizar la total transparencia, y se consideró que un valor P < 0,05 era estadísticamente significativo en relación con el grupo de control especificado. Los análisis estadísticos y la visualización de datos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.).

Resultados

El análisis bioinformático sugiere que la aspirina influye en el metabolismo de los aminoácidos y sus derivados y en la vía de señalización HIF-1 en las células de cáncer de colon HT-29 PIK3CA-MT

Intentamos estimar el mecanismo de acción de la aspirina utilizando Connectivity Map para realizar un análisis de enriquecimiento de genes que causan cambios en la expresión génica similares a los causados por el tratamiento con aspirina. Realizamos un análisis de enriquecimiento en "genes relacionados con la aspirina" (puntuación de similitud > 90, Tabla S2A-C) utilizando Metascape, y los resultados sugieren que es posible que la aspirina influya en el metabolismo de los aminoácidos y sus derivados y en las vías hipóxicas en la línea celular de cáncer de colon PIK3CA-MT HT-29 (Fig. 1A, B). Sin embargo, esto no se observó en el análisis de las ocho líneas celulares (Fig. 1C, D) ni en el de MCF-7 (Fig. S1). En particular, en las células de cáncer de colon, un impacto significativo de las mutaciones de PIK3CA en el metabolismo de los aminoácidos fue posible. Estos análisis bioinformáticos se utilizaron como una herramienta de apoyo para generar hipótesis, lo que sugiere que el impacto metabólico de la aspirina puede estar modulado por el contexto genético y metabólico de cada tipo de célula.

La hipoxia induce la importación de aminoácidos en las células de cáncer de colon PIK3CA-MT, pero no en las células PIK3CA-WT, SW48

Guiados por el análisis de perfiles de expresión génica públicos en diversas líneas celulares, que sugirió una posible participación de la aspirina en el metabolismo de los aminoácidos y la señalización hipóxica, particularmente en las células HT-29, buscamos examinar si estas asociaciones estaban relacionadas con el estado de mutación de PIK3CA. Con este fin, comparamos los patrones de expresión génica inducidos por la aspirina entre las células de cáncer de colon SW48 parentales (PIK3CA-WT) y su contraparte isogénica mutante de PIK3CA (PIK3CA-MT). En las células SW48 PIK3CA-MT, GSEA utilizando tanto las bases de datos Gene Ontology (GO) como Reactome reveló un enriquecimiento significativo de los genes asociados con las vías de transporte de aminoácidos en el grupo tratado con aspirina en comparación con el grupo tratado con DMSO bajo condiciones hipóxicas (FDR q < 0,05; Fig. 2A, B). En contraste, estas vías no se regularon al alza significativamente en las células SW48 PIK3CA-WT tratadas con aspirina (Fig. 2C, D). Aunque los cambios de los genes individuales fueron modestos, el enriquecimiento constante de estas vías en diferentes bases de datos y el umbral estadístico más estricto subrayan la importancia biológica del impacto de la aspirina en el metabolismo de los aminoácidos en las células mutadas de PIK3CA.

El nivel intracelular de glutamina aumenta en las células de cáncer de colon PIK3CA-MT HCT116 después de la administración de aspirina y bajo condiciones hipóxicas

Dado el vínculo observado entre el tratamiento con aspirina y la expresión de los transportadores de aminoácidos bajo hipoxia en las células mutadas de PIK3CA, exploramos a continuación si estos cambios se acompañan de alteraciones en el metabolismo intracelular de la glutamina. Empleamos un enfoque de metabolómica basado en la espectrometría de masas para cuantificar los metabolitos relacionados con el ciclo del TCA en las células de cáncer de colon PIK3CA-MT. Entre estos metabolitos, la glutamina fue el más afectado por el estado de mutación de PIK3CA, el tratamiento con aspirina y las condiciones hipóxicas en las células de cáncer de colon HCT116 (Fig. S2A, B). Las células HCT116 PIK3CA-MT exhibieron una expresión relativamente aumentada de los genes involucrados en la captación de aminoácidos en respuesta a la aspirina en hipoxia, en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. S3A-C). El tratamiento con aspirina aumentó significativamente los niveles intracelulares de glutamina en las células HCT116, independientemente de la disponibilidad de oxígeno y el estado de mutación de PIK3CA. En particular, bajo condiciones hipóxicas, el tratamiento con aspirina condujo a un mayor aumento de los niveles intracelulares de glutamina en las células HCT116 PIK3CA-MT, mientras que no se observó un efecto aditivo en las células PIK3CA-WT (Fig. 3A, B). Estos resultados indican que la hipoxia mejora aditivamente el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina, con un efecto más pronunciado observado en las células de cáncer de colon PIK3CA-MT.

Las células de cáncer de colon PIK3CA-MT HCT116 exhiben una disminución de los niveles intracelulares de glutamina y un aumento de los niveles de ROS después del tratamiento con fármacos dirigidos a la glutamina.

Investigamos más a fondo el mecanismo subyacente a la elevación de los niveles intracelulares de glutamina inducida por la aspirina en células de cáncer de colon PIK3CA-MT bajo condiciones de hipoxia. Utilizamos L-MS, un inhibidor de la glutamina sintetasa, y V-9302, un inhibidor del transportador de glutamina ASCT2, para examinar la regulación de la dinámica de la glutamina en respuesta al tratamiento con aspirina (Fig. S4). En células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HCT116, los niveles intracelulares de glutamina disminuyeron tras el tratamiento con L-MS y V-9302. Además, ambos fármacos contrarrestaron el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina (Fig. 4A, B). Estos hallazgos sugieren que el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina está regulado tanto a nivel de la síntesis de novo como de la importación desde el entorno extracelular. La glutaminólisis promueve la generación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) a través de la degradación del glutamato mediada por la glutamato deshidrogenasa (GLUD), contribuyendo así a la homeostasis de las especies reactivas del oxígeno (ROS)^[39]. Observamos que los niveles de ROS aumentaron tras la exposición a la aspirina en células PIK3CA-MT HCT116. Cabe destacar que el cotratamiento con aspirina y V-9302 o L-MS produjo un aumento aún más pronunciado de los niveles intracelulares de ROS (Fig. S5A, B), lo que revela una asociación fenomenológica entre el aumento de los niveles intracelulares de ROS y la reducción de la viabilidad celular tras el cotratamiento. Si bien estos hallazgos sugieren que el estrés oxidativo puede acompañar a los efectos inhibidores del crecimiento, el papel causal definitivo aún debe dilucidarse.

V-9302 reduce el crecimiento de células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT cuando se combina con aspirina

Se informa que la alteración del metabolismo de la glutamina es una estrategia novedosa para la terapia del cáncer en tumores hematológicos y sólidos dependientes de la glutamina, incluido el cáncer colorrectal PIK3CA-MT^[40]–^[42]. Tratamos células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT con aspirina en combinación con V-9302 en condiciones normóxicas (20% O2, NO) e hipóxicas (1% O2, HY). La combinación de aspirina y V-9302, tanto en condiciones normóxicas como hipóxicas, produjo una inhibición más pronunciada del crecimiento celular en comparación con el tratamiento único en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HCT116 y PIK3CA-MT DLD-1 (Fig. 5A–D). Además, el ensayo de formación de colonias en células HCT116 confirmó el efecto antitumoral combinado (Fig. 6A-D). Sin embargo, la combinación de aspirina y L-MS no mostró ningún efecto inhibidor sobre la proliferación celular, en comparación con L-MS solo (Fig. S6). Estos resultados sugieren que la inhibición de los transportadores implicados en la vía de la glutamina mejoró la eficacia de la aspirina en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT.

El análisis bioinformático sugiere que la aspirina influye en el metabolismo de los aminoácidos y sus derivados y en la vía de señalización HIF-1 en células de cáncer de colon PIK3CA-MT HT-29

Intentamos estimar el mecanismo de acción de la aspirina utilizando Connectivity Map para realizar un análisis de enriquecimiento de genes que causan cambios en la expresión génica similares a los causados por el tratamiento con aspirina. Realizamos un análisis de enriquecimiento de los "genes relacionados con la aspirina" (puntuación de similitud > 90, Tabla S2A–C) utilizando Metascape, y los resultados sugieren que es posible que la aspirina influya en el metabolismo de los aminoácidos y sus derivados y en las vías hipóxicas en la línea celular de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HT-29 (Fig. 1A, B). Sin embargo, esto no se observó en el análisis de las ocho líneas celulares (Fig. 1C, D) ni en el de MCF-7 (Fig. S1). En particular, en las células de cáncer colorrectal, un impacto significativo de las mutaciones de PIK3CA en el metabolismo de los aminoácidos fue posible. Estos análisis bioinformáticos se utilizaron como una herramienta de apoyo para generar hipótesis, lo que sugiere que el impacto metabólico de la aspirina puede estar modulado por el contexto genético y metabólico de cada tipo de célula.

La hipoxia induce la importación de aminoácidos en células PIK3CA-MT, pero no en células PIK3CA-WT, SW48 de cáncer colorrectal

Guiados por el análisis de perfiles de expresión génica públicos de diversas líneas celulares, que sugirió una posible implicación de la aspirina en el metabolismo de los aminoácidos y la señalización hipóxica, particularmente en las células HT-29, buscamos examinar si estas asociaciones estaban relacionadas con el estado de mutación de PIK3CA. Con este fin, comparamos los patrones de expresión génica inducidos por la aspirina entre las células de cáncer colorrectal SW48 parentales (PIK3CA-WT) y su contraparte isogénica mutante de PIK3CA (PIK3CA-MT). En las células PIK3CA-MT SW48, GSEA utilizando tanto las bases de datos Gene Ontology (GO) como Reactome reveló un enriquecimiento significativo de genes asociados con las vías de transporte de aminoácidos en el grupo tratado con aspirina en comparación con el grupo tratado con DMSO en condiciones hipóxicas (FDR q < 0,05; Fig. 2A, B). En contraste, estas vías no se regularon al alza de manera significativa en las células PIK3CA-WT SW48 tratadas con aspirina (Fig. 2C, D). Aunque los cambios en la expresión de los genes individuales fueron modestos, el enriquecimiento constante de estas vías en diferentes bases de datos y el umbral estadístico más estricto subrayan la importancia biológica del impacto de la aspirina en el metabolismo de los aminoácidos en las células mutadas de PIK3CA.

El nivel de glutamina intracelular aumenta en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HCT116 tras la administración de aspirina y en condiciones hipóxicas

Dado el vínculo observado entre el tratamiento con aspirina y la expresión de los transportadores de aminoácidos en condiciones hipóxicas en las células mutadas de PIK3CA, a continuación, exploramos si estos cambios se acompañan de alteraciones en el metabolismo de la glutamina intracelular. Empleamos un enfoque de metabolómica basado en la espectrometría de masas para cuantificar los metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT. Entre estos metabolitos, la glutamina fue el más afectado por el estado de mutación de PIK3CA, el tratamiento con aspirina y las condiciones hipóxicas en las células de cáncer colorrectal HCT116 (Fig. S2A, B). Las células PIK3CA-MT HCT116 exhibieron una expresión relativamente aumentada de los genes implicados en la captación de aminoácidos en respuesta a la aspirina en condiciones de hipoxia, en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. S3A-C). El tratamiento con aspirina aumentó significativamente los niveles intracelulares de glutamina en las células HCT116, independientemente de la disponibilidad de oxígeno y del estado de mutación de PIK3CA. En particular, en condiciones hipóxicas, el tratamiento con aspirina condujo a un mayor aumento de los niveles intracelulares de glutamina en las células PIK3CA-MT HCT116, mientras que no se observó un efecto aditivo en las células PIK3CA-WT (Fig. 3A, B). Estos resultados indican que la hipoxia potencia de forma aditiva el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina, con un efecto más pronunciado observado en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT.

Investigamos más a fondo el mecanismo subyacente a la elevación de los niveles intracelulares de glutamina inducida por la aspirina en las células de cáncer de colon PIK3CA-MT bajo condiciones de hipoxia. Utilizamos L-MS, un inhibidor de la glutamina sintetasa, y V-9302, un inhibidor del transportador de glutamina ASCT2, para examinar la regulación de la dinámica de la glutamina en respuesta al tratamiento con aspirina (Fig. S4). En las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HCT116, los niveles intracelulares de glutamina disminuyeron tras el tratamiento con L-MS y V-9302. Además, ambos fármacos contrarrestaron el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina (Fig. 4A, B). Estos hallazgos sugieren que el aumento de los niveles intracelulares de glutamina inducido por la aspirina está regulado tanto a nivel de la síntesis de novo como de la importación desde el entorno extracelular. La glutaminólisis promueve la generación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) a través de la degradación del glutamato mediada por la glutamato deshidrogenasa (GLUD), contribuyendo así a la homeostasis de las especies reactivas del oxígeno (ROS)^[39]. Observamos que los niveles de ROS aumentaron tras la exposición a la aspirina en las células PIK3CA-MT HCT116. Cabe destacar que el cotratamiento con aspirina y V-9302 o L-MS produjo un aumento aún más pronunciado de los niveles intracelulares de ROS (Fig. S5A, B), lo que revela una asociación fenomenológica entre el aumento de los niveles intracelulares de ROS y la reducción de la viabilidad celular tras el cotratamiento. Si bien estos hallazgos sugieren que el estrés oxidativo puede acompañar a los efectos inhibidores del crecimiento, el papel causal definitivo aún debe dilucidarse.

V-9302 reduce el crecimiento de células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT cuando se combina con aspirina

Se informa que la alteración del metabolismo de la glutamina es una estrategia novedosa para la terapia del cáncer en tumores hematológicos y sólidos dependientes de la glutamina, incluido el cáncer colorrectal PIK3CA-MT^[40]–^[42]. Tratamos células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT con aspirina en combinación con V-9302 en condiciones normóxicas (20% O2, NO) e hipóxicas (1% O2, HY). La combinación de aspirina y V-9302, tanto en condiciones normóxicas como hipóxicas, produjo una inhibición más pronunciada del crecimiento celular en comparación con el tratamiento único en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT HCT116 y PIK3CA-MT DLD-1 (Fig. 5A–D). Además, el ensayo de formación de colonias en células HCT116 confirmó el efecto antitumoral combinado (Fig. 6A-D). Sin embargo, la combinación de aspirina y L-MS no mostró ningún efecto inhibidor sobre la proliferación celular, en comparación con L-MS solo (Fig. S6). Estos resultados sugieren que la inhibición de los transportadores implicados en la vía de la glutamina mejoró la eficacia de la aspirina en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT.

Discusión

Anteriormente, informamos que la glutamina es esencial para el crecimiento de las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT y que el efecto inhibidor de la aspirina sobre el crecimiento depende de la presencia de glutamina^[21]. En este estudio, nos centramos en investigar los mecanismos a través de los cuales la aspirina modula el comportamiento de la glutamina en condiciones hipóxicas prevalentes en el microentorno tumoral. Los resultados demostraron que la aspirina ejerció un efecto antitumoral incluso en condiciones hipóxicas en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT y que su combinación con fármacos que redujeron los niveles intracelulares de glutamina mejoró sus efectos antitumorales.

En promedio, el nivel de oxígeno dentro de los tumores es aproximadamente un 1-2% menor que en los tejidos normales^[43]. Se ha detectado la sobreexpresión de HIF-1, un regulador maestro implicado en la adaptación celular a la hipoxia, tanto en las lesiones de cáncer colorrectal primarias como en las metastásicas^[44]. La heterogeneidad intratumoral y las mutaciones en TP53, APC, KRAS y PIK3CA están asociadas positivamente con la hiperactivación de la señalización de la hipoxia^[45],^[46]. La importancia clínica de las mutaciones de PIK3CA como biomarcador predictivo de la eficacia de la aspirina ha sido objeto de un intenso debate. Los resultados recientes del estudio ALASCCA (Martling et al., 2025) y las directrices actualizadas de la NCCN sugieren que el contexto metabólico subyacente es crucial para identificar el subgrupo que responde^[13]. Nuestro estudio proporciona una base mecánica para estas observaciones, mostrando que el efecto sinérgico de la aspirina y la hipoxia está mediado por alteraciones en el metabolismo de la glutamina.

La glutamina desempeña un papel crucial en el crecimiento y la supervivencia de diversos tumores hematológicos y sólidos^[47],^[48]. En condiciones normales, la glucosa se convierte en acetil-CoA, que entra en el ciclo de Krebs. Sin embargo, las células cancerosas exhiben el efecto de Warburg, convirtiendo la glucosa en lactato incluso en presencia de oxígeno, y dependen de la glutamina para reponer el ciclo de Krebs^[49]. Este proceso proporciona la energía necesaria para la proliferación celular y regula la fosforilación oxidativa, la biosíntesis de nucleótidos, la homeostasis redox y la homeostasis de las ROS. Como tal, la glutamina contribuye activamente al crecimiento y la supervivencia del tumor, particularmente en condiciones hipóxicas^[50].

El estrés oxidativo, caracterizado por un desequilibrio entre las ROS y los antioxidantes, se ha relacionado con el cáncer y diversas otras patologías^[51]. Las ROS pueden ejercer efectos paradójicos sobre la evolución del cáncer, ya sea iniciando/estimulando la tumorigénesis y apoyando la transformación/proliferación de las células cancerosas o induciendo la muerte celular^[52]. En nuestro estudio, confirmamos las alteraciones en el equilibrio de las ROS inducidas por la aspirina, V-9302 y L-MS (Fig. 5C, D). Si bien existen informes contradictorios con respecto a la generación de ROS en células tratadas con AINE^[53], se ha informado que las células de cáncer de colon exhiben una mayor generación de ROS que otros tipos de células cancerosas^[54],^[55], lo que es consistente con los hallazgos de nuestro estudio actual. Los precursores, como el glutamato y la cisteína, están directamente involucrados en la regulación de la homeostasis de las ROS al proporcionar la síntesis de glutatión y promover la producción de NADPH a través de GLUD^[39]. Creemos que este mecanismo puede explicar el aumento de los niveles de ROS observados en las células expuestas a V-9302 (Fig. 5C). L-MS, un inhibidor de la glutamina sintetasa, no aumentó los niveles de ROS cuando se usó solo; sin embargo, aumentó los niveles de ROS cuando se usó en combinación con aspirina (Fig. 5D). En cuanto a la evaluación de las ROS, nos centramos en el fenómeno oxidativo total en lugar de en las tasas de producción por célula. Dado que la siembra inicial fue uniforme, el aumento observado en RLU total refleja la acumulación neta de ROS, que creemos que es el principal impulsor de la respuesta antitumoral. Se evitó intencionalmente la normalización mediante el recuento de células después del tratamiento para evitar el enmascaramiento matemático del estrés oxidativo total que impulsa la muerte celular. Dado que no se realizaron experimentos de rescate con antioxidantes, la causalidad directa entre las ROS y la eficacia antitumoral sigue siendo un tema para futuras investigaciones.

Nuestro estudio demostró que los niveles intracelulares de glutamina se incrementaron con la aspirina, especialmente en condiciones hipóxicas (Fig. 4). El cáncer colorrectal PIK3CA-MT depende de la glutamina para el crecimiento y la supervivencia^[21], y el aumento de la glutamina intracelular puede contribuir a la resistencia a los fármacos. Estos hallazgos pueden conciliarse con informes recientes de Holt et al. (2023), quienes demostraron mediante el rastreo de isótopos que, si bien la aspirina disminuyó la glutaminólisis, paradójicamente condujo a una acumulación de glutamina intracelular si la utilización posterior se vio más afectada que la captación^[56]. Nuestros datos metabolómicos estáticos reflejan este equilibrio neto, lo que sugiere que, en condiciones de estrés metabólico, la captación puede superar la utilización. Por lo tanto, proponemos que la combinación de fármacos que reducen los niveles de glutamina intracelular con aspirina puede mejorar el efecto antitumoral de la aspirina. Nuestros resultados indicaron que L-MS no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular con o sin hipoxia, pero V-9302 influyó en la proliferación celular, particularmente en combinación con aspirina (Fig. 6).

V-9302 es un antagonista competitivo de molécula pequeña que se dirige selectiva y potentemente al flujo de glutamina transmembrana al dirigirse específicamente al transportador de aminoácidos ASCT2 (SLC1A5)^[41]. Dada la función crítica de la glutamina en el crecimiento y la homeostasis de las células cancerosas, las nuevas terapias dirigidas al metabolismo de la glutamina han demostrado tener un potencial anticancerígeno. Sin embargo, los esfuerzos actuales en este campo han encontrado un éxito limitado^[40],^[42]. Una estrategia que se está evaluando actualmente en ensayos clínicos de fase temprana se centra en la glutaminasa mitocondrial (GLS1), una enzima responsable de convertir la glutamina en glutamato (por ejemplo, CB-839 de Calithera Biosciences)^[40]. Se ha informado que los niveles de GLS1 aumentan después de la inhibición de mTOR^[57],^[58], y previamente propusimos la combinación de un inhibidor de GLS y aspirina, un inhibidor de mTOR, para el tratamiento del cáncer colorrectal PIK3CA-MT. Aunque prometedora, esta estrategia tiene limitaciones, ya que no aborda completamente los roles extramitocondriales de la glutamina, que incluyen la activación independiente de RAS de la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos^[59].

Nuestra hipótesis es que la inhibición del transporte intracelular de glutamina a través de ASCT2, como con V-9302, puede ser una estrategia más eficaz para dirigirse al metabolismo de la glutamina en las células cancerosas PIK3CA-mutadas que dirigirse a las actividades enzimáticas posteriores, como GLS1 o la glutamina sintetasa. Si bien L-MS inhibe la síntesis de glutamina de novo a partir del glutamato, no bloquea la captación de glutamina del entorno extracelular. En nuestro estudio, el tratamiento con L-MS tuvo un impacto limitado en la proliferación celular, mientras que V-9302 mejoró significativamente los efectos antitumorales de la aspirina. Estos hallazgos sugieren que, cuando se someten a estrés metabólico, inducido por la combinación de aspirina e hipoxia, las células de cáncer colorrectal PIK3CA-mutadas parecen depender predominantemente de la captación de glutamina extracelular en lugar de la síntesis de novo para mantener los niveles de glutamina intracelular, como lo demuestra su alta sensibilidad a V-9302.

Este estudio tiene varias limitaciones que deben reconocerse. En primer lugar, no pudimos evaluar los mecanismos a través de los cuales los antecedentes mutacionales adicionales, particularmente en el contexto de las mutaciones PIK3CA, o el entorno inmunitario pueden alterar los efectos de la aspirina. Las mutaciones PIK3CA están asociadas con la expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario^[60], y, por lo tanto, también es esencial investigar el impacto de la aspirina en las células inmunitarias. Además, Kerk et al. informaron que RAS promueve el metabolismo de la glutamina, lo que destaca la importancia de evaluar las co-mutaciones con las mutaciones PIK3CA en futuras investigaciones^[61]. En segundo lugar, si bien se informa que V-9302 es altamente selectivo, no podemos excluir por completo la posibilidad de posibles efectos fuera del objetivo inherentes a los inhibidores de moléculas pequeñas. Nuestras conclusiones con respecto a la causalidad específica de ASCT2 deben considerarse como observaciones farmacológicas que justifican una mayor validación utilizando enfoques genéticos para el silenciamiento de genes, como los métodos basados en siRNA o CRISPR, para confirmar definitivamente la especificidad de estos hallazgos.

En tercer lugar, nuestros hallazgos con respecto a la posible regulación al alza de los transportadores de glutamina se basan principalmente en datos a nivel de ARNm. Si bien intentamos la validación a nivel de proteínas para ASCT2 mediante Western blot, la proteína se detectó como una mancha difusa, probablemente debido a la N-glucosilación. Esta limitación técnica impidió la cuantificación densitométrica precisa, pero creemos que las alteraciones significativas en la acumulación real de glutamina intracelular proporcionan una base funcional convincente para nuestras conclusiones.

En cuarto lugar, con respecto a nuestro análisis de ROS, reconocemos la limitación de proporcionar valores de RLU brutos en lugar de tasas de producción por célula. Además, dado que no se realizaron experimentos de rescate con antioxidantes en este estudio, la acumulación de ROS observada sigue siendo un fenómeno asociado en lugar de un mediador causal probado de la muerte celular. Establecer una relación causal directa entre este estrés metabólico y la eficacia antitumoral sigue siendo un tema para futuras investigaciones.

Con respecto a nuestras condiciones experimentales, la concentración de aspirina utilizada en este estudio (2 mM) excede los niveles fisiológicos que normalmente se alcanzan en el plasma humano. Sin embargo, esta concentración es consistente con estudios mecanicistas in vitro previos y fue necesaria para capturar los cambios metabólicos agudos. Se justifican estudios futuros que utilicen modelos más fisiológicamente relevantes o exposición a largo plazo a dosis bajas para relacionar aún más estos hallazgos con la clínica.

En general, nuestros hallazgos sugieren que la aspirina puede mejorar la vulnerabilidad metabólica a la inhibición de la captación de glutamina, lo que proporciona una base prometedora para combinar la aspirina con agentes que se dirigen al transporte de glutamina. Sin embargo, una limitación importante del estudio actual es que nuestras observaciones se realizaron exclusivamente utilizando sistemas de cultivo in vitro. El microentorno tumoral in vivo implica interacciones complejas entre las células cancerosas, los componentes del estroma y el sistema inmunitario, junto con gradientes fluctuantes de nutrientes y oxígeno que no se capturaron completamente en nuestros modelos. Por lo tanto, son esenciales más investigaciones in vivo, incluidos estudios que utilicen modelos de xenoinjerto de ratón o xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) de cáncer colorrectal PIK3CA-mutado, para validar la eficacia y la seguridad de este enfoque combinatorio. Dicha validación será un paso fundamental para traducir estas estrategias metabólicas en aplicaciones clínicas eficaces para pacientes con cáncer colorrectal PIK3CA-mutado.

Conclusiones

La metabolómica dirigida demostró que el tratamiento con aspirina y la estimulación hipóxica aumentaron aditivamente los niveles de glutamina intracelular en las células de cáncer colorrectal PIK3CA-MT. Este hallazgo sugiere el potencial de que la hipoxia inhiba la eficacia de la aspirina contra el cáncer colorrectal PIK3CA-MT. Además, nuestros hallazgos destacan que la eficacia antitumoral de la aspirina se puede mejorar al dirigirse a la glutamina en el cáncer colorrectal PIK3CA-MT.

Información complementaria

A continuación, se muestra el enlace al material complementario electrónico.