La inhibición del andamiaje de la tanquirasa en el complejo de destrucción de la β-catenina mediante PROTAC supera las limitaciones de los inhibidores catalíticos en el cáncer.

La señalización WNT/β-catenina desempeña un papel importante en el crecimiento, la diferenciación y la migración celular^[1],^[2]. La desregulación de esta vía permite que las células cancerosas reprogramadas proliferen, metastaticen y resistan a la quimioterapia y la radioterapia. En el cáncer colorrectal (CCR), las mutaciones de pérdida de función en el gen adenomatosis poliposis coli (APC) son los principales impulsores de la señalización aberrante de WNT/β-catenina^[3]. Sin embargo, la inhibición terapéutica de esta vía oncogénica sigue siendo infructuosa a pesar de los extensos esfuerzos^[4]. Por ejemplo, aunque el silenciamiento de la tanquirasa (TNKS1/2, también conocida como PARP5A/B y ATRD5/6)^[5]–^[7] imitó la restauración de APC y previno la tumorigénesis en ratones APC-nulos^[8], los inhibidores de TNKS (TNKSi) no mostraron una eficacia prometedora en varios modelos de CCR in vitro e in vivo. Abordar la discrepancia entre la intercepción genética y farmacológica de la señalización WNT/β-catenina a través de TNKS puede proporcionar una vía para desarrollar nuevos tratamientos para el CCR.

La proteína de inhibición del eje (AXIN) y APC son ambas proteínas de andamiaje del complejo de destrucción de β-catenina (DC) que existe como condensados biomoleculares en el citoplasma para preparar la β-catenina para la degradación proteasómica^[9]–^[11]. Dado que la poli(ADP-ribosil)ación dependiente de TNKS (PARdU) es necesaria para la renovación de AXIN^[12]–^[14], el bloqueo de la función enzimática de TNKS mediante IWR1 o XAV939 conduce a la acumulación de AXIN^[12],^[15], mejorando así la capacidad del DC para promover la degradación de β-catenina. La formación de puntos de AXIN que acompaña generalmente se atribuye a la acumulación de AXIN y se considera que desempeña un papel positivo en la supresión de la señalización WNT/β-catenina. Sin embargo, TNKS también se asocia con el DC^[16],^[17], donde sus contribuciones a la función del DC aún no se comprenden bien. Específicamente, dado que TNKS regula su propia abundancia a través de la auto-poli(ADP-ribosilación) (PARilación), la inhibición catalítica también promueve una acumulación drástica de TNKS^[12]. No está claro si este mecanismo de retroalimentación afecta la función del DC y da como resultado la eficacia antitumoral limitada de los TNKSi, ya que la acumulación de TNKS inducida por el inhibidor puede respaldar la señalización WNT/β-catenina a través del andamiaje molecular independientemente de su función catalítica. De hecho, la deleción del dominio PARP catalítico de TNKS atenuó, pero no suprimió por completo la transcripción de los genes controlados por TCF/LEF inducida por WNT^[18],^[19]. Por el contrario, la eliminación del dominio del motivo alfa estéril (SAM) o de los grupos de repetición de anquirina (ARCs) de TNKS abolió la actividad de la vía WNT/β-catenina de manera más completa.

Para comprender el papel del andamiaje de TNKS en la señalización WNT/β-catenina, desarrollamos una quimera de proteólisis dirigida a TNKS (PROTAC)^[20],^[21] como un degradador selectivo de TNKS (TNKSd). La comparación entre TNKSd y TNKSi nos permitió comprender la función de andamiaje independiente de la catálisis de TNKS y descubrir el mecanismo subyacente a la ineficacia de los TNKSi contra el cáncer. Descubrimos que la inhibición de TNKS por TNKSi condujo a la acumulación de TNKS dentro del DC, lo que indujo la formación de puntos de AXIN, promovió la maduración^[22],^[23] de los condensados del DC e impidió la renovación de β-catenina. En contraste, la degradación de TNKS por TNKSd enriqueció AXIN sin inducir puntos ni afectar la dinámica del DC. Como resultado, TNKSd proporcionó una supresión más profunda de la actividad de la vía WNT/β-catenina, así como un mejor control de la proliferación de las células de CCR que albergan mutaciones de APC disfuncionales. En conjunto, nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los roles de TNKS en el DC y presenta una estrategia prometedora para mejorar la eficacia terapéutica de los tratamientos anticancerígenos dirigidos a TNKS.

Resultados

IWR1-POMA induce la degradación de TNKS

Para estudiar el papel del andamiaje de TNKS, primero desarrollamos una molécula PROTAC para permitir la degradación selectiva de TNKS1 y TNKS2 al mismo tiempo mediante pequeñas moléculas. En comparación con los enfoques genéticos convencionales, este enfoque químico ayuda a abordar la redundancia de los genes de manera más conveniente y efectiva. TNKS utiliza el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) como donante de ADP-ribosa. El bolsillo correspondiente en el dominio PARP contiene dos sitios discretos, uno para la nicotinamida (NI) y el otro para la unión de adenosina (AD). IWR1 es un TNKSi altamente selectivo que explota el sitio AD único de TNKS, e IWR6 es un TNKSi promiscuo pero potente estructuralmente similar a XAV939 que se une al sitio NI común a todas las PARPs^[12],^[24]. Basándonos en las estructuras de cristal de TNKS1 y TNKS2 en complejo con IWR1 o XAV939 (Figura S1), imaginamos que la modificación del grupo quinolina de IWR1 y el grupo fenilo de IWR6 no afectaría negativamente la unión a TNKS. Por lo tanto, hemos creado una pequeña biblioteca de 30 moléculas PROTAC uniendo pomalidomida^[25] o VH032^[26] a través de una cadena de PEG de varias longitudes a IWR1 o IWR6 (Figura S2A) para interactuar con cereblona (CRBN) o la proteína supresora de tumores de von Hippel-Lindau (VHL), respectivamente, y examinamos su capacidad para inducir la degradación de TNKS.

Para facilitar el descubrimiento de un TNKSd, también desarrollamos un ensayo de luciferasa para medir el nivel de TNKS1 de una manera de alto rendimiento. Utilizando la tecnología de inserción asistida por CRISPR (CRISPaint)^[27], introdujimos una etiqueta de nanoluciferasa (NanoLuc) en el extremo C-terminal de TNKS1 en células HAP1 (Figura S2B). Elegimos monitorear TNKS1 porque se expresa constitutivamente, mientras que TNKS2 se expresa mínimamente sin inducción. Al seguir la actividad de la luciferasa, la eficiencia de la eliminación de todos los 5 grupos de moléculas PROTAC se puede cuantificar de manera fácil y precisa utilizando un dispensador de líquidos robótico en placas de 96 pocillos, lo que mejoró significativamente la eficiencia en comparación con el método tradicional que se basa en la inmunodetección y el procesamiento de imágenes. Utilizando este ensayo de luciferasa, encontramos que las PROTAC basadas en IWR1 eliminaron TNKS1 de manera significativamente más efectiva que las PROTAC basadas en IWR6 (Figura S2C). Además, la mediación por CRBN de la degradación de TNKS1 fue más eficiente que la mediación por VHL. La inserción de un grupo triazol entre el grupo quinolina y la cadena de PEG mejoró aún más la eficiencia de la degradación. Sin embargo, reemplazar el enlazador de PEG con un enlazador no polar o rígido no mejoró la eficacia. Mientras tanto, el uso de G007-LK^[28] como la cabeza de lanza con varias estrategias de enlazador condujo a una menor potencia y grado de degradación.

IWR1-TP4-Poma (IWR1-POMA en adelante) es la PROTAC más potente entre estas series. Inició la degradación de TNKS1 a 1 nM, operó con un DC50 de 60 nM y alcanzó una degradación del 96% a 1,2 μM en células HAP1 (Figura 1A). El análisis de inmunodetección confirmó que IWR1-POMA también pudo agotar TNKS1 y suprimir la inducción de TNKS2 de manera dependiente de la dosis y el tiempo en las células de CCR DLD-1 que portan mutaciones de APC truncantes (Figura 1B y C). El nivel de TNKS no se recuperó 36 horas después de que se eliminó IWR1-POMA, lo que indica un efecto farmacológico duradero (Figura S3A). La adición de IWR1, pomalidomida o MG132 bloqueó la degradación de TNKS (Figura S3B y C), lo que apoya que IWR1-POMA funcionó a través del modo de acción diseñado. La generalidad de IWR1-POMA para inducir la degradación de TNKS se demostró en células SW480, HT-29 y HeLa (Figura S3D). La capacidad de IWR1-POMA para estabilizar AXIN y promover la degradación de β-catenina en el citoplasma se confirmó además en células HEK293 (Figura 1D). En comparación con IWR1, IWR1-POMA proporcionó un mejor control del nivel de β-catenina citosólica. El rendimiento de esta molécula PROTAC es particularmente notable, considerando que el cierre de la catálisis de TNKS conduce a una acumulación de más de 30 veces de TNKS total, creando una diferencia de casi 3 órdenes de magnitud en los niveles de TNKS entre la inhibición catalítica y la degradación inducida químicamente. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de degradación dirigida de una proteína autorregulada.

Para examinar la especificidad de degradación de IWR1-POMA, realizamos un perfil de expresión a nivel de proteoma en células DLD-1 tratadas con DMSO, IWR1 o IWR1-POMA durante 16 horas. Utilizando un enfoque de espectrometría de masas (MS) cuantitativa multiplexada basada en etiquetas de tándem (TMT) con dos muestras biológicamente independientes (Figura S4A), identificamos 7.884 proteínas, entre las cuales 5.822 pudieron cuantificarse con alta confianza (30 veces, lo que crea una diferencia de casi 3 órdenes de magnitud en los niveles de TNKS entre la inhibición catalítica y la degradación inducida químicamente. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de degradación dirigida de una proteína autorregulada.

Para examinar la especificidad de la degradación de IWR1-POMA, realizamos un perfilado de expresión a nivel de proteoma en células DLD-1 tratadas con DMSO, IWR1 o IWR1-POMA durante 16 horas. Utilizando un enfoque de espectrometría de masas (MS) cuantitativa multiplexada basada en etiquetas de tándem (TMT) con dos muestras biológicamente independientes (Figura S4A), identificamos 7.884 proteínas, entre las cuales 5.822 pudieron cuantificarse con alta confianza (