Un estudio exploratorio in vitro de la citotoxicidad y el perfil de citoquinas de las células asesinas inducidas por citoquinas (CIK) contra las células de cáncer colorrectal (CRC) HCT-15.

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer gastrointestinal (GI) en todo el mundo. Según el informe de 2022 de la Observatorio Mundial del Cáncer (GLOBOCAN) de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), el cáncer colorrectal (CCR) se encuentra entre los tres tipos de cáncer más comunes y es la principal causa de mortalidad por cáncer gastrointestinal. En 2022, se estimaron 1,9 millones de nuevos casos de CCR y más de 900.000 muertes a nivel mundial.^[1] A pesar de los avances en la quimioterapia, la resistencia terapéutica y la progresión de la enfermedad, que limitan las opciones de tratamiento para la enfermedad en etapa avanzada, siguen siendo importantes desafíos clínicos.^[1],^[2] Además, la mayoría de los CCR, en particular los subtipos con microsatélites estables, se consideran tumores inmunológicamente "fríos", caracterizados por un bajo número de linfocitos infiltrantes tumorales y una respuesta limitada al bloqueo de puntos de control inmunitarios.^[3],^[4] Estas limitaciones han impulsado un creciente interés en las estrategias inmunoterapéuticas, en particular en la terapia celular adoptiva, como un enfoque alternativo para mejorar la inmunidad antitumoral en el CCR.

Las células asesinas inducidas por citocinas (CIK) son una población heterogénea de células efectoras inmunitarias caracterizadas por su citotoxicidad no restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y su capacidad para atacar una amplia gama de células tumorales.^[5],^[6] Están compuestas principalmente por células T (CD3⁺CD8⁺), células T asesinas naturales (NKT) (CD3⁺CD56⁺) y un subconjunto de células asesinas naturales (NK) (CD3−CD56⁺).^[5] Las células CIK se pueden expandir in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante la activación con interferón-γ (IFN-γ) y anticuerpos anti-CD3, seguida de la estimulación con interleucina-2 (IL-2).^[5] En condiciones de cultivo optimizadas, las células CIK pueden experimentar una expansión sustancial manteniendo una potente actividad citotóxica.^[7],^[8] Su mecanismo de eliminación no restringido por el CMH las hace particularmente atractivas para atacar tumores con baja inmunogenicidad, como el CCR.^[7]

Además de la estimulación por citocinas, el microambiente desempeña un papel importante en la regulación del comportamiento de las células inmunitarias durante la expansión ex vivo. Los componentes de la matriz extracelular (MEC), como la laminina, favorecen la adhesión celular e influyen en la activación, proliferación y supervivencia celular a través de las vías de señalización mediadas por integrinas.^[9],^[10] Se ha demostrado que estas interacciones entre la MEC y las células inmunitarias modulan la función y la capacidad de respuesta de las células inmunitarias.^[11] Por lo tanto, la incorporación de sustratos que imitan la MEC durante el cultivo puede proporcionar una plataforma de apoyo para mejorar la expansión y la funcionalidad de las células CIK. Las células CIK ejercen efectos antitumorales a través de múltiples mecanismos, que incluyen la citotoxicidad mediada por NKG2D, la adhesión dependiente del antígeno de función leucocitaria-1 (LFA-1) a las células tumorales y la apoptosis inducida por el ligando de Fas (FasL).^[5]

Más allá de la citotoxicidad directa, las células CIK modulan activamente el microambiente inmunitario a través de la secreción de citocinas y quimiocinas. Tras la estimulación tumoral, se regulan al alza las citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, el IFN-γ y la IL-2, lo que contribuye a la activación inmunitaria y al reclutamiento de células efectoras.^[8] También aumentan los ligandos citotóxicos, como el FasL y el ligando inductor de apoptosis relacionado con el TNF (TRAIL), que inducen la muerte de las células tumorales. La evidencia emergente sugiere que el entorno de citocinas desempeña un papel fundamental en la configuración de las interacciones tumor-inmunitarias al regular el reclutamiento, la activación y los mecanismos inmunosupresores de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral.^[12] Sin embargo, a pesar del creciente interés en la terapia con células CIK, el perfil completo de las respuestas de las citocinas en el contexto del CCR, en particular en relación con las interacciones tumor-inmunitarias, sigue estando insuficientemente caracterizado.

Estudios preclínicos y clínicos previos han demostrado el potencial terapéutico de las células CIK en las neoplasias gastrointestinales, incluido el CCR.[13–15] En particular, las estrategias de combinación que integran las células CIK con la quimioterapia han mostrado resultados prometedores en la mejora de la eficacia antitumoral y, posiblemente, en la superación de la resistencia a los fármacos.^[14],^[16] Sin embargo, los mecanismos inmunomoduladores subyacentes, especialmente aquellos relacionados con las redes de citocinas dentro del microambiente tumoral, no se comprenden completamente. Una caracterización más detallada de estas interacciones mediadas por citocinas puede proporcionar información importante para optimizar las terapias basadas en células CIK e identificar posibles biomarcadores de respuesta.

Por lo tanto, este estudio exploratorio tuvo como objetivo (1) generar células CIK Cytopeutics® a partir de pacientes con CCR metastásico y donantes sanos, (2) comparar su citotoxicidad contra la línea celular HCT-15, (3) evaluar los efectos citotóxicos mejorados de las células CIK Cytopeutics® en combinación con fluorouracilo (5-FU), que es un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado y la base de los regímenes de tratamiento estándar para el cáncer colorrectal, y (4) identificar los factores de crecimiento y las citocinas asociadas con la actividad antitumoral. Estos hallazgos proporcionan información preliminar sobre la viabilidad y el potencial mecanicista de la inmunoterapia basada en células CIK para el CCR.

Materiales y Métodos

Líneas celulares

La línea celular de cáncer colorrectal (CCR) humana HCT-15 se obtuvo del Banco de Cultivos Celulares Americano (ATCC; EE. UU.). Se ha informado que HCT-15 alberga una mutación de KRAS y se utiliza ampliamente como modelo in vitro de CCR para investigar la biología tumoral y las respuestas a los agentes terapéuticos.^[17],^[18] Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (SFB) y un 1% de solución antibiótico-antimicótica (todos de Gibco, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2 (Memmert GmbH, Alemania).

Grupo de estudio

Se recolectaron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de tres donantes sanos y un paciente con CCR en estadio IV. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Médico de Investigación y Ética (MREC), Ministerio de Salud de Malasia (MOH) (Número de aprobación: 24-03956-VSD) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (1975, revisada en 2013). Las identidades de los donantes se anonimizaron (Tabla 1).

Generación de células CIK

Las células CIK se generaron según lo descrito previamente.^[19] Las PBMC se aislaron utilizando el medio de gradiente de densidad Lymphoprep™ (STEMCELL Technologies, Canadá) y se cultivaron en un matraz de 175 cm² recubierto con laminina que contenía el medio de expansión de células T LymphoOne (Takara Bio, Japón), suplementado con plasma autólogo inactivado por calor. Se utilizaron matraces de cultivo recubiertos con laminina para proporcionar un sustrato que imita la MEC que facilita la adhesión celular y favorece la expansión celular en condiciones ex vivo a través de las vías de señalización mediadas por integrinas.^[10] Las culturas se activaron con IFN-γ humano recombinante (PeproTech, EE. UU.) a una dosis total de 1000 UI por cultura durante 24 horas, seguida de la estimulación con 400 ng/mL de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (T&L Biological Technology Co., Ltd, China) y 1000 U/mL de IL-2 humano recombinante (Four Rings Bio-Pharmaceutical Co., Ltd, China). Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2 durante 21 días, reponiendo el medio LymphoOne y la IL-2 cada 2 a 3 días.

Caracterización fenotípica de las células CIK

Después de 21 días de cultivo, se recolectaron las células CIK y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de células T CD3⁺CD8⁺, células NKT CD3⁺CD56⁺ y células NK CD3−CD56⁺. Se utilizaron un total de 5 × 10⁵ células y se tiñeron con anticuerpos anti-humanos: CD3-APC, CD8-FITC y CD56-PE durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavaron dos veces y se tiñeron con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) para evaluar la viabilidad. Los datos de 100.000 eventos por muestra se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSLyrics™ y se analizaron con el software FACSuite™ Clinical Software (todos de BD Biosciences, EE. UU.).

Ensayo de citotoxicidad in vitro de las células CIK del donante sano 1 contra las células HCT-15

La citotoxicidad de las células CIK contra las células HCT-15 se evaluó utilizando el ensayo MTT en proporciones efector:objetivo (E:O) que oscilaron entre 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:2 y 1:5. Las células HCT-15 se sembraron durante la noche en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5000 células/pocillo. Las células CIK derivadas del donante sano 1 se recolectaron y se resuspendieron en medio de expansión de células T LymphoOne suplementado con plasma autólogo inactivado por calor y 1000 U/mL de IL-2 humano recombinante, y se añadieron a los pocillos en las proporciones E:O designadas en un volumen igual al del medio de las células objetivo. Después de 72 horas de cocultivo a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2, las células CIK se eliminaron cuidadosamente mediante un lavado suave con PBS para eliminar las células efectoras no adheridas. Posteriormente, se añadió bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil tetrazolio (MTT) a cada pocillo para alcanzar una concentración final de 0,5 mg/mL y la placa se incubó durante 4 horas. Los cristales de formazán se solubilizaron con 150 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) y se midió la absorbancia a 570 nm (Infinite® M200 PRO; Tecan, Suiza). La viabilidad celular se normalizó con respecto al control de HCT-15 no tratado.

Se utilizó el ensayo MTT para evaluar la viabilidad celular; sin embargo, refleja principalmente la actividad metabólica en lugar de la muerte celular directa. Por lo tanto, los resultados deben interpretarse como una medida indirecta de la citotoxicidad en los sistemas de cocultivo.

Ensayo de citotoxicidad in vitro de las células CIK del donante sano 2 en combinación con 5-FU contra las células HCT-15

Para evaluar el efecto combinatorio del 5-fluorouracilo (5-FU) con las células CIK, las células HCT-15 (10.000 células/pocillo) se sembraron durante la noche en una placa de 96 pocillos y se pretrataron con 5-FU (0,050, 0,075 o 0,100 mg/mL) durante 24 horas. Las células CIK derivadas del donante sano 2 se recolectaron, se resuspendieron en medio LymphoOne suplementado con plasma autólogo inactivado por calor y 1000 U/mL de IL-2 y se cocultivaron con las células HCT-15 a proporciones E:O de 1:5, 1:1, 10:1 y 20:1 durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2. Se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente. La viabilidad celular se expresó en relación con el control de HCT-15 no tratado.

Comparación de la citotoxicidad de las células CIK del donante sano 3 frente a las células del paciente con CCR contra las células HCT-15

Las células CIK derivadas del donante sano 3 y de un paciente con CCR metastásico se cocultivaron con las células HCT-15 (5000 células/pocillo) a proporciones E:O de 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:2 y 1:5 durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2. Después de la incubación, se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente para determinar la citotoxicidad relativa entre las células CIK derivadas del donante y del paciente.

Ensayo de perfil proteómico

Se utilizó el kit de matriz de citocinas y quimiocinas humanas XL del perfil proteómico (R&D System, EE. UU.) para identificar los niveles relativos de 105 citocinas y quimiocinas humanas diferentes en el medio acondicionado del cocultivo CIK:HCT-15, siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HCT-15 (150.000 células/pocillo) se sembraron durante la noche en una placa de 6 pocillos. Las células CIK del donante sano 3 se añadieron a proporciones E:O de 1:1 y 10:1 y se cultivaron durante 72 horas. Se recolectaron los medios acondicionados (supernatante) del cocultivo de CIK solamente, HCT-15 solamente y CIK:HCT-15 y se centrifugaron a 5000 g durante 10 minutos. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales de quimioluminiscencia se visualizaron utilizando el sistema de imágenes iBright™ FL1500 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y la densidad de píxeles se cuantificó utilizando el software de análisis iBright™ con la intensidad de fondo sustráida.

Anotación funcional de proteínas y análisis de enriquecimiento

Se realizó la anotación funcional y el análisis de enriquecimiento de las proteínas reguladas de forma significativa utilizando la Base de datos para la anotación, visualización y descubrimiento integrado, versión 6.7 (DAVID v6.7; EE. UU.) para la clasificación de la ontología génica (GO).^[20],^[21] Las listas de genes correspondientes se asignaron a la base de datos de referencia Homo sapiens para identificar los procesos biológicos, las funciones moleculares y los componentes celulares enriquecidos. Posteriormente, se analizaron las interrelaciones entre las proteínas reguladas de forma significativa identificadas en el ensayo de citocinas utilizando la Herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes (STRING; versión 12.0; https://string-db.org/).^[22] Se construyeron redes de interacción proteína-proteína (PPI) con una tasa máxima de falsos descubrimientos (FDR) de 0,05 y un umbral de fuerza mínimo de 0,01.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism (versión 9.0; GraphPad Software, Inc., EE. UU.) y se presentaron como media ± desviación estándar (DE) de los triplicados técnicos de cada donante. Se realizaron análisis estadísticos según lo apropiado para cada experimento. Los ensayos de citotoxicidad que involucraron comparaciones de una sola variable se analizaron utilizando ANOVA de una vía, mientras que los ensayos de tratamiento combinado (células CIK + 5-FU) se analizaron utilizando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las comparaciones de la actividad citotóxica entre las células CIK derivadas de un paciente con CRC y donantes sanos se realizaron utilizando una prueba t independiente. La inmunofenotipificación de las células CIK y los datos del ensayo de citocinas se analizaron utilizando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey. La significación estadística se estableció en p < 0,05.

Líneas celulares

La línea celular humana de cáncer colorrectal (CRC) HCT-15 se obtuvo de la Colección de cultivos celulares americanos (ATCC; EE. UU.). Se ha informado que HCT-15 alberga una mutación de KRAS y se utiliza ampliamente como modelo in vitro de CRC para investigar la biología tumoral y las respuestas a los agentes terapéuticos.^[17],^[18] Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SFB) y un 1% de solución antibiótica-antimicótica (todo de Gibco, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 (Memmert GmbH, Alemania).

Grupo de estudio

Se recolectaron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de tres donantes sanos y un paciente con CRC en estadio IV. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Médica y Ética (MREC), Ministerio de Salud de Malasia (MOH) (Número de aprobación: 24-03956-VSD) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki (1975, revisada en 2013). Las identidades de los donantes se anonimizaron (Tabla 1).

Generación de células CIK

Las células CIK se generaron según lo descrito previamente.^[19] Las PBMC se aislaron utilizando el medio de gradiente de densidad Lymphoprep™ (STEMCELL Technologies, Canadá) y se cultivaron en un frasco laminina-recubierto de 175 cm2 que contenía el medio de expansión de células T LymphoOne (Takara Bio, Japón), suplementado con plasma autólogo inactivado por calor. Se utilizaron frascos de cultivo recubiertos con laminina para proporcionar un sustrato que imite la MEC y que facilite la adhesión de las células inmunitarias y respalde la expansión celular en condiciones ex vivo a través de la señalización mediada por integrinas.^[10] Las culturas se estimularon con IFN-γ humano recombinante (PeproTech, EE. UU.) a una dosis total de 1000 UI por cultura durante 24 horas, seguido de la estimulación con 400 ng/mL de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (T&L Biological Technology Co., Ltd, China) y 1000 U/mL de IL-2 humano recombinante (Four Rings Bio-Pharmaceutical Co., Ltd, China). Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante 21 días, reponiendo el medio LymphoOne y la IL-2 cada 2-3 días.

Caracterización fenotípica de las células CIK

Después de 21 días de cultivo, se recolectaron las células CIK y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de células T CD3+CD8+, células NKT CD3+CD56+ y células NK CD3−CD56+. Un total de 5 × 105 células se tiñeron con anticuerpos anti-humanos: CD3-APC, CD8-FITC y CD56-PE durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavaron dos veces y se tiñeron con 7-aminoactinomicina D (7-AAD) para la evaluación de la viabilidad. Los datos de 100 000 eventos por muestra se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSLyrics™ y se analizaron con el software FACSuite™ Clinical Software (todo de BD Biosciences, EE. UU.).

Ensayo de citotoxicidad in vitro de las células CIK del donante sano 1 contra las células HCT-15

La citotoxicidad de las células CIK contra las células HCT-15 se evaluó utilizando el ensayo MTT en diferentes proporciones efector:objetivo (E:T) que oscilaron entre 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:2 y 1:5. Las células HCT-15 se sembraron durante la noche en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5000 células/pocillo. Las células CIK derivadas del donante sano 1 se recolectaron y se resuspendieron en el medio de expansión de células T LymphoOne suplementado con plasma autólogo inactivado por calor y 1000 U/mL de IL-2 humano recombinante, y se agregaron a los pocillos en las proporciones E:T designadas en un volumen igual al del medio de las células objetivo. Después de 72 horas de cocultivo a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2, las células CIK se eliminaron cuidadosamente mediante un lavado suave con PBS para eliminar las células efectoras no adheridas. Posteriormente, se agregó bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) en cada pocillo para alcanzar una concentración final de 0,5 mg/mL, y la placa se incubó durante 4 horas. Los cristales de formazán se solubilizaron con 150 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) y se midió la absorbancia a 570 nm (Infinite® M200 PRO; Tecan, Suiza). La viabilidad celular se normalizó con respecto al control de HCT-15 no tratado.

El ensayo MTT se utilizó para evaluar la viabilidad celular; sin embargo, refleja principalmente la actividad metabólica en lugar de la muerte celular directa. Por lo tanto, los resultados deben interpretarse como una medida indirecta de la citotoxicidad en los sistemas de cocultivo.

Ensayo de citotoxicidad in vitro de las células CIK del donante sano 2 en combinación con 5-FU contra las células HCT-15

Para evaluar el efecto combinatorio del 5-fluorouracilo (5-FU) con las células CIK, las células HCT-15 (10 000 células/pocillo) se sembraron durante la noche en una placa de 96 pocillos y se pretrataron con 5-FU (0,050, 0,075 o 0,100 mg/mL) durante 24 horas. Las células CIK derivadas del donante sano 2 se recolectaron, se resuspendieron en el medio LymphoOne suplementado con plasma autólogo inactivado por calor y 1000 U/mL de IL-2, y se cocultivaron con las células HCT-15 a proporciones E:T de 1:5, 1:1, 10:1 y 20:1 durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente. La viabilidad celular se expresó en relación con el control de HCT-15 no tratado.

Comparación de la citotoxicidad de las células CIK del donante sano 3 frente a las células de un paciente con CRC contra las células HCT-15

Las células CIK derivadas del donante sano 3 y de un paciente con CRC metastásico se cocultivaron con las células HCT-15 (5000 células/pocillo) a proporciones E:T de 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:2 y 1:5 durante 72 horas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Después de la incubación, se realizó el ensayo MTT como se describió anteriormente para determinar la citotoxicidad relativa entre las células CIK derivadas del donante y del paciente.

Ensayo de perfil proteómico

Se utilizó el kit de matriz de citocinas humanas XL del perfil proteómico (R&D System, EE. UU.) para identificar los niveles relativos de 105 citocinas y quimiocinas humanas diferentes en el medio acondicionado del cocultivo CIK:HCT-15, siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células HCT-15 (150 000 células/pocillo) se sembraron durante la noche en una placa de 6 pocillos. Las células CIK del donante sano 3 se agregaron a proporciones E:T de 1:1 y 10:1 y se cultivaron durante 72 horas. Se recolectaron los medios acondicionados (supernatante) de las células CIK únicamente, las células HCT-15 únicamente y el cocultivo de CIK:HCT-15 y se centrifugaron a 5000 g durante 10 minutos. Se realizaron los ensayos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales quimioluminiscentes se visualizaron utilizando el sistema de imágenes iBright™ FL1500 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y la densidad de píxeles se cuantificó utilizando el software de análisis iBright™ con la intensidad de fondo sustráida.

Anotación funcional de proteínas y análisis de enriquecimiento

Se realizó la anotación funcional y el análisis de enriquecimiento de las proteínas reguladas de forma significativa utilizando la base de datos para la anotación, visualización y descubrimiento integrado, versión 6.7 (DAVID v6.7; EE. UU.) para la clasificación de la ontología génica (GO).^[20],^[21] Las listas de genes correspondientes se asignaron a la base de datos de referencia Homo sapiens para identificar los procesos biológicos, las funciones moleculares y los componentes celulares enriquecidos. Posteriormente, se analizaron las interrelaciones entre las proteínas reguladas de forma significativa identificadas en el ensayo de citocinas utilizando la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes (STRING; versión 12.0; https://string-db.org/).^[22] Se construyeron redes de interacción proteína-proteína (PPI) con una tasa máxima de falsos descubrimientos (FDR) de 0,05 y un umbral de fuerza mínimo de 0,01.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism (versión 9.0; GraphPad Software, Inc., EE. UU.) y se presentaron como media ± desviación estándar (DE) de los triplicados técnicos de cada donante. Se realizaron análisis estadísticos según lo apropiado para cada experimento. Los ensayos de citotoxicidad que involucraron comparaciones de una sola variable se analizaron utilizando ANOVA de una vía, mientras que los ensayos de tratamiento combinado (células CIK + 5-FU) se analizaron utilizando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las comparaciones de la actividad citotóxica entre las células CIK derivadas de un paciente con CRC y donantes sanos se realizaron utilizando una prueba t independiente. La inmunofenotipificación de las células CIK y los datos del ensayo de citocinas se analizaron utilizando ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post hoc de Tukey. La significación estadística se estableció en p < 0,05.

Resultados

Generación de células CIK de donantes sanos y un paciente con CRC

Las PBMC aisladas de tres donantes sanos y un paciente con CRC se expandieron con éxito en células CIK, y su fenotipo se analizó mediante citometría de flujo después de 21 días de cultivo. La citometría de flujo (Figura 1 y Figura suplementaria 1) mostró un aumento de las células T CD3+CD8+ y las células NKT CD3+CD56+ después de 21 días, mientras que las células NK CD3−CD56+ disminuyeron. La reducción observada en las células NK CD3−CD56+ puede reflejar la expansión preferencial de los subconjuntos de células T CD3+CD8+ y células NKT CD3+CD56+ en condiciones de cultivo impulsadas por IL-2, así como la influencia de la estimulación por citocinas y los cambios inducidos por la activación durante la expansión in vitro. Las células CIK derivadas del paciente con CRC mostraron proporciones de subconjuntos comparables (CD3+CD8+ 85,91%; CD3+CD56+ 27,81%) a las observadas en los donantes sanos (media CD3+CD8+ 85,10 ± 2,55%; CD3+CD56+ 31,54 ± 13,15%) (Tabla 2), lo que sugiere que los pacientes con CRC metastásico pueden ser capaces de generar porcentajes similares de poblaciones de células CIK que los donantes sanos, aunque esta observación está limitada por un tamaño de muestra pequeño.

Para evaluar el efecto combinado de la quimioterapia, las células HCT-15 se pretrataron con el agente antineoplásico, 5-FU, comúnmente utilizado en el tratamiento de pacientes con CRC, durante 24 horas, seguido de una coincubación con células CIK del donante sano 2 a varias relaciones E:T. Para determinar la dosis óptima de 5-FU para la combinación con las células CIK, las células HCT-15 se trataron con diferentes concentraciones de 5-FU (que oscilan entre 0 y 0,150 mg/mL) durante 24 horas. Basándose en estos resultados preliminares (los resultados no se muestran aquí), se seleccionaron tres concentraciones, 0,050, 0,075 y 0,100 mg/mL, para el cotratamiento con células CIK. El ensayo MTT reveló que el 5-FU solo redujo la viabilidad celular en las tres concentraciones después de 72 horas en comparación con el control (Figura 3A). La coincubación con células CIK también redujo la viabilidad celular de forma dependiente de la dosis (Figura 3B). En la relación E:T más baja de 1:5, la viabilidad de las células HCT-15 fue del 60,05 ± 3,57%, que disminuyó al 38,46 ± 9,24% a 20:1. La combinación de 5-FU y células CIK resultó en una mayor reducción de la viabilidad celular en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado (Figura 3C). Por ejemplo, el pretratamiento con 0,050 mg/mL de 5-FU seguido de la coincubación con células CIK redujo la viabilidad a 22,63 ± 3,06%, 11,47 ± 6,54%, 9,30 ± 4,76% y 1,02 ± 1,01% a relaciones E:T de 1:5, 1:1, 10:1 y 20:1, respectivamente. Se observaron tendencias similares con otras dosis de 5-FU en coincubación con células CIK. Estos hallazgos sugieren un efecto citotóxico mejorado del tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado.

Viabilidad de las células HCT-15 en coincubación con células CIK del donante 3 y de un paciente con CRC

Para comparar las actividades citotóxicas, las células CIK derivadas de un paciente con CRC y del donante sano 3 se cocultivaron con células HCT-15 a varias relaciones E:T (1:5, 1:2, 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 40:1). Como se muestra en la Figura 4, las células CIK derivadas del donante sano mostraron una mayor citotoxicidad a una relación E:T de 5:1, correspondiente a aproximadamente el 70% de la destrucción celular estimada, en comparación con aproximadamente el 25% de la destrucción celular estimada por las células CIK derivadas del paciente con CRC. A medida que la relación E:T aumentó, la actividad citotóxica de ambas poblaciones celulares mejoró, con una eliminación casi completa observada a 20:1 y 40:1. La viabilidad de las células HCT-15 a una relación E:T de 20:1 cuando se cocultivaron con células CIK del donante 3 y del paciente con CRC fue del 2,60 ± 5,86% y del 0,0%, respectivamente. A una relación E:T de 40:1, la viabilidad de las células HCT-15 cuando se cocultivaron con células CIK del donante 3 y del paciente con CRC fue del 0,0%. Estos hallazgos sugieren que las células CIK derivadas de un paciente con CRC metastásico también mostraron funcionalidad citotóxica a altas relaciones E:T, comparable a las células CIK del donante 3, aunque los efectos citotóxicos pueden ser menores a bajas relaciones E:T.

Perfiles de citocinas y factores de crecimiento de las células CIK del donante 3, las células HCT-15 y las condiciones de cocultivo

Como se muestra en la Figura 2, las células CIK indujeron una citotoxicidad eficaz a relaciones E:T de 1:1 y 10:1, lo que corresponde a una destrucción estimada de >50% y >80% de las células HCT-15, respectivamente, después de 72 horas de incubación. Basándose en estas observaciones, se realizó un perfil de citocinas para explorar más a fondo los posibles mecanismos subyacentes a los efectos mediados por las células CIK en el sistema de cocultivo. Por lo tanto, se compararon las citocinas liberadas tanto de las células CIK derivadas del donante sano 3 como de las células HCT-15 a relaciones E:T de 1:1 y 10:1.

Para caracterizar los factores secretados en el medio acondicionado de las células CIK en respuesta a las células HCT-15, se analizaron las citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento (Figura 5 y Figura Suplementaria 2). Los niveles de expresión de 105 citocinas se visualizaron en un mapa de calor (Figura 6A), y los valores de densidad de píxeles correspondientes se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Se consideraron altamente expresadas las citocinas con una densidad de píxeles superior a 300.000. En este estudio, 15 citocinas relacionadas con la inflamación, la regulación de las células inmunitarias, la proliferación y el quimiotaxis se expresaron en gran medida en las células CIK. En contraste, las células HCT-15 exhibieron 16 citocinas elevadas asociadas con respuestas celulares, inflamatorias e inmunitarias, y la transducción y las vías de señalización (Figura 6B y Tabla Suplementaria 2). De estas 105 citocinas, nueve marcadores se expresaron comúnmente tanto en las células CIK como en las células HCT-15, principalmente asociadas con la regulación inmunitaria, las respuestas inflamatorias y las respuestas celulares (Figura 6B).

Respuesta celular asociada con los cambios en las citocinas y los factores de crecimiento exhibidos por las células CIK del donante 3 y las células HCT-15

Para caracterizar los factores secretados en el medio acondicionado, se analizaron muestras de células CIK derivadas del donante sano 3, células HCT-15 y su cocultivo. Se observó que un total de 36 citocinas y factores de crecimiento se regulaban de forma diferente en las condiciones de cocultivo de las células CIK y las células HCT-15 (Tabla Suplementaria 1). El análisis de enriquecimiento GO (DAVID v6.7) identificó que la respuesta inflamatoria, la respuesta inmunitaria, la quimiotaxis y la señalización intercelular fueron los términos GO más enriquecidos asociados con los factores secretados por las células CIK en respuesta a las células HCT-15 (Tabla 3). Esto sugiere que el cocultivo con células HCT-15 puede influir en el perfil de secreción de citocinas de las células CIK, particularmente en términos de inmunomodulación.

Específicamente, la quimiocina tímica y regulada por la activación (TARC/CCL17), la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α/MIP-1β (CCL3/CCL4), regulada tras la activación, la proteína normal T expresada y secretada (RANTES/CCL5), IL-2, IL-5, IL-8 (CXCL8), la proteína similar a la quitinasa-3 (CHI3L1), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el componente del complemento C5/C5a, el dominio inmunoglobulínico y mucínico de la célula T-3 (TIM-3), el factor migratorio de macrófagos (MIF), el factor plaquetario 4 (PF4/CXCL4), la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1), FasL y CD31 se redujeron, mientras que MIP-3α (CCL20), la monocina inducida por IFN-γ (MIG/CXCL9), la proteína inducida por IFN-γ de 10 kDa (IP-10/CXCL10), el receptor de superficie del activador del plasminógeno de urocinasa (uPAR) y el factor de diferenciación del crecimiento 15 (GDF-15) aumentaron.

Por el contrario, cuando las células HCT-15 se expusieron a las células CIK, IP-10 y el inductor de la metaloproteinasa de la matriz extracelular (EMMPRIN/CD147) aumentaron, mientras que MIP-1α/MIP-1β, RANTES, TIM-3, la trombospondina-1 (TSP-1), VCAM-1 y la adiponectina disminuyeron.

En comparación con las células HCT-15 solas, a una relación E:T de 1:1, los niveles de MIG e IL-2 aumentaron, mientras que los niveles de IL-8 disminuyeron. A una relación E:T de 10:1, los niveles de IL-5 y CD31 aumentaron, mientras que los niveles de GDF-15 y uPAR disminuyeron (Tabla Suplementaria 1). Estos factores se asociaron con procesos como la quimiotaxis de los neutrófilos y la transducción de señales, que están implicados en las respuestas inflamatorias e inmunitarias (Tabla 3).

Se evaluaron las relaciones entre los factores identificados utilizando STRING y se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) (Figura 7). Tras la estimulación por las células HCT-15, las células CIK liberaron factores asociados con la regulación positiva de la proliferación de células mononucleares, los procesos inmunitarios, la migración de leucocitos y la regulación negativa y positiva del proceso celular. En contraste, el cocultivo con células CIK condujo a que las células HCT-15 se asociaran con la regulación positiva del sistema inmunitario, la cascada de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), la proliferación celular y la comunicación celular. Estos hallazgos se alinean con el análisis DAVID y sugieren un papel para estas citocinas y factores de crecimiento regulados en la modulación de las interacciones célula a célula, la inflamación y las respuestas inmunitarias durante la interacción entre las células CIK y las células HCT-15.

Regulación de los marcadores tumorales en las células CIK del donante 3 y las células HCT-15

Se investigaron aún más los papeles biológicos de los factores regulados en las células HCT-15 comparando las células HCT-15 cultivadas solas con las células HCT-15 en cocultivo con células CIK derivadas del donante sano 3 a relaciones E:T de 1:1 y 10:1. Entre las citocinas y los factores de crecimiento regulados (Tabla Suplementaria 1), se identificaron 15 como que desempeñan un papel clave en la modulación del crecimiento o la supresión tumoral. Estos factores se clasificaron en tres grupos en función de sus funciones: efectos antitumorales, inmunosupresión y proliferación y metástasis celular (Figura 8). En comparación con las células HCT-15 solas, los marcadores relacionados con el tumor, como IP-10, MIG y EMMPRIN, mostraron una expresión aumentada en las células HCT-15 tras el cocultivo con las células CIK, mientras que los marcadores asociados con la inmunosupresión, la proliferación celular y la metástasis se redujeron. En particular, a medida que el número de células CIK aumentaba, se produjo una mayor reducción de los niveles de TSP-1, la proteína relacionada con Dickkopf-1 (DKK-1), la proteína de unión al retinol 4 (RBP-4), uPAR, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-2 (IGFBP-2), la serpina E1 y GDF-15 (Figura 8). Estas observaciones sugieren que las células CIK pueden influir en las vías de señalización asociadas con el tumor.

Generación de células CIK de donantes sanos y de un paciente con CRC

Las células CIK se expandieron con éxito a partir de PBMCs aisladas de tres donantes sanos y de un paciente con CRC, y su fenotipo se analizó mediante citometría de flujo después de 21 días de cultivo. La citometría de flujo (Figura 1 y Figura Suplementaria 1) mostró un aumento de las células T CD3+CD8+ y las células NKT CD3+CD56+ después de 21 días, mientras que las células NK CD3−CD56+ disminuyeron. La reducción observada en las células NK CD3−CD56+ puede reflejar la expansión preferencial de los subconjuntos de células T CD3+CD8+ y células NKT CD3+CD56+ en condiciones de cultivo impulsadas por IL-2, así como la influencia de la estimulación por citocinas y los cambios inducidos por la activación durante la expansión in vitro. Las células CIK derivadas del paciente con CRC mostraron proporciones de subconjuntos comparables (CD3+CD8+ 85,91%; CD3+CD56+ 27,81%) a las observadas en los donantes sanos (media de CD3+CD8+ 85,10 ± 2,55%; CD3+CD56+ 31,54 ± 13,15%) (Tabla 2), lo que sugiere que los pacientes con CRC metastásico pueden ser capaces de generar porcentajes similares de poblaciones de células CIK que los donantes sanos, aunque esta observación está limitada por un tamaño de muestra pequeño.

Viabilidad de las células HCT-15 en cocultivo con células CIK del donante 1

Para evaluar el potencial citotóxico, las células CIK derivadas del donante sano 1 se cocultivaron con células HCT-15 a varias relaciones E:T, y la viabilidad de las células tumorales se evaluó utilizando el ensayo MTT (Figura 2). En la relación E:T más baja de 1:5, el 47,73 ± 8,38% de las células HCT-15 permanecieron viables. A medida que las relaciones E:T aumentaron a 1:2, 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 40:1, la viabilidad celular disminuyó de forma dependiente de la dosis. En las relaciones E:T más altas de 20:1 y 40:1, la viabilidad de las células HCT-15 fue del 8,98 ± 0,61% y del 8,08 ± 2,00%, respectivamente. Estos resultados indican una reducción dependiente de la dosis de la viabilidad de las células tumorales en presencia de células CIK. Dado que el ensayo MTT refleja la actividad metabólica en lugar de la muerte celular directa, estos hallazgos deben interpretarse como una medida indirecta de la citotoxicidad.

Viabilidad de las células HCT-15 en cocultivo con células CIK del donante 2 con o sin cocultivo con 5-FU

Para evaluar el efecto combinado de la quimioterapia, las células HCT-15 fueron pretratadas con el agente antineoplásico, 5-FU, comúnmente utilizado en el tratamiento de pacientes con CRC, durante 24 horas, seguido de una coincubación con células CIK del donante sano 2 a varias relaciones E:T. Para determinar la dosis óptima de 5-FU para la combinación con las células CIK, las células HCT-15 fueron tratadas con diferentes concentraciones de 5-FU (que oscilan entre 0 y 0,150 mg/mL) durante 24 horas. Basándose en estos resultados preliminares (los resultados no se muestran aquí), se seleccionaron tres concentraciones, 0,050, 0,075 y 0,100 mg/mL, para el cotratamiento con las células CIK. El ensayo MTT reveló que el 5-FU solo redujo la viabilidad celular en las tres concentraciones después de 72 horas en comparación con el control (Figura 3A). La cocultivo con células CIK también redujo la viabilidad celular de forma dependiente de la dosis (Figura 3B). En la relación E:T más baja de 1:5, la viabilidad de las células HCT-15 fue del 60,05 ± 3,57%, que disminuyó a 38,46 ± 9,24% a 20:1. La combinación de 5-FU y células CIK resultó en una mayor reducción de la viabilidad celular en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado (Figura 3C). Por ejemplo, el pretratamiento con 0,050 mg/mL de 5-FU seguido de la cocultivo con células CIK redujo la viabilidad a 22,63 ± 3,06%, 11,47 ± 6,54%, 9,30 ± 4,76% y 1,02 ± 1,01% a relaciones E:T de 1:5, 1:1, 10:1 y 20:1, respectivamente. Se observaron tendencias similares con otras dosis de 5-FU en cocultivo con células CIK. Estos hallazgos sugieren un efecto citotóxico mejorado del tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado.

Viabilidad de las células HCT-15 en cocultivo con células CIK del donante 3 y de un paciente con CRC

Para comparar las actividades citotóxicas, las células CIK derivadas de un paciente con CRC y del donante sano 3 se cocultivaron con células HCT-15 a varias relaciones E:T (1:5, 1:2, 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 y 40:1). Como se muestra en la Figura 4, las células CIK derivadas del donante sano mostraron una mayor citotoxicidad a una relación E:T de 5:1, correspondiente a aproximadamente el 70% de la destrucción celular estimada, en comparación con aproximadamente el 25% de la destrucción celular estimada por las células CIK derivadas del paciente con CRC. A medida que la relación E:T aumentó, la actividad citotóxica de ambas poblaciones celulares mejoró, con una eliminación casi completa observada a 20:1 y 40:1. La viabilidad de las células HCT-15 a una relación E:T de 20:1 cuando se cocultivaron con células CIK del donante 3 y del paciente con CRC fue del 2,60 ± 5,86% y del 0,0%, respectivamente. A una relación E:T de 40:1, la viabilidad de las células HCT-15 cuando se cocultivaron con células CIK del donante 3 y del paciente con CRC fue del 0,0%. Estos hallazgos sugieren que las células CIK derivadas de un paciente con CRC metastásico también mostraron funcionalidad citotóxica a altas relaciones E:T, comparable a las células CIK del donante 3, aunque los efectos citotóxicos pueden ser menores a bajas relaciones E:T.

Perfiles de citocinas y factores de crecimiento de las células CIK del donante 3, las células HCT-15 y las condiciones de cocultivo

Como se muestra en la Figura 2, las células CIK indujeron una citotoxicidad eficaz a relaciones E:T de 1:1 y 10:1, lo que corresponde a una destrucción estimada de >50% y >80% de las células HCT-15, respectivamente, después de 72 horas de incubación. Basándose en estas observaciones, se realizó un perfil de citocinas para explorar más a fondo los posibles mecanismos subyacentes a los efectos mediados por las células CIK en el sistema de cocultivo. Por lo tanto, se compararon las citocinas liberadas tanto de las células CIK derivadas del donante sano 3 como de las células HCT-15 a relaciones E:T de 1:1 y 10:1.

Para caracterizar los factores secretados en el medio acondicionado de las células CIK en respuesta a las células HCT-15, se analizaron las citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento (Figura 5 y Figura Suplementaria 2). Los niveles de expresión de 105 citocinas se visualizaron en un mapa de calor (Figura 6A), y los valores de densidad de píxeles correspondientes se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1. Se consideraron altamente expresadas las citocinas con una densidad de píxeles superior a 300.000. En este estudio, 15 citocinas relacionadas con la inflamación, la regulación de las células inmunitarias, la proliferación y el quimiotaxis se expresaron en gran medida en las células CIK. En contraste, las células HCT-15 exhibieron 16 citocinas elevadas asociadas con respuestas celulares, inflamatorias e inmunitarias, y con la transducción y las vías de señalización (Figura 6B y Tabla Suplementaria 2). De entre estas 105 citocinas, nueve marcadores se expresaron comúnmente tanto en las células CIK como en las células HCT-15, principalmente asociadas con la regulación inmunitaria, las respuestas inflamatorias y las respuestas celulares (Figura 6B).

Respuesta celular asociada con los cambios en las citocinas y los factores de crecimiento exhibidos por las células CIK del donante 3 y las células HCT-15

Para caracterizar los factores secretados en el medio acondicionado, se analizaron muestras de células CIK derivadas del donante sano 3, células HCT-15 y su cocultivo. Se observó que un total de 36 citocinas y factores de crecimiento se regulaban de forma diferente en las condiciones de cocultivo de las células CIK y las células HCT-15 (Tabla Suplementaria 1). El análisis de enriquecimiento GO (DAVID v6.7) identificó que la respuesta inflamatoria, la respuesta inmunitaria, la quimiotaxis y la señalización célula-célula fueron los términos GO más enriquecidos asociados con los factores secretados por las células CIK en respuesta a las células HCT-15 (Tabla 3). Esto sugiere que el cocultivo con las células HCT-15 puede influir en el perfil de secreción de citocinas de las células CIK, particularmente en términos de inmunomodulación.

Específicamente, la quimiocina tímica y regulada por la activación (TARC/CCL17), la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α/MIP-1β (CCL3/CCL4), regulada tras la activación, la proteína normal T expresada y secretada (RANTES/CCL5), IL-2, IL-5, IL-8 (CXCL8), la proteína similar a la quitinasa-3 (CHI3L1), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), el componente del complemento C5/C5a, el dominio inmunoglobulínico y mucínico de la célula T-3 (TIM-3), el factor de migración inhibitoria de macrófagos (MIF), el factor plaquetario 4 (PF4/CXCL4), la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1), FasL y CD31 se redujeron, mientras que MIP-3α (CCL20), la monocina inducida por IFN-γ (MIG/CXCL9), la proteína inducida por IFN-γ de 10 kDa (IP-10/CXCL10), el receptor de superficie del activador del plasminógeno de urocinasa (uPAR) y el factor de diferenciación del crecimiento 15 (GDF-15) aumentaron.

Por el contrario, cuando las células HCT-15 se expusieron a las células CIK, IP-10 y la metaloproteinasa de la matriz extracelular inductora (EMMPRIN/CD147) aumentaron, mientras que MIP-1α/MIP-1β, RANTES, TIM-3, la trombospondina-1 (TSP-1), VCAM-1 y la adiponectina disminuyeron.

En comparación con las células HCT-15 solas, a una relación E:T de 1:1, los niveles de MIG e IL-2 aumentaron, mientras que los niveles de IL-8 disminuyeron. A una relación E:T de 10:1, los niveles de IL-5 y CD31 aumentaron, mientras que los niveles de GDF-15 y uPAR disminuyeron (Tabla Suplementaria 1). Estos factores se asociaron con procesos como la quimiotaxis de los neutrófilos y la transducción de señales, que están implicados en las respuestas inflamatorias e inmunitarias (Tabla 3).

Se evaluaron las relaciones entre los factores identificados utilizando STRING y se construyó una red de interacción proteína-proteína (PPI) (Figura 7). Tras la estimulación por las células HCT-15, las células CIK liberaron factores asociados con la regulación positiva de la proliferación de las células mononucleares, los procesos inmunitarios, la migración de los leucocitos y la regulación negativa y positiva del proceso celular. En contraste, el cocultivo con las células CIK condujo a que las células HCT-15 se asociaran con la regulación positiva del sistema inmunitario, la cascada de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), la proliferación celular y la comunicación celular. Estos hallazgos se alinean con el análisis DAVID y sugieren un papel para estas citocinas y factores de crecimiento regulados en la modulación de las interacciones célula-célula, la inflamación y las respuestas inmunitarias durante la interacción entre las células CIK y las células HCT-15.

Regulación de los marcadores tumorales en las células CIK del donante 3 y las células HCT-15

Se investigaron aún más los papeles biológicos de los factores regulados en las células HCT-15 comparando las células HCT-15 cultivadas solas con las células HCT-15 en cocultivo con las células CIK derivadas del donante sano 3 a relaciones E:T de 1:1 y 10:1. Entre las citocinas y los factores de crecimiento regulados (Tabla Suplementaria 1), se identificaron 15 como que desempeñan un papel clave en la modulación del crecimiento o la supresión tumoral. Estos factores se clasificaron en tres grupos en función de sus funciones: efectos antitumorales, inmunosupresión y proliferación y metástasis celular (Figura 8). En comparación con las células HCT-15 solas, los marcadores relacionados con el tumor, como IP-10, MIG y EMMPRIN, mostraron una mayor expresión en las células HCT-15 tras el cocultivo con las células CIK, mientras que los marcadores asociados con la inmunosupresión, la proliferación celular y la metástasis se redujeron. En particular, a medida que el número de células CIK aumentaba, se produjo una mayor reducción de los niveles de TSP-1, la proteína relacionada con Dickkopf 1 (DKK-1), la proteína de unión a retinol 4 (RBP-4), uPAR, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-2 (IGFBP-2), la serpina E1 y GDF-15 (Figura 8). Estas observaciones sugieren que las células CIK pueden influir en las vías de señalización asociadas con el tumor.

Discusión

Este estudio exploratorio demostró que las células CIK se pueden generar con éxito tanto a partir de donantes sanos como de un paciente con CRC metastásico, exhibiendo actividad citotóxica contra las células HCT-15 y modulando los perfiles de citocinas asociadas con el tumor.

Las células CIK generadas en este estudio exhibieron características fenotípicas establecidas que se informaron en estudios anteriores, incluido el enriquecimiento de las células T CD3⁺CD8⁺ y las células NKT CD3⁺CD56⁺.^[5],^[6] La reducción de las células NK CD3−CD56⁺ observada durante la expansión de las células CIK es consistente con los hallazgos previos y puede reflejar la proliferación selectiva de los subconjuntos de células T CD3⁺CD8⁺ y células NKT CD3⁺CD56⁺ en condiciones de cultivo impulsadas por citocinas. La generación de células CIK a partir de varios pacientes con CRC con metástasis hepáticas también mostró mayores rendimientos de células T CD3⁺CD8⁺ y células NKT CD3⁺CD56⁺, mientras que el subconjunto de células NK CD3−CD56⁺ se redujo.^[7] Nuestros resultados mostraron que, a pesar de la variabilidad del donante, las células CIK derivadas de un paciente con CRC metastásico exhibieron una expansión y una actividad citotóxica comparables a las de los donantes sanos, lo que apoya su posible aplicabilidad en entornos autólogos. Aunque se observó una citotoxicidad reducida a relaciones efector-a-objetivo (E:T) más bajas, el aumento de la densidad de las células efectoras mejoró la destrucción de las células tumorales, lo que se alinea con los hallazgos previos que muestran que la densidad de las células T citotóxicas influye en la eficiencia de la eliminación tumoral.^[23] Además, los niveles más altos de células NKT se han asociado con una mejor inmunidad antitumoral y resultados clínicos, incluido un subconjunto conocido como células NKT invariantes (iNKT), que se han relacionado con una mejor supervivencia y control tumoral en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, así como con una mayor supervivencia libre de enfermedad en el cáncer colorrectal.^[24],^[25]

Los estudios clínicos han demostrado que la inmunoterapia basada en células CIK se asocia con actividad antitumoral en múltiples neoplasias malignas, incluidos los cánceres gastrointestinales.^[14],^[26],^[27] En el CRC metastásico, la combinación de células CIK con quimioterapia se ha asociado con una mejor supervivencia general y supervivencia libre de progresión en comparación con la quimioterapia sola.^[26] Se han informado observaciones similares en el cáncer gástrico, con un posible beneficio para la supervivencia que respalda la viabilidad de integrar las células CIK con los enfoques de tratamiento convencionales.^[27] En este estudio, el pretratamiento con 5-FU se asoció con una mayor reducción de la viabilidad de las células HCT-15 cuando se combinó con las células CIK. Se han informado hallazgos similares en los que las células CIK mejoran los efectos de los agentes quimioterapéuticos, posiblemente a través de la activación inmunitaria mediada por citocinas o el aumento de la susceptibilidad tumoral.^[28],^[29]

El análisis del perfil de citocinas en este estudio reveló una modulación dinámica de los factores implicados en la regulación inmune, la quimiotaxis y la inflamación tras el cocultivo con células HCT-15. Varias citocinas asociadas al reclutamiento y la activación de las células inmunitarias, entre ellas MIP-1β, GM-CSF e IL-2, se modularon en condiciones de cocultivo. Los cambios observados en estas citocinas pueden reflejar un entorno inmunológicamente receptivo inducido por la interacción CIK-tumor, lo que concuerda con los mecanismos propuestos de la citotoxicidad mediada por CIK y la activación inmune (Figura Suplementaria 3). Estudios previos han demostrado que MIP-1β atrae a las células T CD8⁺, las células T CD4⁺ y las células NK, y promueve las respuestas inmunitarias antitumorales, mientras que GM-CSF regula el reclutamiento y la activación de las células inmunitarias, como las células dendríticas y los linfocitos, y la IL-2 desempeña un papel fundamental en la proliferación y la activación de las células T en la inmunoterapia del cáncer.[30–32] Además, las quimiocinas inducidas por el interferón, como MIG (CXCL9) e IP-10 (CXCL10), aumentaron tras el cocultivo en este estudio. El aumento de estas quimiocinas puede estar asociado con una mayor actividad relacionada con el sistema inmunitario, aunque no se realizó una validación funcional.^[33],^[34]

Cabe destacar que la expresión de EMMPRIN (CD147) aumentó tras el cocultivo. Este hallazgo sugiere una posible participación de CD147 en las interacciones tumor-inmune dentro del sistema experimental. CD147 es una glicoproteína multifuncional que participa en la activación de las células T y la regulación inmune.^[35] Sin embargo, también se ha asociado patológicamente con funciones promotoras del tumor en otros contextos, incluido el aumento de la angiogénesis mediante la regulación del VEGF, la promoción de la invasión y la metástasis del tumor y la supresión de la actividad antitumoral mediada por las células T CD8⁺.[36–38] Dados estos roles dependientes del contexto, el aumento de CD147 observado en este estudio debe interpretarse con cautela, ya que su implicación funcional en el CRC no puede determinarse únicamente a partir de los datos de expresión.

Además, varios factores asociados con la progresión tumoral, la evasión inmune y la metástasis, entre ellos TSP-1, DKK-1, TIM-3, uPAR, IGFBP-2 y GDF-15, disminuyeron en condiciones de cocultivo en este estudio. La disminución de estas moléculas puede sugerir un cambio hacia un perfil menos promotor del tumor dentro del sistema experimental, ya que se ha demostrado que estos factores participan en las vías de progresión tumoral, angiogénesis y evasión inmune (Figura Suplementaria 4). En relación con nuestros hallazgos, la disminución observada en TSP-1 y DKK-1 puede estar asociada con un entorno menos inmunosupresor, ya que se ha informado que estos factores regulan las respuestas inmunitarias y alteran la actividad antitumoral mediada por las células CD8⁺.^[39],^[40] De manera similar, la reducción en la expresión de TIM-3 puede reflejar una disminución de las señales relacionadas con la progresión tumoral y el potencial metastásico en el CRC.^[41] La disminución de los niveles de uPAR y GDF-15 observados en este estudio también puede estar asociada con una reducción de la migración, la invasión y la transición epitelio-mesenquimal de las células tumorales.^[42],^[43] Además, la reducción de IGFBP-2 puede sugerir una posible disminución de la señalización inmunosupresora, ya que se ha demostrado que IGFBP-2 promueve la diferenciación de las células T reguladoras.^[44]

En conjunto, estos hallazgos sugieren que las células CIK pueden influir en múltiples componentes de la red de citocinas asociadas al tumor observada en este sistema in vitro. Se proporciona un resumen esquemático de la actividad antitumoral mediada por CIK y los mecanismos asociados al tumor en las Figuras Suplementarias 3 y 4. Sin embargo, dado el diseño exploratorio, el tamaño limitado de la muestra y la ausencia de validación funcional, estas observaciones deben interpretarse como preliminares. Además, la evaluación de la citotoxicidad en este estudio se basó en el ensayo MTT, que refleja la actividad metabólica en lugar de la muerte directa de las células tumorales, y puede verse influenciada por el metabolismo de las células efectoras en los sistemas de cocultivo. Se necesitan estudios futuros que incorporen cohortes de pacientes más amplias, modelos más fisiológicamente relevantes y ensayos de citotoxicidad directa, como los ensayos de eliminación basados en citometría de flujo (por ejemplo, enfoques basados en Annexin V/PI o CFSE), para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes a las interacciones CIK-tumor.

Conclusión

En conclusión, este estudio exploratorio demuestra que se pueden generar células CIK funcionales tanto a partir de donantes sanos como de un paciente con CRC metastásico, con características fenotípicas y actividad citotóxica comparables contra las células HCT-15. La combinación de células CIK con 5-FU se asoció con una mayor reducción de la viabilidad de las células tumorales en comparación con cualquiera de los tratamientos por separado. El análisis del perfil de citocinas sugiere que las células CIK pueden modular las respuestas inmunitarias asociadas al tumor a través de cambios en los factores proinflamatorios e inmunorreguladores. En particular, los factores asociados con la activación inmune aumentaron, mientras que varias citocinas asociadas al tumor disminuyeron, lo que sugiere que las células CIK pueden influir en el entorno inmunitario asociado al tumor. Estos hallazgos proporcionan información preliminar sobre las interacciones mediadas por citocinas entre las células CIK y las células HCT-15.