Los degradadores moleculares que se unen a HuR suprimen el cáncer colorrectal con mutación en el gen BRAF.

Las mutaciones de BRAF que confieren una función alterada, en particular BRAF(V600E), afectan aproximadamente al 10% de todos los pacientes con cáncer colorrectal (CRC) y predicen un mal pronóstico con opciones terapéuticas limitadas. Los inhibidores de BRAF, como encorafenib, son ineficaces debido a la reactivación de la vía MAPK causada por la dimerización de BRAF. La inhibición combinada de BRAF y EGFR, aunque son terapias aprobadas, produce beneficios de supervivencia limitados y frecuentes casos de resistencia al tratamiento y recurrencia1,2,3. Aquí, mediante un diseño racional de una biblioteca química, combinado con un cribado proteómico paralelo, identificamos dHuR como un degradador molecular de la proteína R humana (HuR), una proteína de unión al ARN que impulsa el crecimiento tumoral, la invasión y la resistencia a la terapia. dHuR se une a la ubiquitina ligasa CRBN para crear una superficie compuesta única unida por benzofurano, con el fin de reclutar a HuR como un neosustrato mediante la interacción con su β-asa G, el degrón, tal y como se reveló en la estructura de la microscopía crioelectrónica del complejo ternario. dHuR abolió la expresión de BRAF al inducir el omisión del exón 18, y demostró una supresión superior de los tumores de CRC con mutaciones de BRAF, incluidos aquellos que desarrollaron resistencia a los inhibidores de BRAF. Finalmente, realizamos un cribado CRISPR de una biblioteca de cinomas y revelamos que la inactivación de EGFR o MEK mejoró la citotoxicidad de dHuR, estableciendo así una estrategia combinatoria para tratar a pacientes con CRC con mutaciones de BRAF refractario. Contenido similar que están viendo otros usuarios

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El CRC que alberga mutaciones de BRAF (aproximadamente el 10% de los casos) representa uno de los subtipos de CRC más agresivos y terapéuticamente desafiantes4, con una supervivencia media de menos de 12 meses con las terapias actuales3. A diferencia del melanoma mutado en BRAF, donde los inhibidores de BRAF (por ejemplo, vemurafenib y encorafenib) muestran una eficacia notable, el CRC mutado en BRAF exhibe resistencia intrínseca debido a la reactivación dependiente de EGFR de la vía MAPK. Aunque la combinación aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) de encorafenib (un inhibidor de BRAF (BRAFi)) + cetuximab (un anticuerpo anti-EGFR) mejora las tasas de respuesta (20-26% frente al 5% con BRAFi solo)5,6, la mayoría de los pacientes no obtienen ningún beneficio y los respondedores suelen recaer en un plazo de 4 a 6 meses6. En consecuencia, más del 75% de los pacientes con CRC mutado en BRAF carecen de opciones de tratamiento duraderas7, lo que subraya la urgente necesidad de nuevas modalidades terapéuticas que superen la resistencia o estrategias de orientación alternativas para BRAF o sus cofactores críticos. La proteína de unión al ARN HuR, codificada por el gen ELAV-like RNA-binding protein 1 (ELAVL1; también conocida como HUR), se une a elementos ricos en AU dentro de los intrones o las regiones 3′ no traducidas de los ARNm diana, regulando así el procesamiento del pre-ARNm, la estabilidad del ARNm y la traducción8,9. HuR desempeña un papel fundamental en la modulación de la estabilidad del ARNm y el control de la traducción, actuando como un regulador postranscripcional clave de ARNs específicos en contextos fisiológicos y patológicos, particularmente en la progresión del cáncer10,11. HuR se expresa con frecuencia en exceso y/o se enriquece de forma anormal en el citoplasma de las células cancerosas. Su expresión aberrante se asocia con grados tumorales altos y malos pronósticos en un amplio espectro de neoplasias malignas, incluido el CRC12. HuR mejora la expresión de proteínas que impulsan la progresión del cáncer, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y los reguladores del ciclo celular, particularmente en respuesta a factores estresantes como las mutaciones oncogénicas y la quimioterapia o las terapias dirigidas10,13,14. A través de sus efectos pleotrópicos, HuR promueve el crecimiento tumoral, la invasión, la angiogénesis y la resistencia a los agentes terapéuticos, lo que la convierte en un objetivo importante para las terapias contra el cáncer15. El descubrimiento de moléculas pequeñas y ARN de interferencia pequeños que inhiben la función de HuR ha proporcionado pruebas de concepto del posible beneficio terapéutico de dirigir a HuR en muchos tipos de cáncer, como el cáncer colorrectal, pancreático, renal, ovárico, de mama, hepático y de pulmón, así como el tumor de vaina nerviosa periférica maligno16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Sin embargo, ninguno de estos candidatos a fármacos ha avanzado hasta el desarrollo clínico hasta la fecha, debido a una baja potencia o a la falta de una administración eficiente al tumor26. Los degradadores moleculares (MGD), una nueva clase de compuestos químicos, han surgido recientemente como una estrategia prometedora para dirigir y degradar selectivamente las proteínas causantes de enfermedades, incluidas aquellas consideradas "no susceptibles a fármacos". Al inducir químicamente la formación de un complejo ternario entre una proteína diana y una ligasa E3 de ubiquitina, los MGD desencadenan la ubiquitinación impulsada por la proximidad y la posterior degradación de la proteína diana. Cabe destacar que los avances recientes han ampliado el espectro de objetivos de MGD basados en cereblona (CRBN). Más allá de los fármacos inmunomoduladores (IMiD) clásicos, como los análogos de la talidomida, que se dirigen a los factores de transcripción IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZMYM2 y SALL4 (refs. 27,28,29,30), también se han identificado MGD contra proteínas zinc adicionales (por ejemplo, IKZF2 y WIZ)31,32, quinasas (por ejemplo, CK1α)33 y proteínas de andamiaje (por ejemplo, GSPT1)34. Además, los estudios estructurales de criomicroscopía electrónica (cryo-EM) de los complejos CRBN-MGD-neosustrato han revelado determinantes moleculares críticos para la formación de complejos ternarios35,36,37, incluido la estabilización de la horquilla β y los "parches de pegamento" hidrofóbicos. A pesar de estos avances, persisten desafíos fundamentales en el desarrollo racional de MGD. La serendipia sigue impulsando la mayoría de los descubrimientos debido a las herramientas predictivas limitadas. Este cuello de botella se debe a la naturaleza transitoria de las interacciones proteína-proteína inducidas por MGD y a la falta de firmas estructurales universales para las interfaces "pegajosas". Los esfuerzos computacionales recientes que utilizan plataformas de aprendizaje profundo (por ejemplo, AlphaFold38) para la predicción de interfaces muestran ser prometedores, pero requieren validación experimental.

Afortunadamente, las tecnologías proteómicas emergentes ahora están permitiendo el descubrimiento sistemático de objetivos sensibles a MGD. Aquí utilizamos un perfil proteómico a gran escala de células tratadas con moduladores de CRBN diseñados racionalmente e identificamos MGD que se dirigen a HuR. Los estudios del mecanismo de acción mostraron que dHuRs funciona como pegamentos moleculares para inducir un complejo ternario CRBN-MGD-HuR, lo que conduce a la poliubiquitinación y la degradación proteasómica de HuR. A través de una serie de análisis bioinformáticos, ensayos celulares in vitro y modelos in vivo, descubrimos que las células de CRC mutadas en BRAF son particularmente sensibles al tratamiento con dHuRs. El mecanismo que conduce a esta actividad se debe al menos en parte a los efectos de la degradación de HuR en el empalme del ARN de BRAF y la disminución del nivel de proteína BRAF. El efecto antiproliferativo de la degradación de HuR también se demuestra en las células resistentes a los inhibidores de BRAFi y se asocia con una disminución de las proteínas oncogénicas BRAF y EGFR y una disminución sostenida de la señalización de la vía MAPK, medida por el nivel de p-ERK. Esta combinación de degradación de HuR con la inhibición de EGFR-BRAF-MEK resultó en efectos antitumorales sinérgicos. Estos datos respaldan el desarrollo de dHuR en el CRC mutado en BRAF.

dHuRs identificados por proteómica

Para identificar sistemáticamente los neosustratos que interactúan con CRBN, se diseñó una biblioteca de pegamentos moleculares basada en CRBN con más de 10.000 compuestos. Aproximadamente 200 compuestos representativos con estructuras diversificadas se aplicaron a un ensayo de fluorescencia homogéneo y resuelto en el tiempo (HTRF) para medir la afinidad de unión binaria de CRBN, lo que se reflejó en el desplazamiento del rojo de la talidomida del bolsillo de unión a CRBN. Se incluyeron fármacos moduladores de la ligasa E3 CRBN disponibles comercialmente como puntos de referencia, y se diseñó específicamente N-metil-pomalidomida (Poma-CH3) para abolir la unión a CRBN, sirviendo como control negativo. A una concentración fija de compuesto de 1,6 µM, las puntuaciones de HTRF revelaron tres clases de unión: débil (puntuación de HTRF > 0,8), media (0,8-0,4) y fuerte (menor que 0,4). De los compuestos probados, el 87,4% mostró una afinidad de unión a CRBN de media a fuerte (Fig. 1a), lo que indica que la mayoría de los compuestos de la biblioteca son unidores de CRBN. En este caso, las células CRBN de tipo salvaje (WT, CRBN+/+) y de knockout (KO, CRBN−/−) se trataron con un conjunto de compuestos agrupados aleatoriamente de la biblioteca y luego se sometieron a una proteómica cuantitativa global. Como se muestra en la Fig. 1b, HuR se identificó como uno de los principales candidatos, con una abundancia de proteínas reducida específicamente en las células CRBN WT pero no en las células CRBN-KO tras el tratamiento con el grupo de compuestos.

Fig. 1: Identificación de dHuRs.

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a, Cribado primario basado en HTRF de una biblioteca de compuestos (1,6 µM) para los unidores de CRBN. Cpds, compuestos. b, Esquema del cribado proteómico en células CRBN WT frente a células CRBN-KO tratadas con grupos de compuestos (izquierda) y gráficos de dispersión que muestran los cambios en la abundancia de proteínas en las células JHH-7 CRBN WT (medio) o CRBN-KO (derecha). LC–MS/MS, cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem; TMT, etiqueta de masa en tándem. c, Estructura química y peso molecular (MW) de dHuR-1 (1). d, Inmunoblot de HuR en células JHH-7 tratadas con dimetilsulfóxido (DMSO) o dHuR-1. e, Inmunoblot de HuR en células JHH-7 tratadas con dHuR-1 (10 µM) con o sin MLN4924 (1 µM; un inhibidor de Nedd8) o MG132 (10 µM; un inhibidor del proteasoma). f, Inmunoblot cuantificado de HuR en células CRBN WT y CRBN-KO tratadas con cicloheximida (CHX; 100 µg ml−1) en presencia o ausencia de dHuR-1 (10 µM) a lo largo del tiempo (0-8 h). g, Esquema de las estructuras químicas de 2-7 generadas mediante la adición de la porción de cola de dHuR-1 al andamiaje principal de Poma o lenalidomida (Lena; izquierda). La afinidad de unión a CRBN medida por HTRF (eje y izquierdo) y la cuantificación basada en HiBiT de la degradación de HuR (eje y derecho) también se muestran (derecha). h, Estructura química y MW de dHuR-2 (8), un degradador optimizado. i, Gráficos de dispersión de los cambios en la abundancia de proteínas en las células KP4 tratadas con dHuR-1 o dHuR-2 (10 µM, 2 h). Los valores p se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas (b, i). Las líneas punteadas grises indican el corte de la relación de cambio (FC) y el valor p (b, i). Para los datos de origen del gel, consulte la Fig. S2.

A continuación, examinamos la expresión endógena de proteínas en respuesta a compuestos individuales e identificamos que dHuR-1 (1) disminuyó fuertemente la abundancia de HuR de forma dependiente de la dosis y/o del tiempo (Fig. 1c, d). El tratamiento con el inhibidor de la enzima Nedd8 MLN4924 o el inhibidor del proteasoma MG132 previno la disminución inducida por dHuR-1 de HuR (Fig. 1e). Se observó una vida media de la proteína acortada, según lo determinado por el ensayo de persecución de CHX, tras el tratamiento con dHuR-1 en las células CRBN WT pero no en las células CRBN-KO (Fig. 1f y Datos suplementarios ampliados Fig. 1a). En cambio, el nivel de ARNm se redujo solo ligeramente (Datos suplementarios ampliados Fig. 1b), lo que podría deberse a la autorregulación de HuR sobre su propio ARNm39. Un ensayo de reportero de doble fluorescencia (HuR-GFP-IRES-mCherry) confirmó la degradación del objetivo a nivel postranscripcional (Datos suplementarios ampliados Fig. 1c). Todos estos datos respaldaron la degradación dependiente de CRBN de HuR mediada por dHuR-1. Además, el fraccionamiento nuclear-citoplasmático demostró la degradación de HuR en todo el compartimento (Datos suplementarios ampliados Fig. 1d).

Para tener un degradador más potente de HuR para ensayos bioquímicos o biofísicos y biológicos funcionales posteriores, se realizó un estudio de relación estructura-actividad a pequeña escala modificando las subestructuras del núcleo (el sistema de anillos directamente unido a la glutarimida) y la cola (el grupo de extensión unido al núcleo) basándose en dHuR-1. Descubrimos que el núcleo de benzofurano único de dHuR-1 era fundamental para la interacción de HuR en comparación con los andamios IMiD. Aunque 2-7 (para los nombres de los compuestos, consulte la Información complementaria) mostraron afinidad de unión a CRBN, perdieron actividad en la degradación de HuR con el núcleo reemplazado (Fig. 1g y Datos suplementarios ampliados Fig. 1e). El análogo optimizado dHuR-2 (8) logró una afinidad de unión a CRBN superior (IC50 de HTRF = 0,16 µM) y una potencia de degradación de HuR (DC50 = 3,8 nM, Dmax = 96% y T1/2 = 2,45 h; Fig. 1h). El perfil proteómico y el análisis de inmunoblot revelaron la degradación selectiva de HuR y los neosustratos CRBN conocidos ZFP91 y ZMYM2 con una potencia comparable, mientras que GSPT1 y los paralogos de la proteína Hu (HuB, HuC y HuD) se conservaron; Fig. 1i y Datos suplementarios ampliados Fig. 1f-h).

Caracterización del complejo CRBN-MGD-HuR

Inspirados en la topología de la horquilla β conservada en el bucle G en los neosustratos de CRBN32,34,40, mapeamos dos motivos estructurales análogos en HuR (bucles G58/G144) mediante el acoplamiento molecular. Descubrimos que la mutagénesis en G58 pero no en G144 del reportero de HuR abolió la degradación mediada por dHuR-1 (Datos suplementarios ampliados Fig. 2a). Además, un análisis exhaustivo de la mutagénesis reveló un estricto requisito de glicina en la posición 58, lo que refleja la conservación del mecanismo del bucle G (Figura 2b en los datos suplementarios). La mutación G58N interrumpió la interacción CRBN-HuR, como se demostró mediante los ensayos NanoBRET y de co-inmunoprecipitación (Figura 2a y Figura 2c en los datos suplementarios). En cuanto a qué aminoácidos de CRBN participan en la degradación de HuR, descubrimos que la reintroducción de CRBN de tipo salvaje (WT) mediante transfección en células 293T CRBN-KO restauró la degradación dependiente de dHuR-1 del reportero de HuR, mientras que los mutantes de CRBN (E377V o V388I)34,41 mostraron una actividad disminuida, y los mutantes dobles exhibieron un efecto más fuerte (Figura 2d en los datos suplementarios). De manera consistente, el HuR endógeno de ratón no pudo ser degradado en fibroblastos embrionarios de ratón Crbn WT, pero sí pudo serlo en fibroblastos embrionarios de ratón CrbnI391V/V380E de doble inserción génica (KI) (Figura 2e en los datos suplementarios). Los dos conjuntos de datos indicaron el papel fundamental tanto de E377 como de V388 en el complejo CRBN-HuR.

Figura 2: Caracterización de la formación del complejo ternario CRBN-MGD-HuR.
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a, Ensayo NanoBRET que compara la formación del complejo ternario entre CRBN y HuR de tipo salvaje (WT) o el mutante HuR(G58N) inducido por 10 μM de dHuR-1. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 3 muestras biológicamente independientes. Los valores de P se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. BRET, transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia. b, Ensayo TR-FRET que muestra la formación del complejo ternario entre His-DDB1-CRBN y GST-HuR inducido por varias concentraciones (8 a 0,0005 μM, diluciones de cuatro en cuatro) de dHuR-1 o dHuR-2. c, Detección por Western blot de HuR polí-ubiquitinado después de la incubación con enzimas E1, E2 y E3 recombinantes ± 100 μM de dHuR-2 (2 h a 30 °C). Para los datos fuente del gel, consulte la Figura 2 en el material suplementario. Ub, ubiquitina. d, Mapa de criomicroscopía electrónica (cryo-EM) de DDB1-CRBN unido a HuR y dHuR-2 (el dominio BPB de DDB1 se enmascaró). e, Bolsillo de unión de dHuR-2 en el complejo ternario. Los residuos clave que interactúan se muestran en representación de barras, y el Cα de G58 se muestra en representación esférica. Los enlaces de hidrógeno se representan como líneas discontinuas. f, dHuR-2 (verde) indujo una interacción proteína-proteína estrecha entre CRBN (gris) y HuR (rosa). DDB1 se omitió para mayor claridad. g, La unión de dHuR-2 creó un área de superficie enterrada adicional en la interfaz proteína-proteína entre CRBN y HuR. La superficie enterrada de la unión de dHuR-2 (marrón claro) se comparó con la superficie enterrada entre CRBN y HuR (púrpura).

Una vez mapeado el degrón de HuR, se purificó la proteína HuR humana que contiene los dominios RRM1 y RRM2, así como las proteínas DDB1-CRBN-TBD. La resonancia plasmónica de superficie (SPR) cuantificó las interacciones CRBN-MGD, mostrando una unión más estrecha de dHuR-2 (constante de afinidad (KD) = 4,6 μM frente a 15,5 μM; Figura 2f en los datos suplementarios). La señal negativa detectada con CRBN(W386A) demostró una estricta dependencia de las interfaces CRBN-MGD intactas (Figura 2f en los datos suplementarios), lo que excluye mecanismos de unión no específicos. dHuR-2 también desencadenó una formación más fuerte del complejo ternario, como se demostró mediante experimentos de SPR que mostraron que HuR se une a CRBN-DDB1 con KD = 434 nM frente a 299 nM en presencia de dHuR-1 frente a dHuR-2 (Figura 2g en los datos suplementarios). De manera consistente, el análisis del complejo ternario mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) reveló una mayor cooperatividad para dHuR-2 en comparación con dHuR-1 (concentración efectiva máxima = 0,13 μM frente a 0,71 μM; Figura 2b). Para establecer un vínculo funcional entre la formación del complejo ternario y la activación de la maquinaria de degradación, se realizó el ensayo de etiquetado de sustratos E3 mediante biotinilación de ubiquitina (ESTUB) para verificar la ubiquitinación de HuR. Como se esperaba, la cadena de poliubiquitina se añadió al HuR endógeno en presencia de dHuR-2 (Figura 2h en los datos suplementarios). El ensayo de ubiquitinación de reconstitución in vitro también confirmó que dHuR-2 impulsa la poliubiquitinación de HuR mediada por CRL4-CRBN (Figura 2c).

Para comprender mejor la formación del complejo ternario, resolvimos la estructura de criomicroscopía electrónica (cryo-EM) del complejo DDB1-CRBN-MGD-HuR a 3,3 Å (Figura 2d y Figura 3b en los datos suplementarios) siguiendo el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 3a en los datos suplementarios. La estructura reveló que HuR interactuaba con CRBN-dHuR-2 a través de su bucle G, siendo G58 un papel fundamental. El anillo de glutarimida de dHuR-2 se unió al bolsillo Tri-W de CRBN utilizando W380, W386 y W400, al tiempo que formaba un enlace de hidrógeno con las cadenas laterales de H378. El fragmento de benzofurano se apiló contra W386, H378 y P352 en CRBN, mientras que el fragmento de pirazol se posicionó cerca del bucle G58 de HuR. El anillo de fenilo de dHuR-2 se orientó hacia el bucle F150 de CRBN, probablemente estabilizando una conformación "cerrada" de CRBN42. Además, un residuo clave, R53, en HuR interactuó con E377 en CRBN (Figura 2e). Además, nuestro degradador no solo indujo cambios conformacionales en HuR (Figura 3c-f en los datos suplementarios), sino que también promovió las interacciones CRBN-HuR, enterrando un área de superficie total de aproximadamente 780 Å2 (Figura 2f, g). Estas interacciones crearon posibles contactos entre CRBN y HuR, específicamente entre los residuos CRBN Y355, H397 y R373 y los residuos HuR V56, A57 y N30, respectivamente (Figura 3g en los datos suplementarios).

HuR degrada BRAF en el CRC mutante
Para identificar las vulnerabilidades celulares dependientes de HuR, analizamos los datos del consorcio DepMap (https://depmap.org/portal), que revelaron una fuerte correlación positiva entre HuR y BRAF, así como MEK1 (codificado por MAP2K1; Figura 4a en los datos suplementarios). El estado de mutación de BRAF surgió como el predictor más fuerte de la dependencia de HuR en las líneas celulares cancerosas (Figura 3a). BRAF muta con mayor frecuencia en los cánceres de piel y en el CRC, y la co-dependencia fue particularmente pronunciada en el CRC (Figura 4b, c en los datos suplementarios). Estos análisis sugirieron que los CRC con mutación BRAF pueden ser particularmente sensibles a la degradación de HuR.

Figura 3: La degradación de HuR exhibió una eficacia selectiva en el CRC mutante BRAF y suprimió la señalización de MAPK.
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a, El análisis de DepMap reveló una sensibilidad preferencial de las células tumorales con mutación BRAF a la deleción de HuR. Los datos representan la diferencia en las puntuaciones de CRISPR de HUR entre las líneas celulares mutantes y WT, con los números de caso indicados. Los valores de P se calcularon mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Los datos provienen de DepMap (DepMapPublic23Q2+Score y Mutation22Q2Public; https://depmap.org/portal/). Las líneas discontinuas indican el corte para el efecto de la aberración del gen y el valor de P. b, Inhibición del crecimiento de dHuR-2 en líneas celulares con mutación BRAF y WT durante 8 días. Los datos se normalizaron con respecto al control DMSO. Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 3 muestras biológicamente independientes. c, Ensayo de crecimiento de esferoides 3D de células Colo205 que expresan ARN guía único (sgRNA) de control o sgRNA dirigido a HUR (sgHuR) con o sin inducción de doxiciclina (Dox; 200 ng ml−1) (izquierda). Los datos se presentan como media ± desviación estándar; n = 3 muestras biológicamente independientes. Los valores de P se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. El inmunoblot confirmó la depleción de HuR después de la inducción (derecha). d, Análisis de Western blot de la degradación de HuR en células Colo205 parentales, CRBN−/− y HURG58A tratadas con dHuR-2 durante 24 h. La vinculina sirvió como control de carga. e, Inhibición correspondiente del esferoide 3D por dHuR-2 (0,001-1 μM) en células Colo205 parentales frente a células HURG58A durante 8 días. f, Curvas de crecimiento tumoral en xenoinjertos de Colo205 (n = 6 por grupo) tratadas con vehículo o dHuR-2 (6,25-25 mg kg−1, dos veces al día (b.i.d.)) durante 28 días. Los datos muestran el volumen tumoral medio ± SEM. mpk, mg kg−1; p.o., administración oral. g, Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los genes regulados a la baja en las células Colo205 tratadas con dHuR-2 (1 μM, 96 h) frente al control DMSO. Se muestran las diez vías principales enriquecidas (tasa de descubrimiento falso < 0,05). h, Análisis de Western blot de los componentes de la vía MAPK en células Colo205 parentales y HURG58A tratadas con dHuR-2 (0,1 o 1 μM, 6 días). Para los datos fuente del gel, consulte la Figura 2 en el material suplementario.

Los estudios de prueba de concepto en 13 líneas celulares de CRC confirmaron esta hipótesis: dHuR-2 redujoPotentemente la viabilidad en las 6 líneas con mutación BRAF, mientras que las líneas celulares BRAF WT siguieron siendo resistentes a pesar de la eficiente degradación de HuR (Figura 3b y Figura 4d, e en los datos suplementarios). Esta vulnerabilidad selectiva se validó aún más en los ensayos de formación de colonias (Figura 4f en los datos suplementarios). La corroboración genética mediante la deleción de HUR mediada por CRISPR-Cas9 recapitulo este fenotipo (Figura 3c y Figura 4g-i en los datos suplementarios). Para determinar si la degradación de HuR es responsable de la inhibición de la proliferación mediada por dHuR-2, introdujimos una mutación HURG58A en las células Colo205 mediante inserción génica (KI). La degradación de HuR inducida por dHuR-2 se abolió por completo en esta línea celular, al igual que en el caso de la depleción de CRBN (Figura 3d). En consecuencia, la deleción de CRBN o HURG58A abolió la anti-proliferación inducida por dHuR-2 en un ensayo de esferoides 3D (Figura 3e). Estos datos confirmaron el efecto dependiente de CRBN y de HuR de dHuR-2.

Dadas las propiedades fisicoquímicas favorables, la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) in vitro y la biodisponibilidad oral de dHuR-2 en ratones (Figura 5a en los datos suplementarios y Tabla 4 en el material suplementario), evaluamos su eficacia in vivo en un modelo de xenoinjerto de Colo205. Los ratones con tumores de Colo205 fueron tratados con dHuR-2 mediante administración oral (6,25, 12,5 o 25 mg kg−1, dos veces al día (b.i.d.)) durante 28 días, lo que resultó en una inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis (Figura 3f). Cabe destacar que dHuR-2 fue bien tolerado, sin cambios significativos en el peso corporal ni en las observaciones clínicas adversas (Figura 5b en los datos suplementarios). Se realizaron análisis farmacocinéticos y farmacodinámicos el día 14 (a mitad del estudio) y el día 28 (dosis final), respectivamente. Tanto las muestras de plasma como las de tumor mostraron una exposición y una interacción con el objetivo proporcionales a la dosis (Figura 5c, d en los datos suplementarios), lo que confirmó la actividad in vivo del compuesto. Además, la tasa de recuperación de HuR en los tumores de Colo205 in vivo se correlacionó con la observada in vitro, donde se necesitaron aproximadamente 24 h para que la proteína HuR se recuperara por completo después de retirar dHuR-2 del medio de cultivo de las células Colo205 (Figura 5e en los datos suplementarios).

Para dilucidar el mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento tumoral mediada por la depleción de HuR, realizamos una secuenciación de ARN (RNA-seq) en las células Colo205 tratadas con dHuR-2. El análisis de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) demostró que dHuR-2 suprimióPotentemente las vías de señalización de MAPK y relacionadas con el ciclo celular (Figura 3g), un hallazgo corroborado aún más por el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (Figura 6a en los datos suplementarios). Al aplicar un perfilado de proteómica adicional, también se descubrió que el ciclo celular y la replicación del ADN estaban enriquecidos como las principales vías de las proteínas reguladas a la baja de Colo205 tratadas con dHuR-2 (Figura 6b en los datos suplementarios). Coherente con estas observaciones, el tratamiento con dHuR-2 o la depleción genética de HuR atenuaron la señalización de MAPK e indujeron la detención del ciclo celular (fase G1) (Figura 6c, d en los datos suplementarios). Para dilucidar el papel de HuR en estas vías, tratamos las células Colo205 parentales y los mutantes isogénicos HuR(G58A) con dHuR-2. En las células parentales, dHuR-2 redujo marcadamente la fosforilación de ERK (un indicador de la vía de MAPK) y redujo los niveles de proteína de BRAF y EGFR (Figura 3h). Estos efectos se abolieron en las células mutantes HuR(G58A). En conjunto, nuestros datos respaldan un modelo en el que la pérdida de HuR interrumpe la señalización de MAPK a través de la desregulación de BRAF-EGFR, lo que culmina en la detención del ciclo celular.

HuR regula el empalme alternativo de BRAF
Para descubrir cómo la degradación de HuR mediada por dHuR-2 suprime BRAF, un mecanismo que podría explicar por qué el CRC con mutación BRAF es propenso a responder a la degradación de HuR. En primer lugar, demostramos que el tratamiento con dHuR-2 provocó una reducción dependiente de la dosis de los niveles de proteína BRAF en varias líneas celulares de CRC (Figura 4a), sin alterar la abundancia o la estabilidad del ARNm total de BRAF (Figura 7a, b en los datos suplementarios). En segundo lugar, un ensayo de pulso demostró una disminución de la síntesis de BRAF naciente después de la degradación de HuR (Figura 7c en los datos suplementarios). Al analizar los datos de RNA-seq, se observó un empalme alternativo de BRAF tras el tratamiento con dHuR-2 (Figura 4b, panel superior). Los estudios mecanísticos revelaron que la degradación de HuR promueve el omisión del exón 18 en el pre-ARNm de BRAF, como se muestra mediante la PCR específica de isoformas con transcripción inversa (RT-PCR; Fig. 4b, panel inferior). Esta regulación dependía de HuR, como se confirmó mediante las células HUR-KO y las células HuR(G58A) resistentes a la degradación (Fig. 4c). Para definir la base molecular de esta regulación, identificamos las interacciones directas entre el ARN de HuR y BRAF mediante: (1) inmunoprecipitación de ARN y ensayos de extracción de ARN, que mapearon la unión de HuR a un elemento rico en U en el intrón 17 de BRAF, lo que es consistente con el análisis del conjunto de datos público eCLIP-seq (https://www.encodeproject.org/, ENCSR296TSJ y ENCSR09OLNQ)43 (Fig. 4d, e y Fig. 7d del material suplementario); (2) análisis SPR que cuantificó la unión de alta afinidad de HuR y ARN rico en U (Fig. 4f); y (3) ensayos con minigenes, que mostraron que la deleción del elemento rico en U o la mutación de U a C abole la omisión del exón 18 de BRAF mediada por la degradación de HuR (Fig. 4g y Fig. 7e del material suplementario). Cabe destacar que este mecanismo es específico de humanos, ya que el Braf del ratón carece de la secuencia rica en U conservada. Cuando se reemplazó el intrón 17 de BRAF humano con el intrón 17 de Braf del ratón en el minigene, la omisión del exón 18 de BRAF mediada por la degradación de HuR se abolió. En las células de ratón con CRBN humano sobreexpresado, no se observó el isoforma de Braf con el exón 18 omitido (Fig. 7f del material suplementario). Con la construcción de un isoforma que incluye el exón 18 o que omite el exón 18 (designadas como BRAF-X1 y BRAF-X2, respectivamente), confirmamos que BRAF-X2 mostró una reducción drástica en la expresión de proteínas y una función alterada, al no activar la fosforilación de ERK (Fig. 4h, i). Además, un inhibidor del proteasoma, MG132, pero no el inhibidor del lisosoma CQ, aumentó ligeramente la abundancia de proteínas de mCherry–X2, en la que mCherry se fusionó con la región C-terminal (E17–E19) de BRAF-X2 (Fig. 4j). También realizamos ensayos de fraccionamiento de polisomas y descubrimos que, a diferencia de BRAF-X1, BRAF-X2 estaba más enriquecido en fracciones de monosomas y tenía una asociación reducida con los polisomas, lo que indica una eficiencia de traducción significativamente menor de este transcrito (Fig. 4k, l). Estas observaciones son consistentes con una publicación anterior44. En conjunto, dHuR-2 aumentó la conversión del transcrito BRAF-X1 a BRAF-X2 (Fig. 4m), que no se podía traducir en proteína BRAF de manera eficiente y robusta. Estos resultados demostraron que la degradación de HuR suprimió la expresión de BRAF al promover la unión al ARN dependiente de elementos ricos en U y la omisión del exón 18, revelando un nuevo mecanismo basado en el splicing que regula los niveles oncogénicos de BRAF mediante HuR. Fig. 4: HuR reguló el splicing de BRAF a través de la unión directa al ARN. El texto alternativo para esta imagen puede haber sido generado utilizando IA. Imagen de tamaño completo. a, Análisis de Western blot de los niveles de proteína HuR, BRAF y EGFR en líneas celulares de CRC con mutación BRAF y WT tratadas con DMSO o dHuR-2 durante 8 días. La vinculina sirvió como control de carga. b, Rastros de RNA-seq de la región del exón 17-19 de BRAF con el porcentaje de splicing (arriba). Análisis de RT-PCR de los transcritos de BRAF con el exón 18 incluido o omitido en las células Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2 a lo largo del tiempo (6-24 h) (abajo). El sombreado rojo resalta la región (alrededor del exón 18 de BRAF) con el número de lecturas que cambia notablemente tras el tratamiento con dHuR-2. c, Análisis de RT-PCR de la abundancia de transcritos de BRAF con el exón 18 incluido o omitido en las células HURG58A (arriba) o HUR-KO (abajo) de Colo205. sgNT, sgRNA no dirigido. d, Análisis de PCR cuantitativa (qPCR) de los ARN unidos de IgG o extracciones de HuR en células Colo205 tratadas con o sin dHuR-2. RIP, inmunoprecipitación de ARN. e, Western blot de las extracciones de HuR utilizando ARN biotinilado del intrón 17 de BRAF (que contiene el elemento rico en U) frente al control revuelto. f, Sensorgramas de la unión de HuR a un elemento rico en U derivado del ARN de BRAF (de 3,84 a 0,03 μM, diluciones de dos en dos). RU, unidad de respuesta. g, Diagrama del minigene de BRAF (arriba) y análisis de RT-PCR de las variantes del minigene de BRAF (WT frente a mutante rico en U) en células 293T tratadas con 1 μM de dHuR-2 (24 h; abajo). Para el mutante rico en U, la secuencia rica en U de 20 pb aguas arriba del sitio de empalme 3' (SS) se mutó a UCUCUCUCUCUCUCUCUCUC. h, Esquema de la región 3' de BRAF que muestra las isoformas que incluyen el exón 18 (X1) y que omiten el exón 18 (X2). La omisión del exón 154 pb 18 desplaza el codón de parada en 127 pb, lo que da como resultado una BRAF-X2 27 pb más corta. i, Esquema de los constructos de reportero FLAG–BRAF (X1 o X2)–IRES–eGFP (arriba). Análisis de Western blot de las células 293T que expresan las isoformas de BRAF, que muestra los niveles de FLAG–BRAF y p-ERK (abajo). j, Reporteros de doble fluorescencia del extremo C de BRAF (exones 17-19) para X1 o X2 (arriba). Citometría de flujo de mCherry normalizada a eGFP en células tratadas con DMSO, CQ (10 μM, 24 h) o MG132 (10 μM) también se muestra (abajo). k, Perfil de polisomas de lisados de células Colo205 (sucrosa del 10 al 50%). El rastro de absorbancia (densidad óptica a 260 nm (OD260)) muestra los picos de 40S, 60S y 80S de monosomas y polisomas. Las fracciones analizadas en los paneles posteriores se indican a lo largo del eje x. Esquema creado en BioRender; Wang, X. https://biorender.com/prnw9m6 (2026). l, Distribución de los ARNm de BRAF-X1 y BRAF-X2 en las fracciones de polisomas cuantificada mediante RT-qPCR. El ARNm de ACTB sirvió como control positivo para los transcritos en traducción. Los datos se presentan como el porcentaje del ARNm total en cada fracción. m, RT-qPCR del cambio de isoformas de BRAF (X1/X2) en las células Colo205 ± dHuR-2 (1 μM, 24 h). Los datos se presentan como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (d, j, l, m). Los valores de P se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los datos fuente del gel, consulte la Fig. 2 del material suplementario. Para explorar más a fondo el efecto de la degradación de HuR en la regulación del splicing, realizamos un análisis de splicing basado en los datos de RNA-seq y revelamos que dHuR-2 alteró solo el 2% del total de eventos de lectura de unión, y la omisión de exones fue el tipo principal de estas alteraciones (68,7%; Fig. 7g del material suplementario). Para excluir el efecto indirecto, superpusimos estos eventos de splicing controlados por HuR con los ARN unidos a HuR potenciales de los conjuntos de datos públicos eCLIP-seq (https://www.encodeproject.org/, ENCSR09OLNQ) y encontramos 288 genes en común. Mientras tanto, para comprender la consecuencia de la regulación del splicing en los niveles de proteínas, integramos la proteómica de toda la célula en Colo205 tras el tratamiento con dHuR-2. Entre los 288 genes, solo 4 genes (BRAF, NSD2, SLC35B1 y GRB10) mostraron una disminución significativa en el nivel de proteína, lo que indica que la alteración directa del splicing regulada por HuR no siempre se traduce en cambios en la abundancia de proteínas (Fig. 7h del material suplementario). Teniendo en cuenta que BRAF no es el único gen regulado por la degradación de HuR, se realizó un experimento de rescate para determinar el papel del splicing de BRAF mediado por dHuR y la disminución de la proteína en sus actividades antiproliferativas en el CRC con mutación BRAF. Generamos una línea celular estable (MDST8) con sobreexpresión inducible de BRAF(V600E) (CDS) y confirmamos que la sobreexpresión de FLAG–BRAF(V600E) (CDS) no se redujo mediante dHuR-2, y los niveles de p-ERK permanecieron sin cambios tras el tratamiento con dHuR-2. En este caso, la mayor parte del efecto antiproliferativo de dHuR-2 se rescató mediante la sobreexpresión de BRAF(V600E) (con CDS sin intrones). Por el contrario, la sobreexpresión de FLAG–BRAF(V600E) (con el intrón 17), que aún respondía a la regulación del splicing mediada por dHuR-2, no logró rescatar el efecto antiproliferativo de dHuR-2 (Fig. 7i, j del material suplementario). En conjunto, llegamos a la conclusión de que HuR modula, de hecho, genes adicionales más allá de BRAF. Sin embargo, el efecto de la degradación de HuR en la regulación del splicing y la posterior disminución de la proteína no parece ser generalizado en el contexto del CRC con mutación BRAF. Además, se demostró que el splicing de BRAF es un actor importante en la mediación del efecto antiproliferativo de la degradación de HuR. Además de nuestros hallazgos que establecen la regulación del splicing de BRAF mediada por HuR, estudios anteriores han demostrado que HuR se une y regula posttranscripcionalmente el ARNm de VEGFA14,45. Aquí, encontramos que la degradación de HuR redujo los niveles de ARNm y proteína secretada de VEGFA (Fig. 8a del material suplementario). Mecánicamente, la eficiencia del splicing del pre-ARNm se redujo, ya que la reducción de la expresión del ARNm de VEGFA se observó antes de la reducción del pre-ARNm (Fig. 8b-d del material suplementario). Al analizar los conjuntos de datos públicos eCLIP-seq (https://www.encodeproject.org/, ENCSR09OLNQ), identificamos picos de unión de HuR en VEGFA (Fig. 8e del material suplementario). Utilizando ensayos de extracción de ARN, se descubrió que una secuencia rica en U dentro del intrón 5 de VEGFA es necesaria para la unión de HuR (Fig. 8f, g del material suplementario). Como resultado de la unión y la regulación del splicing de VEGFA por HuR, tras el tratamiento con dHuR, se detectó menos angiogénesis (indicada por la tinción de CD31 del ratón) en los tumores de Colo205 CDX (Fig. 8h del material suplementario). Este efecto antiangiogénico puede contribuir a la actividad antitumoral in vivo de dHuR. Los dHuR inhiben las células resistentes a BRAFi y se combinan sinérgicamente con BRAFi. El CRC sigue siendo un importante problema de salud mundial, especialmente en pacientes con mutaciones de BRAF, que se asocian con un mal pronóstico. Las opciones de tratamiento sistémico para estos pacientes incluyen BRAFi más anti-EGFR con o sin quimioterapia más anti-VEGF6,46,47. A pesar de los grandes avances, siguen existiendo importantes necesidades insatisfechas para los pacientes cuyos tumores albergan mutaciones de BRAF debido al rápido desarrollo de la resistencia a la inhibición de BRAF3. Para evaluar la degradación de HuR como una estrategia para superar la resistencia, generamos líneas resistentes a BRAFi (WiDr, HT29 y MDST8 para CRC, y SH4 para melanoma; todas ellas con mutaciones BRAF(V600E) o BRAF(V600K)) mediante un tratamiento con dabrafenib en dosis crecientes durante más de 3 meses. Todas las líneas resistentes mostraron resistencia a encorafenib, un BRAFi de nueva generación, pero conservaron la sensibilidad a dHuR-2 (Fig. 5a y Fig. 9a, b del material suplementario). En el CRC con mutación BRAF(V600E), la reactivación mediada por EGFR de la vía MAPK se consideró uno de los principales mecanismos de resistencia. Coherente con la literatura1,2, las líneas resistentes inducidas compartieron características comunes identificadas en pacientes resistentes clínicos, incluido el aumento de la expresión de RTK (EGFR, FGFR y MET) y RAS, entre otras proteínas (Fig. 9c del material suplementario). También se observaron niveles más altos de EGFR en las líneas celulares de CRC con mutación BRAF(V600E) o BRAF(V600K) que en la línea celular de melanoma (A375; Fig. 9d del material suplementario). BRAFi indujo la regulación al alza de p-EGFR, mejoró la señalización de p-ERK y la expresión compensatoria de genes relacionados con MAPK a través de un bucle de retroalimentación después de 6 h (Fig. 9e-g del material suplementario). Por el contrario, dHuR-2 mantuvo la supresión de la vía MAPK durante al menos 8 días, junto con la reducción de la proteína BRAF y EGFR (Fig. 4a y Fig. 5b). Las células resistentes a BRAFi aún podían responder a la depleción de HuR o BRAF, lo que podría explicar por qué los dHuR mantuvieron la actividad antiproliferativa en las células resistentes a BRAFi (Fig. 5c y Fig. 9h del material suplementario). Se observó un efecto antiproliferativo sinérgico o, al menos, aditivo de dHuR-2 combinado con BRAFi en múltiples líneas celulares de CRC con mutación BRAF (Fig. 5d y Fig. 10a del material suplementario). Se observaron fenotipos similares en los xenoinjertos derivados de pacientes cuando se combinaron BRAFi y dHuR-3 (9) (Fig. 5e y Fig. 10b del material suplementario), un análogo cercano de dHuR-2 que muestra menos inhibición del citocromo P450, lo que reduce el potencial de interacción fármaco-fármaco y, por lo tanto, es más adecuado para los estudios de combinación de fármacos in vivo. En consecuencia, hubo una inhibición más profunda de la vía MAPK tras el tratamiento combinado (Fig. 5f, g). Utilizando los sistemas HUR-KO y HuR(G58A)-mutante, confirmamos que un efecto combinado requiere estrictamente la depleción o degradación de HuR (Fig. 10c, d del material suplementario). Además, al realizar un cribado CRISPR imparcial con una biblioteca de kinomas en las células HT29 (Fig. 10e del material suplementario), descubrimos que EGFR fue el gen principal cuya depleción sensibilizó a las células a dHuR-2. MAPK1 (también conocido como ERK2) también se incluyó entre los principales candidatos, lo que enfatiza nuevamente la participación de la vía EGFR-RAF-MEK-ERK (Fig. 5h). De manera consistente, EGFRi o MEKi mejoraron la inhibición de la formación de colonias cuando se combinaron con dHuR-2 en las células HT29 (Fig. 5i). El efecto sinérgico de potenciar la citotoxicidad entre dHuR-2 y un inhibidor de EGFR o MEK también se observó en las células Colo205, Colo201, HT29 y WiDr (Figura de datos ampliados 10f).

Fig. 5: La degradación de HuR supera la resistencia a los inhibidores de BRAF mediante la supresión sostenida de la vía de señalización.

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a, Curvas de respuesta a la dosis para la viabilidad celular de las células WiDr parentales y resistentes a los inhibidores de BRAF tratadas con dabrafenib (0,1–100 nM), encorafenib (0,1–100 nM) o dHuR-2 (0,01–10 μM) durante 6 días. b, Inmunoblot de los niveles de HuR, BRAF y p-ERK en las células Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2 desde 3 h hasta 8 días. HSP70 se utilizó como control de carga. c, Ensayo de formación de colonias de las células WiDr parentales y resistentes a los inhibidores de BRAF transfectadas con sgCtrl o sgHuR después de 14 días de cultivo (izquierda), e inmunoblot de confirmación de la eficiencia de la eliminación de HUR (derecha). d, Viabilidad celular relativa de las células Colo205 tratadas con dabrafenib (0,1–10 nM) ± dHuR-2 (0,1 o 0,3 μM) durante 6 días. e, Curvas de crecimiento tumoral de un xenoinjerto derivado del paciente (PDX) con BRAFV600E tratado con vehículo, dHuR-3 (25 mg/kg, una vez al día), encorafenib (30 mg/kg, una vez al día) o una combinación durante 25 días. Una vez al día. n = 6 animales por grupo. Los datos muestran el volumen tumoral medio ± SEM. f, Puntuación de la firma KEGG de la vía MAPK en las células Colo205 tratadas durante 96 h con DMSO, 1 μM de dHuR-2, 3 nM de dabrafenib o ambos. Se realizó el secuenciamiento para duplicados biológicos. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), el rango intercuartílico (caja) y el rango completo de datos (bigotes). Se superponen los puntos de datos individuales. g, Inmunoblot de los componentes de la vía MAPK en las células Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2, 3 nM de dabrafenib o ambos. La vinculina se utilizó como control de carga. h, Diagrama de dispersión de los genes sintéticamente letales para dHuR-2. El eje x muestra la puntuación de esencialidad del gen, que se muestra como el cambio de pliegue logarítmico (log2FC; día 12 de DMSO frente a día 0 de DMSO), y el eje y indica la puntuación de sensibilidad, que se muestra como log2FC (día 12 de dHuR-2 frente a día 12 de DMSO). Los genes sintéticamente letales para dHuR-2 se marcan con puntos rojos. i, Formación de colonias en las células HT29 tratadas con dHuR-2 (1 μM), gefitinib (3 μM), MEK162 (10 nM) o ambos durante 14 días. j, Diagrama que ilustra el mecanismo de acción de la sinergia de dHuR con los inhibidores de BRAF, EGFR o MEK mediante la mediación del salto del exón 18 de BRAF. Diagrama creado en BioRender; Wang, X. https://biorender.com/wk9d06q (2026). Para los datos fuente del gel, consulte la Figura suplementaria 3.

Datos fuente

Discusión

El CRC sigue siendo una carga importante para la salud mundial, con una alta mortalidad, especialmente en pacientes con alteraciones genéticas específicas, como las mutaciones de BRAF. Los regímenes aprobados para estos pacientes a menudo combinan los inhibidores de BRAF con los anti-EGFR y otras terapias dirigidas. Sin embargo, los pacientes con CRC con mutación de BRAF siguen teniendo opciones de tratamiento limitadas y una rápida resistencia a los fármacos3, lo que pone de manifiesto las necesidades médicas insatisfechas. En este estudio, identificamos HuR como una vulnerabilidad en el CRC con mutación de BRAF e informamos sobre el desarrollo de los primeros MGD de su clase: dHuR-1 y dHuR-2. Las actividades antitumorales de los dHuR en el CRC con mutación de BRAF se demostraron a fondo a través de una serie de análisis bioinformáticos, ensayos celulares in vitro y modelos in vivo. Como se muestra en el diagrama de la Figura 5j, descubrimos que la degradación de HuR interrumpió el empalme de BRAF, suprimió la expresión de EGFR e inhibió la angiogénesis mediada por VEGFA, superando así la resistencia a los inhibidores de BRAF. Entre ellos, la degradación de HuR interrumpe la vía MAPK al inducir el salto del exón 18 en el pre-ARNm de BRAF, lo que reduce los niveles de proteína BRAF oncogénica y la fosforilación de ERK aguas abajo. Este hallazgo dilucida un mecanismo regulador postranscripcional previamente no reconocido para BRAF, que ofrece una nueva estrategia terapéutica para el CRC con mutación de BRAF. La inhibición dual de BRAF y EGFR por la degradación de HuR subraya su potencial para superar la resistencia a los inhibidores de BRAF, que a menudo fracasan debido a la reactivación compensatoria de la vía MAPK. Estos resultados respaldan el desarrollo de dHuR para el tratamiento del CRC con mutación de BRAF. Aunque nuestros hallazgos son prometedores, todavía existen limitaciones. Dado que nuestras líneas celulares de resistencia utilizaron modelos inducidos en el laboratorio en lugar de modelos de resistencia derivados clínicamente, lo que simplifica potencialmente los complejos mecanismos de resistencia observados en los pacientes, los efectos de la degradación de HuR también deberán evaluarse de forma exhaustiva antes y durante la investigación clínica en humanos.

Más allá de BRAF, se ha informado que HuR regula una red de ARNm oncogénicos, incluidos VEGF, EGFR y los reguladores del ciclo celular, que influyen en el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la resistencia a la terapia15,45,48. Nuestros datos mostraron que la degradación de HuR reduce la expresión de VEGFA, lo que perjudica la angiogénesis tumoral y altera el microambiente tumoral. Este efecto pleiotrópico sugiere que los degradadores de HuR podrían dirigirse simultáneamente a múltiples características del cáncer, lo que ofrece ventajas sobre los inhibidores de una sola vía. Sin embargo, también observamos que los ARNm diana de HuR parecen depender del contexto. Dado que HuR actúa como un sensor del estrés, su red reguladora podría alterarse en un microambiente de estrés. Los estudios futuros deberían explorar los cambios transcriptómicos y proteómicos más amplios inducidos por la degradación de HuR para identificar oportunidades terapéuticas y biomarcadores de respuesta adicionales.

Por el contrario, el desarrollo de MGD que se dirigen a la proteína de unión al ARN HuR representó un avance notable en la focalización de proteínas no susceptibles a fármacos. Un estudio reciente49 ha descubierto dos tipos de dHuR: uno es una quimera de proteólisis basada en CRBN (PROTAC) con reclutadores de HuR conjugados con talidomida; el otro son las llamadas "colas bivalentes", que se unen tanto a la E3 ligasa como a HuR a través de sitios de unión distintos en un andamio compacto, sin necesidad de un largo enlazador. El estudio mencionó que la E3 que se une a las colas bivalentes es RNF165, pero no se encontraron datos de respaldo en el artículo. Otra bioPROTAC dirigida a HuR (T21RBCC-VHHHuR)50 se utilizó como herramienta para evaluar la biología de la degradación de HuR. Sin embargo, ninguno de estos compuestos de laboratorio se ha trasladado a ensayos preclínicos debido a la falta de una caracterización completa o una potencia suficiente. Aquí hemos revelado las colas monovalentes clásicas para HuR, con un mecanismo distinto, que se unen a una E3 ligasa (CRBN) y remodelan su superficie para reclutar a HuR. También se demostró la degradación dependiente de la dosis y las actividades antitumorales. Además, nuestro estudio dilucidó la base estructural y mecanicista de la degradación de HuR inducida por MGD. La estructura de cristalografía de rayos X del complejo ternario CRBN-MGD-HuR reveló interacciones críticas que estabilizan el complejo, incluido el compromiso del asa G de HuR con CRBN y el "parche de pegamento" hidrofóbico formado por dHuR-2. Estas perspectivas estructurales proporcionaron un posible plano para el diseño racional de MGD dirigidos a HuR, así como para la mejora de la selectividad.

En conclusión, nuestro estudio estableció a HuR como un objetivo terapéutico convincente en el CRC con mutación de BRAF, lo que allanó el camino para las aplicaciones traslacionales de los dHuR. En cuanto a las evaluaciones de seguridad, se determinó que los compuestos herramienta utilizados en este estudio (dHuR1-3) eran inactivos (IC50 > 30 μM) frente al canal iónico hERG. Se realizó un estudio de tolerabilidad exploratorio con dHuR-3 tanto en ratones WT como en ratones humanizados Crbn-KI, estos últimos permitieron la degradación de HuR inducida por dHuR-3 in vivo. El tratamiento de estos ratones con dHuR-3 a una dosis eficaz produjo una reducción mínima del peso corporal a pesar de la degradación eficiente de HuR en múltiples órganos, incluido el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el cerebro (Figura suplementaria 1). Solo se realizaron evaluaciones de toxicidad y seguridad estándar para DEG6498, el candidato clínico de MGD de HuR de Degron Therapeutics. Ha demostrado un perfil de toxicidad y seguridad aceptable y ha sido aprobado por los organismos reguladores para el desarrollo clínico en tumores sólidos avanzados, incluidos los tumores con mutación de BRAF como cohorte de expansión (ClinicalTrials.gov NCT07244835).

Métodos

Cualquier método y referencias adicionales se incluyen en la información complementaria.

Resumen de la información

Hay más información sobre el diseño de la investigación disponible en el Resumen de información de Nature Portfolio vinculado a este artículo. Disponibilidad de datos

Todos los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el artículo y en la información suplementaria. Se han proporcionado imágenes y geles de Western blot completos y sin recortar en las Figuras Suplementarias 2 a 6. Los conjuntos de datos eCLIP-seq analizados en este estudio están disponibles públicamente (https://www.encodeproject.org/). Los datos de cribado CRISPR procesados y los datos de mutación genética de las líneas celulares se descargaron de DepMap (https://depmap.org/portal). Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en el Genome Sequence Archive del National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA-Human: HRA012545) y son de acceso público (https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/browse). Los datos de proteómica se han depositado en el ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio asociado iProX, con los identificadores de conjunto de datos PXD077365 y PXD072281. La estructura y el mapa de criomicroscopía electrónica se han depositado en la Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) y en la Electron Microscopy Data Bank (https://www.ebi.ac.uk/emdb/), con los códigos de acceso 9W2F y EMD-65569, respectivamente. Los datos fuente se proporcionan con este artículo. Referencias: Corcoran, R. B. et al. EGFR-mediated re-activation of MAPK signaling contributes to insensitivity of BRAF mutant colorectal cancers to RAF inhibition with vemurafenib. Nature 2, 227–235 (2012). CAS Google Scholar Prahallad, A. et al. Unresponsiveness of colon cancer to BRAF(V600E) inhibition through feedback activation of EGFR. Nature 483, 100–103 (2012). Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar Kopetz, S. et al. Molecular profiling of BRAF-V600E-mutant metastatic colorectal cancer in the phase 3 BEACON CRC trial. Nat. Med. 30, 3261–3271 (2024). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Yi, Q. et al. Spectrum of BRAF aberrations and its potential clinical implications insights from integrative pan-cancer analysis. Front. Bioeng. Biotechnol. 14, 806851 (2022). Artículo Google Scholar Kopetz, S. et al. Phase II pilot study of vemurafenib in patients with metastatic BRAF-mutated colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 33, 4032–4038 (2015). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Tabernero, J. et al. Encorafenib plus cetuximab as a new standard of care for previously treated BRAF V600E-mutant metastatic colorectal cancer: updated survival results and subgroup analyses from the BEACON study. J. Clin. Oncol. 39, 273–284 (2021). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Corcoran, R. B. et al. Combined BRAF, EGFR, and MEK inhibition in patients with BRAFV600E-mutant colorectal cancer. Cancer Discov. 8, 428–443 (2018). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Brennan, C. M. & Steitz, J. A. HuR and mRNA stability. Cell. Mol. Life Sci. 58, 266–277 (2001). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Mukherjee, N. et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR (ELAVL1) couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Mol. Cell 43, 327–339 (2011). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Wu, M., Tong, C. W. S., Yan, W., To, K. K. W. & Cho, W. C. S. The RNA binding protein HuR: a promising drug target for anticancer therapy. Curr. Cancer Drug Target. 19, 382–399 (2019). Artículo CAS Google Scholar Lachiondo-Ortega, S. et al. Hu antigen R (HuR) protein structure, function and regulation in hepatobiliary tumors. Cancers 14, 2666 (2022). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Kotta-Loizou, I., Giaginis, C. & Theocharis, S. Clinical significance of HuR expression in human malignancy. Med. Oncol. 31, 161 (2014). Artículo PubMed Google Scholar Levy, N. S., Chung, S., Furneaux, H. & Levy, A. P. Hypoxic stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by the RNA-binding protein HuR. J. Biol. Chem. 273, 6417–6423 (1998). Artículo CAS PubMed Google Scholar Kurosu, T. et al. HuR keeps an angiogenic switch on by stabilising mRNA of VEGF and COX-2 in tumour endothelium. Br. J. Cancer 104, 819–829 (2011). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Finan, J. M., Sutton, T. L., Dixon, D. A. & Brody, J. R. Targeting the RNA-binding protein HuR in cancer. Cancer Res. 83, 3507–3516 (2023). Artículo CAS PubMed Google Scholar Lang, M. et al. HuR small-molecule inhibitor elicits differential effects in adenomatosis polyposis and colorectal carcinogenesis. Cancer Res. 77, 2424–2438 (2017). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Jimbo, M. et al. Targeting the mRNA-binding protein HuR impairs malignant characteristics of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Oncotarget 6, 27312–27331 (2015). Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar Chand, S. N. et al. Posttranscriptional regulation of PARG mRNA by HuR facilitates DNA repair and resistance to PARP inhibitors. Cancer Res. 77, 5011–5025 (2017). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Danilin, S. et al. Role of the RNA-binding protein HuR in human renal cell carcinoma. Carcinogenesis 31, 1018–1026 (2010). Artículo CAS PubMed Google Scholar Huang, Y.-H. et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Res. 76, 1549–1559 (2016). Artículo CAS PubMed Google Scholar Yuan, Z., Sanders, A. J., Lin Ye, Y. W. & Jiang, W. G. Knockdown of human antigen R reduces the growth and invasion of breast cancer cells in vitro and affects expression of cyclin D1 and MMP-9. Oncol. Rep. 26, 237–245 (2011). CAS PubMed Google Scholar Zhang, Z., Huang, A., Zhang, A. & Zhou, C. HuR promotes breast cancer cell proliferation and survival via binding to CDK3 mRNA. Biomed. Pharmacother. 91, 788–795 (2017). Artículo CAS PubMed Google Scholar Papatheofani, V. et al. HuR protein in hepatocellular carcinoma: implications in development, prognosis and treatment. Biomedicines 9, 119 (2021). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Zhang, Y., Yang, L., Ling, C. & Heng, W. HuR facilitates cancer stemness of lung cancer cells via regulating miR-873/CDK3 and miR-125a-3p/CDK3 axis. Biotechnol. Lett. 40, 623–631 (2018). Artículo CAS PubMed Google Scholar Palomo-Irigoyen, M. et al. HuR/ELAVL1 drives malignant peripheral nerve sheath tumor growth and metastasis. J. Clin. Invest. 130, 3848–3864 (2020). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Schultz, C. W., Preet, R., Dhir, T., Dixon, D. A. & Brody, J. R. Understanding and targeting the disease-related RNA binding protein human antigen R (HuR). WIREs RNA 11, e1581 (2020). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Krönke, J. et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science 343, 301–305 (2014). Artículo ADS PubMed Google Scholar Wu, W. et al. Overcoming IMiD resistance in T-cell lymphomas through potent degradation of ZFP91 and IKZF1. Blood 139, 2024–2037 (2022). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Renneville, A. et al. Avadomide induces degradation of ZMYM2 fusion oncoproteins in hematologic malignancies. Blood Cancer Discov. 2, 250–265 (2021). Artículo CAS PubMed Google Scholar Matyskiela, M. E. et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nat. Chem. Biol. 14, 981–987 (2018). Artículo CAS PubMed Google Scholar Bonazzi, S. et al. Discovery and characterization of a selective IKZF2 glue degrader for cancer immunotherapy. Cell Chem. Biol. 30, 235–247.e12 (2023). Artículo CAS PubMed Google Scholar Ting, P. Y. et al. A molecular glue degrader of the WIZ transcription factor for fetal hemoglobin induction. Science 385, 91–99 (2024). Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar Krönke, J. et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1α in del(5q) MDS. Nature 523, 183–188 (2015). Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar Matyskiela, M. E. et al. A novel cereblon modulator recruits GSPT1 to the CRL4(CRBN) ubiquitin ligase. Nature 535, 252–257 (2016). Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar Matyskiela, M. E. et al. Crystal structure of the SALL4–pomalidomide–cereblon–DDB1 complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 27, 319–322 (2020). Artículo CAS PubMed Google Scholar Fischer, E. S. et al. Structure of the DDB1–CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature 512, 49–53 (2014). Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Petzold, G., Fischer, E. S. & Thomä, N. H. Structural basis of lenalidomide-induced CK1α degradation by the CRL4CRBN ubiquitin ligase. Nature 532, 127–130 (2016). Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar Akdel, M. et al. A structural biology community assessment of AlphaFold2 applications. Nat. Struct. Mol. Biol. 29, 1056–1067 (2022). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Dai, W., Zhang, G. & Makeyev, E. V. RNA-binding protein HuR autoregulates its expression by promoting alternative polyadenylation site usage. Nucleic Acids Res. 40, 787–800 (2012). Artículo CAS PubMed Google Scholar Sievers, Q. L. et al. Defining the human C2H2 zinc finger degrome targeted by thalidomide analogs through CRBN. Science 362, eaat0572 (2018). Fink, E. C. et al. Crbn I391V is sufficient to confer in vivo sensitivity to thalidomide and its derivatives in mice. Blood 132, 1535–1544 (2018). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Watson, E. R. et al. Molecular glue CELMoD compounds are regulators of cereblon conformation. Science 378, 549–553 (2022). Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Abascal, F. et al. Expanded encyclopaedias of DNA elements in the human and mouse genomes. Nature 583, 699–710 (2020). Artículo Google Scholar Marranci, A. et al. The landscape of BRAF transcript and protein variants in human cancer. Mol. Cancer 16, 85 (2017). Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar Chang, S.-H. et al. Antagonistic function of the RNA-binding protein HuR and miR-200b in post-transcriptional regulation of vascular endothelial growth factor-A expression and angiogenesis. J. Biol. Chem. 288, 4908–4921 (2013). Artículo CAS PubMed Google Scholar Benson, A. B. et al. Colon Cancer, version 3.2024, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. J. Natl Comp. Cancer Netw. 22, e240029 (2024). Kopetz, S. et al. Encorafenib, cetuximab and chemotherapy in BRAF-mutant colorectal cancer: a randomized phase 3 trial. Nat. Med. 31, 901–908 (2025). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Wang, A. et al. Long noncoding RNA EGFR-AS1 promotes cell growth and metastasis via affecting HuR mediated mRNA stability of EGFR in renal cancer. Cell Death Dis. 10, 154 (2019). Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar Kassabri, L. & Benhamou, R. I. Druglike molecular degraders of the oncogenic RNA-binding protein HuR. JACS Au 5, 3879–3891 (2025). Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Fletcher, A. et al. A TRIM21-based bioPROTAC highlights the therapeutic benefit of HuR degradation. Nat. Commun. 14, 7093 (2023). Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar Benoit, R. M. et al. The X-ray crystal structure of the first RNA recognition motif and site-directed mutagenesis suggest a possible HuR redox sensing mechanism. J. Mol. Biol. 397, 1231–1244 (2010). Agradecimientos: Agradecemos a L. Zou por sus valiosas sugerencias, a N. Zheng por su apoyo técnico y al Consorcio ENCODE y al laboratorio de producción ENCODE por generar los conjuntos de datos ENCSR296TSJ y ENCSR09OLNQ. Algunos de los datos utilizados en esta publicación fueron generados por Degron Therapeutics. También se agradece el apoyo del Sistema de Espectrometría de Masas, el Sistema de Flujo y el Centro de Recursos MCB de la Escuela de Ciencias y Tecnología de la Vida de la Universidad de ShanghaiTech.

Financiación: Esta investigación fue apoyada por el Centro de Ciencias Fronterizas de Shanghai para Biomacromoléculas y Medicina de Precisión en la Universidad de ShanghaiTech. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D (n.º 2025YFA1309004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 31970671 y 92053118) y el Plan de Avance de Disciplinas Fundamentales e Interdisciplinarias del Ministerio de Educación de China (n.º JYB2025XDXM502).

Información de los autores: Notas de los autores: Estos autores contribuyeron por igual: Xiaocui Lu, Xiuyun Wang, Zheng Yang, Xusheng Wang.

Autores y afiliaciones: Escuela de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de ShanghaiTech, Shanghai, China: Xiaocui Lu, Xiuyun Wang, Xusheng Wang, Lin Wang, Yisheng Pu, Keyu Zhang, Ziqiang Zhu, Lanxin Ye, Jiayuan Huang, Xiaofan Wei, Fang Bai y Yong Cang.

Degron Therapeutics Co., Ltd, Shanghai, China: Zheng Yang, Lin Wang, Chunhui Xu, I-Chung Lo, Chenlu Geng, Xiaobing Qian, Hao Dou, Hexiu Su y Yong Cang.

Instituto para el Estudio Avanzado en Física y Centro de Innovación Científica y Tecnológica Global ZJU-Hangzhou, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China: Yanan Zhu.

Autores: Xiaocui Lu, Xiuyun Wang, Zheng Yang, Xusheng Wang, Lin Wang, Chunhui Xu, I-Chung Lo, Chenlu Geng, Yisheng Pu, Keyu Zhang, Ziqiang Zhu, Lanxin Ye, Jiayuan Huang, Xiaofan Wei, Yanan Zhu, Xiaobing Qian, Hao Dou, Hexiu Su y Yong Cang.

Consultar las publicaciones de los autores: Xiaocui Lu, Xiuyun Wang, Zheng Yang, Xusheng Wang, Lin Wang, Chunhui Xu, I-Chung Lo, Chenlu Geng, Yisheng Pu, Keyu Zhang, Ziqiang Zhu, Lanxin Ye, Jiayuan Huang, Xiaofan Wei, Yanan Zhu, Xiaobing Qian, Hao Dou, Hexiu Su y Yong Cang.

Contribuciones: X.L., Xiuyun W., Z.Y. y Xusheng W. contribuyeron por igual. Z.Y. diseñó y sintetizó los compuestos. X.L. diseñó y realizó los ensayos celulares para la validación del mecanismo de acción de la molécula adhesiva. Xiuyun W. diseñó y realizó el cribado de panel celular y la exploración para superar la resistencia a BRAFi y su efecto sinérgico. Xusheng W. diseñó y realizó la investigación sobre la regulación del empalme de BRAF. H.D. y L.W. (Degron Therapeutics) diseñaron y llevaron a cabo los estudios sobre las evaluaciones de complejos binarios y ternarios. H.D. resolvió la estructura de la cristalografía de rayos X. Y.Z. ayudó a refinar el mapa de la cristalografía de rayos X. C.X. e I-C.L. realizaron el análisis bioinformático. C.G. llevó a cabo la comparación de la potencia de degradación para respaldar la exploración de la relación estructura-actividad. Y.P. fue responsable de la cría de ratones Crbn-KI y el aislamiento de fibroblastos embrionarios de ratón. K.Z., Z.Z., L.Y., J.H. y X.W. ayudaron a realizar los experimentos repetidos para la verificación y el procesamiento de los datos de Western blot. L.W. (Universidad de ShanghaiTech) y F.B. realizaron la predicción de degrones mediante el diseño de fármacos asistido por ordenador. X.Q. proporcionó orientación al proyecto para los estudios de mecanismo, farmacocinética, farmacodinámica y farmacología. H.S. y Y.C. concibieron el proyecto y redactaron el manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Autores correspondientes: Correspondencia a Hao Dou, Hexiu Su o Yong Cang.

Declaraciones éticas:

Conflictos de intereses: Z.Y., L.W. (Degron Therapeutics), C.X., I-C.L., C.G., X.Q., H.D. y H.S. son empleados actuales y accionistas de Degron Therapeutics. Y.C. es accionista y consultor de Degron Therapeutics, y recibe financiación para la investigación de Degron Therapeutics. Z.Y., H.S., C.G. y H.D. tienen una patente relacionada con este trabajo: WO2024114639A, titulada ‘Compuestos para modular HuR (ELAVL1)’; estos autores no declaran otros conflictos de intereses. Los demás autores no declaran conflictos de intereses.

Revisión por pares:

Información sobre la revisión por pares: Nature agradece a Rene Bernards, Mikihiko Naito, Weiping Tang y al otro revisor anónimo su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Información adicional: La nota del editor de Springer Nature indica que se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales.

Datos ampliados, figuras y tablas:

Figura de datos ampliados 1: Validación de la degradación de HuR. a, Western blot de HuR en células JHH-7 CRBN WT y CRBN-KO tratadas con cicloheximida (CHX; 100 µg/ml) en presencia o ausencia de dHuR-1 (10 µM) a lo largo del tiempo. La vinculina se utilizó como control de carga. b, Cuantificación de RT-qPCR de HUR mRNA en células JHH-7 tratadas con 10 µM de dHuR-1 durante 24 h. GAPDH se utilizó como gen de referencia. c, Análisis de citometría de flujo de células 293T cotransfectadas con el reportero HuR-eGFP-IRES-mCherry y el plásmido de expresión de CRBN, y luego tratadas con DMSO o 10 µM de dHuR-1 en presencia o ausencia de 1 µM de MLN4924 durante 24 h. La relación de intensidad de fluorescencia de eGFP/mCherry se normalizó al grupo solo con DMSO. d, Análisis de Western blot de HuR en fracciones citoplasmáticas o nucleares de células KP4 tratadas con 10 µM de dHuR-1 a lo largo del tiempo. Lamin B1 (nuclear) y vinculina (citoplasmática) se utilizaron como controles de fraccionamiento. e, Estructura química de 2-7. f, Western blot de HuR, ZMYM2, ZFP91 y GSPT1 en células MOLT4 tratadas con DMSO o dHuR-1/dHuR-2 (0,1-10 µM, 24 h). g, Western blot de HuR, ZFP91 y ZMYM2 en células Colo205 tratadas con DMSO o dHuR-2 (0,1-10000 nM, 24 h) y se cuantificó la abundancia relativa de proteínas para determinar la DC50 de dHuR-2. h, Western blot de HuR, HuB, HuC y HuD en células U-87 MG y U-118 MG tratadas con dHuR-1 o dHuR-2 (10 µM, 24 h). Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (b, c). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los datos fuente del gel, consulte la Figura Suplementaria 4.

Figura de datos ampliados 2: Validación de las interacciones MGD-CRBN-HuR. a, b, Análisis de citometría de flujo de células 293T transfectadas con el reportero HuR-eGFP-IRES-mCherry WT, G58N o G144N (a) o los mutantes G58X indicados (b). Tras el tratamiento con 10 µM de dHuR-1 durante 24 h. La relación de intensidad de fluorescencia de eGFP/mCherry se normalizó al grupo solo con DMSO para cada reportero. c, Análisis de co-inmunoprecipitación en células 293T transfectadas transitoriamente con FLAG-HuR y MYC-CRBN. Los Western blot mostraron la HuR-FLAG o HuR-G58N inmunoprecipitada y la MYC-CRBN asociada en presencia de 100 µM de dHuR-1. La vinculina se utilizó como control negativo. d, Análisis de citometría de flujo de los niveles de HuR-eGFP en células 293T CRBNKO reconstituidas con CRBN humana WT o CRBN mutante (E377V, V388I, E377V/V388I) tras el tratamiento con 10 µM de dHuR-1 durante 24 h. e, Análisis de Western blot de HuR de ratón en fibroblastos embrionarios de ratones WT, CrbnV380E, CrbnI391V o CrbnV380E/I391V tratados con dHuR-2 durante 24 h. La vinculina se utilizó como control de carga. f, Diagramas de sensores que muestran la interacción directa de dHuR-1 o dHuR-2 con CRBN. Se utilizaron unidades de respuesta en estado estacionario (RU) para determinar las afinidades de unión. CRBN(W386A) se utilizó como control negativo. g, Diagramas de sensores de la unión de HuR a CRBN-dHuR-1 o CRBN-dHuR-2, con CRBN titulada de 2,4 a 0,2 µM a una relación molar CRBN:MGD de 1:70. Los parámetros cinéticos se derivaron del ajuste del modelo de unión 1:1 (software Biacore 8k). h, Western blot de HuR tras la extracción con biotina-Ubi en el ensayo ESTUB. Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (a, b, d). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los datos fuente del gel, consulte la Figura Suplementaria 4.

Figura de datos ampliados 3: Flujo de trabajo del procesamiento de la cristalografía de rayos X y detalles de la formación del complejo ternario CRBN-MGD-HuR. a, Esquema del procesamiento de la cristalografía de rayos X de CRBN-DDB1 con HuR y dHuR-2. b, Estructura de la cristalografía de rayos X del complejo DDB1:CRBN:HuR unido a dHuR-2 a 3,3 Å (el dominio BPB de DDB1 se enmascaró). c, Superposición estructural de HuR del complejo ternario CRBN-dHuR-2-HuR (rosa) con la estructura cristalina nativa de HuR existente (amarillo, PDB 3hi9 (ref. 51)). d, Representación de superficie de la estructura ternaria CRBN-dHuR-2-HuR. e, Modelo de la estructura cristalina de HuR (amarillo) acoplada a CRBN-dHuR-2 en representación de superficie. f, Cambios estructurales en HuR desde su estado nativo (amarillo) hasta el estado ternario con CRBN y dHuR-2 (rosa). g, Interacciones detalladas observadas en el complejo ternario CRBN-dHuR-2-HuR. Los residuos clave que interactúan se mostraron en representación de varilla y el Cα de G58 se mostró en representación de esfera.

Figura de datos ampliados 4: Dependencia de HuR en el CRC con mutación BRAF. a, Los diez genes principales que muestran la correlación de Pearson más alta con las puntuaciones de dependencia de HuR en 1086 líneas celulares de cáncer (DepMap Public 24Q4). Los símbolos de los genes se colorean en rojo (correlación positiva) o azul (correlación negativa). b, Número de líneas celulares con o sin mutaciones BRAF en diferentes tipos de tumores en DepMap, clasificadas por los valores de p (determinados mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas) para comparar las puntuaciones de CRISPR de HuR entre las células con mutación BRAF y las de tipo salvaje. c, Correlación de la puntuación de CRISPR para HuR y la depleción de BRAF en las líneas celulares de CRC y melanoma con mutación BRAF (rojo) o de tipo salvaje (azul). Los datos de los paneles a-c se adaptaron del conjunto de datos público 25Q3 de DepMap (www.depmap.org). d, e, Análisis de Western blot de los niveles de proteína HuR en las líneas celulares de CRC con mutación BRAF (d) y de tipo salvaje (e) tratadas con dHuR-2. f, Formación de colonias en 2 líneas celulares de CRC con mutación BRAF (WiDr y HT29) y 3 líneas celulares de tipo salvaje (HCT116, HCT15 y DLD1) tratadas con dHuR-2 (0,01-1 µM, 8 días). g, Viabilidad celular relativa de las células HT29 con expresión inducible de HUR por doxitoxina (sgCtrl frente a sgHuR) durante 8 días. Confirmación de Western blot de la depleción de HuR 96 h después de la inducción. h, Viabilidad celular relativa de las células DLD1 y HCT116 con eliminación de HuR (sgCtrl frente a sgHUR) durante 8 días. Confirmación de Western blot de la depleción de HuR 96 h después de la inducción. i, Formación de colonias de las células HT29 y DLD1 con eliminación de HuR después de 12 días de incubación. Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (g, h). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los datos fuente del gel, consulte la Figura Suplementaria 4.

Figura de datos ampliados 5: Farmacocinética y farmacodinámica in vivo de dHuR-2. a, Curvas de concentración-tiempo en plasma de dHuR-2 en ratones C57BL/6 tras la administración de una sola dosis por vía intravenosa (i.v., 5 mg/kg), intraperitoneal (i.p., 50 mg/kg) y oral (p.o., 50 mg/kg). b, Cambios en el peso corporal (PC) en ratones con tumores Colo205 (n = 6 por grupo) tratados con vehículo o dHuR-2 (6,25-25 mg/kg, dos veces al día) durante 28 días. Los datos se presentaron como media ± EE. b.i.d., dos veces al día. c, Concentraciones de plasma libre de dHuR-2 en ratones con xenoinjertos de Colo205 en los puntos temporales indicados tras la administración (6,25-25 mg/kg) el día 14. La línea discontinua indica la DC80 de dHuR-2. d, Validación del compromiso del objetivo in vivo. Análisis de Western blot de los niveles de proteína HuR en los tumores de la Figura 3f a las 12 h y 24 h después de la dosis final el día 28. La tubulina se utilizó como control de carga. mg/kg: mg/kg. e, Las células Colo205 se trataron con dHuR-2 (1 µM) durante 24 h, seguido del lavado del compuesto. Los niveles de proteína HuR se analizaron mediante Western blot en los puntos temporales indicados. Para los datos fuente del gel, consulte la Figura Suplementaria 5. 6. Efectos de la depleción o degradación de HuR en las vías de señalización de MAPK y en la regulación del ciclo celular. a, Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) que muestra una disminución significativa de la señalización de MAPK (NES = -1,1866) y de las vías del ciclo celular (NES = -1,2203) en las células Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2 frente al control con DMSO (96 h). b, Análisis de la vía KEGG de las proteínas reguladas a la alza o a la baja identificadas mediante proteómica de células completas en Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2 durante 5 días. Se mostraron las 10 vías más enriquecidas (FDR < 0,05). c, (Izquierda) Análisis inmunoblot de los niveles de proteína HuR y de la señal de MAPK, indicado por p-ERK, en células Colo205 con knockout de HuR inducible por doxiciclina (sgCtrl frente a sgHuR). Para los datos de origen del gel, consulte la Figura Suplementaria 5. (Derecha) Análisis por citometría de flujo del ciclo celular y cuantificación de la distribución de las fases G1, S y G2/M en las células correspondientes. d, Análisis por citometría de flujo del ciclo celular y cuantificación de la distribución de las fases G1, S y G2/M en líneas celulares de CRC con mutación de BRAF (Colo201, Colo205, HT29 y WiDr) tratadas con 1 μM de dHuR-2 o DMSO durante 8 días. Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (c, d). Los valores de P se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Figura de datos ampliados 7. El empalme del ARN de BRAF mediado por HuR. a, Cuantificación mediante RT-qPCR de los niveles totales de transcrito de BRAF en células Colo205 tratadas con dHuR-2 durante 8 días. b, Ensayo de estabilidad del ARNm utilizando 5 μg/ml de actinomicina D (ActD) ± 1 μM de dHuR-2 durante 0-12 h. c, Ensayo de etiquetado con AHA con extracción con estreptavidina seguido de detección por inmunoblot de las proteínas BRAF y HuR sintetizadas recientemente en células Colo205 tratadas con 1 μM de dHuR-2 (0-24 h). La actina sirvió como control negativo. d, Datos públicos de eCLIP-seq en células HepG2 y K562 (https://www.encodeproject.org/, ENCSR296TSJ y ENCSR09OLNQ) que muestran la unión de HuR en la región del exón 18 de BRAF. El esquema se adaptó de la ref. 43, Springer Nature Limited, licencia Creative Commons CC BY 4.0. e, Mapeo de elementos reguladores. El omisión del exón 18 de BRAF se evaluó en células 293T tratadas con 1 μM de dHuR-2 durante 24 h tras la transfección con minigenes que contenían: (Izquierda) deleciones de secuencia (K1-K16), o (Derecha) mutaciones de U a C. f, (Izquierda) Alineamiento de la secuencia del intrón 17 de BRAF humano/ratón. Análisis de omisión del exón 18 en (Centro) células 293T que expresan minigenes "murinizados" (mediante el reemplazo del intrón 17 humano por el intrón 17 del ratón) o minigenes BRAF humanos, o (Derecha) MC38-hCRBN, una línea celular de ratón con sobreexpresión de hCRBN que permite la degradación de HuR del ratón tras el tratamiento con dHuR-2. g, RNA-seq y análisis de empalme en células Colo205 tratadas con dHuR-2 durante 4 días. El gráfico circular muestra la proporción de eventos de empalme alternativo significativos (FDR < 0,05 y |ΔΨ| > 0,2). El diagrama de dispersión (derecha) muestra el porcentaje de eventos JCEC significativos por categoría de sitios de empalme alternativos 3' (A3SS), sitios de empalme alternativos 5' (A5SS), exones mutuamente excluyentes (MXE), intrones retenidos (RI) o exones omitidos (SE). h, Diagrama de Venn que ilustra el número de genes superpuestos entre los ARN unidos a HuR (azul; a partir de HuR eCLIP-seq: IDR < 0,01, p < 0,01, enriquecimiento ≥ 8), los genes con empalme alternativo tras el tratamiento con dHuR-2 (verde; RNA-seq: FDR < 0,05, |ΔΨ| > 0,2) y las proteínas expresadas de forma diferencial (rojo; proteómica: |Log2FC| > 1, p < 0,05). i, j, Ensayos de rescate utilizando FLAG-BRAF(V600E) (CDS) o FLAG-BRAF(V600E) (Intrón) construcciones. Se mostró el inmunoblot en células MDST8 que sobreexpresan FLAG-BRAF(V600E) (CDS) o FLAG-BRAF(V600E) (Intrón) tratadas con 1 μM de dHuR-2 durante 72 h. Se trazaron las curvas de respuesta dosis correspondientes para las células tratadas con dabrafenib (0,03-100 nM) o dHuR-2 (0,001-10 μM) durante 6 días. Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (a, b, i, j). Los valores de P se determinaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Para los datos de origen del gel, consulte la Figura Suplementaria 5. Figura de datos ampliados 8. La degradación de HuR modula la expresión y el empalme de VEGFA para suprimir la angiogénesis tumoral. a, Regulación de VEGFA por HuR. (Arriba) Análisis RT-qPCR de los niveles de ARNm de VEGFA en células Colo205 WT y HuR(G58A) KI tratadas con 1 μM de dHuR-2 (0-48 h). Los datos se normalizaron con GAPDH. (Abajo) Cuantificación ELISA de VEGFA secretada en el sobrenadante de las células correspondientes. b, Diagrama que ilustra los cebadores para la detección del pre-ARNm y el ARNm de VEGFA. c, Cuantificación de los niveles de pre-ARNm y ARNm de VEGFA en células Colo205 tratadas con dHuR-2 durante 0-48 h mediante RT-qPCR utilizando los cebadores emparejados indicados. d, Análisis de la eficiencia del empalme basado en la cuantificación mediante RT-qPCR del pre-ARNm de VEGFA (E5-I5) y el ARNm maduro (E5-E7 y E5-E8). La eficiencia del empalme se calculó como ARNm/pre-ARNm. e, Picos de unión de HuR en el locus de VEGFA. Los datos públicos de eCLIP-seq de células HepG2 (https://www.encodeproject.org/, ENCSR09OLNQ) revelaron una posible ocupación de HuR en la región intrónica entre el exón 5 y el exón 6 de VEGFA. El esquema se adaptó de la ref. 43, Springer Nature Limited, licencia Creative Commons CC BY 4.0. f, Esquema de los fragmentos de ARN derivados del intrón 5 de VEGFA utilizados para los ensayos de extracción de ARN. g, Análisis inmunoblot de HuR tras la extracción de ARN con los ARN biotinilados que se muestran en el panel f. Los ARN se generaron mediante transcripción in vitro mediada por T7. Para los datos de origen del gel, consulte la Figura Suplementaria 5. h, Efectos antiangiogénicos. (Arriba) Inmunohistoquímica (IHC) representativa de los vasos CD31+ en xenoinjertos de Colo205 tratados con vehículo o degradador de HuR (25 mg/kg, 28 días; barra de escala: 50 μm). (Abajo) Cuantificación de la densidad de microvasos (MVD) (5 tumores por grupo, 5 campos por tumor). Para los paneles a, c, d, h, los datos se presentaron como media ± DE. n = 3 muestras biológicamente independientes, excepto en el panel h (n = 5). El valor de P se determinó mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas. Figura de datos ampliados 9. La degradación de HuR supera la resistencia a los inhibidores de BRAF mediada por EGFR. a, b, Curvas de respuesta dosis para células HT29 (a) y MDST8, SH4 (b) parentales y resistentes a BRAFi tratadas con dabrafenib o dHuR-2 durante 6 días, medidas mediante el ensayo Cell Titer-Lumi (CTL) (media ± DE, n = 3). c, Mapa de calor que ilustra los niveles de expresión de RTK, RAS y RAF en RNA-seq para 3 líneas celulares resistentes a BRAFi y células parentales. d, Análisis inmunoblot de los niveles de proteína BRAF, p-ERK, EGFR y HuR en líneas celulares de cáncer colorrectal y melanoma (A375) con mutación de BRAF. HSP70 sirvió como control de carga. e, Activación de retroalimentación de EGFR. Análisis inmunoblot de la evolución temporal (0-5 h) de EGFR, p-EGFR (Y1068) y p-ERK en células Colo205 tratadas con inhibidores de BRAF (1 μM de vemurafenib, 3 nM de dabrafenib, 1 nM de encorafenib) durante 0-5 h. f, Análisis inmunoblot de la activación dinámica de la retroalimentación de p-ERK tras el tratamiento con dabrafenib en líneas celulares de CRC con BRAF(V600E) (Colo205, HT29, WiDr y MDST8). g, Análisis RT-qPCR y cuantificación del nivel de ARNm relativo de los genes relacionados con MAPK indicados durante 0-48 h de tratamiento con 10 nM de dabrafenib. h, Validación genética de la dependencia de BRAF en células WiDr resistentes a BRAFi. (Izquierda) Ensayo de formación de colonias de células WiDr parentales y resistentes a BRAFi transfectadas con sgRNA de control (sgCtrl) o sgRNA dirigido a BRAF (sgBRAF) (cultivo de 14 días; tinción con cristal violeta). (Derecha) Confirmación por inmunoblot de la eficiencia del knockout de BRAF y la posterior disminución de p-MEK y p-ERK. Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicamente independientes (a, b, g). Para los datos de origen del gel, consulte la Figura Suplementaria 6. Figura de datos ampliados 10. La degradación de HuR tiene una actividad antitumoral sinérgica con los inhibidores de BRAF/MEK/EGFR. a, Sinergia de amplio espectro entre el degradador de HuR y el inhibidor de BRAF. Distribución de la sinergia para las combinaciones de dHuR-2 (eje x, nM) con dabrafenib (eje y, nM) en células Colo205, Colo201, HT29 y WiDr. Se aplicó el modelo de Loewe para el cálculo de la puntuación de sinergia media y el valor de P (https://synergyfinder.org/). b, Estructura química de dHuR-3 (9). c, Validación genética de la sinergia. (Izquierda) Viabilidad celular relativa de células Colo205 que expresan sgRNA de control inducida por doxiciclina (sgCtrl) o sgRNA dirigido a HUR (sgHUR) tratadas con dabrafenib diluido en serie. (Derecha) Curvas de respuesta dosis de células Colo205 parentales o HuR G58A KI tratadas durante 6 días con dabrafenib diluido en serie en presencia o ausencia de dHuR-2 (0,1 o 0,3 μM). d, Ensayo de crecimiento de esferoides 3D de células Colo205 parentales o HuR G58A KI tratadas durante 6 días con dHuR-2 diluido en serie en presencia o ausencia de dabrafenib. e, Esquema del cribado CRISPR con una biblioteca de cinasas en células HT29. Esquema creado en BioRender; Wang, X. https://biorender.com/v3fgkxo (2026). f, Sinergia de bloqueo de la vía. Distribución de la sinergia para las combinaciones de dHuR-2 (eje x, nM) con erlotinib o MEK162 (eje y, nM) en células Colo205, Colo201, HT29 y WiDr. Se aplicó el modelo de Loewe para el cálculo de la puntuación de sinergia media y el valor de P (https://synergyfinder.org/). Los datos se presentaron como media ± DE; n = 3 muestras biológicas independientes (c, d). Información complementaria Información complementaria (descargar PDF) Métodos complementarios, Tablas complementarias 1-4 y Figuras complementarias 1-7. Resumen del informe (descargar PDF) Archivo de revisión por pares (descargar PDF) Fuente de datos Datos para las Figuras 3, 5 y la Figura Suplementaria 1 (descargar XLSX) Derechos y permisos
Acceso abierto Este artículo se distribuye bajo una licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional, que permite cualquier uso, distribución y reproducción no comercial en cualquier medio o formato, siempre que se dé el crédito adecuado al autor o autores originales y a la fuente, se proporcione un enlace a la licencia y se indique si se realizaron cambios. No se permite la adaptación del material bajo esta licencia. Los gráficos u otro material de terceros incluidos en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la leyenda del material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la legislación o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso del titular de los derechos de autor. Para consultar una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/. Reimpresiones y permisos Acerca de este artículo Citar este artículo Lu, X., Wang, X., Yang, Z. et al. Los degradadores moleculares de HuR suprimen el cáncer colorrectal con mutación de BRAF. Nature (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10613-5 Descargar cita Recibido: 4 de agosto de 2025 Aceptado: 30 de abril de 2026 Publicado: 10 de junio de 2026 Versión del registro: 10 de junio de 2026 DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10613-5