La secreción de IL-10 por las células T CD8 orquesta el reclutamiento temprano de las células NK y la inmunidad antitumoral tras la terapia anti-VEGFR-2/PD-1.

La angiogénesis tumoral es esencial para el crecimiento tumoral; por lo tanto, se promovió el tratamiento dirigido al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y a su vía de señalización del receptor (VEGFR) como un medio para desarrollar terapias antitumorales eficaces. El desarrollo inicial de agentes antiangiogénicos (AA) se centró principalmente en bloquear la formación de vasos sanguíneos tumorales. Sin embargo, ahora se comprende que las vías de señalización del VEGF también afectan el comportamiento de las células inmunitarias en los tumores. Se ha descubierto que el VEGF perjudica la proliferación y la función de las células T CD8, promueve el agotamiento de las células T y aumenta la expresión de moléculas inhibidoras de los puntos de control.^[1][3] Por el contrario, la terapia antiangiogénica mejora la respuesta de los tumores de ratón al tratamiento con anticuerpo anti-proteína de muerte celular programada-1 (anti-PD-1), lo que refuerza aún más la justificación para combinar las terapias anti-VEGF y anti-PD-1 en ratones.^[4] Las observaciones anteriores proporcionaron la base para evaluar la combinación de terapias antiangiogénicas e inhibidores de los puntos de control inmunitarios en pacientes. Estas terapias combinadas demuestran actividad clínica en múltiples tipos de tumores y han sido aprobadas para el tratamiento del carcinoma hepatocelular, el carcinoma de células renales y el cáncer de endometrio. Sin embargo, no comprendemos completamente cómo los mecanismos inmunitarios median esta respuesta terapéutica. Esto es particularmente importante para el cáncer colorrectal (CCR), donde la inhibición de los puntos de control inmunitarios tiene una eficacia limitada fuera de los subconjuntos con inestabilidad de microsatélites.^[5] Los datos clínicos publicados recientemente que respaldan el beneficio de la inhibición combinada de VEGF y PD-1 para los pacientes con CCR ilustran lo crucial que es comprender completamente cómo la terapia antiangiogénica modifica la respuesta inmunitaria antitumoral en esta enfermedad.^[6]

Las células asesinas naturales (NK) y las células T CD8 son poblaciones clave de células inmunitarias citotóxicas que contribuyen de manera crítica a la vigilancia y la erradicación inmunitarias del tumor. Sin embargo, todavía existe poca claridad sobre cómo se reclutan y coordinan funcionalmente las células T CD8 y las células NK dentro del microambiente tumoral (MET).

La interleucina-10 (IL-10) generalmente se ha considerado una citocina inmunosupresora en los MET; se asocia con la inhibición de la función de las células T y las células NK y con la evasión inmunitaria tumoral.[7 8] Sin embargo, la IL-10 puede estimular la actividad inmunitaria en ciertas condiciones, particularmente cuando es producida transitoriamente por las células inmunitarias activadas.^[9][11] El papel de la IL-10 en la facilitación de la estimulación inmunitaria cuando se utiliza con inmunoterapia combinada y el posible impacto que tiene en los eventos inmunitarios tempranos asociados con las terapias antiangiogénicas que afectan al MET, aún no se comprenden completamente.

En este estudio, examinamos las respuestas inmunitarias inducidas por el bloqueo combinado de VEGFR-2 y PD-1 en dos modelos preclínicos de CCR, con un enfoque en los cambios intratumorales tempranos. Mostramos que la inhibición de VEGFR-2 afecta directamente a las células T CD8, lo que lleva a su rápida expansión y a la inducción de IL-10 antes del desarrollo de la función efectora completa. La IL-10 derivada de las células T CD8 promovió inesperadamente el reclutamiento de células NK en los tumores, iniciando una cascada de citocinas que apoyó la maduración de los macrófagos y la infiltración secundaria de células T CD8. Esta secuencia inmunitaria fue necesaria para la actividad antitumoral del bloqueo combinado de VEGFR-2 y PD-1. Estos hallazgos identifican un programa inmunitario temprano desencadenado por la inhibición de la angiogénesis y proporcionan información sobre cómo la terapia dirigida al VEGF puede apoyar una inmunidad antitumoral eficaz en los CCR preclínicos.

Resultados

Las células T CD8 son necesarias para la eficacia anti-VEGFR-2/anti-PD-1 contra el modelo tumoral de CCR

Para investigar los eventos inmunitarios que ocurren en los tumores después del tratamiento combinado (Bith) con anticuerpos anti-VEGFR-2 (αR2) y anti-PD-1 (αPD1), evaluamos la respuesta de los modelos de CCR CT26 y MC38. Ambos modelos mostraron una eficacia modesta de la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 solos, con una ligera disminución en el crecimiento tumoral. El anti-VEGFR-2 no tuvo eficacia en CT26, mientras que disminuyó ligeramente el crecimiento tumoral en el modelo MC38. En contraste, se observaron respuestas significativas con la combinación de anticuerpos anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 (bith), mostrando un efecto sinérgico en el modelo CT26 y un efecto aditivo en el modelo MC38 (figura 1 A; figura suplementaria en línea S1, A-B). También evaluamos el crecimiento tumoral en un modelo de implantación ortotópica de células CT26-luciferasa en el ciego, donde la terapia combinada también demostró una eficacia significativa (figura 1C; figura suplementaria en línea S1B). Para confirmar nuestros datos, también estudiamos la respuesta utilizando anti-VEGF-A y encontramos que funcionó en una medida similar (figura suplementaria en línea S1D). En consecuencia, utilizando ratones desnudos, demostramos que los linfocitos T son cruciales para la eficacia de la biterapia, ya que no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral en ausencia de linfocitos T en los tumores CT26 y MC38 (figura suplementaria en línea S1E y F).

Para evaluar ampliamente el impacto de la biterapia en el perfil inmunitario del MET, realizamos un análisis de NanoString para analizar el transcriptoma de muestras tumorales masivas de CT26 recolectadas 9 días después del inicio de la terapia combinada. Al observar los genes asociados con las funciones de las células T, más del 38% de ellos se encontraron significativamente regulados al alza en el grupo de biterapia (figura 1C; tabla suplementaria en línea S1), lo que sugiere la activación de las células T inducida por la biterapia.

En consecuencia, el análisis de citometría de flujo de los tumores CT26 reveló un aumento muy rápido y significativo en el número de células T CD8 1 y 9 días después de la primera inyección del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 1, D y E), mientras que la población de células T CD4 permaneció sin cambios (figura suplementaria en línea S2, A y B). Para explicar este rápido aumento en respuesta al anti-VEGFR-2, evaluamos la proliferación de las células T CD8 1 día después del tratamiento. Encontramos que las células T CD8 exhibieron una expresión significativamente mayor de Ki-67 en los tumores tratados (figura 1F). Interesantemente, el 10% de las células T CD8 de los tumores CT26 expresaron VEGFR-2, lo que sugiere un efecto directo sobre el objetivo de la inhibición de VEGFR-2 en las células T CD8 (figura 1G). Además, la mayoría de las células T CD8 específicas del antígeno tumoral en los tumores CT26 expresaron VEGFR-2 (figura 1H) y aumentaron después del primer tratamiento anti-VEGFR2 (figura suplementaria en línea S2C). En consecuencia, solo la transferencia de células T CD8 que expresan VEGFR-2 en ratones desnudos portadores de tumores CT26 permitió un efecto de la biterapia sobre el crecimiento tumoral, mientras que la transferencia de células T CD8 VEGFR-2− no tuvo ningún impacto (figura suplementaria en línea S2D). Dado que se sabe que el eje VEGF/VEGFR suprime la proliferación de las células T, estos datos sugieren fuertemente un efecto directo del anti-VEGFR-2 sobre la proliferación de las células T CD8.^[12]

Interesantemente, aunque la población de células T CD8 aumentó en el tumor tan pronto como 1 día después del tratamiento, estas células no mostraron en este momento una mayor activación (medida por la expresión de CD69) o una mayor citotoxicidad (indicada por la expresión de granzima B) (figura 1, I y J). Sin embargo, 9 días después del tratamiento, las células T CD8 exhibieron una mayor activación y niveles más altos de granzima B después de la biterapia (figura 1, K y L), lo que sugiere que diferentes mecanismos regulan tanto su proliferación como su activación con el tiempo.

Las células T CD8 desempeñan un papel importante al inicio del tratamiento

Para confirmar aún más el papel de las células T CD8 en la respuesta inmunitaria a la terapia combinada, realizamos ensayos de crecimiento tumoral utilizando un anticuerpo monoclonal que agota las células CD8β y que elimina eficazmente las células T CD8 en 24 horas (figura suplementaria en línea S2E). La depleción de las células T CD8 abolió por completo la eficacia de la terapia combinada en los modelos CT26 y MC38, lo que subraya el papel crucial de las células T CD8 en la respuesta al tratamiento (figura 1M y figura suplementaria en línea S2F). También investigamos la importancia temporal de las células T CD8 en la eficacia de la terapia combinada mediante la depleción de las células T CD8 ya sea al inicio del tratamiento (D0) o 3 días después del inicio del tratamiento (D3). Si bien la depleción de las células T CD8 3 días después del inicio del tratamiento tuvo un impacto muy limitado en la inhibición del crecimiento tumoral, la depleción al inicio del tratamiento perjudicó drásticamente la capacidad de la terapia para controlar el crecimiento tumoral en los modelos de tumores CT26 y MC38 (figura 1N; figura suplementaria en línea S2 G y H). Estos hallazgos sugieren que las células T CD8 desempeñan un papel antitumoral crítico dentro de los primeros 3 días después del tratamiento anti-VEGFR-2.

A partir de estos hallazgos, nuestro objetivo fue investigar el papel temprano de las células T CD8. Encontramos mediante citometría de flujo que la depleción temprana de las células T CD8 redujo el número de células NK intratumorales 1 día después del tratamiento en los tumores CT26 y MC38 (figura 1O y figura suplementaria en línea S2 I). Las células NK no expresan VEGFR-2, lo que elimina la posibilidad de un efecto directo del anti-VEGFR-2 sobre estas células (figura suplementaria en línea S2J). La depleción de las células T CD8 no afectó la proliferación de las células NK, lo que sugiere que las células T CD8 pueden facilitar el reclutamiento de las células NK en el tumor (figura suplementaria en línea S2K). En conjunto, estos datos establecen aún más a las células T CD8 como objetivos directos del tratamiento anti-VEGFR-2 y sugieren que desempeñan un papel fundamental en el aumento temprano posterior del tratamiento de las células NK.

En resumen, nuestros datos demuestran que la terapia combinada de anti-PD-1 y anti-VEGFR-2 depende de las células T CD8 para una inhibición eficaz del crecimiento tumoral en modelos preclínicos de carcinoma colorrectal. Además, revelamos una relación inesperada entre las células T CD8 y las células NK dentro del MET tan pronto como 1 día después del tratamiento.

Caracterización de las posibles interacciones de las células T CD8 y las células NK después del anti-VEGFR-2

Para obtener una comprensión más profunda de la relación entre las células T CD8 y las células NK en los tumores CT26, realizamos un análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) 1 día después del primer tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 2A). Después del control de calidad, las células se agruparon en 16 tipos de células distintos (figura suplementaria en línea S3).

Nos centramos en los cuatro grupos de células NK (NK1, NK2, NK3 y NK4) y los dos grupos que contienen células T CD8 (Tcells1 y Tcells2). Mostramos que los cuatro grupos de células NK corresponden a células NK en ciclo (Mki67, Birc5 y Nusap1) (NK4), células NK secretoras (Ccl3, Ccl4, Ccl5) (NK3), células NK citotóxicas (Gzmd, Gzme, Gzmc) (NK2) y, finalmente, células NK sin características definitorias, excepto la expresión de los marcadores clásicos de las células NK Eomes y Ncr1, a las que en adelante se denomina células NK en reposo (NK1) (figura 2, B y C; figura suplementaria en línea S4C). En cuanto a las células T, el grupo Tcells2 corresponde a células T CD8 en ciclo (Mki67, Birc5 y Cd8a) y el grupo Tcells1 corresponde a una población de células T mixtas (Cd4, Cd8a, Cd3e) (figura 2, B y C).

Utilizamos CellChat para identificar posibles vías de comunicación intercelular entre las células T CD8 y las células NK y comparar dos conjuntos de datos de scRNA-seq, establecidos utilizando células de ratones tratados con Ig y de ratones tratados con anti-VEGFR-2 1 día después del primer tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 2A). Con base en este análisis, identificamos varias posibles interacciones desde células T mixtas hasta células NK (figura 2D) y desde células T en ciclo hasta células NK (figura 2E). Dado que buscábamos interacciones desencadenadas por el tratamiento, nos centramos en las interacciones que se encontraron solo en el conjunto de datos tratado con anti-VEGFR-2 (figura 2F) e identificamos siete posibles vías de comunicación de señalización inducidas por el tratamiento. La expresión de ARN mensajero (ARNm) de Spp1 por las células T CD8 se correlacionó con sus receptores Cd44, ItgavItgb1, Itga4Itg1b y ItgavItgb3 ARNm en las células NK. La expresión de ARNm de Cxcl10, Il10 y Tnsfs9 en las células T CD8 se asoció con la presencia de sus receptores ARNm Cxcr3, Il10ra-Il10rb y Tnfrsf9_ en las células NK.

En conjunto, nuestros datos de scRNA-seq subrayan las posibles interacciones entre las células T CD8 y las células NK inducidas por la terapia anti-VEGFR-2.

A continuación, evaluamos la expresión de proteínas de las vías candidatas identificadas en las células T CD8 y las células NK. Mediante citometría de flujo, observamos que las células T CD8 no expresan niveles significativos de las proteínas SPP1 ni TNFSF9 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura S4, D y E, material suplementario en línea), descartando estas vías. La vía CXCL10-CXCR3 mostró una baja probabilidad, un valor p alto y solo apareció una vez, lo que hace que esta vía sea poco probable. Por lo tanto, el eje IL-10/receptor de IL-10 (IL-10R) siguió siendo la única vía plausible.

La IL-10 es producida por las células T CD8 después del tratamiento anti-VEGFR-2

Para explorar si la vía IL-10/IL-10R está involucrada en el reclutamiento de células NK mediado por las células T CD8, primero evaluamos los niveles de IL-10 en el tumor 3 días después del primer tratamiento anti-VEGFR2 y encontramos que tanto el tratamiento con anti-VEGFR-2 solo como la biterapia fueron capaces de desencadenar un aumento de la IL-10 en los tumores CT26 (figura S5A, material suplementario en línea). También pudimos detectar un aumento de la IL-10 en los tumores MC38 tratados con la biterapia 3 días después del primer tratamiento anti-VEGFR2 (figura S5B, material suplementario en línea) y, en un ensayo de crecimiento tumoral de MC38, observamos que el uso de un anticuerpo bloqueante dirigido contra la IL-10 redujo la eficacia antitumoral de la biterapia contra el crecimiento tumoral de MC38 (figura S5C, material suplementario en línea). Luego, probamos la capacidad de las células T CD8 intratumorales para producir IL-10 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2. Descubrimos que las células T CD8 aisladas de los tumores CT26 produjeron más del doble de la cantidad de IL-10 en comparación con los controles no tratados, mientras que otros tipos de células inmunitarias no mostraron un aumento en la producción de IL-10 (figura 3A y figura S5, D a O, material suplementario en línea). Por lo tanto, el aumento intratumoral de IL-10 se debió principalmente a las células T CD8 y nuestros datos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) confirmaron la presencia de células que coexpresan Cd8a e Il10, así como células que coexpresan Foxp3 e Il10; sin embargo, no se observó un aumento en la expresión de Il10 en las células T reguladoras (Tregs) (figura S5, P y Q, material suplementario en línea). En consecuencia, las células T CD8 aisladas del bazo de ratones naive y activadas durante 3 días produjeron cantidades cada vez mayores de IL-10 (figura 3B). Esta observación coincide con estudios previos que demuestran que las células T CD8 altamente activadas pueden producir IL-10 después de infecciones virales.^[13]

Para investigar si el VEGF-A podría modular la producción de IL-10 por las células T CD8, incubamos células T CD8 purificadas del bazo de ratones naive con concentraciones crecientes de VEGF-A, dentro del rango observado in vivo en los tumores CT26 (figura S5, R, material suplementario en línea), durante 72 horas ex vivo. Observamos que el VEGF-A inhibió significativamente la producción de IL-10 por las células T CD8 (figura 3C). A continuación, evaluamos el papel de la IL-10 en la eficacia de la combinación de terapias anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 en los tumores CT26. Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal neutralizante de la IL-10, encontramos que el bloqueo de la IL-10 afectó significativamente la eficacia terapéutica, lo que condujo a un crecimiento tumoral más rápido (figura 3D; figura S6A, material suplementario en línea), lo que destaca un papel inmunostimulante de la IL-10. Estos resultados indican que la producción de IL-10 por las células T CD8 se induce rápidamente mediante el tratamiento anti-VEGFR-2 y desempeña un papel crucial en el aumento de la eficacia de esta biterapia.

La IL-10 puede dirigir directamente el reclutamiento de células NK

Para evaluar el posible efecto de la IL-10 sobre las células NK, primero medimos la expresión de IL-10R en su superficie. Descubrimos que casi todas las células NK de la sangre de ratones naive y de ratones con tumores CT26 expresaban IL-10R (figura 3E). In vivo, observamos una disminución significativa en el porcentaje de células NK que expresan IL-10R dentro del tumor 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 3F), lo que es consistente con la internalización conocida del IL-10R al unirse a la IL-10 (3). Utilizando células NK clasificadas del bazo de ratones naive y cultivadas in vitro con dosis crecientes de IL-10, confirmamos la disminución de la expresión de IL-10R después de la señalización de IL-10 (figura 3G). Estos hallazgos sugieren que las células NK en el microambiente tumoral (TME) estuvieron expuestas a niveles significativamente activos de IL-10 después del tratamiento anti-VEGFR-2. También observamos que el aumento en el número de células NK inducido por el tratamiento anti-VEGFR-2 en los tumores CT26 se abolió con el bloqueo de la IL-10 (figura 3H), lo que sugiere un papel crítico de la IL-10 en el aumento de las células NK después del tratamiento. Además, esto es consistente con la ausencia de un aumento en el número de células NK en tumores que carecen de células T CD8, como se muestra en la figura 1O. El aumento observado en las células NK 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2, que depende tanto de las células T CD8 como de la IL-10, y el aumento de la producción de IL-10 por las células T CD8 sugirieron un posible efecto directo de la IL-10 sobre el reclutamiento de células NK.

Para explorar el impacto directo de la IL-10 sobre el reclutamiento de células NK, clasificamos las células NK del bazo de ratones naive y las cultivamos con dosis crecientes de IL-10. Después de 24 horas, no observamos un cambio significativo en la proliferación de células NK, según lo medido por la expresión de Ki-67 (figura 3I). Luego, realizamos ensayos de migración utilizando un sistema de transwell, exponiendo las células NK esplénicas de ratones naive a concentraciones crecientes de IL-10 durante 4 horas. Aquí, demostramos que la IL-10 atrajo significativamente las células NK de manera dependiente de la dosis (figura 3J). Además, se observó un efecto similar con las células NK aisladas de tumores CT26 no tratados (figura S6B, material suplementario en línea). Dado que la IL-10 señala a través de la vía mTOR (4), evaluamos el papel de mTOR en la migración de células NK mediada por IL-10. Para ello, tratamos las células NK con rapamicina, un potente inhibidor del complejo 1 de mTOR, lo que resultó en una inhibición completa de la migración de células NK (figura 3J). En conjunto, estos resultados confirman que la IL-10, de manera dependiente de mTOR, exhibe capacidad quimiotáctica y facilita la migración de células NK.

Finalmente, para demostrar que el papel antitumoral de la IL-10 durante el tratamiento depende de la función de las células NK, y en ausencia de ratones con knockout de IL10RA, realizamos un experimento de crecimiento tumoral de CT26 en ratones WT utilizando la biterapia junto con el anti-asialo-GM1 (para agotar las células NK) y un anticuerpo monoclonal anti-IL-10R. Observamos que tanto el agotamiento de las células NK como el bloqueo de IL-10R limitaron la eficacia de la biterapia en un grado similar y que la combinación de estos dos anticuerpos no tiene un efecto adicional, lo que sugiere fuertemente que las células NK y el IL-10R forman parte de la misma cascada de eventos, lo que refuerza el vínculo entre la señalización de IL-10 y las células NK (figura 3K y figura S6, C y D, material suplementario en línea).

En conclusión, nuestros datos demuestran que las células T CD8 producen IL-10 en respuesta al tratamiento anti-VEGFR-2, y esta señalización de IL-10 desempeña un papel fundamental en el reclutamiento de células NK al tumor.

Las células NK son necesarias para la maduración de macrófagos inducida por la biterapia

Para dilucidar el papel de las células NK en la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido contra el asialo-GM1 que agota las células NK (figura S7A, material suplementario en línea). El agotamiento de las células NK afectó significativamente el control tumoral tanto en los tumores CT26 como en los tumores MC38, lo que demuestra que las células NK son esenciales para la eficacia terapéutica de la biterapia (figura 4A y figura S7B, material suplementario en línea). En particular, el análisis de citometría de flujo del microambiente tumoral (TME) mostró que el agotamiento de las células NK condujo a una reducción significativa en la proporción de macrófagos maduros dentro del TME 9 días después del inicio del tratamiento (figura 4B).

El análisis de citometría de flujo del infiltrado inmunitario en un ensayo cinético reveló que el tratamiento indujo una mayor maduración de los macrófagos, como lo indica el aumento en el porcentaje de macrófagos que expresan altos niveles de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II 3 días después del inicio del tratamiento (figura 4C).

Aunque se sabe que el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) tiene la capacidad de promover la maduración de los macrófagos,^[14] el interferón gamma (IFN-γ)^[15] y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)^[16] también pueden inducir la maduración de los macrófagos y son producidos por las células NK.^[17] El análisis cinético de estos niveles de citocinas en los tumores CT26 reveló que, si bien los niveles de TNF-α permanecieron sin cambios después de la biterapia (figura 4D), los niveles de IFN-γ se elevaron solo 9 días después del tratamiento, cuando los niveles de GM-CSF se elevaron significativamente en los tumores tratados con la biterapia a los 3 días posteriores al tratamiento y se mantuvieron elevados en el día 9 (figura 4D). El aumento de GM-CSF coincidió con el aumento observado en la maduración de los macrófagos en los días 3 y 9, lo que sugiere un papel fundamental de GM-CSF en este proceso.

Para evaluar directamente la contribución de GM-CSF a la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal contra GM-CSF y encontramos que el bloqueo de GM-CSF disminuyó significativamente la eficacia de la biterapia en el control del crecimiento tumoral de CT26 (figura 4E). El bloqueo de GM-CSF interrumpió la maduración de los macrófagos inducida por la biterapia, como lo demuestra la reducción de la expresión de MHC II (figura 4F y figura S7C, material suplementario en línea). Esto destaca el papel indispensable de GM-CSF en la facilitación de la maduración de los macrófagos in vivo en el contexto de esta terapia combinada.

La producción de GM-CSF por las células NK aumenta la maduración de los macrófagos

Para identificar la fuente de la producción de GM-CSF en el TME 3 días después del tratamiento, clasificamos las principales poblaciones de células inmunitarias conocidas por producir GM-CSF de los tumores CT26 tratados con la biterapia o con vehículo y las cultivamos ex vivo durante 24 horas. Si bien los macrófagos, las células dendríticas (DC) y las células T CD8 no mostraron un aumento en el ARNm de Csf2, que codifica para GM-CSF, las células NK exhibieron un aumento significativo en el ARNm de Csf2 y la producción de proteína GM-CSF después del tratamiento con biterapia (figura 4G; figura S7, D y E, material suplementario en línea). Validamos aún más el papel in vivo de las células NK en la producción de GM-CSF al evaluar los niveles de GM-CSF en los tumores CT26 tratados con biterapia, ya sea con o sin agotamiento de las células NK. El aumento en los niveles de GM-CSF observado con la biterapia se abolió en ausencia de células NK, lo que confirma que las células NK son la fuente principal de GM-CSF después de la biterapia (figura 4H). Además, dado que las células T CD8 median el reclutamiento de células NK en respuesta a la biterapia (figura 3), observamos que tanto la producción de GM-CSF como la maduración de los macrófagos estuvieron ausentes cuando las células T CD8 fueron agotadas (figura 4, I y J y figura S7F, material suplementario en línea). Finalmente, en ratones Ncr1cre Csf2flox en los que las células NK no pueden producir GM-CSF, que tienen tumores MC38 y son tratados con la biterapia, observamos que la ausencia de GM-CSF derivado de las células NK bloqueó la expansión de macrófagos con alta expresión de MHC II (figura S7G, material suplementario en línea).

En conjunto, estos datos demuestran que la biterapia promueve que las células NK produzcan GM-CSF, lo que es esencial para la maduración de los macrófagos en el TME. Esta maduración de los macrófagos es crucial para la eficacia general de la biterapia en el control de la progresión tumoral.

CXCL11 recluta células T CD8 al tumor en momentos posteriores después del tratamiento

Observamos un aumento de la población de células T CD8 al noveno día tras la administración de la terapia combinada con anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 (figura 1E). Para comprender mejor el papel del anti-PD-1, diferenciamos diferentes subpoblaciones de células T CD8 utilizando PD1, Tim3 y SlamF6 para definir las subpoblaciones no agotadas (triple negativo), las progenitoras agotadas (PD1+SlamF6+) y las células T CD8 terminalmente agotadas (PD1+Tim3+). En este momento, las células T CD8 terminalmente agotadas aumentaron preferentemente en el grupo tratado con la combinación, lo que apoya aún más el papel del anti-PD-1 en la modulación del estado funcional de las células T CD8 infiltrantes tumorales (Datos complementarios, figura suplementaria en línea 8A). Si bien el anti-VEGFR-2 promovió la acumulación de células T CD8, el anti-PD-1 es necesario para la adquisición óptima de funciones efectoras, incluida la producción de granzima B e IFNγ en múltiples subconjuntos de células T CD8 (Datos complementarios, figura suplementaria en línea 8 A, B y C). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes que impulsan este aumento, evaluamos la proliferación de las células T CD8 mediante la medición de la expresión de Ki-67. No se observó ninguna diferencia significativa en la expresión de Ki-67, lo que sugiere que el aumento de las células T CD8 no se debió a una mayor proliferación, sino más bien a un mayor reclutamiento de estas células hacia el tumor (figura 5A). A continuación, investigamos los mecanismos moleculares subyacentes al reclutamiento de las células T CD8 evaluando la expresión de CXCL9, CXCL10 y CXCL11, que son ligandos de CXCR3 y se sabe que atraen a las células T CD8.^[18] Las tres quimiocinas mostraron un aumento de la expresión de ARNm en comparación con los controles en los análisis del tumor en masa (figura suplementaria en línea S8, de la C a la E). Curiosamente, solo los niveles de proteína CXCL11 aumentaron significativamente en los tumores CT26 después del tratamiento combinado al día 9 (figura 5B, figura suplementaria en línea S8, F y G). Si bien nuestros datos respaldan a CXCL11 como el ligando funcional predominante de CXCR3 en este contexto, no podemos descartar que CXCL9 y CXCL10 también puedan contribuir a la respuesta general dependiente de CXCR3, posiblemente a través de una producción transitoria y un rápido consumo local dentro del microambiente tumoral (MET). Aunque CCL5, un ligando de CCR5, también es capaz de atraer a las células T CD8,^[19] no aumentó significativamente 9 días después del tratamiento (figura suplementaria en línea S8H).

Para determinar cuándo aumenta CXCL11 en los tumores, realizamos un análisis cinético de esta proteína y demostramos que la terapia combinada aumenta significativamente la secreción de CXCL11 en los tumores CT26 a partir del día 5 in vivo (figura 5C). Para probar la importancia de CXCL11 en la eficacia de la terapia combinada, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido a CXCR3. Un ensayo de crecimiento tumoral demostró que el bloqueo de CXCR3 afectó significativamente la eficacia de la terapia combinada en los tumores CT26 (figura 5D), lo que destaca la importancia del eje CXCR3. El análisis de citometría de flujo mostró que el bloqueo de CXCR3 inhibió el aumento de las células T CD8 en los tumores al día 9 (figura 5E), lo que confirma que CXCR3 es crucial para el reclutamiento de células T CD8 en respuesta a la terapia combinada.### La secreción de CXCL11 por los macrófagos depende de GM-CSF

Para identificar la fuente de CXCL11 en el MET después del tratamiento, clasificamos las células dendríticas (CD) y los macrófagos de los tumores CT26 tratados o no con la terapia combinada al día 5 después del inicio del tratamiento. Este momento específico se eligió porque coincide con el aumento observado en la secreción de CXCL11 en respuesta a la terapia combinada (figura 5C). Los macrófagos, que son uno de los productores conocidos de CXCL11, fueron la única población inmunitaria que mostró un aumento significativo en la expresión de ARNm de Cxcl11 después del tratamiento (figura 5F; figura suplementaria en línea S8I-J).

Los macrófagos maduros secretan CXCL11, y se sabe que GM-CSF promueve la maduración de los macrófagos. In vivo, la producción de GM-CSF desencadenada por la terapia combinada fue fundamental para el aumento de CXCL11, ya que el bloqueo de GM-CSF previno por completo la regulación ascendente de CXCL11 en el MET 9 días después del tratamiento (figura 5G). Finalmente, dado que CXCL11 recluta células T CD8, investigamos si GM-CSF desempeña un papel en el reclutamiento de células T después de la terapia combinada. Observamos que el bloqueo de GM-CSF abolió el aumento de las células T CD8 observado al día 9 después del tratamiento in vivo en los tumores CT26 (figura 5H), lo que confirma el papel de GM-CSF en este proceso.

Dado que GM-CSF es producido por las células NK, examinamos el papel de las células NK en la producción de CXCL11 y la acumulación de células T CD8 al día 9. Mostramos que el agotamiento de las células NK utilizando el anticuerpo monoclonal anti-asialo-GM1 previno el aumento tanto de CXCL11 como de las células T CD8 (figura 5, I y J), lo que confirma que las células NK son esenciales para la producción de CXCL11 y, por lo tanto, para el reclutamiento de células T CD8 hacia el tumor. Finalmente, dado que las células T CD8 promueven el reclutamiento de células NK 1 día después del tratamiento, investigamos si el agotamiento de las células T CD8 podría afectar la producción de CXCL11 en los tumores. El agotamiento de las células T CD8 resultó en la pérdida del aumento de CXCL11 en el tumor después del tratamiento (figura 5K), lo que indica que las células T CD8 desempeñan un papel en el mantenimiento de la producción de CXCL11.

En resumen, nuestros datos demuestran que el aumento de las células T CD8 dentro del tumor al día 9 después del tratamiento se debe principalmente a su reclutamiento a través de CXCL11, producido por los macrófagos. Este reclutamiento depende de GM-CSF, las células NK y las células T CD8, y desempeña un papel crucial en la eficacia antitumoral de la terapia combinada.### El reclutamiento de Tregs por la terapia combinada dificulta su eficacia

Se sabe que las células T reguladoras CD4 (Tregs) expresan altos niveles de CXCR3 y pueden ser reclutadas por sus ligandos: CXCL9, CXCL10 y CXCL11.^[20] En nuestro estudio, observamos niveles elevados de CXCL11 en los tumores tratados con la terapia combinada (figura 5, B y C). Para evaluar si la población de Tregs en los tumores CT26 también se vio afectada por el tratamiento, realizamos análisis de citometría de flujo. Como se esperaba, encontramos que la terapia combinada condujo a un aumento significativo de las Tregs en los tumores CT26 9 días después del tratamiento, pero no al día 1 (figura 6A y B). Curiosamente, las Tregs no produjeron niveles elevados de IL-10 con el tratamiento anti-VEGFR-2 (figura suplementaria en línea S9A). Además, confirmamos que las Tregs expresan CXCR3, y observamos que la terapia combinada redujo la expresión de CXCR3 en la superficie de las Tregs, lo que es consistente con informes anteriores que indican que CXCR3 se internaliza y degrada después de la unión del ligando^[21] (figura 6C).

El aumento de las Tregs se abolió por completo cuando se bloqueó la señalización de CXCR3 utilizando un anticuerpo monoclonal contra CXCR3 (figura 6D), lo que confirma que las Tregs son reclutadas al tumor por la terapia combinada a través de la vía CXCR3. Además, un análisis de NanoString de los tumores CT26 al día 9 después del tratamiento mostró una sobreexpresión de genes asociados con las Tregs (figura 6E), lo que corroboró los hallazgos del análisis de citometría de flujo.

Se sabe que las Tregs fomentan un entorno inmunosupresor que limita la respuesta inmunitaria antitumoral. Para explorar si la focalización de las Tregs podría mejorar la eficacia de la terapia combinada, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido a CD25, que es la subunidad alfa del receptor de IL-2 necesario para la supervivencia de las Tregs, lo que permite la inactivación específica de las Tregs.^[22] En un ensayo de crecimiento tumoral de CT26, la combinación de la terapia combinada junto con el anticuerpo anti-CD25, que se dirige a las células Tregs sin afectar a las células T CD8 o a las células NK, resultó en una mejora drástica en el control tumoral, con casi el 100% de los ratones que lograron una regresión tumoral completa (figura 6, F y G y figura suplementaria en línea S9, de la B a la F). El re-inoculación de los ratones curados en la extremidad contralateral con células tumorales CT26 no reveló el desarrollo de tumores, lo que sugiere el establecimiento de una inmunidad antitumoral robusta y duradera (figura 6H).

Nuestro trabajo anterior demostró que CXCL11 es inducido por la producción de GM-CSF de las células NK (figura 4). En línea con esto, encontramos mediante citometría de flujo que el bloqueo de GM-CSF previno el aumento inducido por la terapia combinada de las Tregs en los tumores CT26 (figura 6I). De manera similar, el agotamiento de las células NK también abolió el aumento de las Tregs observado después del tratamiento con la terapia combinada (figura 6J). Dado que las células NK son reclutadas por las células T CD8 (figura 3), investigamos a continuación si el agotamiento de las células T CD8 afectaría el número de Tregs en los tumores CT26 después del tratamiento. Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD8 previno por completo el aumento de las Tregs en los tumores CT26 observados 9 días después del tratamiento (figura 6K), lo que confirma aún más la cascada secuencial de eventos que conduce a la producción de CXCL11 y el reclutamiento de Tregs.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que las Tregs son reclutadas al tumor por la terapia combinada, lo que implica la producción de CXCL11 y GM-CSF, así como la activación de las células NK y las células T CD8. A pesar del papel beneficioso observado de IL-10 en el reclutamiento de células NK, las Tregs aún ejercen funciones pro-tumorales, y su eliminación permite la eficacia antitumoral completa de la terapia combinada.

Las células T CD8 son necesarias para la eficacia del anti-VEGFR-2/anti-PD-1 contra un modelo tumoral de CRC

Para investigar los eventos inmunitarios que ocurren en los tumores después del tratamiento combinado (terapia combinada) con anticuerpos anti-VEGFR-2 (αR2) y anti-PD-1 (αPD1), evaluamos la respuesta de los modelos CT26 y MC38 de CRC. Ambos modelos mostraron una eficacia modesta de la terapia con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 solos, con una ligera disminución en el crecimiento tumoral. El anti-VEGFR-2 no tuvo eficacia en CT26, mientras que disminuyó ligeramente el crecimiento tumoral en el modelo MC38. En contraste, se observaron respuestas significativas con la combinación de anticuerpos anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 (terapia combinada), lo que mostró un efecto sinérgico en el modelo CT26 y un efecto aditivo en el modelo MC38 (figura 1A; figura suplementaria en línea S1, A-B). También evaluamos el crecimiento tumoral en un modelo de implantación ortotópica de células CT26-luciferasa en el ciego, donde la terapia combinada también demostró una eficacia significativa (figura 1C; figura suplementaria en línea S1B). Para confirmar nuestros datos, también estudiamos la respuesta utilizando anti-VEGF-A y encontramos que funcionó en una medida similar (figura suplementaria en línea S1D). En consecuencia, utilizando ratones desnudos, demostramos que los linfocitos T son cruciales para la eficacia de la terapia combinada, ya que no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral en ausencia de linfocitos T en los tumores CT26 y MC38 (figura suplementaria en línea S1E y F).

Para evaluar ampliamente el impacto de la terapia combinada en el perfil inmunitario del MET, realizamos un análisis de NanoString para analizar el transcriptoma de los tumores CT26 en masa recolectados 9 días después del inicio de la terapia combinada. Al observar los genes asociados con las funciones de las células T, más del 38% de ellos se regularon al alza significativamente en el grupo de terapia combinada (figura 1C; tabla suplementaria en línea S1), lo que sugiere la activación de las células T inducida por la terapia combinada.

En consecuencia, el análisis de citometría de flujo de los tumores CT26 reveló un aumento muy rápido y significativo en el número de células T CD8 1 y 9 días después de la primera inyección del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 1, D y E), mientras que la población de células T CD4 permaneció sin cambios (figura suplementaria en línea S2, A y B). Para explicar este rápido aumento en respuesta al anti-VEGFR-2, evaluamos la proliferación de las células T CD8 1 día después del tratamiento. Encontramos que las células T CD8 exhibieron una expresión significativamente mayor de Ki-67 en los tumores tratados (figura 1F). Curiosamente, el 10% de las células T CD8 de los tumores CT26 expresaron VEGFR-2, lo que sugiere un efecto directo sobre el objetivo de la inhibición de VEGFR-2 en las células T CD8 (figura 1G). Además, la mayoría de las células T CD8 específicas del antígeno tumoral en los tumores CT26 expresaron VEGFR-2 (figura 1H) y aumentaron después del primer tratamiento con anti-VEGFR2 (figura suplementaria en línea S2C). En consecuencia, solo la transferencia de células T CD8 que expresan VEGFR-2 a ratones desnudos que portan tumores CT26 permitió un efecto de la terapia combinada en el crecimiento tumoral, mientras que la transferencia de células T CD8 que no expresan VEGFR-2 no tuvo ningún impacto (figura suplementaria en línea S2D). Dado que se sabe que el eje VEGF/VEGFR suprime la proliferación de las células T, estos datos sugieren fuertemente un efecto directo del anti-VEGFR-2 sobre la proliferación de las células T CD8.^[12]

Curiosamente, aunque la población de células T CD8 aumentó en el tumor tan pronto como 1 día después del tratamiento, estas células no mostraron en este momento una mayor activación (medida por la expresión de CD69) ni un aumento de la citotoxicidad (indicado por la expresión de granzima B) (figura 1, I y J). Sin embargo, 9 días después del tratamiento, las células T CD8 exhibieron una mayor activación y niveles más altos de granzima B tras la biterapia (figura 1, K y L), lo que sugiere que diferentes mecanismos regulan tanto su proliferación como su activación con el tiempo.

Las células T CD8 desempeñan un papel importante al inicio del tratamiento

Para confirmar aún más el papel de las células T CD8 en la respuesta inmunitaria a la terapia combinada, realizamos ensayos de crecimiento tumoral utilizando un anticuerpo monoclonal depletor de CD8β que se dirige y elimina eficazmente las células T CD8 en 24 horas (figura suplementaria en línea S2E). La depleción de células T CD8 abolió por completo la eficacia de la terapia combinada tanto en los modelos CT26 como en MC38, lo que subraya el papel crucial de las células T CD8 en la respuesta al tratamiento (figura 1M y figura suplementaria en línea 2F). También investigamos la importancia temporal de las células T CD8 en la eficacia de la terapia combinada mediante la depleción de células T CD8 al inicio del tratamiento (D0) o 3 días después del inicio del tratamiento (D3). Si bien la depleción de células T CD8 3 días después del inicio del tratamiento tuvo un impacto muy limitado en la inhibición del crecimiento tumoral, la depleción al inicio del tratamiento afectó drásticamente la capacidad de la terapia para controlar el crecimiento tumoral tanto en los modelos de tumor CT26 como en MC38 (figura 1N; figura suplementaria en línea S2 G y H). Estos hallazgos sugieren que las células T CD8 desempeñan un papel antitumoral crítico en los primeros 3 días después del tratamiento anti-VEGFR-2.

A partir de estos hallazgos, nuestro objetivo fue investigar el papel temprano de las células T CD8. Descubrimos mediante citometría de flujo que la depleción temprana de células T CD8 redujo el número de células NK intratumorales 1 día después del tratamiento, tanto en los tumores CT26 como en MC38 (figura 1O y figura suplementaria en línea S2 I). Las células NK no expresan VEGFR-2, lo que elimina la posibilidad de un efecto directo del anti-VEGFR-2 sobre estas células (figura suplementaria en línea S2J). La depleción de células T CD8 no afectó la proliferación de las células NK, lo que sugiere que las células T CD8 podrían facilitar el reclutamiento de células NK en el tumor (figura suplementaria en línea S2K). En conjunto, estos datos establecen aún más a las células T CD8 como objetivos directos del tratamiento anti-VEGFR-2 y sugieren que desempeñan un papel fundamental en el aumento temprano posterior de las células NK tras el tratamiento.

En resumen, nuestros datos demuestran que la terapia combinada de anti-PD-1 y anti-VEGFR-2 depende de las células T CD8 para una inhibición eficaz del crecimiento tumoral en modelos preclínicos de carcinoma colorrectal. Además, revelamos una relación inesperada entre las células T CD8 y las células NK dentro del microambiente tumoral (TME) tan pronto como 1 día después del tratamiento.

Caracterización de las células T CD8 y las posibles interacciones de las células NK después del tratamiento anti-VEGFR-2

Para obtener una comprensión más profunda de la relación entre las células T CD8 y las células NK en los tumores CT26, realizamos un análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) 1 día después del primer tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 2A). Después del control de calidad, las células se agruparon en 16 tipos de células distintos (figura suplementaria en línea S3).

Nos centramos en los cuatro grupos de células NK (NK1, NK2, NK3 y NK4) y los dos grupos que contienen células T CD8 (Tcells1 y Tcells2). Mostramos que los cuatro grupos de células NK corresponden a células NK en ciclo (Mki67, Birc5 y Nusap1) (NK4), células NK secretoras (Ccl3, Ccl4, Ccl5) (NK3), células NK citotóxicas (Gzmd, Gzme, Gzmc) (NK2) y, finalmente, células NK sin características definitorias, excepto la expresión de los marcadores clásicos de las células NK Eomes y Ncr1, a las que en adelante se denominará células NK en reposo (NK1) (figura 2, B y C; figura suplementaria en línea S4C). En cuanto a las células T, el grupo Tcells2 corresponde a células T CD8 en ciclo (Mki67, Birc5 y Cd8a) y el grupo Tcells1 corresponde a una población de células T mixtas (Cd4, Cd8a, Cd3e) (figura 2, B y C).

Utilizamos CellChat para identificar posibles vías de comunicación intercelular entre las células T CD8 y las células NK y comparar dos conjuntos de datos de scRNA-seq, establecidos utilizando células de ratones tratados con Ig y de ratones tratados con anti-VEGFR-2 1 día después del primer tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 2A). Con base en este análisis, identificamos varias posibles interacciones desde células T mixtas hasta células NK (figura 2D) y desde células T en ciclo hasta células NK (figura 2E). Dado que buscábamos interacciones desencadenadas por el tratamiento, nos centramos en las interacciones que se encontraron solo en el conjunto de datos tratado con anti-VEGFR-2 (figura 2F) e identificamos siete posibles vías de comunicación cruzada inducidas por el tratamiento. La expresión de ARN mensajero (ARNm) de Spp1 por las células T CD8 se correlacionó con sus receptores Cd44, ItgavItgb1, Itga4Itg1b e ItgavItgb3 en las células NK. La expresión de ARNm de Cxcl10, Il10 y Tnsfs9 en las células T CD8 se asoció con la presencia de sus receptores Cxcr3, Il10ra-Il10rb y Tnfrsf9_ en las células NK.

En conjunto, nuestros datos de scRNA-seq resaltan las posibles interacciones entre las células T CD8 y las células NK inducidas por la terapia anti-VEGFR-2.

Luego, evaluamos la expresión de proteínas de las vías candidatas identificadas en las células T CD8 y las células NK. Utilizando citometría de flujo, encontramos que las células T CD8 no expresan niveles significativos de las proteínas SPP1 ni TNFSF9 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura suplementaria en línea S4, D y E), lo que descarta estas vías. La vía CXCL10-CXCR3 mostró una baja probabilidad, un valor p alto y solo apareció una vez, lo que hace que esta vía sea poco probable. Por lo tanto, el eje IL-10/receptor de IL-10 (IL-10R) siguió siendo la única vía plausible.

IL-10 es producida por las células T CD8 después del tratamiento anti-VEGFR-2

Para explorar si la vía IL-10/IL-10R está involucrada en el reclutamiento de células NK mediado por las células T CD8, primero evaluamos los niveles de IL-10 en el tumor 3 días después del primer tratamiento anti-VEGFR2 y encontramos que tanto el anti-VEGFR-2 solo como la biterapia fueron capaces de desencadenar un aumento de IL-10 en los tumores CT26 (figura suplementaria en línea S5A). También pudimos detectar un aumento de IL-10 en los tumores MC38 tratados con la biterapia 3 días después del primer tratamiento anti-VEGFR2 (figura suplementaria en línea S5B) y, en un ensayo de crecimiento tumoral MC38, observamos que el uso de un anticuerpo bloqueador dirigido contra IL-10 redujo la eficacia antitumoral de la biterapia contra el crecimiento tumoral MC38 (figura suplementaria en línea S5C). Luego, probamos la capacidad de las células T CD8 intratumorales para producir IL-10 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2. Descubrimos que las células T CD8 aisladas de los tumores CT26 produjeron más del doble de la cantidad de IL-10 en comparación con los controles no tratados, mientras que otros tipos de células inmunitarias no mostraron un aumento en la producción de IL-10 (figura 3A y figura suplementaria en línea S5 D a O). Por lo tanto, el aumento intratumoral de IL-10 se debió principalmente a las células T CD8 y nuestros datos de scRNA-seq confirmaron la presencia de células que coexpresan Cd8a e Il10, así como células que coexpresan Foxp3 e Il10; sin embargo, no se observó un aumento en la expresión de Il10 en las células T reguladoras (Tregs) (figura suplementaria en línea S5P-Q). En consecuencia, las células T CD8 aisladas del bazo de ratones naive y activadas durante 3 días produjeron cantidades crecientes de IL-10 (figura 3B). Esta observación se alinea con estudios previos que demuestran que las células T CD8 altamente activadas pueden producir IL-10 después de infecciones virales ^[13].

Para investigar si el VEGF-A podría modular la producción de IL-10 por las células T CD8, incubamos células T CD8 purificadas del bazo de ratones naive con concentraciones crecientes de VEGF-A, dentro del rango observado in vivo en los tumores CT26 (figura suplementaria en línea S5 R), durante 72 horas ex vivo. Observamos que el VEGF-A inhibió significativamente la producción de IL-10 por las células T CD8 (figura 3C). A continuación, evaluamos el papel de IL-10 en la eficacia de la terapia combinada anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 en los tumores CT26. Utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizador de IL-10, encontramos que el bloqueo de IL-10 perjudicó significativamente la eficacia terapéutica, lo que provocó un crecimiento tumoral más rápido (figura 3D; figura suplementaria en línea S6A), lo que destaca un papel inmunostimulante de IL-10. Estos resultados indican que la producción de IL-10 por las células T CD8 se induce rápidamente mediante el tratamiento anti-VEGFR-2 y desempeña un papel crucial en el aumento de la eficacia de esta biterapia.

IL-10 puede impulsar directamente el reclutamiento de células NK

Para evaluar el posible efecto de IL-10 sobre las células NK, primero medimos la expresión de IL-10R en su superficie. Descubrimos que casi todas las células NK del sangre de ratones naive y de ratones con tumores CT26 expresaban IL-10R (figura 3E). In vivo, observamos una disminución significativa en el porcentaje de células NK que expresan IL-10R dentro del tumor 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2 (figura 3F), lo que es consistente con la internalización conocida de IL-10R al unirse a IL-10 (3). Utilizando células NK clasificadas del bazo de ratones naive y cultivadas in vitro con dosis crecientes de IL-10, confirmamos la disminución de la expresión de IL-10R después de la señalización de IL-10 (figura 3G). Estos hallazgos sugieren que las células NK en el microambiente tumoral (TME) se expusieron a niveles significativamente activos de IL-10 después del tratamiento anti-VEGFR-2. También observamos que el aumento en el número de células NK inducido por el tratamiento anti-VEGFR-2 en los tumores CT26 se abolió con el bloqueo de IL-10 (figura 3H), lo que sugiere un papel crítico de IL-10 en el aumento de las células NK después del tratamiento. Además, esto es consistente con la ausencia de un aumento en el número de células NK en tumores que carecen de células T CD8, como se muestra en la figura 1O. El aumento observado en las células NK 1 día después del tratamiento anti-VEGFR-2, que depende tanto de las células T CD8 como de IL-10, y el aumento de la producción de IL-10 por las células T CD8 sugieren un posible efecto directo de IL-10 en el reclutamiento de células NK.

Para explorar el impacto directo de IL-10 en el reclutamiento de células NK, clasificamos las células NK del bazo de ratones naive y las cultivamos con dosis crecientes de IL-10. Después de 24 horas, no observamos un cambio significativo en la proliferación de células NK, según lo medido por la expresión de Ki-67 (figura 3I). Luego, realizamos ensayos de migración utilizando un sistema de transwell, exponiendo las células NK del bazo de ratones naive a concentraciones crecientes de IL-10 durante 4 horas. Aquí, demostramos que IL-10 atrajo significativamente a las células NK de manera dependiente de la dosis (figura 3J). Además, se observó un efecto similar con las células NK aisladas de tumores CT26 no tratados (figura suplementaria en línea S6B). Dado que IL-10 señala a través de la vía mTOR (4), evaluamos el papel de mTOR en la migración de células NK mediada por IL-10. Para ello, tratamos las células NK con rapamicina, un potente inhibidor del complejo 1 de mTOR, lo que resultó en una inhibición completa de la migración de células NK (figura 3J). En conjunto, estos resultados confirman que IL-10, de manera dependiente de mTOR, exhibe una capacidad quimiotáctica y facilita la migración de células NK.

Finalmente, para demostrar que el papel antitumoral de IL-10 durante el tratamiento depende de la función de las células NK, y en ausencia de ratones con deleción de IL10RA, realizamos un experimento de crecimiento tumoral CT26 en ratones WT utilizando la biterapia junto con el anti-asialo-GM1 (para agotar las células NK) y un anticuerpo monoclonal anti-IL-10R. Observamos que tanto el agotamiento de las células NK como el bloqueo de IL-10R limitaron la eficacia de la biterapia en un grado similar y que la combinación de estos dos anticuerpos no tiene un efecto adicional, lo que sugiere fuertemente que las células NK y IL-10R forman parte de la misma cascada de eventos, lo que refuerza el vínculo entre la señalización de IL-10 y las células NK (figura 3K y figura suplementaria en línea S6C-D).

En conclusión, nuestros datos demuestran que las células T CD8 producen IL-10 en respuesta al tratamiento anti-VEGFR-2, y esta señalización de IL-10 desempeña un papel fundamental en el reclutamiento de células NK en el tumor.

Las células NK son necesarias para la maduración de macrófagos inducida por la biterapia

Para dilucidar el papel de las células NK en la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido contra asialo-GM1 que agota las células NK (figura S7A en el material suplementario en línea). El agotamiento de las células NK alteró significativamente el control tumoral tanto en los tumores CT26 como en los MC38, lo que demuestra que las células NK son esenciales para la eficacia terapéutica de la biterapia (figura 4A y figura S7B en el material suplementario en línea). En particular, el análisis por citometría de flujo del microambiente tumoral (TME) mostró que el agotamiento de las células NK condujo a una reducción significativa en la proporción de macrófagos maduros dentro del TME 9 días después del inicio del tratamiento (figura 4B).

El análisis por citometría de flujo del infiltrado inmunitario en un ensayo cinético reveló que el tratamiento indujo una mayor maduración de los macrófagos, como lo indica el aumento del porcentaje de macrófagos que expresan altos niveles del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II 3 días después del inicio del tratamiento (figura 4C).

Aunque el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) es conocido por su capacidad para promover la maduración de los macrófagos,^[14] el interferón gamma (IFN-γ)^[15] y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)^[16] también pueden inducir la maduración de los macrófagos y son producidos por las células NK.^[17] El análisis cinético de estos niveles de citocinas en los tumores CT26 reveló que, si bien los niveles de TNF-α permanecieron sin cambios después de la biterapia (figura 4D), los niveles de IFN-γ se elevaron solo 9 días después del tratamiento, cuando los niveles de GM-CSF se incrementaron significativamente en los tumores tratados con la biterapia 3 días después del tratamiento y se mantuvieron elevados en el día 9 (figura 4D). El aumento de GM-CSF coincidió con el aumento observado en la maduración de los macrófagos en los días 3 y 9, lo que sugiere un papel fundamental de GM-CSF en este proceso.

Para evaluar directamente la contribución de GM-CSF a la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal contra GM-CSF y descubrimos que el bloqueo de GM-CSF disminuyó significativamente la eficacia de la biterapia en el control del crecimiento tumoral de CT26 (figura 4E). El bloqueo de GM-CSF interrumpió la maduración de los macrófagos inducida por la biterapia, como lo demuestra la reducción de la expresión de MHC II (figura 4F y figura 7C en el material suplementario en línea). Esto destaca el papel indispensable de GM-CSF en la facilitación de la maduración de los macrófagos in vivo en el contexto de esta terapia combinada.

La producción de GM-CSF por las células NK aumenta la maduración de los macrófagos

Para identificar la fuente de la producción de GM-CSF en el TME 3 días después del tratamiento, se clasificaron las principales poblaciones de células inmunitarias conocidas por producir GM-CSF a partir de tumores CT26 tratados con la biterapia o con vehículo, y se cultivaron ex vivo durante 24 horas. Si bien los macrófagos, las células dendríticas (DC) y las células T CD8 no mostraron un aumento en el ARNm de Csf2, que codifica para GM-CSF, las células NK exhibieron un aumento significativo en el ARNm de Csf2 y en la producción de proteína GM-CSF después del tratamiento con la biterapia (figura 4G; figura S7D y E en el material suplementario en línea). Validamos aún más el papel in vivo de las células NK en la producción de GM-CSF al evaluar los niveles de GM-CSF en los tumores CT26 tratados con biterapia, con o sin el agotamiento de las células NK. El aumento en los niveles de GM-CSF observado con la biterapia se abolió en ausencia de células NK, lo que confirma que las células NK son la fuente principal de GM-CSF después de la biterapia (figura 4H). Además, dado que las células T CD8 median el reclutamiento de las células NK en respuesta a la biterapia (figura 3), observamos que tanto la producción de GM-CSF como la maduración de los macrófagos estaban ausentes cuando las células T CD8 fueron agotadas (figura 4, I y J y figura S7F en el material suplementario en línea). Finalmente, en ratones Ncr1cre Csf2flox en los que las células NK no pueden producir GM-CSF, que presentaban tumores MC38 y fueron tratados con la biterapia, observamos que la ausencia de GM-CSF derivado de las células NK bloqueó la expansión de macrófagos con alta expresión de MHC II (figura S7G en el material suplementario en línea).

En conjunto, estos datos demuestran que la biterapia promueve que las células NK produzcan GM-CSF, lo cual es esencial para la maduración de los macrófagos en el TME. Esta maduración de los macrófagos es crucial para la eficacia general de la biterapia en el control de la progresión tumoral.

CXCL11 recluta células T CD8 en el tumor en momentos posteriores al tratamiento

Observamos un aumento en la población de células T CD8 en el día nueve después de la biterapia con anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 (figura 1E). Para comprender mejor el papel del anti-PD-1, discriminamos diferentes subpoblaciones de células T CD8 utilizando PD1, Tim3 y SlamF6 para definir células T no agotadas (triple negativo), células T progenitoras agotadas (PD1+SlamF6+) y células T CD8 terminalmente agotadas (PD1+Tim3+). En este momento, las células T CD8 terminalmente agotadas se incrementaron preferentemente en el grupo de tratamiento combinado, lo que apoya aún más un papel del anti-PD-1 en la configuración del estado funcional de las células T CD8 infiltrantes tumorales (Datos ampliados, figura S8A en el material suplementario en línea). Si bien el anti-VEGFR-2 promovió la acumulación de células T CD8, el anti-PD-1 es necesario para la adquisición óptima de funciones efectoras, incluida la producción de granzima B e IFNγ en múltiples subconjuntos de células T CD8 (Datos ampliados, figura S8 A, B y C en el material suplementario en línea). Para comprender mejor los mecanismos subyacentes que impulsan este aumento, evaluamos la proliferación de las células T CD8 midiendo la expresión de Ki-67. No se observó una diferencia significativa en la expresión de Ki-67, lo que sugiere que el aumento de las células T CD8 no se debió a una mayor proliferación, sino más bien al aumento del reclutamiento de estas células al tumor (figura 5A). A continuación, investigamos los mecanismos moleculares subyacentes al reclutamiento de las células T CD8 al evaluar la expresión de CXCL9, CXCL10 y CXCL11, que son ligandos de CXCR3 y se sabe que atraen a las células T CD8.^[18] Los tres quimiocinas mostraron un aumento en la expresión de ARNm en comparación con los controles en los análisis del tumor (figura S8 C a E en el material suplementario en línea). Curiosamente, solo los niveles de proteína CXCL11 aumentaron significativamente en los tumores CT26 después del tratamiento con biterapia en el día 9 (figura 5B, figura S8, F y G en el material suplementario en línea). Si bien nuestros datos respaldan a CXCL11 como el ligando funcional predominante de CXCR3 en este entorno, no podemos descartar que CXCL9 y CXCL10 también puedan contribuir a la respuesta general dependiente de CXCR3, posiblemente a través de una producción transitoria y un rápido consumo local dentro del TME. Aunque CCL5, un ligando de CCR5, también es capaz de atraer a las células T CD8,^[19] no aumentó significativamente 9 días después del tratamiento (figura S8H en el material suplementario en línea).

Para determinar cuándo CXCL11 aumenta en los tumores, realizamos un análisis cinético de esta proteína y demostramos que la biterapia aumenta significativamente la secreción de CXCL11 en los tumores CT26 a partir del día 5 in vivo (figura 5C). Para probar la importancia de CXCL11 en la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido contra CXCR3. Un ensayo de crecimiento tumoral demostró que el bloqueo de CXCR3 alteró significativamente la eficacia de la biterapia en los tumores CT26 (figura 5D), lo que destaca la importancia del eje CXCR3. El análisis por citometría de flujo mostró que el bloqueo de CXCR3 inhibió el aumento de las células T CD8 en los tumores en el día 9 (figura 5E), lo que confirma que CXCR3 es crucial para el reclutamiento de las células T CD8 en respuesta a la biterapia.

La secreción de CXCL11 por los macrófagos depende de GM-CSF

Para identificar la fuente de CXCL11 en el TME después del tratamiento, clasificamos las DC y los macrófagos de los tumores CT26 tratados o no con la biterapia en el día 5 después del inicio del tratamiento. Este momento específico se eligió ya que coincide con el aumento observado en la secreción de CXCL11 en respuesta a la biterapia (figura 5C). Los macrófagos, que son uno de los productores conocidos de CXCL11, fueron la única población inmunitaria que mostró un aumento significativo en la expresión de ARNm de Cxcl11 después del tratamiento (figura 5F; figura S8I-J en el material suplementario en línea).

Los macrófagos maduros secretan CXCL11, y se sabe que GM-CSF promueve la maduración de los macrófagos. In vivo, la producción de GM-CSF desencadenada por la biterapia fue fundamental para el aumento de CXCL11, ya que el bloqueo de GM-CSF previno por completo la regulación al alza de CXCL11 en el TME 9 días después del tratamiento (figura 5G). Finalmente, dado que CXCL11 recluta a las células T CD8, investigamos si GM-CSF juega un papel en el reclutamiento de las células T después de la biterapia. Observamos que el bloqueo de GM-CSF abolió el aumento de las células T CD8 observado en el día 9 después del tratamiento in vivo en los tumores CT26 (figura 5H), lo que confirma el papel de GM-CSF en este proceso.

Dado que GM-CSF es producido por las células NK, examinamos el papel de las células NK en la producción de CXCL11 y la acumulación de células T CD8 en el día 9. Mostramos que el agotamiento de las células NK utilizando el anticuerpo monoclonal anti-asialo-GM1 previno el aumento tanto de CXCL11 como de las células T CD8 (figura 5, I y J), lo que confirma que las células NK son esenciales para la producción de CXCL11 y, por lo tanto, para el reclutamiento de las células T CD8 al tumor. Finalmente, dado que las células T CD8 promueven el reclutamiento de las células NK 1 día después del tratamiento, investigamos si el agotamiento de las células T CD8 podría afectar la producción de CXCL11 en los tumores. El agotamiento de las células T CD8 resultó en una pérdida del aumento de CXCL11 en el tumor después del tratamiento (figura 5K), lo que indica que las células T CD8 juegan un papel en el mantenimiento de la producción de CXCL11.

En resumen, nuestros datos demuestran que el aumento de las células T CD8 dentro del tumor en el día 9 después del tratamiento se debe principalmente a su reclutamiento a través de CXCL11, producido por los macrófagos. Este reclutamiento depende de GM-CSF, las células NK y las células T CD8, y juega un papel crucial en la eficacia antitumoral de la biterapia.

El reclutamiento de Tregs por la biterapia dificulta su eficacia

Se sabe que las células T reguladoras CD4 (Tregs) expresan altos niveles de CXCR3 y pueden ser reclutadas por sus ligandos: CXCL9, CXCL10 y CXCL11.^[20] En nuestro estudio, observamos un aumento en los niveles de CXCL11 en los tumores tratados con la biterapia (figura 5, B y C). Para evaluar si la población de Tregs en los tumores CT26 también se veía afectada por el tratamiento, realizamos análisis por citometría de flujo. Como se esperaba, encontramos que la biterapia condujo a un aumento significativo de las Tregs en los tumores CT26 9 días después del tratamiento, pero no en el día 1 (figura 6A y B). Curiosamente, las Tregs no produjeron niveles aumentados de IL-10 con el tratamiento anti-VEGFR-2 (figura S9A en el material suplementario en línea). Además, confirmamos que las Tregs expresan CXCR3, y observamos que la biterapia redujo la expresión de CXCR3 en la superficie de las Tregs, lo que es consistente con informes anteriores que indican que CXCR3 se internaliza y se degrada después de la unión al ligando^[21] (figura 6C).

El aumento de las Tregs se abolió por completo cuando la señalización de CXCR3 se bloqueó utilizando un anticuerpo monoclonal contra CXCR3 (figura 6D), lo que confirma que las Tregs son reclutadas al tumor por la biterapia a través de la vía CXCR3. Además, un análisis NanoString de los tumores CT26 en el día 9 después del tratamiento mostró una sobreexpresión de genes asociados con las Tregs (figura 6E), lo que corroboró los hallazgos del citometría de flujo.

Se sabe que las Tregs fomentan un entorno inmunosupresor que limita la respuesta inmunitaria antitumoral. Para explorar si la focalización de las Tregs podría mejorar la eficacia de la biterapia, utilizamos un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD25, que es la subunidad alfa del receptor de IL-2 necesario para la supervivencia de las Tregs, lo que permite la inactivación específica de las Tregs.^[22] En un ensayo de crecimiento tumoral de CT26, la combinación de la biterapia junto con el anticuerpo anti-CD25, que se dirige a las células Tregs sin afectar a las células T CD8 o a las células NK, resultó en una mejora dramática en el control tumoral, con casi el 100% de los ratones logrando una regresión tumoral completa (figura 6, F y G y figura S9 B a F en el material suplementario en línea). El re-inoculación de los ratones curados en la extremidad contralateral con células tumorales CT26 no reveló el desarrollo de tumores, lo que sugiere el establecimiento de una inmunidad antitumoral robusta y duradera (figura 6H).

Nuestro trabajo previo demostró que CXCL11 es inducido por la producción de GM-CSF a partir de las células NK (figura 4). En línea con esto, encontramos mediante citometría de flujo que el bloqueo de GM-CSF previno el aumento de Tregs inducido por la biterapia en tumores CT26 (figura 6I). De manera similar, el agotamiento de las células NK también abolió el aumento de Tregs observado después del tratamiento con biterapia (figura 6J). Dado que las células NK son reclutadas por las células T CD8 (figura 3), investigamos a continuación si el agotamiento de las células T CD8 afectaría el número de Tregs en los tumores CT26 después del tratamiento. Como se esperaba, el agotamiento de las células T CD8 previno por completo el aumento de Tregs en los tumores CT26 observado 9 días después del tratamiento (figura 6K), lo que confirma aún más la cascada secuencial de eventos que conduce a la producción de CXCL11 y el reclutamiento de Tregs.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que los Tregs son reclutados al tumor por la biterapia, lo que implica la producción de CXCL11 y GM-CSF, así como la activación de las células NK y las células T CD8. A pesar del papel beneficioso observado de IL-10 en el reclutamiento de células NK, los Tregs aún ejercen funciones pro-tumorales, y su eliminación permite la eficacia antitumoral completa de la biterapia.

Discusión

La combinación de un agente antiangiogénico (AA) y un bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB) ha recibido la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) para el tratamiento de múltiples cánceres, lo que demuestra mejoras significativas en la supervivencia libre de progresión y la supervivencia general de los pacientes.^[23][25] Existe una sólida justificación para combinar un ICB con un AA. De hecho, si bien los AA normalizan los vasos tumorales y promueven la infiltración de células inmunitarias en los tumores,[12 26], también mejoran la respuesta al anti-PD1 en modelos de tumores murinos.^[4] En conjunto, esta combinación terapéutica promete mejorar la respuesta antitumoral general. Sin embargo, el uso de ICB solo no se recomienda para pacientes con CRC con cáncer de microsatélites estables (MSS), y se necesitan terapias combinadas para revertir la resistencia, y los ensayos clínicos recientes sugieren una posible eficacia del AA y el ICB en el CRC MSS.^[6] Sin embargo, las interacciones entre la terapia antiangiogénica y los inhibidores de puntos de control dentro del microambiente inmunitario se comprenden poco.

El presente estudio dilucida los mecanismos inmunitarios desencadenados por la combinación de terapias anti-VEGFR-2 y anti-PD-1 en dos modelos preclínicos de CRC. Inesperadamente, nuestros hallazgos proporcionan evidencia convincente de que las células T CD8 actúan como los primeros respondedores a este tratamiento y desempeñan un papel fundamental en la configuración de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas dentro del tumor en ratones. Caracterizamos aún más la secuencia de eventos inmunitarios provocados por la biterapia, que involucra a las células T CD8, las células NK, los macrófagos y los Tregs, así como las señales moleculares que vinculan a estas poblaciones celulares (ver esquema gráfico en la figura suplementaria en línea S14).

Las células T CD8 están bien establecidas como mediadores clave de la inmunidad antitumoral. En nuestros modelos murinos, observamos un aumento de las células T CD8 dentro del tumor después del tratamiento, lo que coincide con los hallazgos de estudios clínicos en los que las células T infiltrantes tumorales (TIL) CD8 aumentaron después de la terapia con ramucirumab (anti-VEGFR-2).^[27] En particular, el agotamiento de las células T CD8 resultó en una marcada reducción de la eficacia de la biterapia. Los experimentos de agotamiento en diferentes puntos temporales revelaron que las células T CD8 ejercen sus funciones antitumorales más significativas dentro de los 3 días posteriores al tratamiento inicial con anti-VEGFR-2, con efectos limitados en etapas posteriores. Observamos que, entre las células T CD8 que expresan VEGFR-2, más del 60% de ellas son específicas para un antígeno tumoral, lo que coincide con el hecho conocido de que VEGFR-2 se sobreexpresa en la activación de las células T.^[28] Se ha demostrado que el VEGF suprime la proliferación de las células T.^[12] Esto es consistente con nuestra observación de una mayor proliferación de las células T CD8 después del tratamiento con anti-VEGFR-2. Estos datos sugieren que el bloqueo del eje VEGFR-2/VEGF-A facilita la rápida expansión de las células T CD8 en nuestros dos modelos murinos de tumores de CRC.

Curiosamente, el agotamiento de las células T CD8 también condujo a una reducción significativa del número de células NK dentro del tumor. Para investigar la interacción entre las células T CD8 y las células NK, realizamos secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) y descubrimos una relación inesperada. De hecho, nuestro análisis reveló que el aumento de la producción de IL-10 por las células T CD8 después del tratamiento con anti-VEGFR-2 fue un factor clave que impulsó el reclutamiento de células NK al tumor.

La producción de IL-10 por las células T CD8 ha sido ampliamente documentada y normalmente requiere una fuerte estimulación antigénica.^[29] Si bien el VEGF no se ha relacionado previamente con la producción de IL-10, se sabe que contribuye al agotamiento de las células T,^[28], y observamos que el tratamiento con anti-VEGFR-2 no solo mejoró la proliferación de las células T CD8, sino que también indujo la producción de IL-10 por estas células.

A pesar de sus conocidas propiedades inmunorreguladoras,[13 30], también se ha demostrado que la IL-10 activa las células NK, mejorando su proliferación y citotoxicidad.^[31][33] En nuestro estudio, inesperadamente, la IL-10 desempeña un papel no canónico como un quimioatrayente para las células NK hacia el tumor, aumentando así su población después del tratamiento. El papel preciso de la IL-10 en la migración celular sigue siendo controvertido, ya que puede promover^[34][36] e inhibir la migración.[37 38]. Informes recientes indican que la IL-10 activa la vía mTORC1 en las células NK humanas y mejora sus funciones.^[31] Curiosamente, se sabe que la vía de señalización mTOR media la migración celular.[39 40]. Mecánicamente, demostramos que la IL-10 es suficiente para inducir la migración de células NK al tumor en ratones, y este proceso requiere la señalización de mTOR, como lo demuestra la inhibición de la migración de células NK inducida por IL-10 con el tratamiento con rapamicina, un inhibidor de mTOR.

Este estudio describe una nueva interacción entre las células T CD8 y las células NK en ratones, donde las células NK están influenciadas por las células T CD8. Este hallazgo sugiere que las células T CD8 no solo actúan como efectoras, sino que también influyen en otras poblaciones inmunitarias innatas, como las células NK. También describe cómo la IL-10, que normalmente se asocia con la tolerancia inmunitaria, puede promover el reclutamiento de células NK en el contexto de la activación inmunitaria, lo que marca un concepto emergente en la inmunología murina.

Después de establecer los primeros eventos inmunitarios desencadenados por la biterapia, exploramos a continuación las funciones antitumorales de las células NK. El agotamiento de las células NK condujo a una pérdida significativa de la eficacia terapéutica. Encontramos que el GM-CSF derivado de las células NK promovió la maduración de los macrófagos, un fenómeno observado previamente en la artritis inflamatoria.^[17] Las células NK expresaron tanto los genes CD2 como IL2rb, lo que podría explicar su producción de GM-CSF como se observó anteriormente.^[41] A su vez, estos macrófagos exhibieron una mayor producción de CXCL11, una quimiocina conocida por atraer a las células que expresan CXCR3, incluidas las células T CD8,^[42], lo que probablemente explica el aumento de las células T CD8 observadas en etapas posteriores de la terapia en nuestro modelo preclínico. Además, confirmamos que el agotamiento tanto de las células T CD8 como de las células NK abolió la regulación al alza de CXCL11 en los macrófagos, lo que valida aún más nuestra cascada inmunitaria.

Sin embargo, el eje CXCL11/CXCR3 no solo permite el reclutamiento de células T CD8 antitumorales, sino también de Tregs,^[43], lo que coincide con nuestras observaciones. Curiosamente, el bloqueo de anti-VEGFR-2 solo conduce a una disminución de los Tregs^[44] cuando la biterapia resultó en un aumento de los Tregs. Como se esperaba, el agotamiento de los Tregs utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 mejoró la eficacia de la biterapia. Además, validamos la cascada de eventos que conducen al aumento de la producción de CXCL11 y el reclutamiento de Tregs. Curiosamente, aunque se sabe que la IL-10 está asociada con la inmunosupresión mediada por Tregs,^[45], nuestros hallazgos sugieren que la IL-10 es crucial para fomentar una potente respuesta inmunitaria antitumoral, lo que refleja un cambio de paradigma en nuestra comprensión del papel de la IL-10 en la inmunidad tumoral en ratones.

En conclusión, este estudio revela una coreografía inmunitaria en capas que explica por qué el bloqueo dual de VEGFR-2 y PD-1 puede sinergizar incluso en tumores poco inmunogénicos en ratones. Este trabajo identifica una nueva cascada inmunitaria, con la producción de IL-10 por las células T CD8 como piedra angular de la eficacia de la biterapia. Las características específicas del microambiente tumoral necesarias para que la IL-10 medie los efectos antitumorales aún deben dilucidarse. Hasta entonces, se debe tener precaución al considerar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que utilicen la IL-10 para modular las respuestas inmunitarias antitumorales. Si se traduce con éxito a un entorno humano, estos hallazgos podrían proporcionar un marco útil para la generación de hipótesis con respecto a la interacción vascular-inmunitaria y tener implicaciones importantes para el diseño de inmunoterapias combinadas, particularmente en cánceres y enfermedades en las que la inmunidad mediada por las células T CD8 y las células NK es fundamental para el éxito terapéutico.

Limitaciones del estudio

Este estudio está estrictamente limitado a la inmunidad murina, utilizando dos modelos murinos de CRC para explorar el vínculo entre las células T CD8 y las células NK, estos hallazgos pueden no traducirse a la inmunidad humana. Además, este estudio utilizó anticuerpos monoclonales de rata dirigidos contra PD-1 y VEGFR-2, que son diferentes de los anticuerpos utilizados contra el cáncer humano, por lo que las conclusiones obtenidas pueden no ser aplicables en un entorno humano. Se requieren estudios adicionales que involucren muestras derivadas de humanos para garantizar que la cascada de eventos que descubrimos en este estudio pueda aplicarse potencialmente a los humanos. Finalmente, este estudio no fue diseñado para evaluar la eficacia terapéutica, sino más bien para explorar la cascada inmunitaria detrás de la asociación de las terapias anti-VEGFR-2 y anti-PD1 en modelos murinos de CRC.

Limitaciones del estudio

Este estudio está estrictamente limitado a la inmunidad murina, utilizando dos modelos murinos de CRC para explorar el vínculo entre las células T CD8 y las células NK, estos hallazgos pueden no traducirse a la inmunidad humana. Además, este estudio utilizó anticuerpos monoclonales de rata dirigidos contra PD-1 y VEGFR-2, que son diferentes de los anticuerpos utilizados contra el cáncer humano, por lo que las conclusiones obtenidas pueden no ser aplicables en un entorno humano. Se requieren estudios adicionales que involucren muestras derivadas de humanos para garantizar que la cascada de eventos que descubrimos en este estudio pueda aplicarse potencialmente a los humanos. Finalmente, este estudio no fue diseñado para evaluar la eficacia terapéutica, sino más bien para explorar la cascada inmunitaria detrás de la asociación de las terapias anti-VEGFR-2 y anti-PD1 en modelos murinos de CRC.

Materiales y métodos

Diseño del estudio

El objetivo de este estudio fue dilucidar la respuesta inmunitaria que se produce después de un tratamiento combinado que incluye un anticuerpo anti-VEGFR2 y un anticuerpo anti-PD1. Para lograr esto, las líneas celulares de CRC CT26 o MC38 se inyectaron subcutáneamente en ratones Balb/c o C576BL/6J, respectivamente, y recibieron un total de cuatro dosis de anticuerpos anti-VEGFR-2 y/o anti-PD1. En diferentes puntos temporales durante el tratamiento (1, 3 o 9 días después del primer tratamiento con VEGFR2), se recolectaron los tumores y las células inmunitarias infiltrantes tumorales se analizaron mediante citometría de flujo, ELISA, RT-PCR cuantitativa de transcripción inversa (RTqPCR), Luminex, NanoString. A continuación, se realizó la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) para estudiar posibles interacciones entre las células T CD8 y las células NK. Los experimentos in vitro e in vivo nos permitieron confirmar los datos del análisis CellChat. No se excluyeron datos. Los ratones se asignaron a los grupos al azar el día del primer tratamiento, luego se les tatuó en los dedos de los pies para su identificación y se creó una hoja de cálculo de Excel para vincular a cada ratón con sus tratamientos y cronograma específicos.

Cultivo de líneas celulares tumorales

Las líneas celulares CT26 (CRL-2638, ATCC) y MC38 (ENH204-FP, Kerafast) se cultivaron a 37 °C bajo 5 % de CO2 en RPMI 1640 o en medio de Eagle modificado de Dulbecco, respectivamente, suplementados con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Dutscher) y penicilina-estreptomicina (10 000 UI/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina, PAN Biotech). Las células se dividieron tres veces por semana antes de que la confluencia superara el 80 %. La contaminación por micobacterias se comprobó de forma rutinaria utilizando el kit MycoAlert (LT07, Lonza). Para el trasplante ortotópico, se utilizó la línea celular CT26-Luc (pAIPCMVpLuciferase_Puro), amablemente proporcionada por el Dr. Olivier Micheau y Abdelmnim Radoua.

Ratones

Todos los protocolos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Laboratorio Animal (FELASA) y todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Borgoña. Todos los experimentos con ratones se realizaron en la Universidad de Borgoña en condiciones específicas libres de patógenos, con una alternancia de 12 horas de día/noche en una sala a 22 °C y 55 % de humedad. Se adquirieron ratones hembra C57BL/6J (referencia 632C57BL/6J), Balb/c (referencia 627BALBC/CBYJ) y Nude (referencia 639NU/NUMRI) de Charles River Laboratories. Los ratones IL10−/− se adquirieron de Taconic (referencia 15660) y los ratones NCR1cre Csf2flox fueron un regalo del profesor Wick. Todos los ratones se utilizaron en experimentos entre las 8 y las 12 semanas de edad. Los números de protocolo son #35480, #46231 y #55889.

Inyección heterotópica subcutánea de células tumorales y monitorización del crecimiento

Para inducir la formación de tumores s.c., se inyectaron 3,105 células cancerosas CT26 o 1,106 células cancerosas MC38 en ratones Balb/c o C57BL/6J, respectivamente. 7 días después de la inyección de células tumorales, se midieron los tumores de los ratones con un calibrador y se dividieron en grupos con un tamaño tumoral medio similar. Para los experimentos de crecimiento tumoral, el tamaño del tumor se determinó tres veces por semana. La superficie del tumor se expresa en mm² y se calculó multiplicando el ancho por la longitud de cada tumor. Todos los ratones fueron sacrificados antes de alcanzar los límites establecidos, de acuerdo con las directrices de la FELASA.

Inyección cecal ortotópica de células tumorales y monitorización del crecimiento

Para minimizar el riesgo de infecciones postoperatorias, se administró profilaxis antibiótica con 22 000 UI/kg de Duplocillin (MSD, Animal Health) por vía s.c. diariamente dentro de las 72 horas previas a la inyección cecal ortotópica. Se afeitó a los ratones en el sitio de la incisión el día anterior al procedimiento.

10 minutos antes de la anestesia, para evitar el dolor, se administró una inyección s.c. de buprenorfina (0,1 mg/kg). Además, para prevenir la deshidratación, se inyectaron 300 µL de solución salina al 0,9 % (B. Braun) por vía s.c. Para prevenir daños corneales, se aplicó un gel ocular (Ocry-gel, TVM). Para mejorar la anestesia local, se aplicó lidocaína (Emla, Apsen) en el abdomen. La inducción de la anestesia se realizó con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (75 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg).

La asepsia se logró mediante la aplicación doble de Vetadine en el sitio quirúrgico, seguida de la aplicación de una película adhesiva (Medline).

Primero, se realizó una incisión en la piel y el peritoneo de la línea media para acceder a la cavidad abdominal. Se realizó una exploración rápida y se exteriorizó el ciego. Posteriormente, se realizó una inyección subserosa de 30 µL de una solución que contenía 1,5 × 10⁵ células CT26 Luciferasa diluidas en Matrigel (Fisher Scientist) utilizando una jeringa de insulina estéril (B. Braun). Este paso se realizó bajo un microscopio estereoscópico trinocular (OZM 933, Kern). Finalmente, el peritoneo y la capa de piel se suturaron con puntos continuos e interrumpidos, respectivamente, utilizando Monocryl 6/0 (Laboderm, 46378). Para reforzar el cierre de la piel, se aplicó un pegamento biológico (adhesivo tópico para la piel, derma+flex) en la incisión inmediatamente después de la cirugía. Entre los procedimientos, los instrumentos se esterilizaron utilizando un esterilizador de perlas (Germinator 500).

Después de la cirugía, los ratones se colocaron en una incubadora (Cimuka) a 37 °C y se monitorizaron hasta que estuvieran completamente despiertos. Durante el monitoreo, se evaluó la hidratación y se reinjectaron 100 µL de solución salina (B. Braun) por vía s.c. si era necesario. También se comprobó la temperatura y la cianosis.

El seguimiento postoperatorio incluyó el monitoreo diario del progreso de la cicatrización de la herida, la recuperación del peso, el comportamiento de aseo y la evaluación del dolor. Para promover la rehidratación y la ingesta de nutrientes, se administró a los ratones un gel que contenía agua y nutrientes (Safe Geldiet). La analgesia continuó durante 3 días con dos inyecciones s.c. al día de buprenorfina (0,1 mg/kg).

7 días después de la cirugía, se realizó una medición inicial de la bioluminiscencia (IVIS Luminalll, Perkin Elmer) 15 minutos después de la inyección i.p. de luciferina (150 mg/kg). Una vez que los tumores estuvieron establecidos (valor de bioluminiscencia de al menos 2 × 10⁶ p/seg/cm²/sr), los ratones se dividieron en grupos con una bioluminiscencia media similar al inicio del tratamiento. La bioluminiscencia se midió cada tres o cuatro días hasta que se cumplieron los criterios éticos definidos. Las imágenes de bioluminiscencia se analizaron utilizando el software Living Image (Perkin Elmer), y los resultados se representaron como un cambio en la bioluminiscencia.

Tratamiento de los ratones

Los ratones fueron tratados con un anticuerpo anti-PD-1 (200 µg/ratón, clon RMP1-14, BE0146 BioXCell) en los días 2, 4, 6 y 8 o con su control isotípico (Rat IgG2a clon 2A3, BE0089 BioXCell), con un anticuerpo anti-VEGFR-2 (200 µg/ratón, clon DC101, BP0060 BioXCell) en los días 0, 2, 4 y 6 o con su control isotípico (rat IgG1 clon HRPN, BP0088 BioXCell), con un anticuerpo anti-CXCR3 (200 µg/ratón, clon CXCR3-173, BE0249 BioXCell) en los días 0, 2, 4, 6 y 8 o con su control isotípico (IgG de hámster armenio policlonal, BE0091 BioXCell) con un anticuerpo anti-GM-CSF (200 µg/ratón, clon MP1-22E9, BE0259 BioXCell) en los días 0, 2, 4, 6 y 8 o con su control isotípico (Rat IgG2a clon 2A3, BE0089 BioXCell), con un anticuerpo anti-CD8β (100 µg/ratón, clon 53-5.8, BE0223 BioXCell) en los días 0 y 7 o con su control isotípico (rat IgG1 clon HRPN, BP0088 BioXCell), con un anticuerpo anti-IL10 en los días 0, 2, 4, 6 y 8 (100 µg/ratón, clon JES5-2A5, BE0049 BioXCell) o con su control isotípico (rat IgG1 clon HRPN, BP0088 BioXCell), con un anticuerpo anti-IL10R en los días 7 y 14 (20 µg/ratón, clon 1B1.3A, BP0050 BioXCell) o con su control isotípico (rat IgG1 clon HRPN, BP0088 BioXCell), con un anticuerpo anti-Asialo-GM1 (10 µl/ratón, Fujifilm Wako) en los días 0, 2, 4, 6 y 8 o con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X, y con un anticuerpo anti-CD25 (200 µg/ratón, mcd25c2-mab10-1, InvivoGen) en el día 0. Los ratones también fueron tratados con el anticuerpo anti-VEGF-A en los días 0, 2, 4 y 6, que fue amablemente proporcionado por Genentech (100 µg/ratón). Todos los tratamientos se diluyeron en PBS 1X y se inyectaron por vía i.p.

Para el re-desafío de los ratones, los ratones curados recibieron 3,105 células cancerosas CT26 en el lado opuesto por vía s.c. 51 días después de la primera inyección de células tumorales.

Disociación tumoral

Los tumores se recolectaron, se cortaron en trozos pequeños con unas tijeras y se colocaron en un tubo gentleMACS C (130-093-237, Miltenyi Biotec) con 2,35 mL de RPMI 1640, 100 µL de enzima D, 50 µL de enzima R y 12,5 µL de enzima A del kit de disociación tumoral (130-096-730, Miltenyi Biotec). Para el análisis de CXCR3, la cantidad de enzima R se redujo a 10 µL.

Los tubos se añadieron al disociador Octo gentleMACS (130-096-427, Miltenyi Biotec) siguiendo el programa 37mTDK1. Los sobrenadantes tumorales utilizados para el análisis posterior de citocinas se recolectaron en este paso. Las células tumorales se filtraron en un filtro de 70 µm (130-110-916, Miltenyi Biotec) seguido de tres lavados con PBS 1X. Luego, las células estuvieron listas para su uso en análisis posteriores.

Aislamiento de células inmunitarias

Cuando se analizaron varias poblaciones de células inmunitarias (células T CD8, células NK, macrófagos y células dendríticas), se utilizó la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un BD FACSAria III (BD Biosciences) después de la disociación tumoral. Las células T CD8 se definieron como células CD45+ CD3+ CD8a+, las células NK como células CD45+ CD3− NKp46+ y CD49b+, los macrófagos como células CD45+ CD11b+ F4/80+ y las células dendríticas como células CD45+ CD11c+. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: tinte de viabilidad (FVS780, BD Biosciences, 565388), anti-CD45 (VioGreen, REA737, Miltenyi Biotec, 130-110-803), anti-CD3 (FITC, 17A2, Miltenyi Biotec, 130-118-958), anti-CD49b (BB700, HMα2, BD Biosciences, 742140), anti-NKp46 (APC, REA815, Miltenyi Biotec, 130-112-202), CD8a (V450, 53-6.7, BD Biosciences, 560469), anti-CD11b (PE-Vio770, REA592, Miltenyi Biotec, 130-116-246), anti-F4/80 (BV605, T45-2342, BD Biosciences, 123133), anti-CD11c (PE, N418, BioLegend, 117308).

En caso de aislamiento de una sola población de células inmunitarias, se realizó la clasificación magnética (Separador QuadroMACS, 130-091-051, Miltenyi Biotec). Para la purificación de células NK o CD8 T intratumorales, se utilizó el kit de aislamiento de células NK de ratón seguido del kit de microesferas TIL de CD45 de ratón (130-115-818 y 130-110-618, Miltenyi Biotec) o el kit de microesferas CD8 (TIL) de ratón (130-116-478, Miltenyi Biotec), respectivamente. Para el aislamiento de células inmunitarias esplénicas, se recolectaron el bazo y los ganglios linfáticos de ratones no inmunizados y luego se disociaron antes de filtrarlos en un filtro de 70 µm (130-110-916, Miltenyi Biotec). A continuación, se añadió tampón de lisis de glóbulos rojos (EDTA 0,1 mM, NH4Cl 0,83 % y KHCO3 0,1 %) durante 1 minuto. Después de la centrifugación, las células NK o CD8 T se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células NK de ratón (130-115-818, Miltenyi Biotec) o el kit de microesferas CD8a (Ly-2) de ratón (130-117-044, Miltenyi Biotec), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. En cuanto al aislamiento de macrófagos peritoneales, las células peritoneales se recolectaron mediante lavado peritoneal con PBS 1X frío que contenía 3 % de FBS. Luego, las células se lavaron y los macrófagos se clasificaron utilizando el kit de purificación UltraPure de microesferas F4/80 (130-110-443, Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cultivo ex vivo de células inmunitarias

Después de la clasificación por FACS, las células se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10 % de FBS (Dutscher) y penicilina-estreptomicina (10 000 UI/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina, 25 µg/mL de anfotericina B, PAN Biotech, P06-07300) durante 24 horas. Los sobrenadantes se recolectaron y se congelaron, mientras que las células se resuspendieron en el reactivo TRIzol y se congelaron para su posterior análisis.

Después de la clasificación magnética, las células T CD8 intratumorales se mantuvieron durante 24 horas en RPMI 1640 que contenía 10 % de FBS, 1 % de penicilina-estreptomicina, 1 % de solución de aminoácidos no esenciales MEM (Gibco, 11140-035), 1 % de piruvato de sodio (Gibco, 11360-070) y 1 % de L-glutamina (Gibco, 25030-081) (en adelante, RPMI completo). Los sobrenadantes se recolectaron y se congelaron para su posterior análisis.

Las células NK esplénicas se incubaron durante 24 horas con concentraciones crecientes de IL-10 de ratón (Miltenyi Biotec, 130-094-068) en RPMI completo suplementado con 80 UI/mL de IL-2 de ratón (Miltenyi Biotec, 130-120-662). Luego, las células se recolectaron y se analizaron mediante citometría de flujo.

Las células T CD8 esplénicas se incubaron en condiciones activadoras (placa recubierta con 2 µg/mL de anticuerpo anti-CD3 (InVivoMab, BE0002) y anti-CD28 (InVivoMab, BE0015-1)) o en reposo con concentraciones crecientes de VEGF-A de ratón (Miltenyi Biotec, 130-094-086). A las 24, 48 y 72 horas, se recolectaron los sobrenadantes y se congelaron para su posterior análisis.

Los macrófagos peritoneales se incubaron con concentraciones crecientes de GM-CSF de ratón (Miltenyi Biotec, 130-094-043) en RPMI completo. A las 24 y 48 horas, se recolectaron los sobrenadantes y se congelaron para su posterior análisis.

Ensayo de transwell

50.103 células NK aisladas del bazo de ratones o células NK intratumorales se añadieron en la cámara superior de la placa HTS Transwell de 96 pocillos de 5 µm (3387, Corning) en RPMI 1640 que contenía 10% de FBS suplementado con 80 UI/mL de IL-2 murina (130–120-662, Miltenyi Biotec) y, en algunos casos, rapamicina (553210, R&D systems) a 20 nM, según se describió previamente (10.3389/fimmu.2021.619195). En la cámara inferior, se añadió RPMI 1640 que contenía 10% de FBS suplementado con IL-2 murina y concentraciones crecientes de IL-10 murina (Miltenyi Biotec, 130–094-068). Después de 4 horas de incubación a 37°C, las células de la cámara inferior se recogieron, se tiñeron para detectar marcadores de superficie de células NK murinas y viabilidad, y luego se analizaron en un citómetro de flujo utilizando cuentas de recuento (424902, BioLegend). El índice de migración se calculó mediante la relación entre el número de células migradas de cada condición en comparación con la condición de control (sin IL-10).### Análisis por citometría de flujo

Para estudiar la producción de citocinas por las células inmunitarias, las células tumorales se incubaron durante 4 horas en una placa de fondo en U de 96 pocillos en un cóctel de estimulación celular más inhibidores del transporte de proteínas (eBioscience, 00–4975-93, Thermo Fisher Scientific) diluido en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS (Dutscher) y penicilina-estreptomicina (10.000 UI/mL de penicilina, 10 mg/mL de estreptomicina, PAN Biotech).

La tinción de viabilidad se realizó en PBS 1X durante 10 min en la oscuridad a 4°C. Para evitar la unión específica de anticuerpos, las células se incubaron con el reactivo de bloqueo de FcR (130–092-575, Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se realizó la tinción de los marcadores de superficie celular durante 15 min en la oscuridad a 4°C en el tampón de tinción Brilliant Stain (566349, BD Biosciences) utilizando anticuerpos diluidos a 1/50. La tinción intracelular se realizó después de la fijación y permeabilización de las células utilizando el kit de tinción de Foxp3 (130–093-142, Miltenyi Biotec) durante 30 min. Finalmente, la tinción de los marcadores intracelulares se realizó durante 45 min en la oscuridad a 4°C utilizando anticuerpos diluidos a 1/25. Para la tinción de Foxp3, tanto el paso de fijación y permeabilización como el paso de tinción se realizaron durante 1 hora. Las células teñidas se analizaron utilizando un BD LSR Fortessa (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo. Para identificar las células NK y las células T CD8 (figura suplementaria en línea S10-11), las células se tiñeron con un colorante de viabilidad FVS510 (BD Biosciences, 564406), anti-CD45 (VioBlue, REA737, Miltenyi Biotec, 130–110-664), anti-CD8a (BUV395, 53–6.7, BD Biosciences, 563786), anti-CD3e (FITC, 145–2 C11, BioLegend, 100306), anti-Nkp46 (APC-Vio770, REA815, Miltenyi Biotec, 130–112-361), anti-CD49b (BB700, HMα2, BD Biosciences, 742140), anti-Granzima B (PE, REA226, Miltenyi Biotec, 130–116-486), anti-CD69 (PE-Cy7, H1.2F3, BioLegend, 104512), anti-IFNγ (PE-Cy7, xmg1.2, BioLegend, 505825), anti-PD1 (BV605, J43, BD Biosciences, 563059), anti-Tim3 (Pe-Cy7, RMT3-23, BioLegend, 119716), anti-SlamF6 (FITC, 13G3, Miltenyi Biotec, 130–109-859) y anti-Ki-67 (BV605, 16A8, BioLegend, 652413). Para identificar los macrófagos (figura suplementaria en línea S12), las células se tiñeron con un colorante de viabilidad (FVS575, BD Biosciences, 565694), anti-F4/80 (FITC, BM8, BioLegend, 123108), anti-CD11b (VioGreen, REA592, Miltenyi Biotec, 130–113-811), IA/ie (APC-Vio770, REA983, Miltenyi Biotec, 130–112-233). Para identificar las células CD4 y las células Treg (figura suplementaria en línea S13), las células se tiñeron con un colorante de viabilidad FVS510 (BD Biosciences, 564406), anti-CD4 (BUV805, BD Biosciences, 612900), anti-CD25 (BV421, BD Biosciences, 564370), anti-Foxp3 (PE, Invitrogen, 12–5173-82), anti-CXCR3 (BV510, BioLegend, 126528). Para identificar los basófilos, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad, anti-CD45 (BUV805, 30-F11, BD, 568336), anti-CD49b (BB700, HMα2, BD, 742140), anti-CD200R3 (VioBlue, REA128, Miltenyi, 130–103-387) y anti-CD11b (VioGreen, REA592, Miltenyi, 130–113-811) y resultaron negativas para CD3 (APC-Vio770, REA641, Miltenyi, 130–119-793). Para identificar los eosinófilos, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad, anti-CD45 (BUV805), anti-CD11b (VioGreen), anti-CD11c (PeCy7, HL3, BD, 558079), anti-siglecF (BB515, E50-2440, BD, 564514) y resultaron negativas para CD3 (APC-Vio770). Para identificar los neutrófilos, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad, anti-CD45, anti-CD11b, anti-Ly6G (BV421, 1A8, BioLegend, 127641). Para identificar los monocitos, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad, anti-CD45, anti-Cd11b, anti-Ly6C (PE, 1G7.G10, Miltenyi, 130–117-522) y resultaron negativas para F4/80 (BV605, T45-2342, BD, 569237) y CD3 (APC-Vio770). Las subpoblaciones de DCs se definieron como cDC1: CD45+ (BUV805) CD3− (APC-Vio770), CD49b− (BB700), CD11c+ (PeCy7), XCR1+ (PE-Dazzle594, ZET, BioLegend, 148234), mientras que cDC2 se definieron como CD45+ (BUV805), CD3− (APC-Vio770), CD49b− (BB700), CD11c+ (PeCy7), CD11b+ (VioGreen).

Se utilizaron anticuerpos adicionales: anti-SPP1 (AF405, NBP3-20774AF405, Bio-Techne), anti-Tnfsf9 (APC, Miltenyi Biotec, 130–116-087), anti-VEGFR-2 (PE, BioLegend, 121906) y anti-CD210 (PE, BioLegend, 112705). La tinción con el tetrámero H-2Ld MuLV gp70 (MBL International, TB-M521-2) se realizó según las instrucciones del fabricante.

En el caso de la tinción de las células NK de la sangre de ratones, primero se recogió sangre de la vena mandibular del ratón en tubos que contenían EDTA (Microtube SARSTED, 41.1395.105). Los glóbulos rojos se lisaron utilizando un tampón de lisis de glóbulos rojos casero (EDTA 0,1 mM, NH4Cl 0,83% y KHCO3 0,1%) antes del procedimiento de tinción descrito anteriormente.

El número de células inmunitarias intratumorales se normalizó utilizando la siguiente fórmula:### Transferencia de células T CD8 a tumores CT26

Recogimos células T CD8 procedentes de tumores CT26 de ratones Balb/c WT o IL-10−/− inducidos como se describió anteriormente, 1 día después de un tratamiento con un anti-VEGFR2 (200 µg/ratón). Tras la disociación utilizando el kit de disociación tumoral (130–096-730, Miltenyi Biotec), se clasificaron magnéticamente las células T CD8 de los tumores utilizando el kit de microesferas CD8 (TIL) (130–116-478, Miltenyi Biotec). A continuación, inyectamos estas células T CD8, WT o IL-10−/−, en tumores CT26 de ratones IL-10−/− y analizamos las poblaciones de NK 24 horas después. Se transfirieron 80.000 células T CD8 al tumor de cada ratón.

También transferimos células T CD8 VEGFR2+ o VEGFR2− a tumores CT26 en ratones Nude. Aislamos células T CD8 de tumores CT26 de ratones WT 1 día después del primer tratamiento con anti-VEGFR2 mediante citometría de flujo (Aria II, BD) y clasificamos células T CD8 definidas como: CD45+, CD3+, CD4−, CD8+ viables y VEGFR2+ y VEGFR2−. Estas células T CD8 se transfirieron a tumores CT26 en ratones Nude, transfiriendo 50.000 células CD8 por tumor. A continuación, los ratones recibieron la biterapia como se describió anteriormente y se evaluó el crecimiento tumoral tres veces por semana utilizando un calibrador. Todos los ratones fueron sacrificados antes de alcanzar los límites establecidos, de acuerdo con las directrices de la FELASA.### Análisis de citocinas

El análisis de citocinas se realizó en sobrenadantes de tumores CT26 en los días 1–5 y 9 después del tratamiento. Los sobrenadantes tumorales se centrifugaron a 12.000 g durante 5 min y luego se almacenaron a −20 °C hasta su uso. Se utilizaron el panel personalizado de ratón LEGENDplex, que incluye TNF-α, y el ensayo de personalización Luminex, que incluye GM-CSF e IFNγ, siguiendo las instrucciones del fabricante.

También se realizaron ensayos ELISA para medir la concentración de IL-10 murina (DY417, R&D systems), GM-CSF murina (DY415, R&D systems), CXCL9 murina (DY492, R&D systems), CXCL10 murina (DY466, R&D systems), CXCL11 murina (DY572, R&D systems) y CCL5 murina (DY478, R&D systems), según las instrucciones del fabricante.### PCR cuantitativa en tiempo real

Después de la preparación de las células tumorales, se resuspenden 1.106 células en el reactivo TRIzol (15 596 026 Invitrogen) y se realiza la extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN extraído se determinó utilizando el Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Se transcribieron 300 ng de ARN a ADN complementario (ADNc) utilizando el kit de reactivo de transcripción inversa PrimeScript (Takara, RR037A). A continuación, se diluyeron las muestras a 1/10 y se cuantificó el ADNc utilizando el PowerUp SYBR Green Master Mix (A25742, Applied Biosystems). Los resultados se obtuvieron utilizando el sistema ViiA 7 Real-Time PCR y el software QuantStudio Real-Time. Se determinaron las expresiones relativas en relación con la β-actina utilizando el método 2−ΔΔCt. La secuencia de los cebadores fue: Cxcl9, sentido 5’-TAGGCAGGTTTGATCTCCGT-3’ y reverso 5’-CGATCCACTACAAATCCCTCA-3’; Cxcl10, sentido 5’-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3’ y reverso 5’-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3’; Cxcl11, sentido 5’-CCGAGTAACGGCTGCGACAAAG-3’ y reverso 5’-CCTGCATTATGAGGCGAGCTTG-3’; Csf2, sentido 5’-TTTTCCTGGGCATTGTGGTCTA-3’ y reverso 5‘-TCTCTCGTTTGTCTTCCGCT-3’.### Análisis NanoString

Para el análisis nCounter (NanoString Technologies), se utilizaron 100 ng de ARN con el panel de perfilado inmunitario pancanceroso específico para ratón. El protocolo se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Las muestras se prepararon y se mezclaron con el panel Master Mix nCounter (que contiene el conjunto de códigos de reportero y el conjunto de sondas de captura), y luego cada muestra se cargó en un cartucho nCounter para la recopilación de datos. Los datos se analizaron y se recopilaron utilizando un analizador NanoString. Los datos de recuento de ARN nCounter se normalizaron utilizando la media geométrica de los controles positivos y los genes de referencia. La normalización se realizó utilizando cálculos de puntuación z.### Secuenciación de ARN de una sola célula

Preparación de células

Se recogieron tumores CT26 de ratones tratados o no con un anticuerpo anti-VEGFR-2 (200 µg/ratón, clon DC101, BP0060 BioXCell) y se obtuvo una suspensión de células individuales siguiendo el protocolo de 10x Genomics (CG000147). A continuación, se realizó la eliminación de restos (130–109-398, Miltenyi Biotec), la eliminación de células muertas (130–090-101, Miltenyi Biotec), la clasificación magnética de microesferas anti-F4/80 ultrapuras (130–110-443, Miltenyi Biotec) seguida de la clasificación magnética de microesferas CD45 (130–110-618, Miltenyi Biotec).### Secuenciación de ARN de una sola célula

Se capturaron 15.000 células utilizando un kit de Gel Bead de una sola célula 3′ V.3.1 y un kit de GEM de una sola célula 3′ V.3.1 en cada pocillo de un Chip G (10X Genomics). La preparación de la biblioteca, desde la transcripción inversa hasta la amplificación final, se realizó con un kit de biblioteca de una sola célula 3′ V.3.1 (10X Genomics) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada biblioteca se secuenció en pares (28/90 bp) en un dispositivo NextSeq 2000 (Illumina) con una profundidad de 1.000 millones de lecturas, lo que resultó en una profundidad de lectura de 20.000 lecturas por célula.### Análisis de datos brutos

Cell Ranger mkfastq (V.7.1.0) (10x Genomics) se utilizó para generar archivos FASTQ desmultiplexados a partir de las lecturas de secuenciación en bruto. Las lecturas resultantes se alinearon al genoma de referencia del ratón mm10 y se cuantificaron los recuentos de genes utilizando Cell Ranger count (V.7.1.0) (10x Genomics).### Análisis de ARN de una sola célula

Se cargaron en R (V.4.3.3) las matrices de conteo correspondientes a D1Ig y D1αR2 y se filtraron utilizando los siguientes parámetros: se excluyeron las células con 9.000 genes y que presentaban más del 10% de transcritos mitocondriales. Las matrices de expresión génica filtradas se fusionaron en un único objeto, se normalizaron y se escalaron utilizando Seurat^[46] (V.5.0.3). Los 2.000 genes más variables se calcularon antes de la integración utilizando el método cca. Se calculó la reducción de dimensionalidad mediante aproximación uniforme de la variedad y proyección (UMAP) utilizando los 35 componentes principales. Los clústeres de Seurat se identificaron utilizando una resolución de 1.2. Los clústeres se anotaron utilizando marcadores canónicos de la literatura y los genes más expresados diferencialmente (DEGs). Los gráficos UMAP de los clústeres y Ptprc, y los gráficos de violín, se generaron utilizando, respectivamente, Seurat DimPlot, FeaturePlot y VlnPlot. Los gráficos de puntos se generaron utilizando DotPlotHeatmap de RightOmicsTools^[47] (V.2.2.0). Los gráficos de densidad conjunta se generaron utilizando PlotDensityJointOnly de scCustomize^[48] (V.2.0.1). El gráfico de volcán se generó utilizando un código personalizado de ggplot2 (V.3.5.1). El análisis de la comunicación célula-célula se realizó utilizando CellChat^[49] (V.2.1.2) en un subconjunto que contenía cuatro clústeres de células NK y dos clústeres de células T. Los gráficos de burbujas se generaron utilizando netVisualbubble y las redes se generaron utilizando ccnetwork de CCPlotR^[50] (V.0.99.3). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó utilizando fgsea^[51] (V.1.28.0) sobre los valores de cambio de pliegue log2 estadísticamente significativos (p