El análisis mutacional revela que el complejo de destrucción de la vía WNT se autorregula mediante un mecanismo asistido por sustrato.

La vía WNT–β-catenina es un sistema de comunicación entre células que coordina el desarrollo y la homeostasis de los tejidos^[1]. La señalización descontrolada de la vía WNT–β-catenina es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad por cáncer en humanos, y, sin embargo, no disponemos de ningún agente aprobado que se dirija a esta vía en ningún tipo de cáncer^[2]. Las mutaciones truncantes en el gen supresor tumoral adenomatosis poliposis coli (APC) conducen a una señalización oncogénica independiente de los ligandos que impulsa más del 80% de los casos de cáncer colorrectal (CCR) en humanos, que es la segunda causa principal de muerte por cáncer^[3],^[4]. APC es un componente del complejo BDC, un complejo multiproteico que limita la señalización al promover la degradación de la β-catenina^[5]–^[7]. El BDC está compuesto por dos proteínas de andamiaje (APC y AXIN1), dos quinasas (CK1α y GSK3β) y la β-catenina. En ausencia de WNT, el BDC inhibe la señalización al promover la fosforilación secuencial de la β-catenina por CK1α y GSK3β, lo que marca la ubiquitina y la degradación^[8] (Fig. 1a). Los WNT desencadenan la inactivación del BDC por el complejo receptor, lo que conduce a la acumulación de β-catenina y al ensamblaje de un complejo transactivador con BCL9 y los factores de transcripción TCF/LEF en los promotores de los genes diana^[9].

Tres décadas de estudios estructurales y bioquímicos han cartografiado varias interacciones proteína-proteína (PPI) superpuestas y aparentemente redundantes entre los componentes del BDC^[5],^[6],^[10] (Fig. 1b). La β-catenina contiene un dominio central de armadillo (ARM) estructurado compuesto por 12 repeticiones y segmentos N- y C-terminales flexibles. La β-catenina se une a AXIN1, APC y la familia de factores de transcripción TCF/LEF en una hendidura que se extiende a lo largo de la superhélice ARM. AXIN1 se une en las repeticiones ARM 3-4, mientras que APC y las proteínas TCF/LEF se unen a una extensión más larga de esta hendidura. APC puede unirse a la β-catenina a través de cuatro motivos peptídicos de 15 aminoácidos (aa; 15R A-D) y seis motivos de 20 aa (20R 1-7, excluyendo 20R2). La fosforilación de las repeticiones 20R por CK1α y GSK3β aumenta su afinidad por la β-catenina en aproximadamente 1000 veces^[11],^[12]. APC contiene tres motivos SAMP que le permiten interactuar independientemente con un dominio RGS N-terminal en AXIN1^[13]. AXIN1 recluta las quinasas CK1α y GSK3β en el complejo BDC, acercándolas a sus sustratos, la β-catenina y APC^[14]–^[16]. Otras proteínas también ocupan la misma hendidura de la β-catenina: los factores de transcripción de la familia TCF/LEF, las cadherinas y ICAT (inhibidor de la β-catenina y TCF4)^[6].

La compleja bioquímica del BDC ha presentado obstáculos tanto para la comprensión mecanicista como para la focalización terapéutica. Aquí presentamos los resultados de los estudios de edición de bases de adenina (ABE) y citosina (CBE) para evaluar el fenotipo de señalización WNT de las mutaciones introducidas en los loci génicos endógenos que codifican los componentes del BDC^[17]–^[21]. Estos estudios permitieron la anotación funcional in situ de las interfaces PPI del BDC identificadas por estudios estructurales y bioquímicos previos. También identificamos clases de mutaciones que son muy informativas en los estudios de relación estructura-función: mutaciones activadoras, mutaciones de separación de función y mutaciones que modulan selectivamente la actividad del BDC oncogénico.

Resultados

Estudios de edición de bases en mosaico dirigidos a los genes del complejo de destrucción

Utilizamos ABE y CBE promiscuos y flexibles en cuanto a PAM (NG-PAM Cas9n) (NG-ABE8e y NG-BE3) para generar mutaciones de transición en todos los exones de APC, AXIN1, CTNNB1 (que codifica la β-catenina) y GSK3B (que codifica GSK3β) en un formato agrupado^[19]–^[22]. Nuestras bibliotecas de ABE y CBE contienen ARN guía únicos (sgRNA) que se predicen para generar mutaciones con cambio de sentido, mutaciones en el sitio de empalme, mutaciones sin sentido y mutaciones silenciosas que cubren el 80-90% de los residuos de aa codificados por cada gen (Fig. 1a y Fig. 1b en los datos suplementarios y Tabla S1). La mutagénesis se llevó a cabo en células haploides humanas (eHAP1) que expresan de forma estable nuestro reportero transcripcional fluorescente de la intensidad de la señalización WNT–β-catenina^[23] (7TS; Fig. 1c). Las bibliotecas de células mutantes ABE y CBE agrupadas se expusieron al ligando Wnt-3a y las células con intensidades de fluorescencia 7TS en el 10% superior o el 15% inferior de la población se aislaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Fig. 1d). Se calcularon dos puntuaciones z para cada sgRNA (para el enriquecimiento en el 10% superior y las puertas del 15% inferior) basándose en una distribución de aproximadamente 280 sgRNA de control no dirigidos (NTC) (Tabla S1 en los datos suplementarios). El diseño del estudio, la reproducibilidad, las distribuciones de las puntuaciones z y las tasas de falsos positivos/negativos se describen en la Fig. 1c-g en los datos suplementarios, la Nota suplementaria y la Fig. S1.

Nuestros estudios identificaron muchos sitios funcionales conocidos en el BDC, incluido el fosfodegrón en la β-catenina y los sitios de unión a la tanquirasa, la β-catenina y Dishevelled (DVL) en AXIN1 (Fig. 2 y Fig. 3 en los datos suplementarios). De manera tranquilizadora, los sgRNA más estadísticamente significativos en nuestro estudio codifican mutaciones que impulsan la señalización WNT–β-catenina oncogénica en el cáncer humano^[4],^[24]. Más del 80% de los casos de CCR esporádicos y familiares están impulsados por mutaciones truncantes que se mapean en un segmento de aproximadamente 250 aa en la región intrínsecamente desordenada (IDR) central de APC conocida como la región de agrupación de mutaciones (MCR)^[25]–^[31] (Fig. 1e). Los alelos APCmcr mutados en el cáncer humano producen una proteína truncada que carece de los tres motivos SAMP que median la interacción directa de APC con AXIN1 (Fig. 1e), formando un BDC oncogénico comprometido que no puede suprimir completamente la abundancia de β-catenina^[10],^[32],^[33]. Reflejando los alelos impulsores APCmcr oncogénicos, varios sgRNA que se predicen para introducir mutaciones sin sentido en APC antes del primer motivo SAMP se enriquecieron en la puerta del 10% superior (Fig. 1e). Notablemente, las mutaciones sin sentido en APC después del primer motivo SAMP no se enriquecieron, lo que destaca la baja tasa de falsos positivos de los estudios y su capacidad para recapitular la genética del CCR humano (Fig. 1g en los datos suplementarios).

Las mutaciones oncogénicas más comunes de la β-catenina en los cánceres humanos interrumpen un motivo de degrón N-terminal (32DSGIHSGATTAPS45) que es fosforilado secuencialmente por dos quinasas unidas a AXIN1, CK1α y GSK3β^[8],^[33],^[34] (Fig. 1f). La fosforilación de Ser33 y Ser37 por GSK3β genera un sitio de unión de alta afinidad (32DpSGφXpS37) para la E3 ligasa SCFβ-TrCP, que ubiquitina la β-catenina y la marca para la degradación proteasómica^[35]. La mayoría (~60%) de los 31 sgRNA superpuestos que se predicen para dirigirse a los residuos de este fosfodegrón se enriquecieron en la población ordenada del 10% superior con una puntuación z > 2, lo que es consistente con su efecto esperado de causar una señalización WNT–β-catenina constitutiva y de alto nivel (Fig. 1f). En general, las variantes patogénicas de la β-catenina con cambio de sentido en ClinVar se enriquecieron como resultados de los estudios en comparación con otras clases de variantes (Nota suplementaria y Tabla S2).

Un diagrama de dispersión x–y de las puntuaciones z de los sgRNA para el enriquecimiento en la puerta del 15% inferior (eje x) frente a la puerta del 10% superior (eje y) identificó los sgRNA que se predicen para realizar mutaciones en muchas regiones que se sabe que son críticas para la función y la regulación del BDC (Fig. 1g). Utilizamos un enfoque de varios pasos para validar las mutaciones con cambio de sentido seleccionadas para un análisis mecanicista más profundo (Fig. 4 en los datos suplementarios y Tabla S3). La mayoría de las mutaciones con cambio de sentido validadas se mapearon en la β-catenina y AXIN1 (Fig. 5 en los datos suplementarios). Las mutaciones en APC (Fig. 3a-d en los datos suplementarios) y GSK3β (Fig. 3e-h en los datos suplementarios) tuvieron puntuaciones z generales más bajas en el estudio y efectos más pequeños en la señalización en las pruebas de validación (Fig. 4f y Fig. 4g en los datos suplementarios). La redundancia de las interacciones de APC (Fig. 1b) dificulta su interrupción con mutaciones puntuales, lo que es consistente con el hecho de que solo se encuentran mutaciones sin sentido como impulsores en el CCR^[24]. La redundancia funcional entre GSK3β y GSK3α en las células HAP1 probablemente explica la ausencia de resultados de GSK3B^[36]. Por lo tanto, nos centramos en los análisis mecanicistas de la β-catenina y AXIN1.

El panorama de relación estructura-función de la β-catenina

El mapeo de las puntuaciones z de enriquecimiento del 10% superior y el 15% inferior (por encima de un umbral de 2) en un modelo estructural^[37],^[38] reveló que nuestro estudio identificó mutaciones con cambio de sentido en la β-catenina ubicadas en interfaces de interacción conocidas con β-TrCP, BCL9, AXIN1, APC y los factores de transcripción TCF/LEF (Fig. 2a y Fig. 2a-d en los datos suplementarios). Estas mutaciones alteran los residuos de β-catenina que realizan contactos directos con la proteína asociada (definidos como una distancia 2, lo que es consistente con su efecto esperado de causar una señalización WNT–β-catenina constitutiva y de alto nivel (Fig. 1f). En general, las variantes de β-catenina con cambio de sentido patógenas en ClinVar se enriquecieron como resultados del cribado en comparación con otras clases de variantes (Nota del suplemento y Tabla 2 del suplemento).

Un diagrama de dispersión x–y de las puntuaciones z de los sgARN para el enriquecimiento en la puerta del 15% inferior (eje x) frente a la puerta del 10% superior (eje y) identificó sgARN que se predicen para realizar mutaciones en muchas regiones que se sabe que son críticas para la función y la regulación del complejo BDC (Fig. 1g). Utilizamos un enfoque de varios pasos para validar las mutaciones con cambio de sentido seleccionadas para un análisis mecanístico más profundo (Fig. 4a del suplemento y Tabla 3 del suplemento). La mayoría de las mutaciones con cambio de sentido validadas se mapearon a β-catenina y AXIN1 (Fig. 4b–e del suplemento). Las mutaciones en APC (Fig. 3a–d del suplemento) y GSK3β (Fig. 3e–h del suplemento) tuvieron puntuaciones z generales más bajas en el cribado y efectos más pequeños en la señalización en las pruebas de validación (Fig. 4f, g del suplemento). La redundancia de las interacciones de APC (Fig. 1b) dificulta su interrupción con mutaciones puntuales, lo que es consistente con el hecho de que solo se encuentran mutaciones sin sentido como impulsores en el CCRC^[24]. La redundancia funcional entre GSK3β y GSK3α en las células HAP1 probablemente explica la ausencia de resultados de GSK3B^[36]. Por lo tanto, nos centramos en los análisis mecanísticos de β-catenina y AXIN1.

El panorama secuencia-función de β-catenina

El mapeo de las puntuaciones z de enriquecimiento del 10% superior y el 15% inferior (por encima de un umbral de 2) en un modelo estructural^[37],^[38] reveló que nuestro cribado identificó mutaciones con cambio de sentido en β-catenina ubicadas en interfaces de interacción conocidas con β-TrCP, BCL9, AXIN1, APC y los factores de transcripción TCF/LEF (Fig. 2a y Fig. 2a–d del suplemento). Estas mutaciones alteran los residuos de β-catenina que realizan contactos directos con la proteína asociada (definidos como una distancia 70% de guías que coinciden perfectamente (observado 80–96%),