Plasticidad progresiva de las células tumorales intestinales, activación de Myc y pérdida del compromiso de la línea celular troncal tumoral Lgr5+ tras la depleción de Wnt.

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo (^[1]). El pronóstico del CCR se ve muy afectado por la presencia de metástasis a distancia, y estudios recientes han demostrado que, entre otros factores, la plasticidad de las células tumorales impulsa la metástasis del CCR (^[2]–^[5]). La plasticidad fenotípica, que es una de las características distintivas del cáncer, incluye la plasticidad intralínica y la plasticidad translínica (^[6], ^[7]). La plasticidad intralínica permite que las células reviertan de estados maduros a estados progenitores y promueve la inhibición de la diferenciación (^[6], ^[7]). Tras la plasticidad translínica, las células pueden transdiferenciarse de su propia línea de desarrollo hacia distintas líneas celulares, como se ha informado en el CCR (^[6]–^[10]). En el contexto del CCR, la plasticidad translínica se caracteriza por la pérdida de la identidad celular intestinal canónica y la aparición de programas génicos de transcripción oncofetal y no canónicos (^[8]–^[10]). Se ha sugerido que uno de los pasos iniciales de la plasticidad progresiva en el CCR es la pérdida de la señalización de wingless-related integration site (Wnt)/β-catenina (^[9]). Sin embargo, los pasos que siguen a la pérdida del estado tumoral canónico mediante la depleción de la señalización Wnt canónica no están completamente caracterizados.

La vía de señalización Wnt/β-catenina está hiperactivada en la mayoría de los pacientes con CCR debido a mutaciones en el gen Adenomatous polyposis coli (APC), que se considera que inicia la secuencia adenoma-carcinoma del desarrollo del CCR (^[11]–^[14]). Uno de los genes diana de la señalización Wnt/β-catenina, el receptor acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina 5 (LGR5), se expresa en las células madre del CCR (^[15]–^[17]). Paradójicamente, las células que expresan bajos niveles de Lgr5 pueden formar metástasis del CCR (^[18]). Además, la inhibición farmacológica de la oncoproteína RAS-G12D convirtió las células metastásicas plásticas Emp1+ en un estado impulsado por WNT y Lgr5+ (^[19]). Por otro lado, las células madre cancerosas Lgr5+ son esenciales para la metástasis hepática en modelos de ratón preclínicos (^[20]). Por lo tanto, el papel de las células tumorales Lgr5+ en la plasticidad y la metástasis sigue siendo complejo. Otro gen diana de la señalización Wnt/β-catenina en el CCR es el factor de transcripción Prospero homeobox 1 (PROX1), que se ha demostrado que se expresa en las células madre tumorales resistentes al tratamiento (^[21]–^[23]). Las células madre tumorales Lgr5+ y Prox1+ muestran un compromiso de línea distinto en los tumores ApcMin/+ (^[23]).

Hasta la fecha, la plasticidad de las células tumorales se ha estudiado en muestras derivadas de pacientes con CCR avanzado y en modelos tumorales de ratón preclínicos que albergan múltiples mutaciones típicas del CCR avanzado (^[8]–^[10], ^[19], ^[24]). Para abordar los pasos iniciales del desarrollo de la plasticidad, primero investigamos las células tumorales en modelos tumorales de ratón preclínicos que contienen solo la deleción de Apc. Además, investigamos muestras de pólipos de pacientes con poliposis adenomatosa familiar (PAF), que albergan mutaciones en el gen APC. En ambos modelos, encontramos un estado celular plástico (PCS) en las células madre tumorales PROX1+ de los pólipos y adenomas, lo que indica la presencia de plasticidad desde la fase más temprana de la secuencia adenoma-carcinoma. Además, investigamos si la deleción de los mediadores de la señalización Wnt/β-catenina, el factor de célula T Tcf7 o el factor de mejora del ligando Lef1 (^[11]), induce una plasticidad progresiva, como se especuló en un estudio anterior (^[9]). Para centrarnos en las células madre tumorales, estas deleciones se indujeron utilizando la recombinasa Lgr5-CreERT2. La deleción de Tcf7 o Lef1 condujo a un cambio transcripcional, consistente con la plasticidad translínica, y a la aparición de poblaciones celulares tumorales altamente plásticas. Estas deleciones también condujeron a un aumento de la plasticidad intralínica, lo que se refleja en el fracaso de las células madre Lgr5+ para comprometerse con las células de tipo enterocitario, y a un aumento de la expresión de Inhibidor de la unión al ADN 1-3 (Id1-3) y del factor de transcripción SRY-box 9 (Sox9) que actúan como inhibidores de la diferenciación (^[25], ^[26]). Además, encontramos un aumento de la expresión de transcritos implicados en la señalización Wnt no canónica, un aumento de la proliferación de las células tumorales y una aceleración de la tumorigénesis a través de una mayor señalización de Myc, todo lo cual representa características previamente no descritas de la plasticidad progresiva.

RESULTADOS

Las células madre tumorales en los pólipos intestinales humanos y los adenomas de ratón son altamente plásticas

Para analizar la plasticidad en los tumores de etapa temprana del intestino grueso, reanalizamos datos publicados de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de individuos sanos y de pacientes con PAF o carcinoma de colon (GSE201348) (^[8], ^[27]). Tras la agrupación de las células epiteliales, encontramos un grupo específico del tumor, que fue compartido tanto por las muestras de pólipos de PAF como por las de carcinoma (fig. 1A, fig. S1, A y B, y tabla S1). Como se esperaba, las células de este grupo mostraron una alta expresión de PROX1, pero inesperadamente, también expresaron múltiples marcadores de plasticidad translínica, lo que refleja su HPCS (fig. 1B).

Para estudiar la plasticidad en modelos de ratón preclínicos de adenomas intestinales en etapa temprana, inducimos la deleción de Apc en las células Lgr5+ administrando tamoxifeno a ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; Apcfl/fl; Rosa26LSLTdTomato (LApc) (fig. S2A). Además, para investigar el impacto de la pérdida de la señalización Wnt/β-catenina, también inducimos la deleción de Tcf7 administrando tamoxifeno a ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; Apcfl/fl; Tcf7fl/fl; Rosa26LSLTdTomato (LApcT) (fig. S2A). La deleción de Tcf7 se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia de la proteína Tcf1 codificada por el gen Tcf7 en las secciones tumorales 19 días después de la administración de tamoxifeno (fig. S2B). Para analizar la transcriptómica tumoral, aislamos las células intestinales tdTomato+ de estos ratones y las sometimos a scRNA-seq (tabla S2). Además, reanalizamos nuestro conjunto de datos de scRNA-seq publicado anteriormente (GSE179483) (^[28]) que contiene muestras tumorales de ratones LApc y ratones con deleción de Apc y Lef1 (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; ApcΔ/Δ; Lef1Δ/Δ; Rosa26LSLTdTomato) (LApcLef1) (fig. S3A). Para identificar grupos celulares específicos del tumor, integramos las muestras epiteliales intestinales de ratones de tipo salvaje (WT) en el análisis (GSE169197) (^[29]). Después del filtrado y la agrupación no supervisada, las células positivas para la molécula de adhesión celular epitelial (Epcam+) se reagruparon y los grupos se anotaron (fig. 1C y figs. S2, C a E, y S3, B a D). Las deleciones de Tcf7 y Lef1 se asociaron con proporciones aumentadas de grupos específicos del tumor, lo que coincidió con la mayor carga tumoral observada en los ratones LApcT y LApcLef1 en comparación con los ratones LApc (0,5, 5 y 36 % para WT, LApc y LApcT, respectivamente; 1, 14 y 56 % para WT, LApc y LApcLef1, respectivamente) (fig. 1C, figs. S2, C y E, y S3, B y C, y tabla S3).

Para investigar la plasticidad en las células de los grupos específicos del tumor, seleccionamos y reagrupamos. Encontramos que 5 de 12 y 7 de 13 grupos estaban presentes predominantemente en las muestras LApcT y LApcLef1, respectivamente, lo que indica cambios transcripcionales notables en las células tumorales con deleción de Tcf7 y Lef1 (fig. 1, D y E, y tabla S3). Para comprender las firmas transcripcionales de cada grupo, identificamos los genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos celulares por separado para las muestras LApc, LApcT y LApcLef1 y realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) con firmas génicas canónicas del epitelio intestinal y de plasticidad translínica. En línea con los datos tumorales humanos, todas las muestras tumorales de ratón, incluidas las muestras LApc, mostraron un enriquecimiento de múltiples firmas génicas asociadas con la plasticidad translínica y una represión de las firmas epiteliales intestinales canónicas en las células del grupo número 1 (fig. 1, F a H, y fig. S4, A y B). Además, tanto las muestras LApcT como las LApcLef1 presentaron múltiples poblaciones celulares con firmas de plasticidad oncofetal y no canónica (fig. 1, I y J). Para explorar más a fondo las células que formaron el grupo altamente plástico 1, establecimos la identidad en la anotación original (fig. 1C) y encontramos que las células Prox1+ formaron este grupo en todas las muestras tumorales (fig. 1, K y L, y figs. S2D y S3D). Para caracterizar aún más los cambios en los estados celulares transcripcionales tras la deleción de Tcf7 o Lef1, realizamos un análisis de TissueEnrich en los DEG en las células específicas del tumor entre los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1 y los tumores de control. Encontramos un enriquecimiento de genes asociados con el epitelio escamoso, incluido la piel y el esófago, y una pérdida de genes asociados con los tejidos intestinales, como el intestino delgado, el estómago, el duodeno y el colon, en las muestras tumorales con deleción (fig. S4, C y D). En conjunto, encontramos una subpoblación de células tumorales con PCS tanto en los pólipos intestinales humanos como en los adenomas de ratón, y que la deleción de Tcf7 o Lef1 impulsa la plasticidad progresiva en los adenomas intestinales.

La deleción de Tcf7 o Lef1 en los adenomas intestinales aumenta la plasticidad translínica

Dado que la plasticidad translínica puede influir en todas las células tumorales y no solo en las células tumorales específicas, volvimos a analizar el conjunto de datos que comprende todas las células tumorales. Además de analizar las firmas génicas canónicas del epitelio intestinal y de plasticidad translínica (tabla S3), también incluimos una lista de genes diana de la proteína asociada a Yes 1 (Yap1) y genes que codifican las subunidades de la proteína activadora 1 (AP-1) y sus genes diana, que se ha demostrado que controlan la reprogramación oncofetal (^[9]). El GSEA de los DEG reveló una disminución de la expresión de los conjuntos de genes del epitelio intestinal canónico y un enriquecimiento de la expresión de los conjuntos de genes de plasticidad oncofetal y no canónica en las células tumorales con deleción de Tcf7 o Lef1 (fig. 2, A a C). Para explorar esto con más detalle, calculamos la expresión de estos módulos génicos para cada célula en cada grupo de tratamiento y trazamos los valores. Aunque la deleción de Apc aumentó la expresión de la firma génica oncofetal y disminuyó la firma génica absorbente en comparación con las muestras WT, la deleción adicional de Tcf7 o Lef1 aumentó sustancialmente estos efectos (fig. 2, D a G). Estos resultados indican que la deleción de Tcf7 o Lef1 aumenta la plasticidad translínica. Además, analizamos la expresión de genes que se sabe que están regulados al alza o a la baja 24 horas después de la pérdida inducida por toxina de difteria de las células tumorales Lgr5+ (^[20]). Una firma génica para los genes regulados al alza tras la pérdida de las células tumorales Lgr5+ se enriqueció tanto en las muestras LApcT como en las LApcLef1 en comparación con sus tumores de control (tabla S3). Además, una firma génica para los genes regulados a la baja tras la pérdida de las células Lgr5+ se enriqueció en las muestras tumorales LApcT (tabla S3). Por lo tanto, estos resultados sugieren que los genes activados tras la pérdida de las células tumorales Lgr5+ también se activan tras la plasticidad progresiva inducida por la deleción de Tcf7 o Lef1.

Para explorar si las muestras de pacientes con CCR y una puntuación baja de señalización Wnt canónica muestran una alta puntuación de transplasticidad, exploramos estas correlaciones en los datos de microarrays derivados de pacientes con CCR (GSE39582) (^[30]). Como se esperaba, encontramos la puntuación más alta del epitelio intestinal canónico (puntuación HiCol: 10) en las muestras de pacientes con la puntuación WNT más alta (fig. S5A). En contraste, la puntuación más alta de escamas (puntuación HiSquam: 10) se encontró en las células con la puntuación WNT más baja (fig. S5B). En línea con esto, las muestras con la expresión más baja de TCF7 también mostraron la puntuación más baja del epitelio intestinal canónico y la puntuación HiSquam (fig. S5, C y D). Sin embargo, no se encontró correlación entre la expresión de LEF1 y las puntuaciones del epitelio intestinal canónico o de escamas (fig. S5, E y F). En conjunto, encontramos una correlación negativa entre WNT/TCF7 y la firma de transplasticidad de escamas también en las muestras de pacientes con CCR.

Los genes que codifican las subunidades de AP-1 se activan tras la deleción de Tcf7 o Lef1

Para explorar cómo la programación oncofetal se ve afectada por la deleción de los efectores de la vía Wnt, analizamos la accesibilidad de la cromatina en los tumores LApcLef1 y LApc utilizando el ensayo de secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (ATAC-seq). Descubrimos que la deleción de Lef1 aumentó la accesibilidad de la cromatina en los motivos de los factores de transcripción (FT) de las subunidades AP-1, Fos, Fosl2, Jun, Batf, Fosl1, Jund y Junb, que son los impulsores de la reprogramación oncofetal (^[9]), y de múltiples miembros de la familia Sox, incluido Sox17 (Fig. 3A). También encontramos una disminución de la accesibilidad de la cromatina en los motivos de los FT Hnf4a, Nr2f6, Rxra, Ppard y Rxrg, que actúan como protectores de las características epiteliales intestinales canónicas (Fig. 3B) (^[9]). Además, exploramos el análisis de enriquecimiento de motivos de FT publicado a partir de datos de ATAC-seq de pacientes con CRC incluidos en The Cancer Genome Atlas (^[10]) y encontramos una pérdida de accesibilidad en los sitios que contenían motivos para TCF7 y LEF1 en pacientes con una alta firma de genes escamosos, lo que apoya nuestros hallazgos.

Para investigar si los cambios en la accesibilidad de la cromatina de los motivos de los FT se correlacionan con alteraciones en la expresión de ARN, analizamos los datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de las muestras WT, LApc, LApcT y LApcLef1. En línea con los resultados de ATAC-seq, varios marcadores oncofetales, incluidos, por ejemplo, Yap1, Anxa1, Fos, Fosl1 y miembros de la familia Sox (por ejemplo, Sox4, Sox13 y Sox17), se expresaron en mayor medida en las células LApcT y LApcLef1 que en las células tumorales LApc (Fig. 3C y fig. S6). Sin embargo, a pesar de la disminución de la accesibilidad de la cromatina de sus motivos de FT, los transcritos de Hnf4a, Nr2f6, Rxra, Ppard y Rxrg no disminuyeron en las muestras LApcT o LApcLef1 en comparación con las muestras LApc (fig. S7A). En general, estos resultados indicaron aún más que Tcf7 y Lef1 suprimen la plasticidad progresiva en los adenomas intestinales.

Dado que las subunidades del complejo AP-1 también funcionan como efectores de la vía de señalización no canónica Wnt/polaridad celular planar (PCP) (^[31]), investigamos si la deleción de Tcf7 o Lef1 impulsa la expresión de componentes adicionales de la vía de señalización no canónica Wnt que pertenecen a la vía Wnt/PCP o Wnt/Ca2+. En los datos de scRNA-seq de los tumores, la puntuación de enriquecimiento de módulos (Materiales y métodos) para la vía Wnt no canónica aumentó, especialmente en los grupos de células específicas del tumor tras la deleción de Tcf7 o Lef1 (fig. S7B). Estos resultados sugieren un aumento de la activación de la vía de señalización Wnt no canónica en asociación con la plasticidad progresiva.

La mutación de KRAS suprime la expresión de Lef1 y Prox1 en los adenomas intestinales

Se ha sugerido que, en el CRC, la supresión del estado tumoral Wnt canónico permite la reprogramación oncofetal, lo que conduce a un estado celular no canónico que impulsa la progresión del CRC (^[9]). Aunque se han informado de factores genéticos y no genéticos para dicha reprogramación (^[8]–^[10]), los mecanismos que inician la reprogramación de la plasticidad no se comprenden completamente. Dado que las mutaciones de pérdida de función en los efectores de la vía WNT, TCF7 y LEF1, son raras en los pacientes con CRC (^[8]), la pérdida de la actividad de la vía WNT canónica debe estar impulsada por otros factores. Se ha demostrado que las mutaciones de Kras cambian la activación de la vía Wnt canónica de un estado hiperactivo a un estado hipoactivo en modelos preclínicos de tumores intestinales (^[32]). Para evaluar si Kras mutante afecta la expresión del factor de transcripción 1 de las células T (Tcf1) y Lef1, los marcamos en secciones de tumores de ratones ApcMin/+ y ApcMin/+; KrasLSL-G12D/+; Villin-CreERT2 (fig. S8A). También marcamos las secciones para Prox1, que es un gen diana de Wnt que se expresa en gran medida en los tumores de CRC mutantes de Apc (^[21], ^[33]) y que se expresa en las células madre de tumores ApcMin/+ y CRC (^[22], ^[23]). En línea con el estado hipoactivo de la vía de señalización Wnt canónica tras la mutación de Kras, encontramos una disminución de la expresión de Lef1 y Prox1, pero no de Tcf1, en los tumores mutantes de Kras (fig. S8, de la B a la G). Para evaluar esto aún más en muestras de pacientes con CRC, analizamos los datos de microarrays de muestras de pacientes con subtipos moleculares consensuados (CMS) de CRC (GSE39582) (^[30]). Descubrimos que, en los tumores del subtipo CMS3 que se caracterizan por la mutación de KRAS, la expresión de LEF1 era menor que en los otros subtipos CMS (^[28], ^[34]). Además, la expresión de TCF7 fue menor en las muestras CMS3 en comparación con las muestras CMS2 con alta expresión de Wnt (fig. S8H). En resumen, nuestros resultados de los tumores de ratón y los datos de los pacientes con CRC indican que las mutaciones de KRAS realmente impulsan un estado hipoactivo de la vía Wnt canónica en el CRC.

La expresión de Prox1 disminuye tras la deleción de Tcf7 o Lef1

Aunque los datos previos del modelo tumoral intestinal de ratón preclínico indicaron una función prometastásica para Prox1 (^[35]), otro estudio mostró un aumento de los marcadores de plasticidad translineal tras el silenciamiento de PROX1 en organoides derivados de pacientes con CRC (^[8]). Para estudiar los efectos de la deleción de Tcf7 o Lef1 sobre la expresión de Prox1, marcamos las secciones de tumores de ratón para Prox1 y para la anexina A1 (Anxa1), un marcador de la reprogramación oncofetal y un gen regulado negativamente por Prox1 (^[9], ^[22]), y para Msh homeobox 1 (Msx1), un marcador no canónico de osteoblastos (^[8]). De manera similar, como en las muestras con deleción de Lef1 (^[28]), encontramos una disminución marcada de Prox1 y un aumento de la expresión de Msx1 y Anxa1 en los tumores con deleción de Tcf7 (Fig. 4, de la A a la E, y tabla S4). Si bien las células Anxa1+ eran principalmente negativas para Prox1 en las secciones de tumores marcadas y en el análisis de scRNA-seq de las células en los grupos de células específicas del tumor, las células Msx1+ eran fuertemente Prox1+ y principalmente Anxa1− en los datos de scRNA-seq. La expresión de Msx1 se encontró principalmente en las células Anxa1− específicas del tumor (Fig. 4, de la F a la G). En conjunto, estos resultados indican que la deleción de Tcf7 y Lef1 suprime la expresión de Prox1 y sugieren que las células oncofetales y similares a osteoblastos marcadas por Anxa1+ y Msx1+, respectivamente, representan distintas poblaciones de células tumorales.

Inhibición del compromiso de la línea de células madre tumorales Lgr5+ tras la plasticidad progresiva

Anteriormente, informamos que las células Lgr5+ en los tumores ApcMin/+ se diferencian predominantemente en células tumorales similares a enterocitos (^[23]). El análisis de la proporción de tipos de células de las muestras tumorales mostró una disminución de la población de células similares a enterocitos tanto en los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1, lo que sugiere una plasticidad intralineal y una diferenciación bloqueada (78 y 11% en el análisis de LApc frente a LApcT, respectivamente; 35 y 12% en el análisis de LApc frente a LApcLef1, respectivamente) (Fig. 5A). La diferenciación intestinal se correlaciona negativamente con una puntuación aberrante de células madre en el CRC (^[26], ^[36]). Por lo tanto, cuantificamos esta puntuación utilizando el enriquecimiento de módulos (Materiales y métodos) y encontramos que estaba aumentada en las muestras con deleción de Tcf7 o Lef1 en comparación con las muestras de control, lo que sugiere una reducción de la diferenciación de las células tumorales (Fig. 5, de la B a la C). Dado que nuestro análisis de LApcT incluye un trazador de linaje tdTomato y dado que las deleciones se indujeron en las células Lgr5+, evaluamos la proporción de células hijas Lgr5−; tdTomato+ dentro de la población de células tumorales. Encontramos una disminución del 20% en las células hijas Lgr5−; tdTomato+ en las muestras LApcT en comparación con las muestras LApc, lo que proporciona evidencia adicional de la inhibición de la diferenciación de las células tumorales (Fig. 5D). Para analizar aún más los cambios en las trayectorias de las células tumorales, analizamos la pseudotiempo utilizando el paquete Monocle3 (RRID:SCR018685) (^[37]–^[40]) y encontramos una mayor proporción de células con un valor de pseudotiempo bajo en las muestras LApcT o LApcLef1 en comparación con los tumores LApc (Fig. 5, de la E a la H). Para encontrar una explicación para la diferenciación inhibida, analizamos los genes diferencialmente expresados (DEG) entre las muestras LApc y LApcT o LApcLef1. Entre los DEG regulados al alza en las muestras con deleción de Tcf7 o Lef1, encontramos transcritos que codifican genes que funcionan como inhibidores de la diferenciación de las células tumorales, incluidos, por ejemplo, inhibidores de la diferenciación 1, 2 y 3 (Id1/2/3_) y Sox9 (^[25], ^[26]). La expresión de estos genes aumentó tanto en las muestras LApcT como en las LApcLef1, especialmente en los grupos de células específicas del tumor y en las células madre y progenitoras (Fig. 5I). En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de una diferenciación celular tumoral alterada de las células madre tumorales Lgr5+ tras la plasticidad intralineal progresiva.

Para analizar la población de células tumorales similares a enterocitos en las muestras tumorales aisladas de los pacientes, cuantificamos las proporciones de células similares a enterocitos a partir de tejido sano, pólipos de FAP y muestras de carcinoma (Fig. 1A y fig. S1B). Además, analizamos los DEG entre las muestras de pólipos y carcinoma. Como se esperaba, muchos de los programas de plasticidad translineal se enriquecieron en las muestras de carcinoma en comparación con los pólipos, lo que refleja la progresión de la enfermedad. Además, en línea con nuestros datos de adenoma de ratón, la población total de células similares a enterocitos disminuyó en las muestras de pólipos y carcinoma en comparación con las muestras de tejido sano, pero no entre las muestras de pólipos y carcinoma (fig. S1B). Sin embargo, la positividad de EMP1 aumentó con la progresión de la enfermedad, ya que el 63 y el 92% de las células similares a enterocitos expresaron EMP1 en las muestras de pólipos y carcinoma, respectivamente. Esto es de interés, ya que EMP1 se asocia con la plasticidad y un mal pronóstico en los pacientes con CRC (^[19], ^[41]).

El aumento de la plasticidad se asocia con un aumento de la proliferación de células tumorales y el crecimiento tumoral, y depende de Myc

Para investigar si la plasticidad progresiva inducida por la deleción de Tcf7 se asocia con una mayor tumorigenesis de manera similar a lo que ocurre tras la deleción de Lef1 (^[28]), realizamos un análisis de supervivencia en los ratones LApcT y LApc. La deleción de Tcf7 condujo a una disminución marcada de la supervivencia de los ratones LApcT en comparación con los ratones LApc, lo que resultó en una vida media de 24 y 68 días, respectivamente (Fig. 6A), lo que confirma que Tcf7 también inhibe la tumorigenesis en los ratones Apc mutantes. Este hallazgo fue respaldado por un aumento de la expresión de Mki67 y la proporción de células proliferantes en las muestras con deleción de Tcf7 (16, 6 y 32% en las muestras WT, LApc y LApcT, respectivamente) (Fig. 6B). En consecuencia, en las muestras WT, LApc y LApcLef1, las proporciones de células proliferantes fueron 19, 16 y 49% (fig. S3C). Además, el GSEA de los DEG reveló una mayor activación de las vías Myc, E2F y G2-M en los tumores con deleción de Tcf7 (Fig. 6, de la C a la D). En línea con esto, al analizar las células Tcf7+; Lef1+ de doble positividad y las células Tcf7−; Lef1− de doble negatividad en los tumores de control LApc, encontramos una supresión de la actividad de Myc en las células de doble positividad (Fig. 6E). Además, observamos un aumento de la tinción de inmunofluorescencia de Myc y la incorporación de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) en las secciones de tumores LApcT en comparación con las muestras LApc, de manera similar a lo que se informó previamente para las muestras LApcLef1 (Fig. 6, de la F a la G) (^[28]). Para confirmar que Myc participó en el aumento de la tumorigenesis, aislamos organoides de los ratones LApc y LApcT 29 y 19 días después de las deleciones génicas in vivo, respectivamente. Como se esperaba, el tamaño medio de los organoides con deleción de Tcf7 fue mayor que el de los organoides de control (Fig. 6H). Sin embargo, esta diferencia se eliminó con el tratamiento con el inhibidor de Myc EN4 (Fig. 6H) (^[42]). Estos resultados indican un papel vital de Myc en la promoción del crecimiento tumoral tras la plasticidad progresiva.

Una alta expresión de TCF7 atenúa el impacto pronóstico adverso de la plasticidad translineal

Aunque los programas individuales de plasticidad translinaje están asociados con la recurrencia tumoral y la supervivencia en pacientes con CRC (^[8]), se desconoce una posible correlación entre las firmas oncofetales y la supervivencia. Además, falta una firma génica general de plasticidad translinaje con un número limitado de genes derivados de marcadores oncofetales y no canónicos de plasticidad. Para identificar los genes pronósticos asociados con la supervivencia libre de recurrencia (SLR) y la supervivencia global (SG), reanalizamos una cohorte publicada de pacientes con CRC (GSE39582) (^[30]) y realizamos un análisis de múltiples pasos que combinó datos de expresión génica con resultados clínicos (Materiales y métodos). Esto nos permitió generar firmas de plasticidad translinaje y oncofetales para los análisis de SLR y SG (Fig. 7A). Descubrimos que las firmas de plasticidad translinaje y oncofetales estaban correlacionadas negativamente tanto con la SLR como con la SG, ya que la peor supervivencia se observó en pacientes con la puntuación de plasticidad translinaje u oncofetal más alta (Fig. 7, B y C, y fig. S9, A y B).

Además, analizamos si la expresión de TCF7 o LEF1 junto con la puntuación de plasticidad translinaje se correlaciona con la supervivencia del paciente. Para ello, estratificamos las muestras en función de su expresión génica y puntuación de plasticidad translinaje en cuartiles, y en función de esto, asignamos a cada muestra una etiqueta combinada que representa tanto su expresión génica como los cuartiles de la puntuación de plasticidad translinaje (por ejemplo, Q1Q1; Materiales y métodos y Fig. 7D). Aunque la expresión de LEF1 no se correlacionó con la SLR o la SG (fig. S9, C y D), el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para TCF7 mostró que los pacientes en el grupo Q1Q4, caracterizados por la expresión más baja de TCF7 y la puntuación de plasticidad translinaje más alta, presentaban la peor SG y una tendencia a una peor SLR (Fig. 7, E y F).

Las células madre tumorales en los pólipos intestinales humanos y los adenomas de ratón son altamente plásticas

Para analizar la plasticidad en los tumores de etapa temprana del intestino grueso, reanalizamos datos de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) publicados de individuos sanos y de pacientes con FAP o carcinoma de colon (GSE201348) (^[8], ^[27]). Tras la agrupación de las células epiteliales, encontramos un grupo específico del tumor, que fue compartido tanto por las muestras de pólipos de FAP como por las de carcinoma (Fig. 1A, fig. S1, A y B, y tabla S1). Como se esperaba, las células de este grupo mostraron una alta expresión de PROX1, pero inesperadamente, también expresaron múltiples marcadores de plasticidad translinaje, lo que refleja sus HPCS (Fig. 1B).

Para estudiar la plasticidad en modelos preclínicos de ratón de adenomas intestinales en etapa temprana, inducimos la deleción de Apc en las células Lgr5+ administrando tamoxifeno a ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; Apcfl/fl; Rosa26LSLTdTomato (LApc) (fig. S2A). Además, para investigar el impacto de la pérdida de la señalización Wnt/β-catenina, también inducimos la deleción de Tcf7 mediante la administración de tamoxifeno a ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; Apcfl/fl; Tcf7fl/fl; Rosa26LSLTdTomato (LApcT) (fig. S2A). La deleción de Tcf7 se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia de la proteína Tcf1 codificada por el gen Tcf7 en las secciones de tumor 19 días después de la administración de tamoxifeno (fig. S2B). Para analizar la transcriptómica tumoral, aislamos las células tdTomato+ intestinales de estos ratones y las sometimos a scRNA-seq (tabla S2). Además, reanalizamos nuestro conjunto de datos de scRNA-seq publicado anteriormente (GSE179483) (^[28]) que contenía muestras de tumores de ratones LApc y ratones con deleción de Apc y Lef1 (Lgr5EGFP-IRES-CreERT2; ApcΔ/Δ; Lef1Δ/Δ; Rosa26LSLTdTomato) (LApcLef1) (fig. S3A). Para identificar grupos de células específicas del tumor, integramos las muestras epiteliales intestinales de ratones de tipo salvaje (WT) en el análisis (GSE169197) (^[29]). Después del filtrado y la agrupación no supervisada, las células positivas para la molécula de adhesión celular epitelial (Epcam+) se reagruparon y se anotaron los grupos (Fig. 1C y figs. S2, C a E, y S3, B a D). Las deleciones de Tcf7 y Lef1 se asociaron con proporciones más altas de grupos de células específicas del tumor, lo que coincidió con la mayor carga tumoral observada en los ratones LApcT y LApcLef1 en comparación con los ratones LApc (0,5, 5 y 36% para WT, LApc y LApcT, respectivamente; 1, 14 y 56% para WT, LApc y LApcLef1, respectivamente) (Fig. 1C, figs. S2, C y E, y S3, B y C, y tabla S3).

Para investigar la plasticidad en las células de los grupos de células específicas del tumor, seleccionamos y reagrupamos estas células. Descubrimos que 5 de 12 y 7 de 13 grupos estaban presentes predominantemente en las muestras LApcT y LApcLef1, respectivamente, lo que indica cambios transcripcionales notables en las células tumorales con deleción de Tcf7 y Lef1 (Fig. 1, D y E, y tabla S3). Para comprender las firmas transcripcionales de cada grupo, identificamos los genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos de células por separado para las muestras LApc, LApcT y LApcLef1 y realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) con firmas génicas canónicas del epitelio intestinal y de plasticidad translinaje. En línea con los datos del tumor humano, todas las muestras de tumor de ratón, incluidas las muestras LApc, mostraron un enriquecimiento de múltiples firmas génicas asociadas con la plasticidad translinaje y la represión de las firmas del epitelio intestinal canónico en las células del grupo número 1 (Fig. 1, F a H, y fig. S4, A y B). Además, tanto las muestras LApcT como las LApcLef1 presentaron múltiples poblaciones celulares con firmas de plasticidad oncofetal y no canónica (Fig. 1, I y J). Para explorar más a fondo las células que formaron el grupo altamente plástico 1, restablecimos la identidad a la anotación original (Fig. 1C) y descubrimos que las células Prox1+ formaron este grupo en todas las muestras de tumor (Fig. 1, K y L, y figs. S2D y S3D). Para caracterizar aún más los cambios en los estados celulares transcripcionales tras la deleción de Tcf7 o Lef1, realizamos un análisis de TissueEnrich en los DEG en las células específicas del tumor entre los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1 y los tumores de control. Descubrimos un enriquecimiento de genes asociados con el epitelio escamoso, incluido el de la piel y el esófago, y una pérdida de genes asociados con los tejidos intestinales, como el intestino delgado, el estómago, el duodeno y el colon, en las muestras de tumor con deleción (fig. S4, C y D). En conjunto, encontramos una subpoblación de células tumorales con PCS tanto en los pólipos intestinales humanos como en los adenomas de ratón, y que la deleción de Tcf7 o Lef1 impulsa la plasticidad progresiva en los adenomas intestinales.

La deleción de Tcf7 o Lef1 en los adenomas intestinales aumenta la plasticidad translinaje

Dado que la plasticidad translinaje puede influir en todas las células tumorales y no solo en las células específicas del tumor, volvimos a analizar el conjunto de datos que comprende todas las células tumorales. Además de analizar las firmas génicas del epitelio intestinal canónico y de la plasticidad translinaje (tabla S3), también incluimos una lista de genes diana de la proteína asociada a Yes 1 (Yap1) y genes que codifican las subunidades de la proteína activadora 1 (AP-1) y sus genes diana, que se ha demostrado que controlan la reprogramación oncofetal (^[9]). El GSEA de los DEG reveló una disminución de la expresión de los conjuntos de genes del epitelio intestinal canónico y un enriquecimiento de la expresión de los conjuntos de genes de plasticidad oncofetal y no canónica en las células tumorales con deleción de Tcf7 o Lef1 (Fig. 2, A a C). Para explorar esto con más detalle, calculamos la expresión de estos módulos génicos para cada célula en cada grupo de tratamiento y trazamos los valores. Aunque la deleción de Apc aumentó la expresión de la firma génica oncofetal y disminuyó la firma génica absortiva en comparación con las muestras WT, la deleción adicional de Tcf7 o Lef1 aumentó sustancialmente estos efectos (Fig. 2, D a G). Estos resultados indican que la deleción de Tcf7 o Lef1 aumenta la plasticidad translinaje. Además, analizamos la expresión de genes que se sabe que están regulados al alza o a la baja 24 horas después de la pérdida de las células tumorales Lgr5+ inducida por la toxina de la difteria (^[20]). Una firma génica para los genes regulados al alza tras la pérdida de las células Lgr5+ se enriqueció tanto en las muestras LApcT como en las LApcLef1 en comparación con sus tumores de control (tabla S3). Además, una firma génica para los genes regulados a la baja tras la pérdida de las células Lgr5+ se enriqueció en las muestras de tumor LApcT (tabla S3). Por lo tanto, estos resultados sugieren que los genes activados tras la pérdida de las células tumorales Lgr5+ también se activan tras la plasticidad progresiva inducida por la deleción de Tcf7 o Lef1.

Para explorar si las muestras de pacientes con CRC y una puntuación baja de señalización WNT canónica muestran una alta puntuación de transplasticidad, exploramos estas correlaciones en los datos de microarrays derivados de pacientes con CRC (GSE39582) (^[30]). Como se esperaba, encontramos la puntuación más alta del epitelio intestinal canónico (puntuación HiCol: 10) en las muestras de pacientes con la puntuación WNT más alta (fig. S5A). En contraste, la puntuación escamosa más alta (puntuación HiSquam: 10) se encontró en las células con la puntuación WNT más baja (fig. S5B). En línea con esto, las muestras con la expresión más baja de TCF7 también mostraron la puntuación más baja del epitelio intestinal canónico y la puntuación HiSquam (fig. S5, C y D). Sin embargo, no se encontró ninguna correlación entre la expresión de LEF1 y las puntuaciones del epitelio intestinal canónico o escamoso (fig. S5, E y F). En conjunto, encontramos una correlación negativa entre WNT/TCF7 y la firma de plasticidad escamosa también en las muestras de pacientes con CRC.

Los genes que codifican las subunidades de AP-1 se activan tras la deleción de Tcf7 o Lef1

Para explorar cómo la programación oncofetal se ve afectada por la deleción de los efectores de Wnt, analizamos la accesibilidad de la cromatina en los tumores LApcLef1 y LApc utilizando un ensayo de secuenciación de cromatina accesible para la transposasa (ATAC-seq). Descubrimos que la deleción de Lef1 aumentó la accesibilidad de la cromatina en los motivos del factor de transcripción (TF) de las subunidades de AP-1 Fos, Fosl2, Jun, Batf, Fosl1, Jund y Junb, que son impulsores de la reprogramación oncofetal (^[9]), y múltiples miembros de la familia Sox, incluido Sox17 (Fig. 3A). También encontramos una disminución de la accesibilidad de la cromatina en los motivos TF de Hnf4a, Nr2f6, Rxra, Ppard y Rxrg, que actúan como protectores de las características del epitelio intestinal canónico (Fig. 3B) (^[9]). Además, exploramos el análisis de enriquecimiento de motivos TF publicado de los datos de ATAC-seq de pacientes con CRC enviados a The Cancer Genome Atlas (^[10]) y encontramos una pérdida de accesibilidad en los sitios que contenían motivos para TCF7 y LEF1 en pacientes con una alta firma génica escamosa, lo que apoya nuestros hallazgos.

Para investigar si los cambios en la accesibilidad de la cromatina de los motivos TF se correlacionan con cambios en la expresión de ARN, analizamos los datos de scRNA-seq de las muestras WT, LApc, LApcT y LApcLef1. En línea con los resultados de ATAC-seq, varios marcadores oncofetales, incluidos, por ejemplo, Yap1, Anxa1, Fos, Fosl1 y miembros de la familia Sox (por ejemplo, Sox4, Sox13 y Sox17), se expresaron más en las células LApcT y LApcLef1 que en las células tumorales LApc (Fig. 3C y fig. S6). Sin embargo, a pesar de la disminución de la accesibilidad de la cromatina de sus motivos TF, las transcripciones de Hnf4a, Nr2f6, Rxra, Ppard y Rxrg no disminuyeron en las muestras LApcT o LApcLef1 en comparación con las muestras LApc (fig. S7A). En general, estos resultados indicaron aún más que Tcf7 y Lef1 suprimen la plasticidad progresiva en los adenomas intestinales.

Dado que las subunidades del complejo AP-1 también funcionan como efectores de la vía de señalización no canónica de Wnt/polaridad celular planar (PCP) (^[31]), investigamos si la deleción de Tcf7 o Lef1 impulsa la expresión de componentes adicionales de la señalización no canónica de Wnt que pertenecen a las vías Wnt/PCP o Wnt/Ca2+. En los datos de scRNA-seq del tumor, la puntuación de enriquecimiento del módulo (Materiales y métodos) para la señalización no canónica de Wnt aumentó especialmente en los grupos de células específicas del tumor tras la deleción de Tcf7 o Lef1 (fig. S7B). Estos resultados sugieren un aumento de la activación de la señalización no canónica de Wnt en asociación con la plasticidad progresiva.

La mutación de Kras suprime la expresión de Lef1 y Prox1 en los adenomas intestinales

Se ha sugerido que, en el CRC, la supresión del estado tumoral canónico Wnt-alto permite la reprogramación oncofetal, lo que conduce a un estado celular no canónico que impulsa la progresión del CRC (^[9]). Aunque se han informado de factores genéticos y no genéticos que impulsan dicha reprogramación (^[8]–^[10]), los mecanismos que inician la reprogramación de la plasticidad no se comprenden completamente. Dado que las mutaciones de pérdida de función en los efectores de la vía WNT, TCF7 y LEF1, son raras en pacientes con CRC (^[8]), la pérdida de la actividad de la vía WNT canónica debe estar impulsada por otros factores. Se ha demostrado que las mutaciones de Kras cambian la activación canónica de Wnt de un estado hiperactivo a un estado hipoactivo en modelos preclínicos de tumores intestinales (^[32]). Para evaluar si la Kras mutante afecta la expresión del factor 1 de las células T (Tcf1) y Lef1, los marcamos en secciones de tumores de ratones ApcMin/+ y ApcMin/+; KrasLSL-G12D/+; Villin-CreERT2 (fig. S8A). También marcamos las secciones para Prox1, que es un gen diana de Wnt expresado en gran medida por los tumores de CRC mutantes de Apc (^[21], ^[33]) y que se expresa en las células madre tumorales de ApcMin/+ y CRC (^[22], ^[23]). En línea con el estado hipoactivo de la señalización canónica de Wnt tras la mutación de Kras, encontramos una disminución de la expresión de Lef1 y Prox1, pero no de Tcf1, en los tumores mutantes de Kras (fig. S8, de la B a la G). Para evaluar esto aún más en muestras de pacientes con CRC, analizamos los datos de microarrays de muestras de pacientes con subtipos moleculares consensuados (CMS) de CRC (GSE39582) (^[30]). Encontramos que, en los tumores del subtipo CMS3, que se caracterizan por la mutación de KRAS, la expresión de LEF1 era menor que en los otros subtipos CMS (^[28], ^[34]). Además, la expresión de TCF7 era menor en las muestras CMS3 en comparación con las muestras CMS2 con alta expresión de Wnt (fig. S8H). En resumen, nuestros resultados de tumores de ratón y los datos de pacientes con CRC indican que las mutaciones de KRAS realmente impulsan un estado hipoactivo de la vía Wnt canónica en el CRC.

La expresión de Prox1 disminuye tras la deleción de Tcf7 o Lef1

Aunque los datos previos de un modelo de tumores intestinales de ratón preclínico indicaron una función prometastásica para Prox1 (^[35]), otro estudio mostró un aumento de los marcadores de plasticidad translineal tras el silenciamiento de PROX1 en organoides derivados de pacientes con CRC (^[8]). Para estudiar los efectos de la deleción de Tcf7 o Lef1 en la expresión de Prox1, marcamos las secciones de tumores de ratón para Prox1 y para la anexina A1 (Anxa1), un marcador de la reprogramación oncofetal y un gen regulado negativamente por Prox1 (^[9], ^[22]), y para el homeobox Msh 1 (Msx1), un marcador de osteoblastos no canónicos (^[8]). De manera similar, como en las muestras con deleción de Lef1 (^[28]), encontramos una disminución marcada de Prox1 y un aumento de Msx1 y la expresión de Anxa1 en los tumores con deleción de Tcf7 (fig. 4, de la A a la E, y tabla S4). Si bien las células Anxa1+ eran principalmente negativas para Prox1 en las secciones de tumores marcadas y en el análisis de secuenciación de ARN de células únicas (scRNA-seq) de las células en los grupos específicos del tumor, las células tumorales Msx1+ eran fuertemente Prox1+ y principalmente Anxa1− en los datos de scRNA-seq. La expresión de Msx1 se encontró principalmente en las células tumorales Anxa1− (fig. 4, de la F a la G). En conjunto, estos resultados indican que la deleción de Tcf7 y Lef1 suprime la expresión de Prox1 y sugieren que las células oncofetales y similares a osteoblastos marcadas por Anxa1+ y Msx1+, respectivamente, representan poblaciones celulares tumorales distintas.

Inhibición del compromiso de la línea de células madre tumorales Lgr5+ tras una plasticidad progresiva

Anteriormente, informamos que las células Lgr5+ en los tumores ApcMin/+ se diferencian predominantemente en células tumorales similares a enterocitos (^[23]). El análisis de la proporción de tipos celulares de las muestras de tumores mostró una disminución de la población de células similares a enterocitos tanto en los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1, lo que sugiere una plasticidad intralineal y una diferenciación bloqueada (78 y 11% en el análisis de LApc frente a LApcT, respectivamente; 35 y 12% en el análisis de LApc frente a LApcLef1, respectivamente) (fig. 5A). La diferenciación intestinal se correlaciona negativamente con una puntuación aberrante de células madre en el CRC (^[26], ^[36]). Por lo tanto, cuantificamos esta puntuación utilizando el enriquecimiento de módulos (Materiales y métodos) y encontramos que estaba aumentada en las muestras con deleción de Tcf7 o Lef1 en comparación con las muestras de control, lo que sugiere una reducción de la diferenciación de las células tumorales (fig. 5, de la B a la C). Dado que nuestro análisis de LApcT incluye un trazador de la línea tdTomato y dado que las deleciones se indujeron en las células Lgr5+, evaluamos la proporción de células hijas Lgr5−; tdTomato+ dentro de la población de células tumorales. Encontramos una disminución del 20% en las células hijas Lgr5−; tdTomato+ en las muestras de LApcT en comparación con las muestras de LApc, lo que proporciona evidencia adicional de la inhibición de la diferenciación de las células tumorales (fig. 5D). Para analizar más a fondo los cambios en las trayectorias de las células tumorales, analizamos el pseudotiempo utilizando el paquete Monocle3 (RRID:SCR018685) (^[37]–^[40]) y encontramos una mayor proporción de células con un valor de pseudotiempo bajo en las muestras de LApcT o LApcLef1 en comparación con los tumores de LApc (fig. 5, de la E a la H). Para encontrar una explicación para la diferenciación inhibida, analizamos los genes diferencialmente expresados (DEG) entre las muestras de LApc y LApcT o LApcLef1. Entre los DEG regulados al alza en las muestras con deleción de Tcf7 o Lef1, encontramos transcritos que codifican genes que funcionan como inhibidores de la diferenciación de las células tumorales, incluidos, por ejemplo, inhibidores de la diferenciación 1, 2 y 3 (Id1/2/3_) y Sox9 (^[25], ^[26]). La expresión de estos genes aumentó tanto en las muestras de LApcT como de LApcLef1, especialmente en los grupos específicos del tumor y en las células madre y progenitoras (fig. 5I). En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de una diferenciación celular tumoral alterada de las células madre tumorales Lgr5+ tras una plasticidad intralineal progresiva.

Para analizar la población de células tumorales similares a enterocitos en las muestras de tumores aisladas de los pacientes, cuantificamos las proporciones de células similares a enterocitos a partir de tejido sano, pólipos de FAP y muestras de carcinoma (fig. 1A y fig. S1B). Además, analizamos los DEG entre las muestras de pólipos y carcinoma. Como se esperaba, muchos de los programas de plasticidad translineal se enriquecieron en las muestras de carcinoma en comparación con los pólipos, lo que refleja la progresión de la enfermedad. Además, en línea con nuestros datos de adenoma de ratón, la población total de células similares a enterocitos disminuyó en las muestras de pólipos y carcinoma en comparación con las muestras de tejido sano, pero no entre las muestras de pólipos y carcinoma (fig. S1B). Sin embargo, la positividad de EMP1 aumentó con la progresión de la enfermedad, ya que el 63 y el 92% de las células similares a enterocitos expresaron EMP1 en las muestras de pólipos y carcinoma, respectivamente. Esto es de interés, ya que EMP1 se asocia con la plasticidad y un mal pronóstico en pacientes con CRC (^[19], ^[41]).

El aumento de la plasticidad asociado con la proliferación de células tumorales y el crecimiento tumoral depende de Myc

Para investigar si la deleción de Tcf7 inducida por la plasticidad progresiva se asocia con una mayor tumorigenesis de manera similar a lo que ocurre tras la deleción de Lef1 (^[28]), realizamos un análisis de supervivencia en los ratones LApcT y LApc. La deleción de Tcf7 condujo a una disminución marcada de la supervivencia de los ratones LApcT en comparación con los ratones LApc, lo que resultó en una vida media de 24 y 68 días, respectivamente (fig. 6A), lo que confirma que Tcf7 también inhibe la tumorigenesis en los ratones Apc mutantes. Este hallazgo se respaldó con un aumento de la expresión de Mki67 y la proporción de células proliferantes en las muestras con deleción de Tcf7 (16, 6 y 32% en las muestras de WT, LApc y LApcT, respectivamente) (fig. 6B). En consecuencia, en las muestras de WT, LApc y LApcLef1, las proporciones de células proliferantes fueron 19, 16 y 49% (fig. S3C). Además, el GSEA de los DEG reveló una mayor actividad de las vías de Myc, E2F y G2-M en los tumores con deleción de Tcf7 (fig. 6, de la C a la D). En línea con esto, al analizar las células Tcf7+; Lef1+ de doble positividad y las células Tcf7−; Lef1− de doble negatividad en los tumores de control LApc, encontramos una actividad de Myc suprimida en las células de doble positividad (fig. 6E). Además, observamos un aumento de la tinción de inmunofluorescencia de Myc y la incorporación de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) en las secciones de tumores de LApcT en comparación con las muestras de LApc, de manera similar a lo que se informó previamente para las muestras de LApcLef1 (fig. 6, de la F a la G) (^[28]). Para confirmar que Myc estaba involucrado en el aumento de la tumorigenesis, aislamos organoides de ratones LApc y LApcT 29 y 19 días después de las deleciones génicas in vivo, respectivamente. Como se esperaba, el tamaño promedio de los organoides con deleción de Tcf7 fue mayor que el de los organoides de control (fig. 6H). Sin embargo, esta diferencia se eliminó con el tratamiento con el inhibidor de Myc EN4 (fig. 6H) (^[42]). Estos resultados indican un papel vital de Myc en la promoción del crecimiento tumoral tras una plasticidad progresiva.

Una alta expresión de TCF7 atenúa el impacto pronóstico adverso de la plasticidad translineal

Aunque los programas individuales de plasticidad translineal se asocian con la recurrencia tumoral y la supervivencia en pacientes con CRC (^[8]), no se conoce una posible correlación entre las firmas oncofetales y la supervivencia. Además, falta una firma génica general de plasticidad translineal con un número limitado de genes derivados de marcadores oncofetales y de plasticidad no canónicos. Para identificar genes pronósticos asociados con la supervivencia libre de recurrencia (RFS) y la supervivencia general (OS), reanalizamos una cohorte publicada de pacientes con CRC (GSE39582) (^[30]) y realizamos un análisis de múltiples pasos que combinó datos de expresión génica con resultados clínicos (Materiales y métodos). Esto nos permitió generar firmas de plasticidad translineal y oncofetal para los análisis de RFS y OS (fig. 7A). Encontramos que las firmas de plasticidad translineal y oncofetal se correlacionaron negativamente con la RFS y la OS, ya que la peor supervivencia se encontró en pacientes con la puntuación de plasticidad translineal u oncofetal más alta (fig. 7, de la B a la C, y fig. S9, de la A a la B).

Además, analizamos si la expresión de TCF7 o LEF1 junto con la puntuación de plasticidad translineal se correlaciona con la supervivencia del paciente. Para ello, estratificamos las muestras en función de su expresión génica cuantil y su puntuación de plasticidad translineal, y en función de esto, asignamos a cada muestra una etiqueta combinada que representa tanto su expresión génica como su puntuación de plasticidad translineal cuantil (por ejemplo, Q1Q1; Materiales y métodos y fig. 7D). Si bien la expresión de LEF1 no se correlacionó con la RFS o la OS (fig. S9, de la C a la D), el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para TCF7 mostró que los pacientes en el grupo Q1Q4, caracterizados por la expresión más baja de TCF7 y la puntuación de plasticidad translineal más alta, tenían la peor OS y una tendencia a una peor RFS (fig. 7, de la E a la F).

DISCUSIÓN

Aquí, mostramos la PCS en las células madre tumorales PROX1+ en pólipos de CRC humanos y adenomas intestinales de ratón, lo que indica que la plasticidad translineal se asocia con el desarrollo temprano del CRC. Además, la deleción homozygous del mediador de la señalización de Wnt, Tcf7 o Lef1, junto con la deleción de Apc en las células Lgr5+, resultó en una plasticidad progresiva de las células de adenoma. La deleción de Tcf7 o Lef1 en las células Lgr5+ resultó en la pérdida de su compromiso de línea hacia las células tumorales similares a enterocitos, lo que refleja una plasticidad intralineal. También demostramos que la mayor tumorigenesis tras estas deleciones está mediada por una mayor señalización de Myc. Además, mostramos que los pacientes con CRC con la expresión más baja de TCF7 y la puntuación de plasticidad translineal más alta tienen la peor OS. En resumen, mostramos que la plasticidad no es solo una característica de los CRC avanzados, sino que está presente ya en las células madre tumorales de los pólipos de colon y los adenomas de ratón, y que la plasticidad progresiva impulsada por la pérdida de la vía canónica de Wnt resulta en una falla de la diferenciación de las células madre tumorales Lgr5+ y una mayor tumorigenesis dependiente de Myc (fig. 8).

Aunque la activación patológica de la señalización Wnt/β-catenina es el evento iniciador más común en pacientes con CRC (^[11], ^[12], ^[14]), demostramos aquí que la señalización Wnt/β-catenina a través de Tcf7 y Lef1 restringe la proliferación de las células tumorales. La deleción de Tcf7 o Lef1 en células tumorales mutantes de Apc resultó en un aumento notable de la proliferación de las células tumorales, lo que condujo a una vida útil más corta de los ratones. Ambas deleciones génicas condujeron a una disminución de la expresión de los genes diana canónicos de Wnt, lo que confirmó la conversión de un estado hiperactivo de Wnt canónico a un estado hipoactivo de Wnt canónico. Sin embargo, también encontramos un aumento de la expresión de los componentes de las vías no canónicas Wnt/Ca2+ y Wnt/PCP tras la deleción de Tcf7 o Lef1 en el análisis scRNA-seq, lo que sugiere una mayor señalización Wnt no canónica durante la plasticidad progresiva. Se necesitan estudios adicionales para revelar los mecanismos involucrados en esta activación y el resultado funcional del aumento de la señalización Wnt no canónica. El posible papel de la Wnt no canónica en la plasticidad progresiva es intrigante, ya que se ha relacionado con la invasión, la supervivencia y la metástasis (^[31], ^[43], ^[44]).

Hasta ahora, no ha estado claro si el proceso de plasticidad también afecta a las células madre tumorales. Se ha informado de una covariación entre la alta expresión de PROX1 y los marcadores de plasticidad translinaje mediante el análisis de secuenciación de ARN de dos cohortes distintas de pacientes con CRC (^[8], ^[45]). Sin embargo, el silenciamiento de PROX1 resultó en un aumento de la expresión de los marcadores de plasticidad translinaje en organoides derivados de pacientes con CRC que presentaban una fuerte firma epitelial intestinal canónica (^[8]). Aquí, mostramos que las células madre intestinales humanas polipoides y adenomatosas de ratón mutantes PROX1+ APC expresan múltiples marcadores de plasticidad translinaje, lo que indica su PCS. Además, mostramos una disminución, pero no una abolición completa, de la expresión de Prox1 en las células tumorales con deleción de Tcf7 o Lef1. Además, el marcador oncofetal Anxa1 se expresó principalmente en las células Prox1−. Esto concuerda con nuestro estudio previo que describe un aumento de la expresión de Anxa1 tras la deleción o el silenciamiento de Prox1 en tumores mutantes de Apc y líneas celulares de CRC, y una tinción mutuamente excluyente de ANXA1 y PROX1 en secciones de tejido de CRC (^[22]). En contraste, las células tumorales que expresan el marcador de osteoblastos Msx1 mostraron una alta expresión de Prox1, incluso en las muestras tumorales con deleción de Tcf7 o Lef1. En conjunto, mostramos que las células oncofetales Anxa1+ y las células similares a osteoblastos Msx1+ (y Prox1+) son dos poblaciones celulares tumorales distintas, lo que sugiere que la expresión de Prox1 difiere entre los distintos programas de plasticidad translinaje. Por lo tanto, definir las funciones dependientes del contexto de Prox1 en los programas de plasticidad Wnt y no canónica representa un desafío importante pendiente.

Estudios previos han demostrado que las células tumorales Lgr5+ funcionan como células madre tumorales (^[15]–^[17], ^[23], ^[46]). Aunque las células madre Lgr5+ dan lugar a múltiples linajes de células tumorales en tumores ApcMin/+, su progenie consiste predominantemente en células tumorales similares a enterocitos (^[23]). En consonancia con esto, la deleción de Tcf7 o Lef1 en las células Lgr5+ resultó en una disminución de la proporción de progenie Lgr5−; tdTomato+ y células tumorales similares a enterocitos, lo que se asoció con un aumento de la expresión de inhibidores de la diferenciación, incluidos, por ejemplo, Id1-Id3 y Sox9 en los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1. Cabe destacar que no se encontraron cambios significativos en las poblaciones de células secretoras tras la deleción de Tcf7 o Lef1. Nuestros resultados sobre las células similares a enterocitos concuerdan con la inhibición de la diferenciación como un evento iniciador que precede al desarrollo del CRC (^[26]). Además, estos resultados y nuestro hallazgo de un aumento de la expresión de genes oncofetales tras la deleción de Tcf7 o Lef1 concuerdan con los datos publicados que muestran que Sox9 media la diferenciación epitelial intestinal alterada y promueve la reactivación de los genes intestinales fetales durante la tumorigénesis (^[26], ^[36]). Se ha demostrado que la transición entre la actividad similar a la de las células madre y la diferenciación en el CRC está controlada por reguladores epigenéticos [SMARCB1 del complejo BAF asociado a BRG1/BRM], lo que apoya nuestros hallazgos de modificaciones en la accesibilidad de la cromatina de los impulsores oncofetales y los protectores epiteliales intestinales (^[36]). Un estudio que describe la transformación maligna de pólipos a carcinoma mostró una disminución de las poblaciones de enterocitos en las muestras de pacientes (^[27]). Nuestro reanálisis, que incluyó estas muestras y muestras tumorales adicionales, confirmó este resultado. En general, nuestros resultados indican que el estado tumoral dependiente de la Wnt canónica es necesario para la diferenciación de las células madre tumorales Lgr5+ en células similares a enterocitos y que tanto las muestras tumorales humanas como las de ratón muestran una disminución de las poblaciones de células tumorales similares a enterocitos tras la plasticidad intralinaje progresiva.

La deleción de Lef1 se asoció con una reducción de la accesibilidad de la cromatina en los motivos TF de múltiples protectores del linaje epitelial intestinal, por ejemplo, Hnf4a, Rxra y Ppard. Este resultado concuerda con un estudio publicado que muestra una disminución de la accesibilidad de la cromatina de estos genes durante la plasticidad progresiva (^[9]). Sin embargo, en el presente estudio, estos genes no mostraron una disminución de la expresión según nuestros datos de secuenciación de ARN de células únicas. Por otro lado, encontramos un aumento de la accesibilidad de la cromatina de los motivos TF oncofetales y la expresión de genes oncofetales, incluidos, por ejemplo, Yap1 y los genes que codifican múltiples subunidades AP-1 en los tumores con deleción de Tcf7 o Lef1, lo que concuerda con los datos publicados (^[9]). También encontramos un aumento de la accesibilidad de la cromatina de los motivos TF y la expresión de los marcadores de plasticidad translinaje y múltiples miembros de la familia Sox, como Sox9 y Sox17, tras la deleción de Tcf7 o Lef1. Estos datos indican que la pérdida de la Wnt canónica mediante la deleción de Tcf7 o Lef1 en las células tumorales mutantes de Apc imita los efectos sobre la accesibilidad de la cromatina que se han informado en modelos tumorales de ratón preclínicos más avanzados (^[9]).

Aunque se han investigado intensamente otros reguladores de la plasticidad, sus efectores posteriores y los objetivos farmacológicos siguen siendo en gran medida desconocidos. Aquí, encontramos un aumento de la expresión de Myc en los tumores con deleción de Tcf7, lo que concuerda con nuestros resultados previos con respecto a la deleción de Lef1 (^[28]). Encontramos que el aumento del crecimiento de los organoides inducido por la deleción de Tcf7 se inhibió mediante la inhibición de Myc, lo que indica que Myc tiene un papel vital en la proliferación de las células tumorales asociada con la plasticidad progresiva. Esto es consistente con un estudio previo que muestra un aumento de la señalización de Myc después del agotamiento de las células Lgr5+ en los organoides ApcMin/+;Lgr5DTR/eGFP;VillinCre;KrasLSL-G12D (^[20]). Además, la expresión de Sox17, un objetivo directo de Myc (^[47]), también aumentó en las muestras tumorales con deleción de Tcf7 o Lef1 (^[28]). Dado que Sox17 aumenta el crecimiento tumoral al mediar la evasión inmune tumoral en la fase temprana del CRC (^[48]), los estudios adicionales que exploren la inhibición de la progresión tumoral mediante la focalización de la señalización de Myc en el contexto de la plasticidad de las células tumorales y la evasión inmune serán de interés. Además, dado que la inhibición de Myc en los organoides intestinales fetales sanos aumentó la proporción de células enterocíticas, se necesitan estudios adicionales para explorar si la señalización de Myc podría afectar directamente a la pérdida de la población similar a enterocitos durante la plasticidad progresiva (^[49]).

Las reprogramaciones individuales de la plasticidad translinaje se han relacionado tanto con la supervivencia libre de recurrencia como con la supervivencia global (^[8]). Aquí, utilizando solo un número limitado de genes, diseñamos una firma génica de plasticidad translinaje simple y específica que podría ser adecuada para fines pronósticos. Validamos su importancia en una cohorte de pacientes con CRC que no se ha utilizado en estudios previos que exploran la correlación entre la plasticidad y la supervivencia. Encontramos que esta firma génica se correlaciona inversamente con la supervivencia, y los pacientes con las puntuaciones de plasticidad translinaje más altas presentan los peores resultados. Además, observamos que la alta expresión de TCF7 se correlacionó positivamente con la supervivencia global en pacientes con altas puntuaciones de plasticidad translinaje, lo que subraya la relevancia clínica de nuestros hallazgos obtenidos de los modelos de ratón preclínicos. Sin embargo, no encontramos una correlación general entre la expresión de LEF1 y la supervivencia, lo que sugiere que otras mutaciones o cambios a nivel de la cromatina pueden afectar a la supervivencia relacionada con LEF1 en las etapas tardías del CRC.

En conclusión, mostramos que la señalización de la Wnt canónica reprime tanto la plasticidad intra- como translinaje progresiva al mantener el compromiso del linaje homeostático de las células Lgr5+. Sin embargo, dado que las células madre tumorales en pólipos y adenomas muestran una alta expresión de los genes diana de la Wnt canónica y los marcadores de plasticidad translinaje, el papel de la señalización de la Wnt canónica en el control de la plasticidad es más complejo de lo que se ha descrito hasta ahora.

MATERIALES Y MÉTODOS

Experimentos con animales

Todos los experimentos in vivo fueron aprobados por la Agencia Estatal de Administración Regional de Finlandia (ESAVI/22643/2022 y ESAVI/22042/2019). Los experimentos cumplieron con las directrices y recomendaciones de la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Laboratorio con respecto a los aspectos del alojamiento de animales, el tratamiento y los criterios de eutanasia (pérdida de peso máxima del 15%, signos de angustia y sangre en las heces). Los ratones se alojaron en instalaciones de monitoreo y tuvieron acceso ilimitado a alimentos y agua. Los genotipos de los ratones se verificaron a partir de muestras de oreja dos veces antes del experimento y una vez a partir de una muestra de cola recolectada después de la eutanasia. Se utilizaron las siguientes líneas de ratones con fondo C57BL/6 (RRID:MGI:5656552): Tcf7GFP flox (^[52]) (The Jackson Laboratory, número de stock 030909, RRID:IMSRJAX:030909), Lef1fl/fl (^[53]), Lgr5-EGFP-IRES-CreERT (^[17]), Apcfl/fl (^[54]), CAG-FLPe (^[55]), Rosa26LSL-TdTomato (^[56]) (The Jackson Laboratory, número de stock 021875, RRID:IMSRJAX:021875), ApcMin/+ (^[57]) (The Jackson Laboratory, número de stock 002020), KrasLSL-G12D/+ (^[58]) y Villin-CreERT2 (^[59]) (The Jackson Laboratory, número de stock 020282). Todos los experimentos se realizaron tres veces con cohortes independientes de aproximadamente el mismo número de ratones machos y hembras.

Para inducir la deleción de genes marcados con LoxP mediada por CreERT2, se administraron 2 mg de tamoxifeno (#T5648, Sigma-Aldrich) disueltos en aceite de maíz mediante inyección intragástrica durante dos o tres días consecutivos. Los ratones recibieron 0,1 mg de EdU (Invitrogen, A10044) disuelto en solución salina al 0,9% mediante inyección intraperitoneal aproximadamente 4 horas antes de la eutanasia.### Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa

El ADN se extrajo de muestras de tejido de oreja, cola e intestino de ratón añadiendo 50 μl de hidróxido de sodio 50 mM (S/4920/60, Fisher Chemical) a las muestras de tejido e incubando a 95 °C durante 10 min. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la mezcla de genotipado PCR KAPA2G Fast HotStart (KK562107961316001, Kapa Biosystems) y un termociclador Applied Biosystems 2720 con el siguiente programa: 3 min a 95 °C, 35 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 52 °/60 °C y de 15 a 60 s a 72 °C, seguido de 3 min a 72 °C y ∞ a 4 °C. Cuando se utilizaron los cebadores Prox1-CreERT2, se utilizó un protocolo de PCR de "touchdown": desnaturalización inicial durante 2 min a 95 °C, 10 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 65,0 Δ–0,5 °C y 15 s a 68 °C (touchdown), seguido de 28 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 60 °C y de 15 a 60 s a 72 °C, terminando con una etapa de extensión final de 3 min a 72 °C y ∞ a 10 °C. Los cebadores de genotipado utilizados se enumeran en la tabla S5. Los fragmentos de PCR se electroforetizaron en un gel de agarosa al 3 % (BIO-41025, Meridian Bioscience) a 300 V durante 30 a 45 min. La longitud del amplicón se estimó por comparación con la escala de ADN GeneRuler lista para usar de 100 pares de bases (pb) (SM0243, Thermo Fisher Scientific).### Clasificación de células tumorales para scRNA-seq

La clasificación de células tumorales Epcam+ LApc y LApcLef1 para el análisis de scRNA-seq publicado anteriormente se realizó 29 (LApc) o 21 (LApcLef1) días después de la primera dosis de tamoxifeno (tabla S2A) (^[28]). En los experimentos de supervivencia LApc frente a LApcT, los primeros ratones LApcT tuvieron que ser sacrificados debido a problemas de bienestar relacionados con el tumor en el día 20 y los últimos en el día 30, mientras que los días correspondientes para los ratones LApc fueron los días 38 y 115. Esto requirió la finalización y el muestreo del análisis de los ratones LApcT en el día 19, lo cual fue demasiado pronto para los ratones LApc que tenían una menor carga tumoral. Para comparar ratones con una carga tumoral similar, elegimos los días 19 y 68 para el sacrificio de los ratones LApcT y LApc, respectivamente. Teniendo en cuenta que esto podría influir en el fenotipo tumoral, aislamos células tumorales del intestino delgado de los ratones LApcT y LApc 19 y 29 días después de la administración de tamoxifeno, respectivamente, y realizamos una clasificación de células tdTomato+ mediante citometría de flujo (FACS) (tabla S2B).

Se abrieron los intestinos delgados de los ratones LApc y LApcT, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en 10 mM de EDTA en un agitador a 37 °C durante 10 min. Los tejidos se lavaron dos veces con PBS y las células se rasparon con un cubreobjetos de vidrio. Las células se centrifugaron luego a 1500 rpm durante 5 min, seguido de la incubación con una mezcla de digestión compuesta por solución salina tamponada con Hanks (HBSS) con Mg2+ y Ca2+ (#14025-050, Gibco) y suplementada con 1 mg/ml de colagenasa tipo I (#17100-017, Gibco), colagenasa tipo IV (1 mg/ml) (#17104-019, Gibco), 4 mg/ml de Dispase II (#04942078001, Sigma-Aldrich) y 1 μl/ml de desoxirribonucleasa 1 (#EN0521, Thermo Fisher Scientific) durante 30 a 40 min a 37 °C. Después de esto, se añadió medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y la suspensión celular se filtró a través de un filtro de 70 μm y dos veces a través de un filtro de 40 μm y se centrifugó durante 10 min a 1500 rpm. Las células tdTomato+ de los ratones LApc y LApcT se clasificaron utilizando BD Influx (BD Biosciences) para scRNA-seq y validación de la expresión génica. Un total de 10 000 células clasificadas se resuspendieron en HBSS que contenía 0,04 % de albúmina sérica bovina y se sometieron a Chromium X (RRID:SCR_024537).### Análisis de scRNA-seq

LApc, LApcT y LApcLef1

Las bibliotecas de muestras de cDNA se generaron después del análisis utilizando Chromium X y se secuenciaron en un secuenciador Illumina NovaSeq 6000 (RRID:SCR016387) en la Unidad de Análisis de Células Únicas del Instituto de Medicina Molecular de Finlandia (FIMM). Se utilizó Cell Ranger (versión 6.1.2, 7.0.0 o 7.0.1; RRID:SCR017344) para alinear las lecturas, cuantificar la expresión génica, generar referencias personalizadas y llamar a las células. Las lecturas se alinearon con el genoma de referencia del ratón, mm10. El análisis de datos se realizó utilizando RStudio (versión 4.2.2, RRID:SCR000432) siguiendo las instrucciones de Seurat versión 4 y 5 (RRID:SCR007322) (^[60], ^[61]). Para garantizar datos de alta calidad para el análisis posterior, aplicamos criterios de preprocesamiento estandarizados y control de calidad basados en los datos. Para las muestras internas, se excluyeron las células si tenían un contenido de genes mitocondriales > 15 %, un contenido de ARN ribosómico < 1 %, un número total de identificadores moleculares únicos (UMI) fuera del rango de 3000 a 85 000 o un número de genes detectados fuera del rango de 1000 a 8500. Las muestras WT obtenidas de Gene Expression Omnibus (GEO; GSE169197) (^[29]) se excluyeron si tenían un contenido de genes mitocondriales > 10 %, un número total de UMI > 80 000 o un número de genes detectados fuera del rango de 800 a 6500. Los genes que representan sesgos técnicos y contaminación de ARN ribosómico, incluidos Malat1, Gm26917, Gm42418 y AY36118, se excluyeron de los análisis posteriores. Las muestras individuales se normalizaron utilizando la función SCTransform en Seurat utilizando el método glmGamPoi, que tiene en cuenta la profundidad de secuenciación y otras variaciones técnicas (RRID:SCR022146) (^[62]). Los efectos de lote entre las muestras se corrigieron utilizando el método de integración de componentes principales recíprocos (RPCA). Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en el conjunto de datos integrado y los primeros 30 componentes principales identificados como significativos en función de la inspección de las visualizaciones de ElbowPlot y DimHeatmap se seleccionaron para el análisis posterior. La agrupación de células se realizó utilizando las funciones FindNeighbors y FindClusters (resolución = 1,6). Los genes utilizados para la identificación de grupos se enumeran en la tabla S3. El paquete R ScCustomize (RRID:SCR024675) (^[63]) se utilizó para visualizar los datos de scRNA-seq.

En los experimentos de scRNA-seq, se utilizaron dos estrategias diferentes basadas en FACS para aislar las células tumorales. En los experimentos de deleción de Lef1 [datos de scRNA-seq publicados anteriormente (^[28])], las células disociadas se clasificaron utilizando EpCAM, mientras que en los experimentos de deleción de Tcf7, la clasificación se realizó en función de la expresión de tdTomato. Además, dado que el experimento de deleción de Lef1 se realizó sustancialmente antes que los experimentos de deleción de Tcf7 y porque utilizó una química de reactivos 10x Genomics diferente (v2 frente a v3), los análisis de LApc frente a LApcT y LApc frente a LApcLef1 se realizaron por separado. Sin embargo, los resultados del análisis combinado con muestras WT, LApc, LApcT y LApcLef1 que confirman los principales hallazgos de los análisis individuales se presentan en la figura S10 y en la tabla S6. Número total de todas las células analizadas en el análisis WT-LApc-LApcT: WT: 12 550, LApc: 15 435 y LApcT: 10 609; y en el análisis WT-LApc-LApcLef1: WT: 10 949, LApc: 10 697 y LApcLef1: 16 281. Número de células tumorales en el análisis LApc-LApcT: LApc: 855 y LApcT: 3857; y en el análisis LApc-LApcLef1: LApc: 1466 y LApcLef1: 9115. Los datos de scRNA-seq brutos y procesados producidos en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE288156.### Muestras de tejido sano, pólipos de FAP y carcinomas

Las muestras de tejido sano, los pólipos de FAP y las muestras de carcinoma del conjunto de datos GSE201348 (^[27]) se integraron en un conjunto de datos que consta de muestras de carcinoma de intestino grueso de pacientes con CRC de inicio tardío (edad al diagnóstico ≥ 50 años) (^[8]). Número de células: sano: 8303; pólipo: 30 105; carcinoma: 3825. El procesamiento y el análisis de datos se realizaron utilizando Seurat v5 (RRID:SCR007322). Los objetos fusionados se normalizaron utilizando SCTransform, seguido de la reducción de dimensionalidad con RunPCA. La integración de muestras se realizó utilizando IntegrateLayers con el método RPCA. La agrupación de células se realizó utilizando FindNeighbors y FindClusters, y la visualización se generó utilizando RunUMAP, utilizando los primeros 35 componentes principales. Para los análisis posteriores, las células epiteliales (EPCAM > 0) se separaron de las células del estroma. Se realizaron una agrupación y una separación iterativas hasta que solo quedaron células epiteliales en el objeto Seurat. La anotación de grupos epiteliales se realizó utilizando GSEA con firmas génicas publicadas anteriormente que definen los tipos de células epiteliales intestinales sanas (^[8]). Las identidades de los grupos se asignaron en función de las firmas significativamente enriquecidas, y solo se retuvieron las anotaciones con un P ajustado < 0,05.### Análisis de TissueEnrich

El paquete R TissueEnrich (^[64]) se utilizó para caracterizar las células en los grupos tumorales específicos. Primero, buscamos DEG en las células tumorales específicas entre las muestras LApcLef1 y LApc, de las cuales se utilizaron aquellas con avglog2FC > 1,5 (n = 136) o < 1,5 (n = 800) para el análisis de TissueEnrich realizado con la configuración predeterminada. Se realizó un análisis similar en las células tumorales específicas de LApcT frente a LApc, pero para TissueEnrich, se utilizaron DEG con avglog2FC > 2,5 (n = 164) o < 1,5 (n = 1111). Los genes utilizados para el análisis se enumeran en la tabla S3.### Firmas génicas

Para analizar si la puntuación de WNT se correlaciona con las firmas HiCol o HiSquam (^[10]), cuantificamos la puntuación de WNT para cada muestra de paciente GSE39582 (^[30]) con ssGSEA [análisis de variación de conjuntos de genes (GSVA) R package (^[65])] utilizando la firma Hallmark de señalización de Wnt/β-catenina de MSigDB. Además, la expresión de TCF7 y LEF1 se correlacionó con las firmas HiCol y HiSquam. Para evaluar esto, dividimos las muestras de los pacientes en tres grupos en función de su puntuación de WNT y la expresión de TCF7 o LEF1: Q3, Q1-Q3 y Q1. Trazamos las firmas HiCol y HiSquam frente a estos grupos.### Análisis de la composición de células tumorales

Las diferencias en la composición celular entre las muestras LApc y LApcT se analizaron utilizando el marco bayesiano scCODA (versión 0.1.9) (^[66]). El grupo de células de Tuft (seleccionado automáticamente por la herramienta) y el grupo de células de Goblet se utilizaron como tipos de células de referencia. Este enfoque produce resultados consistentes, lo que demuestra la solidez de nuestros hallazgos. Se aplicó un umbral de tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,05 para distinguir los efectos creíbles de los efectos no creíbles, de acuerdo con la configuración predeterminada del paquete.### Generación de firmas génicas de plasticidad y su correlación con la supervivencia en pacientes con CRC

1) Selección y filtrado de genes: Comenzamos importando una lista predefinida de genes candidatos que contienen marcadores no canónicos (^[8]) y oncofetales (^[9]) (tabla S3). Estos genes se utilizaron luego para separar la matriz de expresión génica completa de GSE39582 (^[30]), conservando solo las filas que corresponden a los genes seleccionados. Para garantizar la relevancia biológica y reducir el ruido, eliminamos los genes con baja variabilidad en la expresión entre las muestras. Específicamente, calculamos la desviación estándar de la expresión para cada gen y conservamos solo aquellos con una desviación estándar > 0,5, lo que indica una variabilidad intermuestral suficiente.

2) Análisis de regresión de riesgos proporcionales univariado de Cox: El conjunto de genes filtrado se sometió a un análisis de regresión de riesgos proporcionales univariado de Cox para evaluar la asociación entre la expresión de cada gen y la supervivencia libre de recurrencia (SLR) o la supervivencia general (SG). Cada gen se probó de forma independiente utilizando el modelo de Cox, y los resultados se resumieron para extraer los valores de P, las razones de riesgo y los intervalos de confianza. Este paso permite la identificación de genes con un potencial significado pronóstico.

3) Regresión de Cox regularizada mediante Lasso: Dada la alta dimensionalidad de los datos de expresión génica y el riesgo de sobreajuste en los modelos multivariados, aplicamos la regresión de Cox penalizada LASSO utilizando el paquete glmnet (^[67]). Este método realiza simultáneamente la selección de variables y la regularización, identificando el subconjunto de genes más predictivo. La validación cruzada se utilizó para determinar el parámetro de penalización óptimo (lambda.min), y los genes con coeficientes distintos de cero en este lambda óptimo se consideraron significativos.

4) Cálculo del puntaje de riesgo y estratificación de la supervivencia. Utilizando los coeficientes derivados de Lasso y los datos de expresión génica, calculamos un puntaje de riesgo para cada paciente como una combinación lineal de las expresiones génicas seleccionadas, ponderadas por sus coeficientes del modelo. Los pacientes con CRC (n = 566) se estratificaron en cuartiles en función de sus puntajes de riesgo. Primero, los puntajes de riesgo se convirtieron en valores numéricos y luego se dividieron en cuatro grupos (Q1 a Q4) utilizando los percentiles 25, 50 y 75 como valores de corte. El cuartil 1 (Q1) representó a los pacientes con menor riesgo, mientras que el cuartil 4 (Q4) incluyó a aquellos con el mayor riesgo predicho. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en los cuatro grupos de cuartiles.

Estratificación conjunta de la expresión de TCF7/LEF1 y los puntajes de plasticidad para el análisis de supervivencia

Sobre la base de las firmas génicas de plasticidad RFS y OS, realizamos ssGSEA y calculamos los puntajes de la firma para cada paciente utilizando el método ssgseaParam. Los puntajes de enriquecimiento resultantes se normalizaron utilizando el algoritmo GSVA para obtener puntajes por muestra. Para cada firma, los pacientes se estratificaron en cuatro grupos (muy bajo, bajo, moderado, alto) en función de la distribución de cuartiles de sus puntajes ssGSEA. Los valores de corte de los cuartiles se calcularon individualmente para cada firma. Para explorar los efectos interactivos de la expresión a nivel del gen y los puntajes de plasticidad en la supervivencia del paciente, realizamos un análisis de estratificación combinada. Evaluamos TCF7 y LEF1 en las muestras de la matriz de expresión. Los valores de expresión se categorizaron en cuartiles (Q1 a Q4) para definir los niveles de actividad de TCF7 y LEF1. Luego, cada muestra se asignó a un grupo combinado que representa tanto su expresión de TCF7 o LEF1 como los cuartiles del puntaje de la firma de plasticidad RFS u OS (por ejemplo, Q1Lowest [expresión génica]Q4Highest [puntaje de plasticidad]). Nos centramos en cuatro combinaciones biológicamente informativas: (i) Q1Q1: tanto la expresión génica como el puntaje fueron bajos, (ii) Q4Q4: ambos fueron altos, (iii) Q1Q4: baja expresión génica y alta actividad de la vía, y (iv) Q4_Q1: alta expresión génica y baja actividad de la vía. Estas combinaciones nos permitieron investigar las relaciones aditivas o antagónicas entre los niveles de expresión génica y el puntaje de plasticidad en relación con los resultados de supervivencia analizados mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (^[68], ^[69]).

ATAC-seq

Se realizó ATAC-seq para las células tumorales tdTomato+ clasificadas por FACS (tabla S2C) de cuatro ratones LApc y cuatro ratones LApcLef1 siguiendo el protocolo Omni-ATAC-seq (^[70]). La transposición se realizó para 50.000 núcleos por muestra en triplicado (150.000 núcleos en total) para inducir la complejidad de la biblioteca. Los fragmentos de ADN de cada muestra se agruparon después de la transposición y se purificaron utilizando un kit Zymo DNA Clean and Concentrator-5 (número de catálogo D4014, Nordic BioSite). Las bibliotecas se amplificaron mediante PCR y se cuantificaron, y la calidad se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR; número de catálogo KK4824, KAPA Library Quantification Kit, Illumina) y TapeStation 2200 (Agilent Technologies). Las bibliotecas ATAC-seq se enviaron para secuenciación Illumina de 100 pares de bases, con el objetivo de obtener 80 millones de lecturas de pares de bases.

Se utilizó Cutadapt versión 1.18 (RRID:SCR011841) en Trim Galore versión 0.6.5 (RRID:SCR011847), con parámetros predeterminados, para el recorte de calidad y adaptadores. Las lecturas recortadas se alinearon al genoma de referencia mm10 utilizando Bowtie 2 versión 2.3.5 (RRID:SCR005476). Las lecturas con una calidad de mapeo inferior a 20 se filtraron, se contaron las lecturas mitocondriales y se eliminaron los duplicados de PCR utilizando Samtools versión 1.9 (RRID:SCR002105). Se utilizó MACS2 versión 2.1.4 para la llamada de picos. Creamos picos de ancho fijo que abarcan 250 pb desde el pico máximo llamado con el comando MACS2 callpeak con los parámetros “--shiff 75 --extsize 150 --nomodel --call-summits --nolambda --keep-dup all -p 0.01”.

La accesibilidad diferencial entre grupos se calculó utilizando DESeq2 versión 1.32.0 (RRID:SCR015687) con la configuración predeterminada y las estadísticas de Wald. Para obtener el número de inserciones de Tn5, los alineamientos de pares de bases correctamente emparejados se corrigieron para el desplazamiento de Tn5 (“+” hebra +4 pb, “−” hebra −5 pb) (^[71]). Se contaron las inserciones de Tn5 en picos no superpuestos, y se mantuvo en el análisis el pico con la puntuación de pico más alta, para todos los picos presentes en al menos dos muestras. Las regiones de accesibilidad diferencial (DAR) se definieron con una P ajustada de Benjamini-Hochberg (BH) < 0.05. El gen más cercano para cada DAR se anotó utilizando HOMER (RRID:SCR010881) annotatePeaks.pl contra la base de datos mm10 RefSeq (RRID:SCR_003496).

El enriquecimiento de los motivos TF en los DAR se calculó por separado para las regiones más accesibles [cambio de registro 2 (FC) > 0] y menos accesibles (FC < 0) utilizando el análisis de enriquecimiento simple (SEA) (^[72]) en MEME Suite (^[73]) con la configuración predeterminada. Los datos ATAC-seq brutos y procesados producidos en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE288156.

Procesamiento de tejidos e inmunohistoquímica

Las muestras de tejido fresco se congelaron en nitrógeno líquido o se fijaron durante la noche (o/n) con un 4% de paraformaldehído a 4 °C. Al día siguiente, se contaron los tumores y los intestinos se enrollaron en forma de rollos suizos, se deshidrataron durante la noche, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Las secciones de tejido se desparafinaron y se rehidrataron en los siguientes pasos: 3 × 5 minutos de lavado en Tissue-Clear (Tissue-Tek, #1466, Sakura), seguido de una serie de alcohol decreciente (2 × etanol absoluto, 2 × etanol al 96%, 1 × etanol al 70% y 1 × etanol al 50% durante 3 minutos cada uno). Esto fue seguido por la recuperación del antígeno inducida por calor con una solución de recuperación de objetivos de pH alto, 30 a 40 minutos de bloqueo con el tampón TNB (0,1 M tris-HCl, 0,15 M NaCl y 0,5% de reactivo de bloqueo TSA, NEL700001KT, PerkinElmer) a temperatura ambiente (TA) e incubación del anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Para el anticuerpo anti-c-Myc (RRID:AB731658), se utilizó un tampón de recuperación de objetivos basado en citrato de sodio de pH bajo (6), y el anticuerpo primario se incubó durante 48 horas. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-Tcf1 (1:100; #2203, Cell Signaling, RRID:AB2199302), conejo anti-Tcf1 (1:200; #MA5-14972, Thermo Fisher Scientific), cabra anti-Prox1 (1:200; AF2727, R&D Systems, RRID:AB2170716), conejo anti-Lyz1 (1:500; Dako A0099, RRID:AB2341230), cabra anti-Msx1 (1:200; AF5045, R&D Systems, RRID:AB2148804), conejo anti-Ki67 (1:200; ab16667, Abcam, RRID:AB302459), conejo anti-c-Myc (1:200; Abcam, ab32072, RRID:AB731658), conejo anti-Anxa1 (1:200; 71-3400, Invitrogen) y ratón anti-β-catenina (1:200; #0030773, BD Biosciences, RRID:AB305407). Para la detección de EdU, se utilizó el kit Click-IT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit (C10337, Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los datos de cuantificación específicos de cada tinción se presentan en la tabla S4.

Al día siguiente, las secciones se lavaron durante 3 × 5 minutos con TNT [0,1 M tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl y 0,05% de Tween 20], se incubaron en TNB-Alexa Fluor 488-, 594- y 647- (1:500; Invitrogen) conjugado con una mezcla de anticuerpos secundarios durante 60 minutos a TA, se lavaron nuevamente con TNT y agua Milli-Q, y se montaron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) que contiene el medio de montaje VECTASHIELD (#H-1200, Vector Laboratories, RRID:AB2336790) para contrateñir los núcleos y, finalmente, se sellaron bajo una cubierta con cytoseal (#8310-4, Thermo Fisher Scientific). Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia (Zeiss Axio Imager, RRID:SCR018876) equipado con una cámara Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT. Las imágenes originales se procesaron y analizaron utilizando el software Fiji (RRID:SCR_002285).

Tinción con hematoxilina y eosina

Las secciones de tejido se desparafinaron y se rehidrataron como se describió anteriormente, seguido de la incubación en agua MQ durante 1 minuto y en solución de hematoxilina (#1092492500, Merck) durante 1 a 2 minutos, se lavaron bajo agua corriente durante 10 minutos y se incubaron en una solución de stock de eosina al 1% en metanol durante 30 segundos. A continuación, las secciones de tejido en las láminas se deshidrataron en una serie de alcohol creciente (10 segundos en etanol al 70%, 1 minuto en etanol al 96%, 2 × 3 minutos en etanol absoluto y 3 × 5 minutos en Tissue-Clear). Las láminas se montaron con el medio de montaje Pertex (#00811, Histolab) y se visualizaron en campo claro utilizando un microscopio Zeiss Axio Imager (RRID:SCR_018876).

Aislamiento de RNA, síntesis de cDNA y qPCR

El aislamiento de RNA, la síntesis de cDNA y el qPCR se realizaron de manera similar, como se describió anteriormente (^[23]). En resumen, el aislamiento de RNA de las células tumorales se realizó utilizando un kit NucleoSpin RNA II Kit (#740955, Macherey-Nagel), el cDNA se sintetizó utilizando un kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, #4368814) y el análisis de expresión de transcritos de RNA se realizó utilizando qPCR (CFX96 Real-Time System) con un kit DyNAmo HS SYBR Green qPCR Kit (#F410XL, Thermo Fisher Scientific). Los cebadores utilizados para el qPCR se enumeran en la tabla S5.

Aislamiento y cultivo de organoides

Para inducir la tumorigénesis, se administraron 2 mg de tamoxifeno a los ratones LApc y LApcT durante dos días consecutivos. Después de 19 (LApcT) o 29 (LApc) días, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los intestinos delgados. Los tejidos intestinales se lavaron a fondo con PBS, se cortaron en pequeños fragmentos y se incubaron en 10 mM de EDTA durante 15 minutos a 4 °C. Después de un único lavado con PBS, los tejidos se sometieron a una segunda incubación en 10 mM de EDTA durante 45 minutos a 4 °C. Durante las incubaciones con EDTA, las muestras se agitaron vigorosamente cada 10 a 15 minutos.

Después de la incubación, los fragmentos de tejido se agitaron aún más y se dejaron reposar, y el sobrenadante que contenía los criptas liberadas se recolectó. El sobrenadante se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. Las criptas aisladas se incluyeron en Matrigel (#356231, Corning) y, después de la polimerización de Matrigel, las culturas se recubrieron con Advanced DMEM/F12 (#12634-010, Gibco) suplementado con B27 (#17504-044, Gibco), N2 (#17502-048, Gibco), 10 mM de Hepes (#BP310-1, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de N-acetilcisteína (#A-9165, Sigma-Aldrich), penicilina G (100 UI/ml)/sulfato de estreptomicina (100 μg/ml) (ECB001D, Euroclone) y 2 mM de l-glutamina (ECB3000D, Euroclone). Los experimentos se realizaron una vez que la formación y el crecimiento de los organoides se habían estabilizado.

Análisis estadístico

El número de réplicas técnicas y biológicas se indica en las leyendas de las figuras. Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario en la leyenda de la figura. GraphPad Prism (versión 9, RRID:SCR002798) y RStudio (versión 4.2.2, RRID:SCR000432) se utilizaron para los análisis estadísticos. Los análisis estadísticos que comparan grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student no pareada, la prueba de Mann-Whitney o el análisis de varianza (ANOVA) de dos vías. Los análisis estadísticos seleccionados se indican en las leyendas de las figuras. La significación estadística se indica mediante valores de P (*P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,005 y ****P < 0,001). RStudio (versión 4.2.2) se utilizó para los análisis estadísticos.

Experimentos con animales

Todos los experimentos in vivo fueron aprobados por la Agencia Regional de Administración Estatal de Finlandia (ESAVI/22643/2022 y ESAVI/22042/2019). Los experimentos cumplieron con las directrices y recomendaciones de la Federación de la Asociación Europea de Ciencia de Laboratorio Animal en lo que respecta a los aspectos del alojamiento, tratamiento y criterios de eutanasia de los animales (pérdida de peso máxima del 15%, signos de sufrimiento y sangre en las heces). Los ratones se alojaron en instalaciones de monitoreo y tuvieron acceso ilimitado a alimentos y agua. Los genotipos de los ratones se verificaron a partir de muestras de oreja dos veces antes del experimento y una vez a partir de una muestra de cola recolectada después de la eutanasia. Se utilizaron las siguientes líneas de ratones con antecedentes C57BL/6 (RRID:MGI:5656552): Tcf7GFP flox (^[52]) (The Jackson Laboratory, número de stock 030909, RRID:IMSRJAX:030909), Lef1fl/fl (^[53]), Lgr5-EGFP-IRES-CreERT (^[17]), Apcfl/fl (^[54]), CAG-FLPe (^[55]), Rosa26LSL-TdTomato (^[56]) (The Jackson Laboratory, número de stock 021875, RRID:IMSRJAX:021875), ApcMin/+ (^[57]) (The Jackson Laboratory, número de stock 002020), KrasLSL-G12D/+ (^[58]) y Villin-CreERT2 (^[59]) (The Jackson Laboratory, número de stock 020282). Todos los experimentos se realizaron tres veces con cohortes independientes de aproximadamente el mismo número de ratones machos y hembras.

Para inducir la deleción mediada por CreERT2 de los genes dirigidos por LoxP, se administraron 2 mg de tamoxifeno (#T5648, Sigma-Aldrich) disueltos en aceite de maíz mediante inyección intragástrica durante dos o tres días consecutivos. Los ratones recibieron 0,1 mg de EdU (Invitrogen, A10044) disuelto en solución salina al 0,9% mediante inyección intraperitoneal aproximadamente 4 horas antes de la eutanasia.

Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa

El ADN se extrajo de las muestras de tejido de oreja, cola e intestino de ratón agregando 50 μl de hidróxido de sodio al 50 mM (S/4920/60, Fisher Chemical) a las muestras de tejido e incubando a 95 °C durante 10 minutos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando la mezcla de genotipado PCR KAPA2G Fast HotStart (KK562107961316001, Kapa Biosystems) y un termociclador Applied Biosystems 2720 con el siguiente programa: 3 minutos a 95 °C, 35 ciclos de 15 segundos a 95 °C, 15 segundos a 52 °/60 °C y de 15 a 60 segundos a 72 °C, seguido de 3 minutos a 72 °C y ∞ a 4 °C. Cuando se utilizaron los cebadores Prox1-CreERT2, se utilizó un protocolo de PCR de "touchdown": desnaturalización inicial durante 2 minutos a 95 °C, 10 ciclos de 15 segundos a 95 °C, 15 segundos a 65,0 Δ–0,5 °C y 15 segundos a 68 °C (touchdown), seguido de 28 ciclos de 15 segundos a 95 °C, 15 segundos a 60 °C y de 15 a 60 segundos a 72 °C, terminando con una etapa de extensión final durante 3 minutos a 72 °C y ∞ a 10 °C. Los cebadores de genotipado utilizados se enumeran en la tabla S5. Los fragmentos de PCR se electroforesaron en un gel de agarosa al 3% (BIO-41025, Meridian Bioscience) a 300 V durante 30 a 45 minutos. La longitud del amplicón se estimó por comparación con la escala de ADN de 100 pares de bases (bp) lista para usar GeneRuler (SM0243, Thermo Fisher Scientific).

Clasificación de células tumorales para scRNA-seq

La clasificación de células tumorales Epcam+ LApc y LApcLef1 para el análisis scRNA-seq publicado anteriormente se realizó 29 (LApc) o 21 (LApcLef1) días después de la primera dosis de tamoxifeno (tabla S2A) (^[28]). En los experimentos de supervivencia LApc frente a LApcT, los primeros ratones LApcT tuvieron que ser sacrificados debido a problemas de bienestar relacionados con el tumor en el día 20 y los últimos en el día 30, mientras que los días correspondientes para los ratones LApc fueron los días 38 y 115. Esto requirió la finalización y el muestreo del análisis de los ratones LApcT en el día 19, lo cual fue demasiado pronto para los ratones LApc que tenían una carga tumoral menor. Para comparar ratones con una carga tumoral similar, elegimos los días 19 y 68 para el sacrificio de los ratones LApcT y LApc, respectivamente. Teniendo en cuenta que esto podría influir en el fenotipo tumoral, aislamos células tumorales de los intestinos delgados de los ratones LApcT y LApc 19 y 29 días después de la administración de tamoxifeno, respectivamente, y clasificamos mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) las células tdTomato+ (tabla S2B).

Se abrieron los intestinos delgados de los ratones LApc y LApcT, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en 10 mM de EDTA en un agitador a 37 °C durante 10 minutos. Los tejidos se lavaron dos veces con PBS y las células se rasparon con una cubierta de vidrio. Luego, las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, seguido de la incubación con una mezcla de digestión compuesta por solución salina tamponada con Hanks (HBSS) con Mg2+ y Ca2+ (#14025-050, Gibco) y suplementada con 1 mg/ml de colagenasa tipo I (#17100-017, Gibco), colagenasa tipo IV (1 mg/ml) (#17104-019, Gibco), 4 mg/ml de Dispase II (#04942078001, Sigma-Aldrich) y 1 μl/ml de desoxirribonucleasa 1 (#EN0521, Thermo Fisher Scientific) durante 30 a 40 minutos a 37 °C. Después de esto, se agregó medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y la suspensión celular se filtró a través de un filtro de 70 μm y dos veces a través de un filtro de 40 μm y se centrifugó durante 10 minutos a 1500 rpm. Las células tdTomato+ de los ratones LApc y LApcT se clasificaron utilizando BD Influx (BD Biosciences) para scRNA-seq y validación de la expresión génica. Un total de 10 000 células clasificadas se resuspendieron en HBSS que contenía 0,04% de albúmina sérica bovina y se sometieron a Chromium X (RRID:SCR_024537).

Análisis scRNA-seq

LApc, LApcT y LApcLef1

Las bibliotecas de muestra de cDNA se generaron después del análisis utilizando Chromium X y se secuenciaron en un secuenciador Illumina NovaSeq 6000 (RRID:SCR016387) en la Unidad de Análisis de Células Únicas del Instituto de Medicina Molecular de Finlandia (FIMM). Se utilizó Cell Ranger (versión 6.1.2, 7.0.0 o 7.0.1; RRID:SCR017344) para alinear las lecturas, cuantificar la expresión génica, generar referencias personalizadas y llamar a las células. Las lecturas se alinearon con el genoma de referencia del ratón, mm10. El análisis de datos se realizó utilizando RStudio (versión 4.2.2, RRID:SCR000432) siguiendo las instrucciones de Seurat versión 4 y 5 (RRID:SCR007322) (^[60], ^[61]). Para garantizar datos de alta calidad para el análisis posterior, aplicamos criterios de control de calidad estandarizados y basados en datos. Para las muestras internas, se excluyeron las células si tenían un contenido de genes mitocondriales > 15%, un contenido de ARN ribosómico < 1%, un número total de identificadores moleculares únicos (UMI) fuera del rango de 3000 a 85 000 o un número de genes detectados fuera del rango de 1000 a 8500. Las muestras WT obtenidas de Gene Expression Omnibus (GEO; GSE169197) (^[29]) se excluyeron si tenían un contenido de genes mitocondriales > 10%, un número total de UMI > 80 000 o un número de genes detectados fuera del rango de 800 a 6500. Los genes que representan sesgos técnicos y contaminación de ARN ribosómico, incluidos Malat1, Gm26917, Gm42418 y AY36118, se excluyeron de los análisis posteriores. Las muestras individuales se normalizaron utilizando la función SCTransform en Seurat utilizando el método glmGamPoi, que tiene en cuenta la profundidad de secuenciación y otras variaciones técnicas (RRID:SCR022146) (^[62]). Los efectos de lote entre las muestras se corrigieron utilizando el método de integración de componentes principales recíprocos (RPCA). Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en el conjunto de datos integrado y los primeros 30 componentes principales identificados como significativos en función de la inspección de las visualizaciones de ElbowPlot y DimHeatmap se seleccionaron para el análisis posterior. La agrupación de células se realizó utilizando las funciones FindNeighbors y FindClusters (resolución = 1,6). Los genes utilizados para la identificación de grupos se enumeran en la tabla S3. El paquete R ScCustomize (RRID:SCR024675) (^[63]) se utilizó para visualizar los datos de scRNA-seq.

En los experimentos de scRNA-seq, se utilizaron dos estrategias diferentes basadas en FACS para aislar las células tumorales. En los experimentos de deleción de Lef1 [datos de scRNA-seq publicados anteriormente (^[28])], las células disociadas se clasificaron utilizando EpCAM, mientras que en los experimentos de deleción de Tcf7, la clasificación se realizó en función de la expresión de tdTomato. Además, dado que el experimento de deleción de Lef1 se realizó sustancialmente antes que los experimentos de deleción de Tcf7 y porque utilizó una química de reactivos 10x Genomics diferente (v2 frente a v3), los análisis LApc frente a LApcT y LApc frente a LApcLef1 se realizaron por separado. Sin embargo, los resultados del análisis combinado con las muestras WT, LApc, LApcT y LApcLef1 que confirman los principales hallazgos de los análisis individuales se presentan en la figura S10 y en la tabla S6. Número total de todas las células analizadas en el análisis WT-LApc-LApcT: WT: 12 550, LApc: 15 435 y LApcT: 10 609; y en el análisis WT-LApc-LApcLef1: WT: 10 949, LApc: 10 697 y LApcLef1: 16 281. Número de células tumorales en el análisis LApc-LApcT: LApc: 855 y LApcT: 3857; y en el análisis LApc-LApcLef1: LApc: 1466 y LApcLef1: 9115. Los datos de scRNA-seq en bruto y procesados producidos en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE288156.

Tejido sano, pólipos de FAP y muestras de carcinoma

Las muestras de tejido sano, pólipos de FAP y muestras de carcinoma del conjunto de datos GSE201348 (^[27]) se integraron en un conjunto de datos que consta de muestras de carcinoma de intestino grueso de pacientes con cáncer colorrectal de inicio tardío (edad al diagnóstico ≥ 50 años) (^[8]). Número de células: sano: 8303; pólipo: 30 105; carcinoma: 3825. El procesamiento y el análisis de datos se realizaron utilizando Seurat v5 (RRID:SCR007322). Los objetos fusionados se normalizaron utilizando SCTransform, seguido de la reducción de dimensionalidad con RunPCA. La integración de muestras se realizó utilizando IntegrateLayers con el método RPCA. La agrupación de células se realizó utilizando FindNeighbors y FindClusters, y la visualización se generó utilizando RunUMAP, utilizando los primeros 35 componentes principales. Para los análisis posteriores, las células epiteliales (EPCAM > 0) se separaron de las células estromales. Se realizaron una agrupación y una separación iterativas hasta que solo quedaron células epiteliales en el objeto Seurat. La anotación de grupos epiteliales se realizó utilizando GSEA con firmas génicas publicadas anteriormente que definen los tipos de células epiteliales intestinales sanas (^[8]). Las identidades de los grupos se asignaron en función de las firmas significativamente enriquecidas, y solo se retuvieron las anotaciones con un valor de P ajustado < 0,05.

En los experimentos de secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq), se utilizaron dos estrategias diferentes basadas en citometría de flujo (FACS) para aislar las células tumorales. En los experimentos de deleción de Lef1 [datos de scRNA-seq publicados previamente (^[28])], las células disociadas se clasificaron utilizando EpCAM, mientras que en los experimentos de deleción de Tcf7, la clasificación se realizó en función de la expresión de tdTomato. Además, dado que el experimento de deleción de Lef1 se llevó a cabo sustancialmente antes que los experimentos de deleción de Tcf7 y porque utilizó una química de reactivos 10x Genomics diferente (v2 frente a v3), los análisis de LApc frente a LApcT y LApc frente a LApcLef1 se realizaron por separado. Sin embargo, los resultados del análisis combinado con las muestras de WT, LApc, LApcT y LApcLef1, que confirman los principales hallazgos de los análisis individuales, se presentan en la figura S10 y en la tabla S6. Número total de todas las células analizadas en el análisis de WT-LApc-LApcT: WT: 12.550, LApc: 15.435 y LApcT: 10.609; y en el análisis de WT-LApc-LApcLef1: WT: 10.949, LApc: 10.697 y LApcLef1: 16.281. Número de células específicas del tumor en el análisis de LApc-LApcT: LApc: 855 y LApcT: 3857; y en el análisis de LApc-LApcLef1: LApc: 1466 y LApcLef1: 9115. Los datos de scRNA-seq brutos y procesados generados en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE288156.

Tejido sano, pólipos de FAP y muestras de carcinoma

Las muestras de tejido sano, los pólipos de FAP y las muestras de carcinoma del conjunto de datos GSE201348 (^[27]) se integraron con el conjunto de datos que consta de muestras de carcinoma de intestino grueso de pacientes con CRC de inicio tardío (edad al diagnóstico ≥ 50 años) (^[8]). Número de células: tejido sano: 8303; pólipo: 30.105; carcinoma: 3825. El procesamiento y el análisis de los datos se realizaron utilizando Seurat v5 (RRID:SCR007322). Los objetos fusionados se normalizaron utilizando SCTransform, seguido de la reducción de la dimensionalidad con RunPCA. La integración de las muestras se llevó a cabo utilizando IntegrateLayers con el método RPCA. La agrupación de células se realizó utilizando FindNeighbors y FindClusters, y la visualización se generó utilizando RunUMAP, utilizando los primeros 35 componentes principales. Para los análisis posteriores, las células epiteliales (EPCAM > 0) se separaron de las células del estroma. Se realizaron agrupaciones y separaciones iterativas hasta que solo quedaran células epiteliales en el objeto Seurat. La anotación de los grupos de células epiteliales se realizó utilizando GSEA con firmas genéticas publicadas previamente que definen los tipos de células epiteliales intestinales sanas (^[8]). Las identidades de los grupos se asignaron en función de las firmas significativamente enriquecidas, y solo se conservaron las anotaciones con una P ajustada < 0,05.

Análisis de TissueEnrich

El paquete R TissueEnrich (^[64]) se utilizó para caracterizar las células de los grupos de células específicas del tumor. Primero, buscamos DEG en las células específicas del tumor entre las muestras de LApcLef1 y LApc, de las cuales se utilizaron aquellas con avglog2FC > 1,5 (n = 136) o < 1,5 (n = 800) para el análisis de TissueEnrich realizado con la configuración predeterminada. Se realizó un análisis similar en las células tumorales específicas de LApcT frente a LApc, pero para TissueEnrich, se utilizaron DEG con avglog2FC > 2,5 (n = 164) o < 1,5 (n = 1111). Los genes utilizados para el análisis se enumeran en la tabla S3.

Firmas genéticas

Para analizar si la puntuación de WNT se correlaciona con las firmas de HiCol o HiSquam (^[10]), cuantificamos la puntuación de WNT para cada muestra de paciente de GSE39582 (^[30]) con GSEA de muestra única [ssGSEA; análisis de variación del conjunto de genes (GSVA) paquete R (^[65])] utilizando la firma del conjunto de genes de señalización Wnt/β-catenina de MSigDB. Además, la expresión de TCF7 y LEF1 se correlacionó con las firmas de HiCol y HiSquam. Para evaluar esto, dividimos las muestras de los pacientes en función de su puntuación de WNT y la expresión de TCF7 o LEF1 en tres grupos: Q3, Q1-Q3 y Q1. Representamos las firmas de HiCol y HiSquam frente a estos grupos.

Análisis de la composición de las células tumorales

Las diferencias en la composición celular entre las muestras de LApc y LApcT se analizaron utilizando el marco bayesiano scCODA (versión 0.1.9) (^[66]). El grupo de células de Tuft (seleccionado automáticamente por la herramienta) y el grupo de células de Goblet se utilizaron como tipos de células de referencia. Este enfoque produce resultados consistentes, lo que demuestra la solidez de nuestros hallazgos. Se aplicó un umbral de tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,05 para distinguir los efectos creíbles de los efectos no creíbles, de acuerdo con la configuración predeterminada del paquete.

Generación de firmas genéticas de plasticidad y su correlación con la supervivencia en pacientes con CRC

1) Selección y filtrado de genes: Comenzamos importando una lista predefinida de genes candidatos que contienen marcadores no canónicos (^[8]) y oncofetales (^[9]) (tabla S3). Estos genes se utilizaron luego para separar la matriz de expresión génica completa de GSE39582 (^[30]), conservando solo las filas correspondientes a los genes seleccionados. Para garantizar la relevancia biológica y reducir el ruido, eliminamos los genes con baja variabilidad en la expresión en las muestras. Específicamente, calculamos la desviación estándar (SD) de la expresión para cada gen y conservamos solo aquellos con SD > 0,5, lo que indica una variabilidad intermuestral suficiente.

2) Análisis de regresión de riesgos proporcional univariado de Cox: El conjunto de genes filtrado se sometió a un análisis de regresión de riesgos proporcional univariado de Cox para evaluar la asociación entre la expresión de cada gen y la supervivencia libre de recurrencia (RFS) o la supervivencia general (OS). Cada gen se probó de forma independiente utilizando el modelo de Cox, y los resultados se resumieron para extraer los valores de P, las razones de riesgo y los intervalos de confianza. Este paso permite la identificación de genes con un potencial significado pronóstico.

3) Regresión de Cox regularizada mediante Lasso: Dada la alta dimensionalidad de los datos de expresión génica y el riesgo de sobreajuste en los modelos multivariados, aplicamos la regresión de Cox penalizada LASSO utilizando el paquete glmnet (^[67]). Este método realiza simultáneamente la selección de variables y la regularización, identificando el subconjunto de genes más predictivo. La validación cruzada se utilizó para determinar el parámetro de penalización óptimo (lambda.min), y los genes con coeficientes distintos de cero en este lambda óptimo se consideraron significativos.

4) Cálculo de la puntuación de riesgo y estratificación de la supervivencia. Utilizando los coeficientes derivados de Lasso y los datos de expresión génica, calculamos una puntuación de riesgo para cada paciente como una combinación lineal de las expresiones génicas seleccionadas ponderadas por sus coeficientes del modelo. Los pacientes con CRC (n = 566) se estratificaron en cuartiles en función de sus puntuaciones de riesgo. Las puntuaciones de riesgo primero se convirtieron en valores numéricos y luego se dividieron en cuatro grupos (Q1 a Q4) utilizando los percentiles 25, 50 y 75 como valores de corte. El cuartil 1 (Q1) representó a los pacientes con menor riesgo, mientras que el cuartil 4 (Q4) incluyó a aquellos con el mayor riesgo previsto. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en los cuatro grupos de cuartiles.

Estratificación conjunta de la expresión de TCF7/LEF1 y las puntuaciones de plasticidad para el análisis de supervivencia

Con base en las firmas genéticas de RFS y OS de plasticidad, realizamos ssGSEA y calculamos las puntuaciones de la firma para cada paciente utilizando el método ssgseaParam. Las puntuaciones de enriquecimiento resultantes se normalizaron utilizando el algoritmo GSVA para obtener puntuaciones por muestra. Para cada firma, los pacientes se estratificaron en cuatro grupos (muy bajo, bajo, moderado, alto) en función de la distribución de cuartiles de sus puntuaciones ssGSEA. Los valores de corte de los cuartiles se calcularon individualmente para cada firma. Para explorar los efectos interactivos de la expresión a nivel de los genes y las puntuaciones de plasticidad en la supervivencia de los pacientes, realizamos un análisis de estratificación combinado. Evaluamos TCF7 y LEF1 en las muestras de la matriz de expresión. Los valores de expresión se categorizaron en cuartiles (Q1 a Q4) para definir los niveles de actividad de TCF7 y LEF1. Luego, a cada muestra se le asignó un grupo combinado que representaba tanto su expresión de TCF7 o LEF1 como los cuartiles de la puntuación de la firma de plasticidad de RFS o OS (por ejemplo, Q1Lowest [expresión génica]Q4Highest [puntuación de plasticidad]). Nos centramos en cuatro combinaciones biológicamente informativas: (i) Q1Q1: tanto la expresión génica como la puntuación eran bajas, (ii) Q4Q4: ambas eran altas, (iii) Q1Q4: baja expresión génica y alta actividad de la vía, y (iv) Q4_Q1: alta expresión génica y baja actividad de la vía. Estas combinaciones nos permitieron investigar las relaciones aditivas o antagónicas entre los niveles de expresión génica y los niveles de puntuación de plasticidad en relación con los resultados de supervivencia analizados mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (^[68], ^[69]).

ATAC-seq

Se realizó ATAC-seq para las células de tdTomato+ clasificadas por FACS (tabla S2C) de cuatro ratones LApc y cuatro ratones LApcLef1 siguiendo el protocolo Omni-ATAC-seq (^[70]). La transposición se realizó para 50.000 núcleos por muestra en triplicado (150.000 núcleos en total) para inducir la complejidad de la biblioteca. Los fragmentos de ADN de cada muestra se agruparon después de la transposición y se purificaron utilizando un kit Zymo DNA Clean and Concentrator-5 (núm. de catálogo D4014, Nordic BioSite). Las bibliotecas se amplificaron mediante PCR y se cuantificaron, y la calidad se midió mediante PCR cuantitativa (qPCR; núm. de catálogo KK4824, KAPA Library Quantification Kit, Illumina) y TapeStation 2200 (Agilent Technologies). Las bibliotecas de ATAC-seq se enviaron para la secuenciación Illumina de pares de extremos de 100 pb, con el objetivo de obtener 80 millones de lecturas de pares de extremos.

Cutadapt versión 1.18 (RRID:SCR011841) en Trim Galore versión 0.6.5 (RRID:SCR011847), con la configuración predeterminada, se utilizó para el recorte de calidad y adaptadores. Las lecturas recortadas se alinearon con el genoma de referencia mm10 utilizando Bowtie 2 versión 2.3.5 (RRID:SCR005476). Las lecturas con una calidad de mapeo inferior a 20 se descartaron, se contaron las lecturas mitocondriales y se eliminaron los duplicados de PCR utilizando Samtools versión 1.9 (RRID:SCR002105). MACS2 versión 2.1.4 se utilizó para la llamada de picos. Creamos picos de ancho fijo que van desde 250 pb desde la cumbre del pico llamada con el comando MACS2 callpeak con los parámetros “--shiff 75 --extsize 150 --nomodel --call-summits --nolambda --keep-dup all -p 0.01”.

La accesibilidad diferencial entre los grupos se calculó utilizando DESeq2 versión 1.32.0 (RRID:SCR015687) con la configuración predeterminada y las estadísticas de Wald. Para obtener el número de inserciones de Tn5, las lecturas de pares de extremos correctamente emparejadas se corrigieron para el desplazamiento de Tn5 (“+” hebra +4 pb, “−” hebra −5 pb) (^[71]). Se contaron las inserciones de Tn5 en picos no superpuestos, y se conservó en el análisis el pico con la puntuación de pico más alta presente en al menos dos muestras. Las regiones de accesibilidad diferencial (DAR) se definieron con una P ajustada de Benjamini-Hochberg (BH) < 0,05. El gen más cercano para cada DAR se anotó utilizando HOMER (RRID:SCR010881) annotatePeaks.pl contra la base de datos RefSeq mm10 (RRID:SCR_003496).

El enriquecimiento de los motivos de los factores de transcripción en los DAR se calculó por separado para las regiones más accesibles [cambio de registro 2 (FC) > 0] y menos accesibles (FC de registro 2 < 0) utilizando el análisis de enriquecimiento simple (SEA) (^[72]) en MEME Suite (^[73]) con la configuración predeterminada. Los datos de ATAC-seq brutos y procesados generados en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso GSE288156.

Procesamiento de tejidos e inmunohistoquímica

Se tomaron muestras de tejido fresco y se congelaron en nitrógeno líquido o se fijaron durante la noche (o/n) con un 4% de paraformaldehído a 4 °C. Al día siguiente, se contaron los tumores y los intestinos se enrollaron como rollos suizos, se deshidrataron durante la noche, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Las secciones de tejido se desparafinaron y se rehidrataron siguiendo los siguientes pasos: 3 lavados de 5 minutos en Tissue-Clear (Tissue-Tek, n.º 1466, Sakura), seguidos de una serie decreciente de alcohol (2 × etanol absoluto, 2 × etanol al 96 %, 1 × etanol al 70 % y 1 × etanol al 50 % durante 3 minutos cada uno). A continuación, se realizó una recuperación de antígenos inducida por calor con una solución de recuperación de antígenos de pH alto, y se realizó un bloqueo con tampón TNB (0,1 M de tris-HCl, 0,15 M de NaCl y 0,5 % de reactivo de bloqueo TSA, NEL700001KT, PerkinElmer) durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiente (TA), seguido de la incubación del anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Para el anticuerpo anti-c-Myc (RRID:AB731658), se utilizó un tampón de recuperación de antígenos a pH bajo (6) a base de citrato de sodio, y el anticuerpo primario se incubó durante 48 horas. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: conejo anti-Tcf1 (1:100; n.º 2203, Cell Signaling, RRID:AB2199302), conejo anti-Tcf1 (1:200; n.º MA5-14972, Thermo Fisher Scientific), cabra anti-Prox1 (1:200; AF2727, R&D Systems, RRID:AB2170716), conejo anti-Lyz1 (1:500; Dako A0099, RRID:AB2341230), cabra anti-Msx1 (1:200; AF5045, R&D Systems, RRID:AB2148804), conejo anti-Ki67 (1:200; ab16667, Abcam, RRID:AB302459), conejo anti-c-Myc (1:200; Abcam, ab32072, RRID:AB731658), conejo anti-Anxa1 (1:200; 71-3400, Invitrogen) y ratón anti-β-catenina (1:200; n.º 0030773, BD Biosciences, RRID:AB305407). Para la detección de EdU, se utilizó el kit de imagen Click-IT EdU Alexa Fluor 488 (C10337, Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los datos de cuantificación específicos de cada tinción se presentan en la tabla S4.

Al día siguiente, las secciones se lavaron con TNT [0,1 M de tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M de NaCl y 0,05 % de Tween 20] durante 3 × 5 minutos, se incubaron en TNB-Alexa Fluor 488-, 594- y 647- (1:500; Invitrogen) conjugado con una mezcla de anticuerpos secundarios durante 60 minutos a TA, se lavaron de nuevo con TNT y agua Milli-Q, y se montaron con un medio de montaje VECTASHIELD que contiene 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (n.º H-1200, Vector Laboratories, RRID:AB2336790) para contrateñir los núcleos y, por último, se sellaron bajo una cubierta con citoseal (n.º 8310-4, Thermo Fisher Scientific). Las muestras se visualizaron mediante un microscopio de epifluorescencia (Zeiss Axio Imager, RRID:SCR018876) equipado con una cámara Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT. Las imágenes originales se procesaron y analizaron utilizando el software Fiji (RRID:SCR_002285).

Tinción con hematoxilina y eosina

Las secciones de tejido se desparafinaron y se rehidrataron como se describió anteriormente, seguido de la incubación en agua MQ durante 1 minuto y en solución de hematoxilina (n.º 1092492500, Merck) durante 1 o 2 minutos, se lavaron con agua corriente durante 10 minutos y se incubaron en una solución de eosina al 1 % en metanol durante 30 segundos. A continuación, las secciones de tejido en las láminas se deshidrataron en una serie creciente de alcohol (10 segundos en etanol al 70 %, 1 minuto en etanol al 96 %, 2 × 3 minutos en etanol absoluto y 3 × 5 minutos en Tissue-Clear). Las láminas se montaron con un medio de montaje Pertex (n.º 00811, Histolab) y se visualizaron en campo claro utilizando un microscopio Zeiss Axio Imager (RRID:SCR_018876).

Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y qPCR

El aislamiento de ARN, la síntesis de ADNc y la qPCR se realizaron de forma similar a como se describió anteriormente (^[23]). En resumen, el aislamiento de ARN de las células tumorales se realizó utilizando un kit NucleoSpin RNA II (n.º 740955, Macherey-Nagel), el ADNc se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific, n.º 4368814) y el análisis de la expresión de transcritos de ARN se realizó utilizando qPCR (sistema CFX96 en tiempo real) con un kit de qPCR DyNAmo HS SYBR Green (n.º F410XL, Thermo Fisher Scientific). Los cebadores utilizados para la qPCR se enumeran en la tabla S5.

Aislamiento y cultivo de organoides

Para inducir la tumorigénesis, se administraron 2 mg de tamoxifeno a los ratones LApc y LApcT durante dos días consecutivos. Después de 19 (LApcT) o 29 (LApc) días, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los intestinos delgados. Los tejidos intestinales se lavaron a fondo con PBS, se cortaron en pequeños fragmentos y se incubaron en 10 mM de EDTA durante 15 minutos a 4 °C. Después de un único lavado con PBS, los tejidos se sometieron a una segunda incubación en 10 mM de EDTA durante 45 minutos a 4 °C. Durante las incubaciones con EDTA, las muestras se agitaron vigorosamente cada 10 a 15 minutos.

Después de la incubación, los fragmentos de tejido se agitaron aún más y se dejaron reposar, y se recolectó el sobrenadante que contenía las criptas liberadas. El sobrenadante se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. Las criptas aisladas se incluyeron en Matrigel (n.º 356231, Corning) y, después de la polimerización del Matrigel, los cultivos se recubrieron con Advanced DMEM/F12 (n.º 12634-010, Gibco) suplementado con B27 (n.º 17504-044, Gibco), N2 (n.º 17502-048, Gibco), 10 mM de Hepes (n.º BP310-1, Thermo Fisher Scientific), 1 mM de N-acetilcisteína (n.º A-9165, Sigma-Aldrich), penicilina G (100 UI/ml)/sulfato de estreptomicina (100 μg/ml) (ECB001D, Euroclone) y 2 mM de l-glutamina (ECB3000D, Euroclone). Los experimentos se realizaron una vez que la formación y el crecimiento de los organoides se habían estabilizado.

Análisis estadístico

El número de réplicas técnicas y biológicas se indica en las leyendas de las figuras. Los datos se presentan como media ± DE, a menos que se indique lo contrario en la leyenda de la figura. GraphPad Prism (versión 9, RRID:SCR002798) y RStudio (versión 4.2.2, RRID:SCR000432) se utilizaron para los análisis estadísticos. Los análisis estadísticos que comparan grupos se realizaron utilizando la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney o el análisis de varianza (ANOVA) de dos vías. Los análisis estadísticos seleccionados se indican en las leyendas de las figuras. La significación estadística se indica mediante valores P (*P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,005 y ****P < 0,001). RStudio (versión 4.2.2) se utilizó para los análisis estadísticos.