Nanoplataforma probiótica modificada genéticamente para la terapia del cáncer colorrectal mediante ultrasonido, que permite la administración dirigida, la modulación inmune y la inhibición de la angiogénesis.

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo uno de los cánceres más prevalentes y mortales a nivel mundial [^[1], ^[2]]. Por lo tanto, el diagnóstico y el tratamiento tempranos son de suma importancia para mejorar el pronóstico y las tasas de supervivencia. Las herramientas de diagnóstico actuales para el CCR dependen principalmente de la colonoscopia, pero este método es incómodo, costoso y está relacionado con complicaciones raras pero graves [^[3]]. La ecografía (US), reconocida por su naturaleza no invasiva, en tiempo real y repetible, ofrece un enfoque prometedor para el monitoreo dinámico del crecimiento y la metástasis del CCR [^[4]]. Sin embargo, la aplicación de la US en el diagnóstico del CCR a menudo se ve obstaculizada por la interferencia de los gases intestinales, lo que limita su capacidad para evaluar con precisión la morfología del tumor y la profundidad de la invasión [^[5]]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico en tiempo real para el CCR, junto con la exploración de enfoques de tratamiento multimodal sinérgicos, promete mejorar significativamente los resultados clínicos de los pacientes.

Recientemente, las herramientas de la biología sintética, que se pueden aprovechar para permitir que las bacterias administradas por vía oral codifiquen y administren localmente moléculas de diagnóstico y terapéuticas a las lesiones intestinales, han atraído cada vez más atención [^[6]]. En particular, los genes de reportero acústico (ARG) se pueden integrar en el cuerpo de los microorganismos mediante técnicas de ingeniería genética para emitir señales detectables bajo la estimulación por US, lo que no solo logra la obtención de imágenes no invasivas de los tumores, sino que también mejora significativamente la precisión y la sensibilidad del diagnóstico [^[7], ^[8], ^[9]]. Típicamente, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), una cepa probiótica con propiedades de bioseguridad favorables y efectos beneficiosos sobre la salud intestinal, ha sido cada vez más reconocida como una plataforma prometedora para la expresión de los ARG [^[10], ^[11]]. Al incorporar estos ARG, EcN produce señales sensibles a la US, lo que facilita el monitoreo tumoral en tiempo real y mejora la precisión del diagnóstico [^[12]].

Más allá del diagnóstico temprano, las estrategias de tratamiento oportunas son cruciales para erradicar las pequeñas lesiones cancerosas, inhibir la metástasis tumoral temprana y mejorar el pronóstico general [^[13]]. Entre ellas, las estrategias antitumorales basadas en las especies reactivas del oxígeno (ROS) han demostrado un potencial significativo para el tratamiento del CCR. Los tratamientos actuales para el CCR que inducen ROS [^[14]], como la terapia fotodinámica, la quimioterapia y la modulación redox, enfrentan varios desafíos, que incluyen toxicidad sistémica, limitaciones en el sitio de tratamiento y eficacia terapéutica subóptima [^[15], ^[16]]. Dada la función fundamental de las ROS intracelulares en los efectos antitumorales, las nuevas estrategias dirigidas a las ROS han despertado un interés significativo. Una de estas estrategias prometedoras implica la curcumina, un polifenol de origen natural con una fuerte capacidad de generación de ROS y un excelente perfil de seguridad [^[17]]. Además, la curcumina puede inducir la muerte celular inmunogénica (ICD) y activar la vía del sintetasa de GMP-AMP cíclico—estimulador de los genes de interferón (cGAS-STING) [^[18]], orquestando la inmunidad innata y adaptativa. Curiosamente, la curcumina también funciona como un fotosensibilizador, potenciando sus efectos terapéuticos bajo la exposición a la US [^[19]]. A pesar de estas características prometedoras, la aplicación clínica generalizada de la curcumina se ve limitada por su baja solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad [^[20], ^[21]]. Para abordar estos desafíos, se han desarrollado liposomas de curcumina (Cur-Lip), que encapsulan la curcumina en una estructura de bicapa lipídica [^[22]]. Además, la conjugación de liposomas de curcumina con ácido fólico (FA) puede optimizar aún más la acumulación de fármacos en los tejidos tumorales, con una menor incidencia de efectos secundarios tóxicos, lo que amplifica sus efectos terapéuticos [^[22]].

Inspirados en esto, nuestro estudio introduce un sistema integrado de diagnóstico y tratamiento, EcNA@Cur-Lip-FA, que combina EcNA de ingeniería genética (que expresa ARG) con Cur-Lip conjugado con FA. En este sistema, los conjugados de FA guían las partículas de EcNA@Cur-Lip-FA para que se acumulen específicamente en el sitio del tumor, lo que permite una administración de fármacos eficiente a largo plazo. Al mismo tiempo, los ARG dentro de EcN producen vesículas de gas (GV) que sirven como agentes de contraste para la US, lo que permite el monitoreo tumoral en tiempo real. En las condiciones ácidas del microambiente tumoral (TME), la curcumina se libera del sistema EcNA@Cur-Lip-FA, induciendo la ICD y activando la vía cGAS-STING. Este proceso promueve la maduración de las células dendríticas (DC) y mejora la activación de las células T citotóxicas CD4+ y CD8+ que atacan el tumor. Los experimentos in vitro e in vivo demostraron que EcNA@Cur-Lip-FA puede dirigirse con precisión a los sitios tumorales, permitir el monitoreo dinámico del tumor y suprimir eficazmente tanto los tumores primarios como las metástasis hepáticas. Estos hallazgos sugieren que nuestra plataforma integrada de diagnóstico y terapia tiene un potencial significativo para revolucionar el tratamiento del CCR al combinar las modalidades de diagnóstico y terapéuticas en un sistema único y eficiente.

Resultados

Preparación y caracterización de EcNA@Cur-Lip-FA

La preparación de EcNA@Cur-Lip-FA se muestra en la Figura 1A. Primero, el plásmido bARG1 se transformó en EcN para generar EcNA, una bacteria que expresa GV. Como se muestra en la Figura S1, la electroforesis en gel demostró la expresión exitosa de los ARG en EcN (EcNA), como lo evidencia la aparición de la banda objetivo en la tercera línea. Para respaldar aún más la construcción exitosa de EcNA, los experimentos de centrifugación revelaron que EcN se asentó por completo en el fondo del tubo, mientras que EcNA flotó en la superficie del líquido debido a la presencia de GV (Figura S2).

Para preparar EcNA@Cur-Lip-FA, primero empleamos el método clásico de película delgada para crear liposomas cargados con curcumina conjugados con FA (Cur-Lip-FA). El Western blot (WB) confirmó la sobreexpresión de FOLR1 en las células tumorales CT26 en comparación con las células intestinales normales NCM460 (Figura S3), lo que respalda la focalización mediada por el receptor de folato. Posteriormente, EcNA y Cur-Lip-FA se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas para formar nanopartículas (NP) de EcNA@Cur-Lip-FA. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 1B) revelaron que, en comparación con el grupo EcN, la morfología de EcNA@Cur-Lip-FA permaneció similar, con GV blancas visibles dentro de las bacterias. El TEM de secciones delgadas (Figura 1C) reveló estructuras vesiculares en EcNA@Cur-Lip-FA, lo que confirmó la formación de NP. La espectroscopia UV-Vis (Figura S4) mostró un pico de absorción característico de 425 nm para Cur-Lip-FA, EcN@Cur-Lip-FA y EcNA@Cur-Lip-FA, lo que verificó la incorporación de Cur-Lip-FA. Se obtuvo una carga de curcumina del 5,8% (p/p), lo que superó los métodos informados anteriormente [^[23]]. El análisis de colocalización se realizó etiquetando Cur-Lip-FA con DiO (verde) y EcNA con DAPI (azul). Como se muestra en la Figura 1D, la superposición de las señales verde y azul verificó aún más la preparación exitosa de EcNA@Cur-Lip-FA. Para evaluar la morfología de las bacterias, se empleó la microscopía de fuerza atómica (AFM). Como se muestra en la Figura 1E, EcN exhibió una forma de bastón típica con una superficie lisa. Después de la transformación y la expresión de los ARG, EcNA conservó su forma de bastón, pero exhibió una mayor rugosidad y deformación de la superficie. En contraste, la superficie de EcNA@Cur-Lip-FA se volvió notablemente más áspera, con estructuras esféricas visibles, probablemente debido a la adsorción de liposomas en la superficie bacteriana y la expresión de proteínas. El análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) (Figura S5) reveló que EcNA tenía un tamaño de partícula de 2299,8 nm, mientras que Cur-Lip-FA exhibió un tamaño de partícula promedio más pequeño de 147,9 nm. Después de la modificación con Cur-Lip-FA, el tamaño de partícula de EcNA@Cur-Lip-FA aumentó significativamente a 3085,7 nm, con un potencial zeta de -25,2 mV (Figura S6).

Como se muestra en la Figura 1F, la liberación acumulativa de curcumina de EcNA@Cur-Lip-FA + US a pH 5,0 durante 48 horas fue de aproximadamente el 80%, significativamente mayor que la tasa de liberación sin US y a pH 7,4. Esto demostró que EcNA@Cur-Lip-FA puede lograr una liberación controlada dependiente del pH y la US. A continuación, evaluamos la farmacocinética de la curcumina después de la administración oral de EcNA@Cur-Lip-FA y Cur-Lip-FA en ratones. Las curvas de concentración-tiempo de curcumina en plasma se muestran en la Figura 1G. En comparación con la suspensión de curcumina sola, tanto Cur-Lip-FA como EcNA@Cur-Lip-FA dieron como resultado un aumento significativo en la concentración de curcumina en plasma después de la administración oral. En particular, EcNA@Cur-Lip-FA exhibió el perfil farmacocinético óptimo, lo que se puede atribuir a la capacidad de EcN para colonizar el intestino, lo que permite la liberación sostenida de curcumina con el tiempo. Finalmente, evaluamos la capacidad de diagnóstico de EcNA@Cur-Lip-FA para el CCR. Como se ilustra en la Figura 1H, la imagen de US reveló que EcNA@Cur-Lip-FA mostró límites tumorales más distintos en comparación con el control, lo que sugiere una mejor detección del tumor. Además, la Figura S7A también verificó que EcNA@Cur-Lip-FA exhibió una buena focalización en ratones con tumores. Los datos cuantitativos mostraron los mismos resultados (Figura S7B). La Figura S8 confirmó además que EcNA@Cur-Lip-FA logró una colonización intestinal más fuerte y persistente que EcNA solo. Estos hallazgos subrayaron el potencial de EcNA@Cur-Lip-FA como una plataforma integrada de diagnóstico y terapia para el CCR, que combina una mejor administración de fármacos y la obtención de imágenes del tumor en un solo sistema.

Captación celular, citotoxicidad y eficacia antitumoral de EcNA@Cur-Lip-FA en células de cáncer colorrectal

Basándose en las propiedades fisicoquímicas únicas de la plataforma integrada de diagnóstico y terapia EcNA@Cur-Lip-FA, este estudio evaluó sistemáticamente su eficiencia de captación celular, citotoxicidad y eficacia antitumoral en la línea celular CT26 de CCR. Para monitorear la acumulación intracelular, investigamos la captación celular de EcNA@Cur-Lip-FA etiquetado con Cy5.5 por las células CT26. Después de 1 hora de coincubación, apareció fluorescencia roja en las células CT26 de CCR, lo que indica la captación inicial de EcNA@Cur-Lip-FA por las células tumorales. A medida que aumentó el tiempo de incubación, la señal de fluorescencia roja intracelular se intensificó gradualmente y se volvió más pronunciada a las 8 horas (Figura S9). Los resultados demostraron que EcNA@Cur-Lip-FA se puede captar eficazmente por las células tumorales, lo que permite una actividad antitumoral eficaz.

Para investigar aún más el efecto antitumoral de EcNA@Cur-Lip-FA, se evaluó la viabilidad celular en las células CT26 utilizando el ensayo CCK-8. Como se muestra en la Figura 2A, la viabilidad celular exhibió una disminución dependiente de la dosis con el aumento de la concentración de EcNA@Cur-Lip-FA. Calculamos además la concentración que inhibe el 50% (CI50) de EcNA@Cur-Lip-FA + irradiación con US contra las células CT26 y utilizamos esta concentración en los experimentos posteriores. Con el objetivo de evaluar la bioseguridad de EcNA@Cur-Lip-FA, también realizamos ensayos CCK-8 en las células epiteliales colónicas normales humanas NCM460, y los resultados mostraron que EcNA@Cur-Lip-FA tenía una baja citotoxicidad intrínseca hacia estas células normales (Figura S10). Posteriormente, se utilizó la tinción doble con Calceína-AM/PI para evaluar visualmente la viabilidad celular. Los resultados indicaron que el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US mostró el cambio más dramático en la señal de fluorescencia en comparación con otros grupos (Figura 2B, Figura S11), atribuible principalmente a los efectos sinérgicos de la curcumina y la terapia fotodinámica (SDT). De manera similar, la citometría de flujo (FCM) demostró que el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US tuvo una tasa de apoptosis del 35,6%, aproximadamente 10 veces mayor que el grupo de control y significativamente mayor que otros grupos (Figura 2C, D) (p < 0,001). Y el ensayo TUNEL (Figura 2E, Figura S12) confirmó la fragmentación del ADN, con una tasa de TUNEL positiva del 17,7% (p < 0,001). El análisis de WB (Figura 2F) indicó que en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US, los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis aumentaron significativamente, lo que indica el mismo resultado que se mencionó anteriormente. Los resultados del análisis cuantitativo se presentan en la Figura S13.

Dado que se ha confirmado que EcNA@Cur‐Lip‐FA puede inducir significativamente la muerte celular, exploramos más a fondo su efecto inhibidor sobre la proliferación de las células tumorales. El ensayo de formación de colonias (Figura 2G) reveló que EcNA@Cur‐Lip‐FA por sí solo solo causó un ligero efecto inhibidor. EcNA o la irradiación con ultrasonidos (US) por sí solos tuvieron efectos limitados en el retraso de la formación de colonias. Sin embargo, cuando EcNA o la irradiación con US se combinaron con Cur‐Lip‐FA, el efecto inhibidor se mejoró sustancialmente. Además, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US (Figura 2H) demostró el efecto antiproductivo más notable, con una tasa de formación de colonias inferior al 20% (p < 0,001). El ensayo EdU (Figura S14) confirmó aún más esta tendencia, mostrando que el número de células EdU positivas en el grupo tratado con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US era casi indetectable. Estos resultados indicaron que el tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación con US puede lograr el efecto sinérgico óptimo en términos de citotoxicidad contra las células tumorales e inhibición de la proliferación tumoral.

Daño en el ADN mediado por ROS y muerte celular inmunogénica inducidos por EcNA@Cur‐Lip‐FA

Animados por los satisfactorios efectos citotóxicos, exploramos más a fondo los mecanismos antitumorales subyacentes de EcNA@Cur‐Lip‐FA. Se ha demostrado que la curcumina ejerce efectos antitumorales al inducir la generación de ROS [^[24], ^[25], ^[26]]. Por lo tanto, detectamos la generación de ROS después de diferentes tratamientos. Como se muestra en la Figura S15A, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + irradiación con US indujo el nivel más alto de ROS, que fue 1,6 veces mayor que el del grupo Cur‐Lip‐FA + irradiación con US y 2,7 veces mayor que el de EcNA@Cur‐Lip‐FA (p < 0,001). Se observó la misma tendencia bajo microscopía de fluorescencia (Figura 3A, Figura S15B). Además, los ROS son mediadores clave del estrés oxidativo celular y su acumulación excesiva puede atacar directamente las membranas mitocondriales [^[27], ^[28]], lo que provoca una disminución del potencial de membrana mitocondrial (PMM). Los resultados mostraron (Figura S16) que después de 24 horas de tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la fluorescencia roja disminuyó mientras que la fluorescencia verde aumentó significativamente en comparación con el grupo de control, lo que indicó una disminución sustancial del PMM.

Numerosos estudios han demostrado que los ROS pueden inducir daño en el ADN [^[29], ^[30]]. Para aclarar el papel del daño en el ADN mediado por ROS en los efectos antitumorales, primero utilizamos el ensayo cometa para evaluar la rotura de cadena simple o doble del ADN (DSB). Como se muestra en la Figura 3B, las células tratadas con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US mostraron colas de cometa distintas, lo que indica un daño extenso en el ADN DSB inducido por ROS. De manera similar al ensayo cometa, el análisis de inmunofluorescencia (Figura 3C, Figura S17) reveló una mayor intensidad de fluorescencia de γ-H2AX en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US en comparación con los otros grupos. Dado que γ-H2AX marca el daño en el ADN DSB [^[31]], estos resultados confirmaron aún más que EcNA@Cur‐Lip‐FA con la irradiación con US condujo principalmente al daño en el ADN DSB. Además, el ADN dañado puede ser reconocido por cGAS, que posteriormente cataliza la producción de cGAMP, activando así la vía de señalización STING-TBK1-IRF3 aguas abajo (Figura 3D, E y Figura S18). Y la activación de esta vía puede desencadenar que las células secreten interferón de tipo I (IFN-β) (Figura 3F), lo que puede inducir aún más la maduración de las células dendríticas (CD). En resumen, estos resultados indicaron que EcNA@Cur‐Lip‐FA con la irradiación con US puede inducir daño en el ADN mediado por ROS, aumentar el dsDNA libre citoplásmico y activar indirectamente la vía cGAS-STING.

Además de activar la vía cGAS-STING, numerosos estudios han demostrado que la curcumina induce la generación de ROS [^[24], ^[25], ^[26]], lo que provoca estrés del retículo endoplásmico y, posteriormente, desencadena la muerte celular inmunogénica (ICD), caracterizada por la exposición de calreticulina (CRT) en la superficie celular y la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP), como HMGB1 y ATP [^[33], ^[34]]. La Figura 3G y la Figura S19 revelaron que en los grupos de control, solo irradiación con US y solo EcNA, las células CT26 tenían una intensidad de fluorescencia de CRT muy baja en su superficie. Sin embargo, después de que las células fueran tratadas con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la intensidad de fluorescencia de CRT alcanzó su punto máximo, duplicando la del grupo Cur‐Lip‐FA + irradiación con US. Por el contrario, la intensidad de fluorescencia de HMGB1 disminuyó (Figura 3H, Figura S20), ya que HMGB1 se libera fuera de la célula durante la ICD. Los resultados de Western blot reflejaron una tendencia consistente (Figura S21), mostrando niveles aumentados de CRT y HSP70 y niveles disminuidos de HMGB1. Además, en comparación con solo EcNA@Cur‐Lip‐FA, cuando EcNA@Cur‐Lip‐FA se combinó con la irradiación con US, aumentó notablemente la secreción de ATP y la liberación de HMGB1 (Figura 3I, J), lo que demuestra que el efecto sonodinámico puede amplificar aún más el efecto ICD.

Además, la secreción de IFN-β y la liberación de DAMP desencadenadas por la ICD pueden inducir la maduración de las CD, lo que a su vez activa la inmunidad antitumoral [^[35], ^[36]]. Por lo tanto, a continuación, cocultivamos células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) con sobrenadantes recogidos de células CT26 sometidas a diferentes tratamientos durante 48 horas (Figura 3K). El análisis de citometría de flujo (FCM) (Figura 3L, M) demostró que en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la tasa positiva de maduración de CD (CD80+CD86+) fue significativamente mayor que en los otros grupos. En resumen, EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación con US ejerce sus efectos inmunostimulantes a través de un mecanismo dual que implica el daño en el ADN mediado por ROS y la ICD. Por un lado, los niveles elevados de ROS inducen daño en el ADN, lo que posteriormente activa la vía cGAS-STING, lo que resulta en la producción de IFN-β. Esto mejoró la presentación de antígenos y promovió la maduración de las CD. Por otro lado, los ROS también desencadenan la ICD, lo que lleva a la liberación de DAMP de las células tumorales moribundas, lo que estimuló aún más la maduración de las CD. En conjunto, estas dos vías (Figura 3N) promovieron sinérgicamente una robusta respuesta inmune antitumoral, lo que destaca el potencial terapéutico de EcNA@Cur‐Lip‐FA + US como un potente activador inmune.

Efectos antiangiogénicos de EcNA@Cur‐Lip‐FA con irradiación con US en el microambiente tumoral

Como se mencionó anteriormente, EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación con US mejora significativamente la inmunidad antitumoral a través de la ICD inducida por ROS y la activación de la vía de señalización cGAS-STING. Sin embargo, el microambiente tumoral inmunosupresor (ITM) no solo está impulsado por la disfunción de las células inmunitarias, sino también por la hipoxia y la deficiencia de nutrientes que resultan de la angiogénesis tumoral anormal. En particular, la curcumina, un compuesto natural con actividades biológicas pleiotrópicas, ha demostrado inhibir la angiogénesis tumoral [^[37]]. Para explorar si EcNA@Cur‐Lip‐FA + la irradiación con US podrían ejercer efectos antiangiogénicos adicionales, realizamos una serie de ensayos relacionados con la angiogénesis. Se realizó un ensayo de curación de heridas para evaluar el efecto de diferentes tratamientos sobre la migración de HUVEC. Como se muestra en la Figura 4A, el cierre del arañazo se retrasó significativamente después de 36 horas en los grupos Cur‐Lip‐FA + US y EcNA@Cur‐Lip‐FA, especialmente en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. El análisis cuantitativo (Figura 4B) mostró que la tasa de curación de heridas disminuyó hasta solo el 4,16% (p < 0,001) en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, lo que indica un potente efecto inhibidor sobre la migración de HUVEC. Y los ensayos de invasión transwell (Figura 4C, D) revelaron resultados consistentes, con una capacidad de invasión marcadamente reducida después del tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. Estos hallazgos demostraron la eficacia sinérgica del tratamiento combinado en la supresión de la motilidad de las células endoteliales.

Para investigar más a fondo los mecanismos subyacentes, se emplearon tinción de inmunofluorescencia (Figura 4E, F) y análisis de Western blot (Figura 4G, Figura S22). Los resultados mostraron que la expresión de los principales marcadores proangiogénicos, incluido VEGF, VEGFR1 y ANGPT1, se redujo significativamente después del tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. Los efectos antiangiogénicos se validaron aún más a través de dos ensayos in vitro clásicos. Además, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US exhibió una reducción del 60,2% en la longitud total de la rama y una disminución del 72,2% en el número de nodos en comparación con el control (p < 0,001), lo que indica una alteración grave de la formación de la red vascular (Figura 4H–J). De manera similar, el número de brotes de microvasos se redujo significativamente en un 80,9%, lo que confirmó una fuerte inhibición del brote angiogénico (Figura 4K, L). Además, la normalización vascular tumoral mejoró notablemente el microambiente hipóxico y atenuó la acumulación de lactato (Figura S23). En resumen, estos resultados indican colectivamente que EcNA@Cur‐Lip‐FA + la irradiación con US no solo mejora la activación inmune, sino que también inhibe eficazmente la angiogénesis tumoral al reducir los factores proangiogénicos y alterar las funciones de HUVEC, ofreciendo así una ventaja terapéutica dual.

Evaluación de la bioseguridad de EcNA@Cur‐Lip‐FA: biocompatibilidad y evaluación histopatológica

Antes de evaluar la eficacia antitumoral in vivo, realizamos evaluaciones de bioseguridad exhaustivas. Como se muestra en la Figura S24B, EcNA@Cur‐Lip‐FA, incluso a 320 µg/mL, no desencadenó hemólisis, y la tasa de hemólisis se mantuvo constantemente por debajo del 5% en todas las concentraciones, lo que cumplió con los requisitos de biocompatibilidad para biomateriales. La tinción con H&E de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón e intestino) (Figura S24A) confirmó además que no hubo anomalías patológicas, como vacuolización celular, encogimiento nuclear o infiltración inflamatoria, en todos los grupos. Además, después de la exposición a EcNA@Cur‐Lip‐FA, los indicadores hematológicos y bioquímicos relevantes en los ratones (Figura S24C) no mostraron ninguna variación significativa del grupo de control. Estos resultados ofrecieron un respaldo de seguridad confiable para las investigaciones antitumorales in vivo posteriores de EcNA@Cur‐Lip‐FA.

Evaluación de las capacidades terapéuticas de EcNA@Cur‐Lip‐FA en modelos ortotópicos de cáncer colorrectal

Animados por los prometedores efectos antitumorales in vitro de EcNA@Cur‐Lip‐FA, exploramos más a fondo su eficacia terapéutica in vivo. Con este fin, establecimos un modelo de cáncer colorrectal CT26 ortotópico en ratones BALB/c, que imita de cerca las características clínicas y patológicas del cáncer colorrectal humano. El protocolo de tratamiento se describe en la Figura 5A. El tratamiento con US se realizó 6 horas después de la administración por gavage.

La progresión tumoral se monitoreó dinámicamente utilizando imágenes de bioluminiscencia in vivo para evaluar la respuesta al tratamiento (Figura 5B). Los resultados revelaron que tanto el grupo de control como el grupo de solo US exhibieron señales de bioluminiscencia progresivamente crecientes, lo que indica un crecimiento tumoral descontrolado y confirma que la irradiación con US por sí sola no tuvo ningún efecto terapéutico. En contraste, los grupos Cur‐Lip‐FA + US y EcNA@Cur‐Lip‐FA mostraron una modesta inhibición tumoral, lo que se refleja en aumentos relativamente más lentos en la intensidad de la bioluminiscencia. De manera notable, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US demostró una supresión casi completa de las señales de bioluminiscencia durante todo el período de tratamiento, lo que sugiere una inhibición robusta del crecimiento tumoral. Este resultado no solo destaca el efecto terapéutico sinérgico de EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación con US, sino que también sugiere una mayor capacidad de detección de lesiones y precisión diagnóstica. Es importante destacar que no se observaron cambios significativos en el peso corporal en todos los grupos durante el tratamiento (Figura S25), lo que indica que la formulación tuvo una toxicidad sistémica mínima. Al final del experimento, se extirpó el colorrecto y se inspeccionó visualmente. En el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, no se observaron tumores visibles, signos de obstrucción intestinal, edema, metástasis peritoneal ni metástasis hepática (Figura S26). Además, este grupo también exhibió un tiempo de supervivencia significativamente prolongado (Figura 5C). Estos hallazgos confirman colectivamente la potente eficacia antitumoral in vivo y la seguridad de EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación con US, lo que lo posiciona como una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer colorrectal.

Los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina (Figura 5D) revelaron apoptosis y necrosis de las células tumorales. En contraste, otros grupos de tratamiento mostraron diversos grados de agrandamiento nuclear, hipercromasia y aumento de las figuras mitóticas. El análisis de inmunofluorescencia (Figura 5D, Figura S27) resaltó aún más las diferencias significativas entre el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US y el grupo de control. Específicamente, el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US mostró un mayor número de células TUNEL-positivas (fluorescencia verde), lo que indica un marcado aumento de la apoptosis (Figura S27). Además, la intensidad de fluorescencia de HIF-1α se redujo significativamente en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US en comparación con el control, lo que sugiere una supresión eficaz del microambiente hipóxico del tumor. La reducción de las intensidades de fluorescencia de CD31 y VEGF también indicó la inhibición de la angiogénesis. Además, Ki67, un marcador proteico nuclear asociado con la proliferación de las células tumorales y un indicador clave de la malignidad tumoral, fue notablemente menor en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US. En conjunto, estos resultados sugieren que la irradiación con EcNA@Cur-Lip-FA + US inhibe eficazmente la proliferación de las células tumorales, induce la apoptosis, alivia el microambiente tumoral hipóxico y ejerce efectos antiangiogénicos, lo que es consistente con los hallazgos de los estudios in vitro.

Modulación del microambiente inmunitario tumoral por EcNA@Cur-Lip-FA con irradiación de ultrasonido: perfilaje transcriptómico y mejora de la activación inmune

Para evaluar el impacto de EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación de ultrasonido en el microambiente inmunitario tumoral (MIT) in vivo, primero realizamos un análisis transcriptómico de los tejidos tumorales de ratones tratados. El mapa de calor (Figura 5E) reveló diferencias significativas en la expresión génica entre el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US y el grupo de control (p < 0,05), lo que confirma una alteración sustancial en el perfil génico inmunitario. El diagrama de dispersión (Figura S28) identificó 983 genes sobreexpresados y 583 genes subexpresados (p < 0,05), lo que proporciona una visión general completa del efecto del tratamiento sobre la expresión génica. La red de interacción funcional (Figura S29) sugirió además que estos genes diferencialmente expresados están estrechamente interconectados, lo que podría amplificar sus efectos biológicos. El análisis de enriquecimiento KEGG (Figura 5F) destacó las principales vías de señalización asociadas con la regulación de la respuesta inmune, incluidas las interacciones citocina-receptor de citocinas, la señalización PI3K-Akt y las interacciones ECM-receptor (p < 0,05). Además, el análisis de enriquecimiento GO (Figura 5G) reveló que los genes sobreexpresados estaban principalmente involucrados en procesos biológicos críticos, como la activación del sistema inmunitario, la respuesta al estrés, la migración celular, la regulación del ciclo celular y la unión a proteínas (p < 0,05). En general, estos hallazgos indicaron que EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación de ultrasonido altera significativamente la expresión de los genes relacionados con la inmunidad en los tejidos tumorales.

Dado que EcNA@Cur-Lip-FA tiene la capacidad de activar la inmunidad in vitro y los resultados del análisis transcriptómico, investigamos más a fondo la capacidad de activación inmune sistémica in vivo de EcNA@Cur-Lip-FA. Las células dendríticas (CD), como las principales células presentadoras de antígenos (APC), son esenciales para iniciar las respuestas inmunitarias de las células T. Por lo tanto, evaluamos los efectos de los diferentes grupos de tratamiento sobre la maduración de las CD y la inmunidad antitumoral utilizando citometría de flujo (FCM). Nuestros resultados revelaron que EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación de ultrasonido podría mejorar significativamente la proporción de CD maduras CD80+CD86+ tanto en los ganglios linfáticos que drenan el tumor (Figura 5H, J) como en los tejidos tumorales (Figura S30), en comparación con los otros grupos. Esto sugirió que EcNA@Cur-Lip-FA puede promover eficazmente la maduración de las CD, lo que es crucial para la presentación de antígenos y la activación de las células T. Además, el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US exhibió un aumento sustancial de las células T citotóxicas CD8+ dentro del tumor (Figura 5I, K), lo que representa un aumento de aproximadamente 4,5 veces en comparación con el grupo de control. Además, hubo un aumento notable en la proporción de células T CD8+ que secretan granzima B (Figura 5L, Figura S31) e IFN-γ (Figura 5M, Figura S32), ambos de los cuales son marcadores de una mayor actividad citotóxica. El tratamiento con irradiación de EcNA@Cur-Lip-FA + US también aumentó significativamente la presencia de células T CD4+ y CD8+ en el bazo (Figura 5N-P), lo que sugiere la activación sistémica de las respuestas de las células T. Es importante destacar que hubo una reducción significativa en la proporción de células T reguladoras (Treg), que se sabe que suprimen las respuestas inmunitarias, tanto en el tumor (Figura 5Q, R) como en el bazo (Figura 5S, Figura S33). Esta disminución de las Treg indicó que el tratamiento interrumpe eficazmente el microambiente inmunosupresor del tumor, promoviendo una respuesta inmunitaria antitumoral más robusta. Además, se midió un aumento significativo de las citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IL-12p70 en el suero en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US utilizando ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) (Figura S34A-C). Estas citocinas contribuyen a crear un microambiente inflamatorio que apoya la activación del sistema inmunitario antitumoral. En conclusión, la combinación de EcNA@Cur-Lip-FA e irradiación de ultrasonido promueve eficazmente la maduración de las CD y mejora la activación de las células T CD8+, remodelando así el microambiente inmunitario tumoral y produciendo un efecto antitumoral robusto.

Inhibición de la metástasis hepática por EcNA@Cur-Lip-FA con irradiación de ultrasonido

Dado el prometedor efecto antitumoral de EcNA@Cur-Lip-FA + irradiación de ultrasonido sobre los tumores primarios, investigamos más a fondo su impacto en la metástasis tumoral. Se estableció un modelo de metástasis hepática mediante la inyección esplénica de células CT26-Luc, y los animales fueron tratados según el protocolo experimental (Figura 6A). Durante el tratamiento, se registraron las señales de bioluminiscencia utilizando la imagenología in vivo en animales pequeños para controlar la metástasis hepática (Figura 6B). Las mediciones del peso corporal realizadas cada 3 días no mostraron cambios significativos entre los grupos (Figura 6C). Las fotografías del hígado (Figura 6D) revelaron densos nódulos metastásicos en las superficies del hígado en los grupos de PBS, irradiación de ultrasonido y EcNA, con metástasis voluminosas, textura dura, blanqueamiento y casi una pérdida completa de la morfología hepática normal. En contraste, los hígados en el grupo de irradiación de EcNA@Cur-Lip-FA + US mantuvieron una buena morfología, un color rojo brillante y menos o ningún nódulo hepático. Además, el coeficiente del órgano hepático (Figura 6E) en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA se redujo en comparación con el grupo de control (p < 0,05). La tinción con hematoxilina y eosina confirmó además (Figura 6F) la extensa infiltración de células tumorales invasivas en el hígado del grupo de control, mientras que solo se observaron lesiones pequeñas dispersas en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + US, y algunos tejidos hepáticos mostraron casi ninguna metástasis tumoral. Es interesante destacar que IL-6, TNF-α e IL-12p70 (Figura 6G-I) son citocinas antitumorales cruciales. Sus niveles aumentaron significativamente en los ratones sometidos a terapia con irradiación de EcNA@Cur-Lip-FA + US. Finalmente, la curva de pronóstico de supervivencia mostró que la irradiación de EcNA@Cur-Lip-FA + US prolongó significativamente la supervivencia de los ratones con tumor (Figura 6J). Estas evidencias demostraron que el tratamiento con EcNA@Cur-Lip-FA + US suprimió drásticamente la metástasis del CRC en el hígado y prolongó significativamente la supervivencia, lo que subraya su potencial como estrategia terapéutica.

Preparación y caracterización de EcNA@Cur-Lip-FA

La preparación de EcNA@Cur-Lip-FA se muestra en la Figura 1A. Primero, el plásmido bARG1 se transformó en EcN para generar EcNA, una bacteria que expresa vesículas extracelulares (VE). Como se muestra en la Figura S1, la electroforesis en gel demostró la expresión exitosa de los ARGs en EcN (EcNA), como lo demuestra la aparición de la banda objetivo en la tercera línea. Para respaldar aún más la construcción exitosa de EcNA, los experimentos de centrifugación revelaron que EcN se asentó por completo en el fondo del tubo, mientras que EcNA flotó en la superficie del líquido debido a la presencia de VE (Figura S2).

Para preparar EcNA@Cur-Lip-FA, primero empleamos el método clásico de película delgada para crear liposomas cargados con curcumina conjugados con ácido fólico (Cur-Lip-FA). El Western blot (WB) confirmó la sobreexpresión de FOLR1 en las células tumorales CT26 en comparación con las células intestinales normales NCM460 (Figura S3), lo que respalda el direccionamiento mediado por el receptor de folato. Posteriormente, EcNA y Cur-Lip-FA se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas para formar nanopartículas (NP) de EcNA@Cur-Lip-FA. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 1B) revelaron que, en comparación con el grupo EcN, la morfología de EcNA@Cur-Lip-FA se mantuvo similar, con VE blancas visibles dentro de las bacterias. El TEM de secciones delgadas (Figura 1C) reveló estructuras vesiculares en EcNA@Cur-Lip-FA, lo que confirmó la formación de NP. La espectroscopia UV-Vis (Figura S4) mostró un pico de absorción característico de 425 nm para Cur-Lip-FA, EcN@Cur-Lip-FA y EcNA@Cur-Lip-FA, lo que verificó la incorporación de Cur-Lip-FA. Se obtuvo una carga de curcumina del 5,8% (p/p), lo que superó los métodos informados anteriormente [^[23]]. Se realizó un análisis de colocalización etiquetando Cur-Lip-FA con DiO (verde) y EcNA con DAPI (azul). Como se muestra en la Figura 1D, la superposición de las señales verde y azul verificó aún más la preparación exitosa de EcNA@Cur-Lip-FA. Para evaluar la morfología de las bacterias, se empleó la microscopía de fuerza atómica (AFM). Como se muestra en la Figura 1E, EcN exhibió una forma de bastón típica con una superficie lisa. Después de la transformación y la expresión de los ARGs, EcNA conservó su forma de bastón, pero exhibió una mayor rugosidad superficial y deformación. En contraste, la superficie de EcNA@Cur-Lip-FA se volvió notablemente más áspera, con estructuras esféricas visibles, probablemente debido a la adsorción de liposomas en la superficie bacteriana y la expresión de proteínas. El análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS) (Figura S5) reveló que EcNA tenía un tamaño de partícula de 2299,8 nm, mientras que Cur-Lip-FA exhibió un tamaño de partícula promedio más pequeño de 147,9 nm. Después de la modificación con Cur-Lip-FA, el tamaño de partícula de EcNA@Cur-Lip-FA aumentó significativamente a 3085,7 nm, con un potencial zeta de -25,2 mV (Figura S6).

Como se muestra en la Figura 1F, la liberación acumulativa de curcumina de EcNA@Cur-Lip-FA + US a pH 5,0 durante 48 horas fue de aproximadamente el 80%, significativamente mayor que la tasa de liberación sin US y a pH 7,4. Esto demostró que EcNA@Cur-Lip-FA puede lograr una liberación controlada dependiente del pH y del US. A continuación, evaluamos la farmacocinética de la curcumina después de la administración oral de EcNA@Cur-Lip-FA y Cur-Lip-FA en ratones. Las curvas de concentración plasmática-tiempo de curcumina se muestran en la Figura 1G. En comparación con la suspensión de curcumina sola, tanto Cur-Lip-FA como EcNA@Cur-Lip-FA dieron como resultado un aumento significativo en la concentración plasmática de curcumina después de la administración oral. En particular, EcNA@Cur-Lip-FA exhibió el perfil farmacocinético óptimo, lo que se puede atribuir a la capacidad de EcN para colonizar el intestino, lo que permite la liberación sostenida de curcumina con el tiempo. Finalmente, evaluamos la capacidad diagnóstica de EcNA@Cur-Lip-FA para el CRC. Como se ilustra en la Figura 1H, la imagenología por ultrasonido reveló que EcNA@Cur-Lip-FA mostró límites tumorales más distintos en comparación con el control, lo que sugiere una mejora en la detección del tumor. Además, la Figura S7A también verificó que EcNA@Cur-Lip-FA exhibió un buen direccionamiento en ratones con tumor. Los datos cuantitativos mostraron los mismos resultados (Figura S7B). La Figura S8 confirmó además que EcNA@Cur-Lip-FA logró una colonización intestinal más fuerte y persistente que EcNA solo. Estos hallazgos subrayaron el potencial de EcNA@Cur-Lip-FA como una plataforma diagnóstica y terapéutica integrada para el CRC, que combina una mejor administración de fármacos y la imagenología del tumor en un solo sistema.

Captación celular, citotoxicidad y eficacia antitumoral de EcNA@Cur-Lip-FA en células de cáncer colorrectal

Basándose en las propiedades fisicoquímicas únicas de la plataforma diagnóstica y terapéutica integrada EcNA@Cur‐Lip‐FA, este estudio evaluó sistemáticamente su eficiencia de captación celular, citotoxicidad y eficacia antitumoral en la línea celular CT26 de cáncer colorrectal. Para monitorizar la acumulación intracelular, investigamos la captación celular de EcNA@Cur‐Lip‐FA marcada con Cy5.5 por las células CT26. Después de 1 hora de coincubación, apareció fluorescencia roja en las células CT26 de cáncer colorrectal, lo que indica la captación inicial de EcNA@Cur‐Lip‐FA por las células tumorales. A medida que aumentaba el tiempo de incubación, la señal de fluorescencia roja intracelular se intensificó gradualmente y se hizo más pronunciada a las 8 horas (Figura S9). Los resultados demostraron que EcNA@Cur‐Lip‐FA puede ser captada eficazmente por las células tumorales, lo que permite una actividad antitumoral eficaz.

Para investigar más a fondo el efecto antitumoral de EcNA@Cur‐Lip‐FA, se evaluó la viabilidad celular en las células CT26 utilizando el ensayo CCK‐8. Como se muestra en la Figura 2A, la viabilidad celular disminuyó de forma dependiente de la dosis con el aumento de la concentración de EcNA@Cur‐Lip‐FA. Calculamos además la concentración inhibitoria media (IC50) de EcNA@Cur‐Lip‐FA + irradiación US contra las células CT26, y utilizamos esta concentración en los experimentos posteriores. Con el objetivo de evaluar la bioseguridad de EcNA@Cur‐Lip‐FA, también realizamos ensayos CCK‐8 en células epiteliales colónicas normales humanas NCM460, y los resultados mostraron que EcNA@Cur‐Lip‐FA tenía una baja citotoxicidad intrínseca hacia estas células normales (Figura S10). Posteriormente, se utilizó la tinción doble con Calcein‐AM/PI para evaluar visualmente la viabilidad celular. Los resultados indicaron que el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US mostró el cambio más drástico en la señal de fluorescencia en comparación con otros grupos (Figura 2B, Figura S11), atribuible principalmente a los efectos sinérgicos de la curcumina y la terapia fotodinámica (SDT). De manera similar, la citometría de flujo (FCM) demostró que el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US tenía una tasa de apoptosis del 35,6%, aproximadamente 10 veces mayor que el grupo de control y significativamente mayor que otros grupos (Figura 2C, D) (p < 0,001). Y el ensayo TUNEL (Figura 2E, Figura S12) confirmó la fragmentación del ADN, con una tasa TUNEL positiva del 17,7% (p < 0,001). El análisis WB (Figura 2F) indicó que en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis aumentaron significativamente, lo que indica el mismo resultado mencionado anteriormente. Los resultados del análisis cuantitativo se presentan en la Figura S13.

Considerando la confirmación de que EcNA@Cur‐Lip‐FA puede inducir significativamente la muerte celular, exploramos más a fondo su efecto inhibitorio sobre la proliferación de las células tumorales. El ensayo de formación de colonias (Figura 2G) reveló que EcNA@Cur‐Lip‐FA por sí sola solo causó un ligero efecto inhibitorio. EcNA o la irradiación US por sí solas tuvieron efectos limitados en el retraso de la formación de colonias. Sin embargo, cuando EcNA o la irradiación US se combinaron con Cur‐Lip‐FA, el efecto inhibitorio se mejoró sustancialmente. Además, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US (Figura 2H) demostró el efecto antiproductivo más notable, con una tasa de formación de colonias inferior al 20% (p < 0,001). El ensayo EdU (Figura S14) confirmó aún más esta tendencia, mostrando que el número de células EdU positivas en el grupo tratado con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US era casi indetectable. Estos resultados indicaron que el tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA combinado con la irradiación US puede lograr el efecto sinérgico óptimo en términos de citotoxicidad contra las células tumorales e inhibición de la proliferación tumoral.

Daño al ADN mediado por ROS y muerte celular inmunogénica inducidos por EcNA@Cur‐Lip‐FA

Animados por los satisfactorios efectos citotóxicos, exploramos más a fondo los mecanismos antitumorales subyacentes de EcNA@Cur‐Lip‐FA. Se ha demostrado que la curcumina ejerce efectos antitumorales al inducir la generación de ROS [^[24], ^[25], ^[26]]. Por lo tanto, detectamos la generación de ROS después de diferentes tratamientos. Como se muestra en la Figura S15A, el grupo de irradiación EcNA@Cur‐Lip‐FA + US indujo el nivel más alto de ROS, que fue 1,6 veces mayor que el del grupo Cur‐Lip‐FA + irradiación US y 2,7 veces mayor que el del grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA (p < 0,001). Se observó la misma tendencia bajo la microscopía de fluorescencia (Figura 3A, Figura S15B). Además, los ROS son mediadores clave del estrés oxidativo celular y su acumulación excesiva puede atacar directamente las membranas mitocondriales [^[27], ^[28]], lo que provoca una disminución del potencial de membrana mitocondrial (MMP). Los resultados mostraron (Figura S16) que después de 24 horas de tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la fluorescencia roja disminuyó mientras que la fluorescencia verde aumentó significativamente en comparación con el grupo de control, lo que indicó una disminución sustancial de MMP.

Numerosos estudios han demostrado que los ROS pueden inducir daño al ADN [^[29], ^[30]]. Para aclarar el papel del daño al ADN mediado por ROS en los efectos antitumorales, primero utilizamos el ensayo cometa para evaluar la rotura de cadena simple o doble del ADN (DSB). Como se muestra en la Figura 3B, las células tratadas con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US mostraron colas de cometa distintas, lo que indica un daño extenso del ADN DSB inducido por ROS. De manera similar al ensayo cometa, el análisis de inmunofluorescencia (Figura 3C, Figura S17) reveló una mayor intensidad de fluorescencia de γ‐H2AX en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US en comparación con los otros grupos. Dado que γ‐H2AX marca el ADN DSB [^[31]], estos resultados confirmaron aún más que EcNA@Cur‐Lip‐FA con irradiación US condujo principalmente al ADN DSB. Además, el ADN dañado puede ser reconocido por cGAS, que posteriormente cataliza la producción de cGAMP, activando así la vía descendente STING‐TBK1‐IRF3 [^[32]] (Figura 3D, E y Figura S18). Y la activación de esta vía puede desencadenar que las células secreten interferón de tipo I (IFN‐β) (Figura 3F), lo que puede inducir aún más la maduración de las células dendríticas (DC). En resumen, estos resultados indicaron que EcNA@Cur‐Lip‐FA con irradiación US puede inducir daño al ADN mediado por ROS, aumentar el ADN ds libre citoplásmico y activar indirectamente la vía cGAS‐STING.

Además de activar la vía cGAS‐STING, numerosos estudios han demostrado que la curcumina induce la generación de ROS [^[24], ^[25], ^[26]], lo que provoca estrés del retículo endoplásmico y, posteriormente, desencadena la muerte celular inmunogénica (ICD), caracterizada por la exposición de calreticulina (CRT) en la superficie celular y la liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP), como HMGB1 y ATP [^[33], ^[34]]. La Figura 3G y la Figura S19 revelaron que en los grupos de control, irradiación US sola y EcNA sola, las células CT26 tenían una intensidad de fluorescencia de CRT muy baja en su superficie. Sin embargo, después de que las células fueran tratadas con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la intensidad de fluorescencia de CRT alcanzó su punto máximo, duplicando la del grupo de irradiación Cur‐Lip‐FA + US. Por el contrario, la intensidad de fluorescencia de HMGB1 disminuyó (Figura 3H, Figura S20), ya que HMGB1 se libera fuera de la célula durante la ICD. Los resultados de WB reflejaron una tendencia consistente (Figura S21), mostrando niveles aumentados de CRT y HSP70 y niveles disminuidos de HMGB1. Además, en comparación con EcNA@Cur‐Lip‐FA sola, cuando EcNA@Cur‐Lip‐FA se combinó con la irradiación US, aumentó notablemente la secreción de ATP y la liberación de HMGB1 (Figura 3I, J), lo que demuestra que el efecto sonodinámico puede amplificar aún más el efecto ICD.

Además, la secreción de IFN‐β y la liberación de DAMP desencadenadas por la ICD pueden inducir la maduración de las DC, lo que a su vez activa la inmunidad antitumoral [^[35], ^[36]]. Por lo tanto, a continuación, cocultivamos células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) con sobrenadantes recogidos de células CT26 sometidas a diferentes tratamientos durante 48 horas (Figura 3K). El análisis de FCM (Figura 3L, M) demostró que en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, la tasa positiva de maduración de DC (CD80+CD86+) fue significativamente mayor que en otros grupos. En resumen, EcNA@Cur‐Lip‐FA combinada con la irradiación US ejerce sus efectos inmunostimulantes a través de un mecanismo dual que implica el daño al ADN mediado por ROS y la ICD. Por un lado, los niveles elevados de ROS inducen daño al ADN, lo que posteriormente activa la vía cGAS‐STING, lo que resulta en la producción de IFN‐β. Esto mejoró la presentación de antígenos y promovió la maduración de las DC. Por otro lado, los ROS también desencadenan la ICD, lo que lleva a la liberación de DAMP de las células tumorales moribundas, lo que estimula aún más la maduración de las DC. En conjunto, estas dos vías (Figura 3N) promovieron sinérgicamente una robusta respuesta inmune antitumoral, lo que destaca el potencial terapéutico de EcNA@Cur‐Lip‐FA + US como un potente activador inmune.

Efectos antiangiogénicos de EcNA@Cur‐Lip‐FA con irradiación US en el microambiente tumoral

Como se mencionó anteriormente, EcNA@Cur‐Lip‐FA combinada con la irradiación US mejora significativamente la inmunidad antitumoral a través de la ICD inducida por ROS y la activación de la vía de señalización cGAS‐STING. Sin embargo, el microambiente tumoral inmunosupresor (ITM) no solo está impulsado por la disfunción de las células inmunitarias, sino también por la hipoxia y la deficiencia de nutrientes que resultan de la angiogénesis tumoral anormal. Cabe destacar que la curcumina, un compuesto natural con actividades biológicas pleiotrópicas, ha demostrado inhibir la angiogénesis tumoral [^[37]]. Para explorar si EcNA@Cur‐Lip‐FA + irradiación US podría ejercer efectos antiangiogénicos adicionales, realizamos una serie de ensayos relacionados con la angiogénesis. Se realizó un ensayo de curación de heridas para evaluar el efecto de diferentes tratamientos sobre la migración de HUVEC. Como se muestra en la Figura 4A, el cierre del rasguño se retrasó significativamente después de 36 horas en los grupos Cur‐Lip‐FA + US y EcNA@Cur‐Lip‐FA, especialmente en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. El análisis cuantitativo (Figura 4B) mostró que la tasa de curación de la herida disminuyó hasta solo el 4,16% (p < 0,001) en el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US, lo que indica un potente efecto inhibitorio sobre la migración de HUVEC. Y los ensayos de invasión transwell (Figura 4C, D) revelaron resultados consistentes, con una capacidad de invasión marcadamente reducida después del tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. Estos hallazgos demostraron la eficacia sinérgica del tratamiento combinado en la supresión de la motilidad de las células endoteliales.

Para investigar más a fondo los mecanismos subyacentes, se emplearon la tinción de inmunofluorescencia (Figura 4E, F) y el análisis de WB (Figura 4G, Figura S22). Los resultados mostraron que la expresión de los principales marcadores proangiogénicos, incluidos VEGF, VEGFR1 y ANGPT1, se redujo significativamente después del tratamiento con EcNA@Cur‐Lip‐FA + US. Los efectos antiangiogénicos se validaron aún más a través de dos ensayos in vitro clásicos. Además, el grupo EcNA@Cur‐Lip‐FA + US exhibió una reducción del 60,2% en la longitud total de la rama y una disminución del 72,2% en el número de nodos en comparación con el control (p < 0,001), lo que indica una alteración grave de la formación de la red vascular (Figura 4H–J). De manera similar, el número de brotes de microvasos se redujo significativamente en un 80,9%, lo que confirma una fuerte inhibición del brote angiogénico (Figura 4K, L). Además, la normalización vascular tumoral mejoró notablemente el microambiente hipóxico y atenuó la acumulación de lactato (Figura S23). En resumen, estos resultados indican colectivamente que EcNA@Cur‐Lip‐FA + irradiación US no solo mejora la activación inmune, sino que también inhibe eficazmente la angiogénesis tumoral al reducir los factores proangiogénicos y alterar las funciones de HUVEC, ofreciendo así una ventaja terapéutica dual.

Evaluación de la bioseguridad de EcNA@Cur‐Lip‐FA: biocompatibilidad y evaluación histopatológica

Antes de evaluar la eficacia antitumoral in vivo, realizamos evaluaciones de bioseguridad exhaustivas. Como se muestra en la Figura S24B, EcNA@Cur‐Lip‐FA, incluso a 320 µg/mL, no desencadenó hemólisis, y la tasa de hemólisis se mantuvo constantemente por debajo del 5% en todas las concentraciones, lo que cumplió con los requisitos de biocompatibilidad para biomateriales. La tinción con H&E de los principales órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón e intestino) (Figura S24A) confirmó además que no hubo anomalías patológicas, como vacuolización celular, encogimiento nuclear o infiltración inflamatoria, en todos los grupos. Además, después de la exposición a EcNA@Cur‐Lip‐FA, los indicadores hematológicos y bioquímicos relevantes en los ratones (Figura S24C) no mostraron ninguna variación significativa del grupo de control. Estos resultados ofrecieron un respaldo de seguridad confiable para las investigaciones antitumorales in vivo posteriores de EcNA@Cur‐Lip‐FA.

Evaluación de las capacidades terapéuticas de EcNA@Cur-Lip-FA en modelos ortotópicos de cáncer colorrectal

Animados por los prometedores efectos antitumorales in vitro de EcNA@Cur-Lip-FA, exploramos más a fondo su eficacia terapéutica in vivo. Para ello, establecimos un modelo ortotópico de cáncer de colon CT26 en ratones BALB/c, que imita de cerca las características clínicas y patológicas del cáncer colorrectal humano. El protocolo de tratamiento se describe en la Figura 5A. El tratamiento con ultrasonidos se realizó 6 horas después de la administración por sonda.

La progresión tumoral se monitorizó dinámicamente mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo para evaluar la respuesta al tratamiento (Figura 5B). Los resultados revelaron que tanto el grupo de control como el grupo que recibió solo ultrasonidos mostraron un aumento progresivo de las señales de bioluminiscencia, lo que indica un crecimiento tumoral descontrolado y confirma que la irradiación con ultrasonidos por sí sola no tiene efecto terapéutico. En contraste, los grupos Cur-Lip-FA + ultrasonidos y EcNA@Cur-Lip-FA mostraron una modesta inhibición tumoral, lo que se refleja en un aumento relativamente más lento de la intensidad de la bioluminiscencia. De manera notable, el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos demostró una supresión casi completa de las señales de bioluminiscencia durante todo el período de tratamiento, lo que sugiere una robusta inhibición del crecimiento tumoral. Este resultado no solo destaca el efecto terapéutico sinérgico de EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación con ultrasonidos, sino que también sugiere una mayor capacidad de detección de lesiones y precisión diagnóstica. Es importante destacar que no se observaron cambios significativos en el peso corporal en todos los grupos durante el tratamiento (Figura S25), lo que indica que la formulación tiene una toxicidad sistémica mínima. Al final del experimento, se extirpó el colorrecto y se inspeccionó visualmente. En el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos, no se observaron tumores visibles, signos de obstrucción intestinal, edema, metástasis peritoneal ni metástasis hepática (Figura S26). Además, este grupo también mostró un tiempo de supervivencia significativamente prolongado (Figura 5C). En conjunto, estos hallazgos confirman la potente eficacia antitumoral in vivo y la seguridad de EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación con ultrasonidos, lo que lo posiciona como una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer colorrectal.

Los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 5D) revelaron apoptosis y necrosis de las células tumorales. En contraste, otros grupos de tratamiento mostraron diferentes grados de agrandamiento nuclear, hipercromasia y aumento de las figuras mitóticas. El análisis de inmunofluorescencia (Figura 5D, Figura S27) destacó aún más las diferencias significativas entre el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos y el grupo de control. Específicamente, el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos mostró un mayor número de células TUNEL-positivas (fluorescencia verde), lo que indica un marcado aumento de la apoptosis (Figura S27). Además, la intensidad de la fluorescencia de HIF-1α se redujo significativamente en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos en comparación con el control, lo que sugiere una supresión eficaz del microambiente hipóxico del tumor. La reducción de las intensidades de fluorescencia de CD31 y VEGF también indicó la inhibición de la angiogénesis. Además, Ki67, un marcador proteico nuclear asociado con la proliferación de las células tumorales y un indicador clave de la malignidad tumoral, fue notablemente menor en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos. En conjunto, estos resultados sugieren que EcNA@Cur-Lip-FA + la irradiación con ultrasonidos inhiben eficazmente la proliferación de las células tumorales, inducen la apoptosis, alivian el microambiente tumoral hipóxico y ejercen efectos antiangiogénicos, lo que es consistente con los hallazgos de los estudios in vitro.

Modulación del microambiente inmunitario tumoral por EcNA@Cur-Lip-FA con irradiación por ultrasonidos: perfilaje transcriptómico y mejora de la activación inmunitaria

Para evaluar el impacto de EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación con ultrasonidos en el microambiente tumoral inmunitario (ITM) in vivo, primero realizamos un análisis transcriptómico de los tejidos tumorales de los ratones tratados. El mapa de calor (Figura 5E) reveló diferencias significativas en la expresión génica entre el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos y el grupo de control (p < 0,05), lo que confirma una alteración sustancial en el perfil génico inmunitario. El diagrama de dispersión (Figura S28) identificó 983 genes sobreexpresados y 583 genes subexpresados (p < 0,05), lo que proporciona una visión general completa del efecto del tratamiento sobre la expresión génica. La red de interacción funcional (Figura S29) sugirió además que estos genes expresados de forma diferencial están estrechamente interconectados, lo que podría amplificar sus efectos biológicos. El análisis de enriquecimiento KEGG (Figura 5F) destacó las principales vías de señalización asociadas con la regulación de la respuesta inmunitaria, incluidas las interacciones citocina-receptor de citocinas, la señalización PI3K-Akt y las interacciones ECM-receptor (p < 0,05). Además, el análisis de enriquecimiento GO (Figura 5G) reveló que los genes sobreexpresados estaban implicados principalmente en procesos biológicos críticos, como la activación del sistema inmunitario, la respuesta al estrés, la migración celular, la regulación del ciclo celular y la unión a proteínas (p < 0,05). En general, estos hallazgos indicaron que EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación con ultrasonidos altera significativamente la expresión de los genes relacionados con la inmunidad en los tejidos tumorales.

Dada la capacidad de activación inmunitaria in vitro de EcNA@Cur-Lip-FA y los resultados del análisis transcriptómico, investigamos más a fondo la capacidad de activación inmunitaria sistémica in vivo de EcNA@Cur-Lip-FA. Las células dendríticas (DCs), como las principales células presentadoras de antígenos (APCs), son esenciales para iniciar las respuestas inmunitarias de las células T. Por lo tanto, evaluamos los efectos de los diferentes grupos de tratamiento sobre la maduración de las DCs y la inmunidad antitumoral utilizando citometría de flujo (FCM). Nuestros resultados revelaron que EcNA@Cur-Lip-FA combinado con la irradiación con ultrasonidos podía mejorar significativamente la proporción de DCs maduras CD80+CD86+ tanto en los ganglios linfáticos que drenan el tumor (Figura 5H, J) como en los tejidos tumorales (Figura S30), en comparación con los otros grupos. Esto sugiere que EcNA@Cur-Lip-FA puede promover eficazmente la maduración de las DCs, lo que es crucial para la presentación de antígenos y la activación de las células T. Además, el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos mostró un aumento sustancial de las células T citotóxicas CD8+ dentro del tumor (Figura 5I, K), lo que representa un aumento de aproximadamente 4,5 veces en comparación con el grupo de control. Además, hubo un aumento notable en la proporción de células T CD8+ que secretan granzima B (Figura 5L, Figura S31) e IFN-γ (Figura 5M, Figura S32), ambos marcadores de una mayor actividad citotóxica. El tratamiento con EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos también aumentó significativamente la presencia de células T CD4+ y CD8+ en el bazo (Figura 5N-P), lo que sugiere una activación sistémica de las respuestas de las células T. Es importante destacar que hubo una reducción significativa en la proporción de células T reguladoras (Tregs), que se sabe que suprimen las respuestas inmunitarias, tanto en el tumor (Figura 5Q, R) como en el bazo (Figura 5S, Figura S33). Esta disminución de las Tregs indicó que el tratamiento interrumpe eficazmente el microambiente inmunosupresor del tumor, promoviendo una respuesta inmunitaria antitumoral más robusta. Además, se midió un aumento significativo de las citocinas proinflamatorias IL-6, TNF-α e IL-12p70 en el suero en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos utilizando ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) (Figura S34A-C). Estas citocinas contribuyen a crear un microambiente inflamatorio que apoya la activación del sistema inmunitario antitumoral. En conclusión, la combinación de EcNA@Cur-Lip-FA y la irradiación con ultrasonidos promueve eficazmente la maduración de las DCs y mejora la activación de las células T CD8+, remodelando así el microambiente inmunitario tumoral y produciendo un efecto antitumoral robusto.

Inhibición de la metástasis hepática por EcNA@Cur-Lip-FA con irradiación por ultrasonidos

Dada la prometedora eficacia antitumoral de EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos en los tumores primarios, investigamos más a fondo su impacto en la metástasis tumoral. Se estableció un modelo de metástasis hepática mediante la inyección esplénica de células CT26-Luc, y los animales fueron tratados según el protocolo experimental (Figura 6A). Durante el tratamiento, se registraron las señales de bioluminiscencia mediante imágenes in vivo en animales pequeños para controlar la metástasis hepática (Figura 6B). Las mediciones del peso corporal realizadas cada 3 días no mostraron cambios significativos entre los grupos (Figura 6C). Las fotografías del hígado (Figura 6D) revelaron densos nódulos metastásicos en las superficies del hígado en los grupos de PBS, irradiación con ultrasonidos y EcNA, con metástasis voluminosas, textura dura, blanqueamiento y casi una pérdida completa de la morfología hepática normal. En contraste, los hígados del grupo EcNA@Cur-Lip-FA + irradiación con ultrasonidos mantuvieron una buena morfología, un color rojo brillante y menos o ningún nódulo hepático. Además, el coeficiente hepático (Figura 6E) en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA se redujo en comparación con el grupo de control (p < 0,05). La tinción con H&E confirmó además (Figura 6F) la extensa infiltración de células tumorales invasivas en el hígado del grupo de control, mientras que solo se observaron pequeñas lesiones dispersas en el grupo EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos, y algunos tejidos hepáticos mostraron casi ninguna metástasis tumoral. Es interesante destacar que IL-6, TNF-α e IL-12p70 (Figura 6G-I) son citocinas antitumorales cruciales. Sus niveles aumentaron significativamente en los ratones sometidos a terapia con EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos. Finalmente, la curva de pronóstico de supervivencia mostró que EcNA@Cur-Lip-FA + la irradiación con ultrasonidos prolongó significativamente la supervivencia de los ratones con tumor (Figura 6J). Estas evidencias demostraron que el tratamiento con EcNA@Cur-Lip-FA + ultrasonidos suprimió drásticamente la metástasis del cáncer colorrectal en el hígado y prolongó significativamente la supervivencia, lo que subraya su potencial como estrategia terapéutica.

Discusión

El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores malignos más comunes del tracto digestivo [^[38]]. El diagnóstico temprano y preciso y el tratamiento eficaz son cruciales para mejorar el pronóstico del paciente [^[39]]. EcN, como una de las probióticos modificadas genéticamente más utilizadas, demuestra amplias perspectivas de aplicación en el campo de las enfermedades gastrointestinales debido a sus destacadas características biológicas. Además, como anaerobio facultativo, EcN puede lograr una colonización dirigida en microambientes hipóxicos, como tumores o el colon, sirviendo así como una plataforma de administración de fármacos de precisión para mejorar la focalización y la biodisponibilidad de los fármacos [^[40], ^[41]]. Es importante destacar que EcN no solo es aplicable para el tratamiento de enfermedades, sino también para el diagnóstico [^[42]]. Al inducir a EcN a expresar ARGs y administrarlos en el cuerpo, debido a la importante diferencia de impedancia acústica entre estas vesículas y los tejidos biológicos circundantes, su presencia mejora significativamente la intensidad de la dispersión de ultrasonidos. Como resultado, el contraste de las imágenes de diagnóstico mejora y se puede lograr una imagen en tiempo real de su distribución dentro de los tejidos tumorales, lo que facilita un diagnóstico tumoral preciso.

Además, para mejorar la estabilidad y la eficacia de la curcumina in vivo, los investigadores han desarrollado varias plataformas de administración de fármacos basadas en sistemas de administración nano [^[43], ^[44]]. Los liposomas, en particular, muestran ser prometedores para la administración de curcumina, gracias a su estructura única de bicapa de fosfolípidos, que puede acomodar tanto fármacos lipofílicos como hidrofílicos [^[22], ^[45]]. Además, al modificar la superficie de los liposomas con ácido fólico (FA), que puede dirigirse activamente a los tumores a través del mecanismo mediado por ligandos, se puede mejorar aún más la eficiencia de captación de los liposomas en las células tumorales específicas [^[46]]. Además, la formación de una capa protectora se facilita mediante el clorhidrato de polialilamina (PAH), que establece una alta densidad de adhesión multivalente electrostática y un impedimento estérico en las superficies de las células EcN y los liposomas cargados con curcumina. Esto, a su vez, apoya aún más la estabilidad de las nanopartículas en el complejo microambiente intestinal. Bajo la influencia de los ultrasonidos, la curcumina se activa, generando ICD impulsado por ROS, que sirven como potentes señales de peligro para reclutar y promover la maduración de las células dendríticas (DCs), lo que a su vez activa aún más la inmunidad antitumoral.

En conclusión, desarrollamos EcNA@Cur‐Lip‐FA, un nanosistema antitumoral para el diagnóstico y la terapia del CCRC (Figura 7). Este nanosistema combina EcN, una bacteria probiótica modificada genéticamente, y liposomas modificados con FA que contienen curcumina. El FA permite la acumulación específica en el tumor, EcN modula la microbiota intestinal y potencia la inmunidad, y la irradiación con ultrasonido desencadena la activación de cGAS‐STING, la inducción de ICD y la antiangiogénesis a través de la curcumina. Los estudios in vitro e in vivo confirmaron la potente inhibición del crecimiento, la proliferación y la metástasis del tumor. En última instancia, este nanosistema permite un diagnóstico en tiempo real y no invasivo, así como una terapia sinérgica, ofreciendo un paradigma escalable para un diagnóstico y tratamiento integral del cáncer.

Materiales y Métodos

Preparación de los productos

El plásmido pET28a‐bARG1 se transformó en EcN, y los transformantes se cultivaron en LB a 37 °C hasta alcanzar una densidad óptica de 0,4-0,6 (A600), se indujo con IPTG a 30 °C durante 24 h y se recolectaron mediante flotación centrífuga (300× g, 4 °C, 4 h) para obtener EcNA. Para la preparación de Cur‐Lip‐FA, se disolvieron curcumina, DOPC, DOPG, DSPE‐PEG‐FA y colesterol (2:20:5:5:2,5 mg) en cloroformo, se secaron, se hidrataron con PBS, se sometieron a sonicación (130 W, 5 min, baño de hielo) y se extruyeron a través de membranas de policarbonato para formar liposomas uniformes. Finalmente, se incubó EcNA (OD600 = 2,0, 900 µL) con PAH (100 µL) durante 15 min y, a continuación, se hizo reaccionar con Cur‐Lip‐FA (100 µL) a temperatura ambiente durante 2 h; el producto se recolectó mediante centrifugación y se resuspendió en PBS (4 °C).

Modelo de tumor ortotópico de cáncer colorrectal

Se alojaron ratones BALB/c de cinco semanas de edad (SPF Biotechnology) en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Guangxi. Las células CT26‐Luc en fase logarítmica se mezclaron en una proporción de 1:1 con Matrigel hasta alcanzar una concentración final de 5 × 106 células/50 µL. Bajo anestesia, se inyectaron 50 µL de la suspensión de forma oblicua en la capa muscular de la pared cecal utilizando una aguja de 30 G, y se suturó la herida. Los ratones se dividieron en seis grupos (n = 5): (1) Control (no tratado), (2) US solo (1,0 MHz, 50 % de ciclo de trabajo, 2,0 W/cm2, 5 min), (3) EcNA (1 × 1010 UFC/kg), (4) Cur‐Lip‐FA (Cur: 100 mg/kg) + US (mismos parámetros), (5) EcNA@Cur‐Lip‐FA (Cur: 100 mg/kg) y (6) EcNA@Cur‐Lip‐FA (Cur: 100 mg/kg) + US. Se controló periódicamente el peso corporal y el crecimiento tumoral (mediante imagenología in vivo).

Ensayo de citotoxicidad in vitro

Se sembraron células CT26 y NCM460 a 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Después de tratar con varias concentraciones de EcNA@Cur‐Lip‐FA durante 8 h, las células se expusieron a US (1,0 MHz, 50 % de ciclo de trabajo, 1,0 W/cm2) durante 5 min y, a continuación, se incubaron durante otras 16 h. Se añadió solución CCK‐8 (ZP328‐3, Zomanbio, China) y se leyó la absorbancia a 450 nm.

Western Blotting

Inicialmente, se lavaron las células dos veces con PBS y, a continuación, se lisaron con NP‐40 (N8032, Solarbio, China) durante 30 min sobre hielo. La mezcla celular se centrifugó a 15 000 g durante 15 min a 4 °C. Se determinaron las concentraciones de proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (P0012S, Beyotime, China). Se cargaron cantidades iguales de proteína en el gel SDS‐PAGE (PG112, Epizyme, China). Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF. A continuación, se incubó la membrana con anticuerpos primarios, seguidos de anticuerpos secundarios. Los anticuerpos primarios incluyeron Cas‐3 (ABclonal, 1:1000), Bcl‐2 (ABclonal, 1:1000), Bax (ABclonal, 1:1000), GAPDH (Abways, 1:1000), p‐TBK1 (ABclonal, 1:1000), TBK1 (ABclonal, 1:1000), p‐IRF3 (ABclonal, 1:1000), IRF3 (ABclonal, 1:1000), p‐STING (AffInity, 1:1000), STING (ABclonal, 1:1000), HSP70 (ABclonal, 1:1000), Calreticulin (ABclonal, 1:1000), HMGB1 (ABclonal, 1:1000), VEGFR (Abways, 1:1000), ANGPT1 (ABclonal, 1:1000), VEGF (ABclonal, 1:1000), FOLR1 (STARTER, 1:1000) y β‐tubulina (ABclonal, 1:1000). El anticuerpo anti‐rabbit IgG (ABclonal, 1:1000) y el anticuerpo anti‐mouse IgG (ABclonal, 1:1000) se utilizaron como anticuerpo secundario. Las imágenes se visualizaron utilizando el software Image Lab (V.6.0.1; Bio‐Rad).

Ensayo de formación de tubos

Antes del experimento, se aplicó el gel de matriz a la placa de 96 pocillos. A continuación, se tomaron células de cordón umbilical humano (HUVEC) que habían sido sometidas a diferentes tratamientos y se ajustó su densidad a 3 × 105 células/mL. A continuación, se colocaron 100 µL de la suspensión celular verticalmente sobre la superficie del Matrigel solidificado (354248, Corning Incorporated, USA) y se dejó la placa en posición horizontal durante 5 min.

Citometría de flujo

Al final del experimento, se recolectaron el tumor, los bazo y los ganglios linfáticos y se cortaron en trozos pequeños. A continuación, estos trozos se disociaron en suspensiones de células individuales. A continuación, las células individuales se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia: Zombie‐APC‐CY7, CD86‐BV421, CD8‐FITC, GZMB‐BV421, CD3‐PE‐CY7, F4/80‐PC5.5, CD4‐APC, CD25‐BV421, Foxp3‐PE e IFN‐γ‐PE, siguiendo los protocolos del fabricante de Biolegend, EE. UU. Finalmente, las suspensiones celulares teñidas se cargaron en un citómetro de flujo para un análisis detallado.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentaron como la media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó utilizando ANOVA. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p inferiores a 0,05, y *p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 9.0.

Contribuciones de los autores

Yunxi Huang, Kang Zhang y Weizhong Tang diseñaron y apoyaron el proyecto. Jie Long, Yunfang Yu, Tongrui Shang, Xuezhong Mo, Feng Lin, Yunxi Huang, Zixuan Liang y Renchuan Liang realizaron los experimentos y recolectaron los datos. Jie Long, Feng Lin, Olivia Monteiro, Daniel Baptista‐Hon y Man Tong analizaron e interpretaron los datos. Jie Long, Yunxi Huang y Yunfang Yu redactaron, revisaron y editaron el artículo. Tongrui Shang, Dominic Chi‐Chung FOO y Lui Ng proporcionaron comentarios constructivos sobre la revisión del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el contenido de este artículo.

Financiación

Este trabajo fue financiado por la Fundación China para la Ciencia y la Tecnología Postdoctoral (Número de subvención MD763947), el Proyecto Especial de Base y Talento de Ciencia y Tecnología de Guangxi (Número de subvención GuikeAD24010010), el Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico de Macao (Número de subvención 0003/2021/AKP) y el Departamento de Ciencia y Tecnología de Guangdong (No. 2024B1212030002).

Declaración ética

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Guangxi (Nanning, China) con el número de aprobación: LW2025040. Todo el cuidado y los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales.

Conflicto de intereses

El profesor Kang Zhang es editor asociado de MedComm. Sin embargo, no participó en el proceso de revisión por pares ni en la toma de decisiones editoriales para este manuscrito. Todos los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.