Nanoplataforma multifuncional modificada con ácido hialurónico y hueca de MnO(2) que coadministra L-arginina y regorafenib para una terapia sinérgica contra el cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal (CCR) se sitúa como el tercer cáncer más diagnosticado a nivel mundial y representa la segunda causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer [^[1],^[2]]. La resección quirúrgica radical combinada con la disección de los ganglios linfáticos sigue siendo el estándar de oro para el tratamiento del CCR localizado. Sin embargo, las micrometástasis residuales posoperatorias y la presencia de un microambiente tumoral inmunosupresor (MTI) a menudo conducen a la recurrencia local y a la metástasis a distancia, lo que supone un importante obstáculo para la supervivencia a largo plazo de los pacientes [^[3],^[4]]. Las intervenciones clínicas actuales abarcan estrategias como la quimioterapia, la terapia dirigida a nivel molecular, la radioterapia, la terapia con inhibidores de puntos de control inmunitarios y los sistemas emergentes de administración de fármacos a nanoescala. No obstante, las monoterapias a menudo se ven limitadas por tasas de respuesta subóptimas o resistencia adquirida [^[5],^[6]]. En particular, un sistema de triple terapia que integre la quimiosensibilización, la regulación dirigida y la activación inmunitaria a través de mecanismos sinérgicos multimodales no solo puede superar las barreras biológicas de los tratamientos convencionales, sino también lograr una mayor eficacia y reducir los efectos secundarios mediante la administración de fármacos espacial y temporalmente precisa, ofreciendo una solución innovadora para mejorar la situación del tratamiento del CCR [^[1],^[7]].

El regorafenib (Reg), un inhibidor de la tirosina quinasa con múltiples dianas, inhibe eficazmente la angiogénesis y la proliferación tumoral en el CCR mediante la modulación precisa de las principales vías de señalización, como el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) [^[8],^[9]]. En comparación con los agentes quimioterapéuticos tradicionales, su mecanismo de bloqueo multidimensional de la progresión tumoral mejora significativamente la especificidad del tratamiento al tiempo que reduce el riesgo de toxicidad sistémica. Abordando la alta heterogeneidad y las características de evasión inmunitaria del CCR metastásico (CCRm), el regorafenib puede inhibir la neovascularización en los focos metastásicos mediante la regulación a la baja del eje HIF-1α/VEGF en las células tumorales y mejorar la actividad antitumoral del microambiente inmunitario mediante la modulación del estado de polarización de los macrófagos asociados al tumor (MAT) [^[10]]. El ensayo clínico CORRECT confirmó que el regorafenib prolonga la mediana de supervivencia global en 1,4 meses en pacientes con CCRm resistente a la quimioterapia estándar y aumenta significativamente la tasa de control de la enfermedad hasta el 41% [^[11]]. Sin embargo, este fármaco aún enfrenta los obstáculos comunes de la terapia dirigida, en particular en lo que respecta a la administración de fármacos y la resistencia [^[12],^[13]]. Por lo tanto, la optimización de la distribución espacio-temporal del fármaco a través de sistemas de administración de fármacos a nanoescala se ha convertido en una dirección de investigación vital para superar el actual estancamiento terapéutico. Por otro lado, aunque el regorafenib ejerce potentes efectos antiangiogénicos en el CCRm, su eficacia terapéutica se ve considerablemente obstaculizada por el microambiente tumoral inmunosupresor e hipóxico, lo que promueve la resistencia a los fármacos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de combinar la terapia antiangiogénica con modalidades sinérgicas capaces de modular el MTI, como la terapia quimiodinámica y la terapia con gases.

La terapia quimiodinámica (TQD) induce el daño o la apoptosis de las células tumorales mediante la generación de radicales hidroxilo (·OH) altamente reactivos a partir del abundante peróxido de hidrógeno (H2O2) en el MTI a través de reacciones de Fenton o Fenton-like [^[14],^[15]]. Sin embargo, la alta expresión de glutatión (GSH), un antioxidante clave en las células tumorales, elimina las especies reactivas de oxígeno (ERO), lo que compromete la eficacia de la TQD [^[16]]. En consecuencia, la selección de nanoagentes de TQD capaces de intervenir eficazmente en el MTI con alto contenido de GSH es crucial. El desarrollo de nanosistemas de TQD que puedan agotar de manera eficiente y completa el GSH tiene un valor significativo para mejorar la especificidad y la eficacia del tratamiento, aunque sigue siendo un desafío importante. Ciertos nanomateriales basados en metales pueden alterar el equilibrio redox del MTI al unirse específicamente al GSH, mientras que los iones metálicos liberados pueden producir radicales reactivos a través de reacciones de tipo Fenton. Estas propiedades únicas los convierten en candidatos prometedores para el desarrollo de nanoagentes para la TQD tumoral [^[17]]. Entre los diversos materiales candidatos, el dióxido de manganeso (MnO2) ha atraído una considerable atención debido a su excelente biocompatibilidad y su capacidad para metabolizarse en iones de Mn2+ solubles en agua [^[18],^[19]]. En particular, la disociación de las nanoestructuras durante el proceso de TQD abre nuevas posibilidades para su uso como portadores de fármacos. Sin embargo, las nanoestructuras tradicionales de MnO2 (por ejemplo, nanopartículas, nanohojas) son portadores menos ideales debido a su limitada capacidad de carga de fármacos. En contraste, los materiales de dióxido de manganeso hueco (H-MnO2, HMn), aprovechando su estructura de cavidad, no solo logran una alta carga de fármacos, sino que también permiten la construcción de sistemas de liberación de fármacos precisos y controlados [^[20],^[21]]. El desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos basados en HMn basados en esta característica tiene un valor de investigación significativo. Se espera que la aplicación de estos multifuncionales nanoagentes terapeuticos-diagnósticos supere los obstáculos técnicos de la administración tradicional de fármacos, proporcionando soluciones innovadoras para mejorar la eficacia de la terapia tumoral.

A pesar de las promesas individuales de estas terapias, ningún estudio ha integrado aún el regorafenib, la L-arginina y el H-MnO2 en una única nanoplattaforma para lograr una triple terapia sinérgica que combine la antiangiogénesis, la terapia quimiodinámica y la terapia con gas de óxido nítrico (NO). Basándonos en estas consideraciones, construimos nanopartículas de H-MnO2 cargadas con regorafenib (Reg) modificadas con ácido hialurónico (HA) y L-arginina (L-Arg) para generar ·OH independientemente de las limitaciones del MTI. El HA puede dirigirse a las células de CCR a través del receptor CD44, mejorando la eficiencia de la internalización celular de las nanopartículas y promoviendo su acumulación dentro del tumor [^[22]]. Simultáneamente, la L-arginina sirve como sustrato para la biosíntesis de NO asociada a la NOS en las células tumorales y en el MTI inflamatorio, lo que puede revertir la resistencia a los fármacos del tumor y activar la inmunidad antitumoral [^[23],^[24]]. Como se ilustra en la Fig. 1, la nanoplattaforma multifuncional (Reg y L-Arg@H-MnO2-HA, RLHMnH) puede dirigirse con precisión a los sitios tumorales a través de la mejora de la retención tumoral y la internalización celular después de la administración local. La modificación con HA mejora la biocompatibilidad y permite la unión a los receptores CD44 en las células tumorales. Posteriormente, RLHMnH no solo puede agotar el GSH intracelular para evitar la eliminación de las ERO, sino también desencadenar una reacción de tipo Fenton entre el Mn2+ y el H2O2 local, logrando así una mejora eficaz de la TQD tumoral. A medida que se descompone el marco de HMn, el Reg cargado se libera de forma controlada en el tejido tumoral, bloqueando la angiogénesis tumoral al inhibir la vía de señalización VEGFR2 y reduciendo la evasión inmunitaria inducida por la hipoxia, al tiempo que se combina con el NO para remodelar el MTI y activar las respuestas inmunitarias antitumorales. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en informar sobre una nanoplattaforma de MnO2 hueco modificada con HA para la coadministración de regorafenib y L-arginina, lo que permite la combinación sinérgica de la terapia quimiodinámica, la antiangiogénesis y la terapia con gases para el tratamiento del CCR. En resumen, esta novedosa nanopartícula multifuncional proporciona una nueva perspectiva para el tratamiento de los tumores colorrectales.

Materiales y métodos

Materiales

El regorafenib (Reg) se compró a MedChemExpress (EE. UU.). La L-arginina (L-Arg), el permanganato de potasio (KMnO4), el sulfato de manganeso (MnSO4) y el ácido hialurónico (HA, PM ≈ 200 kDa) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Todos los demás productos químicos y disolventes eran de grado analítico y se utilizaron sin purificación adicional. La línea celular de carcinoma de colon de ratón (CT26) y la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH-3T3) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Los ratones BALB/c (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) fueron suministrados por Vital River Laboratory (Pekín, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital del Distrito de Dazu de Chongqing y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales.

Síntesis de nanopartículas de SiO2

Las nanopartículas de SiO2 se sintetizaron mediante el método de Stöber con ligeras modificaciones [^[25]]. Brevemente, se preparó una mezcla de reacción agitando vigorosamente una solución que contenía 25 ml de etanol anhidro, 0,5 ml de agua ultrapura y 1,6 ml de solución de amoníaco en un baño de agua a temperatura constante a 45 °C durante 30 min. Posteriormente, se introdujo rápidamente 0,75 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) en la mezcla bajo agitación a 1000 rpm durante 1 min. A continuación, se redujo la velocidad de agitación a 500 rpm y se permitió que la reacción continuara durante la noche. Las nanoesferas de SiO2 resultantes se recogieron y se lavaron dos veces con agua y etanol.

Síntesis de nanopartículas de SiO2@MnO2 de núcleo-cáscara

Las nanopartículas de SiO2 sintetizadas se utilizaron como plantilla para fabricar la estructura de núcleo-cáscara. Específicamente, las nanopartículas de SiO2 se dispersaron ultrasónicamente en 10 ml de agua pura. A continuación, se añadió gota a gota 40 ml de una solución acuosa que contenía 250 mg de permanganato de potasio (KMnO4) a la dispersión bajo ultrasonido continuo. El ultrasonido se mantuvo durante 6 h a temperatura ambiente inicial, asegurando que la temperatura no superara los 50 °C durante todo el proceso. El precipitado de color marrón oscuro resultante, indicativo del recubrimiento de MnO2, se recogió por centrifugación a 14 800 rpm durante 30 min y se lavó tres veces con agua para obtener las nanopartículas de SiO2@MnO2 de núcleo-cáscara.

Síntesis de nanopartículas de H-MnO2 (HMn)

El HMnO2 se obtuvo mediante la eliminación del núcleo de SiO2 de las nanopartículas de SiO2@MnO2. Brevemente, las nanopartículas de SiO2@MnO2 se centrifugaron y el pellet se redispersó ultrasónicamente en 5 ml de una solución de carbonato de sodio (Na2CO3) 2 M (Solución A). A continuación, la Solución A se vertió en 20 ml de una solución de Na2CO3 2 M precalentada a 60 °C y se agitó durante la noche a la misma temperatura. Al día siguiente, el producto se recogió por centrifugación a 14 800 rpm y se lavó tres veces con agua para eliminar el silicato de sodio, obteniendo las nanoesferas de HMnO2 finales.

Carga de fármacos de regorafenib (Reg@H-MnO2, RHMn)

El regorafenib (Reg) se cargó en el nanocargador de HMnO2 mediante un simple método de adsorción. Específicamente, se mezclaron 125 ml de una dispersión de HMnO2 (2 mg/ml) con 25 ml de una solución de Rg (5 mg/ml, disuelta en DMSO) y se agitaron en la oscuridad durante 24 h. A continuación, la mezcla se centrifugó a 12 000 rpm durante 15 min para eliminar las moléculas de fármaco no cargadas. El pellet resultante, denominado RHMn, se recogió y se liofilizó para su uso posterior.

Modificación con L-arginina (Reg&L-Arg@H-MnO2, RLHMn)

Para cargar la L-arginina (L-Arg), se dispersaron 250 mg de nanopartículas RHMn y 2,5 g de L-Arg en 100 ml de agua desionizada y se agitaron durante 12 h. Las nanopartículas cargadas con L-Arg, designadas como RLHMn, se recogieron por centrifugación a 12 000 rpm durante 25 min.

Determinación de la capacidad de carga de fármacos y la eficiencia de encapsulación

El regorafenib (Reg) y la L-arginina (L-Arg) no encapsulados, presentes en el sobrenadante, se separaron de las nanopartículas cargadas con el fármaco mediante centrifugación (12.000 rpm, 15 min) utilizando tubos de ultrafiltración. Las cantidades de fármacos libres se determinaron utilizando métodos espectroscópicos específicos. Concretamente, para garantizar la disolución completa del regorafenib hidrofóbico, el sobrenadante se mezcló primero con un volumen igual de disolvente orgánico antes de la medición. La concentración de regorafenib en esta solución clarificada se determinó posteriormente utilizando un espectrofotómetro UV-Vis a una longitud de onda máxima (λmax) de 265 nm, basándose en una curva estándar preestablecida preparada en la mezcla de disolventes correspondiente. Para verificar aún más la precisión de los datos de carga, la carga del fármaco se validó adicionalmente disolviendo las nanopartículas liofilizadas cargadas con el fármaco en DMSO/HCl para liberar completamente el regorafenib encapsulado, y el contenido total del fármaco se cuantificó utilizando el mismo método UV-Vis. Dado que la L-arginina carece de una fuerte absorción natural en el rango UV, su concentración se cuantificó utilizando el ensayo colorimétrico clásico con ninhidrina. Brevemente, el sobrenadante se mezcló con una solución de reactivo de ninhidrina y se calentó a 95 °C durante 15 min. La reacción produjo un complejo azul-púrpura, que luego se midió por espectrofotometría UV-Vis a una longitud de onda máxima (λmax) de 570 nm frente a una curva estándar de L-Arg. Para eliminar posibles interferencias ópticas de los componentes de las nanopartículas, el sobrenadante de nanopartículas en blanco (sin carga de fármaco) sometido a los mismos procedimientos se utilizó como control en blanco para la sustracción del fondo. La eficiencia de encapsulación (EE) y la capacidad de carga (LC) se calcularon según las siguientes fórmulas: donde Mtotal es la masa inicial del fármaco añadido, Mfree es la masa del fármaco no encapsulado en el sobrenadante y Mnanopartículas es la masa total de las nanopartículas cargadas con el fármaco recuperadas.

Recubrimiento con ácido hialurónico (Reg & L-Arg@H-MnO2, RLHMnH)

El recubrimiento con HA se logró mediante una reacción de acoplamiento catalizada por carbodiimida. Primero, se preparó una solución de reacción (Solución A) disolviendo 240 mg de EDC y 240 mg de NHS en 90 mL de agua ultrapura, seguido de la adición de 60 mg de HA. La solución A se agitó a temperatura ambiente durante 3 h para activar los grupos carboxilo. Para la síntesis de RHMnH, 250 mg de nanopartículas RHMn se dispersaron mediante sonicación en 30 mL de agua desionizada y luego se añadieron gradualmente por goteo a la solución A. Se permitió que la reacción continuara durante 12 h bajo agitación protegida de la luz. El producto final se recogió lavándolo dos veces con agua desionizada y liofilizándolo. La síntesis de RHMnH siguió un procedimiento idéntico, excepto que se utilizaron nanopartículas RLHMn (250 mg) como material de partida en lugar de RHMn.

Caracterización de las nanopartículas

La morfología y la estructura de H-MnO2 y RLHMnH se caracterizaron utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL JEM-2100) y microscopía electrónica de barrido (SEM, Hitachi SU8010). El mapeo elemental se realizó utilizando espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS) acoplada al SEM. La distribución del tamaño hidrodinámico y el potencial zeta se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS. La composición química y la modificación de la superficie se analizaron mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, Thermo Scientific Escalab 250Xi) y espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier (FTIR, Nicolet iS50). Todas las mediciones se realizaron por triplicado a 25 °C. Para evaluar la estabilidad coloidal, las nanopartículas RLHMnH se dispersaron en agua desionizada, PBS y DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS). Sus diámetros hidrodinámicos se controlaron continuamente mediante DLS durante un período de incubación de 7 días a temperatura ambiente.

Perfil de liberación del fármaco

El comportamiento de liberación dependiente del pH de Reg a partir de RLHMnH se investigó utilizando bolsas de diálisis (MWCO: 3,5 kDa). Las dispersiones de RLHMnH se colocaron en PBS a diferentes valores de pH (7,4 y 6,5) y se agitaron a 37 °C. En intervalos de tiempo predeterminados, se tomaron muestras y se reemplazaron con tampón fresco. La cantidad de Reg liberado se cuantificó mediante HPLC.

Captación y direccionamiento celular in vitro

Las células CT26 y NIH-3T3 se utilizaron para evaluar la captación celular y la capacidad de direccionamiento mediada por CD44 de RLHMnH. RLHMnH marcada con Cy5 se incubó con las células durante 2 h y 4 h. Luego, las células se lavaron, se fijaron y se observaron bajo un microscopio confocal de barrido láser (CLSM, Zeiss LSM 880). Para el análisis de escape lisosomal, se utilizó LysoTracker Green para teñir los lisosomas y se analizó la colocalización con las señales de Cy5.

Citotoxicidad y eficacia antitumoral in vitro

La citotoxicidad de varias formulaciones (HMn, RHMn, RHMnH, RLHMnH) frente a las células CT26 y NIH-3T3 se evaluó utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con diferentes nanopartículas durante 24, 48 y 72 h. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Los niveles intracelulares de ROS se detectaron utilizando la sonda DCFH-DA, y la producción de NO se midió utilizando la sonda DAX-J2 Orange. Los niveles de GSH se cuantificaron utilizando un kit de ensayo comercial de GSH. Se realizó Western blotting para analizar la expresión de VEGFR2, Caspasa-3 clivada, Notch1, p-AKT y p-ERK.

Para evaluar la inducción de ICD, las células CT26 se sembraron en placas de múltiples pocillos y se sometieron a tratamientos. Para el análisis de la exposición a calreticulina (CRT), las células tratadas se fijaron sin permeabilización, seguido de la incubación con un anticuerpo primario anti-CRT y un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. Las señales de CRT localizadas en la membrana se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia. Para cuantificar la liberación de ATP, se recogieron los sobrenadantes de cultivo de las células tratadas y se midió la concentración de ATP extracelular utilizando un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP según las instrucciones del fabricante.

Estudio antitumoral in vivo

Los ratones BALB/c se inocularon subcutáneamente con células CT26 (1 × 106 células por ratón) para establecer un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 5): 1. Control (PBS) 2. HMn 3. RHMn 4. RHMnH 5. RLHMnH. Los ratones recibieron inyecciones intratumorales cada dos días durante 14 días. Los volúmenes tumorales y el peso corporal se registraron cada dos días. Después del tratamiento, se recogieron los tumores y los órganos principales para el análisis histológico (tinción con H&E, TUNEL, inmunohistoquímica para Ki67 y CD31). La infiltración de células inmunitarias (células T CD4+, células T CD8+, macrófagos M1/M2) se analizó mediante citometría de flujo.

Análisis transcriptómico mediante RNA-seq

Se extrajo el ARN total de los tumores CT26 recogidos utilizando el reactivo TRIzol. Se evaluó la calidad del ARN para determinar la concentración y la integridad. Se construyeron bibliotecas de secuenciación a partir de muestras de ARN cualificadas siguiendo el flujo de trabajo estándar de enriquecimiento de ARNm, fragmentación, síntesis de ADNc y ligación de adaptadores. Las bibliotecas finales se cuantificaron y se verificó la distribución del tamaño antes de someterlas a secuenciación de doble extremo en una plataforma DNBSEQ. Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron con control de calidad para obtener lecturas limpias. Estas lecturas se alinearon con el genoma de referencia del ratón (GRCm39.109) para la cuantificación de la expresión génica. Se realizó un análisis de expresión diferencial entre los grupos tratados con RLHMnH y los grupos de control, y los genes que cumplieran los umbrales de |log2FC| ≥ 1 y FDR < 0,05 se definieron como significativos. Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional (GO y KEGG) y un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en los conjuntos de genes resultantes para identificar las vías biológicas alteradas.

Evaluación de la bioseguridad

Se midieron los parámetros bioquímicos séricos (AST, ALT, BUN, CREA, CK, etc.) utilizando kits de ensayo comerciales. Los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) se seccionaron y se tiñeron con H&E para el examen histopatológico.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey utilizando GraphPad Prism 9.0. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Materiales

El regorafenib (Reg) se compró a MedChemExpress (EE. UU.). La L-arginina (L-Arg), el permanganato de potasio (KMnO4), el sulfato de manganeso (MnSO4) y el ácido hialurónico (HA, PM ≈ 200 kDa) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Todos los demás productos químicos y disolventes eran de grado analítico y se utilizaron sin purificación adicional. La línea celular de carcinoma de colon de ratón (CT26) y la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH-3T3) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Los ratones BALB/c (hembras, de 6 a 8 semanas de edad) fueron suministrados por Vital River Laboratory (Pekín, China). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital del Distrito de Chongqing Dazu y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales.

Síntesis de nanopartículas de SiO2

Las nanopartículas de SiO2 se sintetizaron mediante el método de Stöber con ligeras modificaciones [^[25]]. Brevemente, se preparó una mezcla de reacción agitando vigorosamente una solución que contenía 25 mL de etanol anhidro, 0,5 mL de agua ultrapura y 1,6 mL de solución de amoníaco en un baño de agua a temperatura constante a 45 °C durante 30 min. Posteriormente, se introdujo rápidamente 0,75 mL de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) en la mezcla bajo agitación a 1000 rpm durante 1 min. La velocidad de agitación se redujo a 500 rpm y se permitió que la reacción continuara durante la noche. Las nanoesferas de SiO2 resultantes se recogieron y se lavaron dos veces con agua y etanol.

Síntesis de nanopartículas de SiO2@MnO2 de núcleo-cáscara

Las nanopartículas de SiO2 sintetizadas se utilizaron como plantilla para fabricar la estructura de núcleo-cáscara. Concretamente, las nanopartículas de SiO2 se dispersaron mediante sonicación en 10 mL de agua pura. A continuación, se añadió por goteo 40 mL de una solución acuosa que contenía 250 mg de permanganato de potasio (KMnO4) a la dispersión bajo sonicación continua. La sonicación se mantuvo durante 6 h a temperatura ambiente inicial, asegurando que la temperatura no superara los 50 °C durante todo el proceso. El precipitado marrón oscuro resultante, indicativo del recubrimiento de MnO2, se recogió mediante centrifugación a 14.800 rpm durante 30 min y se lavó tres veces con agua para obtener las nanopartículas de SiO2@MnO2 de núcleo-cáscara.

Síntesis de nanopartículas de H-MnO2 (HMn)

Los HMnO2 se obtuvieron mediante la eliminación del núcleo de SiO2 de las nanopartículas de SiO2@MnO2. Brevemente, las nanopartículas de SiO2@MnO2 se centrifugaron y el pellet se redispersó mediante sonicación en 5 mL de una solución de carbonato de sodio (Na2CO3) 2 M (Solución A). A continuación, la solución A se vertió en 20 mL de una solución de Na2CO3 2 M precalentada a 60 °C y se agitó durante la noche a la misma temperatura. Al día siguiente, el producto se recogió mediante centrifugación a 14.800 rpm y se lavó tres veces con agua para eliminar el silicato de sodio, obteniendo las nanoesferas de HMnO2 finales.

Carga de fármaco de regorafenib (Reg@H-MnO2, RHMn)

El regorafenib (Reg) se cargó en el nanocargador de HMnO2 mediante un simple método de adsorción. Concretamente, se mezclaron 125 mL de una dispersión de HMnO2 (2 mg/mL) con 25 mL de una solución de Rg (5 mg/mL, disuelta en DMSO) y se agitaron en la oscuridad durante 24 h. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min para eliminar las moléculas de fármaco no cargadas. El pellet resultante, denominado RHMn, se recogió y se liofilizó para su uso posterior.

Modificación con L-arginina (Reg&L-Arg@H-MnO2, RLHMn)

Para cargar L-arginina (L-Arg), se dispersaron conjuntamente nanopartículas RHMn (250 mg) y L-Arg (2,5 g) en 100 mL de agua desionizada y se agitaron durante 12 h. Las nanopartículas cargadas con L-Arg, designadas como RLHMn, se recogieron mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 25 min.

Determinación de la capacidad de carga del fármaco y la eficiencia de encapsulación

El regorafenib (Reg) y la L-arginina (L-Arg) no encapsulados presentes en el sobrenadante se separaron de las nanopartículas cargadas con el fármaco mediante centrifugación (12.000 rpm, 15 min) utilizando tubos de ultrafiltración. Las cantidades de fármacos libres se determinaron utilizando métodos espectroscópicos específicos. Concretamente, para garantizar la disolución completa del regorafenib hidrofóbico, el sobrenadante se mezcló primero con un volumen igual de disolvente orgánico antes de la medición. La concentración de regorafenib en esta solución clarificada se determinó posteriormente utilizando un espectrofotómetro UV-Vis a una longitud de onda máxima (λmax) de 265 nm, basándose en una curva estándar preestablecida preparada en la mezcla de disolventes correspondiente. Para verificar aún más la precisión de los datos de carga, la carga del fármaco se validó adicionalmente disolviendo las nanopartículas cargadas con el fármaco liofilizadas en DMSO/HCl para liberar completamente el regorafenib encapsulado, y el contenido total del fármaco se cuantificó utilizando el mismo método UV-Vis. Dado que la L-arginina carece de una fuerte absorción natural en el rango UV, su concentración se cuantificó utilizando el ensayo colorimétrico clásico de la ninhidrina. Brevemente, el sobrenadante se mezcló con una solución de reactivo de ninhidrina y se calentó a 95 °C durante 15 minutos. La reacción produjo un complejo azul-púrpura, que luego se midió por espectrofotometría UV-Vis a una longitud de onda máxima (λmax) de 570 nm frente a una curva estándar de L-Arg. Para eliminar posibles interferencias ópticas de los componentes de las nanopartículas, el sobrenadante de nanopartículas en blanco (sin carga de fármaco) sometido a los mismos procedimientos se utilizó como control en blanco para la sustracción del fondo. La eficiencia de encapsulación (EE) y la capacidad de carga (LC) se calcularon según las siguientes fórmulas: donde Mtotal es la masa inicial del fármaco añadido, Mfree es la masa del fármaco no encapsulado en el sobrenadante y Mnanopartículas es la masa total de las nanopartículas cargadas con el fármaco recuperadas.

Recubrimiento con ácido hialurónico (Reg & L-Arg@H-MnO2-HA, RLHMnH)

El recubrimiento con HA se logró mediante una reacción de acoplamiento catalizada por carbodiimida. Primero, se preparó una solución de reacción (Solución A) disolviendo 240 mg de EDC y 240 mg de NHS en 90 ml de agua ultrapura, seguida de la adición de 60 mg de HA. La solución A se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para activar los grupos carboxilo. Para la síntesis de RHMnH, 250 mg de nanopartículas RHMn se dispersaron mediante sonicación en 30 ml de agua desionizada y luego se añadieron gradualmente por goteo a la solución A. Se permitió que la reacción continuara durante 12 horas bajo agitación protegida de la luz. El producto final se recogió lavando dos veces con agua desionizada y liofilizando. La síntesis de RHMnH siguió un procedimiento idéntico, excepto que se utilizaron nanopartículas RLHMn (250 mg) como material de partida en lugar de RHMn.

Caracterización de las nanopartículas

La morfología y la estructura de H-MnO2 y RLHMnH se caracterizaron utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEOL JEM-2100) y microscopía electrónica de barrido (SEM, Hitachi SU8010). El mapeo elemental se realizó utilizando espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS) acoplada al SEM. El tamaño hidrodinámico de la distribución y el potencial zeta se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS. La composición química y la modificación de la superficie se analizaron mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, Thermo Scientific Escalab 250Xi) y espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier (FTIR, Nicolet iS50). Todas las mediciones se realizaron por triplicado a 25 °C. Para evaluar la estabilidad coloidal, las nanopartículas RLHMnH se dispersaron en agua desionizada, PBS y DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS). Sus diámetros hidrodinámicos se controlaron continuamente mediante DLS durante un período de incubación de 7 días a temperatura ambiente.

Perfil de liberación del fármaco

El comportamiento de liberación dependiente del pH de Reg a partir de RLHMnH se investigó utilizando bolsas de diálisis (MWCO: 3,5 kDa). Las dispersiones de RLHMnH se colocaron en PBS a diferentes valores de pH (7,4 y 6,5) y se agitaron a 37 °C. En intervalos de tiempo predeterminados, se tomaron muestras y se reemplazaron con tampón fresco. La cantidad de Reg liberado se cuantificó mediante HPLC.

Captación y direccionamiento celular in vitro

Se utilizaron células CT26 y NIH-3T3 para evaluar la captación celular y la capacidad de direccionamiento mediada por CD44 de RLHMnH. RLHMnH etiquetado con Cy5 se incubó con las células durante 2 y 4 horas. Las células se lavaron, se fijaron y se observaron bajo un microscopio confocal de barrido láser (CLSM, Zeiss LSM 880). Para el análisis de escape lisosomal, se utilizó LysoTracker Green para teñir los lisosomas, y se analizó la colocalización con las señales de Cy5.

Citotoxicidad y eficacia antitumoral in vitro

La citotoxicidad de varias formulaciones (HMn, RHMn, RHMnH, RLHMnH) frente a las células CT26 y NIH-3T3 se evaluó utilizando el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con diferentes nanopartículas durante 24, 48 y 72 horas. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Los niveles intracelulares de ROS se detectaron utilizando la sonda DCFH-DA, y la producción de NO se midió utilizando la sonda DAX-J2 Orange. Los niveles de GSH se cuantificaron utilizando un kit de ensayo comercial de GSH. Se realizó Western blotting para analizar la expresión de VEGFR2, Caspasa-3 clivada, Notch1, p-AKT y p-ERK.

Para evaluar la inducción de ICD, las células CT26 se sembraron en placas de múltiples pocillos y se sometieron a tratamientos. Para el análisis de la exposición de calreticulina (CRT), las células tratadas se fijaron sin permeabilización, seguida de la incubación con un anticuerpo primario anti-CRT y un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente. Las señales de CRT localizadas en la membrana se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia. Para cuantificar la liberación de ATP, se recogieron los sobrenadantes de cultivo de las células tratadas y se midió la concentración de ATP extracelular utilizando un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP según las instrucciones del fabricante.

Estudio antitumoral in vivo

Los ratones BALB/c se inocularon subcutáneamente con células CT26 (1 × 106 células por ratón) para establecer un modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (n = 5): 1. Control (PBS) 2. HMn 3. RHMn 4. RHMnH 5. RLHMnH. Los ratones recibieron inyecciones intratumorales cada dos días durante 14 días. Los volúmenes tumorales y el peso corporal se registraron cada dos días. Después del tratamiento, se recogieron los tumores y los órganos principales para su análisis histológico (tinción con H&E, TUNEL, inmunohistoquímica para Ki67 y CD31). La infiltración de células inmunitarias (células T CD4+ y CD8+, macrófagos M1/M2) se analizó mediante citometría de flujo.

Análisis transcriptómico mediante RNA-seq

Se extrajo el ARN total de los tumores CT26 recogidos utilizando el reactivo TRIzol. Se evaluó la calidad del ARN para determinar la concentración y la integridad. Se construyeron bibliotecas de secuenciación a partir de muestras de ARN cualificadas siguiendo el flujo de trabajo estándar de enriquecimiento de ARNm, fragmentación, síntesis de ADNc y ligación de adaptadores. Las bibliotecas finales se cuantificaron y se verificó la distribución del tamaño antes de someterlas a secuenciación de doble extremo en una plataforma DNBSEQ. Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron con control de calidad para obtener lecturas limpias. Estas lecturas se alinearon con el genoma de referencia del ratón (GRCm39.109) para la cuantificación de la expresión génica. Se realizó un análisis de expresión diferencial entre los grupos tratados con RLHMnH y el grupo control, y los genes que cumplieran los umbrales de |log2FC| ≥ 1 y FDR < 0,05 se definieron como significativos. Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional (GO y KEGG) y un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en los conjuntos de genes resultantes para identificar las vías biológicas alteradas.

Evaluación de la bioseguridad

Se midieron los parámetros bioquímicos séricos (AST, ALT, BUN, CREA, CK, etc.) utilizando kits de ensayo comerciales. Los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) se seccionaron y se tiñeron con H&E para el examen histopatológico.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey utilizando GraphPad Prism 9.0. Se consideró que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Caracterización de las nanopartículas HMn y RLHMnH

Las nanoestructuras del dióxido de manganeso hueco sintetizado (H-MnO2) y su complejo funcionalizado (Reg & L-Arg@H-MnO2-HA, RLHMnH) se caracterizaron sistemáticamente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM). Como se muestra en la Fig. 2A, el H-MnO2 puro exhibió una estructura hueca esférica regular con un diámetro uniforme (120 ± 15 nm) y un espesor de capa de aproximadamente 20 nm. El marcado contraste entre los bordes oscuros y el centro brillante en las imágenes de TEM confirmó el éxito de la construcción de la cavidad hueca. Las nanopartículas RLHMnH modificadas mantuvieron la integridad esférica al tiempo que mostraban una estructura de núcleo-cáscara clara, con una capa amorfa visible en la superficie, formada por la deposición secuencial del complejo L-Arg y el polímero HA. El análisis SEM (Fig. 2B) indicó además que RLHMnH estaba uniformemente disperso con buena monodispersidad, y el tamaño de las partículas aumentó ligeramente (150 ± 20 nm) debido a la modificación de la superficie. El mapeo elemental de espectroscopía de rayos X dispersiva de energía (EDS) (Fig. 2C) mostró una fuerte señal de Mn (verde) distribuida uniformemente en toda la nanoestructura, lo que confirmó la integridad del marco de H-MnO2. El elemento N detectado (azul) se asoció con la presencia de regorafenib (C21H15ClF4N4O3) y L-arginina (C6H14N4O2), lo que indica una carga de fármaco exitosa y una modificación de la superficie. La colocalización espacial de Mn (de H-MnO2), C/N (de Reg/L-Arg) y S (de HA) confirmó la integración jerárquica de los componentes terapéuticos dentro de la nanopartícula. El rendimiento de carga de fármacos de la nanoplataforma RLHMnH se cuantificó sistemáticamente. Gracias a la estructura mesoporosa hueca y las interacciones hidrofóbicas, la capacidad de carga (LC) y la eficiencia de encapsulación (EE) para el regorafenib se determinaron en 20,8% y 52,8%, respectivamente. Además, al emplear una estrategia de adsorción de gradiente de concentración, se logró una capacidad de carga satisfactoria de L-arginina del 11,5% (con una EE del 32,6%), lo que garantiza una disponibilidad de sustrato suficiente para la generación posterior de óxido nítrico.

El diámetro hidrodinámico y las características de carga superficial de HMn y sus nanopartículas funcionalizadas RLHMnH se evaluaron sistemáticamente mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Como se muestra en la Fig. 2D, las nanopartículas HMn puras exhibieron una distribución monomodal con un diámetro hidrodinámico promedio de 164,3 ± 3,7 nm (PDI = 0,18). Este valor fue ligeramente mayor que el tamaño en estado seco observado por TEM (120 nm), atribuible al efecto de la capa de solvatación y a la sensibilidad de DLS al estado hidratado. Después de la carga de fármacos y la modificación de la superficie, el tamaño de RLHMnH aumentó significativamente a 190,5 ± 4,2 nm (PDI = 0,21). El análisis de la carga superficial (Fig. 2E) corroboró aún más el proceso de modificación: HMn exhibió una fuerte electronegatividad (potencial zeta = -29,1 ± 0,9 mV) debido a los grupos hidroxilo de la superficie. El valor negativo del potencial de RLHMnH se debilitó (-26,8 ± 0,7 mV), originado en los grupos carboxilo (-COO-) de HA que neutralizaron parcialmente la carga superficial de HMn, mientras que los grupos amino (-NH3+) de L-Arg contribuyeron con carga positiva.

El espectro XPS completo del nanocomplejo RLHMnH (Fig. 2F) reveló claramente su composición elemental superficial y sus características de modificación química. La coexistencia de Mn 2p y O 1s indicó que el portador de MnO2 mantuvo la estabilidad química después de la modificación, y sus propiedades de óxido metálico proporcionaron sitios activos para la terapia fotodinámica (CDT). La señal de alta intensidad C 1s (que representa el 62,3%) se originó en el esqueleto del anillo de azúcar de HA y la estructura de la cadena de carbono de L-Arg, lo que indica la formación de una capa orgánica eficaz que recubre la superficie de la nanopartícula. La aparición del pico N 1s verificó directamente la modificación exitosa de la L-arginina (L-Arg).

Para verificar aún más la estructura química de HMn y el exitoso proceso de modificación superficial del nanocargador funcionalizado RLHMnH, se realizó una caracterización mediante espectroscopía FTIR (Fig. 2G). Para las nanopartículas de HMn, apareció un fuerte pico de absorción característico cerca de 580 cm-1, atribuido a la vibración de estiramiento del enlace Mn-O, lo que confirma la formación exitosa de la estructura de red cristalina de MnO2. Esta posición del pico fue consistente con el espectro estándar de dióxido de manganeso, lo que indica que el portador hueco de MnO2 poseía características típicas de óxido metálico. El nanocomplejo RLHMnH, después de la modificación con HA y L-Arg, exhibió cambios espectrales significativos. El espectro FTIR de RLHMnH exhibió nuevas bandas de absorción atribuibles a HA y L-Arg, particularmente el pico característico a 1650 cm-1 para el enlace amida, lo que confirmó la modificación superficial exitosa. Concurrentemente, la aparición de absorción en la región de 1250-1000 cm-1, característica de las vibraciones de estiramiento C-F, verificó la carga exitosa de Reg. Utilizando el ácido tereftálico (TA) como sonda, se investigó la capacidad de RLHMnH para generar ·OH. A medida que aumentaba la concentración de RLHMnH, la intensidad de la fluorescencia a 435 nm también aumentaba, lo que indica una característica dependiente de la concentración en la generación de ·OH (Fig. S1). Los experimentos de estabilidad para RLHMnH mostraron que el tamaño de partícula de RLHMnH no cambió significativamente con el tiempo, ni en PBS ni en medio DMEM al 10% de FBS, lo que indica que las nanopartículas preparadas poseían una buena estabilidad (Fig. S2). Las nanopartículas de HMn exhiben una respuesta al pH significativa; su estructura se degrada específicamente en las condiciones ligeramente ácidas del microambiente tumoral (pH ≈ 6,5), liberando el fármaco cargado y produciendo Mn2+ y oxígeno (O2). Este mecanismo de respuesta se deriva de la disolución del dióxido de manganeso en un ambiente ácido al reaccionar con H+, al tiempo que se consume el H2O2 sobreexpresado en el sitio tumoral, lo que mejora la hipoxia tumoral y logra la liberación controlada dirigida del fármaco. Este estudio tuvo como objetivo determinar si RLHMnH podría exhibir una liberación dependiente del pH de Reg. El pH del tejido tumoral (5,5-6,0) es típicamente más bajo que el pH del tejido normal (7,4). Como se muestra en la Fig. 2H, en comparación con la liberación total de aproximadamente el 16,1% de Reg a pH 7,4, RLHMnH liberó hasta el 55,6% de Reg a pH 6,5. Por lo tanto, el fármaco anticancerígeno Reg cargado en RLHMnH puede exhibir una liberación dependiente del pH, particularmente en las regiones del tejido del cáncer colorrectal.

Captación celular in vitro y direccionamiento a células tumorales

Si bien el efecto de permeabilidad y retención (EPR) en los tumores sólidos facilita el direccionamiento pasivo, a menudo limita la internalización eficiente de las nanopartículas por las células tumorales [^[26]]. Para abordar esto, construimos una estrategia de direccionamiento activo que se basa en un mecanismo receptor-ligando mediante la modificación de RLHMn con ácido hialurónico (HA, PM ≈ 200 kDa). CD44 es una compleja glicoproteína de adhesión transmembrana expresada en varias células humanas, incluidas las células madre embrionarias, las células diferenciadas y las células cancerosas. Se sobreexpresa con frecuencia en los tumores y, como un marcador reconocido de células madre cancerosas, sirve como un regulador clave de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), participando en la tumorigénesis, la progresión y la metástasis. Primero, medimos los niveles de expresión de ARNm de CD44 endógeno en las células CT26 y la línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH-3T3) (Fig. S3). Como se esperaba, los niveles de expresión de CD44 fueron significativamente más altos en las células CT26 que en las células NIH-3T3, lo que indica el potencial de CD44 como molécula diana. Se investigó la capacidad de direccionamiento a células tumorales de las nanopartículas utilizando RLHMnH marcado con Cy5. En consecuencia, se utilizaron células NIH-3T3 para verificar si la mayor captación de RLHMnH era específica de las células tumorales en lugar de las células normales. Como se muestra en la Fig. 3A, las células CT26 tratadas con RLHMnH marcado con Cy5 mostraron intensas señales fluorescentes rojas en el citoplasma. En contraste, las células NIH-3T3 tratadas con RLHMnH mostraron una fluorescencia de Cy5 casi indetectable. El análisis cuantitativo utilizando el software ImageJ confirmó que la intensidad media de fluorescencia intracelular del grupo de direccionamiento fue significativamente mayor que la del grupo no dirigido, como se muestra en la Fig. 3B. Estos fenómenos indican que RLHMnH puede aumentar significativamente la captación de RLHMn por las células CT26 a través de la unión dirigida HA-CD44. Además, la mayor captación fue específica de las células tumorales y no se observó en las células normales. Para validar la capacidad de escape lisosomal de RLHMnH, se realizó la colocalización lisosomal incubando las células CT26 con RLHMnH durante diferentes duraciones (Fig. 3C). A las 2 h, la fluorescencia roja de RLHMnH se superpuso en gran medida con la fluorescencia verde de los lisosomas (teñidos con LysoTracker Green), lo que indica que RLHMnH fue internalizado por las células CT26 y se colocalizó con los lisosomas. El área de superposición disminuyó gradualmente con el tiempo y se separó significativamente a las 4 h, lo que demuestra la capacidad de escape lisosomal de RLHMnH. Este proceso de escape dinámico se corroboró aún más mediante el análisis cuantitativo de colocalización (Fig. 3D).

Eficacia antitumoral in vitro y estudios mecanicistas

Para investigar el efecto terapéutico de RLHMnH sobre el cáncer colorrectal, realizamos ensayos celulares in vitro. En los experimentos in vitro, se configuraron un total de cinco subgrupos: 1. Control, 2. H-MnO2 (HMn), 3. Reg@H-MnO2 (RHMn), 4. Reg@H-MnO2-HA (RHMnH), 5. Reg y L-Arg@H-MnO2-HA (RLHMnH). Para verificar el efecto terapéutico sinérgico de los diversos componentes dentro del nanomaterial contra el cáncer de colon, co-cultivamos células CT26 y células NIH-3T3 con las diferentes formulaciones de nanopartículas durante 24, 48 y 72 h. En los tres puntos temporales, la viabilidad de las células CT26 en el grupo RLHMnH fue significativamente menor que en los otros grupos de materiales precursores (Fig. 4A). Debido al direccionamiento mediado por HA a CD44, la citotoxicidad de la nanoplataforma modificada se mejoró significativamente. La viabilidad de las células CT26 tratadas con la formulación dirigida disminuyó a aproximadamente el 20% a las 72 h, lo que fue notablemente menor que la viabilidad del 52% observada en el grupo de tratamiento RHMn. Concurrentemente, la baja expresión del receptor CD44 hizo que el direccionamiento con HA fuera ineficaz en las células NIH-3T3, y ninguno de los grupos de tratamiento mostró una toxicidad significativa hacia las células NIH-3T3 (viabilidad >80% a las 72 h) (Fig. 4B). Estos resultados indican preliminarmente que la combinación efectiva de componentes en RLHMnH puede ejercer un efecto antitumoral combinado, maximizando la muerte de las células tumorales e inhibiendo la proliferación celular. A continuación, buscamos investigar el impacto de RLHMnH en la proliferación de las células CT26. En comparación con el grupo de control, RLHMnH inhibió significativamente la tasa de proliferación celular. En consecuencia, los efectos inhibitorios sobre la proliferación celular en los grupos RHMnH y RHMn fueron mayores que en el grupo HMn, pero más débiles que en el grupo RLHMnH (Fig. S4). Como se muestra en la Fig. 4C, los niveles de GSH en los grupos RHMnH y RLHMnH fueron significativamente más bajos en comparación con los otros grupos. Este profundo agotamiento se puede atribuir a un mecanismo sinérgico: la estructura de la cavidad de MnO2 consume eficientemente GSH, y este proceso se amplifica aún más por el NO generado a partir de L-Arg, lo que intensifica sinérgicamente el estrés oxidativo. La acción colectiva de estos múltiples mecanismos conduce a un agotamiento casi completo de GSH, lo que inhibe eficazmente la eliminación de ROS y, por lo tanto, mejora el efecto antitumoral. Posteriormente, se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar el estado apoptótico de las células tratadas. En el punto temporal de 24 h, el grupo tratado con RLHMnH mostró una mayor proporción de células apoptóticas en comparación con el grupo de control y los grupos de materiales precursores (Fig. 4D y E).

En el modelo de células CT26, los niveles intracelulares de ROS mostraron diferencias significativas entre los diferentes grupos de tratamiento, lo que refleja las contribuciones funcionales de los diversos componentes en el nanosistema (Fig. 4F). El grupo de control mostró solo niveles basales de ROS. El grupo de tratamiento HMn indujo un aumento moderado de ROS debido al agotamiento parcial de GSH y al desencadenamiento de reacciones tipo Fenton mediadas por Mn2+. El grupo RHMn elevó aún más los niveles de ROS al inhibir las vías antioxidantes y exacerbar el estrés intracelular [^[27], ^[28]]. Notablemente, el grupo RHMnH exhibió una generación de ROS significativamente mayor, lo que se benefició del direccionamiento mediado por HA a CD44, lo que mejoró la eficiencia de la endocitosis celular, lo que a su vez amplificó la producción de ·OH impulsada por Mn2+. El grupo RLHMnH presentó el efecto de acumulación de ROS más sustancial. Este mecanismo se deriva de la liberación continua de NO a partir de L-Arg, lo que agota poderosamente GSH y maximiza los efectos del daño oxidativo. L-Arg puede facilitar la generación de gas NO. Mientras tanto, la producción de ROS intracelular también puede promover la liberación de NO a partir de L-Arg. DAF-FM es una sonda fluorescente que se une específicamente a NO para producir fluorescencia, lo que permite la detección de la generación de NO intracelular. Como se muestra en la Fig. 4G, después de la modificación con L-Arg, el grupo RLHMnH exhibió una fluorescencia roja significativa, lo que indica la presencia de producción de NO, con una intensidad de fluorescencia aproximadamente 8,9 veces mayor que la del grupo de control. Estos resultados demuestran el papel crítico del diseño combinatorio, que regula conjuntamente la generación de ROS y los mecanismos de defensa antioxidantes, para mejorar la eficacia quimiodinámica. Dado el estrés oxidativo y el daño intracelular causados por la generación sinérgica de ROS y NO, hipotetizamos que la nanoplataforma dirigida podría desencadenar eficazmente la muerte celular inmunogénica (ICD), sirviendo como una vacuna endógena para preparar las respuestas inmunitarias posteriores. Para verificar esto, se evaluaron in vitro los principales biomarcadores de ICD, a saber, la exposición superficial de calreticulina (CRT) y la liberación de ATP. Como se muestra en la Fig. S5A, se observó una prominente fluorescencia verde correspondiente a la CRT unida a la membrana en el grupo de tratamiento dirigido. En contraste, no se detectó una exposición insignificante de CRT en el control de PBS. Además, el análisis cuantitativo del medio de cultivo (Fig. S5B) confirmó un aumento masivo en la secreción extracelular de ATP después del tratamiento combinado. La emisión de estas moléculas asociadas al daño (DAMP) confirma la potente capacidad de inducción de ICD de la nanoplataforma, lo que sustenta la extensa activación de las células inmunitarias y la infiltración de células T observadas en los modelos portadores de tumores.

El análisis mediante Western Blot (Fig. 4H) reveló el mecanismo por el cual RLHMnH inhibe el crecimiento de las células tumorales a través de la sinergia ROS/NO. En comparación con el grupo de control, el grupo HMn solo redujo ligeramente la expresión de VEGFR2, lo que indica que el CDT por sí solo tiene un efecto limitado en la regulación de la angiogénesis. En contraste, los grupos RHMn y RHMnH redujeron significativamente los niveles de VEGFR2, lo que confirma que la administración dirigida de Reg bloquea eficazmente la señalización de VEGFR2. Cabe destacar que el grupo RLHMnH exhibió la mayor supresión de VEGFR2, originada en el NO derivado de L-Arg, que dilata los vasos sanguíneos tumorales y alivia la hipoxia, atenuando así la sobreexpresión de VEGFR2 inducida por el retroalimentación mediada por HIF-1α. En la vía de la apoptosis, RLHMnH indujo una expresión significativamente mayor de Caspasa-3 activada en comparación con los grupos RHMnH y HMn, un mecanismo estrechamente relacionado con la vía de apoptosis mitocondrial desencadenada por la sinergia ROS/NO. Otro hallazgo interesante fue la profunda inhibición del eje de señalización de Notch: el tratamiento con RLHMnH disminuyó significativamente la expresión de la proteína del dominio intracelular de Notch1 (NICD) y sus genes diana posteriores, Hes1 y Hey1, en comparación con el grupo de control, con una intensidad inhibitoria muy superior a la de los demás grupos. Los resultados anteriores demuestran que RLHMnH no solo activa directamente la proteína de ejecución de la apoptosis, Caspasa-3 activada, sino que también impacta significativamente el eje de señalización de Notch a través de la sinergia entre sus componentes. Un análisis más profundo mostró que se detectaron altos niveles basales de p-AKT y p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) en el grupo de control, lo que refleja el estado de activación inherente de la señalización proliferativa en las células CT26 (Fig. 4I). El grupo HMn solo redujo ligeramente p-AKT y no afectó significativamente p-ERK, lo que indica una intervención limitada en estas dos vías por parte del CDT solo. Cabe destacar que el efecto inhibidor se mejoró aún más en el grupo HA-modificado RHMnH en comparación con el grupo RHMn no dirigido, lo que se atribuye a la internalización dirigida mediada por CD44, que aumenta la concentración intracelular de Reg. El grupo RLHMnH exhibió la inhibición de la vía más significativa, bloqueando eficazmente el eje de señalización pro-supervivencia a través de una sinergia multi-objetivo. En resumen, a través de la acción sinérgica de sus componentes, RLHMnH se dirige y bloquea los ejes de señalización de Notch y P-AKT, y, en última instancia, logra una mejora significativa de la apoptosis dependiente de la caspasa.### Evaluación antitumoral in vivo

En experimentos anteriores, confirmamos el significativo efecto de eliminación dirigida de RLHMnH sobre las células CT26 in vitro. En esta sección, basándonos en nuestros resultados in vitro, establecimos además un modelo de xenoinjerto de células CT26 en ratones BALB/c. Los ratones BALB/c portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en cinco grupos que recibieron diferentes tratamientos, a saber, los grupos de control, HMn, RHMn, RHMnH y RLHMnH. A los ratones de los cuatro grupos de tratamiento con nanopartículas se les administró intratumoralmente sus respectivas formulaciones a una dosis constante de 15 mg/kg. El grupo de control recibió inyecciones intravenosas de un volumen igual de PBS. Después de 14 días de tratamiento con las respectivas formulaciones, se recolectaron tejidos tumorales de cada grupo de ratones (Fig. 5A). No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el peso corporal de los ratones de los cinco grupos después del período de tratamiento de 14 días (Fig. 5B). Además, las diferentes formulaciones de nanopartículas no afectaron la supervivencia de los ratones en ningún grupo. Un análisis más profundo del volumen y el peso del tumor reveló que el grupo RLHMnH tenía el menor volumen y peso tumoral promedio entre los cinco grupos (Fig. 5C y D), lo que indica que la sinergia entre Reg/L-Arg y HA en RLHMnH mejoró la eficacia terapéutica de las nanopartículas y proporcionó una supresión tumoral superior. Para evaluar la retención tumoral in vivo y la biodistribución después de la inyección intratumoral, se trató a los ratones con RLHMnH etiquetado con Cy5. La imagen in vivo durante 72 horas demostró una fluorescencia persistente estrictamente confinada a la región tumoral (Fig. S6A). La posterior imagen ex vivo y el análisis cuantitativo (Fig. S6B) confirmaron esta prolongada retención tumoral, con una señal insignificante que se filtraba a los órganos principales. Esta acumulación localizada estable, mejorada por la captación celular mediada por HA-CD44, garantiza una sólida eficacia terapéutica local al tiempo que minimiza la toxicidad sistémica.

Para investigar el mecanismo de la apoptosis tumoral, realizamos un análisis histológico mediante tinción con H&E. Como se muestra en la Fig. 5E, en comparación con el grupo de control, los tumores de los grupos RHMn, RHMnH y RLHMnH mostraron una condensación y fragmentación nuclear significativas, con los cambios más pronunciados observados en el grupo RLHMnH. El grupo HMn también mostró un ligero daño, pero fue menos evidente que en los otros grupos. Para validar aún más el efecto de amplificación de nuestro sistema in vivo, se cuantificaron los niveles reales de NO dentro de los tejidos tumorales extirpados utilizando un kit de ensayo de Griess (Fig. S7). Coherente con los hallazgos in vitro, los tejidos tumorales tratados con la nanoplataforma RLHMnH intacta exhibieron concentraciones de NO significativamente más altas que el grupo de control. Esta mejora significativa proporciona evidencia directa de que nuestro diseño de combinación puede amplificar eficazmente la generación de NO dentro del complejo microambiente tumoral. Para evaluar el estado proliferativo de las células tumorales en los tejidos, realizamos inmunohistoquímica (IHC) para detectar el nivel de expresión de Ki67 en los tejidos tumorales de cada grupo (Fig. 5F). Los resultados mostraron la mayor expresión de Ki67 en el grupo de control. La expresión se redujo en diversos grados en los grupos de nanopartículas precursoras, y la menor expresión de Ki67 se encontró en el grupo RLHMnH, lo que indica que el efecto sinérgico de los componentes en RLHMnH inhibió significativamente la proliferación de las células tumorales. CD31 (también conocido como PECAM-1) es un marcador de superficie específico de las células endoteliales vasculares. La detección de la expresión de CD31 revela claramente la distribución y la morfología de las células endoteliales vasculares en las secciones de tejido. Para verificar el efecto inhibidor de REG dentro de las nanopartículas sobre la angiogénesis del tejido tumoral, examinamos además la expresión de CD31 en los tejidos tumorales (Fig. 5G). Los resultados mostraron que, en el grupo HMn, la expresión de CD31 no mostró cambios significativos en comparación con el grupo de control. En contraste, la adición de Reg redujo significativamente la expresión de CD31. Además, debido a la modificación con HA, el grupo RLHMnH exhibió una mejor orientación hacia el tejido tumoral, lo que resultó en una disminución significativa de la expresión de CD31 en este grupo de tratamiento.### El análisis de RNA-seq revela alteraciones transcriptómicas inducidas por el tratamiento con RLHMnH

Para dilucidar aún más los mecanismos moleculares subyacentes a la eficacia antitumoral de RLHMnH, se realizó una secuenciación masiva de ARN en los tejidos tumorales CT26 después del tratamiento con RLHMnH. El análisis comparativo identificó un total de 877 genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos tratados con RLHMnH y el grupo de control (FDR 80% a las 72 horas) (Fig. 4B). Estos resultados indican preliminarmente que la combinación efectiva de componentes en RLHMnH puede ejercer un efecto antitumoral combinado, maximizando la muerte de las células tumorales e inhibiendo la proliferación celular. A continuación, buscamos investigar el impacto de RLHMnH en la proliferación de las células CT26. En comparación con el grupo de control, RLHMnH inhibió significativamente la tasa de proliferación celular. En consecuencia, los efectos inhibitorios sobre la proliferación celular en los grupos RHMnH y RHMn fueron mayores que en el grupo HMn, pero más débiles que en el grupo RLHMnH (Fig. S4). Como se muestra en la Fig. 4C, los niveles de GSH en los grupos RHMnH y RLHMnH fueron significativamente menores en comparación con los otros grupos. Este profundo agotamiento puede atribuirse a un mecanismo sinérgico: la estructura de cavidad de MnO2 consume eficientemente GSH, y este proceso se amplifica aún más por el NO generado a partir de L-Arg, lo que intensifica sinérgicamente el estrés oxidativo. La acción colectiva de estos múltiples mecanismos conduce a un agotamiento casi completo de GSH, lo que inhibe eficazmente la eliminación de ROS y, por lo tanto, mejora el efecto antitumoral. Posteriormente, se realizó un análisis de citometría de flujo para evaluar el estado apoptótico de las células tratadas. En el punto temporal de 24 horas, el grupo tratado con RLHMnH mostró una mayor proporción de células apoptóticas en comparación con el grupo de control y los grupos de materiales precursores (Fig. 4D y E).

En el modelo de células CT26, los niveles intracelulares de ROS mostraron diferencias significativas entre los diferentes grupos de tratamiento, lo que refleja las contribuciones funcionales de los diversos componentes en el nanosistema (Fig. 4F). El grupo de control mostró solo niveles basales de ROS. El grupo de tratamiento HMn indujo un aumento moderado de ROS debido al agotamiento parcial de GSH y al desencadenamiento de reacciones tipo Fenton mediadas por Mn2+. El grupo RHMn elevó aún más los niveles de ROS al inhibir las vías antioxidantes y exacerbar el estrés intracelular [^[27], ^[28]]. Notablemente, el grupo RHMnH exhibió una generación de ROS significativamente mayor, lo que se debió al direccionamiento mediado por HA hacia CD44, que mejoró la eficiencia de la endocitosis celular, amplificando así la producción de ·OH impulsada por Mn2+. El grupo RLHMnH presentó el efecto de acumulación de ROS más sustancial. Este mecanismo se deriva de la liberación continua de NO a partir de L-Arg, lo que agota poderosamente GSH y maximiza los efectos del daño oxidativo. L-Arg puede facilitar la generación de gas NO. Mientras tanto, la producción de ROS intracelular también puede promover la liberación de NO a partir de L-Arg. DAF-FM es una sonda fluorescente que se une específicamente a NO para producir fluorescencia, lo que permite la detección de la generación de NO intracelular. Como se muestra en la Fig. 4G, después de la modificación con L-Arg, el grupo RLHMnH exhibió una fluorescencia roja significativa, lo que indica la presencia de producción de NO, con una intensidad de fluorescencia aproximadamente 8,9 veces mayor que la del grupo de control. Estos resultados demuestran el papel crítico del diseño combinatorio, que regula conjuntamente la generación de ROS y los mecanismos de defensa antioxidantes, en la mejora de la eficacia quimiodinámica. Dado el estrés oxidativo y el daño intracelular causados por la generación sinérgica de ROS y NO, hipotetizamos que la nanoplataforma dirigida podría desencadenar eficazmente la muerte celular inmunogénica (ICD), sirviendo como una vacuna endógena para preparar las respuestas inmunitarias posteriores. Para verificar esto, se evaluaron in vitro los principales biomarcadores de ICD, a saber, la exposición superficial de calreticulina (CRT) y la liberación de ATP. Como se muestra en la Fig. S5A, se observó una fluorescencia verde prominente correspondiente a la CRT unida a la membrana en el grupo de tratamiento dirigido. Por el contrario, se detectó una exposición insignificante de CRT en el control de PBS. Además, el análisis cuantitativo del medio de cultivo (Fig. S5B) confirmó un aumento masivo en la secreción extracelular de ATP después del tratamiento combinado. La emisión de estas moléculas asociadas al daño (DAMP) críticas confirma la potente capacidad de inducción de ICD de la nanoplataforma, lo que sustenta la extensa activación de células inmunitarias y la infiltración de células T observadas en los modelos portadores de tumores.

El análisis de Western Blot (Fig. 4H) reveló el mecanismo por el cual RLHMnH inhibe el crecimiento de las células tumorales a través de la sinergia ROS/NO. En comparación con el grupo de control, el grupo HMn solo redujo ligeramente la expresión de VEGFR2, lo que indica que CDT por sí solo tiene un efecto limitado sobre la regulación de la angiogénesis. En contraste, los grupos RHMn y RHMnH redujeron significativamente los niveles de VEGFR2, lo que confirma que la administración dirigida de Reg bloquea eficazmente la señalización de VEGFR2. Notablemente, el grupo RLHMnH exhibió la supresión más fuerte de VEGFR2, originada en el NO derivado de L-Arg que dilata los vasos sanguíneos tumorales y alivia la hipoxia, atenuando así la regulación ascendente del retroceso de VEGFR2 impulsada por HIF-1α. En la vía de la apoptosis, RLHMnH indujo una expresión significativamente mayor de Caspasa-3 escindida en comparación con los grupos RHMnH y HMn, un mecanismo estrechamente relacionado con la vía de apoptosis mitocondrial desencadenada por la sinergia ROS/NO. Otro hallazgo interesante fue la profunda inhibición del eje de señalización de Notch: el tratamiento con RLHMnH disminuyó significativamente la expresión de la proteína del dominio intracelular de Notch (NICD) y sus genes diana posteriores Hes1 y Hey1 en comparación con el grupo de control, con una intensidad inhibitoria muy superior a la de los otros grupos. Los resultados anteriores demuestran que RLHMnH no solo activa directamente la proteína de ejecución de la apoptosis, Caspasa-3 escindida, sino que también impacta significativamente el eje de señalización de Notch a través de la sinergia entre sus componentes. Un análisis adicional mostró que se detectaron altos niveles basales de p-AKT y p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) en el grupo de control, lo que refleja el estado de activación inherente de la señalización proliferativa en las células CT26 (Fig. 4I). El grupo HMn solo redujo ligeramente p-AKT y no afectó significativamente p-ERK, lo que indica una intervención limitada en estas dos vías por parte de CDT por sí solo. Notablemente, el efecto inhibitorio se mejoró aún más en el grupo RHMnH modificado con HA en comparación con el grupo RHMn no dirigido, debido a la internalización dirigida mediada por CD44, lo que aumenta la concentración intracelular de Reg. El grupo RLHMnH exhibió la inhibición de la vía más significativa, bloqueando eficazmente el eje de señalización pro-supervivencia a través de la sinergia multi-objetivo. En resumen, a través de la acción sinérgica de sus componentes, RLHMnH se dirige y bloquea los ejes de señalización de Notch y P-AKT, y finalmente logra una mejora significativa de la apoptosis dependiente de la caspasa.

Evaluación antitumoral in vivo

En experimentos anteriores, confirmamos el significativo efecto de muerte celular dirigida de RLHMnH sobre las células CT26 in vitro. En esta sección, basándonos en nuestros resultados in vitro, establecimos además un modelo de xenoinjerto de células CT26 en ratones BALB/c. Los ratones BALB/c portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en cinco grupos que recibieron diferentes tratamientos, a saber, los grupos de control, HMn, RHMn, RHMnH y RLHMnH. A los ratones de los cuatro grupos de tratamiento de nanopartículas se les administró intratumoralmente sus respectivas formulaciones a una dosis constante de 15 mg/kg. El grupo de control recibió inyecciones intravenosas del mismo volumen de PBS. Después de 14 días de tratamiento con las respectivas formulaciones, se recolectaron tejidos tumorales de cada grupo de ratones (Fig. 5A). El peso corporal de los ratones de los cinco grupos no mostró diferencias estadísticamente significativas después del período de tratamiento de 14 días (Fig. 5B). Además, las diferentes formulaciones de nanopartículas no afectaron la supervivencia de los ratones en ningún grupo. Un análisis adicional del volumen y el peso del tumor reveló que el grupo RLHMnH tenía el menor volumen y peso tumoral promedio entre los cinco grupos (Fig. 5C y D), lo que indica que la sinergia entre Reg/L-Arg y HA en RLHMnH mejoró la eficacia terapéutica de las nanopartículas y proporcionó una supresión tumoral superior. Para evaluar la retención tumoral in vivo y la biodistribución después de la inyección intratumoral, se trató a los ratones con RLHMnH etiquetado con Cy5. La imagen in vivo durante 72 horas demostró una fluorescencia persistente estrictamente confinada a la región tumoral (Fig. S6A). El análisis ex vivo posterior y el análisis cuantitativo (Fig. S6B) confirmaron esta prolongada retención tumoral, con una señal insignificante que se filtraba a los órganos principales. Esta acumulación localizada estable, mejorada por la captación celular mediada por HA-CD44, garantiza una sólida eficacia terapéutica local al tiempo que minimiza la toxicidad sistémica.

Para investigar el mecanismo de la apoptosis tumoral, realizamos un análisis histológico mediante tinción con H&E. Como se muestra en la Fig. 5E, en comparación con el grupo de control, los tumores en los grupos RHMn, RHMnH y RLHMnH mostraron una condensación y fragmentación nuclear significativas, con los cambios más pronunciados observados en el grupo RLHMnH. El grupo HMn también mostró un ligero daño, pero fue menos evidente que en los otros grupos. Para validar aún más el efecto de amplificación de nuestro sistema in vivo, se cuantificaron los niveles reales de NO dentro de los tejidos tumorales extraídos utilizando un kit de ensayo de Griess (Fig. S7). Coherente con los hallazgos in vitro, los tejidos tumorales tratados con la nanoplataforma RLHMnH intacta exhibieron concentraciones de NO significativamente más altas que el grupo de control. Esta mejora significativa proporciona evidencia directa de que nuestro diseño combinatorio puede amplificar eficazmente la generación de NO dentro del complejo microambiente tumoral. Para evaluar el estado proliferativo de las células tumorales en los tejidos, realizamos inmunohistoquímica (IHC) para detectar el nivel de expresión de Ki67 en los tejidos tumorales de cada grupo (Fig. 5F). Los resultados mostraron la mayor expresión de Ki67 en el grupo de control. La expresión se redujo en diversos grados en los grupos de nanopartículas precursoras, y la menor expresión de Ki67 se encontró en el grupo RLHMnH, lo que indica que el efecto sinérgico de los componentes en RLHMnH inhibió significativamente la proliferación de las células tumorales. CD31 (también conocido como PECAM-1) es un marcador de superficie específico de las células endoteliales vasculares. La detección de la expresión de CD31 revela claramente la distribución y la morfología de las células endoteliales en las secciones de tejido. Para verificar el efecto inhibitorio de REG dentro de las nanopartículas sobre la angiogénesis del tejido tumoral, examinamos aún más la expresión de CD31 en los tejidos tumorales (Fig. 5G). Los resultados mostraron que en el grupo HMn, la expresión de CD31 no mostró cambios significativos en comparación con el grupo de control. En contraste, la adición de Reg redujo significativamente la expresión de CD31. Además, debido a la modificación con HA, el grupo RLHMnH exhibió un mejor direccionamiento hacia el tejido tumoral, lo que resultó en una disminución significativa de la expresión de CD31 en este grupo de tratamiento.

El análisis de RNA-seq revela alteraciones transcriptómicas inducidas por el tratamiento con RLHMnH

Para dilucidar aún más los mecanismos moleculares que subyacen a la eficacia antitumoral de RLHMnH, se realizó una secuenciación masiva de ARN en tejidos tumorales CT26 después del tratamiento con RLHMnH. El análisis comparativo identificó un total de 877 genes expresados diferencialmente (DEG) entre los grupos tratados con RLHMnH y los grupos de control (FDR