Un atlas exhaustivo de las alteraciones funcionales a nivel del proteoma que mapea el panorama de la respuesta a la quimioterapia.

Las terapias contra el cáncer han evolucionado desde la quimioterapia tradicional hasta enfoques más precisos, como las terapias dirigidas y las terapias celulares^[1]. A pesar de estos avances, la quimioterapia sigue siendo una opción de primera línea para muchos tipos de cáncer, a menudo debido a consideraciones de costo-beneficio y a la falta de objetivos moleculares bien definidos. Sin embargo, su eficacia clínica se ve con frecuencia limitada por la aparición de resistencia a los fármacos, que es una de las principales causas de fracaso del tratamiento y de la mortalidad relacionada con el cáncer^[2]. Para abordar este desafío y mejorar el impacto de la quimioterapia, combinarla con inhibidores dirigidos ofrece una estrategia prometedora para superar los mecanismos de resistencia y mejorar la eficacia terapéutica^[3]. La combinación de agentes quimioterapéuticos, como la doxorrubicina, con un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el gefitinib, ha demostrado ser potencialmente útil para interrumpir las vías de señalización clave, restaurando así la sensibilidad en las células cancerosas resistentes y mejorando los resultados del tratamiento^[4]. Es esencial comprender la dinámica molecular sistémica de la quimiorresistencia y la quimiosensibilización para diseñar racionalmente estrategias combinadas.

Los enfoques contemporáneos de la oncología de precisión se han basado principalmente en la elaboración de perfiles genómicos, como el secuenciamiento del genoma completo y del exoma completo, para identificar mutaciones accionables y guiar la terapia dirigida^[5]. Si bien estas estrategias han demostrado ser transformadoras para el tratamiento personalizado, han mostrado un valor predictivo limitado para las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos convencionales^[6]. Los datos genómicos y transcriptómicos, incluido el secuenciamiento de ARNm, a menudo proporcionan solo instantáneas estáticas de la biología tumoral y no logran capturar las propiedades funcionales y adaptativas de las células cancerosas bajo presión farmacológica. Los determinantes críticos de la sensibilidad a los fármacos, como la actividad de las vías, la abundancia de proteínas y la plasticidad celular, no se revelan fácilmente mediante estos análisis basados en el secuenciamiento^[7]. Para abordar estos desafíos, la genómica funcional ha surgido como un enfoque complementario poderoso a la elaboración de perfiles genéticos estáticos^[8]. Al alterar experimentalmente la expresión génica y medir los resultados fenotípicos, el cribado funcional puede descubrir los principales reguladores de la respuesta a los fármacos que permanecen invisibles para la elaboración de perfiles estáticos.

El método de genómica funcional más común es el cribado de pérdida de función, como el cribado de knockout CRISPR-Cas9^[9], que ha proporcionado información valiosa sobre las dependencias genéticas en el cáncer. Si bien es muy informativo, el cribado de knockout presenta algunos desafíos para confirmar el efecto de knockout de los genes que ya están silenciados, lo que representa aproximadamente el 50% de los genes codificantes de proteínas en cada línea celular o tejido^[10]. Complementando el cribado de knockout, los enfoques de ganancia de función, como la activación CRISPR (CRISPRa)^[11] y los cribados de bibliotecas de marcos de lectura abiertos (ORFs)^[12], que se administran con mayor frecuencia a través de sistemas lentivirales^[13], han ofrecido una perspectiva adicional. El cribado de sobreexpresión génica es especialmente adecuado para identificar los mecanismos de resistencia impulsados por la amplificación génica o la regulación ascendente transcripcional, revelando así las "vías de escape" que utilizan las células cancerosas para evadir la presión terapéutica y mantener la proliferación^[14]. Esto puede proporcionar un enfoque único y racionalizado para proponer la terapia dirigida como un complemento a la quimioterapia. Si bien los cribados de sobreexpresión que utilizan CRISPRa^[15] o lentivirus^[16] son útiles, tienen limitaciones para capturar la complejidad total de la heterogeneidad tumoral. Estas incluyen la expresión génica heterogénea debido a la integración genómica aleatoria^[17], la cobertura proteómica limitada, definida aquí como la cobertura de los genes codificantes de proteínas, causada por la dinámica de la accesibilidad de la cromatina^[18] y los falsos candidatos impulsores identificados a partir de la activación de múltiples genes por célula^[19]. Además, dado que el 90% de los fármacos aprobados por la FDA que se pueden utilizar para la terapia combinada se sabe que se dirigen a proteínas, la genómica funcional de los genes codificantes de proteínas^[20] podría proporcionar información clínica más inmediata para la reutilización de fármacos^[21]. Por lo tanto, existe la necesidad de una plataforma de cribado de sobreexpresión que permita una forma "proteómica", "de un solo gen por célula" a partir de un locus genómico definido para encontrar los principales "impulsores" de la quimiorresistencia.

Este estudio presenta BOGO, una nueva plataforma de cribado de sobreexpresión génica robusta y escalable que ha integrado con precisión la colección completa de ORFeomas humanos (hORFeoma)^[22],^[23] utilizando el sistema de plataforma de aterrizaje Bxb1^[24] (Bxb1-landing pad human ORFeome-integrated system for a proteome-wide Gene Overexpression (BOGO)]. BOGO permite la investigación sistemática de cómo la sobreexpresión génica contribuye a la resistencia a los fármacos en el cáncer (Figura 1A). La colección de ORFeomas proporciona una cobertura casi completa de los genes a nivel de proteoma, con aproximadamente 19 000 ORFs. El sistema BOGO garantiza la integración precisa de un solo ORF en el locus AAVS1, eliminando la variabilidad y los artefactos de inserción que se asocian comúnmente con los métodos tradicionales de sobreexpresión génica y garantizando la sobreexpresión de un solo gen por célula. Aplicamos BOGO en la línea celular HeLa, que es el modelo de célula cancerosa más utilizado^[25], y las expusimos a 16 agentes quimioterapéuticos clínicamente relevantes, descubriendo tanto mecanismos de resistencia establecidos como nuevos, particularmente aquellos que involucran el dominio de unión a BCL2, la autofagia y las vías de la apoptosis. La quimioterapia con análogos de nucleósidos basados en timidina, TAS-102, activó la actividad lisosomal, mientras que el inhibidor de BCL2, ABT-263, suprimió la sobreexpresión de la familia BCL2 y alteró la función lisosomal. El tratamiento combinado con TAS-102 y ABT-263 resultó en una mayor citotoxicidad en las líneas celulares de cáncer de colon y páncreas, así como en una mayor supresión tumoral en los modelos de cáncer de colon CDX y PDX. Esta plataforma predice los mecanismos de resistencia, informa sobre la selección del tratamiento y revela los impulsores oncogénicos. BOGO identifica los genes que impulsan la resistencia y apoya el diseño racional de terapias combinadas mediante el mapeo de las interacciones gen-fármaco.

Resultados

El sistema BOGO representa un avance significativo en la genómica funcional al proporcionar una plataforma confiable para el cribado de ganancia de función a gran escala.

BOGO facilita la sobreexpresión estable de un solo ORF por célula a través de la integración precisa de un vector donante de plataforma de aterrizaje Bxb1 en el locus AAVS1 mediante recombinación homóloga^[26] (Figura 1B). Se utilizó el clonado de Gateway para garantizar la sobreexpresión a granel precisa de los genes codificantes de proteínas, con cada ORF expresado bajo el promotor EF1α. El grupo de células resultante abarcó aproximadamente 19 000 genes codificantes de proteínas, derivados del hORFeoma 9.1^[22],^[23] y clones adicionales (ORFeoma Delta) proporcionados por colaboradores. Las células HeLa diseñadas con el sistema de plataforma de aterrizaje Bxb1 se transfectaron con la biblioteca de hORFeoma (Figura 1B). La integrasa Bxb1 permitió la inserción precisa de un solo ORF en el sitio AAVS1, minimizando la variabilidad y garantizando una expresión génica uniforme. Las células se clasificaron en función de la señal del reportero mCherry y se expandieron para formar el grupo experimental, que representa todo el panorama del hORFeoma. El análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) reveló que aproximadamente el 20% de las células eran mCherry-positivas/mTagBFP2-negativas (Figura suplementaria 1A, panel izquierdo), logrando una cobertura de 150 veces con más de 3 millones de células clasificadas, lo que indica una representación robusta del ORFeoma (Figura suplementaria 1A, panel derecho). El secuenciamiento exhaustivo del grupo de células inicial confirmó que las secuencias de ORF eran concordantes con sus correspondientes secuencias de ADN codificante (CDS), y aproximadamente el 90% de los ORFs se integraron con éxito (Figura 1C). Para evaluar la reproducibilidad, probamos cinco lotes independientes en cribados de fármacos a gran escala. Los resultados mostraron efectos de lote mínimos, con altas correlaciones entre los replicados técnicos en todos los tratamientos (Figura 1D), lo que confirma la estabilidad y la confiabilidad de la representación del ORFeoma después de la congelación y descongelación.

Aprovechando el grupo de células HeLa ORFeoma establecido, realizamos dos cribados funcionales iniciales para investigar: i) la respuesta a los fármacos y ii) el silenciamiento de ORFs, que son aspectos críticos de la biología del cáncer y la regulación de la expresión génica. Para evaluar el impacto de los ORFs individuales en la respuesta a los fármacos, cuantificamos la abundancia relativa de las poblaciones de células que expresan ORFs en tres condiciones: i) línea de base (células de la biblioteca no tratadas), ii) células tratadas con DMSO (control del vehículo) y iii) células tratadas con quimioterapia (condición experimental). Los amplicones derivados del ADN genómico se sometieron a secuenciación de última generación (NGS) para medir la abundancia de ORFs. El cambio de registro 2 (log2FC) entre las condiciones tratadas con fármacos y las condiciones de control del vehículo se utilizó para evaluar la representación diferencial. Los ORFs con log2FC > 0,5 o < -0,5 y p < 0,05 se definieron como efectores de la respuesta a los fármacos (Tabla suplementaria 1). Clasificamos estos ORFs enriquecidos como impulsores de la resistencia a los fármacos, mientras que los ORFs disminuidos se designaron como impulsores de la sensibilización a los fármacos.

Para verificar la reproducibilidad y la relevancia funcional de nuestro sistema de perturbación, realizamos experimentos de sobreexpresión individuales para siete ORFs seleccionados, comparando sus efectos con las células de control de fluorescencia mCherry. Estas validaciones confirmaron los resultados fenotípicos observados en el cribado de respuesta a los fármacos de BOGO. Por ejemplo, la sobreexpresión de BCL2 resultó en un aumento de la abundancia de células bajo el tratamiento con trifluridina (TFT), lo que es consistente con su clasificación como un impulsor de la resistencia a los fármacos en nuestro cribado (Figura 1E). Por el contrario, la sobreexpresión de CDK6, identificada como un impulsor de la sensibilización a los fármacos, condujo a una marcada reducción de la población celular después del tratamiento con TFT (Figura 1E), lo que se alinea con los hallazgos previos^[27] de que la sobreexpresión de CDK6 sensibiliza a las células al daño del ADN. Esta fuerte concordancia entre los cambios fenotípicos en las líneas de sobreexpresión de un solo ORF y los perfiles de perturbación a nivel de proteoma proporciona evidencia directa de la validez funcional y la reproducibilidad de la metodología de cribado de BOGO.

Para demostrar el valor complementario de la plataforma de cribado de BOGO en relación con los enfoques transcriptómicos convencionales, realizamos un secuenciamiento de ARNm a granel en células HeLa de tipo salvaje tratadas con doxorrubicina, un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado con una amplia gama de aplicaciones clínicas^[28]. Los perfiles de respuesta transcripcional se obtuvieron en dos puntos temporales: 120 horas, que corresponden a la duración de nuestro cribado de ORFeoma, y 24 horas, para capturar los cambios agudos en la expresión génica. Comparamos los conjuntos de genes expresados diferencialmente (DEGs) identificados en estos conjuntos de datos de secuenciamiento de ARNm (Tabla suplementaria 2) con los efectores de respuesta a los fármacos descubiertos a través de nuestro cribado de respuesta a los fármacos. Este análisis reveló conjuntos de genes superpuestos y distintos (Figura 1F). En particular, el cribado de BOGO identificó aproximadamente cinco veces más genes que el secuenciamiento de ARNm a granel en el punto temporal de 120 horas, con solo un 2% de superposición. A las 24 horas, el cribado de BOGO detectó diez veces más genes, pero la superposición con los DEGs fue aún menor, del 0,5%. Estas diferencias probablemente se deban a las limitaciones inherentes del secuenciamiento de ARNm a granel, que captura la expresión génica endógena sujeta a mecanismos de regulación dinámicos. En contraste, la plataforma BOGO utiliza la sobreexpresión constitutiva de ORFs, lo que permite la identificación de los efectores funcionales de la resistencia a los fármacos que pueden estar enmascarados o subrepresentados en los perfiles transcripcionales naturales. Por lo tanto, el cribado basado en la sobreexpresión ofrece un enfoque poderoso y complementario a la transcriptómica convencional, revelando genes biológicamente y clínicamente relevantes que pueden pasarse por alto mediante los métodos estándar.

Para validar y caracterizar aún más los resultados identificados en nuestro estudio de respuesta a fármacos, realizamos una reevaluación de alta saturación (HSR), un enfoque dirigido que implica subconjuntos más pequeños y cuidadosamente seleccionados de la biblioteca de ORFeomas, analizados con mayor cobertura para garantizar la reproducibilidad y la robustez. Aproximadamente el 10% del conjunto original de ORF, que comprende una mezcla de ORF asociados con la proliferación y la respuesta a fármacos, se reevaluó con una cobertura de >1.000 veces. Comparamos los resultados del estudio inicial de respuesta a fármacos con los de la HSR para doxorrubicina (Tabla Suplementaria 3). Primero, confirmamos la alta representación de los ORF seleccionados en el conjunto de datos de la HSR, en el que 2.184 ORF (98,5%) del conjunto seleccionado se detectaron con éxito (Figura Suplementaria 1E, diagrama de Venn izquierdo). Entre los ORF efectores de doxorrubicina, 93 (96,9%) se recuperaron en la HSR, con solo 3 ORF (3,1%) que no se detectaron (Figura Suplementaria 1E, diagrama de Venn derecho), lo que confirma la fidelidad y la cobertura del proceso de reevaluación. Es importante destacar que la HSR validó las tendencias direccionales observadas en el estudio inicial (Figura 1G). Los ORF identificados previamente como factores que impulsan la sensibilización a los fármacos, como HIT1H3B, mostraron cambios promedio negativos en la HSR, lo que es consistente con una mayor sensibilidad a los fármacos. Por el contrario, los factores que impulsan la resistencia a los fármacos, como PITX2, mostraron cambios promedio positivos, lo que confirma su fenotipo de resistencia (Figura Suplementaria 1B). Los ORF clasificados como no respondedores mostraron consistentemente cambios cercanos a cero, lo que refuerza su falta de respuesta a los fármacos. Estos resultados demuestran la robustez estadística y la reproducibilidad de la plataforma BOGO, lo que respalda su fiabilidad para identificar efectores de respuesta a fármacos relevantes desde el punto de vista biológico y clínico.

En paralelo, abordamos el desafío del silenciamiento de los ORF, una limitación inherente de los sistemas de sobreexpresión. Para controlar el silenciamiento, se insertó una casete IRES-mCherry aguas abajo de cada ORF, lo que permite discriminar entre la expresión activa y silenciada de los ORF. Al comparar la abundancia de los ORF en las poblaciones celulares mCherry-positivas y mCherry-negativas, cuantificamos la proporción de expresión activa. Los ORF con log2FC > 1 o < −1 y p < 0,05 se definieron como efectores de silenciamiento. Los valores positivos de log2FC indicaron ORF no silenciosos, mientras que los valores negativos indicaron ORF silenciosos. El análisis reveló que más del 60% de los ORF se mantuvieron como no silenciosos, mientras que menos del 30% mostraron efectos de silenciamiento medibles (Figura Suplementaria 1C). Además, cinco genes seleccionados mantuvieron una expresión estable durante cinco días de cultivo, sin que se observara ningún silenciamiento, lo que corroboró su clasificación como ORF no silenciosos en nuestro estudio. En contraste, GPER y BRD9 mostraron efectos de silenciamiento (Figura Suplementaria 1D), lo que es consistente con sus perfiles de silenciamiento en el estudio de respuesta a fármacos (Figura Suplementaria 1E). En particular, GPER, una proteína de membrana que se sabe que induce toxicidad celular a través de la formación de cuerpos de inclusión, se ha informado previamente que suprime el crecimiento celular a través de este mecanismo^[29], lo que explica su falta de representación detectable. Estos resultados confirman la estabilidad y la fiabilidad de la expresión génica dentro del sistema BOGO y demuestran su utilidad para identificar efectores funcionales de la respuesta a fármacos y evaluar las tendencias de silenciamiento génico.

Clasificación funcional de los efectores de la respuesta a fármacos, que revela sus características moleculares distintas y predice los resultados clínicos en el cáncer.

Nuestro estudio de respuesta a fármacos comprende 16 agentes quimioterapéuticos, que abarcan una amplia gama de mecanismos citotóxicos. Estos fármacos quimioterapéuticos se agruparon en cuatro categorías funcionales distintas según sus mecanismos de acción, incluidos 6 fármacos basados en la actividad antimetabolítica, 4 agentes de reticulación del ADN, 4 agentes que provocan roturas de la cadena y 2 fármacos que detienen los microtúbulos, que sirven como mapa de referencia de los mecanismos citotóxicos clave^[30] (Figura Suplementaria 2A). Clasificamos sistemáticamente 18.388 ORF humanos en categorías distintas según su influencia en las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos (Figura 2A). Debido a la baja o nula representación en las poblaciones celulares, 3.882 ORF se excluyeron del análisis posterior. Los 14.506 ORF restantes se clasificaron según sus patrones de representación diferencial en los diferentes tratamientos quimioterapéuticos, lo que dio como resultado cinco grupos funcionales: Central, Categórico, Multidroga, Periférico y No respondedor (Figura 2A).

Para evaluar el panorama de los ORF que modulan la respuesta a los fármacos (dORF), primero examinamos su distribución acumulada en todos los agentes quimioterapéuticos probados. El número de dORF únicos aumentó progresivamente con la inclusión de fármacos adicionales (Figura Suplementaria 2B), una tendencia que superó significativamente las expectativas de la permutación aleatoria, lo que validó la sensibilidad y la amplitud de nuestra plataforma de detección para capturar las interacciones gen-fármaco. Un histograma de los efectos de la respuesta a los fármacos reveló una disminución en el número de dORF a medida que aumentaba el número de fármacos, con solo un pequeño subconjunto de dORF que ejercía amplios efectos reguladores en hasta 13 agentes (Figura Suplementaria 2C). Basándonos en esta distribución, los dORF que afectaban las respuestas a más de 7 fármacos, aproximadamente la mitad del máximo observado, se designaron como ORF centrales. Para definir los umbrales de respuestas más amplias o singulares a los fármacos, modelamos la distribución del recuento de la respuesta a los fármacos por ORF utilizando una mezcla de distribuciones gamma y normal. La intersección correspondió a 2,64 fármacos (Figura Suplementaria 2D), que se utilizó para definir los ORF multidroga como aquellos que influyen en las respuestas a entre 2 y 7 fármacos. Los ORF periféricos se definieron como aquellos que modulan las respuestas a un único agente quimioterapéutico (Figura Suplementaria 2E), lo que refleja la especificidad de ciertas interacciones gen-fármaco. Dentro de los ORF categóricos, definidos como los ORF que afectan selectivamente las respuestas a los fármacos con mecanismos de acción compartidos, los dORF para los inductores de roturas de la cadena del ADN fueron los más prevalentes, aunque otras categorías de fármacos también mostraron perfiles de dORF distintos (Figura Suplementaria 2F). Los ORF no respondedores son aquellos que no mostraron un impacto significativo en las respuestas a los fármacos en todos los agentes probados. La exclusividad mutua de estas categorías se confirmó mediante el análisis del diagrama de Venn (Figura Suplementaria 2G).

A continuación, investigamos si las categorías de ORF definidas exhiben propiedades intrínsecas distintas que puedan sustentar sus diferentes perfiles de respuesta a los fármacos. Entre estos, los ORF centrales demostraron la divergencia más pronunciada en múltiples características moleculares y funcionales, lo que es consistente con su amplia asociación con fenotipos de resistencia a la quimioterapia. En concreto, los ORF centrales mostraron puntuaciones z significativamente elevadas para el contenido de GC, el trastorno proteico previsto, el enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO), la frecuencia de publicación (PubCount) y las asociaciones con enfermedades mendelianas (Figura 2B). Por el contrario, las características como la regulación específica de tejidos (recuento de tejidos), la edad evolutiva, la amplitud de la expresión (número de tejidos en los que se expresa el gen), la abundancia de la expresión y el número de complejos proteicos asociados (según se anota en la base de datos CORUM) se redujeron notablemente en los ORF centrales (Figura 2B). En particular, los ORF centrales también tendieron a ser más cortos que otras categorías, mientras que los ORF categóricos mostraron las secuencias más largas. Estas observaciones sugieren que los ORF con baja expresión basal pueden ser más susceptibles a la modulación fenotípica tras la sobreexpresión artificial, lo que podría explicar su prominencia en nuestro estudio. Por el contrario, los genes con alta expresión endógena pueden ser menos sensibles a las perturbaciones, lo que limita su detectabilidad como efectores de la respuesta a los fármacos. Si bien este sesgo puede influir en la representación de los ORF centrales, nuestra plataforma de detección sigue siendo robusta para identificar factores funcionales relevantes de la respuesta a los fármacos y la enfermedad. En conjunto, estos hallazgos indican que los ORF centrales representan un subconjunto distinto de elementos reguladores poco apreciados que adquieren importancia funcional tras la regulación al alza, y que difieren de otras categorías de ORF tanto en sus atributos estructurales como funcionales.

Para evaluar la relevancia clínica de los ORF categorizados, evaluamos su superposición con los biomarcadores específicos del cáncer seleccionados en la base de datos TheMarker^[31]. Para cada categoría de ORF, cuantificamos tres métricas: (1) el porcentaje de ORF que se superponen con biomarcadores conocidos del cáncer (% de ORF), (2) la proporción de biomarcadores asociados con los agentes quimioterapéuticos incluidos en nuestro estudio de respuesta a fármacos (% de terapéuticos) y (3) la contribución de cada categoría de ORF al conjunto total de biomarcadores (% de biomarcadores; Figura 2C, izquierda). Los ORF centrales mostraron puntuaciones z significativamente elevadas en las tres métricas, lo que indica un fuerte enriquecimiento de los biomarcadores clínicamente validados y destaca su amplia relevancia para la respuesta a la quimioterapia. Por el contrario, los ORF categóricos mostraron puntuaciones z más bajas, lo que sugiere que sus funciones pueden ser más específicas del mecanismo y menos representadas en las bases de datos de biomarcadores actuales. Estas tendencias se visualizaron claramente en los mapas de calor de las distribuciones de las puntuaciones z, que destacaron el potencial de traslación de los distintos subconjuntos de ORF (Figura 2C, izquierda). Un análisis más profundo de los tipos de biomarcadores reveló una predominancia de los biomarcadores predictivos en todas las categorías de ORF, lo que respalda la hipótesis de que los ORF individuales pueden influir en los resultados favorables o desfavorables en respuesta a agentes quimioterapéuticos específicos (Figura 2C, derecha). Este enfoque integrador, que combina la categorización funcional con la superposición de biomarcadores, demuestra la utilidad de nuestra plataforma de detección para identificar candidatos de ORF con alta relevancia traslacional.

Para evaluar aún más la utilidad de la plataforma BOGO para identificar marcadores clínicos pronósticos y predecir la resistencia a los fármacos, comparamos los efectos de los ORF individuales en la proliferación celular con los indicadores pronósticos del cáncer derivados de la base de datos Human Protein Atlas (HPA)^[20] y The Cancer Genome Atlas (TCGA)^[32]. Los ORF representados de forma diferencial se identificaron comparando sus poblaciones celulares en la línea de base y después de nueve días de crecimiento competitivo. Los ORF con cambios significativos (log2FC > 1 o < −1; p < 0,05) se clasificaron como reguladores de la proliferación celular, y los ORF enriquecidos se designaron como reguladores a la alza del crecimiento celular y los ORF agotados como reguladores a la baja del crecimiento celular. Utilizando las puntuaciones z, evaluamos el rendimiento predictivo de nuestra lista de ORF para identificar marcadores clínicamente relevantes. El análisis de precisión-recuperación reveló que la clasificación de los ORF en orden descendente por puntuación de proliferación (colocando los reguladores a la alza en la parte superior) produjo una alta precisión para identificar los marcadores asociados con un pronóstico desfavorable del cáncer (Figura 2D). Por el contrario, la clasificación de los ORF en orden ascendente (colocando los reguladores a la baja en la parte superior) enriqueció los marcadores de un pronóstico favorable, aunque la precisión disminuyó más pronunciadamente, alcanzando un mínimo comparable de aproximadamente el 40% (Figura 2E). Para ilustrar la importancia clínica de estos hallazgos en el cáncer de cuello uterino (CESC), seleccionamos ORF representativos de ambos extremos del espectro pronóstico. La sobreexpresión de la fosfoglucomutasa 1 (PGM1), un regulador a la alza de primer nivel, se asoció fuertemente con una reducción de la probabilidad de supervivencia (Figura 2F), lo que es consistente con su papel en la promoción de la proliferación celular. Por el contrario, la sobreexpresión de la proteína de unión al bucle de tallo SRA (SLIRP), un regulador a la baja de primer nivel, se correlacionó con la mejora de los resultados de los pacientes (Figura 2G), lo que sugiere un efecto supresor sobre la proliferación del cáncer. En conjunto, estos análisis de precisión-recuperación y supervivencia subrayan la relevancia clínica de nuestro enfoque de detección y su capacidad para identificar prometedores reguladores de la proliferación celular con valor pronóstico.

Hipotetizamos que los efectores de la respuesta a los fármacos exhibirían fuertes correlaciones con los reguladores de la proliferación celular, basándonos en la premisa de que mecanismos de resistencia robustos pueden conferir una mayor capacidad proliferativa a las células cancerosas. Para probar esto, comparamos los resultados de nuestro estudio de respuesta a fármacos con un conjunto de datos de resistencia a fármacos recopilado manualmente a partir de TCGA^[33], evaluando la capacidad de nuestra plataforma para identificar factores de resistencia conocidos. El análisis de precisión-recuperación de nuestro conjunto de datos de respuesta a fármacos clasificado reveló una alta precisión entre los genes mejor clasificados tanto para la resistencia al cisplatino (Figura 2H) como para la resistencia al 5-fluorouracilo (5-FU) (Figura 2I), lo que indica un enriquecimiento eficaz de los mecanismos de resistencia establecidos. Por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína 2 de unión al dominio de homología de Src (SH3BP2), un candidato principal para la resistencia al cisplatino, se asoció fuertemente con una reducción de la supervivencia en pacientes con adenocarcinoma pancreático (PAAD) (Figura 2J). De manera similar, la proteína 47 que contiene el dominio de hélice en espiral (CCDC47), identificada como un factor determinante de la resistencia al 5-FU, se correlacionó con un mal pronóstico en el carcinoma hepatocelular (LIHC) (Figura 2K). Ambos genes también demostraron efectos de inducción de la resistencia a los fármacos en nuestros datos de cribado (Figura Suplementaria 2H). Este análisis integrativo, que combina el cribado funcional con conjuntos de datos clínicos, subraya la capacidad de la plataforma BOGO para descubrir nuevos genes de resistencia a los fármacos con relevancia biológica y clínica directa en el cáncer.

Análisis multimodal de los perfiles de respuesta a fármacos del ORFeoma identifica las vías relacionadas con BCL2 como un mecanismo convergente de quimiorresistencia.

Para investigar cómo las alteraciones genéticas inducidas por la sobreexpresión del ORFeoma humano influyen en las respuestas celulares al estrés quimioterapéutico, realizamos un análisis de reducción de dimensionalidad sobre los 16 perfiles de respuesta a fármacos del ORFeoma. Los diagramas de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) revelaron patrones de agrupamiento distintos que corresponden a los tratamientos individuales con fármacos (Figura 3A). Los controles de DMSO de cinco lotes independientes se agruparon estrechamente a lo largo del eje UMAP1, lo que indica efectos de lote mínimos. Además, los replicados biológicos se agrupan de forma consistente por los agentes quimioterapéuticos, lo que subraya la solidez y la reproducibilidad de los datos de cribado. En particular, los fármacos con mecanismos de acción compartidos generalmente se agruparon en estrecha proximidad, lo que demuestra la capacidad de la reducción de dimensionalidad para capturar amplias respuestas biológicas. Por ejemplo, la mitomicina C se agrupó por separado de otros agentes alquilantes, lo que probablemente refleja su mecanismo único como inhibidor de la síntesis de ADN. De manera similar, aunque el TFT y el 5-FUlisot se clasifican como antimetabolitos, sus patrones de agrupamiento divergentes sugieren perfiles de resistencia distintos y mecanismos de acción subyacentes^[34].

Para descubrir patrones compartidos de los 16 perfiles de respuesta a fármacos, realizamos un análisis de correlación de todos contra todos de los perfiles de respuesta a fármacos ORF, lo que resultó en más de 200 millones de comparaciones por pares (Figura 3B). Se extrajeron y visualizaron como una red de similitud las interacciones de alta confianza, definidas por un coeficiente de correlación de Pearson que supera |0,9|, lo que revela grupos de ORFs con comportamientos de respuesta comparables en conjuntos similares de agentes quimioterapéuticos^[35] (Figura 3B, panel izquierdo). En esta red, las distancias más cortas entre los ORFs indican una mayor similitud en la regulación de la respuesta a los fármacos después de la sobreexpresión, lo que sugiere funciones biológicas compartidas y vías de regulación subyacentes. Para anotar funcionalmente estos grupos, aplicamos el análisis espacial del enriquecimiento funcional (SAFE)^[36], que identificó los procesos biológicos clave asociados con la respuesta quimioterapéutica (Figura 3B, panel derecho). En particular, observamos un enriquecimiento de las vías relacionadas con BCL2, incluidas la unión al dominio de homología de BCL2 y la autofagia y la apoptosis. Estas vías son mediadores bien establecidos tanto de la resistencia como de la sensibilidad a varios agentes quimioterapéuticos^[37],^[38], pero aún no se han relacionado con fármacos análogos del ADN como el TAS-102 y el TFT. Esta nueva asociación destaca la sensibilidad de nuestro enfoque para detectar tanto los mecanismos de respuesta a los fármacos conocidos como los que no se habían reconocido previamente. En conjunto, estos hallazgos demuestran el poder de la plataforma BOGO para revelar redes de genes funcionales y descubrir vías de regulación clave que subyacen a las respuestas quimioterapéuticas, lo que refuerza su utilidad para identificar objetivos viables en la terapia contra el cáncer.

Para investigar más a fondo la relevancia mecánica de las vías relacionadas con BCL2 identificadas en nuestra red de similitud de respuesta a fármacos, específicamente, los grupos anotados como unión al dominio BH y autofagia y apoptosis (Figura 3B), realizamos un análisis de red en profundidad para evaluar su potencial como objetivos para la terapia de combinación. Realizamos un análisis de red STRING^[39] en la subred que comprende los ORFs de estos dos grupos para dilucidar las interacciones proteína-proteína entre los genes identificados (Figura 3C). Los 20 ORFs de los grupos enriquecidos por SAFE se analizaron utilizando STRING para mapear las interacciones experimentales y predichas (Tabla Suplementaria 4). Este análisis reveló 12 genes clave involucrados en vías de señalización críticas y respuestas al daño celular, resaltados como nodos en forma de diamante en la Figura 3C. El panel derecho de la figura ilustra las interacciones entre estos nodos proteicos y sus grupos GO asociados, lo que refleja una fuerte conectividad funcional y relevancia biológica. Entre las vías enriquecidas se encontraban el transporte vesicular, la señalización apoptótica, la modificación de histonas y la señalización del receptor Notch, todas ellas funcionalmente relacionadas con los genes relacionados con BCL2 identificados en los dos grupos. Estos hallazgos proporcionan una base mecánica convincente para dirigir las vías asociadas con BCL2 en la resistencia quimioterapéutica y subrayan la utilidad de la plataforma BOGO para descubrir redes biológicas viables.

Para validar la relevancia biológica de nuestro cribado, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de los reguladores de respuesta a fármacos ORF en las categorías ORF (Figura Suplementaria 3A–B). Los ORFs centrales y multidroga se enriquecieron para las vías del cáncer canónicas, incluidas las vías de señalización de Wnt, TGF-β, PI3K-AKT e Hippo, así como la apoptosis y la respuesta al daño del ADN, lo que es consistente con los mecanismos de quimiorresistencia. Los ORFs no respondedores mostraron un enriquecimiento limitado en las vías relacionadas con el cáncer, y en cambio se mapearon al metabolismo de los ácidos grasos y los procesos de unión estrecha, lo que sugiere contribuciones mínimas a la respuesta a los fármacos. Los ORFs silenciados se enriquecieron de forma única para las vías relacionadas con las quinasas, incluidas las vías de señalización de AMPK y MAP quinasa, lo que destaca que algunos factores determinantes de la resistencia siguen sin detectarse en el cribado BOGO (Figura Suplementaria 3A).

El análisis específico del fármaco reveló patrones mecánicamente coherentes en la quimioterapia individual (Figura Suplementaria 3B). Los efectores de la respuesta a los fármacos para el cisplatino se enriquecieron para la reparación del ADN y la necrosis regulada, lo que es consistente con su mecanismo. Los efectores para el paclitaxel se asociaron con la actividad de los microtúbulos y la senescencia celular, lo que refleja su papel en la detención del ciclo mitótico. Los efectores de TFT/TAS-102 convergieron en la señalización de NF-κB, el metabolismo de las pirimidinas y, de forma única, en la señalización de KIT y la activación de MYC, lo que destaca los mecanismos distintos. Los efectores de la doxorrubicina se enriquecieron en las vías de la apoptosis y la respuesta al estrés, lo que se alinea con su inducción del daño del ADN y el estrés celular. Estas firmas de enriquecimiento se alinean con la correlación y la red STRING. La aparición constante de la actividad de autofagia-lisosoma, la ferroptosis, la necrosis y la piroptosis en los análisis categóricos y específicos de los fármacos refuerza su papel central en la mediación de la resistencia a los fármacos contra el cáncer y valida la capacidad de la plataforma BOGO para capturar tanto los mecanismos de resistencia conocidos como los nuevos.

Para validar aún más la plataforma de cribado de sobreexpresión BOGO, comparamos los perfiles de respuesta a fármacos con los datos transcripcionales obtenidos de la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Se realizó scRNA-seq en células tratadas con TFT, cisplatino, doxorrubicina y paclitaxel, cada uno de los cuales representa distintas categorías mecánicas dentro de nuestro panel de quimioterapia. Se capturaron aproximadamente 32 000 células en cinco condiciones de tratamiento, incluido un control de DMSO, con una variación en el número de células que se mantuvo dentro del 10%. El análisis de agrupamiento reveló perfiles transcripcionales distintos para cada tratamiento (Figura 3D, panel izquierdo). Los tratamientos con paclitaxel y TFT exhibieron patrones de agrupamiento únicos, mientras que el cisplatino y la doxorrubicina mostraron una superposición parcial, lo que es consistente con sus mecanismos de acción convergentes. El análisis de enriquecimiento de genes de los grupos específicos del tratamiento reveló un enriquecimiento significativo de las vías que se asocian comúnmente con la quimiorresistencia, incluida la autofagia, la apoptosis y la señalización de Wnt, lo que se hace eco de los hallazgos de nuestra red de similitud de perfiles de respuesta a fármacos (Figura 3D, panel derecho).

En particular, los genes como BCL2, TP53, CDK6 y TYMS (el objetivo del TFT) se asociaron con los cuatro tratamientos y mostraron una desregulación específica dentro del grupo de autofagia y apoptosis (Figuras Suplementarias 3B–E), lo que sugiere que este grupo puede representar una población de células quimiorresistentes. El análisis de expresión génica diferencial (Tabla Suplementaria 5) identificó además una reducción significativa de TRADD, un gen implicado en la señalización apoptótica dentro del mismo grupo GO^[40],^[41], y una regulación al alza de POLD2, un gen de la vía de Wnt relacionado con la proliferación celular^[42] (Figura 3D). En particular, la regulación de estos genes fue consistente en los datos de scRNA-seq y el análisis de la red de fármacos-ORF. Además, el análisis de puntuación z de los cambios de registro de 2 identificó genes clave asociados con la resistencia, incluidos YBX3 (cisplatino), ZNF143 (doxorrubicina), ZNF217 (TFT) y GATA2 (paclitaxel), junto con varios candidatos menos caracterizados con posibles funciones en la resistencia o la sensibilización a los fármacos^[43]–^[46] (Figura Suplementaria 3F). Esta fuerte concordancia entre las plataformas refuerza la capacidad del cribado BOGO para capturar mecanismos de respuesta a fármacos relevantes a nivel de resolución de una sola célula y posiciona a BCL2 como un objetivo terapéutico prometedor, en particular en el contexto de los fármacos análogos del ADN como el TFT y el TAS-102.

En resumen, la convergencia de la evidencia del análisis de reducción de dimensionalidad, el análisis de la red de genes y fármacos y la transcriptómica de una sola célula apoya firmemente el papel fundamental de las vías relacionadas con BCL2 en la mediación de la resistencia quimioterapéutica en diversas clases de agentes. Estos hallazgos subrayan la solidez y la sensibilidad de nuestra plataforma de cribado de sobreexpresión del ORFeoma para descubrir tanto los mecanismos de resistencia establecidos como los que no se habían reconocido previamente. La identificación constante de BCL2 como un nodo regulador central en múltiples marcos analíticos proporciona una base convincente para su investigación adicional como candidato para la terapia de combinación, en particular en el contexto de los fármacos análogos del ADN como el TFT y el TAS-102.

La inhibición de BCL2 supera la quimiorresistencia al alterar la función lisosomal, un mecanismo revelado mediante el cribado genómico funcional.

Basándonos en nuestra identificación de BCL2 como un regulador central y en el enriquecimiento de las vías de autofagia y apoptosis en la resistencia quimioterapéutica, evaluamos la relevancia terapéutica de combinar un inhibidor de BCL2 con un agente quimioterapéutico. Seleccionamos TAS-102, una formulación oral que comprende TFT e hidrocloruro de tipiracil (TPI), debido a su relevancia clínica y sus propiedades farmacocinéticas favorables, incluida la biodisponibilidad oral^[47]. Para dirigir los mecanismos de resistencia relacionados con BCL2, utilizamos ABT-263 (Navitoclax®), un inhibidor de la familia BCL2 de amplio espectro que se sabe que antagoniza a BCL2, BCL2L1 y BCL2L2^[48], todos ellos identificados como factores determinantes de la resistencia a los fármacos en nuestro análisis de red (Figura 3C). Esta estrategia de combinación fue diseñada para alterar la señalización de supervivencia mediada por BCL2 y mejorar la eficacia citotóxica de TAS-102.

Para identificar modelos de cáncer fisiológicamente relevantes para evaluar la terapia combinada de TAS-102 y un inhibidor de BCL2, investigamos si el tratamiento con TAS-102 modula la expresión endógena de la proteína BCL2. La asociación bien establecida entre la señalización de BCL2, la autofagia y la quimiorresistencia en los cánceres colorrectal y pancreático^[49],^[50] proporcionó una sólida justificación para seleccionar líneas celulares representativas de estas neoplasias. El análisis mediante Western blot reveló una marcada sobreexpresión de BCL2 tras el tratamiento con TAS-102 en las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT 116 y RKO, y en la línea celular de cáncer pancreático MIA PaCa-2. Se observó un aumento modesto en las células HeLa, mientras que las células HT-29 no mostraron expresión detectable de BCL2 (Figura suplementaria 4A). Estos patrones de expresión diferenciales permitieron la selección de HCT 116 como el modelo principal para los experimentos de terapia combinada posteriores, debido a su robusta inducción de BCL2 y su relevancia para el cáncer colorrectal.

Dado el papel de BCL2 en la modulación de la apoptosis y la autofagia^[51], examinamos los marcadores proteicos asociados con la actividad lisosomal y la autofagia tras los tratamientos con un solo fármaco y la terapia combinada. En las células HCT 116, el tratamiento con TAS-102, ya sea solo o en combinación con ABT-263, resultó en un aumento pronunciado en la expresión de LAMP1 y TFEB, marcadores clave de la biogénesis y la función lisosomal^[52] (Figura suplementaria 4B). En contraste, los marcadores de autofagia LC3B y p62^[53] mostraron una expresión relativamente estable en todas las condiciones de tratamiento. Se observaron patrones de expresión similares en las células HeLa, aunque los efectos fueron más modestos, particularmente para TFEB tras el tratamiento combinado. Estos resultados sugieren que, si bien la actividad de la autofagia permanece estable, la modulación lisosomal se regula dinámicamente en respuesta a TAS-102 y ABT-263, lo que implica que las vías lisosomales pueden contribuir a los mecanismos de resistencia quimioterapéutica.

Para investigar más a fondo el impacto de TAS-102 y ABT-263 en la regulación lisosomal, examinamos la localización de TFEB mediante tinción de inmunofluorescencia. El tratamiento con TAS-102 condujo a un aumento de la localización nuclear de TFEB, lo que es consistente con la activación de la biogénesis lisosomal. Sin embargo, el tratamiento combinado con ABT-263 redujo significativamente la localización nuclear de TFEB (Figura 4A; Figura suplementaria 4C), lo que sugiere una interrupción de la activación lisosomal mediada por TFEB. Esta observación se alinea con la elevación concurrente de los niveles de proteína TFEB y LAMP1, en ausencia de la degradación correspondiente de p62 o LC3B (Figura suplementaria 4B), lo que indica que, si bien la maduración del autofagosoma puede continuar, la degradación lisosomal se ve afectada. Estos datos sugieren que, aunque los niveles totales de TFEB aumentan bajo el tratamiento con TAS-102, la translocación nuclear y la activación funcional de los lisosomas se ven interrumpidas cuando se coadministra ABT-263, lo que indica que la modulación lisosomal es un mecanismo clave que subyace a la respuesta observada a los fármacos.

Para investigar más a fondo las consecuencias funcionales de la modulación lisosomal, evaluamos la actividad proteolítica lisosomal utilizando la tinción con DQ-BSA^[54], que emite fluorescencia roja tras la proteólisis. En las células HCT 116, el tratamiento con TAS-102 aumentó significativamente la intensidad de la fluorescencia roja, lo que indica una mayor actividad lisosomal. Sin embargo, el tratamiento concurrente con ABT-263 redujo notablemente la fluorescencia, lo que sugiere una proteólisis alterada (Figura 4B; Figura suplementaria 4D). Coherente con estos hallazgos, las mediciones del pH lisosomal revelaron una acidificación bajo el tratamiento con TAS-102 solo, mientras que la terapia combinada condujo a un aumento del pH, lo que indica una alteración de la acidificación lisosomal (Figura 4C). Estos resultados señalan un posible mecanismo de resistencia que implica una disfunción lisosomal, en el que TAS-102 promueve la activación lisosomal, pero la inhibición de BCL2 compromete la función lisosomal. Para evaluar la relevancia funcional de esta alteración, co-tratamos las células con TAS-102 y bafilomicina A1, un conocido inhibidor lisosomal. Esta combinación redujo significativamente la proliferación celular en comparación con TAS-102 solo después de 48 horas de tratamiento (Figura 4D), lo que respalda el papel de la integridad lisosomal en la modulación de la respuesta quimioterapéutica.

Para identificar los moduladores lisosomales que contribuyen a la resistencia quimioterapéutica, desarrollamos un estudio de perturbación de la sobreexpresión génica de seguimiento integrando la plataforma BOGO con FACS basado en LysoTracker^[55] (Figura 4E). Las células HeLa que expresan la biblioteca ORFeome del estudio de respuesta a fármacos anterior se tiñeron con LysoTracker y se clasificaron en poblaciones con alta y baja actividad lisosomal (el 5% superior e inferior, respectivamente, según la intensidad de la fluorescencia verde). La secuenciación de última generación (NGS) posterior permitió la identificación de ORFs asociados con la modulación lisosomal. Los ORFs enriquecidos en el 5% superior se clasificaron como activadores lisosomales, mientras que los enriquecidos en el 5% inferior se designaron como represores lisosomales (log2FC > 0,5 o < -0,5; p < 0,05). El análisis UMAP confirmó una agrupación consistente en los triplicados biológicos para el 5% superior, el 5% inferior y las muestras previas a la clasificación, lo que respalda la robustez y la reproducibilidad de la plataforma de detección BOGO (Figura suplementaria 4E). Cabe destacar que BCL2, identificado previamente como un impulsor de la resistencia inducida por TAS-102, también exhibió una fuerte activación lisosomal en este estudio (Tabla suplementaria 6). El análisis de enriquecimiento de vías de los moduladores lisosomales reveló una participación significativa de la señalización de TGFβ (Figura 4F), lo que implica su papel en la autofagia y la regulación lisosomal. Para refinar aún más el análisis, intersectamos los moduladores lisosomales con los ORFs que impulsan la resistencia y la sensibilización específicas de TAS-102, identificando 109 ORFs como activadores lisosomales, 78 como represores lisosomales y 91 que se superponen tanto con la modulación lisosomal como con los perfiles de respuesta a TAS-102 (Figura suplementaria 4F). Estos hallazgos destacan un subconjunto de impulsores de la resistencia relacionados con los lisosomas que son específicos de TAS-102, lo que ofrece información mecanicista y posibles objetivos terapéuticos.

Entre los 109 activadores lisosomales identificados, seleccionamos GHSR y CCDC86 para un análisis más profundo basándonos en tres criterios: (i) fuerte activación lisosomal (log2FC > 1), (ii) novedad y (iii) pronunciada resistencia a TAS-102. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando datos del TCGA PanCancer Atlas reveló que una alta expresión de GHSR se asoció significativamente con una peor supervivencia general (Figura 4G, panel izquierdo), particularmente en los cánceres colorrectal, de pulmón y esofagogástrico (Figura 4G, panel derecho). De manera similar, una mayor expresión de CCDC86 se correlacionó con un mal pronóstico durante un período de 10 años (Figura 4H, panel izquierdo), en múltiples tipos de cáncer, incluidos los cánceres colorrectal, de pulmón y de conducto biliar (Figura 4H, panel derecho). Estos hallazgos respaldan la relevancia de GHSR y CCDC86 como marcadores de resistencia asociados con los lisosomas y posibles objetivos terapéuticos. En conjunto, nuestros experimentos funcionales demuestran que la inhibición de BCL2 en combinación con TAS-102 altera la función lisosomal y que la plataforma BOGO permite una detección funcional fenotípica a gran escala para descubrir vías mecanicistas e identificar genes candidatos con implicaciones para la respuesta terapéutica y el pronóstico del cáncer.

El sistema BOGO representa un avance significativo en la genómica funcional al proporcionar una plataforma confiable para la detección de ganancia de función a gran escala.

Para evaluar la aplicabilidad clínica de TAS-102 en combinación con ABT-263, investigamos sus efectos citotóxicos tanto en contextos dependientes de p53 como específicos del cáncer. El análisis de la red STRING reveló una interacción indirecta entre BCL2 y TYMS, el objetivo principal de TAS-102, mediada por p53 (Figura suplementaria 5A), lo que sugiere que p53 puede servir como un centro crítico que conecta las vías de BCL2 y TYMS. Para probar esta hipótesis, empleamos modelos de knockout de p53 y comparamos su respuesta al tratamiento combinado con las células de tipo salvaje (Figura suplementaria 5B). Las dosis de ABT-263 se seleccionaron en función de los valores de CI50 derivados de las curvas de respuesta a la dosis en las líneas celulares de cáncer colorrectal (Figura suplementaria 5C). Los ensayos de citotoxicidad revelaron una reducción sustancial en la viabilidad celular en las células HCT 116 de tipo salvaje de p53 tras el tratamiento combinado con TAS-102 y ABT-263, en comparación con TAS-102 solo (Figura 5A). En particular, la dosis letal mediana (LD50) de TAS-102 disminuyó hasta en 1000 veces cuando se combinó con 50 nM de ABT-263 (Figura 5A). Este efecto sensibilizador se atenuó significativamente en las células HCT 116 con knockout de p53 (Figura 5B), lo que sugiere un mecanismo dependiente de p53 que subyace a la interacción entre la señalización de BCL2 y la respuesta a TAS-102.

Además, evaluamos los efectos sinérgicos de TAS-102 y ABT-263 en una línea celular de cáncer pancreático MIA PaCa-2 y en la línea celular de epitelio ductal pancreático humano normal hTERT-HPNE, para evaluar la citotoxicidad específica del cáncer, lo cual es esencial para minimizar los efectos fuera del objetivo y mejorar los perfiles de seguridad terapéutica^[56]. De manera similar a HCT 116, las células MIA PaCa-2 exhibieron una mayor sensibilidad a TAS-102 cuando se trataron secuencialmente con ABT-263, lo que resultó en una dosis efectiva más baja para alcanzar la LD50 (Figura 5C). En contraste, las células hTERT-HPNE no mostraron una respuesta citotóxica aditiva o sinérgica (Figura 5D), lo que respalda la naturaleza específica del cáncer de la terapia combinada. Estos hallazgos refuerzan el potencial terapéutico de la inhibición de BCL2 para mejorar la eficacia de TAS-102, particularmente en modelos de cáncer epiteliales y con proficiencia en p53, y destacan la importancia del contexto celular para predecir los resultados del tratamiento combinado.

Por otro lado, las células RKO, que comparten el estado de inestabilidad de microsatélites alta (MSI-H) con HCT 116, no mostraron un efecto sinérgico en ninguna de las condiciones de tipo salvaje de p53 o con knockout (Figuras suplementarias 5D–E). Si bien las diferencias morfológicas entre las células epiteliales HCT 116 y las células mesenquimales RKO pueden influir en las respuestas a los fármacos, las mutaciones somáticas como KRAS o BRAF podrían modular la sensibilidad. HCT 116 y MIA PaCa-2, ambas con mutación KRAS, son sensibles a la terapia combinada de ABT-263^[57],^[58] debido a la sobreexpresión de BCL-XL impulsada por KRAS, el objetivo de ABT-263, y a una mayor dependencia de la actividad lisosomal^[59], mientras que las células RKO podrían resistir la apoptosis a través de la regulación al alza de MCL-1 aguas abajo de BRAF-V600E, lo que reduce la sensibilidad a ABT-263^[60].

Para validar los hallazgos in vitro en un contexto más fisiológicamente relevante, replicamos el tratamiento combinado de TAS-102 y ABT-263 en modelos de xenoinjerto derivados de células (CDX) y xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) utilizando sistemas de cáncer colorrectal. En el modelo CDX, la terapia combinada replicó constantemente los efectos antitumorales mejorados observados in vitro, lo que resultó en una reducción significativa del crecimiento tumoral en comparación con la monoterapia (Figura 5E). De manera similar, el modelo PDX demostró una disminución de la progresión del volumen tumoral bajo el tratamiento combinado en relación con TAS-102 solo, lo que confirmó que la eficacia sinérgica de la terapia es reproducible in vivo (Figura 5F). Además, tanto los modelos CDX como PDX mostraron una reducción significativa del peso tumoral bajo el tratamiento combinado en comparación con TAS-102 solo (Figuras 5G–H). Es importante destacar que el peso corporal se mantuvo estable y los recuentos de glóbulos blancos y rojos no mostraron cambios significativos en los modelos CDX y PDX (Figuras suplementarias 5F–H y 5J–L); sin embargo, los niveles de plaquetas disminuyeron en ambos modelos bajo el tratamiento combinado (Figuras suplementarias 5I y 5M), lo que es consistente con los efectos adversos previamente informados de la trombocitopenia inducida por TAS-102 y la supresión de plaquetas asociada con ABT-263^[61],^[62]. Estos resultados confirman que la interacción sinérgica entre TAS-102 y la inhibición de BCL2 es tanto eficaz como reproducible in vivo, lo que refuerza el potencial de traslación de esta estrategia combinada para superar la quimiorresistencia a TAS-102 y mejorar la quimiosensibilización en el cáncer colorrectal.

BOGO facilita la sobreexpresión estable de un único ORF por célula mediante la integración precisa de un vector donante del sitio de inserción Bxb1 en el locus AAVS1 a través de la recombinación homóloga^[26] (Figura 1B). Se utilizó la clonación Gateway para garantizar la sobreexpresión precisa de genes codificantes de proteínas, con cada ORF expresado bajo el promotor EF1α. El conjunto de células resultante abarcó aproximadamente 19.000 genes codificantes de proteínas, derivados de hORFeome 9.1^[22],^[23] y clones adicionales (ORFeome Delta) proporcionados por colaboradores. Las células HeLa, diseñadas con el sistema de sitio de inserción Bxb1, se transfectaron con la biblioteca hORFeome (Figura 1B). La integrasa Bxb1 permitió la inserción precisa de un único ORF en el sitio AAVS1, minimizando la variabilidad y garantizando una expresión génica uniforme. Las células se clasificaron en función de la señal del reportero mCherry y se expandieron para formar el conjunto experimental, que representaba todo el espectro de hORFeome. El análisis mediante citometría de flujo (FACS) reveló que aproximadamente el 20% de las células eran mCherry-positivas/mTagBFP2-negativas (Figura Suplementaria 1A, panel izquierdo), logrando una cobertura de 150× con más de 3 millones de células clasificadas, lo que indica una representación robusta del ORFeome (Figura Suplementaria 1A, panel derecho). El extenso secuenciamiento del conjunto de células inicial confirmó que las secuencias de ORF eran concordantes con sus correspondientes secuencias de ADN codificante (CDS), y aproximadamente el 90% de los ORF se integraron con éxito (Figura 1C). Para evaluar la reproducibilidad, probamos cinco lotes independientes en estudios de detección de fármacos a gran escala. Los resultados mostraron efectos de lote mínimos, con altas correlaciones entre los replicados técnicos en los diferentes tratamientos (Figura 1D), lo que confirmó la estabilidad y la fiabilidad de la representación del ORFeome después de la congelación y descongelación.

Aprovechando el conjunto de células HeLa ORFeome establecido, realizamos dos estudios funcionales iniciales para investigar: i) la respuesta a los fármacos y ii) el silenciamiento de los ORF, ambos aspectos críticos de la biología del cáncer y la regulación de la expresión génica. Para evaluar el impacto de los ORF individuales en la respuesta a los fármacos, cuantificamos la abundancia relativa de las poblaciones de células que expresan ORF en tres condiciones: i) línea de base (células de la biblioteca no tratadas), ii) células tratadas con DMSO (control vehículo) y iii) células tratadas con quimioterapia (condición experimental). Los amplicones derivados del ADN genómico se sometieron a secuenciación de nueva generación (NGS) para medir la abundancia de ORF. El cambio de logaritmo base 2 (log2FC) entre las condiciones tratadas con fármacos y las condiciones de control vehículo se utilizó para evaluar la representación diferencial. Los ORF con log2FC > 0,5 o < −0,5 y p < 0,05 se definieron como efectores de la respuesta a los fármacos (Tabla Suplementaria 1). Clasificamos estos ORF enriquecidos como factores impulsores de la resistencia a los fármacos, mientras que los ORF disminuidos se designaron como factores impulsores de la sensibilización a los fármacos.

Para verificar la reproducibilidad y la relevancia funcional de nuestro sistema de perturbación, realizamos experimentos de sobreexpresión individuales para siete ORF seleccionados, comparando sus efectos con las células de control de fluorescencia mCherry. Estas validaciones confirmaron los resultados fenotípicos observados en el estudio de respuesta a los fármacos BOGO. Por ejemplo, la sobreexpresión de BCL2 resultó en un aumento de la abundancia de células bajo el tratamiento con trifluridina (TFT), lo que es consistente con su clasificación como un factor impulsor de la resistencia a los fármacos en nuestro estudio (Figura 1E). Por el contrario, la sobreexpresión de CDK6, identificado como un factor impulsor de la sensibilización a los fármacos, condujo a una marcada reducción de la población celular después del tratamiento con TFT (Figura 1E), lo que coincide con hallazgos previos^[27] que indican que la sobreexpresión de CDK6 sensibiliza a las células al daño del ADN. Esta fuerte concordancia entre los cambios fenotípicos en las líneas de sobreexpresión de un único ORF y los perfiles de perturbación a nivel del proteoma proporciona evidencia directa de la validez funcional y la reproducibilidad de la metodología de detección BOGO.

Para demostrar el valor complementario de la plataforma de detección BOGO en relación con los enfoques transcriptómicos convencionales, realizamos una secuenciación masiva de ARNm en células HeLa de tipo salvaje tratadas con doxorrubicina, un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado con amplias aplicaciones clínicas^[28]. Los perfiles de respuesta transcripcional se obtuvieron en dos puntos temporales: 120 horas, que corresponde a la duración de nuestro estudio del ORFeome, y 24 horas, para capturar los cambios agudos en la expresión génica. Comparamos los conjuntos de genes expresados diferencialmente (DEG) identificados en estos conjuntos de datos de secuenciación de ARNm (Tabla Suplementaria 2) con los efectores de la respuesta a los fármacos descubiertos a través de nuestro estudio de respuesta a los fármacos. Este análisis reveló conjuntos de genes superpuestos y distintos (Figura 1F). En particular, el estudio BOGO identificó aproximadamente cinco veces más genes que la secuenciación masiva de ARNm en el punto temporal de 120 horas, con solo un 2% de superposición. A las 24 horas, el estudio BOGO detectó diez veces más genes, pero la superposición con los DEG fue aún menor, del 0,5%. Estas diferencias probablemente se deban a las limitaciones inherentes de la secuenciación masiva de ARNm, que captura la expresión génica endógena sujeta a mecanismos reguladores dinámicos. En contraste, la plataforma BOGO utiliza la sobreexpresión constitutiva de ORF, lo que permite la identificación de efectores funcionales de la resistencia a los fármacos que pueden estar enmascarados o subrepresentados en los perfiles transcripcionales naturales. Por lo tanto, la detección basada en la sobreexpresión ofrece un enfoque potente y complementario a la transcriptómica convencional, revelando genes biológicamente y clínicamente relevantes que pueden pasar desapercibidos para los métodos estándar.

Para validar y caracterizar aún más los resultados identificados en nuestro estudio de respuesta a los fármacos, realizamos una reevaluación de alta saturación (HSR), un enfoque dirigido que implica subconjuntos más pequeños y selectivamente seleccionados de la biblioteca de ORFeome analizados con una cobertura aumentada para garantizar la reproducibilidad y la robustez. Aproximadamente el 10% del conjunto de ORF original, que comprende una mezcla de ORF asociados con la proliferación y la respuesta a los fármacos, se reevaluó con una cobertura de >1.000 veces. Comparamos los resultados del estudio de respuesta a los fármacos inicial con los del HSR para la doxorrubicina (Tabla Suplementaria 3). Primero, confirmamos una alta representación de los ORF seleccionados en el conjunto de datos HSR, en el que 2.184 ORF (98,5%) del conjunto seleccionado se detectaron con éxito (Figura Suplementaria 1E, diagrama de Venn izquierdo). Entre los ORF efectores de la doxorrubicina, 93 (96,9%) se recuperaron en el HSR, con solo 3 ORF (3,1%) no detectados (Figura Suplementaria 1E, diagrama de Venn derecho), lo que confirmó la fidelidad y la cobertura del proceso de reevaluación. Es importante destacar que el HSR validó las tendencias direccionales observadas en el estudio inicial (Figura 1G). Los ORF identificados previamente como factores impulsores de la sensibilización a los fármacos, como HIT1H3B, mostraron cambios promedio negativos en el HSR, lo que es consistente con una mayor sensibilidad a los fármacos. Por el contrario, los factores impulsores de la resistencia a los fármacos, como PITX2, mostraron cambios promedio positivos, lo que confirmó su fenotipo de resistencia (Figura Suplementaria 1B). Los ORF clasificados como no respondedores mostraron constantemente cambios cercanos a cero, lo que reforzó su falta de respuesta a los fármacos. Estos resultados demuestran la solidez estadística y la reproducibilidad de la plataforma BOGO, lo que respalda su fiabilidad en la identificación de efectores de la respuesta a los fármacos biológicamente y clínicamente relevantes.

En paralelo, abordamos el desafío del silenciamiento de los ORF, una limitación inherente de los sistemas de sobreexpresión. Para controlar el silenciamiento, se insertó una casete IRES-mCherry aguas abajo de cada ORF, lo que permitió discriminar entre la expresión activa y silenciada de los ORF. Al comparar la abundancia de ORF en las poblaciones de células mCherry-positivas y mCherry-negativas, cuantificamos la proporción de expresión activa. Los ORF con log2FC > 1 o < −1 y p < 0,05 se definieron como efectores del silenciamiento. Los valores positivos de log2FC indicaron ORF no silenciadores, mientras que los valores negativos indicaron ORF silenciadores. El análisis reveló que más del 60% de los ORF se mantuvieron como no silenciadores, mientras que menos del 30% mostraron efectos de silenciamiento medibles (Figura Suplementaria 1C). Además, cinco genes seleccionados mantuvieron una expresión estable durante cinco días de cultivo, sin un silenciamiento observable, lo que corroboró su clasificación como ORF no silenciadores en nuestro estudio. Por el contrario, GPER y BRD9 mostraron efectos de silenciamiento (Figura Suplementaria 1D), lo que es consistente con sus perfiles de silenciamiento en el estudio de respuesta a los fármacos (Figura Suplementaria 1E). En particular, GPER, una proteína de membrana que se sabe que induce toxicidad celular a través de la formación de cuerpos de inclusión, se ha informado previamente que suprime el crecimiento celular a través de este mecanismo^[29], lo que explica su falta de representación detectable. Estos resultados confirman la estabilidad y la fiabilidad de la expresión génica dentro del sistema BOGO y demuestran su utilidad en la identificación de efectores funcionales de la respuesta a los fármacos y en la evaluación de las tendencias de silenciamiento génico.

La clasificación funcional de los efectores de la respuesta a los fármacos revela sus características moleculares distintas y predice los resultados clínicos en el cáncer.

Nuestro estudio de respuesta a los fármacos comprende 16 agentes quimioterapéuticos, que abarcan una amplia gama de mecanismos citotóxicos. Estos fármacos se agruparon en cuatro categorías funcionales distintas según sus mecanismos de acción, incluidos 6 fármacos basados en la actividad antimetabolítica, 4 agentes de reticulación del ADN, 4 agentes de ruptura de cadenas y 2 fármacos que interrumpen los microtúbulos, que sirven como un mapa de referencia de los mecanismos citotóxicos clave^[30] (Figura Suplementaria 2A). Clasificamos sistemáticamente 18.388 ORF humanos en categorías distintas en función de su influencia en las respuestas a los fármacos (Figura 2A). Debido a la baja o indetectable representación en las poblaciones de células, 3.882 ORF se excluyeron del análisis posterior. Los 14.506 ORF restantes se clasificaron según sus patrones de representación diferencial en los diferentes tratamientos quimioterapéuticos, lo que dio como resultado cinco grupos funcionales: Central, Categórico, Multidroga, Periférico y No respondedor (Figura 2A).

Para evaluar el panorama de los ORF que modulan la respuesta a los fármacos (dORF), primero examinamos su distribución acumulada en todos los agentes quimioterapéuticos probados. El número de dORF únicos aumentó progresivamente con la inclusión de fármacos adicionales (Figura Suplementaria 2B), una tendencia que superó significativamente las expectativas de una permutación aleatoria, lo que validó la sensibilidad y la amplitud de nuestra plataforma de detección para capturar las interacciones gen-fármaco. Un histograma de los efectos de la respuesta a los fármacos reveló una disminución en el número de dORF a medida que aumentaba el número de fármacos, con solo un pequeño subconjunto de dORF que ejercía amplios efectos reguladores en hasta 13 agentes (Figura Suplementaria 2C). Con base en esta distribución, los dORF que afectaban las respuestas a más de 7 fármacos, aproximadamente la mitad del máximo observado, se designaron como ORF centrales. Para definir los umbrales de respuestas a fármacos más amplias o singulares, modelamos la distribución del recuento de respuesta a los fármacos por ORF utilizando una mezcla de distribuciones gamma y normal. La intersección correspondió a 2,64 fármacos (Figura Suplementaria 2D), que se utilizó para definir los ORF multidroga como aquellos que influyen en las respuestas a entre 2 y 7 fármacos. Los ORF periféricos se definieron como aquellos que modulan las respuestas a un único agente quimioterapéutico (Figura Suplementaria 2E), lo que refleja la especificidad de ciertas interacciones gen-fármaco. Dentro de los ORF categóricos, definidos como los ORF que afectan selectivamente las respuestas a los fármacos con mecanismos de acción compartidos, los dORF para los inductores de rotura de cadenas de ADN fueron los más prevalentes, aunque otras categorías de fármacos también mostraron perfiles de dORF distintos (Figura Suplementaria 2F). Los ORF no respondedores son aquellos que no mostraron un impacto significativo en las respuestas a los fármacos en todos los agentes probados. La exclusividad mutua de estas categorías se confirmó mediante el análisis del diagrama de Venn (Figura Suplementaria 2G).

A continuación, investigamos si las categorías de ORF definidas presentan propiedades intrínsecas distintas que puedan sustentar sus diferentes perfiles de respuesta a los fármacos. Entre estas, los ORF centrales demostraron la divergencia más pronunciada en múltiples características moleculares y funcionales, lo que concuerda con su amplia asociación con fenotipos resistentes a la quimioterapia. Específicamente, los ORF centrales exhibieron puntuaciones z significativamente más altas para el contenido de GC, la predicción del desorden de las proteínas, el enriquecimiento de términos de la Ontología Génica (GO), la frecuencia de publicación (PubCount) y las asociaciones con enfermedades mendelianas (Figura 2B). Por el contrario, características como la regulación específica de tejidos (Recuento de tejidos), la edad evolutiva, la amplitud de la expresión (número de tejidos en los que se expresa el gen), la abundancia de la expresión y el número de complejos proteicos asociados (según se anota en la base de datos CORUM) se redujeron notablemente en los ORF centrales (Figura 2B). Cabe destacar que los ORF centrales también tendieron a ser más cortos en comparación con otras categorías, mientras que los ORF categóricos exhibieron las secuencias más largas. Estas observaciones sugieren que los ORF con baja expresión basal pueden ser más susceptibles a la modulación fenotípica tras la sobreexpresión artificial, lo que podría explicar su prominencia en nuestro cribado. En contraste, los genes con alta expresión endógena pueden ser menos sensibles a las perturbaciones, lo que limita su capacidad de detección como efectores de la respuesta a los fármacos. Si bien este sesgo puede influir en la representación de los ORF centrales, nuestra plataforma de cribado sigue siendo robusta para identificar factores funcionales relevantes que influyen en la respuesta a los fármacos y en la enfermedad. En conjunto, estos hallazgos indican que los ORF centrales representan un subconjunto distinto de elementos reguladores poco apreciados que adquieren importancia funcional tras la regulación al alza, y que difieren de otras categorías de ORF tanto en sus atributos estructurales como funcionales.

Para evaluar la relevancia clínica de las categorías de ORF, analizamos su superposición con biomarcadores específicos del cáncer recopilados en la base de datos TheMarker^[31]. Para cada categoría de ORF, cuantificamos tres métricas: (1) el porcentaje de ORF que se superponen con biomarcadores conocidos del cáncer (% de ORF), (2) la proporción de biomarcadores asociados con agentes quimioterapéuticos incluidos en nuestro cribado de respuesta a fármacos (% de terapéuticos) y (3) la contribución de cada categoría de ORF al conjunto general de biomarcadores (% de biomarcadores; Figura 2C, izquierda). Los ORF centrales exhibieron puntuaciones z significativamente más altas en las tres métricas, lo que indica un fuerte enriquecimiento de biomarcadores validados clínicamente y destaca su amplia relevancia para la respuesta a la quimioterapia. En contraste, los ORF categóricos mostraron puntuaciones z más bajas, lo que sugiere que sus funciones pueden ser más específicas del mecanismo y menos representadas en las bases de datos de biomarcadores actuales. Estas tendencias se visualizaron claramente en mapas de calor de las distribuciones de las puntuaciones z, lo que resaltó el potencial de traslación de distintos subconjuntos de ORF (Figura 2C, izquierda). Un análisis más profundo de los tipos de biomarcadores reveló una predominancia de biomarcadores predictivos en todas las categorías de ORF, lo que apoya la hipótesis de que los ORF individuales pueden influir en los resultados favorables o desfavorables en respuesta a agentes quimioterapéuticos específicos (Figura 2C, derecha). Este enfoque integrador, que combina la categorización funcional con la superposición de biomarcadores, demuestra la utilidad de nuestra plataforma de cribado para identificar candidatos de ORF con alta relevancia traslacional.

Para evaluar aún más la utilidad de la plataforma BOGO en la identificación de marcadores clínicos pronósticos y en la predicción de la resistencia a los fármacos, comparamos los efectos de los ORF individuales sobre la proliferación celular con los indicadores pronósticos del cáncer derivados de la base de datos Human Protein Atlas (HPA)^[20] y The Cancer Genome Atlas (TCGA)^[32]. Los ORF representados de forma diferencial se identificaron comparando sus poblaciones celulares en el estado basal y después de nueve días de crecimiento competitivo. Los ORF con cambios significativos (log2FC > 1 o < −1; p < 0,05) se clasificaron como reguladores de la proliferación celular, y los ORF enriquecidos se designaron como reguladores a la alza del crecimiento celular y los ORF disminuidos como reguladores a la baja del crecimiento celular. Utilizando las clasificaciones de las puntuaciones z, evaluamos el rendimiento predictivo de nuestra lista de ORF en la identificación de marcadores clínicamente relevantes. El análisis de precisión-recuperación reveló que la clasificación de los ORF en orden descendente por puntuación de proliferación (colocando los reguladores a la alza en la parte superior) produjo una alta precisión para identificar marcadores asociados con un pronóstico desfavorable del cáncer (Figura 2D). Por el contrario, la clasificación de los ORF en orden ascendente (colocando los reguladores a la baja en la parte superior) enriqueció los marcadores de un pronóstico favorable, aunque la precisión disminuyó más rápidamente, alcanzando un mínimo comparable de aproximadamente el 40% (Figura 2E). Para ilustrar la importancia clínica de estos hallazgos en el cáncer de cuello uterino (CESC), seleccionamos ORF representativos de ambos extremos del espectro pronóstico. La sobreexpresión de la fosfoglucomutasa 1 (PGM1), un regulador a la alza de alto rango, se asoció fuertemente con una reducción de la probabilidad de supervivencia (Figura 2F), lo que concuerda con su función en la promoción de la proliferación celular. En contraste, la sobreexpresión de la proteína de unión al ARN de lazo de tallo SRA (SLIRP), un regulador a la baja de alto rango, se correlacionó con una mejora de los resultados de los pacientes (Figura 2G), lo que sugiere un efecto supresor sobre la proliferación del cáncer. En conjunto, estos análisis de precisión-recuperación y supervivencia subrayan la relevancia clínica de nuestro enfoque de cribado y su capacidad para identificar prometedores reguladores de la proliferación celular con valor pronóstico.

Hicimos la hipótesis de que los efectores de la respuesta a los fármacos exhibirían fuertes correlaciones con los reguladores de la proliferación celular, basándonos en la premisa de que los mecanismos de resistencia robustos pueden conferir una mayor capacidad proliferativa a las células cancerosas. Para probar esto, comparamos los resultados de nuestro cribado de respuesta a fármacos con un conjunto de datos de resistencia a fármacos recopilado manualmente de TCGA^[33], evaluando la capacidad de nuestra plataforma para identificar factores de resistencia conocidos. El análisis de precisión-recuperación de nuestro conjunto de datos de respuesta a fármacos clasificado reveló una alta precisión entre los genes de mayor rango tanto para la resistencia al cisplatino (Figura 2H) como para el 5-fluorouracilo (5-FU) (Figura 2I), lo que indica un enriquecimiento eficaz de los mecanismos de resistencia establecidos. Por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína de unión al dominio de homología de Src 2 (SH3BP2), un candidato de resistencia al cisplatino de alto rango, se asoció fuertemente con una reducción de la supervivencia en pacientes con adenocarcinoma pancreático (PAAD) (Figura 2J). De manera similar, la proteína que contiene el dominio de la bobina en espiral 47 (CCDC47), identificada como un factor de resistencia al 5-FU, se correlacionó con un mal pronóstico en el carcinoma hepatocelular (LIHC) (Figura 2K). Ambos genes también demostraron efectos de impulso de la resistencia a los fármacos en nuestros datos de cribado (Figura suplementaria 2H). Este análisis integrador, que combina el cribado funcional con conjuntos de datos clínicos, subraya la capacidad de la plataforma BOGO para descubrir nuevos genes de resistencia a los fármacos con relevancia biológica y clínica directa en el cáncer.

El análisis multimodal de los perfiles de respuesta a los fármacos del ORFeoma identifica las vías relacionadas con BCL2 como un mecanismo convergente de resistencia a la quimioterapia.

Para investigar cómo las perturbaciones genéticas inducidas por la sobreexpresión del ORFeoma humano influyen en las respuestas celulares al estrés quimioterapéutico, realizamos un análisis de reducción de dimensionalidad en los 16 perfiles de respuesta a fármacos del ORFeoma. Los diagramas de aproximación y proyección de múltiples uniformes (UMAP) revelaron distintos patrones de agrupación que corresponden a los tratamientos farmacológicos individuales (Figura 3A). Los controles de DMSO de cinco lotes independientes se agruparon estrechamente a lo largo del eje UMAP1, lo que indica efectos de lote mínimos. Además, las réplicas biológicas se agrupan constantemente por agentes quimioterapéuticos, lo que subraya la robustez y la reproducibilidad de los datos de cribado. Cabe destacar que los fármacos con mecanismos de acción compartidos generalmente se agruparon en estrecha proximidad, lo que demuestra la capacidad del análisis de reducción de dimensionalidad para capturar amplias respuestas biológicas. Por ejemplo, la mitomicina C se agrupó por separado de otros agentes alquilantes, lo que probablemente refleja su mecanismo único como inhibidor de la síntesis de ADN. De manera similar, aunque TFT y 5-FUlysot se clasifican como antimetabolitos, sus patrones de agrupación divergentes sugieren perfiles de resistencia distintos y mecanismos de acción subyacentes^[34].

Para descubrir patrones compartidos de los 16 perfiles de respuesta a fármacos, realizamos un análisis de correlación de todos los pares de perfiles de respuesta a fármacos de ORF, lo que resultó en más de 200 millones de comparaciones por pares (Figura 3B). Se extrajeron las interacciones de alta confianza, definidas por un coeficiente de correlación de Pearson que supera |0,9|, y se visualizaron como una red de similitud, lo que reveló grupos de ORF con comportamientos de respuesta comparables en conjuntos similares de agentes quimioterapéuticos^[35] (Figura 3B, panel izquierdo). En esta red, las distancias más cortas entre los ORF indican una mayor similitud en la regulación de la respuesta a los fármacos tras la sobreexpresión, lo que sugiere funciones biológicas compartidas y vías reguladoras subyacentes. Para anotar funcionalmente estos grupos, aplicamos el análisis espacial del enriquecimiento funcional (SAFE)^[36], que identificó los procesos biológicos clave asociados con la respuesta quimioterapéutica (Figura 3B, panel derecho). Cabe destacar que observamos un enriquecimiento de las vías relacionadas con BCL2, incluidas la unión al dominio de homología de BCL2 y la autofagia y la apoptosis. Estas vías son mediadores bien establecidos tanto de la resistencia como de la sensibilidad a varios agentes quimioterapéuticos^[37],^[38], pero no se han relacionado previamente con fármacos análogos del ADN, como TAS-102 y TFT. Esta nueva asociación destaca la sensibilidad de nuestro enfoque para detectar tanto los mecanismos de respuesta a los fármacos conocidos como los previamente no reconocidos. En conjunto, estos hallazgos demuestran el poder de la plataforma BOGO para revelar redes de genes funcionales y descubrir vías reguladoras clave que subyacen a las respuestas quimioterapéuticas, lo que refuerza su utilidad para identificar objetivos viables en la terapia contra el cáncer.

Para investigar más a fondo la relevancia mecánica de las vías relacionadas con BCL2 identificadas en nuestra red de similitud de respuesta a fármacos, específicamente, los grupos anotados como unión al dominio BH y autofagia y apoptosis (Figura 3B), realizamos un análisis de red en profundidad para evaluar su potencial como objetivos para la terapia de combinación. Realizamos un análisis de red STRING^[39] en la subred que comprende los ORF de estos dos grupos para dilucidar las interacciones proteína-proteína entre los genes identificados (Figura 3C). Los 20 ORF de los grupos enriquecidos por SAFE se analizaron utilizando STRING para mapear las interacciones experimentales y predichas (Tabla suplementaria 4). Este análisis reveló 12 genes clave involucrados en vías de señalización críticas y respuestas al daño celular, resaltados como nodos en forma de diamante en la Figura 3C. El panel derecho de la figura ilustra las interacciones entre estos nodos proteicos y sus grupos GO asociados, lo que refleja una fuerte conectividad funcional y relevancia biológica. Entre las vías enriquecidas se encuentran el transporte vesicular, la señalización apoptótica, la modificación de histonas y la señalización del receptor Notch, todas ellas funcionalmente relacionadas con los genes relacionados con BCL2 identificados en los dos grupos. Estos hallazgos proporcionan una justificación mecánica convincente para dirigir las vías asociadas con BCL2 en la resistencia a la quimioterapia y subrayan la utilidad de la plataforma BOGO para descubrir redes biológicas viables.

Para validar la relevancia biológica de nuestro cribado, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de los reguladores de la respuesta a los fármacos ORF en las diferentes categorías de ORF (Figura suplementaria 3A–B). Los ORF centrales y multidroga se enriquecieron en las vías canónicas del cáncer, incluyendo las vías Wnt, TGF-β, PI3K-AKT e Hippo, así como la apoptosis y la respuesta al daño del ADN, lo que es consistente con los mecanismos de quimiorresistencia. Los ORF no respondedores mostraron un enriquecimiento limitado en las vías relacionadas con el cáncer, y en cambio, se mapearon a procesos del metabolismo de los ácidos grasos y a las uniones estrechas, lo que sugiere una contribución mínima a la respuesta a los fármacos. Los ORF silenciados se enriquecieron de forma única en las vías relacionadas con las quinasas, incluyendo las vías de señalización AMPK y MAP quinasa, lo que destaca que algunos de los factores de resistencia siguen sin detectarse en el cribado BOGO (Figura suplementaria 3A).

El análisis específico de fármacos reveló patrones coherentes a nivel mecanístico en la quimioterapia individual (Figura suplementaria 3B). Los efectores de la respuesta a los fármacos para el cisplatino se enriquecieron en la reparación del ADN y en la necrosis regulada, lo que es consistente con su mecanismo de acción. Los efectores del paclitaxel se asociaron con la actividad de los microtúbulos y la senescencia celular, lo que refleja su papel en la detención del ciclo mitótico. Los efectores de trifluridina/tipiracil convergieron en la señalización NF-κB, el metabolismo de las pirimidinas y, de forma única, en la señalización KIT y la activación de MYC, lo que destaca distintos mecanismos. Los efectores de la doxorrubicina se enriquecieron en las vías de la apoptosis y la respuesta al estrés, lo que se alinea con su inducción del daño del ADN y el estrés celular. Estas firmas de enriquecimiento se alinean con la correlación y la red STRING. La aparición constante de la actividad autofágico-lisosomal, la ferroptosis, la necrosis y la piroptosis en los análisis categóricos y específicos de fármacos refuerza su papel central en la mediación de la resistencia a los fármacos contra el cáncer y valida la capacidad de la plataforma BOGO para capturar tanto los mecanismos de resistencia conocidos como los novedosos.

Para validar aún más la plataforma de cribado de sobreexpresión BOGO, comparamos los perfiles de respuesta a los fármacos con los datos transcripcionales obtenidos mediante la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Se realizó scRNA-seq en células tratadas con trifluridina/tipiracil, cisplatino, doxorrubicina y paclitaxel, cada uno de los cuales representa distintas categorías mecanísticas dentro de nuestro panel de quimioterapia. Se capturaron aproximadamente 32.000 células en cinco condiciones de tratamiento, incluido un control de DMSO, y la variación en el número de células se mantuvo dentro del 10%. El análisis de agrupamiento reveló perfiles transcripcionales distintos para cada tratamiento (Figura 3D, panel izquierdo). Los tratamientos con paclitaxel y trifluridina/tipiracil mostraron patrones de agrupamiento únicos, mientras que el cisplatino y la doxorrubicina mostraron una superposición parcial, lo que es consistente con sus mecanismos de acción convergentes. El análisis de enriquecimiento de genes de los grupos específicos del tratamiento reveló un enriquecimiento significativo de las vías que se asocian comúnmente con la quimiorresistencia, incluyendo la autofagia, la apoptosis y la señalización Wnt, lo que se hace eco de los hallazgos de nuestra red de similitud de perfiles de respuesta a los fármacos (Figura 3D, panel derecho).

Cabe destacar que los genes como BCL2, TP53, CDK6 y TYMS (el objetivo de trifluridina/tipiracil) se asociaron con los cuatro tratamientos y mostraron una desregulación específica dentro del grupo de la autofagia y la apoptosis (Figuras suplementarias 3B–E), lo que sugiere que este grupo puede representar una población de células quimiorresistentes. El análisis de la expresión génica diferencial (Tabla suplementaria 5) identificó además una reducción significativa de TRADD, un gen implicado en la señalización apoptótica dentro del mismo grupo GO^[40],^[41], y un aumento de POLD2, un gen de la vía Wnt relacionado con la proliferación celular^[42] (Figura 3D). Es importante destacar que la regulación de estos genes fue consistente tanto en los datos de scRNA-seq como en el análisis de la red fármaco-ORF. Además, el análisis del puntaje z de los cambios de pliegue log2 destacó los genes clave asociados con la resistencia, incluyendo YBX3 (cisplatino), ZNF143 (doxorrubicina), ZNF217 (trifluridina/tipiracil) y GATA2 (paclitaxel), junto con varios candidatos menos caracterizados con posibles funciones en la resistencia o la sensibilización a los fármacos^[43]–^[46] (Figura suplementaria 3F). Esta fuerte concordancia entre las plataformas refuerza la capacidad del cribado BOGO para capturar los mecanismos de respuesta a los fármacos relevantes a nivel de resolución de una sola célula y posiciona a BCL2 como un prometedor objetivo terapéutico, especialmente en el contexto de los fármacos análogos del ADN, como trifluridina/tipiracil y TAS-102.

En resumen, la convergencia de la evidencia procedente de la reducción de la dimensionalidad, el análisis de la red fármaco-gen y la transcriptómica de una sola célula apoya firmemente el papel fundamental de las vías relacionadas con BCL2 en la mediación de la resistencia quimioterapéutica en diversas clases de agentes. Estos hallazgos subrayan la robustez y la sensibilidad de nuestra plataforma de cribado de sobreexpresión de ORFeoma para descubrir tanto los mecanismos de resistencia establecidos como los previamente no reconocidos. La identificación constante de BCL2 como un nodo regulador central en múltiples marcos analíticos proporciona una sólida justificación para su investigación adicional como candidato para la terapia combinada, especialmente en el contexto de los fármacos análogos del ADN, como trifluridina/tipiracil y TAS-102.

La inhibición de BCL2 supera la quimiorresistencia al alterar la función lisosomal, un mecanismo revelado mediante un cribado genómico funcional.

Basándonos en nuestra identificación de BCL2 como un regulador central y en el enriquecimiento de las vías de la autofagia y la apoptosis en la resistencia a la quimioterapia, evaluamos la relevancia terapéutica de combinar un inhibidor de BCL2 con un agente quimioterapéutico. Seleccionamos TAS-102, una formulación oral que comprende trifluridina y clorhidrato de tipiracil (TPI), debido a su relevancia clínica y a sus favorables propiedades farmacocinéticas, incluyendo la biodisponibilidad oral^[47]. Para dirigirse a los mecanismos de resistencia relacionados con BCL2, empleamos ABT-263 (Navitoclax®), un inhibidor de la familia BCL2 de amplio espectro que se sabe que antagoniza a BCL2, BCL2L1 y BCL2L2^[48], todos los cuales se identificaron como factores de resistencia a los fármacos en nuestro análisis de red (Figura 3C). Esta estrategia de combinación fue diseñada para alterar la señalización de supervivencia mediada por BCL2 y mejorar la eficacia citotóxica de TAS-102.

Para identificar modelos de cáncer fisiológicamente relevantes para evaluar la terapia combinada de TAS-102 e inhibidor de BCL2, investigamos si el tratamiento con TAS-102 modula la expresión endógena de la proteína BCL2. La asociación bien establecida entre la señalización de BCL2, la autofagia y la quimiorresistencia en los cánceres de colon y páncreas^[49],^[50] proporcionó una sólida justificación para seleccionar líneas celulares representativas de estos cánceres. El análisis de Western blot reveló una marcada sobreexpresión de BCL2 tras el tratamiento con TAS-102 en las líneas celulares de cáncer de colon HCT 116 y RKO, y en la línea celular de cáncer de páncreas MIA PaCa-2. Se observó un aumento modesto en las células HeLa, mientras que las células HT-29 no mostraron expresión detectable de BCL2 (Figura suplementaria 4A). Estos patrones de expresión diferenciales informaron sobre la selección de HCT 116 como el modelo primario para los experimentos de terapia combinada posteriores, debido a su robusta inducción de BCL2 y su relevancia para el cáncer de colon.

Dado el papel de BCL2 en la modulación de la apoptosis y la autofagia^[51], examinamos los marcadores proteicos asociados con la actividad lisosomal y la autofagia tras los tratamientos con un solo agente y la combinación. En las células HCT 116, el tratamiento con TAS-102, ya sea solo o en combinación con ABT-263, dio como resultado un aumento pronunciado en la expresión de LAMP1 y TFEB, marcadores clave de la biogénesis y la función lisosomal^[52] (Figura suplementaria 4B). En contraste, los marcadores de autofagia LC3B y p62^[53] mostraron una expresión relativamente estable en todas las condiciones de tratamiento. Se observaron patrones de expresión similares en las células HeLa, aunque los efectos fueron más modestos, especialmente para TFEB tras el tratamiento combinado. Estos resultados sugieren que, si bien la actividad de la autofagia permanece estable, la modulación lisosomal se regula dinámicamente en respuesta a TAS-102 y ABT-263, lo que implica que las vías lisosomales pueden contribuir a los mecanismos de resistencia a la quimioterapia.

Para investigar más a fondo el impacto de TAS-102 y ABT-263 en la regulación lisosomal, examinamos la localización de TFEB mediante la tinción de inmunofluorescencia. El tratamiento con TAS-102 condujo a un aumento de la localización nuclear de TFEB, lo que es consistente con la activación de la biogénesis lisosomal. Sin embargo, el tratamiento combinado con ABT-263 redujo significativamente la localización nuclear de TFEB (Figura 4A; Figura suplementaria 4C), lo que sugiere una alteración de la activación lisosomal mediada por TFEB. Esta observación se alinea con la elevación concurrente de los niveles de proteína TFEB y LAMP1, en ausencia de la degradación correspondiente de p62 o LC3B (Figura suplementaria 4B), lo que indica que, si bien la maduración de los autofagosomas puede progresar, la degradación lisosomal se ve afectada. Estos datos sugieren que, aunque los niveles totales de TFEB aumentan bajo el tratamiento con TAS-102, la translocación nuclear y la activación funcional de los lisosomas se alteran cuando se administra ABT-263, lo que indica que la modulación lisosomal es un mecanismo clave que subyace a la respuesta observada a los fármacos.

Para investigar más a fondo las consecuencias funcionales de la modulación lisosomal, evaluamos la actividad proteolítica lisosomal utilizando la tinción con DQ-BSA^[54], que emite fluorescencia roja tras la proteólisis. En las células HCT 116, el tratamiento con TAS-102 aumentó significativamente la intensidad de la fluorescencia roja, lo que indica una mayor actividad lisosomal. Sin embargo, el tratamiento concurrente con ABT-263 redujo notablemente la fluorescencia, lo que sugiere una proteólisis alterada (Figura 4B; Figura suplementaria 4D). Coherente con estos hallazgos, las mediciones del pH lisosomal revelaron una acidificación bajo el tratamiento con TAS-102 solo, mientras que la terapia combinada condujo a un aumento del pH, lo que indica una alteración de la acidificación lisosomal (Figura 4C). Estos resultados señalan un posible mecanismo de resistencia que implica una disfunción lisosomal, en el que TAS-102 promueve la activación lisosomal, pero la inhibición de BCL2 compromete la función lisosomal. Para evaluar la relevancia funcional de esta alteración, co-tratamos las células con TAS-102 y bafilomicina A1, un conocido inhibidor lisosomal. Esta combinación redujo significativamente la proliferación celular en comparación con TAS-102 solo después de 48 horas de tratamiento (Figura 4D), lo que apoya el papel de la integridad lisosomal en la modulación de la respuesta a la quimioterapia.

Para identificar los moduladores lisosomales que contribuyen a la resistencia a la quimioterapia, desarrollamos un cribado de perturbación de sobreexpresión de genes de seguimiento mediante la integración de la plataforma BOGO con LysoTracker^[55]-FACS (Figura 4E). Las células HeLa que expresan la biblioteca de ORFeoma del cribado de respuesta a los fármacos anterior se tiñeron con LysoTracker y se clasificaron en poblaciones con alta y baja actividad lisosomal (el 5% superior y el 5% inferior en función de la intensidad de la fluorescencia verde). La secuenciación de última generación (NGS) posterior permitió la identificación de los ORF asociados con la modulación lisosomal. Los ORF enriquecidos en el 5% superior se clasificaron como activadores lisosomales, mientras que los enriquecidos en el 5% inferior se designaron como represores lisosomales (log2FC > 0,5 o < −0,5; p < 0,05). El análisis UMAP confirmó un agrupamiento consistente en los triplicados biológicos para el 5% superior, el 5% inferior y las muestras previas al cribado, lo que apoya la robustez y la reproducibilidad de la plataforma de cribado BOGO (Figura suplementaria 4E). Cabe destacar que BCL2, que se identificó previamente como un factor de resistencia inducido por TAS-102, también mostró una fuerte activación lisosomal en este cribado (Tabla suplementaria 6). El análisis de enriquecimiento de vías de los moduladores lisosomales reveló una importante participación de la señalización TGFβ (Figura 4F), lo que implica su papel en la autofagia y la regulación lisosomal. Para refinar aún más el análisis, intersectamos los moduladores lisosomales con los ORF de resistencia y sensibilización específicos de TAS-102, identificando 109 ORF como activadores lisosomales, 78 como represores lisosomales y 91 que se superponen tanto con la modulación lisosomal como con los perfiles de respuesta a TAS-102 (Figura suplementaria 4F). Estos hallazgos destacan un subconjunto de factores de resistencia relacionados con los lisosomas específicos de TAS-102, lo que ofrece información mecanística y posibles objetivos terapéuticos.

Entre los 109 activadores lisosomales identificados, seleccionamos GHSR y CCDC86 para un análisis más exhaustivo basándonos en tres criterios: (i) fuerte activación lisosomal (log2FC > 1), (ii) novedad y (iii) pronunciada resistencia a TAS-102. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando datos del TCGA PanCancer Atlas reveló que una alta expresión de GHSR se asociaba significativamente con una peor supervivencia general (Figura 4G, panel izquierdo), particularmente en cáncer colorrectal, de pulmón y esofagogástrico (Figura 4G, panel derecho). De manera similar, una mayor expresión de CCDC86 se correlacionó con un peor pronóstico en un período de 10 años (Figura 4H, panel izquierdo), en múltiples tipos de cáncer, incluidos el cáncer colorrectal, de pulmón y de las vías biliares (Figura 4H, panel derecho). Estos hallazgos respaldan la relevancia de GHSR y CCDC86 como marcadores de resistencia asociados a los lisosomas y posibles dianas terapéuticas. En conjunto, nuestros experimentos funcionales demuestran que la inhibición de BCL2 en combinación con TAS-102 altera la función lisosomal y que la plataforma BOGO permite la realización de cribados funcionales fenotípicos para descubrir vías mecanísticas e identificar genes candidatos con implicaciones para la respuesta terapéutica y el pronóstico del cáncer.

La validación preclínica in vitro e in vivo demuestra la actividad antitumoral sinérgica y dependiente de p53 de la combinación de la inhibición de BCL2 con TAS-102.

Para evaluar la aplicabilidad clínica de TAS-102 en combinación con ABT-263, investigamos sus efectos citotóxicos tanto en contextos dependientes de p53 como específicos del cáncer. El análisis de la red STRING reveló una interacción indirecta entre BCL2 y TYMS, el objetivo principal de TAS-102, mediada por p53 (Figura suplementaria 5A), lo que sugiere que p53 puede servir como un centro crítico que conecta las vías de BCL2 y TYMS. Para probar esta hipótesis, empleamos modelos de eliminación de p53 y comparamos su respuesta al tratamiento combinado con células de tipo salvaje (Figura suplementaria 5B). Las dosis de ABT-263 se seleccionaron en función de los valores de CI50 derivados de las curvas de respuesta a la dosis en líneas celulares de cáncer colorrectal (Figura suplementaria 5C). Los ensayos de citotoxicidad revelaron una reducción sustancial en la viabilidad celular en las células HCT 116 de tipo salvaje de p53 después del tratamiento combinado con TAS-102 y ABT-263, en comparación con TAS-102 solo (Figura 5A). En particular, la dosis letal mediana (LD50) de TAS-102 disminuyó hasta 1000 veces cuando se combinó con 50 nM de ABT-263 (Figura 5A). Este efecto sensibilizador se atenuó significativamente en las células HCT 116 con eliminación de p53 (Figura 5B), lo que sugiere un mecanismo dependiente de p53 que subyace a la interacción entre la señalización de BCL2 y la respuesta a TAS-102.

Además, evaluamos los efectos sinérgicos de TAS-102 y ABT-263 en una línea celular de cáncer de páncreas, MIA PaCa-2, y en la línea celular de epitelio ductal pancreático humano normal, hTERT-HPNE, para evaluar la citotoxicidad específica del cáncer, lo cual es esencial para minimizar los efectos fuera de la diana y mejorar los perfiles de seguridad terapéutica^[56]. De manera similar a HCT 116, las células MIA PaCa-2 exhibieron una mayor sensibilidad a TAS-102 cuando se trataron secuencialmente con ABT-263, lo que resultó en una dosis efectiva más baja para alcanzar la LD50 (Figura 5C). En contraste, las células hTERT-HPNE no mostraron una respuesta citotóxica aditiva o sinérgica (Figura 5D), lo que respalda la naturaleza específica del cáncer de la terapia combinada. Estos hallazgos refuerzan el potencial terapéutico de la inhibición de BCL2 para mejorar la eficacia de TAS-102, particularmente en modelos de cáncer con expresión de p53 y de tipo epitelial, y resaltan la importancia del contexto celular para predecir los resultados del tratamiento combinado.

Por otro lado, las células RKO, que comparten el estado de alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H) con HCT 116, no mostraron un efecto sinérgico en condiciones de tipo salvaje o con eliminación de p53 (Figuras suplementarias 5D–E). Si bien las diferencias morfológicas entre las células epiteliales HCT 116 y las células RKO de tipo mesenquimal pueden influir en las respuestas a los fármacos, las mutaciones somáticas como KRAS o BRAF podrían modular la sensibilidad. HCT 116 y MIA PaCa-2, ambas con mutación en KRAS, son sensibles a la terapia combinada con ABT-263^[57],^[58] debido a la regulación al alza de BCL-XL, el objetivo de ABT-263, inducida por KRAS, y a una mayor dependencia de la actividad lisosomal^[59], mientras que las células RKO podrían resistir la apoptosis a través de la regulación al alza de MCL-1 aguas abajo de BRAF-V600E, lo que reduce la sensibilidad a ABT-263^[60].

Para validar los hallazgos in vitro en un contexto más fisiológicamente relevante, replicamos el tratamiento combinado con TAS-102 y ABT-263 en modelos de xenoinjerto derivados de células (CDX) y xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) utilizando sistemas de cáncer colorrectal. En el modelo CDX, la terapia combinada replicó consistentemente los efectos antitumorales mejorados observados in vitro, lo que resultó en una reducción significativa del crecimiento tumoral en comparación con la monoterapia (Figura 5E). De manera similar, el modelo PDX demostró una disminución de la progresión del volumen tumoral bajo el tratamiento combinado en relación con TAS-102 solo, lo que confirmó que la eficacia sinérgica de la terapia es reproducible in vivo (Figura 5F). Además, tanto los modelos CDX como PDX mostraron una reducción significativa del peso tumoral bajo el tratamiento combinado en comparación con TAS-102 solo (Figuras 5G–H). Es importante destacar que el peso corporal se mantuvo estable y los recuentos de glóbulos blancos y rojos no mostraron cambios significativos en los modelos CDX y PDX (Figuras suplementarias 5F–H y 5J–L); sin embargo, los niveles de plaquetas disminuyeron en ambos modelos bajo el tratamiento combinado (Figuras suplementarias 5I y 5M), lo que es consistente con los efectos adversos previamente informados de la trombocitopenia inducida por TAS-102 y la supresión de plaquetas asociada a ABT-263^[61],^[62]. Estos resultados confirman que la interacción sinérgica entre TAS-102 y la inhibición de BCL2 es tanto eficaz como reproducible in vivo, lo que refuerza el potencial de traslación de esta estrategia combinada para superar la quimiorresistencia a TAS-102 y mejorar la quimiosensibilización en el cáncer colorrectal.

Discusión

En este estudio, presentamos BOGO, una plataforma novedosa de sobreexpresión de genes a nivel del proteoma que permite perturbaciones precisas de un solo gen por célula para identificar terapias combinadas de traslación. Al integrar el completo ORFeoma humano a través del sistema de plataforma de aterrizaje Bxb1, BOGO supera las limitaciones clave de los enfoques tradicionales basados en lentivirus y CRISPRa, como la expresión heterogénea y la activación multigénica (Figura 1). Aplicado a un panel de 16 agentes quimioterapéuticos, BOGO identificó sistemáticamente subconjuntos de genes asociados con la quimiorresistencia y la quimiosensibilización, descubriendo factores clínicamente relevantes de la resistencia y el pronóstico del cáncer (Figura 2). La plataforma reveló mecanismos de respuesta a los fármacos tanto conocidos como novedosos, incluida la resistencia mediada por BCL2 a los fármacos análogos del ADN, como TAS-102 (Figura 3). La validación mecanística demostró que la terapia combinada con TAS-102 y el inhibidor de BCL2, ABT-263, interrumpe la función lisosomal (Figura 4), mejora selectivamente la citotoxicidad y exhibe una eficacia sinérgica en modelos de cáncer colorrectal y de páncreas, tanto in vitro como in vivo (Figura 5). Estos hallazgos subrayan el potencial de traslación de BOGO para descubrir terapias combinadas racionales y avanzar en la genómica funcional en el cáncer.

A pesar de su diseño robusto y sus capacidades de alto rendimiento, BOGO tiene limitaciones que justifican una futura optimización. En primer lugar, los ORF no detectados aún pueden tener importancia biológica, posiblemente debido al sesgo de selección introducido por la casete IRES-mCherry, que puede desfavorecer a los ORF más largos. En segundo lugar, la plataforma no tiene en cuenta los ARN no codificantes ni los isoformas alternativos, ya que el hORFeoma comprende solo secuencias de codificación canónicas. En tercer lugar, aunque la integración de una sola copia en el locus AAVS1 con el promotor EF1α garantiza una expresión uniforme, es posible que no replique completamente la variación del número de copias observada en los tumores clínicos.

Además, la dependencia de la plataforma de las células HeLa en un momento dado puede limitar su capacidad para capturar los mecanismos de resistencia específicos de la línea celular que son relevantes para otros tipos de cáncer. La configuración actual tampoco tiene en cuenta los factores microambientales y las interacciones entre células, que son fundamentales para la respuesta a los fármacos. Además, el modelo de ratón de plataforma de aterrizaje Bxb1 y las interacciones con el sistema inmunitario aún no se han evaluado en el contexto de la terapia combinada. La futura integración con modelos in vivo^[63], organoides derivados de pacientes^[64] y la ampliación del cribado en diversas líneas celulares de cáncer^[65] podrían mejorar la relevancia de traslación y la profundidad mecanística de BOGO. La capacidad de identificar los mecanismos de resistencia específicos del paciente podría revolucionar la oncología de precisión y extenderse a otros ámbitos de la medicina personalizada. Reconociendo que la resistencia a los fármacos evoluciona con el tiempo, los cribados de BOGO en diferentes momentos podrían distinguir entre los genes de supervivencia temprana y los que median la adaptación a largo plazo, lo que permitiría intervenciones específicas para cada etapa y mejoraría la durabilidad terapéutica.

BOGO también descubrió nuevas vías de quimiorresistencia más allá de la apoptosis, incluida la disfunción lisosomal y la señalización de Wnt. Se necesitan más estudios mecanísticos de los nuevos genes de resistencia identificados, como CCDC86, GHSR y POLD2, para dilucidar su mecanismo en la respuesta a los fármacos y la supervivencia celular, y para evaluar su potencial como dianas terapéuticas. La integración de BOGO con tecnologías de resolución a nivel de una sola célula (por ejemplo, Perturb-seq^[66]) podría revelar la heterogeneidad en los mecanismos de resistencia, lo que permitiría la identificación de subpoblaciones raras pero clínicamente significativas y perfeccionar nuestra comprensión de la evolución del tumor y la respuesta al tratamiento.

Dado que muchos de los efectores de la respuesta a los fármacos identificados por BOGO están relacionados con las vías a las que se dirigen los fármacos existentes, existe un potencial significativo para la reutilización de fármacos. El cribado sistemático de los compuestos aprobados por la FDA^[67] frente a los objetivos de BOGO podría acelerar el desarrollo de terapias combinadas, lo que reduciría el tiempo y el costo asociados con el desarrollo de nuevos fármacos. Esta estrategia podría ser especialmente impactante en entornos con recursos limitados o para enfermedades raras con opciones de tratamiento limitadas.

Más allá del cáncer, BOGO ofrece oportunidades para la expansión a modelos de enfermedades no cancerosas, como los trastornos neurodegenerativos, las enfermedades autoinmunes y los síndromes metabólicos, que a menudo implican la amplificación de genes o la desregulación transcripcional^[68]. Estas aplicaciones posicionan a BOGO como una plataforma versátil para identificar los mecanismos de respuesta a los fármacos y descubrir nuevas dianas terapéuticas. En conjunto, nuestros hallazgos demuestran la amplia aplicabilidad, la información mecanística y la relevancia clínica del sistema BOGO, lo que respalda su uso en diversos sistemas biológicos y modelos de enfermedades.

Métodos

Cultivo celular

La línea celular T-REx™-HeLa (células HeLa) se mantuvo según se describió anteriormente^[69], utilizando medio Dulbecco modificado Eagle (DMEM, Corning, 10–017-CV). Antes del cribado, se analizaron para detectar contaminación por micoplasma (ATCC, 30–1012K) y se confirmaron las células mediante el perfilado de repeticiones cortas en tándem (STR) en el Centro de Diagnóstico Genómico del Hospital para Niños Enfermos (SickKids)^[70]. Las células HeLa Flp-In T-REx diseñadas con la plataforma de aterrizaje Bxb1 en el locus AAVS1 con el promotor EF1α (células HeLa EF1α) fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio Roth de la Universidad de Toronto, que ahora se ha trasladado a la Universidad de Pittsburgh^[71].

Las líneas celulares humanas, el cáncer colorrectal HT29 (RRID: CVCL0320), el cáncer de páncreas MIA PaCa-2 (RRID: CVCL0428) y la línea celular de conducto pancreático hTERT HPNE (RRID: CVCLC466) se cultivaron según las recomendaciones de ATCC. Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano HCT 116 y HCT 116 p53(−/−; KO) fueron proporcionadas por el Dr. Bert Vogelstein de la Universidad Johns Hopkins^[72]. Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano RKO y RKO p53(−/−; KO) fueron proporcionadas por el Dr. Alessandro Carugo del MD Anderson Cancer Center^[73]. Estas líneas celulares se mantuvieron en DMEM y se autenticaron nuevamente mediante el perfilado STR por ATCC o el Roswell Park Genomic Shared Resource en los últimos tres años. Las células se analizaron rutinariamente para detectar micoplasma; todos los estudios utilizaron células libres de micoplasma. Los cultivos celulares humanos se mantuvieron en medios suplementados con un 10% de suero fetal bovino (SFB; Corning, 35–015-CV) inactivado térmicamente y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S, Corning, 30–002-CI) a 37°C con un 5–10% de CO2 en una incubadora humidificada.### Clonación en masse_ de la biblioteca ORFeome con el sitio de inserción Bxb1

Los clones de entrada en la Colección de Marcos de Lectura Abiertos Humanos (ORFeome) v9.1^[22],^[74] con aproximadamente 1000 clones adicionales donados por el Centro de Biología de Sistemas del Cáncer (CCSB) del Dana-Farber Cancer Institute (espacio Delta) se verificaron mediante secuenciación de última generación para confirmar la autenticidad de sus secuencias de ADN codificante. Los clones de entrada se transfirieron desde placas de 384 pocillos a placas de agar LB correspondientes que contenían kanamicina (25 μg/mL; Thermo Fisher, AC611290050) o espectinomicina (50 μg/mL; Thermo Fisher, S05845G). Después de la incubación a 37°C durante 48 horas, las placas de agar LB se rasparon y se recogieron para la preparación de plásmidos agrupados utilizando el kit Qiagen Plasmid Mini Prep (Qiagen, 27104), un miniprep por cada placa de 384 pocillos. La cantidad de ADN proporcional al número de clones se agrupó y se mezcló en un solo tubo para crear un conjunto completo de clones de entrada, donde cada ORF se representó en proporciones equivalentes. Basándonos en estos grupos de clones de entrada, realizamos la clonación en masse LR como se describió previamente^[22],^[23],^[75]. Se incubaron 150 ng del grupo de entrada con 5x LR Clonase (Invitrogen, 11791020) y 150 ng del vector de destino (pDEST-HC-REC, Roth Lab) durante 5 días, comenzando con una reacción de 5 μL y complementando con 1 μL de 5x LR Clonase y 150 ng del vector de destino cada día. Utilizamos 1 μL de la mezcla de reacción LR para realizar 8 electroporaciones (un total de 8 μL utilizados) con E. coli 10-beta electrocompetente (New England Biolabs, C3020K) para generar 20 millones de unidades formadoras de colonias, lo que logra aproximadamente una representación de la biblioteca de 1000x. En detalle, las bacterias electroporadas se sembraron en agar LB que contenía carbenicilina (Fisher, BP26485, 100 μg/ml) y se incubaron a 37°C durante 18 horas. Las colonias se recogieron mediante un raspado suave, y la biblioteca de destino final se aisló utilizando un kit de purificación de plásmidos PureLink™ Fast Low-Endotoxin Maxi (Invitrogen, A35892).### Perturbación de sobreexpresión a gran escala mediante la construcción de un grupo de células HeLa con la biblioteca ORFeome

Las células HeLa EF1α se pasaron 3 veces después de la descongelación antes de la transfección, y se sembraron 1,3 millones de células en cada una de las doce placas de 10 cm. Transfectamos 10 μg del vector de expresión de recombinasa Bxb1 (pCAG-NLS-HA-coBxb, Roth Lab) por placa utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015) según las instrucciones del fabricante. El medio se renovó después de 12 horas para eliminar la mezcla de transfección. Después de 36 horas, transfectamos 10 μg de la biblioteca de destino ORFeome preparada en la sección anterior. El medio se renovó 12 horas después y se incubó durante 24 horas adicionales para permitir que apareciera la expresión de la fluorescencia mCherry. Las células que se transfectaron con la biblioteca se clasificaron para mCherry utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) por Sony MA9000 en el Servicio de Recursos Compartidos de Análisis de Flujo e Inmunología (FIASR) en el Roswell Park Comprehensive Cancer Center (RPCCC), y se cultivaron en placas de 15 cm durante 3 días más hasta que la señal residual de la proteína fluorescente azul (mTagBFP2) disminuyó. Las células integradas con la biblioteca se seleccionaron utilizando FACS dos veces, en una clasificación previa el segundo día y en una clasificación posterior el cuarto día, durante 5 días después de la transfección, y se logró una representación de 150x (Clasificación previa: ~15 millones, Clasificación posterior: ~11 millones de células). Para minimizar el efecto de lote resultante de la variabilidad dentro de los grupos de células, expandimos el grupo de células con integraciones de ORFeome a cien placas de 15 cm. El grupo de células se lisó con tripsina, y se criopreservaron 3 millones de células HeLa integradas con ORFeome (células HeLa ORFeome) por vial, con 200 viales para las posteriores pruebas de selección de fármacos.### Ensayos de respuesta a la dosis de fármacos

Los ensayos de respuesta a la dosis de fármacos se llevaron a cabo utilizando el protocolo modificado del estudio anterior^[12]. Las células HeLa se descongelaron y se cultivaron en placas de 10 cm en condiciones de cultivo estándar antes de un ensayo. Sembraron 3000 células en placas de 96 pocillos a un volumen de 100 μL y se incubaron durante 24 horas para permitir la adhesión. Cada fármaco se diluyó a una concentración de 50 o 100 μM y se diluyó en serie en una proporción de 1:3 utilizando medio de cultivo para cubrir un rango de ocho concentraciones. Se añadieron 100 μL del fármaco diluido en triplicado y se incubaron durante 72 horas. Luego, se retiró el medio y se midió la viabilidad utilizando el reactivo AlamarBlue (Invitrogen, A50101) según las instrucciones del fabricante. La lectura de OD595nm (Absorbancia a 595 nm) se midió después de 2 horas de incubación del reactivo, y la Concentración Inhibitoria Absoluta al 50% (CI50) se calculó utilizando el software GraphPad Prism 9 (Versión 9.1.0).### Cribado quimioterapéutico

Seleccionamos 16 agentes quimioterapéuticos citotóxicos sintetizados químicamente que se dirigen principalmente al ciclo celular o ejercen efectos no específicos a través del daño del ADN. Estos fármacos se eligieron para representar una amplia gama de mecanismos de acción que se utilizan comúnmente en los tratamientos del cáncer en adultos y niños, como se describió anteriormente^[76]. Para simplificar el análisis, categorizamos los quimioterapéuticos en función de sus mecanismos de acción primarios. En algunos casos, los fármacos se agruparon en categorías mecanicistas más amplias. Por ejemplo, la doxorrubicina, un inhibidor de la topoisomerasa II, y la bleomicina, un antibiótico antitumoral, se clasificaron como agentes que inducen roturas de la cadena de ADN, lo que refleja su resultado compartido a pesar de los diferentes mecanismos moleculares. Basándonos en estas clasificaciones mecanicistas, los 16 quimioterapéuticos se agruparon en las siguientes cuatro categorías:
Antimetabolitos: Fluorouracilo (5-FU, Sigma, F5130), Trifluridina (TFT, Med Chem Express, HY-A0061), 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU, Toronto Research Chem - Sigma, E9386), Floxuridina (FdU, Adooq Bioscience, A10392–500), 6-mercaptopurina (Sigma, 852678), TAS-102 (Adooq Bioscience, 733030-01-8)Agentes de reticulación del ADN: Mitomicina C (Sigma, M5353), Cisplatino (Cayman, 13119), Carboplatino (Referencia de la Farmacopea Británica - Sigma, BP711), Carmustina (Referencia de la Farmacopea Europea - Sigma, Y0002128)Agentes de rotura de la cadena de ADN: Doxorrubicina (Tocris, 2252), Bleomicina (Sigma, B1141000), Etopósido (Sigma, PHR2717), Irinotecán (Sigma, 341205)Inhibidores de los microtúbulos: Paclitaxel (Sigma, T7402) y Vinblastina (Sigma, V0300000)

Utilizando los valores de CI50 obtenidos mediante el ensayo de respuesta a la dosis de fármacos, determinamos una dosis adecuada para tratar las células en un formato de placa de 15 cm. Sembraron al menos 3 millones de células y las trataron con los fármacos a su dosis de CI50 durante 72 horas. El DMSO se seleccionó como control vehículo. Los cribados se realizaron en cinco lotes independientes, cada uno de los cuales incluía una línea de base (a menudo denominada T0 en el cribado CRISPR)^[77] y su propio conjunto de controles vehículo para tener en cuenta la variación específica del lote. Para garantizar una representación completa de la biblioteca, descongelamos 10 viales del grupo de sobreexpresión de ORFeome y los expandimos durante 3 días, recuperando un mínimo de 3 millones de células viables en total para mantener una cobertura de 150x. Las células se sembraron a 3 millones por placa y se trataron con los respectivos fármacos en triplicado, incluidos los controles vehículo correspondientes en cada lote. Después de 72 horas de tratamiento, las células se lisaron con tripsina y se sembraron 3 millones de células en placas nuevas con el tratamiento con fármacos continuado. Después de 48 horas adicionales, se retiró el medio que contenía el fármaco y se permitió que las células se recuperaran en un medio de cultivo normal durante 3 días más o hasta que se produjo la confluencia. Las células recuperadas se lisaron con tripsina y se recogieron (~10 millones de células por pellet) para la posterior extracción de ADN genómico.### Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los ORFs a partir del ADN genómico

Según las instrucciones del fabricante, el ADN genómico se extrajo de los pellets celulares utilizando el kit Blood and Cell Culture DNA Midi Kit (Qiagen, 13343). Realizamos dos conjuntos de PCR (PCR anidadas) utilizando el Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, M0544S) y los cebadores (Integrated DNA Technologies) que se unen a i) el locus del sitio de inserción y ii) los sitios de clonación de Gateway, para amplificar el marco de lectura abierto (ORF) de longitud completa desde el sitio de inserción con una mayor selectividad y una reducción de las contaminaciones del ADN genómico. Se utilizaron un total de 18 μg de ADN en la primera PCR en doce reacciones de PCR de 50 μL, que se agruparon para representar la cobertura total de 150x. La segunda PCR se realizó utilizando 2,5 μL de la reacción de PCR anterior como plantilla. Se realizaron dos reacciones de PCR2 de 50 μL y se agruparon antes de preparar la biblioteca de secuenciación. Para la preparación de la biblioteca NGS utilizando la plataforma TruSeq, se utilizaron cebadores personalizados que incluían una secuencia 5′ NNNNN para asegurar la complejidad de los primeros 5 pb durante la secuenciación^[78].### Preparación de la biblioteca de secuenciación

La calidad de los amplicones se confirmó en Tapestation (Agilent, G2991BA) en el Servicio de Recursos Compartidos de Genómica (GSR) del Roswell Park Comprehensive Cancer Center. Con las muestras que superaron el control de calidad, primero se eliminaron los dímeros de cebadores utilizando un kit de limpieza de cuentas Ampure XP (Beckman-Coulter, A63882). Luego, los amplicones se cortaron utilizando un sonicador enfocado Covaris E220 (Covaris, COV-500239) a tamaños que promediaban entre 250 y 300 pb. Estos amplicones cortados se ligaron para los adaptadores TruSeq y se indexaron utilizando Kapa hyperprep para las etiquetas de muestra (Illumina, 20015963; Roche 0796237100). Finalmente, la biblioteca de secuenciación resultante se eliminó de los dímeros de cebadores utilizando un kit Ampure. Finalmente, el ADN se cuantificó utilizando qPCR y se cargó en NovaSeq 6000 (Illumina, 20012850), y se generaron un mínimo de 3 millones de lecturas de apareamiento para cada muestra.### Análisis bioinformático del ORFeome

Se realizó un análisis bioinformático utilizando un script de Python Jupyter Notebook (Python 3.11.0), que se comparte como material suplementario. Los archivos FASTQ se recortaron utilizando Cutadapt^[79] para eliminar la secuencia de adaptador TruSeq restante según las indicaciones de Illumina, y luego se recortaron aún más con Trimmomatic^[80] con una puntuación Phred de secuencia (LEADING:20, TRAILING:20, SLIDINGWINDOW:4:15, MINLEN:25). Para la secuencia del ORFeoma, se revisaron todas las secuencias y se les asignaron los símbolos génicos apropiados utilizando la base de datos de genes NCBI^[81] (descargada el 11 de agosto de 2023). Los archivos analizados se alinearon con la referencia de secuencias del ORFeoma humano v9.1 y el espacio delta utilizando la herramienta Bowtie2^[82],^[83] (v2.5.2). Después de la alineación, los archivos FASTQ y SAM procesados se evaluaron utilizando FASTQC (v0.12.1) y multiQC (v1.27.1)^[84],^[85]. Los archivos SAM se restauraron en formato BAM con una serie de pasos de postprocesamiento utilizando Samtools^[86], y los recuentos de lecturas sin procesar se generaron utilizando Pysam (0.23.0), incluidos los recuentos de lecturas concordantes y múltiples con un umbral de MAPQ de 30^[86]. Los parámetros de los procesos se eligieron en función del flujo Cut&Run utilizado en la publicación de detección del ORFeoma y se adaptaron mejor para la alineación de lecturas cortas^[87],^[88]. Los resultados de las lecturas sin procesar se normalizaron utilizando la media recortada de M-valor (TMM) con EdgeR (v4.0.16)^[89],^[90]. Los recuentos de lecturas normalizados se seleccionaron en función del cálculo de secuencias con una mediana log2TMM superior a −1 para eliminar los recuentos de lecturas de ruido. El conjunto de datos completo se normalizó aún más utilizando el método de normalización cuantil y se corrigió por lotes para crear una distribución equitativa del conjunto de datos para analizar la diferencia entre las muestras utilizando EdgeR (v4.0.16) y Limma (v3.58.1)^[91]. Para la comparación entre muestras, se procesó un conjunto de datos TMM utilizando el análisis de reducción de dimensionalidad de la aproximación y proyección de la variedad uniforme (UMAP) (UMAP-learn^[92]; v0.5.7). La eficiencia del silenciamiento del ORFeoma se evaluó cuantificando los niveles de fluorescencia en las células que expresan mCherry y mTagBFP2. El silenciamiento se evaluó utilizando la relación de silenciamiento, definida como log2 (E / S), donde E representa el número de células que expresan (mCherry+ mTagBFP2−) y S denota el número de células silenciadas (mCherry− mTagBFP2−). Esta relación refleja la diferencia en las unidades de fluorescencia relativa entre las células que expresan activamente el ORF (mCherry+ mTagBFP2−) y aquellas en las que es probable que el ORF esté silenciado (mCherry− mTagBFP2−). Los ORFs con una relación de silenciamiento inferior a −1 (cambio log2 < −1) se clasificaron como silenciados con éxito.

Para realizar pruebas estadísticas más precisas, se excluyeron todas las muestras con una población ORF subyacente inferior a la mitad de la población ORF expresada máxima en las muestras totales antes de la normalización TMM^[93]. Después de la normalización TMM, el conjunto de datos se recortó utilizando DescTools^[94] (0.99.57) con un rango de cuantiles del 0.001% para eliminar los puntos de datos extremos. A continuación, se realizó una normalización de cuantil superior para normalizar aún más el conjunto de datos utilizando EdgeR^[90] (v4.0.16). Se procesó una corrección de lote utilizando una matriz de diseño, que incluía información de la muestra experimental de control, múltiples lotes y cambios en las ejecuciones de secuenciación de última generación para ajustar con precisión el efecto de lote utilizando Limma^[91]. Además, el cambio log2 de los recuentos TMM entre la condición experimental del fármaco y el DMSO correspondiente del lote en la colección y las pruebas estadísticas se procesó utilizando pruebas de permutación (n=10.000). Se calcularon los valores p ajustados utilizando pruebas de dos colas en una combinación de valores t, diferencia media log2 y estadísticas de suma de rangos transformadas en Z, escalando con el método z de Liptak Stouffer^[95]. Los datos se visualizaron utilizando Matplotlib^[96] y Seaborn^[97].

Selección automatizada de clones de entrada para la reevaluación de alta saturación (HSR)

Aproximadamente el 10% del conjunto de ORFeoma se sometió a una reevaluación con mayor cobertura (>1.000 veces) para evaluar los ORFs representados de forma diferencial. La selección de estos ORFs se basó en el análisis estadístico del puntaje T de los cambios log2 para fármacos individuales, agrupados en ocho grupos. Estas selecciones se basaron en los ORFs de resistencia o sensibilización principales en todos los fármacos, fármacos individuales y controles. Los criterios de selección para el ORFeoma HSR se centraron en los genes que demostraron puntajes T altos, lo que indica fenotipos de proliferación fuertes o débiles. En total, se seleccionaron 2.217 ORFs y se seleccionaron del ORFeoma humano utilizando una plataforma robótica personalizada (S&P Robotics Inc., BM3-BC). Estos ORFs seleccionados se agruparon y prepararon en las células HeLa EF1α siguiendo el mismo método de clonación LR en masse^[75]. Se realizó un cribado con doxorrubicina con dosis coincidentes de 5 nM, como en el cribado original, empleando los mismos métodos de amplificación de ORF por PCR y el análisis bioinformático del ORFeoma mencionado en este método. La selección de "Resistente", "Sensibilizante" y "No respondedor" se basó en el mismo parámetro de cambio log2 que el cribado de respuesta a fármacos. El gráfico se generó utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Ensayo de sobreexpresión de ORF único

Para generar líneas celulares únicas para la verificación, se cultivaron durante la noche clones de entrada específicos correspondientes a ORFs como TYMS, RABL3, BCL2, MUTYH, CDK6, GPER y BRD9, y se aislaron utilizando el kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel, NC9405546) de la colección ORFeoma 9.1^[22]. Se incubaron 150 ng de vector de entrada, 150 ng de vector de destino (pDEST-HC-REC compartido por el laboratorio Roth) y 1 μL de LR Clonase durante 1 hora y se transformaron en células competentes químicamente 10-beta (New England Biolabs, C3019) utilizando choque térmico^[98]. Las transformantes se cultivaron durante la noche en LB que contenía carbenicilina (Fisher, 10177012) y se utilizaron para las extracciones de plásmidos. Se confirmaron las secuencias mediante reacciones de Sanger. Un día antes de la transfección, se sembraron células HeLa EF1α en placas de 6 pocillos a 350.000 células/pocillo. Los plásmidos clonados correctamente se cotransfectaron con el plásmido de recombinasa Bxb1 a 1 μg cada uno en células HeLa EF1α utilizando Lipofectamine 3000. Después de 5 días, las células se clasificaron para las poblaciones positivas para mCherry para establecer líneas celulares de sobreexpresión de ORF único estables. Para los ensayos de competencia celular, el protocolo se adaptó de un estudio anterior^[99]. Se cocultivaron 30.000 células positivas para mCherry (experimentales) con 60.000 células positivas para BFP (control) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Después de una incubación de 24 horas, tres pocillos se trataron con 0,75 μM de TFT. Después de un período de tratamiento de 5 días, se cuantificaron las poblaciones celulares relativas leyendo 20.000 eventos por pocillo utilizando FACS. Los resultados del ensayo de competencia se compararon con los datos de cambio de pliegue del cribado inicial de TFT. Para la validación del silenciamiento, se evaluaron los cambios fenotípicos cuantificando su porcentaje de población total después de 5 días sin ningún tratamiento con fármacos utilizando FACS. Después de la recuperación, se clasificaron poblaciones específicas mediante FACS para la secuenciación de bibliotecas posteriores. La correlación entre los cambios fenotípicos y la respuesta transcripcional se evaluó comparando los porcentajes de población con las relaciones de silenciamiento utilizando la tubería bioinformática de ORF mencionada anteriormente. La población celular se normalizó mediante el control de mCherry. El gráfico se generó utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Análisis de transcriptómica de ARNm

La duración del tratamiento y el protocolo se adaptan de un estudio anterior sobre la búsqueda de combinaciones de fármacos^[100]. Se sembraron células HeLa a 3 millones en platos de 15 cm y se trataron con una CI50 de 5 nM de doxorrubicina durante 24 horas y 120 horas. Después del tratamiento, las células se centrifugaron y cada sedimento celular consistió en un mínimo de 1 millón de células por control y conjunto experimental. Cada sedimento celular se conservó en TRIzol (Qiagen, #79306) y se almacenó a −20 °C antes de enviarlo a los Recursos Compartidos de Genómica (GSR) en el Roswell Park Comprehensive Cancer Center. El ARN purificado se preparó utilizando el kit miRNeasy micro (Qiagen, 217084) y se midió el control de calidad del número de integridad del ARN (RIN) utilizando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, G2939BA). Las bibliotecas de secuenciación se prepararon con el kit KAPA mRNA HyperPrep (Roche, KK8581). Las bibliotecas de ARN-seq finales se secuenciaron en Illumina NovaSeq 6000. Se utilizó Nextflow versión 24.10.4^[101] con nf-core/rna-seq v3.18.0^[102] utilizando Docker (v27.5.1). Los archivos de secuenciación se alinearon con el genoma humano GRCh38.p14^[103]. El flujo de trabajo se configuró para realizar el recorte de adaptadores con Trim Galore^[104], seguido de la alineación utilizando STAR^[105] (v2.7.10a) y la cuantificación utilizando RSEM^[106] (v1.3.1). Los ARN ribosómicos se eliminaron utilizando SORTMERNA^[107] (v4.3.7) antes de la cuantificación. El análisis posterior utilizó la cuantificación basada en recuentos, que coincidió con la configuración de la tubería bioinformática del ORFeoma. Se realizaron pruebas t pareadas utilizando la función stats.ttest_rel de SciPy^[108] (v1.15.2) y se calcularon los valores p empíricos mediante pruebas de permutación (n = 10.000) para evaluar la significación estadística. Los datos se visualizaron utilizando Matplotlib^[96] y Seaborn^[97].

Categorización de genes ORF

Según la secuenciación de células HeLa ORFeoma, las lecturas se alinearon con 18.388 bibliotecas ORFeoma. De estas, 14.506 ORFs se consideraron bien representados, definidos por un número mínimo de mediana log2 TMM > −1^[109]. Los ORFs por debajo de este umbral se consideraron ruido y se excluyeron del análisis posterior. Dentro de los 14.506 ORFeomas analizados, estos ORFs se categorizaron en cinco subconjuntos categóricos. Entre los ORFs categorizados, aquellos con un umbral de cambio log2 de ±0,5 y un valor p inferior a 0,05 se identificaron como ORFs representados de forma diferencial. Dentro de este conjunto, los ORFs enriquecidos (cambio log2 positivo) se interpretan como posibles impulsores de resistencia, que confieren una ventaja de supervivencia bajo el tratamiento, mientras que los ORFs agotados (cambio log2 negativo) sugieren impulsores de sensibilización, lo que indica una mayor sensibilidad a los fármacos. Primero, se seleccionaron 197 genes principales en función de cualquier ORF con el filtro de más de 7 fármacos (más de la mitad del total de agentes quimioterapéuticos - 1). En segundo lugar, se asignaron 1.072 genes categóricos en función del recálculo de la mediana(log2{categorías de fármacos}) - mediana(log{resto de categorías}) de las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente y se filtraron para los ORFs representados de forma diferencial. En tercer lugar, se identificaron 3.832 genes periféricos como ORFs que se alteran significativamente (cambio log2 absoluto ≥ 0,5 y valor p ≤ 0,05) en respuesta a fármacos quimioterapéuticos específicos, pero no en otros. Para cada fármaco, se seleccionaron los genes que cumplían estos criterios y luego se filtraron para excluir cualquier gen que también cumpliera los mismos criterios de significación en otros fármacos, asegurando así la especificidad del fármaco. En cuarto lugar, se eligieron 6.556 genes multidroga en función de un filtro en una suma de quimioterapias entre 2 ≤ × < 7. Se seleccionaron dos quimioterapias para un número mínimo, en función de la distribución de mezcla de gamma, y la distribución normal muestra un valor de corte de 2,64 en los ORFs filtrados en la suma de las quimioterapias. Por último, se seleccionaron 2.849 genes no respondedores con ORFs, con el filtro para que no haya ORFs enriquecidos o agotados. Para evitar cualquier superposición de ORFs entre las categorías, la selección se priorizó secuencialmente desde los genes "Principales" hasta los genes "No respondedores". Se determinó la superposición de la categorización de genes en comparación con los resultados del cribado del ORFeoma utilizando la biblioteca Venn (v0.1.3) en Python (3.11).

Análisis de biomarcadores

Para evaluar la relevancia clínica de los subconjuntos de genes identificados en nuestro cribado, realizamos un análisis de superposición de biomarcadores en múltiples niveles utilizando la base de datos TheMarker^[31], un recurso curado de asociaciones entre enfermedades, biomarcadores y fármacos. La correspondencia de genes se basó en los identificadores NCBI Gene, y solo se incluyeron en el análisis los ORF verificados y no silenciosos del conjunto de datos del cribado. Los ORF verificados y no silenciosos se cruzaron con las entradas de biomarcadores específicos del cáncer en la base de datos, y para cada subconjunto de genes, se calculó la proporción de genes que se superponían con biomarcadores asociados al cáncer, clasificados como “ICD-02: Neoplasia benigna/in situ/maligna”, para evaluar el enriquecimiento de genes relacionados con el cáncer validados clínicamente. A continuación, examinamos la asociación entre los ORF anotados con biomarcadores y los fármacos quimioterapéuticos; de los 16 fármacos analizados en el cribado, 7 estaban representados en la base de datos, y cuantificamos cuántos ORF anotados con biomarcadores dentro de cada subconjunto estaban relacionados con uno o más de estos fármacos, conectando los resultados del cribado con el conocimiento farmacogenómico existente. Finalmente, evaluamos la representación de cada subconjunto de genes dentro del conjunto total de biomarcadores calculando la proporción de ORF presentes en la base de datos en relación con el total de biomarcadores únicos catalogados. Todas las proporciones de superposición se normalizaron utilizando puntajes z para permitir comparaciones entre los subconjuntos y resaltar los patrones de enriquecimiento diferencial. Los puntajes z se visualizaron como mapas de calor, y el número de cuatro tipos de biomarcadores dentro de cada categoría de ORF se calculó como recuentos transformados en log10 y se mostraron en gráficos de barras apiladas. Las barras apiladas representan recuentos transformados en logaritmo para cada categoría por separado y no corresponden a la suma del número total de biomarcadores.

Análisis de las propiedades de los genes

La longitud de cada ORF (Longitud del ORF) y su porcentaje de GC (Contenido de GC) se derivaron de las secuencias human ORFeome v9.1 y las referencias del espacio delta después de la alineación, como se describió anteriormente. Adoptamos algunas de las propiedades de los genes de nuestro estudio anterior^[22],^[23]. Los datos de transcriptómica del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx)^[110] v6 (descargados el 15 de marzo de 2016) se procesaron con R v3.5.1 para extraer el recuento de lecturas normalizado en logaritmo. En este conjunto de datos, 16 subregiones cerebrales se combinaron en tres tejidos cerebrales: ganglios basales, cerebelo y otros. Se calculó la expresión mediana de cada gen en todos los tipos de muestras de tejido, y se aplicó un umbral de >5. Se excluyeron las muestras de líneas celulares, y el análisis se restringió al conjunto de genes codificantes de proteínas. Consideramos estos valores como una referencia para el nivel de expresión génica (Abundancia), que se calcularon como se mencionó en nuestro estudio anterior^[22]. Los mismos datos se utilizaron para calcular el número de tejidos en los que se expresó cada gen (Amplitud). La información sobre la edad de los genes (Edad) se obtuvo de la base de datos Protein Historian^[111], con PPODv4Jaccard como la base de datos de familias y el modelo de parsimonia de Dollo como el algoritmo de reconstrucción. La base de datos D2P2 de predicciones de proteínas desordenadas^[112] se utilizó para calcular la fracción de regiones desordenadas en relación con la longitud total de la proteína (Desorden). Extrajimos todos los ID humanos D2P2 asignados a los ID de Ensembl de “genomes.protein.gz”. Utilizando esta lista y el archivo “consensusranges.tsv.gz”, que contiene las posiciones inicial y final de cada región desordenada predicha, se calculó la longitud desordenada total para cada proteína. La longitud de cada proteína se calculó utilizando el archivo “genomes.fa.bz2”, que almacenaba las secuencias completas de las proteínas. La fracción se calculó mediante la combinación de los datos por ID de gen. La herramienta de anotación funcional DAVID^[113] (v2023q4) se utilizó para recuperar la información de otras propiedades. Se envió la lista de ID de Entrez y se descargó la Tabla de anotación funcional para las siguientes bases de datos el 16 de enero de 2024: OMIMDISEASE, GO - GOTERMBPDIRECT (Proceso biológico), GOTERMCCDIRECT (Componentes celulares), GOTERMMFDIRECT (Función molecular), PUBMEDID y UPTISSUE. Se contaron los términos asociados con cada conjunto de datos. El número de publicaciones (PubCount) se determinó por el número de ID únicos de PubMed por gen. De manera similar, utilizamos GO para obtener el número de términos asociados para cada gen (Términos GO), UPTISSUE^[114] para evaluar el número de tejidos en los que el nivel de expresión de cada gen estaba aumentado (Recuento de tejidos) y OMIM para encontrar el número de enfermedades por gen (Términos OMIM). Como un indicador de la importancia de los genes y utilizando la base de datos CORUM versión 4.1 (descargada el 23 de enero de 2024), calculamos el número de complejos de proteínas asociados con cada gen (Complejos CORUM).

Evaluación pronóstica de los ORF asociados a la proliferación utilizando la clasificación de puntajes z, las métricas de precisión-exhaustividad y el análisis de supervivencia

Para evaluar la relevancia clínica de las poblaciones de ORF relacionadas con la proliferación del cáncer, empleamos un enfoque combinado de clasificación de puntajes z. Para cada lote experimental, los cambios en la abundancia de los ORF se calcularon como la diferencia log2 entre la expresión media bajo el tratamiento con DMSO y la expresión basal, siguiendo una estrategia adaptada de las metodologías de cribado CRISPR^[115]. Estas diferencias, que representan las respuestas a la perturbación, se calcularon para cada lote de forma independiente. La matriz de diferencias resultante se normalizó luego con puntajes z por lote, transformando la distribución de cada lote. Para agregar las señales de varios lotes experimentales, se aplicó un método de transformación de puntajes z inversos de un estudio anterior^[116] por ORF. Específicamente, cada puntaje z se convirtió nuevamente en una escala original aproximada utilizando la transformación de puntajes z inversos. El puntaje z combinado para cada ORF se calculó luego promediando estos valores transformados inversamente en todos los lotes. Los ORF se clasificaron en orden descendente según sus puntajes z combinados. La lista de ORF se integró con las anotaciones pronósticas de HPA^[117] (v24.0) a través de una fusión de dos pasos utilizando los ID de genes Entrez y los símbolos de los genes. Los genes anotados con un pronóstico favorable y desfavorable (definido como estar relacionado con un mal resultado en al menos un tipo de cáncer) se designaron como “Resultados”. Basado en el primer resultado, se calculó el primer rango. Para evaluar el rendimiento, la precisión se calculó como la proporción de resultados entre los genes de mayor rango, y la exhaustividad como la proporción del número total de resultados identificados hasta un rango determinado. Además, la precisión máxima en o más allá de cada rango se calculó utilizando una función máxima acumulativa aplicada en orden inverso. Tanto las curvas de precisión máxima como las de exhaustividad se visualizaron para evaluar la capacidad del modelo para priorizar los ORF relacionados con la proliferación asociados con un mal pronóstico. Se aplicó una tubería analítica paralela para evaluar la asociación entre los ORF clasificados y la resistencia a los fármacos, utilizando la resistencia seleccionada manualmente de The Cancer Genome Atlas (TCGA), siguiendo los criterios de trabajos anteriores^[33]. Para el análisis de supervivencia, utilizamos los datos de secuenciación de ARN derivados de TCGA de HPA. Los pacientes se estratificaron en grupos de alta y baja expresión para cada gen utilizando el mejor umbral de expresión, proporcionado por HPA, definido como el umbral de fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (FPKM) que produce el valor p de rango logarítmico más bajo entre los dos grupos.

Análisis de red de enriquecimiento funcional espacial (SAFE)

Utilizando el cambio log2 de las muestras, se calculó la similitud general del perfil de perturbación utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) utilizando Scipy^[108] (v1.15.2). Los ORF emparejados con un PCC de 0,9 y un valor p 0,4 de puntajes de dobletes Scrublet (v0.2.3)^[123]. Los recuentos brutos se normalizaron por célula a 10.000, y se transformó ln(x+1) y posteriormente se utilizaron como valores de expresión génica. Se seleccionaron los 2.000 genes con mayor variabilidad utilizando la función scanpy.pp.highlyvariablegenes con el método seuratv3^[124] para cada conjunto de datos, y se realizó un análisis de componentes principales (PCA) con los genes altamente variables seleccionados. El grafo de vecindad se construyó a partir de los 50 principales componentes y se visualizó utilizando UMAP^[125]. Se realizó el agrupamiento utilizando el método Leiden^[126] con una resolución de 0,5, y la prueba de rangos de Wilcoxon^[127] calculó los genes marcadores de cada grupo. Los puntajes del ciclo celular se calcularon utilizando los genes previamente definidos para el ciclo celular^[128] utilizando la función scanpy.tll.scoregenescellcycle. ### Ensayo de respuesta a fármacos para cribado con LysoTracker

Las células se trataron con TAS-102 a concentraciones que oscilan entre 0,049 y 108 μM en una serie de diluciones triplicadas durante 24, 28 o 72 horas para establecer las condiciones óptimas para la activación lisosomal inducida. Se incluyeron células control tratadas con vehículo DMSO y líneas celulares que sobreexpresan ORF de CDK6 y BCL2 como controles positivos de sensibilidad y resistencia a los fármacos, respectivamente. Después del tratamiento con TAS-102, la actividad lisosomal se evaluó mediante el teñido de las células con 50 nM de LysoTracker Green DND-26 (Thermo Fisher Scientific Inc., L7526) durante 20 minutos a 37°C. Después de dos lavados con DPBS, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo CytoFlex (Beckman Coulter, C09766) para medir la fluorescencia verde como indicador de la actividad lisosomal. ### Cribado con LysoTracker

El método FACS siguió el protocolo del estudio anterior^[129]. Las células HeLa ORFeome se descongelaron y se combinaron para maximizar la cobertura de la biblioteca ORF, luego se les permitió recuperar durante tres días antes del experimento. Para el cribado, se sembraron 3 millones de células por plato de 15 cm para el control con DMSO, y 20 millones de células fueron sembradas para el tratamiento con TAS-102 para asegurar una representación suficiente de poblaciones potencialmente resistentes. El tratamiento con fármacos se inició mientras las células aún estaban en suspensión, antes de la adhesión completa. Después de 72 horas de tratamiento con TAS-102, la actividad lisosomal se evaluó mediante el teñido de las células con 50 nM de LysoTracker Green durante 20 minutos a 37°C. Después de dos lavados con DPBS, las células se separaron en un clasificador celular FACS Sony MA900, seleccionando la positividad para mCherry y luego las poblaciones con actividad lisosomal aumentada (alta fluorescencia verde, el 5% superior) y actividad lisosomal disminuida (baja fluorescencia verde, el 5% inferior). Las células separadas se recogieron, se sembraron en placas de 6 pocillos y se expandieron durante una semana antes de ser cultivadas hasta la confluencia en platos de 15 cm. El ADN genómico, la amplificación por PCR y la secuenciación se realizaron como se describió previamente para el cribado de fármacos quimioterapéuticos. Los datos de secuenciación de las poblaciones separadas se analizaron utilizando la plataforma bioinformática ORFeome para priorizar los genes candidatos y comparar los hallazgos con los del cribado de resistencia a TAS-102. El análisis de supervivencia y la estratificación de pacientes basados en los genes seleccionados se realizaron utilizando datos del Atlas PanCancer TCGA^[32] a través de cBioPortal^[130] (accedido el 7 de julio de 2025), y se visualizaron utilizando Matplotlib. ### Análisis de Western Blot para la detección de proteínas de la vía lisosomal

Las células HeLa se trataron con DMSO, 1 μM de TAS-102 o 1 μM de ABT-263 (MedChemExpress, HY-10087), 1 μM de TAS-102 + 1 μM de ABT-263 en combinación, y las células HCT 116 se trataron con DMSO, 1 μM de TAS-102 o 0,5 μM de ABT-263, 1 μM de TAS-102 + 1 μM de ABT-263 en combinación. Después de 48 horas de incubación, las células se lisaron en un tampón de muestra (60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol y 0,01% bromofenol azul) o un tampón de lisis EBC (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl y 0,5% NP-40), suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich, 11836153001) durante 30 minutos en hielo. Los lisados celulares totales se sonicaron tres veces durante 10 segundos cada uno y se centrifugaron a 15.000 ×g a 4°C durante 15 minutos. Se recogieron los sobrenadantes, y la concentración de proteínas se midió utilizando el ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., 23227). Cantidades iguales de proteína se separaron por SDS-PAGE del 8 al 15% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories, Inc., 1620177). Las membranas se bloquearon en solución salina tamponada con Tris al 1X con 0,1% de Tween 20 y 5% de suero desnatado (CellNest, CNS109) a temperatura ambiente durante 20 minutos y se incubaron con anticuerpos primarios a 4°C durante la noche o a temperatura ambiente durante 1 hora y con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora. La señal se visualizó con ImageQuant™ 800 (Cytiva™, 29399481) utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (GenDEPOT, LLC, W3652–020). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: ### Ensayo de inmunofluorescencia

Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo en placas de 12 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con DMSO, 2 μM de TAS-102 o 0,5 μM de ABT-263, 2 μM de TAS-102 + 0,5 μM de ABT-263 en combinación. Después de 24 horas de incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 5 minutos. A continuación, las células se trataron con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% (A0100–010; GenDEPOT) durante 1 hora y luego se incubaron con anticuerpos primarios en BSA al 2% a 4°C durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con anticuerpo IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (A-11034; Thermo Fisher Scientific Inc.) en BSA al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Los núcleos se tiñeron con 1 μg/mL de Hoechst 33342 (B2261; Sigma) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las láminas de vidrio se montaron sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje de fluorescencia anti-fade (ab104135; Abcam). Se realizó la imagen confocal (LSM800; CLSM). Los anticuerpos primarios utilizados fueron contra TFEB (1:500; 4240; Cell Signaling). La fluorescencia nuclear se midió utilizando el software ImageJ (v1.53K; National Institutes of Health). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni. ### Ensayo DQ-BSA

Para evaluar la actividad proteolítica lisosomal, se realizó el ensayo DQ-BSA según se describió previamente^[131]. Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo sobre láminas de vidrio en una placa de 12 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con 2 μM de TAS-102 o 0,5 μM de ABT-263 o una combinación de ambos. Después de 24 horas de tratamiento con fármacos, las células se incubaron con 10 μg/mL de DQ™ Red-BSA (D12051; Thermo Fisher Scientific Inc.) a 37°C durante 24 horas en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS y se fijaron con formaldehído al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (1 μg/mL). Las láminas de vidrio se montaron sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje de fluorescencia anti-fade (ab104135; Abcam). Se realizó la imagen confocal (LSM800; CLSM). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni. ### Medición del pH lisosomal

Para evaluar la acidificación lisosomal, el pH lisosomal se midió según se describió previamente^[132]. Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se incubaron en medio completo que contenía 2 μM de TAS-102 o 0,5 μM de ABT-263 o 2 μM de TAS-102 + 0,5 μM de ABT-263 en combinación. Después de 24 horas de tratamiento con fármacos, las células se incubaron con 1 μM de LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (L7545; Thermo Fisher Scientific Inc.) durante 5 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS y luego el medio se reemplazó con HBSS suplementado con 10% de FBS durante 10 minutos para los pozos de prueba. Para generar una curva estándar, las células se incubaron con un tampón (25 mM HEPES, 115 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 10 μM glucosa, 10 μM nigericina) calibrado a pH 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0 como se describió previamente. La fluorescencia se midió utilizando un lector de placas PerkinElmer EnSpire con filtros de excitación/emisión configurados en 329/440 nm y 380/540 nm. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni. ### Ensayo de proliferación celular

Para evaluar las diferencias en la proliferación celular durante el tratamiento con fármacos, la proliferación se midió utilizando un método adaptado del protocolo anterior^[133]. Las células HCT 116 se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 5×104 células por pocillo. Al día siguiente, las células se trataron con 2 μM de TAS-102 o 100 nM de Bafilomycin A1 o 2 μM de TAS-102 + 100 nM de Bafilomycin A1 en combinación. Las células se recogieron y contaron a 0, 24 y 48 horas después del tratamiento con fármacos. Cada conteo se realizó en seis réplicas independientes para cada punto temporal, y los valores medios se utilizaron para generar los gráficos de proliferación. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni. ### Ensayo de citotoxicidad

Para examinar la citotoxicidad del fármaco en células humanas, seguimos el protocolo del estudio anterior^[134]. Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se trataron con las concentraciones apropiadas de fármacos (0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 4, 10, 25 y 50 μM) durante 24 horas. El medio se reemplazó con medio que contenía una de las concentraciones (0, 25, 50, 75, 100, 200, 500, 900, 1800 y 3600 nM) de ABT-263, seguido de una incubación de 96 horas. Las células se tiñeron con Methylene Blue al 0,5% durante 30 minutos, se enjuagaron con agua, se solubilizaron en SDS al 5% en DPBS y se leyeron a 650 nm. El promedio del control normalizó la absorbancia bruta. Se generó el gráfico utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías seguida de la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. ### Xenoinjertos derivados de células (CDX)

Ratones hembras SCID/CB17, con 6 a 8 semanas de edad, fueron obtenidos de una colonia mantenida en RPCCC. Los ratones fueron inoculados subcutáneamente en el flanco izquierdo con células tumorales HCT 116 en crecimiento exponencial (1×106 por ratón) suspendidas en una mezcla 1:1 de DPBS y Matrigel. Los ratones fueron monitoreados diariamente, mientras que el peso corporal y el tamaño del tumor se midieron dos veces por semana. Cuando el volumen del tumor alcanzó 50 a 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento (n = 10–11 para cada grupo): (1) Vehículo Control, (2) 50 mg/kg ABT-263, (3) 50 mg/kg TAS-102 (MedChemExpress, Cat. No. HY-16478), y (4) Combinación (50 mg/kg TAS-102 + 50 mg/kg ABT-263). El TAS-102 se disolvió en 10% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD) en DPBS, mientras que el ABT-263 se preparó en 10% de DMSO, 40% de PEG300, 5% de Tween-80 y 45% de salina. Para el grupo de Combinación, el TAS-102 se administró 4 horas antes del ABT-263. Todos los fármacos fueron preparados frescos y administrados por vía oral en un ciclo de 5 días con 2 días de descanso. ### Xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)

Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) de cáncer colorrectal (CRC PDX-03-26-4p) fueron obtenidos y cultivados en ratones SCID/CB17 machos de RPCCC. Los tumores se cultivaron en ratones donantes hasta un volumen de alrededor de 1500 mm3, se cosecharon rápidamente después de la eutanasia, se cortaron en trozos de 2×2×2 mm3 bajo condiciones estériles y se implantaron quirúrgicamente en el flanco izquierdo. Los grapas quirúrgicas se retiraron aproximadamente diez días después de la implantación. El crecimiento del tumor y el peso de los ratones se midieron dos veces por semana. Una vez que el volumen promedio del tumor alcanzó 50–100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos como en el experimento CDX (1) Vehículo Control, (2) 50 mg/kg ABT-263, (3) 50 mg/kg TAS-102 y (4) Combinación (50 mg/kg TAS-102 + 50 mg/kg ABT-263). Los fármacos se prepararon como en el experimento CDX y administrados por la misma vía y programa de dosificación. ### Monitoreo del modelo de ratón

Los ratones se alojaron en unidades de microaislamiento y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Se realizó un control diario de la salud de los animales, el peso corporal y el crecimiento tumoral, así como los procedimientos de finalización del estudio, siguiendo el protocolo y las directrices aprobadas por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Las instalaciones están certificadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) International y cumplen con las regulaciones y estándares del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos.

Al final del estudio, cuando el diámetro del tumor alcanzó los 20 mm, los ratones fueron sacrificados y se les realizó una necropsia y se recolectaron órganos. La evaluación del crecimiento tumoral se detuvo una vez que un ratón alcanzó el punto final (típicamente en un grupo tratado con vehículo), mientras que los datos de supervivencia se siguieron recopilando en el estudio. Se recolectó sangre por vía intracardíaca y se almacenó en tubos recubiertos con EDTA a 4 °C para un análisis de hemograma completo.

Hemograma Completo

La sangre se recolectó mediante punción cardíaca en un tubo que contenía solución de EDTA al final del estudio^[134]. El análisis se realizó con muestras de 20 μL de sangre utilizando el analizador Heska HemaTrue y el software integrado HeskaView versión 2.5.2.

Estadísticas para los datos In Vivo

La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) para cada ratón se calculó como la diferencia relativa entre el volumen tumoral promedio del grupo control vehículo y el volumen tumoral del ratón individual en relación con el promedio del grupo control vehículo. Las diferencias estadísticamente significativas se determinaron utilizando ANOVA de una vía para TGI y hemograma completo, y una prueba ANOVA de dos vías para las curvas de crecimiento tumoral. Se realizaron pruebas múltiples utilizando las comparaciones múltiples de Tukey en GraphPad Prism 9.

Cultivo celular

La línea celular T-REx™-HeLa (células HeLa) se mantuvo como se describió previamente^[69], utilizando medio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Corning, 10–017-CV). Antes del cribado, se analizaron para detectar contaminación por micoplasma (ATCC, 30–1012K) y se confirmaron las células mediante el perfilado de repeticiones tándem cortas (STR) en el Centro de Diagnóstico Genómico del Hospital para Niños Enfermos (SickKids)^[70]. Las células HeLa Flp-In T-REx diseñadas con el sitio de inserción Bxb1 en el locus AAVS1 con el promotor EF1α (células HeLa EF1α) fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio Roth de la Universidad de Toronto, que actualmente se ha trasladado a la Universidad de Pittsburgh^[71].

Las líneas celulares humanas, cáncer colorrectal HT29 (RRID: CVCL0320), cáncer de páncreas MIA PaCa-2 (RRID: CVCL0428) y células ductales pancreáticas hTERT HPNE (RRID: CVCL_C466) se cultivaron según las recomendaciones de ATCC. Las líneas celulares de cáncer colorrectal HCT 116 y HCT 116 p53(−/−; KO) fueron proporcionadas por el Dr. Bert Vogelstein en la Universidad Johns Hopkins^[72]. Las líneas celulares de cáncer colorrectal RKO y RKO p53(−/−; KO) fueron proporcionadas por el Dr. Alessandro Carugo en el MD Anderson Cancer Center^[73]. Estas líneas celulares se mantuvieron en DMEM y se autenticaron nuevamente utilizando el perfilado STR por ATCC o el Servicio de Recursos Genómicos de Roswell Park en los últimos tres años. Las células se analizaron rutinariamente para detectar micoplasma; todos los estudios utilizaron células libres de micoplasma. Los cultivos celulares humanos se mantuvieron en medios suplementados con un 10% de suero fetal bovino (FBS; Corning, 35–015-CV) inactivado por calor y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S, Corning, 30–002-CI) a 37 °C con un 5–10% de CO2 en una incubadora humidificada.

Clonación masiva de la biblioteca ORFeome en el sitio de inserción Bxb1

Los clones de entrada en la Colección de Marcos de Lectura Abiertos Humanos (ORFeome) v9.1^[22],^[74] con aproximadamente 1000 clones adicionales donados por el Centro de Biología de Sistemas del Cáncer (CCSB) en el Dana-Farber Cancer Institute (espacio Delta) se verificaron mediante secuenciación de última generación para confirmar la autenticidad de sus secuencias de ADN codificantes. Los clones de entrada se colocaron desde placas de 384 pocillos en placas de agar LB correspondientes que contenían kanamicina (25 μg/mL; Thermo Fisher, AC611290050) o espectinomicina (50 μg/mL; Thermo Fisher, S05845G). Después de la incubación a 37 °C durante 48 horas, las placas de agar LB se rasparon y se recolectaron para la preparación de plásmidos agrupados utilizando el kit Qiagen Plasmid Mini Prep (Qiagen, 27104), un miniprep por cada placa de 384 pocillos. La cantidad de ADN proporcional al número de clones se agrupó y se mezcló en un solo tubo para crear un conjunto completo de clones de entrada, donde cada ORF se representó en proporciones equivalentes. Basándonos en estos grupos de clones de entrada, realizamos la clonación LR masiva como se describió previamente^[22],^[23],^[75]. Se incubaron 150 ng del grupo de entrada con 5x LR Clonase (Invitrogen, 11791020) y 150 ng del vector de destino (pDEST-HC-REC, laboratorio Roth) durante 5 días, comenzando con una reacción de 5 μL y complementando con 1 μL de 5x LR Clonase y 150 ng del vector de destino cada día. Utilizamos 1 μL de la mezcla de reacción LR para realizar 8 electroporaciones (total de 8 μL utilizados) con E. coli electrocompetente 10-beta (New England Biolabs, C3020K) para generar 20 millones de unidades formadoras de colonias, lo que logra aproximadamente una representación de la biblioteca de 1000x. En detalle, las bacterias electroporadas se colocaron en agar LB que contenía carbenicilina (Fisher, BP26485, 100 μg/ml) y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. Las colonias se recolectaron mediante un raspado suave y la biblioteca de destino final se aisló utilizando un kit de purificación de plásmidos PureLink™ Fast Low-Endotoxin Maxi (Invitrogen, A35892).

Perturbación de sobreexpresión a gran escala mediante la construcción de un grupo de células HeLa con la biblioteca ORFeome

Las células HeLa EF1α se pasaron 3 veces después del descongelamiento antes de la transfección, y se sembraron 1,3 millones de células en cada una de las doce placas de 10 cm. Transfectamos 10 μg del vector de expresión de recombinasa Bxb1 (pCAG-NLS-HA-coBxb, laboratorio Roth) por placa utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015) según las instrucciones del fabricante. El medio se renovó después de 12 horas para eliminar la mezcla de transfección. Después de 36 horas, transfectamos 10 μg de la biblioteca de destino ORFeome preparada en la sección anterior. El medio se renovó 12 horas después y se incubó durante 24 horas adicionales para permitir que apareciera la expresión de la fluorescencia mCherry. Las células que fueron transfectadas con la biblioteca se clasificaron para mCherry utilizando la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) por Sony MA9000 en el Servicio de Recursos de Análisis de Flujo e Inmunología (FIASR) en el Roswell Park Comprehensive Cancer Center (RPCCC), y se cultivaron en placas de 15 cm durante 3 días más hasta que la señal fluorescente azul residual (mTagBFP2) disminuyó. Las células integradas con la biblioteca se seleccionaron utilizando FACS dos veces, en una preselección en el segundo día y una postselección en el cuarto día, durante 5 días después de la transfección, y se logró una representación de 150x (Preselección: ~15 millones, Postselección: ~11 millones de células). Para minimizar el efecto de lote resultante de la variabilidad dentro de los grupos de células, expandimos el grupo de células con integraciones de ORFeome a cien placas de 15 cm. El grupo de células se trituro, y se criopreservaron 3 millones de células HeLa integradas con ORFeome (células HeLa ORFeome) por vial, con 200 viales para los cribados de selección de fármacos posteriores.

Ensayos de respuesta a la dosis de fármacos

Los ensayos de respuesta a la dosis de fármacos se llevaron a cabo utilizando el protocolo modificado del estudio anterior^[12]. Las células HeLa se descongelaron y se cultivaron en placas de 10 cm en condiciones de cultivo estándar antes de un ensayo. Sembró 3000 células en placas de 96 pocillos a un volumen de 100 μL y se incubaron durante 24 horas para permitir la adhesión. Cada fármaco se diluyó a una concentración de 50 o 100 μM y se diluyó en serie en una proporción de 1:3 utilizando medio de cultivo para cubrir un rango de ocho concentraciones. Se agregaron 100 μL del fármaco diluido en triplicado y se incubó durante 72 horas. Luego, se eliminó el medio y se midió la viabilidad utilizando el reactivo AlamarBlue (Invitrogen, A50101) según las instrucciones del fabricante. La lectura de OD595nm (Absorbancia a 595 nm) se midió después de 2 horas de incubación del reactivo, y la Concentración Inhibitoria Absoluta al 50% (IC50) se calculó utilizando el software GraphPad Prism 9 (Versión 9.1.0).

Cribado quimioterapéutico

Seleccionamos 16 agentes quimioterapéuticos citotóxicos sintetizados químicamente que se dirigen principalmente al ciclo celular o ejercen efectos no específicos a través del daño del ADN. Estos fármacos se eligieron para representar una amplia gama de mecanismos de acción que se utilizan comúnmente en los tratamientos del cáncer en adultos y niños, como se describió previamente^[76]. Para simplificar el análisis, categorizamos los quimioterapéuticos en función de sus mecanismos de acción primarios. En algunos casos, los fármacos se agruparon en categorías mecanicistas más amplias. Por ejemplo, la doxorrubicina, un inhibidor de la topoisomerasa II, y la bleomicina, un antibiótico antitumoral, se clasificaron como agentes que inducen roturas de la cadena de ADN, lo que refleja su resultado compartido a pesar de los diferentes mecanismos moleculares. Basándonos en estas clasificaciones mecanicistas, los 16 quimioterapéuticos se agruparon en las siguientes cuatro categorías:
Antimetabolitos: Fluorouracilo (5-FU, Sigma, F5130), Trifluridina (TFT, Med Chem Express, HY-A0061), 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU, Toronto Research Chem - Sigma, E9386), Floxuridina (FdU, Adooq Bioscience, A10392–500), 6-mercaptopurina (Sigma, 852678), TAS-102 (Adooq Bioscience, 733030-01-8)
Agentes de reticulación del ADN: Mitomicina C (Sigma, M5353), Cisplatino (Cayman, 13119), Carboplatino (Referencia de la Farmacopea Británica - Sigma, BP711), Carmustina (Referencia de la Farmacopea Europea - Sigma, Y0002128)
Agentes de rotura de la cadena de ADN: Doxorrubicina (Tocris, 2252), Bleomicina (Sigma, B1141000), Etopósido (Sigma, PHR2717), Irinotecán (Sigma, 341205)
Inhibidores de los microtúbulos: Paclitaxel (Sigma, T7402) y Vinblastina (Sigma, V0300000)

Utilizando los valores de IC50 obtenidos mediante el ensayo de respuesta a la dosis de fármacos, determinamos una dosis adecuada para tratar las células en un formato de placa de 15 cm. Sembró al menos 3 millones de células y las trató con los fármacos a su dosis de IC50 durante 72 horas. El DMSO se seleccionó como control vehículo. Los cribados se realizaron en cinco lotes independientes, cada uno de los cuales incluía una línea de base (a menudo denominada T0 en el cribado CRISPR)^[77] y su propio conjunto de controles vehículo para tener en cuenta la variación específica del lote. Para garantizar una representación completa de la biblioteca, descongelamos 10 viales del grupo de sobreexpresión de ORFeome y los expandimos durante 3 días, recuperando un mínimo de 3 millones de células viables en total para mantener una cobertura de 150x. Las células se sembraron a 3 millones por placa y se trataron con los respectivos fármacos en triplicado, incluidos los controles vehículo correspondientes en cada lote. Después de 72 horas de tratamiento, las células se trituraron y se sembraron 3 millones de células en placas nuevas con el tratamiento con fármacos continuado. Después de 48 horas adicionales, se eliminó el medio que contenía el fármaco y se permitió que las células se recuperaran en un medio de cultivo normal durante 3 días más o hasta la confluencia. Las células recuperadas se trituraron y se pelletizaron (~10 millones de células por pellet) para la extracción de ADN genómico posterior.

Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los ORF a partir del ADN genómico

Según las instrucciones del fabricante, el ADN genómico se extrajo de los pellets de células utilizando el kit Blood and Cell Culture DNA Midi Kit (Qiagen, 13343). Realizamos dos conjuntos de PCR (PCR anidadas) utilizando el Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs, M0544S) y los cebadores (Integrated DNA Technologies) que se unen a i) el locus del sitio de inserción y ii) los sitios de clonación de Gateway, para amplificar el marco de lectura abierto (ORF) completo a partir del sitio de inserción con una mayor selectividad y una reducción de las contaminaciones del ADN genómico. Se utilizaron un total de 18 μg de ADN en la primera PCR en doce reacciones de PCR de 50 μL, que se agruparon para representar la cobertura total de 150x. La segunda PCR se realizó utilizando 2,5 μL de la reacción de PCR anterior como plantilla. Se realizaron dos reacciones de PCR2 de 50 μL y se agruparon antes de preparar la biblioteca de secuenciación. Para la preparación de la biblioteca NGS utilizando la plataforma TruSeq, se utilizaron cebadores personalizados que incluían una secuencia NNNNN de 5' para asegurar la complejidad de los primeros 5 pb durante la secuenciación^[78].

Preparación de la biblioteca de secuenciación

La calidad de los amplicones se confirmó en el Tapestation (Agilent, G2991BA) en el Servicio de Recursos Genómicos Compartidos (GSR) del Roswell Park Comprehensive Cancer Center. Para las muestras que superaron el control de calidad, primero se eliminaron los dímeros de cebadores utilizando un kit de limpieza de cuentas Ampure XP (Beckman-Coulter, A63882). Luego, los amplicones se fragmentaron utilizando un fragmentador ultrasónico enfocado Covaris E220 (Covaris, COV-500239) para obtener tamaños promedio de 250–300 pb. Estos amplicones fragmentados se ligaron a adaptadores TruSeq y se indexaron utilizando Kapa hyperprep para códigos de barras de muestra (Illumina, 20015963; Roche 0796237100). La biblioteca de secuenciación resultante se purificó finalmente para eliminar los dímeros de cebadores utilizando un kit Ampure. Finalmente, el ADN se cuantificó utilizando qPCR y se cargó en NovaSeq 6000 (Illumina, 20012850), y se generaron un mínimo de 3 millones de lecturas de doble extremo para cada muestra.

Análisis bioinformático del ORFeoma

El análisis bioinformático se realizó en un script de Python Jupyter Notebook (Python 3.11.0), que se comparte como material suplementario. Los archivos FASTQ se recortaron utilizando Cutadapt^[79] para eliminar la secuencia de adaptador TruSeq restante según las indicaciones de Illumina, y luego se recortaron aún más con Trimmomatic^[80] con una puntuación Phred de secuencia (LEADING:20, TRAILING:20, SLIDINGWINDOW:4:15, MINLEN:25). Para la secuencia del ORFeoma, todas las secuencias se verificaron y se les asignaron los símbolos de genes apropiados utilizando la base de datos de genes NCBI^[81] (descargada el 11 de agosto de 2023). Los archivos analizados se alinearon con la referencia de secuencias del ORFeoma humano v9.1 y el espacio delta utilizando la herramienta Bowtie2^[82],^[83] (v2.5.2). Después de la alineación, los archivos FASTQ y SAM alineados se evaluaron utilizando FASTQC (v0.12.1) y multiQC (v1.27.1)^[84],^[85]. Los archivos SAM se restauraron en formato BAM con una serie de pasos de post-procesamiento utilizando Samtools^[86], y los recuentos de lecturas sin procesar se generaron utilizando Pysam (0.23.0), incluidos los recuentos de lecturas concordantes y múltiples con un umbral MAPQ de 30^[86]. Los parámetros de los procesos se eligieron en función del flujo Cut&Run utilizado en la publicación de detección del ORFeoma y se adaptaron mejor para la alineación de lecturas cortas^[87],^[88]. Las lecturas sin procesar se normalizaron en el Trimmed Mean of M-value (TMM) utilizando EdgeR (v4.0.16)^[89],^[90]. Los recuentos de lecturas normalizados se seleccionaron en función del cálculo de secuencias con una mediana log2TMM superior a −1 para eliminar los recuentos de lecturas de ruido. El conjunto de datos completo se normalizó aún más utilizando el método de normalización cuantil y se corrigió por lotes para crear una distribución uniforme del conjunto de datos para analizar la diferencia entre las muestras utilizando EdgeR (v4.0.16) y Limma (v3.58.1)^[91]. Para la comparación de muestra a muestra, se procesó un conjunto de datos TMM utilizando el análisis de reducción de dimensionalidad de Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) (UMAP-learn^[92]; v0.5.7). La eficiencia del silenciamiento del ORFeoma se evaluó cuantificando los niveles de fluorescencia en las células que expresan mCherry y mTagBFP2. El silenciamiento se evaluó utilizando la Relación de Silenciamiento, definida como log2 (E / S) donde E representa el número de células que expresan (mCherry+ mTagBFP2−) y S denota el número de células silenciadas (mCherry− mTagBFP2−). Esta relación refleja la diferencia en las unidades de fluorescencia relativas entre las células que expresan activamente el ORF (mCherry+ mTagBFP2−) y aquellas en las que es probable que el ORF esté silenciado (mCherry− mTagBFP2−). Los ORFs con una Relación de Silenciamiento inferior a −1 (cambio de log2 < −1) se clasificaron como silenciados con éxito.

Para realizar pruebas estadísticas más precisas, se excluyeron todas las muestras con una población ORF subyacente inferior a la mitad de la población ORF expresada máxima en el total de las muestras antes de la normalización TMM^[93]. Después de la normalización TMM, el conjunto de datos se recortó utilizando DescTools^[94] (0.99.57) con un rango de cuantiles del 0.001% para eliminar los puntos de datos extremos. Luego, se realizó una normalización de cuantiles superiores para normalizar aún más el conjunto de datos utilizando EdgeR^[90] (v4.0.16). Se realizó una corrección de lote utilizando una matriz de diseño, que incluye información de la muestra experimental de control, múltiples lotes y cambios en las ejecuciones de secuenciación de última generación para ajustar con precisión el efecto de lote utilizando Limma^[91]. Además, el cambio de log2 de los recuentos TMM entre la condición experimental del fármaco y el DMSO correspondiente del lote en la colección y las pruebas estadísticas se procesó utilizando pruebas de permutación (n=10,000). Los valores p ajustados se calcularon utilizando pruebas de dos colas en una combinación de valores t, diferencia media de log2 y estadísticas de suma de rangos transformadas en Z, escalando con el método z de Liptak Stouffer^[95]. Los datos se visualizaron utilizando Matplotlib^[96] y Seaborn^[97].

Selección automatizada de clones de entrada para la reevaluación de alta saturación (HSR)

Aproximadamente el 10% del conjunto de ORFeoma se sometió a una reevaluación con mayor cobertura (>1,000 veces) para evaluar los ORFs representados de forma diferencial. La selección de estos ORFs se basó en el análisis estadístico del puntaje T de los cambios de log2 para fármacos individuales, agrupados en ocho grupos. Estas selecciones se basaron en los ORFs de resistencia o sensibilización principales en todos los fármacos, fármacos individuales y controles. Los criterios de selección para el ORFeoma HSR se centraron en los genes que demostraron puntajes T altos, lo que indica fenotipos de proliferación fuertes o débiles. En total, se seleccionaron 2,217 ORFs y se seleccionaron del ORFeoma humano utilizando una plataforma robótica personalizada (S&P Robotics Inc., BM3-BC). Estos ORFs seleccionados se agruparon y prepararon en las células HeLa EF1α siguiendo el mismo método de clonación LR en masse^[75]. El cribado de doxorrubicina se llevó a cabo con dosis coincidentes de 5 nM, como en el cribado original, empleando los mismos métodos de amplificación de ORF por PCR y el análisis bioinformático del ORFeoma mencionado en este método. La selección de "Resistente", "Sensibilizante" y "No respondedor" se basó en el mismo parámetro de cambio de log2 que el cribado de respuesta a fármacos. El gráfico se generó utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Ensayo de sobreexpresión de ORF único

Para generar líneas celulares únicas para la verificación, se cultivaron durante la noche clones de entrada específicos que corresponden a ORFs como TYMS, RABL3, BCL2, MUTYH, CDK6, GPER y BRD9, y se aislaron utilizando el kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel, NC9405546) de la colección ORFeoma 9.1^[22]. Se incubaron 150 ng de vector de entrada, 150 ng de vector de destino (pDEST-HC-REC compartido por el laboratorio Roth) y 1 μL de LR Clonase durante 1 hora y se transformaron en células competentes químicamente 10-beta (New England Biolabs, C3019) utilizando choque térmico^[98]. Las transformantes se cultivaron durante la noche en LB que contiene carbenicilina (Fisher, 10177012) y se utilizaron para las extracciones de plásmidos. Las secuencias se confirmaron mediante reacciones de Sanger. Un día antes de la transfección, se sembraron células HeLa EF1α en placas de 6 pocillos a 350 000 células por pocillo. Los plásmidos clonados correctamente se cotransfectaron con el plásmido de recombinasa Bxb1 a 1 μg cada uno en células HeLa EF1α utilizando Lipofectamine 3000. Después de 5 días, las células se clasificaron para las poblaciones positivas a mCherry para establecer líneas celulares de sobreexpresión de ORF único estables. Para los ensayos de competencia celular, el protocolo se adaptó de un estudio anterior^[99]. Se cocultivaron 30 000 células positivas a mCherry (experimentales) con 60 000 células positivas a BFP (control) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Después de la incubación de 24 horas, tres pocillos se trataron con 0,75 μM de TFT. Después de un período de tratamiento de 5 días, se cuantificaron las poblaciones celulares relativas leyendo 20 000 eventos por pocillo utilizando FACS. Los resultados del ensayo de competencia se compararon con los datos de cambio de pliegue del cribado inicial de TFT. Para la validación del silenciamiento, se evaluaron los cambios fenotípicos cuantificando su porcentaje de población total después de 5 días sin ningún tratamiento con fármacos utilizando FACS. Después de la recuperación, se clasificaron poblaciones específicas mediante FACS para la secuenciación de bibliotecas posteriores. La correlación entre los cambios fenotípicos y la respuesta transcripcional se evaluó comparando los porcentajes de población con las relaciones de silenciamiento utilizando la tubería bioinformática del ORF mencionada anteriormente. La población celular se normalizó mediante el control de mCherry. El gráfico se generó utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Análisis de transcriptómica de ARNm

La duración del tratamiento y el protocolo se adaptan de un estudio anterior sobre la búsqueda de combinaciones de fármacos^[100]. Se sembraron células HeLa a 3 millones en platos de 15 cm y se trataron con una CI50 de 5 nM de doxorrubicina durante 24 horas y 120 horas. Después del tratamiento, las células se centrifugaron y cada sedimento celular consistió en un mínimo de 1 millón de células por control y conjunto experimental. Cada sedimento celular se conservó en TRIzol (Qiagen, #79306) y se almacenó a −20 °C antes de enviarlo a los Servicios de Recursos Genómicos Compartidos (GSR) en el Roswell Park Comprehensive Cancer Center. El ARN purificado se preparó utilizando el kit miRNeasy micro (Qiagen, 217084) y se midió el control de calidad del número de integridad del ARN (RIN) utilizando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, G2939BA). Las bibliotecas de secuenciación se prepararon con el kit KAPA mRNA HyperPrep (Roche, KK8581). Las bibliotecas de ARN-seq finales se secuenciaron en Illumina NovaSeq 6000. Se utilizó Nextflow versión 24.10.4^[101] con nf-core/rna-seq v3.18.0^[102] utilizando Docker (v27.5.1). Los archivos de secuenciación se alinearon con el genoma humano GRCh38.p14^[103]. El flujo de trabajo se configuró para realizar el recorte de adaptadores con Trim Galore^[104], seguido de la alineación utilizando STAR^[105] (v2.7.10a) y la cuantificación utilizando RSEM^[106] (v1.3.1). Las lecturas de ARN ribosómico se eliminaron utilizando SORTMERNA^[107] (v4.3.7) antes de la cuantificación. El análisis posterior utilizó la cuantificación basada en recuentos, que coincide con la configuración de la tubería bioinformática del ORFeoma. Se realizaron pruebas t pareadas utilizando la función stats.ttest_rel de SciPy^[108] (v1.15.2) y se calcularon los valores p empíricos mediante pruebas de permutación (n = 10,000) para evaluar la significación estadística.

Según el secuenciamiento del ORFeoma de las células HeLa, las lecturas se alinearon con 18.388 bibliotecas de ORFeoma. De estas, 14.506 ORF se consideraron bien representadas, definidas por una mediana mínima de expresión log2 TMM > -1^[109]. Los ORF por debajo de este umbral se consideraron ruido y se excluyeron del análisis posterior. De los 14.506 ORFeomas analizados, estos ORF se categorizaron en cinco subconjuntos categóricos. Entre los ORF categorizados, aquellos con un umbral de cambio log2 de ±0,5 y un valor p inferior a 0,05 se identificaron como ORF diferencialmente representados. Dentro de este conjunto, los ORF enriquecidos (cambio log2 positivo) se interpretan como posibles factores de resistencia, que confieren una ventaja de supervivencia durante el tratamiento, mientras que los ORF disminuidos (cambio log2 negativo) sugieren factores de sensibilización, lo que indica una mayor sensibilidad a los fármacos. Primero, se seleccionaron 197 genes centrales basándose en cualquier ORF con el filtro de más de 7 fármacos (más de la mitad de los quimioterapéuticos totales - 1). En segundo lugar, se asignaron 1.072 genes categóricos basándose en el recálculo de la mediana(log2{categorías de fármacos}) - mediana(log{resto de categorías}) de las pruebas estadísticas mencionadas anteriormente y se filtraron para obtener ORF diferencialmente representados. En tercer lugar, se identificaron 3.832 genes periféricos como ORF significativamente alterados (cambio absoluto log2 ≥ 0,5 y valor p ≤ 0,05) en respuesta a fármacos quimioterapéuticos específicos, pero no en otros. Para cada fármaco, se seleccionaron los genes que cumplían estos criterios y luego se filtraron para excluir cualquier gen que también cumpliera los mismos criterios de significación en otros fármacos, garantizando así la especificidad del fármaco. En cuarto lugar, se eligieron 6.556 genes multidroga basándose en un filtro en la suma de quimioterapéuticos entre 2 ≤ × < 7. Se seleccionaron dos quimioterapéuticos como número mínimo, basándose en la distribución de mezcla de gamma, y la distribución normal muestra un valor de corte de 2,64 en los ORF filtrados en la suma de quimioterapéuticos. Por último, se seleccionaron 2.849 genes no respondedores con ORF, con el filtro para que no haya ORF enriquecidos ni disminuidos. Para evitar cualquier superposición de ORF entre las categorías, la selección se priorizó secuencialmente desde los genes "Centrales" hasta los genes "No respondedores". La superposición de la categorización de genes en comparación con los resultados del cribado de ORFeoma se determinó utilizando la biblioteca Venn (v0.1.3) en Python (3.11).

Análisis de biomarcadores

Para evaluar la relevancia clínica de los subconjuntos de genes identificados en nuestro cribado, realizamos un análisis de superposición de biomarcadores de múltiples niveles utilizando la base de datos TheMarker^[31], un recurso curado de asociaciones entre enfermedades, biomarcadores y fármacos. La correspondencia de genes se basó en los identificadores de genes NCBI, y solo se incluyeron en el análisis los ORF verificados y no silenciosos del conjunto de datos de cribado. Los ORF verificados y no silenciosos se cruzaron con las entradas de biomarcadores específicos del cáncer en la base de datos, y para cada subconjunto de genes, se calculó la proporción de genes que se superponen con biomarcadores asociados al cáncer, clasificados como "ICD-02: Neoplasia benigna/in situ/maligna", para evaluar el enriquecimiento de genes relacionados con el cáncer validados clínicamente. A continuación, examinamos la asociación entre los ORF anotados con biomarcadores y los fármacos quimioterapéuticos; de los 16 fármacos analizados en el cribado, 7 estaban representados en la base de datos, y cuantificamos cuántos ORF anotados con biomarcadores dentro de cada subconjunto estaban vinculados a uno o más de estos fármacos, conectando los resultados del cribado con el conocimiento farmacogenómico existente. Por último, evaluamos la representación de cada subconjunto de genes dentro del conjunto total de biomarcadores calculando la proporción de ORF presentes en la base de datos en relación con el total de biomarcadores únicos catalogados. Todas las proporciones de superposición se normalizaron utilizando puntuaciones z para permitir las comparaciones entre los subconjuntos y resaltar los patrones de enriquecimiento diferencial. Las puntuaciones z se visualizaron como mapas de calor, y el número de cuatro tipos de biomarcadores dentro de cada categoría de ORF se calculó como recuentos transformados en log10 y se mostraron en gráficos de barras apiladas. Las barras apiladas representan recuentos transformados en logaritmo para cada categoría por separado y no corresponden a la suma del número total de biomarcadores.

Análisis de las propiedades de los genes

La longitud de cada ORF (Longitud del ORF) y su porcentaje de GC (Contenido de GC) se derivaron de las secuencias del ORFeoma humano v9.1 y las referencias del espacio delta después de la alineación, como se describe anteriormente. Adoptamos algunas de las propiedades de los genes de nuestro estudio anterior^[22],^[23]. Los datos de transcriptómica del proyecto Genotype-Tissue Expression (GTEx)^[110] v6 (descargados el 15 de marzo de 2016) se procesaron con R v3.5.1 para extraer el recuento de lecturas normalizado en logaritmo. En este conjunto de datos, se combinaron 16 subregiones cerebrales en tres tejidos cerebrales: ganglios basales, cerebelo y otros. Se calculó la expresión mediana de cada gen en todos los ejemplos de tejido, y se aplicó un umbral de >5. Se excluyeron los ejemplos de líneas celulares, y el análisis se restringió al conjunto de genes codificantes de proteínas. Consideramos estos valores como una referencia para el nivel de expresión génica (Abundancia), que se calcularon como se mencionó en nuestro estudio anterior^[22]. Los mismos datos se utilizaron para calcular el número de tejidos en los que se expresó cada gen (Amplitud). La información sobre la edad de los genes (Edad) se adoptó de la base de datos Protein Historian^[111], con PPODv4Jaccard como la base de datos de familias y el modelo de parsimonia de Dollo como el algoritmo de reconstrucción. La base de datos D2P2 de predicciones de proteínas desordenadas^[112] se utilizó para calcular la fracción de regiones desordenadas en relación con la longitud total de la proteína (Desorden). Extrajimos todos los ID humanos de D2P2 asignados a los ID de Ensembl del archivo "genomes.protein.gz". Utilizando esta lista y el archivo "consensusranges.tsv.gz", que contiene las posiciones de inicio y final de cada región desordenada predicha, se calculó la longitud desordenada total para cada proteína. La longitud de cada proteína se calculó utilizando el archivo "genomes.fa.bz2", que almacenaba las secuencias completas de las proteínas. La fracción se calculó fusionando los datos por ID de gen. La herramienta de anotación funcional DAVID^[113] (v2023q4) se utilizó para recuperar la información de otras propiedades. Se envió la lista de ID de Entrez y se descargó la Tabla de anotación funcional para las siguientes bases de datos el 16 de enero de 2024: OMIMDISEASE, GO - GOTERMBPDIRECT (Proceso biológico), GOTERMCCDIRECT (Componentes celulares), GOTERMMFDIRECT (Función molecular), PUBMEDID y UPTISSUE. Se contaron los términos asociados a cada conjunto de datos. El número de publicaciones (Recuento de publicaciones) se determinó por el número de ID únicos de PubMed por gen. De manera similar, utilizamos GO para obtener el número de términos asociados a cada gen (Términos GO), UPTISSUE^[114] para evaluar el número de tejidos en los que el nivel de expresión de cada gen estaba aumentado (Recuento de tejidos) y OMIM para encontrar el número de enfermedades por gen (Términos OMIM). Como proxy de la importancia de los genes y utilizando la base de datos CORUM versión 4.1 (descargada el 23 de enero de 2024), calculamos el número de complejos proteicos asociados a cada gen (Complejos CORUM).

Evaluación pronóstica de los ORF asociados a la proliferación utilizando la clasificación de puntuaciones z, las métricas de precisión-recuperación y el análisis de supervivencia

Para evaluar la relevancia clínica de las poblaciones de ORF relacionadas con la proliferación del cáncer, empleamos un enfoque combinado de clasificación de puntuaciones z. Para cada lote experimental, los cambios en la abundancia de los ORF se calcularon como la diferencia log2 entre la expresión media bajo el tratamiento con DMSO y la expresión basal, siguiendo una estrategia adaptada de las metodologías de cribado CRISPR^[115]. Estas diferencias, que representan las respuestas a la perturbación, se calcularon para cada lote de forma independiente. La matriz de diferencias resultante se normalizó luego con una puntuación z a nivel de lote, transformando la distribución de cada lote. Para agregar las señales de varios lotes experimentales, se aplicó un método de transformación de puntuación z inversa de un estudio anterior^[116] por ORF. Específicamente, cada puntuación z se convirtió nuevamente a una escala original aproximada utilizando la transformación de puntuación z inversa. La puntuación z combinada para cada ORF se calculó luego promediando estos valores transformados inversamente en todos los lotes. Los ORF se clasificaron en orden descendente en función de sus puntuaciones z combinadas. La lista de ORF se integró con las anotaciones pronósticas de HPA^[117] (v24.0) a través de una fusión de dos pasos utilizando los ID de genes Entrez y los símbolos de los genes. Los genes anotados con un pronóstico favorable y desfavorable (definido como estar vinculado a un mal resultado en al menos un tipo de cáncer) se designaron como "Éxitos". Basándose en el primer éxito, se calculó la primera clasificación. Para evaluar el rendimiento, la precisión se calculó como la proporción de éxitos entre los genes de mayor rango, y la recuperación como la proporción de éxitos totales identificados hasta un rango determinado. Además, la precisión máxima en o más allá de cada rango se calculó utilizando una función máxima acumulativa aplicada en orden inverso. Tanto las curvas de precisión máxima como las de recuperación se visualizaron para evaluar la capacidad del modelo para priorizar los ORF relacionados con la proliferación asociados con un mal pronóstico. Se aplicó una canalización analítica paralela para evaluar la asociación entre los ORF clasificados y la resistencia a los fármacos, utilizando la resistencia seleccionada manualmente de The Cancer Genome Atlas (TCGA), siguiendo los criterios de trabajos anteriores^[33]. Para el análisis de supervivencia, utilizamos los datos de secuenciación de ARN derivados de TCGA de HPA. Los pacientes se estratificaron en grupos de alta y baja expresión para cada gen utilizando el mejor umbral de expresión, proporcionado por HPA, definido como el umbral de fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (FPKM) que produce el valor p de rango logarítmico más bajo entre los dos grupos.

Análisis espacial de la red de enriquecimiento funcional (SAFE)

Utilizando el cambio log2 de las muestras, se calculó la similitud general del perfil de perturbación utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) utilizando Scipy^[108] (v1.15.2). Los ORF emparejados con un PCC de 0,9 y un valor p < 0,01 se seleccionaron como una similitud de perturbación de ORF significativa. La visualización de una red de ORF emparejados seleccionados se marcó utilizando la herramienta Cytoscape (v3.4.0)^[118]. Para visualizar esta nueva red, utilizamos el análisis espacial de enriquecimiento funcional (SAFE; v1.5) para determinar, visualizar y predecir módulos funcionales significativos en la red^[36]. Los diseños de la red se generaron utilizando el diseño de resorte ponderado por bordes. Los términos GO para cada ORF se extrajeron de FuncAssociate (v3 - GO actualizado en febrero de 2018)^[119]. El análisis SAFE se ejecutará utilizando MATLAB con las opciones de archivo de configuración predeterminadas: neighborhoodRadius = 1, groupEnrichmentMinSize = 5, plotNetwork = 0 (desactivado) y THRESHOLD_ENRICHMENT = 0.3.

Análisis de la red de interacción proteína-proteína

Seleccionamos 21 genes ORF de dos grupos clave identificados por SAFE ("unión del dominio BH" y "autofagia y apoptosis") basándonos en las primeras puntuaciones de enriquecimiento de vecindad y las puntuaciones de anotación de dominio de SAFE. Estos genes se analizaron utilizando la base de datos STRING^[59] (accedido el 10 de marzo de 2025) para construir una red de interacción proteína-proteína centrada en sus dominios GO predominantes. En STRING, solo se incluyeron las interacciones experimentalmente respaldadas con una puntuación de alta confianza ≥ 0,9. Para capturar las interacciones proteicas relevantes más allá de los ORF seleccionados, el número máximo de interactores se limitó a 50 tanto en la primera como en la segunda capa de interacción. La red resultante se agrupó utilizando el agrupamiento k-medias^[120] con el número mínimo de grupos, y los nombres de los grupos se derivaron de sus descripciones de los términos GO. El diseño de la red se organizó en un formato de cuadrícula y se visualizó aún más en Cytoscape^[118].

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes

El análisis de enriquecimiento se realizó sobre las categorizaciones de ORFs y los ORFs reguladores de la respuesta a fármacos para cada quimioterapia individual utilizando GSEApy (v1.1.9) a través de la API de Enrichr^[121]. El enriquecimiento se probó contra múltiples conjuntos de genes curados, incluidos KEGG2021Human, ReactomePathways2024, WikiPathways2024Human, GOBiologicalProcess2025 y GOMolecularFunction2025. Solo se analizó el ORF individual, incluyendo BioPlanet_2019. Para mejorar la robustez, los términos enriquecidos con menos de tres genes asociados o valores p < 0.05 se filtraron. Para las categorizaciones de ORFs, los términos GO se curaron manualmente para retener aquellos relevantes para los mecanismos relacionados con el cáncer. Para cada quimioterapia individual, se identificaron los términos GO compartidos por múltiples fármacos dentro de la misma categoría (presentes en más de dos fármacos) agrupando los términos por fármaco y categoría. Luego, estos resultados se revisaron manualmente para retener los términos mecanísticamente significativos y relacionados con el cáncer, incorporando tanto los términos GO comúnmente compartidos como los específicos de cada fármaco. Los términos GO curados se visualizaron utilizando Matplotlib, representando la razón de probabilidades y el valor −log10(p) para cada término.

Preparación para secuenciación de ARN unicelular

Las suspensiones celulares HeLa criopreservadas después de la selección por fármacos se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante 1 minuto y se transfirieron a DMEM (Gibco, 11965092) que contenía 10% de FBS (Gibco, 16000044), seguido de centrifugación a 300 ×g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron adicionalmente dos veces con DPBS frío (Gibco, 14190144) que contenía 0.04% de BSA (Miltenyi Biotec, 130-091-376) y se filtraron a través de tamices celulares de 40 μm (Flowmi, BAH136800040). Las suspensiones celulares se cargaron luego, apuntando a la recuperación de 10,000 células por canal para construir bibliotecas de secuenciación de ARN unicelular utilizando el kit Chromium Next GEM Single Cell 5' v2 (10x Genomics, PN-1000263) según las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas generadas se secuenciaron en un Illumina NovaSeq 6000 con una configuración de lectura de doble extremo y 150 pares de bases, apuntando a 400 millones de lecturas por biblioteca.

Análisis bioinformático de la secuenciación de ARN unicelular

Las lecturas se alinearon al genoma humano GRCh38 (2020-A, 10x Genomics) utilizando Cell Ranger (v6.0.2, 10x Genomics) con un parámetro include-introns. Las matrices de conteo filtradas se procesaron adicionalmente con Scanpy (v1.9.1)^[122]. Se filtraron las células de baja calidad con < 2000 conteos totales, < 500 número de genes, > 10% de conteos de genes mitocondriales y > 0.2 Scrublet (v0.2.3)^[123] puntajes de dobletes. Los conteos brutos se normalizaron por célula a 10,000, y se transformó ln(x+1) y luego se utilizó como valores de expresión génica. Los 2000 genes altamente variables se seleccionaron con la función scanpy.pp.highlyvariablegenes con el método seuratv3^[124] para cada conjunto de datos, y se realizó un análisis de componentes principales (PCA) con los genes altamente variables seleccionados. El grafo de vecindad se construyó a partir de los 50 principales componentes y se visualizó utilizando UMAP^[125]. Se realizó el agrupamiento con el método Leiden^[126] con una resolución de 0.5, y la prueba de rangos de Wilcoxon^[127] calculó los genes marcadores de cada grupo. Las puntuaciones del ciclo celular se calcularon con genes previamente definidos para el ciclo celular^[128] utilizando la función scanpy.tll.scoregenescellcycle.

Ensayo de respuesta a fármacos para la detección de LysoTracker

Las células se trataron con TAS-102 a concentraciones que oscilan entre 0.049 y 108 μM en una serie de diluciones triplicadas durante 24, 48 o 72 horas para establecer las condiciones óptimas para la activación lisosomal inducida. Se incluyeron un control vehículo DMSO y líneas celulares que sobreexpresan ORF individuales de CDK6 y BCL2 como controles positivos de sensibilidad y resistencia a los fármacos, respectivamente. Después del tratamiento con TAS-102, la actividad lisosomal se evaluó tiñendo las células con 50 nM de LysoTracker Green DND-26 (Thermo Fisher Scientific Inc., L7526) durante 20 minutos a 37°C. Después de dos lavados con DPBS, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo CytoFlex (Beckman Coulter, C09766) para medir la fluorescencia verde como indicador de la actividad lisosomal.

Detección de LysoTracker

El método FACS siguió el protocolo del estudio anterior^[129]. Las células ORFeome HeLa se descongelaron y se combinaron para maximizar la cobertura de la biblioteca ORF, luego se les permitió recuperar durante tres días antes del experimento. Para la detección, se sembraron 3 millones de células por plato de 15 cm para el control DMSO, y 20 millones de células se sembraron para el tratamiento con TAS-102 para garantizar una representación suficiente de las poblaciones potencialmente resistentes. El tratamiento con fármacos se inició mientras las células aún estaban en suspensión, antes de la adhesión completa. Después de 72 horas de tratamiento con TAS-102, la actividad lisosomal se evaluó tiñendo las células con 50 nM de LysoTracker Green durante 20 minutos a 37°C. Después de dos lavados con DPBS, las células se clasificaron en un clasificador celular Sony MA900, seleccionando positividad para mCherry y luego poblaciones con actividad lisosomal mejorada (alta fluorescencia verde, el 5% superior) y actividad lisosomal disminuida (baja fluorescencia verde, el 5% inferior). Las células clasificadas se recolectaron, se sembraron en placas de 6 pocillos y se expandieron durante una semana antes de ser cultivadas hasta la confluencia en platos de 15 cm. El ADN genómico, la amplificación por PCR y la secuenciación se realizaron según lo descrito previamente para la detección de quimioterapia. Los datos de secuenciación de las poblaciones clasificadas se analizaron utilizando la canalización bioinformática ORFeome para priorizar los genes candidatos y comparar los hallazgos con los de la detección de resistencia a TAS-102. El análisis de supervivencia y la estratificación de pacientes basados en los genes seleccionados se realizaron utilizando datos del Atlas PanCancer TCGA^[32] a través de cBioPortal^[130] (accedido el 7 de julio de 2025), y se visualizaron utilizando Matplotlib.

Análisis de Western Blot para la detección de proteínas de la vía lisosomal

Las células HeLa se trataron con DMSO, 1 μM TAS-102 o 1 μM ABT-263 (MedChemExpress, HY-10087), 1 μM TAS-102 + 1 μM ABT-263 en combinación, y las células HCT 116 se trataron con DMSO, 1 μM TAS-102 o 0.5 μM ABT-263, 1 μM TAS-102 + 1 μM ABT-263 en combinación. Después de 48 horas de incubación, las células se lisaron en buffer de muestra (60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol y 0.01% bromofenol azul) o buffer de lisis EBC (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl y 0.5% NP-40), suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich, 11836153001) durante 30 minutos en hielo. Los lisados celulares totales se sonicaron tres veces durante 10 segundos cada uno y se centrifugaron a 15.000 ×g a 4°C durante 15 minutos. Se recolectaron los sobrenadantes, y la concentración de proteína se midió utilizando el ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., 23227). Cantidades iguales de proteína se separaron por SDS–PAGE de 8–15% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories, Inc., 1620177). Las membranas se bloquearon en solución salina tamponada con Tris al 1% con Tween 20 al 0.1% y leche descremada al 5% (CellNest, CNS109) a temperatura ambiente durante 0.5 horas y se incubaron con anticuerpos primarios a 4°C durante la noche o a temperatura ambiente durante 1 hora y con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora. La señal se visualizó con ImageQuant™ 800 (Cytiva™, 29399481) utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (GenDEPOT, LLC, W3652–020). Se utilizaron los siguientes anticuerpos:

Ensayo de inmunofluorescencia

Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo en placas de 12 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con DMSO, 2 μM TAS-102 o 0.5 μM ABT-263, 2 μM TAS-102 + 0.5 μM ABT-263 en combinación. Después de 24 horas de incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.5% durante 5 minutos. Luego, las células se trataron con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% (A0100–010; GenDEPOT) durante 1 hora y luego se incubaron con anticuerpos primarios en BSA al 2% a 4°C durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con anticuerpo IgG de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (A-11034; Thermo Fisher Scientific Inc.) en BSA al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, los núcleos se tiñeron con 1 μg/mL de Hoechst 33342 (B2261; Sigma) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las láminas se montaron sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje para fluorescencia anti-fade (ab104135; Abcam). La imagen confocal se obtuvo posteriormente (LSM800; CLSM). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: contra TFEB (1:500; 4240; Cell Signaling). La fluorescencia nuclear se midió utilizando el software ImageJ (v1.53K; National Institutes of Health). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni.

Ensayo DQ-BSA

Para evaluar la actividad proteolítica lisosomal, se realizó el ensayo DQ-BSA según lo descrito previamente^[131]. Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 105 células por pocillo en portaobjetos en una placa de 12 pocillos. Al día siguiente, las células se trataron con 2 μM TAS-102 o 0.5 μM ABT-263 o una combinación de ambos. Después de 24 horas de tratamiento con fármacos, las células se incubaron con 10 μg/mL de DQ™ Red-BSA (D12051; Thermo Fisher Scientific Inc.) a 37°C durante 24 horas en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS y se fijaron con formaldehído al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (1 μg/mL). Luego, las láminas se montaron sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje para fluorescencia anti-fade (ab104135; Abcam). La imagen confocal se obtuvo posteriormente (LSM800; CLSM). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni.

Medición del pH lisosomal

Para evaluar la acidificación lisosomal, el pH lisosomal se midió según lo descrito previamente^[132]. Las células HCT 116 se sembraron a una densidad de 1 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, las células se incubaron en medio completo que contenía 2 μM TAS-102 o 0.5 μM ABT-263 o 2 μM TAS-102 + 0.5 μM ABT-263 en combinación. Después de 24 horas de tratamiento con fármacos, las células se incubaron con 1 μM de LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (L7545; Thermo Fisher Scientific Inc.) durante 5 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS y luego el medio se reemplazó con HBSS suplementado con 10% de FBS durante 10 minutos para los pozos de prueba. Para generar una curva estándar, las células se incubaron con un buffer (25 mM HEPES, 115 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 10 μM glucosa, 10 μM nigericina) calibrado a pH 4.5, 5.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 o 7.0 como se describió previamente. La fluorescencia se midió utilizando un lector de placas PerkinElmer EnSpire con filtros de excitación/emisión configurados en 329/440 nm y 380/540 nm. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni.

Ensayo de proliferación celular

Para evaluar las diferencias en la proliferación celular durante el tratamiento con fármacos, la proliferación se midió utilizando un método adoptado del protocolo anterior^[133]. Las células HCT 116 se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 5×104 células por pocillo. Al día siguiente, las células se trataron con 2 μM TAS-102 o 100 nM de Bafilomycin A1 o 2 μM TAS-109 + 100 nM de Bafilomycin A1 en combinación. Las células se recolectaron y contaron a 0, 24 y 48 horas después del tratamiento con fármacos. Cada conteo se realizó en seis réplicas independientes para cada punto de tiempo, y los valores medios se utilizaron para generar los gráficos de proliferación. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, seguida de la corrección múltiple de Bonferroni.

Ensayo de citotoxicidad

Para examinar la citotoxicidad del fármaco en células humanas, seguimos el protocolo del estudio anterior^[134]. Las células se sembraron a una densidad de 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se trataron con las concentraciones apropiadas de fármacos a 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 4, 10, 25 y 50 μM durante 24 horas. Luego, el medio se reemplazó con un medio que contenía una de las concentraciones de 0, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 nM de ABT-263 y se incubó durante 96 horas. Las células se tiñeron con Methylene Blue al 0.5% durante 30 minutos, se enjuagaron con agua, se deshidrataron, se solubilizaron en SDS al 5% en DPBS y se leyeron a 650 nm. El promedio del control normalizó la absorbancia bruta. El gráfico se generó utilizando GraphPad Prism 9, y el análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías seguida de la prueba de Tukey para comparaciones múltiples.

Modelo de xenoinjertos derivados de líneas celulares (CDX)

Se utilizaron ratones SCID/CB17 hembra, de entre 6 y 8 semanas de edad, provenientes de una colonia criada y mantenida en el RPCCC. Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco izquierdo con células tumorales HCT 116 en crecimiento exponencial (1 × 106 por ratón) suspendidas en una mezcla 1:1 de DPBS y Matrigel. Los ratones se controlaron diariamente, y se midió el peso corporal y el tamaño del tumor dos veces por semana. Las dimensiones del tumor se midieron con calibradores digitales y se calcularon utilizando la fórmula: (longitud × ancho^2)/2. Cuando el volumen del tumor alcanzó entre 50 y 100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento (n = 10-11 por grupo): (1) Control con vehículo, (2) 50 mg/kg de ABT-263, (3) 50 mg/kg de TAS-102 (MedChemExpress, n.º de catálogo HY-16478) y (4) Combinación (50 mg/kg de TAS-102 + 50 mg/kg de ABT-263). El TAS-102 se disolvió en 10% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD) en DPBS, mientras que el ABT-263 se preparó en 10% de DMSO, 40% de PEG300, 5% de Tween-80 y 45% de solución salina. Para el grupo de Combinación, el TAS-102 se administró 4 horas antes del ABT-263. Todos los fármacos se prepararon justo antes de su administración y se administraron por vía oral mediante sonda, con un ciclo de 5 días de administración y 2 días de descanso.

Modelo de xenoinjertos derivados del paciente (PDX)

Los xenoinjertos derivados del paciente con cáncer colorrectal (CRC PDX-03-26-4p) donantes y experimentales se cultivaron en ratones SCID/CB17 macho del RPCCC. Los tumores se cultivaron en ratones donantes hasta alcanzar un volumen de alrededor de 1500 mm3, se extrajeron rápidamente después de la eutanasia, se cortaron en fragmentos de 2 × 2 × 2 mm3 en condiciones estériles y se implantaron quirúrgicamente en el flanco izquierdo. Las grapas quirúrgicas se retiraron aproximadamente diez días después de la implantación. El crecimiento del tumor y el peso de los ratones se midieron dos veces por semana. Una vez que el volumen tumoral promedio alcanzó entre 50 y 100 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos, al igual que en el modelo CDX: (1) Control con vehículo, (2) 50 mg/kg de ABT-263, (3) 50 mg/kg de TAS-102 y (4) Combinación (50 mg/kg de TAS-102 + 50 mg/kg de ABT-263). Los fármacos se prepararon como en el experimento CDX y se administraron por la misma vía y con el mismo programa de dosificación.

Monitorización del modelo en ratones

Los ratones se alojaron en unidades de microaislamiento y se les proporcionó comida y agua ad libitum. Se realizó un control diario de la salud de los animales, el peso corporal y el crecimiento del tumor, así como los procedimientos de finalización del estudio, siguiendo el protocolo y las directrices aprobadas por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC). El centro está certificado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de los Centros de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y cumple con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos.

Al final del estudio, cuando el diámetro del tumor alcanzó los 20 mm, los ratones fueron sacrificados y se les realizó una necropsia y se recolectaron órganos. La evaluación del crecimiento tumoral se detuvo una vez que un ratón alcanzó el punto final (normalmente en un grupo tratado con vehículo), mientras que los datos de supervivencia se siguieron recopilando en el estudio. Se recolectó sangre por vía intracardíaca y se almacenó en tubos recubiertos con EDTA a 4 °C para realizar un hemograma completo.

Hemogramas completos

Se recolectó sangre mediante punción cardíaca en un tubo que contenía solución de EDTA al final del estudio^[134]. El análisis se realizó con muestras de 20 μL de sangre utilizando el analizador Heska HemaTrue y el software integrado HeskaView versión 2.5.2.

Estadísticas para los datos in vivo

La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) para cada ratón se calculó como la diferencia relativa entre el volumen tumoral promedio del grupo de control con vehículo y el volumen tumoral del ratón individual en relación con el promedio del grupo de control con vehículo. Las diferencias estadísticamente significativas se determinaron utilizando ANOVA de una vía para TGI y hemograma completo, y una prueba ANOVA de dos vías para las curvas de crecimiento tumoral. Se realizaron pruebas múltiples utilizando la comparación múltiple de Tukey en GraphPad Prism 9.